Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO ÁCIDO ROSMARÍNICO, USO DAS MESMAS, USO DE UMA ENZIMA HIDROLÍTICA OU UM MICRO-ORGANISMO CONTENDO OU PRODU- ZINDO A DITA ENZIMA E PROCESSO PARA O PREPARO DE UMA COMPOSI- ÇÃO QUE TEM UMA BIOEFICÁCIA AUMENTADA".
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se às composições compreendendo ácido rosmarínico ou extratos contendo ácido rosmarínico e ao uso de uma enzima hidro- lítica ou de micro-organismos contendo ou capazes de produzir enzimas hidrolíticas nessas composições. A invenção também refere-se aos métodos para melhorar os efeitos biológicos das composições que contêm ácido rosmarínico e seus deriva- dos.
Técnica Anterior
Ácido rosmarínico é um polifenol encontrado em um número de fontes naturais incluindo alecrim, orégano, manjerona, tomilho, hortelã-pimenta, confrei, salsa, erva cidreira, salva, hissopo, manjericão, lavanda etc. Essas plantas têm sido registradas como remédios herbários com propriedades antioxidantes, anti- inflamatórias, anticarcinogênicas e hepatoprotetoras. Esses efeitos biológicos têm sido relacionados à presença de polifenóis, notadamente ácido rosmarínico, flavo- nas, e flavanóis que foram identificados nas folhas de alecrim, por exemplo.
Não existe nenhum modo descrito na técnica quanto a como melhorar os efeitos biológicos de composições compreendendo ácido rosmarínico ou extra- tos de plantas compreendendo o dito ácido rosmarínico.
Obietivo da invenção
Dessa maneira ainda permanece uma necessidade de melhorar os efeitos biológicos de composições compreendendo ácido rosmarínico ou extratos de plantas que compreendem o dito ácido rosmarínico e derivados do mesmo. Sumário da Invenção
Por isso, esse objetivo é resolvido pelas características das reivindica- ções independentes. As reivindicações dependentes adicionalmente desenvolvem a idéia central da invenção.
Dessa maneira, em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição compreendendo ácido rosmarínico e/ou deriva- dos do mesmo em combinação com uma enzima hidrolítica e/ou com um micro-organismo que contém ou produz a dita enzima.
Em um segundo aspecto, a invenção refere-se a uma composi- ção compreendendo ácido rosmarínico e/ou derivados do mesmo em combi- nação com um produto de hidrólise do mesmo.
Uma composição de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 1 a 15 para uso no melhoramento, ou para prevenir danos para a pele, faz também parte da presente invenção.
Além disso, a invenção abrange o uso de cosmético de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
Em outro aspecto, a invenção refere-se ao uso de uma enzima hidrolítica, ou um micro-organismo que contém ou produz a dita enzima para hidrolisar o ácido rosmarínico.
O uso de uma enzima hidrolítica ou de um micro-organismo, que contém ou produz a dita enzima em uma composição compreendendo ácido rosmarínico e/ou seus derivados para melhorar o efeito biológico da dita composição, enquadra-se em um aspecto adicional da invenção.
Adicionalmente, a invenção também provê um método de prepa- ração de uma composição compreendendo ácido rosmarínico e/ou derivados do mesmo tendo um efeito biológico aumentado compreendendo as etapas de:
a. Prover ácido rosmarínico e/ou derivados do mesmo,
b. Prover uma enzima hidrolítica ou um micro-organismo que contém ou produz a dita enzima, e
c. Misturar o dito ácido rosmarínico e/ou derivados do mesmo e enzima hidrolítica ou micro-organismo que contém ou produz a dita enzima com ingredientes adicionais para produzir a dita composição, de tal maneira que a hidrólise do ácido rosmarínico ocorre na composição ou in vivo.
