CN106578403B - 紫苏籽粕的综合利用方法 - Google Patents

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Abstract

以紫苏籽粕为原料，采用酯酶和蛋白酶复合处理实现了紫苏籽粕的高附加值的综合利用，属于生物工程技术领域。本发明通过双酶复合处理，可得到具有抗氧化性的天然产物、抗菌肽及饲料等产品，具有良好的经济价值和应用前景。

Description

紫苏籽粕的综合利用方法
技术领域
一种综合利用紫苏籽粕的方法，具体为酶法处理紫苏籽粕，从而获得多种高附加值产品。属于生物工程技术领域。
背景技术
紫苏籽粕是紫苏籽经提取油脂后的残渣物，而紫苏籽是唇形科植物紫苏(Perillafrutescens)的干燥成熟果实。紫苏籽粕中不仅含有大量的蛋白质，还含有大量的酚酸类化合物。紫苏籽粕常作为畜禽饲料，这是对于此类植物资料的巨大浪费。
目前已有多种方法从紫苏籽粕中提取蛋白和迷迭香酸(中国专利201210499594.6)的方法，但这些方法均为单一化的处理方法，提取完某种物质后，会产生大量的废渣，不仅是资源的浪费，而且破坏环境。
中北大学张志军等人提出了一种紫苏全株的综合利用的方法，先出紫苏油，榨油后籽粕中提取得到甾醇、分离蛋白产品。从紫苏叶中提取纯化迷迭香酸,以及花青素和精油产品，用紫苏秸秆培养高赖氨酸平菇，进一步加工出α-亚麻酸、精油手工皂、紫苏茶等终端产品。这种方法也仅是停留在紫苏原有成份的提取或利用的层面上。
许多研究已经表明，自然界中存在各种酯酶可将迷迭香酸水解，从而得到丹参素和咖啡酸(Metabolism of Rosmarinic Acid in Rats，J.Nat.Prod.1998,61,993-996；Transepithelial Transport of Rosmarinic Acid in Intestinal Caco-2CellMonolayers,biosci.biotechnol.biochem.,69(3),583-591,2005；In Vitro and in VivoStability of Caffeic Acid Phenethyl Ester,J.Agric.Food Chem.2007,55,3398-3407；Hydrolysis of Rosmarinic Acid from Rosemary Extract with Esterases andLactobacillus johnsonii in Vitro and in a Gastrointestinal Model,J.Agric.FoodChem.2009,57,7700–7705)。雀巢公司的专利(CN200780040651.1，US20140023625)表明经酶或微生物作用产生的迷迭香酸、咖啡酸和丹参素的混合物具有更好的生物活性，可应用于食品或化妆品。这也表明丹参素和咖啡酸相对于迷迭香酸来讲有更好的生理生化活性。
咖啡酸具有抗炎、抗菌、抗病毒、升高白细胞及血小板等多种药理作用，可用于多种与氧化应激、炎症反应、病毒感染相关的疾病，如心血管疾病、脑组织损伤、人免疫缺陷病毒感染的预防和治疗以及白细胞减少症和血小板减少症。咖啡酸作为一种天然抗氧化剂，已广泛应用于食品、药品、化妆品等领域中。
当前丹参素来源于丹参，具有多种药理活性。可用于抑制血小板聚集及抗凝、抗菌消炎及增强机体免疫、抗动脉粥样硬化及降血脂、抗血栓形成、治疗肝损伤的作用，丹参素抗肿瘤、治疗银屑病、防治高原病等。另外丹参素能显著延长小鼠耐缺氧时间，而且对后叶素引起的大鼠缺血性心电变化，具有显著保护作用。它能明显扩张冠状动脉，使其血流量显著增加，并有对抗吗啡和心得安收缩冠状动脉的作用。它还可拮抗低氧性肺血管收缩作用，提示可为肺心病、成人呼吸窘迫综合症(ARDs)，等危重疾病的治疗提供帮助。丹参素对微循环障碍具有明显改善作用，它可降低血浆乳酸含量，能改善细胞缺血缺氧所致的代谢障碍。另外，它并不影响静息状态下的红细胞中游离钙的变化，提示其有阻滞红细胞钙内流的作用。当前市场上丹参素唯一来源于种植丹参，丹参素在丹参根茎中的含量小于0.1％，虽然种植规模达几十万亩，仍然远远无法满足市场的需求。
植物提取过程中经常会通过添加酶制剂的方法以提高提取率，最常见的是添加纤维素酶，利于有效成份的释放。这些酶类的添加并不会使有效份的结构发生变化，无法获得价值更高的产品。
在紫苏籽粕中蛋白最高可达40％以上，迷迭香酸的含量也可达到0.5％以上。对于植物来讲，很多组织结构是由酯键构成，同时紫苏籽粕经过榨油过程，结构变得致密的，不利于有效成份的提取。中国专利201110323645.5通过木瓜蛋白酶辅助的方法从紫苏籽中提取多糖就是将部分物质水解以利于所需物质的释放，但该专利中由于所用酶的特点，蛋白质被水解成氨基酸单体，无法得到抗菌肽。随着传统抗生素的毒副作用及其耐药菌株的出现，许多致病菌几乎对现有的抗生素均产生耐药性，对人类的健康构成了巨大的威胁。抗菌肽成为后抗生素时代的最佳选择，已经在医药、食品、畜牧业、农业等领域显示出广泛的应用前景
