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Verfahren zur Herstellung von neuen Corticohormonderivaten
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Derivaten der Corticohormone und insbesondere auf alkalilösliche, monomere Corticohormonderivate der allgemeinen Formel
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Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens werden die neuen Corticohormonderivate durch Umsetzung von Corticohormonen bei Zimmertemperatur oder bei niedrigeren Temperaturen mit einem Phosphorylierungsmittel erhalten, wobei das letztere in Anteilen entsprechend etwa bis 1 Phosphoratom je Molekül der Corticohormone eingesetzt werden ; danach wird das Reaktionsprodukt hydrolysiert und die erhaltene Fällung isoliert.
Durch Verwendung eines Phosphorylierungsmittels, das ein Phosphorisotop enthält, sind die erhaltenen Verbindungen insbesondere als Indikatorsubstanzen für diagnostische und wissenschaftliche Experimente auf Grund der gut definierten Zusammensetzung der kristallinen Derivate gut geeignet.
Es ist überraschend, dass die neuen Derivate, die drei Moleküle des Corticohormons je Molekül Phosphorsäure enthalten, in der Lage sind, Salze und sogar wasserlösliche Alkalisalze zu bilden. Es war nämlich zu erwarten, dass das Herstellungsverfahren zu einem tertiären Phosphorsäureester führen wird, der keine Salze bilden kann. Die entstehenden Derivate sind aber nicht normale Phosphorsäureester, sondern Verbindungen mit intakten Hydroxylgruppen in der 21-Stellung der Corticohormonmoleküle, worin die Hydroxylgruppe in 17-Stellung einen sauren Charakter erhalten hat, der die Salzbildung ermöglicht.
Die neuen Derivate werden aus Corticohormonen hergestellt, die eine Hydroxylgruppe in 17-Stellung, eine Ketogruppe in 20-Stellung und eine Hydroxylgruppe in 21-Stellung aufweisen, wogegen es ohne Bedeutung ist, ob Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Oxogruppe in 11-Stellung, ob eine Doppelbindung nur in der 4, 5-Stellung, wie in Cortison und Hydrocortison, oder auch in der 1, 2-Stellung, wie in Prednison und Prednisolon, vorliegt, und ob das Corticohormonmolekül in der 6- oder 9-Stellung Halogen und eine Methylgruppe in der 16-Stellung enthält, oder ob solche Substituenten nicht vorliegen.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung der neuen Derivate wird die Phosphorylierung in homogener Phase unter Verwendung eines Lösungsmittels, z. B. Pyridin, vorzugsweise im Gemisch mit Benzol, durchgeführt. Bei Umsetzung in homogener Phase beträgt das Verhältnis vorzugsweise 1 Molekül Phosphorylierungsmittel je 2 Moleküle Corticohormon, das nachstehend als theoretisches Verhältnis des Phosphorylierungsmittels bezeichnet wird. In diesem Falle kann es jedoch auch zweckmässig sein, einen geringen perzentuellen Überschuss, z. B. 2 -10% Überschuss, an Phosphorylierungsmittel anzuwenden. Als Phosphorylierungsmittel werden vorzugsweise Phosphoroxyhalid, Phosphorpentahalid oder Thiophosphorylhalid verwendet.
Die Art des Derivates, das sich unmittelbar durch Phosphorylierung mit diesen Phosphorylierungsmitteln bildet, ist unbekannt, die Phosphorylierung in Verbindung mit darauffolgender Hydrolyse kann aber durch die folgenden Reaktionsschemata erläutert werden, wobei das Corticohormonmolekül durch das Zeichen "M" versinnbildlicht wird.
Mit Phosphoroxychlorid :
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Mit Phosphorpentachlorid :
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Die Phosphorylierung kann jedoch auch als Zweiphasenreaktion durch Suspendieren des Corticohormons in einem gegenüber dem Phosphorylierungsmittel inerten Medium, dem ein Lösungsmittel für das Phosphorylierungsmittel zugesetzt wird, und unter Rühren während der Umsetzung durchgeführt werden.