Finalmente, um método é provido para melhorar a saúde de um sujeito compreendendo a etapa de administrar uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 15. Figuras
A presente invenção é ainda descrita daqui em diante com refe- rência a algumas de suas modalidades mostradas nos desenhos que acom- panham, em que:
- figura 1 ilustra a estrutura molecular do ácido rosmarínico,
- figura 2 ilustra a estrutura molecular do ácido cafeico,
- figura 3 ilustra a estrutura molecular do ácido 3,4-di-hidróxi fe-
nil-láctico,
- figura 4 é um gráfico mostrando a influência da quantidade de enzima de esterase clorogenata sobre a hidrólise do ácido rosmarínico ((A)
0,01 U/mg, (♦) 0,02 U/mg) e na formação do ácido cafeico ((□□) 0,01 U/mg, (·) 0,02 U/mg),
- figura 5 é um gráfico mostrando a influência do pH na formação do ácido cafeico a partir do ácido rosmarínico, usando a enzima de esterase
clorogenata em pH 5,0 (·), pH 6,0 (□□), pH 7,0 (A), e pH 8,0 (♦),
- figura 6 é um gráfico mostrando o efeito da temperatura sobre a hidrólise do ácido rosmarínico (□□), e sobre a formação do ácido cafeico (·) a 30°C, 40°C, e 50°C usando 0,02 U de enzima por mg do ácido rosmarí- nico,
- figura 7 é um gráfico mostrando a influência da concentração
de substrato sobre a taxa de hidrólise do ácido rosmarínico e o rendimento usando (·) 1mg, (♦) 2mg, (A) 4 mg, e (□□) 6 mg do ácido rosmarínico e 0,02 unidade de enzima em pH 6,6 e 40°C,
- figura 8 é um gráfico mostrando o efeito biológico melhorado de um extrato contendo ácido rosmarínico, depois da hidrólise (Naturex PE20
hidrolisado), comparado com um extrato compreendendo ácido rosmarínico (Naturex PE20).
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção refere-se às composições compreendendo ácido rosmarínico e derivados do mesmo. As composições podem ser "com- posições alimentares" ou "composições tópicas". Por "composições alimen- tares" se quer dizer qualquer produto consumível que pode ser usado para fins nutricionais, farmacêuticos e/ou cosméticos. Por "composições tópicas" se quer dizer qualquer composição que pode ser aplicada à pele, pelo, u- nhas ou cabelo de um sujeito para fins farmacêuticos e/ou cosméticos. Pre- ferivelmente, as composições são composições alimentares.
5 O ácido rosmarínico (figura 1) e seus derivados são comumente
encontrados em plantas tais como alecrim, orégano, manjerona, tomilho, hortelã-pimenta, confrei, salsa, erva cidreira, salva, hissopo, manjericão, la- vanda, perila etc.
Por "derivados" de ácido rosmarínico se quer dizer qualquer composto compreendendo pelo menos uma porção de ácido rosmarínico. Esses incluem oligômeros, polímeros, glicosídeos de ácido rosmarínico etc.
O Ácido rosmarínico e seus derivados podem ser providos como compostos puros ou por várias ervas tais como perila (Perílla frutescens L), salva (Salvia offícinalis L), menta (Mentha arvense L), manjericão (Ocimum basilicum L), tomilho (Thymus vulgaris L.), dulcamara chinesa (Celastrus hind- sii) etc. Preferivelmente ele é provido por alecrim (Rosmarinus offícinalis L.).
Além do mais, a extração de plantas contendo uma fonte de áci- do rosmarínico pode ser realizada usando métodos conhecidos na técnica. Na verdade, a composição da presente invenção preferivelmente compreen- 20 de extratos de plantas compreendendo ácido rosmarínico e/ou seus deriva- dos. Preferivelmente, os extratos estão presentes na composição em uma quantidade que varia de 0,01 g a 20g em uma base de substância seca.
A presente invenção dessa maneira provê uma composição compreendendo ácido rosmarínico e/ou derivados do mesmo em combina- ção com uma enzima hidrolítica (por exemplo esterase) ou um micro- organismo que contém ou produz uma enzima hidrolítica capaz de hidrolisar o ácido rosmarínico ou seus derivados.
Devido ao efeito hidrolítico da enzima sobre o ácido rosmarínico e/ou em seus derivados, a composição pode ainda compreender os produtos de hidrólise de ácido rosmarínico e/ou seus derivados com a dita enzima. Esses podem incluir ácido cafeico, ácido 3,4-di-hidróxi fenil-láctico etc. e mis- turas dos mesmos. As composições da presente invenção podem ser composições secas, úmidas ou semiúmidas. Por "secas" se quer dizer composições que têm uma atividade de água abaixo de 0,6. Por "semiúmidas" se quer dizer composições que têm uma atividade de água entre 0,6 e 0,9, e por "úmidas" 5 se quer dizer composições que têm uma atividade de água acima de 0,9.
