BR102021020376A2

BR102021020376A2 - Gene mutante tms18 estéril macho termossensível de arroz e usos do mesmo

Info

Publication number: BR102021020376A2
Application number: BR102021020376-5A
Authority: BR
Inventors: Zhongnan YANG; Jun Zhu; Yueling LI; Yanfei Zhang
Original assignee: Shanghai Normal University
Priority date: 2020-10-16
Filing date: 2021-10-11
Publication date: 2022-05-03
Also published as: CN112501178A; US11761017B2; CN112501178B; US20220119836A1

Abstract

A invenção revela um gene mutante tms18 estéril macho sensível à temperatura de arroz e seus usos. Durante o estudo de gene TMS18, os inventores constataram que a mudança de fertilidade foi relacionada à integridade estrutural da segunda camada de parede externa de pólen. Os inventores acidentalmente constataram o mutante tms18 estéril macho termossensível. A fertilidade do mutante foi afetada por diferentes temperaturas e pode ser restaurada sob tratamento de baixa temperatura. De modo mais importante, o período sensível à fertilidade do mutante foi diferente daquele de outros genes estéreis machos termossensíveis. Essa característica exclusiva do gene pode fornecer uma nova base teórica e aplicar valor para reprodução de arroz híbrida de duas linhas.

Description

GENE MUTANTE TMS18 ESTÉRIL MACHO TERMOSSENSÍVEL DE ARROZ E USOS DO MESMO

[001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido n° CN202011109557.0, depositado em 16 de outubro de 2020.

CAMPO DA TÉCNICA

[002] A invenção refere-se ao campo de agricultura, em particular, a um arroz mutante estéril macho termossensível e usos do mesmo, que pode restaurar fertilidade sob condições específicas.

ANTECEDENTES

[003] Arroz é uma erva anual monocotiledônea e uma das culturas alimentícias mais importantes no mundo. A heterose é mais óbvia com uso da Heterose dentre variedades, subespécies e mesmo heterose distante. Materiais estéreis masculinos de arroz são de grande valor em reprodução híbrida e produção agrícola.

[004] Após o uso de linhagens estéreis masculinas fototermossensíveis, arroz híbrido produz arroz híbrido de três linhagens com base em esterilidade masculina citoplásmica e arroz híbrido de duas linhagens dependente de esterilidade masculina gênica sensível a fotoperíodo e termossensível, P/TGMS. Arroz híbrido de três linhagens precisa de linhagem estéril masculina citoplásmica, linhagem restauradora e linhagem de manutenção, enquanto o método de duas linhagens inclui linhagem estéril masculina gênica sensível a fotoperíodo e termossensível e linhagem restauradora. A linhagem estéril masculina gênica sensível a fotoperíodo e termossensível pode reproduzir por si só sob diferentes fatores ambientais e também podem ser usados para produção de sementes híbridas.

[005] Portanto, a análise em profundidade e mineração de genes sensíveis a fotoperíodo e termossensíveis existente é mais condutiva à aplicação de reprodução molecular. Atualmente, há cerca de 20 linhagens estéreis masculinas gênicas posicionadas com base em sua resposta à luz e temperatura, mas somente 3 genes foram clonados. Embora um determinado grau de ruptura tenha sido realizado, pesquisa em profundidade adicional é necessária. Há relativamente alguns recursos de genes sensíveis a fotoperíodo e termossensíveis, então é necessário explorar novos recursos de genes sensíveis a fotoperíodo e termossensíveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Durante o estudo de gene TMS18, o inventor do presente pedido constatou que a mudança de sua fertilidade é relacionada à integridade estrutural da segunda camada de parede externa de pólen. No processo de pesquisa, os inventores acidentalmente obtiveram um mutante tms18 estéril masculino gênico termossensível de gene TMS18. A fertilidade do mutante é afetada por diferentes temperaturas e pode ser restaurada sob circunstâncias específicas. De modo mais importante, os locais de mutação do mutante são diferentes de outros locais de mutação fotossensível e termossensível relatados, e a período sensível à fertilidade é também diferente de outros genes estéreis machos termossensíveis. No presente, sabe-se que o período sensível de fertilidade de linhagens estéreis masculinas gênicas fotossensíveis e termossensíveis clonadas é principalmente antes da meiose de célula mãe de pólen. No entanto, o período sensível de mutante tms18 estéril masculino gênico termossensível recém-encontrado é afetado após meiose de célula mãe de pólen. Essa característica exclusiva do gene pode fornecer uma nova base teórica e valor de aplicação para reprodução híbrida de duas linhas. Além disso, devido ao período especial e posterior de recuperação de fertilidade de baixa temperatura de tms18, é mais conveniente julgar o período de recuperação de fertilidade de plantas correspondentes, e então aplicar isso na reprodução. Por exemplo, as plantas correspondentes podem ser tratadas em baixa temperatura após meiose de célula mãe de pólen para recuperar sua fertilidade.

[007] A invenção fornece um gene mutante tms18 estéril macho termossensível de arroz da SEQ ID No.1.

[008] Adicionalmente, a invenção também fornece um vetor de expressão que contém o gene mutante tms18 estéril macho sensível à temperatura de arroz.

