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Verfahren zur Erzeugung von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin
EMI1.1
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medium enthält die üblichen Nährstoffe und Mineralen. zou den geeigneten Nährstoffen, die die notwendigen Substanzen liefern, gehören Stärke, Dextrose, Rohrzucker, Glukose, Melasse, Sojabohnenmehl,
EMI2.1
Destillationsrückstand, Fischmehl und andere übliche Substanzen. Zu den anorganischen Salzen gehören Substanzen wie Calciumcarbonat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und die verschiedenen Spurenelemente wie Mangan, Kobalt, Zink, Kupfer, Eisen u. dgl. Im allgemeinen wird die Anwendung eines chloridionenreichen Mediums bevorzugt, auch weil dadurch höhere Ausbeuten an chlorierten Antibiotika erhalten werden.
Die andern allgemeinen Fermentationsbedingungen wie Wasserstoffionenkonzentration, Temperatur, Zeit, Beluftungsgeschwindigkeit, Herstellung der Impfkultur, Sterilisierung, Inokulierung u. dgl. sind wie üblich und können denen zur Bildung von 7-Chlor-6-desmethyltetracyc1in ähnlich sein.
Was den erfindungsgemäss angewendeten Mikroorganismustyp zur Herstellung von 7-Chlor-desmethyltetracyclin betrifft, so sollten ausgewählte mutierte Stämme eines 7-Chlor-7-desmethyltetracyclin bildenden Stammes von S. aureofaciens angewendet werden, wie z. B. in der deutschen Patentschrift Nr.
1041213 beschrieben.
Zur Isolierung des 7-Chlor-6-desmethyltetracyc1ins aus dem Fermentationsmedium werden die in der oben erwähnten Patentschrift Nr. 1041213 beschriebenen Isolierungsverfahren angewendet.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern.
Beispiel l : Es wurde ein Fermentationsmedium hergestellt, das die folgenden Bestandteile ent- hielt :
EMI2.2
<tb>
<tb> Stärke <SEP> 55gprol
<tb> Maisquellflüssigkeit <SEP> 25 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> CaCOs <SEP> 8gprol
<tb> (NHSO4 <SEP> 5 <SEP> g <SEP> pro <SEP> l <SEP>
<tb> NH4C1 <SEP> 1 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> Baumwollsamenmehl <SEP> 5 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb>
Zu diesem Medium wurden in getrennten Ansätzen verschiedene Mengen an Kupfersulfathydrat CuSO. 5 H20 gegeben.
Diese Medien wurden in geeigneten Mengen in Kolben verteilt, die 270 (v/v) Schmalzöl enthielten, sterilisiert, mit einer vegetativen Impfkultur eines 7-Chlor-6-desmethyltetra- cyclin produzierten Stammes von S. aureofaciens (Stamm E-475) inokuliert und bei 26, 50C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung 144 Stunden inkubiert. Sie wurden anschliessend auf ihren Gehalt an 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin geprüft. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle unten aufgeführt.
Tabelle 1
EMI2.3
<tb>
<tb> CuSO. <SEP> 5 <SEP> HO <SEP> 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin
<tb> Teile <SEP> pro <SEP> Million <SEP> y/ml
<tb> 0 <SEP> 1480
<tb> 10 <SEP> 1195
<tb> 50 <SEP> 1205
<tb> 100 <SEP> 1765
<tb> 150 <SEP> 1700
<tb>
Aus der obigen Tabelle ist zu ersehen, dass die Zugabe von Kupfer eine Steigerung der Produktion an 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin bewirkt.