As composições podem compreender veículos alimentares ou farmacêuticos apropriados. Esses incluem leite, iogurte, queijo, leite fermen- tado, leite baseado em produtos fermentados, sorvetes, produtos baseados em cereais fermentados, pó baseado em leite, fórmulas para crianças e be- 10 bês, alimentos para animais, em particular animais domésticos, comprimidos ou pastilhas, suspensões bacterianas líquidas, suplemento oral em forma seca e suplemento oral em forma líquida.
Dessa maneira, a composição pode ser uma composição ali- mentar na forma de alimentos nutricionais completos e alimentos de substi- 15 tuição, bebidas, água mineral, sopas, suplementos alimentares e alimentos de substituição, soluções, atomizadores, pós, comprimidos, cápsulas, barras nutricionais, suspensões bacterianas líquidas, produtos de confeitaria, pro- dutos baseados em leite ou em leite fermentado, iogurtes, pós baseados em leite, produtos de nutrição enteral, composições para crianças e/ou bebês, 20 produtos baseados em cereais ou produtos baseados em cereal fermentado, produtos baseados em soja, sorvetes, chocolate, café, produtos de "culiná- ria" tais como maionese, purê de tomate ou molhos de salada, alimentos para animais domésticos etc. Dessa maneira, a composição pode também ser destinada para animais.
Para ingestão, muitas modalidades de composições orais, e em
particular de suplementos alimentares, são possíveis. Elas são formuladas por meio dos métodos usuais para produzir comprimidos revestidos de açú- car, cápsulas de gelatina, géis, emulsões, comprimidos, cápsulas ou solu- ções. Em particular, a composição compreendendo ácido rosmarínico e/ou 30 um derivado do mesmo em combinação com uma enzima hidrolítica, ou com um micro-organismo que contém ou produz a dita enzima, pode ser incorpo- rada em quaisquer outras formas de suplementos alimentares ou de alimen- tos enriquecidos, por exemplo barras alimentares, ou pós compactados ou não compactados. Os pós podem ser diluídos com água, em uma bebida efervescente, produtos de laticínios ou produtos derivados de soja, ou po- dem ser incorporados em barras alimentares.
5 Alternativamente, a composição pode ser uma composição tópi-
ca na forma de soluções aquosas, aquosas alcoólicas ou oleosas, de disper- sões do tipo solução ou dispersões do tipo loção ou soro, de emulsões que têm uma consistência líquida ou semilíquida do tipo leite, obtidas pela dis- persão de uma fase gordurosa em uma fase aquosa (O/A) ou vice-versa 10 (A/O), ou de suspensões ou emulsão que têm uma consistência mole, se- mimole ou sólida do tipo creme, gel aquoso ou gel de anidro, ou então de microemulsões, de microcápsulas, ou micropartículas ou de dispersões vesi- culares do tipo iônico e/ou não-iônico.
As composições da invenção podem compreender os excipien- tes e constituintes usuais, por exemplo, constituintes graxos e/ou aquosos, agente umidificantes, agentes de espessamento, agentes conservantes, a- gentes de textura, agentes flavorizantes e/ou de revestimento, antioxidantes, corantes que são usuais no domínio alimentar e/ou tópico.
Preferivelmente, a enzima hidrolítica presente na composição é uma esterase.
O princípio subjacente da presente invenção é que certas enzi- mas hidrolíticas são capazes de converter o ácido rosmarínico (figura 1) em ácido cafeico (figura 2) e ácido 3,4-di-hidróxi fenil-láctico (figura 3) que estão mais prontamente biodisponíveis do que o ácido rosmarínico. Dessa manei- 25 ra, a bioeficácia das composições compreendendo ácido rosmarínico, ou extratos de plantas compreendendo ácido rosmarínico, é melhorada.
Por prover uma composição compreendendo a dita enzima hi- drolítica, a presente invenção permite o processo de converter ácido rosma- rínico em ácido cafeico e ácido 3,4-di-hidróxi fenil-láctico descrito acima para 30 ocorrer na própria substância alimentar, no produto para a própria aplicação tópica, ou em um estágio inicial do processo de digestão in vivo, ou median- te a aplicação tópica, dessa maneira aumentando a bioeficácia das compo- sições compreendendo ácido rosmarínico e/ou seus derivados.