Bei dieser besonderen Ausführungsform kann auch ein Gemisch aus Benzol und Pyridin verwendet werden, wobei das erstere als Suspendierungsmittel für das Corticohormon und das letztere als Lösungsmittel für das Phosphorylierungsmittel dient. Es empfiehlt sich dann, einen grösseren Anteil des Phosphorylierungsmittels, z. B. bis zum Zweifachen der theoretischen Menge, zu verwenden.
Beispiel 1 : In einen Dreihalskolben, der mit Einleitung-un Austrittsrohren für Stickstoff, einem Thermometer und einem dicht eingepassten Rührer ausgestattet ist, werden 45 g Hydrocortison, 796 ml Pyridin und 1080 ml Benzol eingebracht. Mit Pyrogallol gewaschene und mit Calciumchlorid getrockneter Stickstoff wird durch den Kolben geführt. Der letztere wird in ein Kühlbad aus Wasser und Eis gebracht und unter Stehenlassen und Rühren wird der Inhalt des Kolbens auf 5 C abgekühlt. Aus einer Bürette werden 6, 3 ml frisch destilliertes Phosphoroxychlorid während etwa 10 min hinzugemischt, worauf die Reaktionstemperatur unterhalb 9 C gehalten wird. Das Rühren wird 0, 5 h fortgesetzt, während welcher Zeit Stickstoff hindurchgeleitet wird ; die Reaktionsmischung wird dann 1 h bei 80 C stehengelassen.
Indessen wird ein Hydrolysebad, das aus 1008 ml konz. Salzsäure und 2375 ml Wasser besteht, in einem andern grösseren Kolben zubereitet, der mit Einrichtungen für das Durchleiten von Stickstoff, einem Rührer und einem Thermometer ausgestattet ist, auf 7 C abgekühlt. Das Kühlbad besteht aus Eis und Wasser.
Nach Abkühlung des Hydrolysebades wird die Reaktionsmischung langsam eingebracht, z. B. innerhalb von 4 bis 5 min, wobei die Temperatur des Bades unterhalb 9 C gehalten wird. Es fällt ein Hydrolyse- produkt aus, das unter Absaugen mittels eines Büchnertrichters abgetrennt wird. Das Absaugen wird so lange fortgesetzt, bis der überwiegende Teil des Benzols entfernt ist, worauf der Rückstand zweimal mit
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je 400 ml Äther gewaschen wird. Die Substanz wird dann in einen Vakuumkolben eingebracht und bei etwa 60 C im Vakuum getrocknet, bis alle Spuren des Äthers entfernt sind, worauf sie mit 100 ml wässerigem Äthanol zur Entfernung von nicht umgesetztem Hydrocortison geschüttelt und 6 h im Hochvakuum getrocknet wird. Das getrocknete Reaktionsprodukt schmilzt bei 205-210 C.
10 g des Reaktionsproduktes werden in 30 ml Äthanol gelöst und 24 h bei Zimmertemperatur stehengelassen. Es kristallisiert ein weisser Festkörper aus, der im Folgenden "R3" genannt wird und der nach Trocknen im Hochvakuum bei 216-217 C schmilzt. Die Ausbeute an R3, berechnet auf Hydrocortison, beträgt 50-60%.
Durch dreimaliges Umkristallisieren aus wasserfreiem Äthanol kann der Schmelzpunkt von R3 bis auf 2200 C gebracht werden.
Beispiel 2 : 10 g Hydrocortison werden in 3, 7 ml Pyridin und 180 ml Benzol suspendiert. Man stellt die Temperatur auf 180 C ein und gibt 1, 32 ml Phosphoroxychlorid zu. Die Reaktionsmischung wird 2 Tage unter einer Stickstoffatmosphäre und unter Rühren stehengelassen. Dann wird die harte Reaktionsmasse vom Benzol abgetrennt und im Vakuum getrocknet. Die getrocknete Substanz wird zweimal mit je 100 ml 50%igem Äthanol extrahiert. Beim Einengen des wässerigen Äthanols kristallisieren etwa 2 g nicht umgesetztes Hydrocortison aus. Der ölige Rückstand wird mit Äther gewaschen und getrocknet, wobei ein Rohprodukt erhalten wird, das bei 200-205 C schmilzt.
