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Verfahren zur Herstellung des neuen 5-Nitro-2'-deoxyuridins
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer neuen viroziden Substanz, nämlich des 5-Nitro-2'- deoxyuridins der Formel
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Stoffe mit ähnlicher Struktur, wie 5-Jod-2'-deoxyuridin.
Ein Ziel der Erfindung ist die Erstellung eines Verfahrens für die Herstellung von 5-Nitro-2'-deoxyuridin in technisch verwertbaren Ausbeuten.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung des neuen 5-Nitro-2'-deoxyuridins der Formel
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besteht nun darin, dass eine wässerige Lösung, die 5-Nitrouracil in Thymidin in einem Verhältnis von 10 : 1 bis 1 : 10 enthält, in Gegenwart eines aktiven Enzyms, welches dadurch gewonnen wird, dass man Lactobacillus Leichmannii in einem Kulturmedium, welches Kohlenstoff in assimilierbarer Form, Stickstoff in assimilierbarer Form und Mineralsalze in Mengen, die für Fermentationsverfahren üblich sind, enthält, fermentiert und das gebildete Enzym abtrennt, 2 - 5 h bei einem pH zwischen etwa 6 und 7 bei 30 - 400 C inkubiert wird.
Es sind bisher zwei Stämme Lactobacillus Leichmannii, u. zw. ATCC 7830 und ATCC 4797 bekannt, die sich beide gleich gut für das erfindungsgemässe Verfahren eignen.
Nach dem Ende der Fermentation werden die Zellen des Mikroorganismus z. B. durch Zentrifugieren isoliert und desintegriert, um das Enzym, welches darin enthalten ist, freizusetzen. Für diesen Zweck kann zweckmässig ein Ultraschall-Desintegrator verwendet werden, der auf eine gepufferte Suspension der Zellen zur Einwirkung gebracht wird. Das Enzym geht in Lösung und kann nach Abtrennung der zelluläre Debris bei niederen Temperaturen in gefrorenem Zustand aufbewahrt werden.
Für die enzymatische Reaktion wird 5-Nitrouracil mit dem Enzym in Gegenwart von Thymidin inkubiert. Im Verlauf dieser Inkubation wird die Deoxyribosegruppe des Thymidins auf das 5-Nitrouracil übertragen, wobei 5-Nitro-2'-deoxyuridin erhalten wird. Die Inkubation wird innerhalb von 2 - 5 h zwischen etwa 30 und 400 C und vorzugsweise 370 C mit einer gepufferten Lösung (PH zwischen etwa 6 und 7) durchgeführt, welche Thymidin und 5-Nitrouracil in wechselnden Verhältnissen zwischen 10 : 1 und 1 : 10 und ein geeignetes Volumen des oben beschriebenen Roh-Enzympräparates enthält. Nach Beendigung der Inkubation kann das 5-Nitro-2'-deoxyuridin nach verschiedenen Verfahren, vorzugsweise chromatographisch isoliert werden.
Während in den Beispielen die Isolationsverfahren genauer beschrieben werden, sei bei dieser Gelegenheit darauf hingewiesen, dass in diesem speziellen Fall für die Chromatographie Wasser ein gutes Lösungsmittel ist. Die Eigenschaften des erhaltenen Produktes werden in Beispiel 1 angeführt.
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<tb>
<tb> Fleischextrakt <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Pepton <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Hefeextrakt <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Enzymatisch <SEP> hydrolysiertes <SEP> Kasein <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Lactose <SEP> 20 <SEP> g
<tb> NaCl <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Wasser <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> End-pH <SEP> 7,3
<tb>
welche in 100 ml Portionen auf 500 ml Erlenmeyerkolben verteilt waren, wurden mit der Kultur von Lactobacillus Leichmannii ATCC 4797, die in einem microinoculum medium gezüchtet worden waren, geimpft und 10 h bei 370 C auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert.
Die durch Zentrifugieren gewonnenen Zellen wurden mit einem M/15 Phosphatpuffer (PH 6,5) gewaschen und nach einer weiteren Zentrifugierung bei mässiger Beschleunigung (5000 g) nochmals in 20 ml des erwähnten Phosphatpuffers suspendiert. Diese Suspension wurde mit einem Ultraschall-Deintegrator behandelt und die erhaltene zelluläre Debris 10 min bei 10000 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit stellt das rohe Enzympräparat dar und wird bei-400 C in gefrorenem Zustand aufbewahrt.