Dessa maneira, as composições da invenção contendo ácido rosmarínico e/ou seus derivados têm efeitos biológicos melhorados.
Alternativamente, ou em adição, a composição da presente in- venção pode compreender um micro-organismo que contém ou produz tal enzima hidrolítica.
A quantidade de enzima ou micro-organismo presente na com- posição da invenção é de tal maneira que pelo menos 10%, preferivelmente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 50% de ácido rosmaríni- 10 co (figura 1) podem ser hidrolisados em ácido cafeico (figura 2) e ácido 3,4- di-hidróxi fenil-láctico (figura 3). Isso pode ser facilmente determinado pela pessoa versada, através dos métodos conhecidos na técnica.
Dependendo da aplicação, a enzima hidrolítica pode estar pre- sente na composição em uma quantidade que varia de 0,01 a 1000 U/g.
Quando o micro-organismo é usado na composição, ele está
preferivelmente presente em uma quantidade que varia de 1x103 a 1x1012 cfu/g.
O micro-organismo usado na composição da invenção pode ser selecionado a partir de bactérias, leveduras ou fungos. Preferivelmente, o 20 micro-organismo é um micro-organismo probiótico. Mais preferivelmente, ele é selecionado de Lactobacillus johnsonii (CNCM 1-1225), Bifidobacterium Iongum (ATCC BAA-999), Bifidobaeterium Iaetis (CNCM I-3446) ou misturas dos mesmos.
Sob outro aspecto da invenção, uma composição compreen- 25 dendo ácido rosmarínico ou extratos de plantas compreendendo ácido ros- marínico e/ou derivados do mesmo, em combinação com um produto de hi- drólise do mesmo, é provida. Preferivelmente, o produto de hidrólise é obte- nível pela clivagem enzimática de ácido rosmarínico e/ou derivados do mesmo. Tal produto de hidrólise pode ser selecionado de ácido cafeico, áci- 30 do 3,4-di-hidróxi fenil-láctico etc. e misturas dos mesmos.
As composições da invenção são particularmente úteis para me- lhorar e prevenir danos na pele. Na verdade, elas têm sido consideradas particularmente úteis na inibição e expressão de metaloproteinase da matriz. Preferivelmente, a metaloproteinase da matriz é do tipo 1.
A Figura 8 mostra o efeito da hidrólise sobre um extrato, com- preendendo ácido rosmarínico, na liberação de MMP1 constitutiva. Pode-se 5 ver que, comparada a um controle, o ácido ferúlico, e para um extrato com- preendendo ácido rosmarínico (não hidrolisado), pelo menos o ácido rosma- rínico parcialmente hidrolisado tem um efeito considerável sobre a liberação do MMP1 constitutivo e que o torna particularmente útil para melhorar e/ou prevenir danos na pele.
De acordo com uma modalidade, a composição da invenção po-
de ser usada cosmeticamente. Nessa modalidade, as composições podem ser projetadas para consumo oral ou para aplicações tópicas.
Por "uso cosmético" se quer dizer um uso não terapêutico que pode melhorar o aspecto estético ou o conforto da pele, pelo e/ou cabelo de seres humanos ou de animais domésticos.
Neste contexto, o uso do cosmético pode incluir prevenção de danos e/ou melhoramento da pele, pelo e/ou cabelo de seres humanos ou de animais domésticos. Tais danos incluem em particular danos actínicos e de envelhecimento da pele tais como ressecamento, pigmentação irregular 20 (notadamente aquisição de sardas, lentigos, hipomelanose manchada e hi- perpigmentação persistente), enrugamento (notadamente linhas de superfí- cie fina e sulcos profundos), pseudocicatrizes radiadas, elastose, inelastici- dade, telangiectasia, lagos venosos, comedones, hiperplasia sebácea, acro- córdon e queratose seborréica.
O uso de cosmético pode também ter benefícios particulares
sobre o cabelo e o pelo, tais como uma densidade de cabelo e pelo, diâme- tro de fibra, cor, oleosidade, brilho, produção de sebo, e pode ajudar a pre- venir perda de cabelo ou de pelo.