Beispiel 2 : Das Verfahren von Beispiel l wird wiederholt, wobei ein 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin produzierender Stamm von S. aureofaciens (Stamm E-1311) angewendet wurde. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten :
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Tabelle 2
EMI3.1
<tb>
<tb> CuSO. <SEP> 5 <SEP> HO <SEP> 7-Chlor-6-desmethyl-6-Desmethyl-% <SEP> 6-Desmethyl- <SEP>
<tb> veile <SEP> pro <SEP> Million <SEP> tetracyclin <SEP> tetracyclin <SEP> tetracyclin
<tb> y/ml <SEP> y/ml <SEP>
<tb> 0 <SEP> 1000 <SEP> 560 <SEP> 36
<tb> 10 <SEP> 1030 <SEP> 555 <SEP> 35
<tb> 100 <SEP> 1445 <SEP> 485 <SEP> 25
<tb>
Beispiel 3 : Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, nur dass die Inkubation bei 26, 50C 24 Stunden und dann zusätzlich 120 Stunden bei 240C durchgeführt wurde.
Die Ergebnisse waren wie folgt :
Tabelle 3
EMI3.2
<tb>
<tb> CuSO4 <SEP> . <SEP> 5H2O <SEP> 7-Chlor-6-desmethyl- <SEP> 6-Desmethyl- <SEP> 5 <SEP> 6-DesmethylTeile <SEP> pro <SEP> Million <SEP> tetracyclin <SEP> tetracyclin <SEP> tetracyclin
<tb> y/ml <SEP> y/ml <SEP>
<tb> 0 <SEP> 1710 <SEP> 610 <SEP> 26
<tb> 10 <SEP> 1770 <SEP> 590 <SEP> 25
<tb> 100 <SEP> 2050 <SEP> 500 <SEP> 20
<tb>
Beispiel 4 : Das Verfahren von Beispiel 3 wurde wiederholt, nur dass die Inkubation bei 250C 144 Stunden lang durchgeführt wurde.
Die Ergebnisse waren wie folgt :
Tabelle 4
EMI3.3
<tb>
<tb> CuSO4. <SEP> 5H2O <SEP> 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin
<tb> Teile <SEP> pro <SEP> Million <SEP> y/ml
<tb> 0 <SEP> 1740
<tb> 100 <SEP> 1840
<tb>
Beispiel 5: Es wurde ein Fermentationsmedium hergestellt, das die folgenden Bestandteile enthielt :
EMI3.4
<tb>
<tb> Stärke <SEP> 43, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1 <SEP>
<tb> Maisquellflüssigkeit <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> CaCO <SEP> 7, <SEP> 5gprol
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 5,6 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> NH4Cl <SEP> 1, <SEP> Ogprol
<tb> Baumwollsamenniehl <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> Maismehl <SEP> 27, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> MnSO <SEP> 0,080 <SEP> g <SEP> pro <SEP> l
<tb> COC12 <SEP> . <SEP> 5H2O <SEP> 0,005 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb>
<Desc/Clms Page number 4>
Zu einem Teil dieses Fermentationsmediums wurde CuSO4 . 5H2O in einer Konzentration von 100 Teilen/Million gegeben, während ein anderer Teil zur Kontrolle zurückgehalten wurde.
Die Medien wurden in entsprechenden Mengen in Kolben verteilt, die e (v/v) Schmalzöl enthielten, sterilisiert, mit einer vegetativen Impfkultur von S. aureofaciens (Stamm E-1311) inokuliert, dann 24 Stunden bei 26, 5 C und anschliessend 120 Stunden bei 240C inkubiert, d. h. bis zur Ernte.