Für die enzymatische Reaktion wird eine Lösung von 0,5 g Thymidin, zu der 0, 1 g 5-Nitrouracil zugefügt werden und 50 ml des rohen Enzympräparates mit M/15 Phosphatpuffer (PH 6,5) auf 500 ml aufgefüllt. Die Lösung wird 3 h bei 370 C inkubiert, auf einem Wasserbad zur Koagulierung der Proteine erhitzt und zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird im Vakuum bis zur Trockne abgedampft, der Rückstand wird mit 10 x 10 ml heissem Äthanol extrahiert und die vereinigten Extrakte im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in der minimal erforderlichen Menge Wasser aufgelöst.
Diese Lösung wird an einer 4 x 30 cm Kolonne mit Dowex-Formiat, welches mit 0, 1 M Ammoniumformiat bei einem PH von 6,0 ins Gleichgewicht gebracht worden war, chromatographiert. Durch den
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Puffer wird zuerst das Thymidin, unmittelbar gefolgt vom Thymin, eluiert. Dann wird der PH-Wert auf 3,5 verändert, wobei das 5-Nitro-2'-deoxyuridin eluiert wird. Die Lösung wird im Vakuum bei 400 C zur Trockne eingedampft und zweimal mit absolutem Äthanol eingedampft. Der trockene Rückstand wird dann mit 5 X 30 ml Äthanol extrahiert und die vereinigten Extrakte bei 400 C im Vakuum eingedampft, wobei ein farbloses Öl erhalten wird, welches beim Stehen fest wird.
Letzteres wird in 20 ml Äthanol gelöst und auf ein kleines Volumen eingedampft, wobei sich nach einigem Stehenlassen 5-Nitro-2'-deoxyuridin abscheidet.
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<tb>
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Ultraviolettspektren
<tb> pH <SEP> # <SEP> max <SEP> m <SEP> # <SEP> mol
<tb> 1 <SEP> 237 <SEP> 8 <SEP> 600
<tb> 1 <SEP> 305 <SEP> 10 <SEP> 600
<tb> 7,38 <SEP> 323 <SEP> 11 <SEP> 450
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Der Rf-Wert bei der aufsteigenden Dünnschicht-Chromatographie in Äthanol-Ammoniumacetat 7 : 3 (pH 7, 5) beträgt 0,55. Der Rf-Wert bei der absteigenden Papierchromatographie in Na2HPO4-Lösung, die mit Isoamylalkohol gesättigt ist, beträgt 0, 82.
Beispiel 2 : 2 l eines Mediums mit der folgenden Zusammensetzung.
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<tb>
<tb>
Hefeextrakt <SEP> 5 <SEP> g <SEP> DL-Tryptophan <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Dextrose <SEP> 10 <SEP> g <SEP> L-Cystein <SEP> 0,2 <SEP> g
<tb> Natriumacetat <SEP> 10 <SEP> g <SEP> p-Amino-benzoesäure <SEP> 0,001 <SEP> g
<tb> Natriumcitrat <SEP> 10 <SEP> g <SEP> Biotin <SEP> 2 <SEP> y <SEP>
<tb> Enzym.hydrolysiertes <SEP> Glutaminsäure <SEP> 10 <SEP> γ
<tb> Kasein <SEP> 5,6 <SEP> g <SEP> Niacin <SEP> 1000 <SEP> γ
<tb> KHzPO, <SEP> f, <SEP> 3 <SEP> g <SEP> Calciumpantothenat <SEP> 200 <SEP> y <SEP>
<tb> KzHP040 <SEP> 3 <SEP> g <SEP> Pyridoxin <SEP> 200 <SEP> y <SEP>
<tb> MgSO. <SEP> 7 <SEP> HzO <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> g <SEP> Thiamin <SEP> 200 <SEP> y <SEP>
<tb> FeSO. <SEP> 7 <SEP> H <SEP> O <SEP> 0, <SEP> 17 <SEP> g <SEP> Riboflavin <SEP> 400 <SEP> y <SEP>
<tb> Tween <SEP> 80 <SEP> 1 <SEP> g <SEP> Adenin <SEP> 0,01 <SEP> g
<tb> Ölsäure <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g <SEP> Guanin <SEP> 0,01 <SEP> g
<tb> Asparagin <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g <SEP> Uracil <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> g
<tb> MnSO <SEP> 4. <SEP> HzO <SEP> 0, <SEP> 16 <SEP> g <SEP> HO <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb>
die in 100 ml Portionen in 500 ml Erlenmeyerkolben aufgeteilt waren, wurden mit einer Kultur von Lactobacillus Leichmannii ATCC 7830, welche in microinoculum broth (Difco) geimpft und 12 h bei 370 C inkubiert.