[009] A invenção também fornece uma semente transgênica para uma planta de cultura, em que o genoma da dita semente transgênica compreende o gene mutante tms18 estéril macho termossensível de arroz da SEQ ID No.1. Preferencialmente, ambas as sequências duplas do cromossomo da semente compreendem o gene mutante tms18.

[010] A invenção fornece um método para cultivar arroz transgênico, em que o método inclui introduzir um gene mutante tms18 estéril macho sensível à temperatura de arroz da SEQ ID No.1 em células de semente de arroz, com uso das células de semente de arroz para cultivar sementes de arroz, e plantar as sementes de arroz para obter o arroz.

[011] Preferencialmente, o método é usado para cultivar arroz recuperável em fertilidade, cuja fertilidade pode ser recuperada por tratamento de baixa temperatura.

[012] Preferencialmente, a temperatura para tratamento de baixa temperatura é menor do que 23 °C.

[013] Preferencialmente, o tratamento de baixa temperatura é realizado no arroz após sua meiose de célula mãe de pólen.

[014] Preferencialmente, o método é usado para cultivar plantas transgênicas Estéreis Macho recessivas.

[015] A invenção também fornece um use do gene mutante tms18 estéril macho termossensível de arroz da SEQ ID No.1, em que o gene mutante tms18 estéril macho de arroz é usado para regular os tratos de fertilidade termossensível de plantas, ou é usado como um marcador de seleção de plantas transgênicas fazendo-se uso de sua característica de fertilidade sensível à temperatura reversível.

[016] O gene mutante tms18 estéril macho sensível à temperatura de arroz pode fornecer arroz com um caráter de fertilidade sensível à temperatura reversível. Mais especificamente, o caráter é que o arroz que contém o mutante tms18 mostra recuperação de fertilidade sob a condição de baixa temperatura (tal como 27-25, preferencialmente 25-23 °C); enquanto sob alta temperatura (por exemplo, 28-29, preferencialmente, 29-32 °C), o arroz mostra caráteres estéreis.

[017] O gene mutante estéril termossensível da invenção é sensível a temperatura. Quando o mesmo é tratado em baixa temperatura, o mesmo pode alcançar mais do que 90% do efeito de recuperação de fertilidade. Além disso, o tempo de resposta de baixa temperatura do gene mutante tem particularidade. Seu tempo de resposta está no 9°-10° estágio de desenvolvimento de pólen, quando as características de aparência de pólen são mais óbvias, fáceis de julgar, e mais condutivas ao controle preciso por experimento. Portanto, durante o processo de fazer uso desse gene mutante tms 18, as plantas correspondentes podem ser tratadas em baixa temperatura durante esse período.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[018] A Figura 1 mostra a temperatura ambiental e umidade durante mudanças de fertilidade de plantas que contêm tms18.

[019] A Figura 2 mostra resultados de análise fenotípica de plantas sensíveis à temperatura e de tipo selvagem que contêm tms18 em diferentes temperaturas, nas quais porções A-C mostra o fenótipo de plantas de tipo selvagem e mutante tms18 após o direcionamento; a porção D mostra anteras de plantas de tipo selvagem e mutante tms18 após florescimento; porção E mostra anteras de plantas de tipo selvagem e de mutante osacos12 após revestimento de espigueta; a porção H mostra antera única de tipo selvagem e mutante osacos12; a porção F mostra solução de corante Alexander de tipo selvagem e mutante osacos12 anteras; o caractere “H” corresponde ao tratamento de alta temperatura (> 28 °C); o caractere “L” corresponde a tratamento de baixa temperatura (< 23 °C); A escala de comprimento (E-F) é 100 μm; (G) 200 μm.

[020] A Figura 3 mostra os resultados de taxa de colocação de semente de plantas que contém tms18 sob tratamentos em tempo diferente, em que a porção A mostra fenótipos de colocação de semente de mutante tms18 após direcionamento; a porção B mostra a tabela estatística de taxa de colocação de semente de mutante tms18 após direcionamento.

[021] A Figura 4 mostra os resultados de observação citológica de desenvolvimento de antera de tipo selvagem e mutantes tms18 em diferentes temperaturas.

[022] A Figura 5 mostra os resultados de observação de SEM de anteras e pólen de tipo selvagem e mutantes tms18 em diferentes temperaturas, em que porções F e K mostra os resultados de observação de SEM de anteras de tipo selvagem e que contêm materiais de tms18 em alta temperatura e baixa temperatura respectivamente; as porções B, G e L mostra os resultados de observação de microscópio de elétron de varredura de estrutura de amplificação de antera de tipo selvagem e materiais de tms18 em alta temperatura e baixa temperatura, respectivamente; as porções C, H e M mostram os resultados de observação de SEM da estrutura de tipo selvagem e materiais de tms18 após rachadura de antera em alta temperatura e baixa temperatura, respectivamente; as porções D, I e N mostram os resultados de observação de SEM de pólen maduro de material de tipo selvagem e tms18 em alta temperatura e baixa temperatura, respectivamente; as porções E, J e O mostram os resultados de observação de SEM de estrutura de amplificação de pólen maduro de tipo selvagem e materiais de tms18 em alta temperatura e baixa temperatura, respectivamente; HT corresponde ao tratamento de alta temperatura (> 28 °C); LT corresponde ao tratamento de baixa temperatura (< 23 °C); A. As escalas em F e K são 200 μm, em B, G, L, D, I e N são 10 pm, e em C, H, M, E, J e O são 1 μm.