Das Rohprodukt wird in 15 ml warmem Äthanol gelöst, worauf 15 ml Wasser zugesetzt werden. Nach
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CR3 des Beispiels 1.
Beispiel 3 : 166 ml trockenes Pyridin und 240 ml Benzol werden in einen Dreihalskolben gebracht, der mit Einlass- und Auslassrohren für Stickstoff, einem Rührer, einem Quecksilberverschluss und einem Scheidetrichter ausgestattet ist ; die Mischung wird mittels eines Kühlbades auf 70 C gekühlt. Nach Hindurchleiten von Stickstoff während 5 min werden 10 g Prednisolon, das bei 230 C oder höher schmilzt, hinzugegeben. Das Prednisolon wird mit 10 ml trockenem Pyridin hinuntergewaschen. Nach Durchleiten von Stickstoff während weiterer 10 min werden 1, 4 ml frisch destilliertes Phosphoroxychlorid innerhalb von 5 min zugegeben. Die Mischung wird 1 h bei 7-8 C und dann 30 min bei 18 C stehengelassen.
200 ml konz. Schwefelsäure und 700 ml Wasser werden in ein mit einem Rührer ausgestattetes Becherglas gebracht ; die Mischung wird auf 5 C abgekühlt, worauf der Inhalt des Kolbens in drei Anteilen in diese saure Mischung eingegossen wird, wobei jedesmal 50 g gestossenes Eis zugesetzt werden. Die Zugabe wird nach 1 min beendet, worauf das Hydrolysegemisch 1 min unter heftigem Rühren stehengelassen wird.
Die Temperatur, die während der Hydrolyse auf etwa 14 C ansteigen kann, wird während einer weiteren Minute auf etwa 7 C unter Zusatz von Eis erniedrigt, und das Hydrolyseprodukt wird dann mittels eines Büchnertrichters durch Absaugen abgetrennt. Das Absaugen wird solange fortgesetzt, bis das Benzol getrocknet ist, worauf am Filter zweimal mit Wasser und zweimal mit Äther gewaschen wird. Der Rückstand wird dann in einen Vakuumkolben gebracht und mit 100 g Äther gewaschen. Die Ausbeute an rück-
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getrocknet. Ausbeute 60%, Schmelzpunkt 214-216 C.
Das so gereinigte Rohprodukt besteht noch immer aus mehreren Komponenten, die durch Chromatographieren über Aluminiumoxyd abgetrennt werden können.
Die Abscheidung wird im Zusammenhang mit einigen in den Zeichnungen dargestellten Diagrammen näher beschrieben.
Beispiel 4 : 0, 25 g Dexamethason werden in 4 ml Pyridin und 6 ml Benzol gelöst. Die Temperatur der Lösung wird auf 6-8 C eingestellt, worauf 0, 03 ml Phosphoroxychlorid zugetropft werden. Die blassgrüne Reaktionsmischung wird 30 min bei 15 C stehengelassen. Die Reaktionsmischung wird dann in eine Mischung aus 5 ml konz. Salzsäure und 16 ml Wasser gegossen, worauf die Fällung in einem Büchnertrichter abgetrennt, mit Wasser gewaschen und in Äther getrocknet wird ; dabei erhält man 120 mg einer Substanz mit dem Schmelzpunkt 160-200 C. Dieses Produkt wird dreimal mit je 2 ml 30%igem wässerigem Äthanol extrahiert und im Vakuum getrocknet. Es werden 70 mg einer Substanz vom Schmelzpunkt 218 C erhalten.
Eine Prüfung des Rohproduktes und des durch Äthanolextraktion erhaltenen Produktes mittels Chromatographie und Elektrophorese wird an Hand der Zeichnung beschrieben.
Die Chromatogramme gemäss Fig. 1, 2 und 3 wurden in einem System mit Formamid als stationäre Phase und Chloroform als mit Formamid gesättigte Phase als fortschreitende Phase ausgeführt. Es wurde bei einer Temperatur von 27 C auf Whatman-Papier Nr. 1 während 90 min im absteigenden Strom chromatographiert.