本发明提出了一种通过酯酶与蛋白酶组合的方法，使紫苏籽粕中的成份发生质变。酯酶与蛋白酶的复合，一方面使用紫苏籽粕被酶处理后产物更易释放，另一方面蛋白质可转化成高价值的抗菌肽、迷迭香酸会转化出市场价值更高的丹参素和咖啡酸。被酶处理后的提取残渣制成饲料后营养成份更易被吸收利用。
发明内容
基于当前的情况，本发明通过紫苏籽粕添加酯酶与蛋白酶转化，然后再分离纯化得到丹参素、咖啡酸、迷迭香酸及抗菌肽、提取剩余部分制成饲料，实现紫苏籽粕的全利用。该方法实施简单，质量可控，具有广阔的应用开发前景。
本发明的技术方案如下：
步骤一、紫苏籽粕的酶处理
紫苏籽粕粉碎至0.1-5mm后，用其重量2:10倍的水浸泡，然后加入干紫苏籽粕重量0.1％-10％的酯酶处理1-72小时，再加入干紫苏籽粕重量0.1％-10％的蛋白酶处理1-72小时。以上过程的温度为20-60℃，pH自然。
所用的酯酶包含有：日本天野(Amano)公司生产的Lipase AY,Lipase MER,LipaseR,Lipase DF,Lipase A,Lipase G；丹麦诺维信(Novozymes)公司生产的:Novozyme 435,lipozyme RM IM,Lipozyme TL IM,Lecitase Ultra,Palatase,Lipopan SGB CN,LipopanFBG。山东苏柯汉生物工程股份有限公司的SUKAZYM-SUKALip；深圳市绿微康生物工程有限公司的LVK-F-100；宁夏夏盛实业集团有限公司的SBE-01Li；。
所用的蛋白酶包含有：丹麦诺维信(Novozymes)公司生产的Neutrase和Alcalase，Kerry公司的N120P，日本天野(Amano)公司生产的Newlase F和Protease A"Amano"2SD。或者其它基因工程菌表达生产的廉价蛋白酶。
步骤二、转化液的处理
采用板框压滤机进行固液分离，得到湿的渣子，并得到含有丹参素、咖啡酸、迷迭香酸和多肽的转化液。
步骤三、转化产物固形物部分的处理。
将步骤二中得到的湿渣子采用回转滚筒干燥设备进行干燥，使用含水率<15％，得到饲料。
步骤四、转化液的处理
将步骤二中得到的转化液，首先提取抗菌肽，用80％NH4Cl盐析，离心后沉淀部分用离心物总重量的10倍去离水复溶。然后用Sephadex G-100凝胶层析柱(10cm×50cm)层析，上样量为150ml样品。用0.5M NaCl洗脱，洗脱速度为100ml/min，并用自动记录仪记录OD280处的吸收峰，收集20-30分钟处的洗脱液，冷冻干燥后得到抗菌肽冻干粉。
提取完抗菌肽的液体采用大孔吸附树脂进行初步纯化，再采用制备色谱制取高纯迷迭香酸、丹参素、咖啡酸。
大孔吸附树脂预处理的方案为：树脂采用D101，HPD600，HPD100，HPD450，SD-401，AB-8。上样量为2BV，流速为1.5BV/h上柱。洗脱液速度为1.5BV/h。依次水洗脱3个柱体积，40％乙醇洗脱3个柱体积，60％乙醇洗脱6个柱体积。
制备色谱条件为：采用汉邦DAC 80系统，填料为C18(5.0μm)，上样量为50ml，流动相为甲醇-0.6％(v/v)乙酸水溶液(55:45,v/v)，柱温为室温，流速为100mL/min，检测波长为280nm。上样液体为大孔吸附树脂步骤中的40％乙醇洗脱液回收乙醇后的溶液。
相关物质的测定方法如下：
丹参素、咖啡酸、迷迭香酸的含量采用液相色谱法测定。测定方法详见：Occurrence of rosmarinic acid,chlorogenic acid and rutin in Marantaceaespecies,Phytochemistry Letters,2008,199–203。
本发明的有益效果：紫苏籽粕经酯酶和蛋白酶转化分离纯化得到丹参素、咖啡酸、迷迭香酸、抗菌肽和饲料。由于紫苏籽粕经双酶处理，因此营养成份更易释放，蛋白酶的处理可明显增加游离氨基酸的含量，因此本发明获得的饲料与紫苏籽粕直接用作饲料性能上有着的显著改变。本发明该方法简单可行，适于大规模放大生产，可产生巨大的经济效益，具有广泛的应用前景。
具体实施方式
实施例1
将1公斤紫苏籽粕粉碎至0.1mm，加入10g Lipase AY和10公斤水40℃保温48小时，然后加入10g Neutrase再40℃保温48小时。酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到150克抗菌肽，然后液体采用HPD600大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到0.2克迷迭香酸(纯度94.1％)，2克咖啡酸(纯度95.4％)，2.1克丹参素(纯度96.5％)。板柜过滤得到的固形物干燥后得到810克饲料。
实施例2