Quando usada cosmeticamente, a composição da invenção po- de assumir qualquer forma de composição alimentar descrita acima. Preferi- velmente, ela está na forma de suplementos dietéticos, que podem ser em forma líquida ou seca, tais como soluções, atomizadores, comprimidos, cáp- sulas, cápsulas gelatinosas, pastilhas, pós, géis, emulsões etc. Mais preferi- velmente ela está na forma de uma cápsula.
Alternativamente, a composição pode assumir a forma de uma composição tópica que pode estar na forma de soluções aquosas, aquosas 5 alcoólicas ou oleosas, de dispersões do tipo solução, ou dispersões do tipo loção ou soro, de emulsões que têm uma consistência líquida ou semilíquida do tipo leite, obtida pela dispersão de uma fase oleosa em uma fase aquosa (O/A) ou vice-versa (A/O), ou de suspensões ou emulsões que têm uma consistência mole, semissólida ou sólida do tipo creme, gel aquoso ou gel de 10 anidro, ou então de microemulsões, de microcápsulas, ou micropartículas ou de dispersões vesiculares do tipo iônico e/ou não-iônico.
Essas composições são preparadas de acordo com os métodos usuais conhecidos da pessoa versada. Em uma modalidade preferida, essas composições tópicas são projetadas de tal maneira que a enzima e/ou o mi- cro-organismo interage com o ácido rosmarínico somente mediante aplica- ção tópica.
Composições para aplicações tópicas podem em particular constituir cremes de limpeza, protetores, tratamento ou cuidados com a face, para as mãos, para os pés, para as principais dobras anatômicas ou para o corpo (por exemplo cremes para o dia, cremes para noite, cremes para re- mover maquiagem, cremes de base, cremes para sol), produtos de maquia- gem tais como bases fluidas, leites de remoção de maquiagem, leites prote- tores ou de cuidados para o corpo, leites para depois da exposição ao sol, loções, géis ou espumas para os cuidados com a pele, tais como loções de limpeza e desinfecção, loções de proteção solar, loções de bronzeamento artificial, composições para banho, composições de desodorantes contendo um agente bactericida, géis ou loções para depois de fazer a barba, cremes depilatórios, ou composições para picadas de insetos, sabonetes, tortas de limpeza, cremes, géis, emulsões ou musses, composições de aerossol para o cabelo etc.
Em outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de en- zima hidrolítica ou de um micro-organismo contendo ou produzindo uma en- zima hidrolítica para hidrolizaro ácido rosmarínico (figura 1). Com referência às figuras 4 a 7, a hidrólise do ácido rosmarínico em ácido cafeico (figura 2) e ácido 3,4-di-hidróxi fenil-láctico (figura 3) pode depender da quantidade de enzima usada, o pH e a temperatura em que a hidrólise é realizada e a quantidade de ácido rosmarínico presente.
O uso de uma enzima hidrolítica ou um micro-organismo con- tendo ou produzindo tal enzima hidrolítica em uma composição compreen- dendo ácido rosmarínico e/ou seus derivados para melhorar a bioeficácia da dita composição é dessa maneira provido pela presente invenção.
Quando um micro-organismo é usado para esse fim, ele é prefe-
rivelmente selecionado de bactérias, leveduras ou fungos. Mais preferivel- mente ele é um micro-organismo probiótico. Ainda mais preferivelmente, ele é selecionado a partir de Lactobacillus johnsonii (CNCM 1-1225), Bifidobaete- rium Iongum (ATCC BAA-999), Bifidobacterium Iaetis (CNCM I-3446) ou mis- turas dos mesmos.
De acordo com outra modalidade da presente invenção, um mé- todo de preparar uma composição compreendendo ácido rosmarínico e/ou seus derivados que tem uma bioeficácia aumentada é fornecido.
O método compreende a primeira etapa de prover o ácido ros- marínico e/ou seus derivados. Isso pode ser provido por várias ervas tais como alecrim, orégano, manjerona, tomilho, perila, hortelã-pimenta, confrei, salsa, erva cidreira, salva, hissopo, manjericão, lavanda etc. ou misturas dos mesmos, ou por extração de fontes naturais.