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Fig. 1 bezieht sich auf Beispiel 1 und betrifft Hydrocortison ; Fig. 2 bezieht sich auf Beispiel 2 und betrifft Prednisolon ; Fig. 3 bezieht sich auf Beispiel 4 und betrifft Dexamethason, und die Fig. 4 und 5 beziehen sich auf Beispiel 1.
Fig. 1 umfasst die folgenden Chromatogramme :
1. Hydrocortison,
2. das Reaktionsprodukt mit dem Schmelzpunkt 205-210 C gemäss Beispiel 1,
3. Rg mit dem Schmelzpunkt 220 C nach dreimaligem Umkristallisieren aus wasserfreiem Äthanol,
4. die Mutterlauge der Kristallisation von Rg,
5. einen wässerigen 1% Äthanol enthaltenden Extrakt der Mutterlauge nach Eindampfen zur Trockne,
6. den Extraktionsrückstand des Extraktes gemäss 5,
7. den Extraktionsrückstand des Extraktes gemäss 8,
8. einen erneuerten Extrakt der Substanz gemäss 6 mit dem gleichen Lösungsmittel.
Aus den Chromatogrammen ergibt sich, dass schon im Chromatogramm 2, welches das Reaktionsprodukt mit dem Schmelzpunkt 205-210 C darstellt, nur Spuren von nicht umgesetztem Hydrocortison R2 zurückbleiben, während das Chromatogramm das Vorliegen der Verunreinigungen Ri und R4 zeigt. Im Chromatogramm 3, das das kristallisierte Produkt Rg mit dem Schmelzpunkt von 220 C zeigt, sind nur Spuren von Restverunreinigungen R enthalten, und von den Verunreinigungen R4 ist nichts zu erkennen.
Um den Verlauf des Verfahrens zu prüfen, wurde die Mutterlauge der Umkristallisation chromatographiert, wobei das Chromatogramm 4 erhalten wurde, in welchem die Verunreinigungen R, Rg und R4 deutlich zu erkennen sind. Die eingeengte Mutterlauge wurde zweimal mit Äthanol enthaltendem Wasser extrahiert ; Extrakt und Rückstand sind durch die Chromatogramme 5 bzw. 6 für den ersten Extrakt und 8 bzw. 7 für den zweiten Extrakt veranschaulicht. Es ergibt sich, dass der Hauptanteil des Hydrocortisons
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Ausbeute zu erhalten.
Eine Umkristallisation der Verunreinigung R4 hat sich nicht als möglich erwiesen, doch liegt der Phosphorgehalt in einem sehr engen Bereich, so dass möglicherweise ein Diester vorliegt. Wie aus dem Chromatogramm 2 hervorgeht, kommt der letztere nur in untergeordneten Mengen im Hydrolyseprodukt vor.
Durch eine Makroanalyse unter Verwendung von etwa 0, 5 g Substanz wurde festgestellt, dass das kristalline Phosphorylierungsprodukt Ra, dans bei 2200 C schmilzt, 2, 61 % Phosphor enthält, während eine Submikroanalyse 2, 67% Phosphor ergeben hat ; beide Analysen wurden nach der AmmoniummolybdatMethode ausgeführt. Bei einer Kohlenstoffanalyse nach Van Slyke wurden 64, 3% C gefunden, während Stickstoff nicht, weder qualitativ noch quantitativ, gefunden werden konnte. Für die Formel [MJa, HaP04 errechnet sich in guter Übereinstimmung mit der Analyse ein Phosphorgehalt von 2, 61% und ein Kohlenstoffgehalt von 63, 9%.