将1公斤紫苏籽粕粉碎至5mm，加入0.1g Lipase MER和10公斤水20℃保温1小时，然后加入0.1g Alcalase再20℃保温48小时。酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到10克抗菌肽，然后液体采用D101大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到3.1克迷迭香酸(纯度95.3％)，0.1克咖啡酸(纯度96.1％)，0.1克丹参素(纯度95.8％)。板柜过滤得到的固形物干燥后得到920克饲料。
实施例3
将1公斤紫苏籽粕粉碎至0.1mm，加入100g Lipase R和5公斤水30℃保温72小时，然后加入100g N120P再30℃保温72小时。酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到301克抗菌肽，然后液体采用HPD100大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到0.01克迷迭香酸(纯度97.5％)，2.2克咖啡酸(纯度95.3％)，2.5克丹参素(纯度96.8％)。板柜过滤得到的固形物干燥后得到686克饲料。
实施例4
将1公斤紫苏籽粕粉碎至2mm，加入10g Lipase DF和2公斤水50℃保温1小时，然后加入10g Newlase F再50℃保温1小时。酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到25克抗菌肽，然后液体采用HPD450大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到2.6克迷迭香酸(纯度94.6％)，0.15克咖啡酸(纯度96.1％)，0.21克丹参素(纯度95.1％)。板柜过滤得到的固形物干燥后得到930克饲料。
实施例5
将1公斤紫苏籽粕粉碎至0.1mm，加入1g Lipase A和2公斤水60℃保温24小时，然后加入1g Protease A"Amano"2SD再60℃保温1小时。酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到24克抗菌肽，然后液体采用SD-401大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到3.1克迷迭香酸(纯度94.1％)，0.11克咖啡酸(纯度95.6％)，0.12克丹参素(纯度96.1％)。板柜过滤得到的固形物干燥后得到810克饲料。
实施例6
将1公斤紫苏籽粕粉碎至2mm，加入50g Lipase G和3公斤水30℃保温72小时，然后加入50g Neutrase再30℃保温72小时。酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到310克抗菌肽，然后液体采用AB-8大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到0.2克迷迭香酸(纯度96.2％)，2.3克咖啡酸(纯度97.4％)，2.4克丹参素(纯度95.2％)。板柜过滤得到的固形物干燥后得到670克饲料。
实施例7
将1公斤紫苏籽粕粉碎至3mm，加入5g Novozyme 435和4公斤水40℃保温24小时，然后加入5g Alcalase再24℃保温48小时。酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到15克抗菌肽，然后液体采用AB-8大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到4克迷迭香酸(纯度96.2％)，0.1克咖啡酸(纯度98.1％)，0.1克丹参素(纯度95.5％)。板柜过滤得到的固形物干燥后得到920克饲料。
实施例8
将1公斤紫苏籽粕粉碎至4mm，加入30g lipozyme RM IM和6公斤水50℃保温12小时，然后加入30g N120P再50℃保温12小时。酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到60克抗菌肽，然后液体采用SD-401大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到2克迷迭香酸(纯度95.2％)，0.71克咖啡酸(纯度96.1％)，0.82克丹参素(纯度98.1％)。板柜过滤得到的固形物干燥后得到906克饲料。
实施例9
将1公斤紫苏籽粕粉碎至4mm，加入80g Lipozyme TL IM和7公斤水20℃保温60小时，然后加入80g Newlase F再20℃保温60小时。酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到120克抗菌肽，然后液体采用HPD450大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到6.5克迷迭香酸(纯度98.1％)，0.02克咖啡酸(纯度95.1％)，0.02克丹参素(纯度96.2％)。板柜过滤得到的固形物干燥后得到801克饲料。