Preferivelmente, o ácido rosmarínico é provido em uma quanti- dade variando de 0,01 mg a 10 g ou uma base de substância seca.
Em segundo lugar, uma enzima hidrolítica ou um micro- organismo contendo ou produzindo a dita enzima hidrolítica é provido.
Quando a enzima é usada como tal, ela é preferivelmente provi- da em uma quantidade variando de 0,01 a 1000 U/g.
Se o micro-organismo é usado, ele é preferivelmente provido em
uma quantidade variando de 1x103 até 1x1012 cfu/g. O micro-organismo po- de ser selecionado a partir de bactérias, leveduras ou fungos. De acordo com uma modalidade preferida, o micro-organismo é um probiótico. Mais preferivelmente, ele é selecionado de Lactobacillus johnsonii (CNCM 1-1225), Bifidobaeterium Iongum (ATCC BAA-999), Bifidobaeterium Iaetis (CNCM I-3446) ou misturas dos mesmos.
A terceira etapa do método então consiste em misturar o ácido
rosmarínico e/ou derivados do mesmo e a enzima hidrolítica e/ou micro- organismo contendo ou produzindo a dita enzima com outros ingredientes para produzir a dita composição, de modo que a hidrólise do ácido rosmarí- nico ocorra na composição ou in vivo.
O processo de conversão do ácido rosmarínico em ácido cafeico
e ácido 3,4-di-hidroxifenilláctico descrito acima pode assim ocorrer tanto na matriz alimentar por ela mesma, no produto para aplicação tópica, ou no es- tágio primitivo do processo de digestão in vivo ou mediante a aplicação tópi- ca, assim aumentando a bioeficácia das ditas composições que compreen- dem o ácido rosmarínico e/ou seus derivados.
Outros ingredientes podem incluir quaisquer ingredientes usa- dos na produção de produtos alimentícios, de composições tópicas e ingre- dientes funcionais. Estes incluem carbo-hidratos, proteínas, lipídios, fibras, vitaminas, prebióticos, minerais, extratos de planta etc.
A composição resultante pode estar em qualquer forma tal como
aquelas composições descritas acima.
A presente invenção ainda abrange um método para melhorar a saúde de um indivíduo, compreendendo a etapa de administrar uma compo- sição de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesl a 15. A administra- ção pode ser tópica ou oral.
A composição da invenção consequentemente pode agir como um antioxidante, como um anti-inflamatório e anti-hipertensivo. Além disso, ela também possui efeitos positivos na prevenção e tratamento de doenças cardiovasculares e cerebrovasculares, na prevenção da diabetes do tipo 2, e nas doenças degenerativas do cérebro.
Além disso, as composições de acordo com a presente invenção podem ser administradas para o tratamento e/ou prevenção dos danos da pele os quais são, por exemplo, produzidos por uma situação de tensão, por exemplo, por meio de uma tensão química, biológica ou física, por exemplo, pela exposição a oxidantes ou carcinogênios, exposição a bactérias, vírus, fungos, lipídios derivados de células circundantes e/ou micróbios, ou exposi- ção à irradiação por UV.
Estes danos, além disso, compreendem ceratoses actínicas, púrpura, angioedema de cereja, carcinoma de célula basal e carcinoma de célula escamosa, queimadura de pele e/ou formação de bolhas, hiperplasia epidermal, inflamação, supressão imune, e câncer, por exemplo, cânceres de pele não-melanoma e melanoma.
O efeito das composições de acordo com a presente invenção, sobre a pele de seres humanos ou animais domésticos, pode ser medido pelo uso de métodos convencionais incluindo dose eritemal mínima (MED), colorimetria, perda de água transepidermal, reparo de DNA, medição 15 das interleucinas e produção de proteoglicanos, ou atividade da colagenase, da função de barreira, ou renovação celular. A composição de acordo com a invenção é, portanto, útil na melhora e prevenção contra os danos da pele.
Será entendido que o conceito da presente invenção pode da 20 mesma forma ser aplicado como ma terapia adjuvante auxiliando as medica- ções atualmente usadas. Visto que as composições da presente invenção podem facilmente ser administradas oralmente com material alimentício, ali- mento clínico especial pode ser administrado contendo uma alta quantidade de substâncias objetivas.