[023] A Figura 6 mostra os resultados de observação de TEM de pólen de tipo selvagem e mutante tms18 em diferentes temperaturas;

[024] em que as porções A-E mostram os resultados de observação de microscópio de elétron de transmissão de pólen de Anteras de tipo selvagem do estágio 7 ao estágio 10 e estágio 12; as porções F-J mostram os resultados de observação de microscópio de elétron de transmissão de pólen de antera de mutante tms18 do estágio 7 ao estágio 10 e estágio 12 sob alta temperatura; as porções K-O mostram o resultado de observação de TEM de pólen a 7a a 10a e 12a anteras de mutante tms18 sob baixa temperatura; a figura pequena à direita de cada Figura é o resultado ampliado da Figura. HT corresponde ao tratamento de alta temperatura (> 28 °C); LT corresponde ao tratamento de baixa temperatura (< 23 °C). AP representa anormal pólen; Ba representa a estrutura de haste; E representa epiderme de antera; EN representa endotélio de antera; Ex corresponde à parede de pólen; Msp corresponde ao micrósporo; Ne representa a camada interna da parede externa; PE representa a parede externa primária; Se representa a camada externa da parede externa; T corresponde à camada de feltro; TDS corresponde a tétrade.

[025] A Figura 7 mostra a espessura da parede externa de pólen II de tipo selvagem e mutante tms18 em diferentes temperaturas. Na Figura, a espessura da parede externa de pólen II do tipo selvagem e mutante tms18 em diferentes temperaturas nos estágios 9, 10 e 12, respectivamente. Os dados na Figura são o desvio padrão ± médio, e cada grupo de dados é 4 réplicas biológicas. P<0,05;

[026] A Figura 8 mostra os resultados de localização de clone e análise de sequência de gene tms18, em que a porção A mostra o resultado de localização inicial de marcador molecular Indel em cromossomo de arroz 12. A porção B representa a verificação de complementaridade genética de mutante tms18. A porção C mostra o sequenciamento e análise de localização de SNP de gene tms18.

[027] A Figura 9 mostra os resultados de análise de árvore evolucionária de proteína homóloga de tms18 e seus locais conservados, em que a porção A mostra o resultado de análise de árvore evolucionária de tms18 e seus genes homólogos lineares dentre diferentes espécies pelo método de adjacência; No processo de cálculo de modelo, o valor de autodesenvolvimento de árvore evolucionária é 1000; a porção B mostra o resultado de análise de local conservativo de proteína homóloga de tms18.

[028] A Figura 10 mostra os resultados de análise de PCR semiquantitativa de gene tms18 em diferentes tecidos de arroz, que mostra a análise semiquantitativa de gene tms18 e gene OsACTIN de referência interna em diferentes tecidos. Le representa lema; PA representa palea; L2.5 representa que o comprimento de gluma é 2,5 mm; L3.0 representa que o comprimento de gluma é 3,0 mm; L4.0 representa que o comprimento de gluma é 4,0 mm; e L5.0 representa que o comprimento de gluma é 5,0 mm.

[029] A Figura 11 mostra os resultados de análises de localização de proteína florescente de tms18-gfp em anteras de arroz.

[030] A Figura 12 mostra os resultados de análise comparativa de diferente proteína mutante de local de sequência de aminoácidos de tms18 e tipo selvagem, no qual "1" é a posição de mutação de aminoácido de proteína de linhagem estéril masculina gênica termossensível nesse experimento; "2" é a posição de esterilidade masculina completa após mutação de aminoácido de proteína conforme descrito em Chang et al, 2016.

[031] A Figura 13 mostra os resultados de experimento de complementaridade de gene.

MODALIDADES

[032] A invenção é descrita em detalhes abaixo em combinação com os desenhos anexos e suas modalidades, mas o escopo de proteção da invenção não é limitado ao escopo descrito nas modalidades.

[033] Os inventores tomaram a Oryza sativa ssp. japonica, ZH11 como o material, submetido à triagem com metanossulfonato de etila (EMS) para obter o material vegetal de linhagem estéril masculina gênica termossensível TMS18, e obtiveram o mutante tms18 estéril masculino termossensível no experimento. A sequência de genes do mutante é mostrada na SEQ ID No.1 (incluindo éxons e íntrons), e a sequência de aminoácidos editada é mostrada na Figura 12. O processo experimental específico é descrito em detalhes abaixo.

MATERIAIS VEGETAIS E SEU PROCESSO DE PLANTIO

[034] Nessa modalidade, o arroz material usado é a variedade de arroz tipo japônica ZH11. Em referência a Zhang et al. 2007 (Zhang ZB, Zhu J, Gao JF, et al. O fator de transcrição AtMYB103 é necessário para desenvolvimento de antera pela regulação de desenvolvimento de tapetum, dissolução de calose e formação de exina em Arabidopsis. Plant Journal, 2007, 52: 528-538), mutantes de EMS são induzidos e submetidos à triagem. Durante a triagem, as plantas mutantes que contêm o mutante tms18 estéril masculino termossensível da SEQ ID No.1 foram acidentalmente obtidas.