实施例10
将1公斤紫苏籽粕粉碎至2mm，加入10g Lecitase Ultra和9公斤水60℃保温12小时，然后加入50g Protease A"Amano"2SD再60℃保温12小时。酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到160克抗菌肽，然后液体采用HPD100大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到4.2克迷迭香酸(纯度93.2％)，0.5克咖啡酸(纯度97.1％)，0.6克丹参素(纯度98.4％)。板柜过滤得到的固形物干燥后得到810克饲料。
实施例11
将1公斤紫苏籽粕粉碎至0.1mm，加入5g Palatase和9公斤水30℃保温1小时，然后加入5g Neutrase再50℃保温48小时。酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到11克抗菌肽，然后液体采用HPD600大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到2.1克迷迭香酸(纯度94.4％)，0.02克咖啡酸(纯度96.6％)，0.03克丹参素(纯度97.4％)。板柜过滤得到的固形物干燥后得到941克饲料。
实施例12
将1公斤紫苏籽粕粉碎至1mm，加入100g Lipopan SGB CN和5公斤水40℃保温24小时，然后加入10g Alcalase再60℃保温72小时。酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到102克抗菌肽，然后液体采用D101大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到0.02克迷迭香酸(纯度97.2％)，3.1克咖啡酸(纯度95.6％)，3.2克丹参素(纯度96.7％)。板柜过滤得到的固形物干燥后得到840克饲料。
实施例13
将1公斤紫苏籽粕粉碎至0.1mm，加入100g Lipopan FBG和10公斤水30℃保温12小时，然后加入10g N120P再20℃保温72小时。酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到106克抗菌肽，然后液体采用D101大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到0.01克迷迭香酸(纯度95.2％)，3.2克咖啡酸(纯度96.1％)，3.4克丹参素(纯度98.1％)。板柜过滤得到的固形物干燥后得到920克饲料。
实施例14
将不同种类的受试菌，分别接种于LB液体培养基中，37℃恒温培养24h。将实施例1至13纯化后冻干所获得的抗菌肽样品分别用lmL蒸馏水溶解，取100μL，加LB培养基30μL和菌液70μL(菌液浓度为5×103CFU/mL)并混匀，37℃、150r/min摇床培养1h，取100μL涂布于LB平板，37℃培养12小时，计算菌落数。以蒸馏水为对照组，计算抑菌率。实验重复3次，计算平均值。抑菌率％＝(对照组菌落数-实验组菌落)/对照组菌落数×100。由表1可以看出，纯化得到的抗菌肽具要较好的抗菌效果。
表1：抗菌肽对于不同微生物的抗菌性能
Figure BDA0001173156840000121
Figure BDA0001173156840000131

Claims (10)

1.一种高附加值利用紫苏籽粕制备抗菌肽、丹参素和饲料的方法，其特征在于：紫苏籽粕粉碎后经酯酶和蛋白酶转化，然后固液分离，再分别对固体和液体进行处理；液体首先用凝胶层析柱纯化，所述凝胶层析柱用Sephadex G-100的10cm×50cm的凝胶层析柱层析，用0.5M NaCl洗脱，洗脱速度为100ml/min，收集20-30分钟OD280处的吸收峰处的洗脱液，并冻干得到抗菌肽；然后液体再用大孔吸附树脂分离，流速为1.5BV/h上柱；洗脱液速度为1.5BV/h；依次水洗脱3个柱体积，40％乙醇洗脱3个柱体积，60％乙醇洗脱6个柱体积；最后采用制备色谱纯化得到迷迭香酸、咖啡酸、丹参素；转化物经固液分离得到的固形物干燥后得到饲料；紫苏籽粕粉碎至0.1-5mm后，用其重量2～10倍的水浸泡，然后加入干紫苏籽粕重量0.1％-10％的酯酶处理1-72小时，再加入干紫苏籽粕重量0.1％-10％的蛋白酶处理1-72小时；酶解过程的温度为20-60℃，pH自然。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将1公斤紫苏籽粕粉碎至5mm，加入0.1gLipase MER和10公斤水20℃保温1小时，然后入0.1g Alcalase再20℃保温48小时；酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到抗菌肽，然后液体采用D101大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到迷迭香酸，咖啡酸，丹参素；板框过滤得到的固形物干燥后得到饲料。