Die durch Zentrifugieren bei 5000 g gewonnenen Zellen wurden mit M/30 Phosphatpuffer (PH 6, 5) gewaschen und nach weiterem Zentrifugieren mit der gleichen Beschleunigung in einer genügenden Menge des gleichen Phosphatpuffers suspendiert, um eine Suspension mit einer Lichtdurchlässigkeit von 6, 5% (Klett) zu erhalten. Diese Suspension wurde mittels Ultraschall desintegriert und die erhaltene zelluläre Debris 10 min mit 10000 g zentrifugiert. Die erhaltene Lösung stellt das rohe Enzympräparat dar und wurde bei-400 C in gefrorenem Zustand aufbewahrt.
Für die enzymatische Reaktion wurde eine Lösung von 1 g 5-Nitrouracil, der 0,2 g Thymidin zugefügt worden war, und 80 ml des rohen Enzympräparates mit 0, 25 M Acetat-Puffer (PH 5,8) auf 160 ml
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aufgefüllt. Die Lösung wurde 150 min bei 370 C inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Proteine durch Zugabe von 3 Volumina Äthanol ausgefällt und bei mässiger Beschleunigung abzentrifugiert. Die erhaltene Lösung wurde auf 25 ml im Vakuum konzentriert, filtriert und auf eine 4 x 30 cm Kolonne mit Dowex-1-Formiat, welches mit 0, 1 M Ammoniumformiat, dessen PH auf 6,0 eingestellt worden war, im Gleichgewicht stand, aufgegeben. Bei der Chromatographie wird zuerst Thymidin und darauffolgend Thymin erhalten. Das PH wird dann auf 3,5 verändert, wobei das 5-Nitro-2'-deoxyuridin eluiert wird.
Die Fraktionen wurden gesammelt und bei 400 C im Vakuum auf etwa 50 ml konzentriert. Diese Lösung wurde 16mal mit Wasser gesättigtem n-Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wurde bei 450 C im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 25 ml absolutem Äthanol gelöst.
Diese Lösung wurde im Vakuum langsam auf ein kleines Volumen eingedampft. Nach dem Abkühlen in Eis kristallisiert 5-Nitro-2'-deoxyuridin aus und ergibt 110 mg reines Produkt.
Die virozide Aktivität von 5-Nitro-2'-deoxyuridin wurde in vitro mit andern Deoxynitrosiden verglichen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst. Aktivität von 5-Nitro-2'-deoxyuridin und andern Deoxynitrosiden in vitro.
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<tb>
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Verbindung <SEP> Cytotoxizität <SEP> Vaccina <SEP> H. <SEP> zoster
<tb> 5-Jod-2'-deoxyuridin <SEP> 250 <SEP> y/ml <SEP> 4 <SEP> - <SEP> 2 <SEP> Y/ml <SEP> 1 <SEP> y/ml
<tb> 5- <SEP> Brom <SEP> - <SEP> 2'-deoxyuridin <SEP> 250 <SEP> y/ml <SEP> 4-2 <SEP> y/ml <SEP>
<tb> 5-Chlor-2'-deoxyuridin <SEP> 250 <SEP> y/ml <SEP> 4-2 <SEP> y/ml <SEP>
<tb> 5-Brom-2'-deoxycytidin <SEP> 125 <SEP> y/ml <SEP> 4-2 <SEP> y/ml <SEP>
<tb> 5-Nitro-2'-deoxyuridin <SEP> 500 <SEP> y/ml <SEP> 0, <SEP> 016-0, <SEP> 008 <SEP> y/ml <SEP> 0-1 <SEP> y/ml <SEP>
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5-Nitro-2'-deoxyuridin ist auch gegen den Schafpockenvirus bei der gleichen Konzentration wie für Vaccina aktiv.
Die angegebenen Konzentrationen sind jene, bei denen eine vollständige Hemmung der zytopathischen Wirkung des betreffenden Virus erhalten wird.
Für die Humantherapie kann 5-Nitro-2'-deoxyuridin örtlich, in Form von Salben oder Lösungen, oral oder parenteral verabreicht werden.