[035] Os inventores polinizaram e hibridizaram a planta estéril macho homozigótica recessiva que contêm o mutante tms18 como o precursor fêmea (doador de óvulo) e a variedade de arroz alvo como o precursor macho (doador de pólen) em alta temperatura, e obtiveram sementes F1. Então, os inventores cultivaram as sementes F1 para obter as plantas F1. As plantas F1 foram autopolinizadas para obter as sementes F2. Nas plantas F2, aquelas plantas com locais homozigóticos recessivos de tms18 foram submetidos à triagem.

IDENTIFICAÇÃO DE CARACTERÍSTICAS SENSÍVEIS À TEMPERATURA DE TMS18

[036] Nesse exemplo, de 18 de maio de 2018, 24 cópias de três tipos de arroz são cultivados por semana, ou seja, arroz de tipo selvagem ZH11, arroz de linhagem estéril masculina de Annong S-1 e mutante tms18 que contém arroz, e obter mudas correspondentes. Depois que as mudas já foram cultivadas e alcançam uma determinada altura, as mudas foram inseridas no campo de Fengxian em Shanghai (um lugar da China) para plantio. De 26 de julho a 1 de agosto, a temperatura média em Shanghai alcançou o ponto mais alto, cerca de 30,5 °C, e o primeiro lote (germinado em 18 de maio) alcançou estágio de treinamento (estágio de desenvolvimento de pólen). Visto que as plantas de tms18 foram tratadas em alta temperatura, após o florescimento e autopolinização de materiais de planta de tms18, as mesmas mostraram esterilidade quase completa devido ao fato de que não há pólen (conforme mostrado na Figura 2). No oitavo lote de materiais (plantas) (Germinação em 6 de julho), visto que o tempo de treinamento foi cerca de 10 de setembro, a temperatura média em Shanghai caiu para 26,5 graus, o desenvolvimento de pólen retornou parcialmente ao normal devido à baixa temperatura, e a fertilidade de materiais autorreproduzidos das plantas foi parcialmente restaurada. Verifica-se que a esterilidade de alta temperatura de planta de tms18 é melhor do que a de Annong S-1 (o nome de outro tipo de arroz).

ANÁLISE CITOLÓGICA

[037] As fatias de antera em diferentes estágios de desenvolvimento (crescimento) de arroz foram fotografadas com câmera digital Olympus dx51. Os estames frescos e grãos de pólen foram envoltos com partículas de ouro de 8 nm para triagem por microscopia de elétron, e observado por microscópio JSM-840. Para o experimento de microscópio de elétron de transmissão, as espiguetas de arroz foram fixadas em gelo na solução fixada (0,1 M de tampão de fosfato que contém glutaraldeído a 2,5%, pH 7,2). Materiais de espigueta são adicionalmente incorporados em resina (resina de incorporação 'hard plus', Reino Unido). Seções ultrafinas (50-70 nm) foram observadas por microscópio de elétron de transmissão jem-1230 (jeol, Japão).

EXTRAÇÃO DE RNA E RT-PCR QUANTITATIVO

[038] RNA foi extraído de tecido de espigueta de plantas de arroz cultivadas de solo maduro por reagente Trizol (Invitrogen, E.U.A). Com uso de iniciadores de poli DT (12 - 18); com uso de transcriptase reversa de MMLV e reagentes correspondentes transcrevem RNA e obtêm a primeira sequência de cDNA (60 minutos, 42 °C). A sequência de cDNA sintetizada foi usada como um modelo para PCR. SYBR Green I master mix (Toyobo, Japão) foi usado para detecção de RT-PCR quantitativa através de sistema ABI prism 7300 (Applied Biosystems, E.U.A). Os parâmetros de programa de RT-PCR quantitativos foram: 95 °C por 5 minutos, 94 °C por 10 segundos, desnaturação por 40 ciclos, hibridização a 60 °C por 1 minuto. β- Actina foi usada como controle.

[039] Deve-se notar que os materiais vegetais na invenção são cultivados solo fértil. Os tratamentos de alta temperatura e baixa temperatura são realizados em estufa de vidro e sala de iluminação com inteligência artificial. A temperatura de tratamento de alta temperatura é, em geral, no verão ou no ambiente com uma temperatura média maior do que 28 °C. o tratamento de baixa temperatura é geralmente no outono ou sob a condição de uma temperatura média de 22-24,5 °C.

[040] Conforme mostrado nas Figuras, conforme comparado ao tipo selvagem, a nutrição e desenvolvimento de mutante tms18 foi normal sem diferença significativa (Figura 2 A-C). As plantas Tms18 mostraram que esterilidade masculina sob alta temperatura (> 28 °C) (Figura 1), e a fertilidade de plantas de tms18 poderiam ser restauradas sob baixa temperatura (< 23 °C) (Figura 1). Após o florescimento, as anteras de mutante plantas de tms18 não dispersam pólen em alta temperatura, mas o pólen nas anteras de mutante plantas de tms18 foi normal em baixa temperatura (Figura 2D). Através da observação de espiguetas de plantas de tipo selvagem e mutante tms18, foi constatado que não há diferença significativa em lema e palea, mas as anteras de planta do tipo selvagem foram cheias e amarelas, enquanto as anteras de mutante plantas de tms18 obviamente encolheram e se tornaram menores em alta temperatura e retornaram ao estado cheio em baixa temperatura (Figura 2 E-F). Resultados de cloração de Alexander de anteras mostraram que pólen de tipo selvagem acumulou conteúdos ricos e se mostraram vermelho arroxeado, enquanto nenhum grãos de pólen colorado em vermelho arroxeado poderia ser visto no mutante tms18 em alta temperatura, mas retornou ao normal em baixa temperatura, indicando que o desenvolvimento de antera de mutante tms18 foi afetado por temperatura, e baixa temperatura poderia se formar para o defeito de desenvolvimento de gametófito masculino em mutante tms18.