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将1公斤紫苏籽粕粉碎至0.1mm，加入100gLipase R和5公斤水30℃保温72小时，然后加入100g N120P再30℃保温72小时；酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到抗菌肽，然后液体采用HPD100大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到迷迭香酸，咖啡酸，丹参素；板框过滤得到的固形物干燥后得到饲料。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将1公斤紫苏籽粕粉碎至2mm，加入50gLipase G和3公斤水30℃保温72小时，然后加入50g Neutrase再30℃保温72小时；酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到抗菌肽，然后液体采用AB-8大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到迷迭香酸，咖啡酸，丹参素；板框过滤得到的固形物干燥后得到饲料。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将1公斤紫苏籽粕粉碎至3mm，加入5gNovozyme 435和4公斤水40℃保温24小时，然后加入5g Alcalase再24℃保温48小时；酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到抗菌肽，然后液体采用AB-8大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到迷迭香酸，咖啡酸，丹参素；板框过滤得到的固形物干燥后得到饲料。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将1公斤紫苏籽粕粉碎至4mm，加入30glipozyme RM IM和6公斤水50℃保温12小时，然后加入30g N120P再50℃保温12小时；酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到抗菌肽，然后液体采用SD-401大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到迷迭香酸，咖啡酸，丹参素；板框过滤得到的固形物干燥后得到饲料。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将1公斤紫苏籽粕粉碎至4mm，加入80gLipozyme TL IM和7公斤水20℃保温60小时，然后加入80g Newlase F再20℃保温60小时；酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到抗菌肽，然后液体采用HPD450大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到迷迭香酸，咖啡酸，丹参素；板框过滤得到的固形物干燥后得到饲料。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将1公斤紫苏籽粕粉碎至1mm，加入100gLipopan SGB CN和5公斤水40℃保温24小时，然后加入10g Alcalase再60℃保温72小时；酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到抗菌肽，然后液体采用D101大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到迷迭香酸，咖啡酸，丹参素；板框过滤得到的固形物干燥后得到饲料。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将1公斤紫苏籽粕粉碎至0.1mm，加入100gLipopan FBG和10公斤水30℃保温12小时，然后加入10g N120P再20℃保温72小时；酶转化产物经板框过滤得到的液体部份，盐析后经Sephadex G-100凝胶层析柱层析提取并冷冻干燥得到抗菌肽，然后液体采用D101大孔吸附树脂预处理，回收乙醇后制备色谱纯化得到迷迭香酸，咖啡酸，丹参素；板框过滤得到的固形物干燥后得到饲料。
10.权利要求1所述的方法在制备迷迭香酸、咖啡酸、丹参素、抗菌肽、饲料中的应用。
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