A presente invenção é ainda ilustrada por meio dos exemplos
não-limitativos descritos abaixo.
Exemplos Exemplo 1
Cosmético para a administração oral Uma composição na forma de uma cápsula dura tem a seguinte
formulação: Composto mg por cápsula Extrato de alecrim 500 Lactobacillus johnsonii 5x108 cfu Excipiente para o núcleo Celulose microcristalina 70 Encompress® 60 Estearato de magnésio 3 Sílica coloidal anidra 1 Agente de revestimento Goma laca 5 Talco 61 Sacarose 250 Polividona 6 Dióxido de titânio 0,3 Agente de coloração 5 A composição pode ser administrada ao indivíduo em uma quan-
tidade de 2 a 3 cápsulas diariamente.
Exemplo 2
Uma receita de alimento foi preparada pela mistura do extrato de
alecrim (ou ácido rosmarínico) com Lactobacillus johnsonii (La1, CNCM I- 1225) na proporção de 1x105 a 1x1012 cfu de bactérias a 1 g a 10 g do extra- to de alecrim (ou ácido rosmarínico). A mistura resultante foi adicionada ou misturada com qualquer veículo adequado, por exemplo, um leite fermenta- 10 do, um iogurte, um queijo fresco, um leite coalhado, uma barra de confeito, flocos ou barras de cereal para café da manhã, uma bebida, leite em pó, produto à base de soja, produto fermentado não-leite ou um suplemento nu- tricional para nutrição clínica. Exemplo 3
Clivagem de ácido rosmarínico por enzimas Influência da quantidade de enzima
Testes foram realizados em tampão de fosfato (50 mM, pH 6,6) 5 a 40°C usando quantidades diferentes de enzima (0,01 U, 0,02 U e 1 U de enzima/mg de ácido rosmarínico). Como mostrado na figura 4, a taxa de re- ação foi proporcional à quantidade de enzima e quando clorogenato estera- se foi usado a 1 U/mg de substrato, ácido rosmarínico foi completamente transformado em ácido cafeico e ácido 3,4-di-hidróxi fenil-láctico após ape- 10 nas 30 minutos de tempo de reação (dados não mostrados).
Influência do pH
A influência do pH sobre a hidrólise enzimática (0,02 U/mg) de ácido rosmarínico foi estudada. A figura 5 mostra a geração de ácido cafeico nos valores de pH de 5,0, 6,0, 7,0 e 8,0. No pH 8,0, ácido rosmarínico foi 15 completamente transformado após 2 h de tempo de reação enquanto a taxa de reação foi muito lenta no pH 6,0 e nenhuma hidrólise foi observada no pH 5,0.
Influência da temperatura
Para estudar a influência da temperatura sobre a taxa de reação 20 e sobre a estabilidade dos produtos, testes foram realizados no pH 6,6, no tampão de fosfato (50 mM), usando a enzima a 0,02 U/mg de substrato e a 30°C, 40°C e 50°C. Como mostrado na figura 6, nenhuma diferença signifi- cativa foi observada quando a reação ocorreu a 40°C ou 50°C, enquanto que a 30°C a taxa de reação foi muito mais lenta.
Influência da concentração do substrato
A influência da concentração do substrato sobre a taxa de rea- ção e sobre o rendimento foi investigada a 40°C, pH 6,6 usando 0,02 unida- de de enzima e 1 mg, 2 mg, 4 mg, ou 6 mg de ácido rosmarínico. A figura 7 mostra que a taxa de reação e o rendimento foram fortemente influenciados pela razão de enzima/substrato.
Consequentemente, mais do que 90% de ácido rosmarínico fo- ram hidrolisados após 4 horas quando 1 mg de substrato foi usado enquanto apenas 40% de hidrólise foram observados quando 6 mg de substrato foram usados sob as mesmas condições.