[041] De modo a verificar a resposta a diferentes temperaturas de tms18, os inventores plantaram o mutante tms18 em diferentes períodos de tempo. O tempo de plantio é de 1 de julho a 15 de setembro. O plantio de germinação é realizado a cada duas semanas para observar a recuperação de fertilidade. Conforme mostrado na Figura 3, todos os materiais de tms18 transplantados antes de meados de julho mostrou fenótipo de esterilidade completa, e alguma fertilidade dos materiais transplantados no começo de agosto recuperados, com uma taxa de recuperação de cerca de 10%. Com o adiamento do tempo de transplante, a fertilidade do material de tms18 sob baixa temperatura natural pode ser basicamente similar ao de material de tipo selvagem, a espigueta pendente é óbvia, e a taxa de colocação de semente é cerca de 90%. Os resultados mostraram que tms18 teve melhor recuperação de fertilidade sob temperatura apropriada.

ANÁLISE DE MECANISMO:

[042] Os inventores constataram que baixa temperatura pode formar os defeitos de desenvolvimento após liberação de tétrades do mutante tms18 (expressões similares neste pedido se referem à planta/material de arroz que contém o gene tms18. A planta mutante de tms18 cultivado pelo inventor é obtida através de experimentos. Os elementos versados na técnica podem introduzir o gene mutante tms18 na planta de arroz com uso de métodos de introdução de Agrobacterium existentes de acordo com a sequência de genes fornecida pela invenção).

[043] De modo a analisar as mudanças e diferenças de antera e desenvolvimento de pólen de plantas que contém tms18 em diferentes temperaturas, as espiguetas jovens e floretes de tipo selvagem ZH11 e mutantes tms18 com comprimento de antera de 1-5,6 mm foram observadas por seções semifinas. Os resultados de seções semifinas de plantas de tipo selvagem e mutante tms18 sob alta temperatura mostraram que do estágio 6 ao 8, o desenvolvimento de anteras poderia passar normalmente por meiose e formar tétrades, e não houve diferença significativa entre os dois tipos de plantas (Figura 4 a-c e G-I). As células de tapetum de tipo selvagem se formaram no estágio precoce e começaram PCD normal no 9° estágio. O micrósporo também se desenvolveu e expandiu. A deposição de esporopólen na parede de pólen foi relativamente densa, e o desenvolvimento de pólen foi normal (Figura 4D). No 10° estágio, micrósporos de desenvolvimento de tipo selvagem normalmente e concentraram para formar estrutura crescente, células de tapetum continuaram a se degradaram, então se desenvolveram em pólen maduro, e finalmente formaram grãos de pólen cheios e normais (Figura 4 E-F). Sob alta temperatura, o tapetum de mutante tms18 basicamente não mudou significativamente no estágio precoce, mas o desenvolvimento de pólen foi anormal no estágio maduro posterior, e finalmente mostrou ruptura e não poderia formar grãos de pólen normais (Figura 4, K-L). Sob baixa temperatura, o desenvolvimento de pólen e células de tapetum de mutante tms18 foi normal, e pólen normal poderia ser formado (Figura 4 M-R).

[044] De modo a conhecer melhor o desenvolvimento de antera e pólen de mutante tms18, o inventor observou a superfície externa e a superfície interna de antera e a estrutura de superfície de pólen por triagem de microscópio de elétron. Sob a triagem de microscópio de elétron, o desenvolvimento de anteras de tipo selvagem normalmente e mostrou tipo cheio, enquanto as anteras de mutante tms18 foram relativamente pequenas e murchas em comparação com o tipo selvagem em alta temperatura, e retornaram ao normal em baixa temperatura (Figura 5a, F e K). No estágio posterior de desenvolvimento de antera, estruturas cerosas e córneas reticulares apareceram na superfície de desenvolvimento normal do tipo selvagem. Não houve diferença significativa na superfície de antera do mutante tms18 em baixa e alta temperatura (Figuras 5b, G e L). Através da observação da estrutura da parede interna de antera, foi constatado que houve estruturas globulares mais densas na parede interna de antera de tipo selvagem e mutante tms18 seja em alta ou baixa temperatura (Figura 5C, h e m), mas o pólen na antera de mutante tms18 mostrou um fenótipo de encolhimento em alta temperatura. Adicionalmente, em comparação com a estrutura densa de tipo selvagem parede externa de pólen, a estrutura de mutante tms18 parede externa de pólen tem defeitos que indicam rachadura e encolhimento óbvio (Figura 5, D-E, I-J, e N-O). Isso indica que mutação de gene tms18 não afeta a epiderme externa e superfície interna de anteras, mas causará o fenótipo defeituoso de parede externa de pólen.