Der Inhalt der Kolben wurde auf 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin und 6-Desmethyltetracyclin geprüft, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden:
Tabelle 5
EMI4.1
<tb>
<tb> CuSO. <SEP> 5H2O <SEP> 7-Chlor-6-desmethyl- <SEP> 6-desmethyl- <SEP> %6-DesmethylTeile <SEP> pro <SEP> Million <SEP> tetracyclin <SEP> tetracyclin <SEP> tetracyclin
<tb> γ/ml <SEP> γ/ml
<tb> 0 <SEP> 1975 <SEP> 800 <SEP> 29
<tb> 100 <SEP> 2035 <SEP> 610 <SEP> 23
<tb>
Beispiel 6 :
Es wurde eine Vergleichsfermentation unter Anwendung des unten angegebenen Me- diums durchgeführt :
EMI4.2
<tb>
<tb> A <SEP> B
<tb> Stärke <SEP> 55 <SEP> 35 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> Maisquellflüssigkeit <SEP> 25 <SEP> - <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> CaCO3 <SEP> 8 <SEP> 3,5 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 5 <SEP> - <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> NH4C1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> Baumwollsamenmehl <SEP> 5 <SEP> 15 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> Hefe <SEP> - <SEP> 5 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> getrockneter <SEP> Fleischextrakt <SEP> - <SEP> 10 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> MnC12 <SEP> . <SEP> 4H2O <SEP> - <SEP> 0.005 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> ZnSO4 <SEP> .
<SEP> 7H2O <SEP> - <SEP> 0,050 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb>
EMI4.3
wurden in entsprechenden Mengen in Kolben verteilt, die 2% (v/v) Schmalzöl enthielten, sterilisiert, mit einer vegetativen Impfkultur. von S. aureofaciens (Stamm E-1311) inokuliert und auf einer rotieren-
EMI4.4
50C und'anschliessendinkubiert.
Nach Beendigung des Testes (144 Stunden) wurden die Fermentationsmaischen geprüft, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden :
Tabelle 6
EMI4.5
<tb>
<tb> Medium <SEP> A <SEP> Medium <SEP> B
<tb> CuSO. <SEP> 5H2O <SEP> 7-Chlor-6-desmethyl- <SEP> -Desmethyl- <SEP> 7-Chlor-6-desmethyl- <SEP> 6-DesmethylTeile <SEP> pro <SEP> Million <SEP> tetracyclin <SEP> tetracyclin <SEP> tetracyclin <SEP> tetracyclin
<tb> y/ml <SEP> y/ml <SEP> y/ml <SEP> y/ml
<tb> 0 <SEP> 2025 <SEP> 725 <SEP> 1900 <SEP> 470
<tb> 100 <SEP> 2325 <SEP> 615 <SEP> 2625 <SEP> 200
<tb>
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Beispiel 7 :
Es wurde ein Fermentationsmedium hergestellt, das die folgenden Bestandteile enthielt :
EMI5.1
<tb>
<tb> Stärke <SEP> 45, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> CaCO <SEP> 10, <SEP> 5 <SEP> g <SEP> pro <SEP> l
<tb> NHCI <SEP> l, <SEP> 5gprol <SEP>
<tb> Baumwollsamenmehl <SEP> 45, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> pro <SEP> l
<tb> Hefe <SEP> 1,5 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb>
EMI5.2
Die Medien wurden in entsprechenden Mengen in Kolben verteilt, die alb (v/v) Schmalzöl enthielten, ) sterilisiert, mit einer vegetativen Impfkultur von S. aureofaciens (Stamm ED-1723) inokuliert und auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung 168 Stunden bei 250C inkubiert.
Der Ertrag der Maischen war wie folgt :
Tabelle 7
EMI5.3
<tb>
<tb> CuSO. <SEP> 5H2O <SEP> 7-Chlor-6-desmethyl- <SEP> 6-Desmethyl- <SEP> % <SEP> 6-DesmethylTeile <SEP> pro <SEP> Million <SEP> tetracyclin <SEP> tetracyclin <SEP> tetracyclin
<tb> y/ml <SEP> r/ml <SEP>
<tb> 50 <SEP> 4340 <SEP> 1920 <SEP> 31
<tb> 150 <SEP> 4635 <SEP> 1370 <SEP> 23
<tb> 200 <SEP> 4510 <SEP> 1350 <SEP> 24
<tb> 300 <SEP> 4080 <SEP> 1235 <SEP> 24
<tb>
Beispiel 8 :
Es wurde ein Fermentationsmedium hergestellt, das die folgenden Bestandteile enthielt :
EMI5.4
<tb>
<tb> Stärke <SEP> 51, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1 <SEP>
<tb> CACAO <SEP> 11, <SEP> 9 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> NH4C1 <SEP> 1. <SEP> 7 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1 <SEP>
<tb> Baumwollsamenmehl <SEP> 51, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> Hefe <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1 <SEP>
<tb>
Zu diesem Medium wurden in getrennten Ansätzen verschiedene Mengen an CuSO. 5H2O gegeben.