Rg ist in Wasser sehr wenig löslich und, wie aus der Herstellungsmethode hervorgeht, gegen Säuren stabil. Beim Sieden der Substanz mit einer wässerigen oder 50% igen äthanolischen Base erfolgt eine Umwandlung ; dabei wird jedoch nicht Hydrocortison gebildet und die Umlagerung kann daher nicht in einer Verseifung von Rs bestehen. Durch Titration einer Lösung von Rg in wässerigem Äthanol mit 0, 1 nNatronlauge in Wasser bis pH 7, 4 wird eine Lösung erhalten, die beim Gefriertrocknen einen weissen Festkörper ergibt, der in Wasser leicht löslich ist (etwa 20% bei Zimmertemperatur).
In Fig. 4 ist eine Titrationskurve dargestellt, die durch Zugabe von 26, 00 ml von 0, 1 n-Natronlauge und 200 ml Wasser zu einer Lösung von 1, 0000 g Ra in 200 ml wasserfreiem Äthanol und Rücktitration mit 0, 1 n-Salzsäure erhalten wurde. Auf der Abszisse sind ml = 0, 1 n-Natronlauge und auf der Ordinate ist der pH-Wert aufgetragen. Aus dem Verbrauch der Base entsprechend den Wendepunkten der Kurve, d. i. 8, 3 bzw. 17, 8 ml 0, 1 n-Natronlauge, wurde das Mol.-Gew. unter der Voraussetzung errechnet, dass im ersten Fall ein und im zweiten Fall zwei dissoziierbare Wasserstoffionen neutralisiert werden. Die gefundenen Zahlenwerte 1205 bzw. 1125 stehen in guter Übereinstimmung mit der unterstellten Bruttoformel (M) a, H3P04, entsprechend einem Mol.-Gew. von 1185.
Von der Verbindung Rg wurde ein Infrarotspektrum gemäss Fig. 5 aufgenommen. In Fig. 5 geben die Zahlenwerte auf der Abszisse die Wellenlänge in [jt. bzw. die Wellenzahl in cm-l, und jene auf der Ordinate die relative Absorption an. Das Spektrum ist mit einer Lösung von 1, 5 mg der Probe in 300 mg Kaliumbromid aufgenommen worden. Es zeigt nicht die Banden der Esterbindung, und eine Berechnung des Gehaltes der freien Hydroxylgruppen auf Basis des Spektrogramms ergibt die Anwesenheit von neun freien Hydroxylgruppen je Molekül.
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Es wird daher angenommen, dass die Verbindung Rg diese Bruttoformel hat, ohne einen Ester darzustellen, und dass alle drei Hydroxylgruppen in jedem Hydrocortisonmolekül unverändert sind.
Die Farbreaktionen mit Tetrazoliumblau und mit Triphenyltetrazoliumchlorid sind, verglichen mit den Farbreaktionen, die mit Hydrocortison selbst mit diesen Farbreagentien erhalten werden können, stark geschwächt. Auch mit Diaminsilber gibt eine Lösung von Rg eine schwächere Reaktion als mit Hydrocortison, die anzeigt, dass die ox-Ketonreaktion stark vermindert ist.
Unter Berücksichtigung dieser Umstände muss R die folgende Formel zugeschrieben werden :
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Die Bindung zwischen jeder der Hydroxylgruppen der Phosphorsäure und der Ketogruppe in der 20Stellung wird als eine Wasserstoffbrückenbindung angenommen, der zufolge das Wasserstoffatom in der Hydroxylgruppe in Stellung 17 als genügend gelockert erscheint, um die Bildung von Alkalisalzen unter Austausch dieses Wasserstoffatoms durch ein Alkalimetallatom zu ermöglichen.
Für andere Corticohormonderivate gemäss der Erfindung wird eine analoge Konstitution angenommen.
Die Chromatogramme in Fig. 2 zeigen :
9. Prednisolon,
10. das Phosphorylierungsprodukt von Prednisolon, das nach der Methode des Beispiels 3 entsteht und einen Schmelzpunkt von 213 bis 2140 C aufweist,
11. das gereinigte Produkt mit einem Schmelzpunkt von 214 bis 216 C, das durch Extraktion mit Äthanol gemäss Beispiel 3 erhalten wird,
12. eine Fraktion, die durch Chromatographieren über Aluminiumoxyd aus dem Produkt gemäss 11 erhalten wird,
13. die Elektrophorese des Natriumsalzes des Produktes R, gemäss 12,
14. die Elektrophorese des Natriumsalzes des Prednisolonmonophosphats.