[045] De modo a assegurar adicionalmente a condição de parede externa de pólen de mutante tms18 em alta e baixa temperatura, os inventores observaram os micrósporos de estágios de antera 7-10 e 12 por microscópio de elétron de transmissão. Os resultados mostraram que, no 7° estágio de Desenvolvimento de Antera (estágio de tétrade), os micrósporos de mutante tms18 e tipo selvagem foram circundados por calose em diferentes temperaturas, e não há diferença significativa entre os mesmos (Figura 6a, F e K). Então os micrósporos foram liberados de calose e entraram no 8° estágio. De acordo com a observação de estrutura de parede externa de pólen nesse estágio, foi constatado que a deposição de esporopólen apareceu gradualmente na parede externa de pólen de tipo selvagem pólen que foi relativamente densa, enquanto a parede externa de pólen deposição de esporopólen de mutante tms18 foi menor em alta temperatura, enquanto a parede externa de pólen deposição de esporopólen se recuperou em baixa temperatura (Figura 6B, G e L). Na fase 9, o tipo selvagem micrósporo expandiu e se ampliou, e a estrutura da parede externa de pólen basicamente se formou, mostrando um formato similar ao caractere "工". A parede externa de pólen de micrósporo de mutante tms18 pode também mostrar uma estrutura em formato de "工" sob tratamento de alta temperatura, mas sua estrutura de segunda camada interna se tornou significativamente mais fina, e houveram algumas fraturas óbvias no interior (Figura 6C, H e M). No 10° estágio, o micrósporo entrou na estrutura crescente. Em alta temperatura, a estrutura defeituosa da segunda camada da parede externa de pólen pode ainda ser observada, enquanto em baixa temperatura, sua espessura ainda não se recuperou, mas sua rachadura desapareceu (consultar as Figuras 6, D, I e N). No estágio posterior de desenvolvimento de antera (crescimento), o tipo selvagem pode formar normalmente pólen fértil, enquanto o mutante tms18 tem defeitos na estrutura de parede externa de pólen em alta temperatura, e finalmente pode não formar pólen normalmente, mas pode formar grãos de pólen maduro em baixa temperatura. Isso mostra que a sensibilidade à temperatura de mutante tms18 é relacionada ao defeito estrutural da segunda camada de parede externa de pólen (Figura 6, e, J e o). A estrutura de segunda camada da parede externa de pólen nos 9°, 10° e 12° estágios de desenvolvimento de pólen foi estatisticamente analisada por software Image J. Nos 9°-10° estágio de desenvolvimento de pólen, micrósporos entraram no estágio de rápida expansão e estágio de concentração. Sob tratamento de alta temperatura, a espessura da segunda camada de parede externa de pólen de mutante tms18 foi significativamente mais fina, que foi significativamente reduzida em 60,7% e 61,2% em comparação com o tipo selvagem, respectivamente. No 10° estágio de desenvolvimento de pólen, o micrósporo entrou na estrutura crescente. O mutante tms18 mostrou diferença significativa sob alta temperatura e baixa temperatura, a alta temperatura de micrósporo foi 32,7% menor do que aquele sob baixa temperatura. Quando o desenvolvimento de pólen está no estágio maduro, o pólen sob tratamento de alta temperatura ainda está quebrado, enquanto o pólen normal pode ser formado sob tratamento de baixa temperatura, mas não há diferença significativa na espessura entre os dois. Os resultados acima mostram que a temperatura tem uma ampla influência no desenvolvimento de pólen de mutante tms18, principalmente no 9° estágio (estágio de expansão de micrósporo) e no 10° estágio (estágio crescente), e após o estágio de meiose da célula mãe de micrósporo. Os genes com essa característica não foram relatados ainda.

GENE TMS18 CODIFICA FAMÍLIA DE COLINA DE METANOL DE GLICOSE (GMC) OXIDOREDUCTASES

[046] Com base no sequenciamento de SNP de genoma inteiro, os inventores constataram que há uma mutação de base de G a A em 183bp do segundo éxon de gene tms18, que causa a mutação de glicina codificada pelo Zhonghua 11 de tipo selvagem em serina (Figura 8C).

[047] O inventor realizou adicionalmente análise de verificação com uso de experimento de complementaridade genética.

[048] Os fragmentos de gene alvo, incluindo região promotora a montante e região a jusante, foram clonados e transformados em sementes de arroz incluindo tms18, que são Híbridos, para realizar o cultivo de plantas transgênicas.

[049] Especificamente, o uso de plantas de tipo selvagem como modelos, o cDNA de genes sensíveis à luz e temperatura foi amplificado com iniciadores específicos, então construídos em Blunt através de vetor intermediário. Os resultados construídos foram amplificados em grandes quantidades, e então construídos em 1300-eGFP através de locais de digestão BamHI e SalI. O vetor que contém plasmídeo e eGFP foi transformado em Agrobacterium EHA105, e então infectou as sementes heterozigóticas dos mutantes correspondentes para obter plantas transgênicas complementares. As plantas complementares mostraram um fenótipo fértil normal em alta temperatura, e os resultados são mostrados na Figura 13.

[050] A depositante identificou as 13 linhagens transgênicas (em que 6 dos mesmos incluem tms18/tms18, isto é, ambas as sequências duplas de cromossomos contêm tms18). Em ambiente de alta temperatura (maior do que 29 °C), essas plantas restauraram a fertilidade e formaram sementes normais em comparação ao tms18 não transgênico/planta de tms18. A Figura na triagem de microscópio de elétron também mostrou que o pólen de plantas transgênicas retornou ao normal e não houve diferença significativa entre tipo selvagem e plantas transgênicas (Figura 8B).