Exemplo 4
Clivagem de ácido rosmarínico com micro-organismos 1. Incubação com Lactobacillus johnsonii (CNCM 1-1225)
A bactéria foi desenvolvida em meio de MRS por 16 horas a 37°C sob condições anaeróbicas. Após a centrifugação, os péletes de célula foram lavados 3 vezes com 10 ml de tampão de fosfato de sódio (50 mM, ph 8). As células (0,60 g) foram suspensas em 1 ml de tampão de fosfato de 10 sódio (50 mM, pH 8) e ácido rosmarínico foi adicionado (5 mg/mL) e a mistu- ra foi incubada a 45°C durante 24 horas. Uma alíquota foi retirada a cada Vz hora para estudo cinético. Após a centrifugação, os sobrenadantes foram analisados por HPLC. Após 4 horas de incubação, todo o ácido rosmarínico foi transformado em ácido cafeico e ácido 3,4-di-hidróxi fenil-láctico.
2. Incubação com Bifidobaeterium Iaetis (CNCM I-3446)
A bactéria foi desenvolvida em MRS + 0,05% de meio de cisteí- na por 16 horas a 37°C sob condições anaeróbicas. Após a centrifugação, os péletes de célula foram lavados 3 vezes com 10 ml de tampão de fosfato de sódio (50 mM, pH 8). As células (0,60 g) foram suspensas em 1 ml de 20 tampão de fosfato de sódio (50 mM, pH 8) e ácido rosmarínico foi adicionado (5 mg/mL) e a mistura foi incubada a 45°C durante 24 horas. Uma alíquota foi retirada a cada >2 hora para estudo cinético. Após a centrifugação, os so- brenadantes foram analisados por HPLC. Após 24 horas de incubação, mais do que 50% de ácido rosmarínico foram transformados em ácido cafeico e 25 ácido 3,4-di-hidróxi fenil-láctico.
Exemplo 5
Condições de teste, dosagem de MMP-1 fmetaloproteinase da matriz) (ELI- SA)
Tratamento e irradiação As células do fibroblasto foram colocadas em um meio de cultivo
em placas de 96 cavidades. Após o pré-cultivo por 24 horas, o meio foi reco- locado com um meio contendo o produto a ser testado (ou nenhum produto para a referência). Cada condição experimental foi realizada em triplicata (usando 3 cavidades de cultivo).
Após o cultivo por 24 horas na presença (ou ausência) do produ- to a ser testado, o meio de cultivo foi removido e recolocado por uma solu- ção tampão (EBSS) e as células foram mantidas afastadas de qualquer fonte de luz.
No final da incubação, a solução de EBSS foi recolocada por um meio contendo o composto a ser testado e as placas foram colocadas a 37°C, 5% de CO2.
Após um tratamento de 48 horas, o sobrenadante de cultura foi
coletado para ELISA dosagem de MMP-1. A viabilidade da célula foi a seguir avaliada sobre uma camada da célula pela medição da redução de MTT por desidrogenases de células viáveis de acordo com procedimento padrão. Quantificação de colagenase (MMP-1)
A dosagem de MMP-1 (colagenase intersticial humana) foi reali-
zada por ELISA usando um kit "BIOTRACK MMP-1 humana, sistema ELISA, Amersham RPN2610", de acordo com as instruções do fornecedor. Processamento dos dados
Os dados de contagem foram transferidos e processados com o programa PRISM (Graf Pad Software). As comparações entre os grupos fo- ram realizadas pela análise de variância (ANOVA) usando o teste de compa- ração múltipla Dunnett.
A tabela abaixo mostra a liberação de MMP-1 constitutiva pelos fibroblastos. * mostra diferenças significativas com respeito à referência (p<0,01). Naturex é um extrato natural comercialmente disponível compre- endendo ácido rosmarínico.
O Naturex hidrolisado é obtido pelo tratamento do extrato natural compreendendo ácido rosmarínico com uma cepa probiótica de Laetobacil- Ius johnsonii (CNCM 1-1225). Ácido rosmarínico foi pelo menos parcialmente transformado em ácido cafeico e ácido 3,4-di-hidróxi fenil-láctico durante a incubação. % de rei Ferência Referência 1 100 Naturex PE 20 Controle 0,01 mg/ml 99 0,001 mg/ml 93 Naturex PE 20 hidrolisado N 0,01 mg/ml 54* 0,001 mg/ml 73 Os resultados mostrados na tabela acima evidenciam os benefí- cios da pele providos pelo ácido rosmarínico pelo menos parcialmente hidro- Iisado em comparação ao ácido rosmarínico não hidrolisado. Mais particu- larmente, ele mostra o efeito inibitório das composições da invenção sobre a expressão de MMP-1.