Die Chromatogramme 9-12 wurden nach der gleichen Methode wie die Chromatogramme 1-8 erhalten. Beim Chromatogramm 10 zeigt sich, dass bei Zuführungspunkt P eine Verunreinigung R vorliegt, die aus einem Pyridinkomplex (siehe die Erläuterung zu Fig. 1) besteht. Es zeigt sich auch ein Rest R2 von Prednisolon und zwei phosphorenthaltende Steroide Ra und R,.
Aus 11 ergibt sich, dass Prednisolon R2 infolge der Reinigung verschwunden ist.
Das Chromatogramm 12 veranschaulicht ein Produkt, das durch Chromatographieren der Substanz des Chromatogramms 11 über eine Aluminiumoxydsäule in der folgenden Weise erhalten worden ist :
100 mg dieser Substanz werden in 0, 5 ml Äthanol gelöst ; man gibt 9, 5 ml Benzol hinzu, worauf die Lösung abfiltriert wird. Eine Aluminiumoxydsäule, die 6 g Aluminiumoxyd enthält, wird mit Benzol gewaschen, worauf zuerst 15 ml Benzol und dann die obige Lösung über die Säule gegossen wird. Nach Eluierung mit 40 ml 5%igem Äthanol in Benzol werden 20 Fraktionen mit dem folgenden Ergebnis erhalten :
Die Fraktionen 1-3 enthalten nichts gelöst, die Fraktionen 4-6 enthalten eine kristalline Substanz und werden durch das Chromatogramm 12 veranschaulicht.
Wie sich daraus ergibt, ist der Anteil R4 verschwunden, und die kristalline Substanz verhält sich so wie fast reine Ra-Substanz.
Die Fraktionen 7-20 enthalten verschiedene Mengen von Rg sowie R4'
Die Fraktion Ru, dite durch Chromatographieren über Aluminiumoxyd erhalten worden ist, wurde in das Natriumsalz umgewandelt, wie oben mit dem Phosphorylierungsprodukt Rg beschrieben worden ist.
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15. Dexamethason, 16. das Rohprodukt des Beispiels 4 mit dem Schmelzpunkt 160-200 C, 17. das Rohprodukt einer Extraktion mit Äthanol (Schmelzpunkt 218 C) sowie ferner 18. die Elektrophorese des Natriumsalzes von Dexamethasonmonophosphat und 19. die Elektrophorese des Natriumsalzes des gereinigten Produktes gemäss 17.
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Aus dem Chromatogramm 16 ergibt sich, dass das Rohprodukt noch unumgesetzes Dexamethason (ruz) enthält und aus 17 folgt, dass die letztere Verbindung durch Extraktion mit Äthanol verschwindet. Aus den beiden Elektrophoresen kann entnommen werden, dass das gereinigte Produkt kein Monophosphat enthält. Die Komponente A ist eine Verbindung aus Steroid und Borat.
Die verschiedenen beim erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten Corticohormone verhalten sich bei der Phosphorylierung und Reinigung ähnlich und sind alle befähigt, mit Phosphorsäure eine Verbindung zu bilden, die 3 Moleküle des Steroids pro Molekül Phosphorsäure enthält und in Alkali löslich ist.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von neuen Corticohormonderivaten der allgemeinen Formel
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worin Xl und X2 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff oder Halogen, Y Wasserstoff, Hydroxyl oder Sauerstoff, Z Wasserstoff oder Methyl, und R Sauerstoff oder Schwefel bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass man ein entsprechendes Corticohormon bei einer Zimmertemperatur nicht überschreitenden Temperatur mit solchen Anteilen eines Phosphorylierungsmittels, die innerhalb des Bereiches von t bis 1 Mol Phosphorylierungsmittel je 1 Mol Corticohormon liegen, zur Reaktion bringt, das Reaktionsprodukt hydrolysiert, das gefällte Hydrolyseprodukt isoliert und dieses durch Umkristallisation reinigt.