[051] O gene TMS18 codifica uma proteína com 587 aminoácidos e cerca de 65 kDa. A análise estrutural mostra que TMS18 proteína pertence a um membro de família de colina de metanol de glicose (GMC) oxidoreductase, em que a família existe amplamente em animais, plantas e micro-organismos, incluindo glucose oxidase e piranose oxidase (Wongnate e Chaiyen, 2013).

[052] Na planta mutante de tms18, o micrósporo retraiu após o estágio de tétrade, indicando que o gene é amplamente relacionado à formação de parede externa de pólen.

MECANISMO MOLECULAR DE LINHAGEM ESTÉRIL MASCULINA GÊNICA TERMOSSENSÍVEL DE TMS18

[053] Através de observação comparativa da planta que contém gene de tipo selvagem e gene mutante, é constatado que o gene mutante sensível à temperatura da invenção é especificamente expresso em anteras. A única mutação de base do gene causou o afinamento da segunda camada de parede externa de pólen em alta temperatura, resultando no fenótipo de esterilidade termossensível.

VALOR DE APLICAÇÃO POTENCIAL DE LINHAGEM ESTÉRIL MASCULINA GÊNICA TERMOSSENSÍVEL DE TMS18

[054] Atualmente, o período sensível de fertilidade de da maioria das linhagens estéreis masculinas fotossensíveis existentes, tais como Photosensitive Genic Male Sterile Lines Nk58s e Ans-1, é antes o período de tétrade meiótico. No entanto, não há relatório correspondente nos materiais para os quais período sensível de fertilidade está no estágio posterior de meiose, então o gene da presente invenção tem um prospecto de aplicação satisfatório.

[055] Na invenção, o período de expressão de gene de linhagem estéril masculina termossensível de tms18 está principalmente no estágio intermediário e posterior de antera, e a parede externa do pólen se torna mais fina no 9o-11o estágio de desenvolvimento de pólen. Isso significa que a linhagem estéril masculina gênica sensível à temperatura pode ser afetada por temperatura, e o período sensível pode ser após o período de meiose da célula mãe de pólen.

[056] Visto que linhagens estéreis masculinas gênicas termossensíveis de tms18 são principalmente afetadas por temperatura no estágio posterior. Portanto, isso pode ser usado para solucionar o problema de fácil recuperação de onda de baixa temperatura no verão encontrado em produção de semente. Isso pode ser usado para hibridizar com linhagens estéreis masculinas gênicas sensíveis à temperatura e construir mutantes duplos para prolongar o período afetado por sensibilidade à temperatura, de modo a tentar solucionar alguns problemas de segurança na produção de semente.

[057] A sequência de aminoácidos do mutante tms18 da invenção é alterada principalmente de glicina para serina na extremidade N da proteína, e outras posições não são alteradas.

[058] Em conclusão, o inventor do presente pedido clonou e obteve o gene tms18 da família de colina de metanol de glicose (GMC) oxidoreductase em arroz, e constatou que o gene mutante mostrou o fenótipo de esterilidade masculina fototermossensível, que não estava no mesmo local que a linhagem estéril masculina gênica fototermossensível atualmente usada na produção. A análise citológica mostrou que a integridade da segunda camada de parede externa de pólen de mutante tms18 teve defeitos de afinamento e fratura óbvios, que causaram a ruptura e aborto de pólen no estágio de rápida expansão. No entanto, a ruptura de parede externa de micrósporo recuperada em uma determinada extensão sob tratamento de baixa temperatura. Análise adicional mostrou que proteína de tms18 foi secretada por células de tapetum e especificamente localizadas em tapetum, antera e superfície de pólen. Os dados de pesquisa do inventor mostram que tms18, como uma nova linhagem estéril masculina gênica sensível à temperatura, seu período sensível à fertilidade é principalmente após meiose de célula mãe de pólen, que é diferente dos materiais sensíveis à luz e temperatura relatadas no presente, e tem valor aplicação significativo.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
<110> Universidade Normal de Shanghai
<120> Gene mutante tms18 estéril macho termossensível de arroz e usos do mesmo
<160> 1
<210> 1
<211> 2191
<212> DNA
<213> tms18
<400> 1
atggcagcac ttggccgcgc gagctcgtcg gcgccggtgc ttgccgccgc cgccgccgtg 60
ctcctctcgc tctgcctcgc cgcgctctcg gaagagcaag gtgcgtaaac gttgcgttgt 120
atctttgcgt tgatgcgtgt tgcgtcgtcg tcgtgttcat ggcgtgcgat ggcgttgtgc
180 agagcaactg gagaacctgc ggttcgtgcg gcacgcgcag gacgcgccgc tggtgtcgag 240
ctacaactac atcgtcatcg gcggcggcac ggcggggtgc ccgctggcgg cgacgctgtc 300
ggagcactcg cgcgtgctgc tgctggagcg cggcggcctg ccgtacgcca acatgtcgag 360
cgagcagcac ttcacggacg cgctggccga cacgtcgccg gcgtcgccgg cgcagcggtt 420
catctcggag gacggcgtgg tgaacgcccg ggcgcgggtg ctcggcggcg ggagctgcct 480
caacgccggg ttctacacgc gggcgagcaa cgagtacgtg cgcgcctccg ggtgggacgc 540
gcggctggtg aactcgtcgt accggtgggt ggagcgctcg ctggtgttcc gccccgacgt 600
gccgccgtgg caggcggcgc tccgcgacgc gctgctcgag gtcggcgtca cgcccgacaa 660
cggcttcacc ttcgaccacg tcaccggcac caagatcggc ggcaccatct tcgacaactc 720
cggccagcgc cacaccgccg ccgacttcct ccgccacgcc cgcccccgcg gcctcaccgt 780
cctcctctac gccaccgtct cccgtatcct cttcaaaagc caaggtacac agctacgatg 840
aaaatggaaa atgtgctgtg cgccgaagaa gcttgacctc acgacggcga gcttttgcca 900
tggcgtgcag acggggtgcc gtacccggtg gcgtacgggg tggtgttctc ggacccgctg 960
ggggtgcagc accgggtgta cctccgcgac ggcgacaaga acgaggtgat cgtgtcggcg 1020
gggacgctgg ggagcccgca gctgctgatg ctgagcggcg tcgggccgca ggcgcacctg 1080
gaggcgcacg gcatcgaggt gatcgtggac caacccatgg tcgggcaggg cgtcgccgac 1140
aacccgatga actcggtgtt catcccgtcg ccggtgccgg tggagctctc cctggtgcag 1200
gtcgtcggca tcacccgctc cggcagcttc atcgaggggg tgagcgggtc ggagttcggc 1260
atgccggtgt cggacggcgc gctccggtgg gcgcgcagct tcgggatgct gtcgccgcag 1320
acggggcagc tcggcacgct gccgccgaag cagaggacgc cggaggcgct gcagcgggcg 1380
gcggaggcga tgatgcggct ggacaggagg gcgttccggg gaggcttcat cctggagaag 1440
atcctcgggc cggtgtcctc cggccacgtc gagctgcgaa ccaccgaccc gagggcgaac 1500
ccgtcggtga cgttcaacta cttccgcgag gcagaggatc tggagcggtg cgtccatggc 1560
atcgagacga tcgagcgggt gatccagtcg cgggccttct ccaacttcac ctacgccaac 1620
gcctccgtcg agtccatctt caccgattcc gccaacttcc ccgtcaacct gctgccgcgc 1680
catgtcaacg actcgcgctc gccggagcag tactgcatgg acaccgtcat gaccatctgg 1740
cactaccacg gcggctgcca tgtcggcgcc gtcgtcgacg acgattaccg ggtgttcggg 1800
gtgcaggggc tcagggtgat cgacagctcc accttcaagt actcccccgg caccaaccct 1860
caggccaccg tcatgatgct cggcaggtaa ctggcatcat tttagctcat gaaagtgcat 1920
tgccatgagt aacaacacac taacagtata gttttcaata tggacactgg gcaggtatat 1980
gggtgtgaag attcagtccg agagatggaa gaaatgatga acaaaagata atttcgtttc 2040
aggagcaaaa aaatgcatgt aattcaagga aaagaaaatg ttcaactgtc tttagagttt 2100
agagtagatt ttatttgcac ccacttaatt tttactcttc tctagacata ggttcagtat 2160
ctgcttgttg attatgtaac cttgaagaag c 2191

Claims

SEMENTE TRANSGÊNICA PARA UMA PLANTA DE CULTURA caracterizada pelo fato de que o genoma da dita semente transgênica compreende um gene mutante tms18 estéril macho termossensível de arroz da SEQ ID No.1.
MÉTODO PARA CULTIVAR ARROZ TRANSGÊNICO, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que inclui introduzir um gene mutante tms18 estéril macho sensível à temperatura de arroz da SEQ ID No.1 em células de semente de arroz, com uso das células de semente de arroz para cultivar sementes de arroz, e plantar as sementes de arroz para obter o arroz.
MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que é usado para cultivar arroz recuperável em fertilidade, cuja fertilidade pode ser recuperada por tratamento de baixa temperatura.
MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a temperatura para tratamento de baixa temperatura é menor do que 23 °C.
MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o tratamento de baixa temperatura é realizado no arroz após sua meiose de célula mãe de pólen.
MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que é usado para cultivar plantas transgênicas Estéreis Macho Recessivas.
MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende: usar uma planta estéril macho homozigótica recessiva que contém o mutante tms18 como um precursor fêmea e usar um arroz alvo como um precursor macho, sendo o precursor fêmea hibridizado com precursor macho em alta temperatura, para obter sementes de geração de F1; cultivar as sementes de geração de F1 para obter as plantas de geração F1; autopolinizar as plantas de geração F1 para obter as sementes de geração F2; e realizar triagem de plantas estéreis macho de plantas de geração F2 cultivadas pelas sementes de geração F2.
USO DO GENE MUTANTE TMS18 ESTÉRIL MACHO TERMOSSENSÍVEL DE ARROZ DA SEQ ID NO.1 caracterizado pelo fato de que o gene mutante tms18 estéril macho de arroz é usado como um marcador de seleção de plantas transgênicas fazendo-se uso de sua característica de fertilidade sensível à temperatura reversível.