Die Medien wurden in entsprechenden Mengen in Kolben verteilt, die : J1/o (v/v) Schmalzöl enthielten, sterilisiert, mit einer vegetativen Impfkultur von S. aureofaciens (Stamm Ed-2047) inokuliert und auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung 160 Stunden bei 250e inkubiert. Der Ertrag der Maischen war wie folgt :
Tabelle 8
EMI5.5
<tb>
<tb> CuSO4 <SEP> . <SEP> 5H2O <SEP> 7-Chlor-6-desmethyl- <SEP> 6-Desmethyl- <SEP> % <SEP> 6-DesmethylTeile <SEP> pro <SEP> Million <SEP> tetracyclin <SEP> tetracyclin <SEP> tetracyclin <SEP>
<tb> y/ml <SEP> y/ml
<tb> 100 <SEP> 4225 <SEP> 1845 <SEP> 31 <SEP>
<tb> 150 <SEP> 4930 <SEP> 1830 <SEP> 28
<tb> 200 <SEP> 4830 <SEP> 1750 <SEP> 27
<tb> 300 <SEP> 4980 <SEP> 1550 <SEP> 24
<tb>
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Beispiel 9 :
Es wurde ein Fermentationsmedium hergestellt, das die folgenden Bestandteile enthielt :
EMI6.1
<tb>
<tb> Stärke <SEP> 30oprol
<tb> CaCO <SEP> 7 <SEP> g <SEP> pro <SEP> I <SEP>
<tb> NH4C1 <SEP> 1 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> Sojabohnenölmehl <SEP> 30'g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> Hefe <SEP> 1 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1 <SEP>
<tb>
Zu diesem Medium wurden in getrennten Ansätzen verschiedene Mengen an CuSO . 5HO gegeben.
Die Medien wurden in entsprechenden Mengen in Kolben verteilt, die e (v/v) Schmalzöl enthielten, sterilisiert, mit einer vegetativen Impfkultur von S. aureofaciens (Stamm ED-2047) inokuliert und auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 250C 160 Stunden inkubiert.
Der Ertrag der Maischen war wie folgt :
Tabelle 9
EMI6.2
<tb>
<tb> CuSO. <SEP> 5 <SEP> HO <SEP> 7-Chlor-6-desmethyl-6-Desmethyl-% <SEP> 6-DesmethylTeile <SEP> pro <SEP> Million <SEP> tetracyclin, <SEP> tetracyclin <SEP> tetracyclin
<tb> y/ml <SEP> y/ml <SEP>
<tb> 50 <SEP> 2570 <SEP> 1415 <SEP> 35
<tb> 100 <SEP> 2955 <SEP> 1280 <SEP> 30
<tb> 200 <SEP> 3275 <SEP> 1130 <SEP> 26
<tb> 300 <SEP> 2560 <SEP> 765 <SEP> 23
<tb>
Beispiel 10 :
Es wurden zwei Baumwollsamenmehlmedien steigender Konzentration wie folgt hergestellt :
EMI6.3
<tb>
<tb> Medium <SEP> A <SEP> Medium <SEP> B
<tb> Stärke <SEP> 45, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> prol <SEP> 60 <SEP> gprol <SEP>
<tb> CaCO <SEP> 10, <SEP> 5 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1 <SEP> 14 <SEP> g <SEP> pro <SEP> l
<tb> NHCl <SEP> 1,5 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> Baumwollsamenmehl <SEP> 45, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> pro <SEP> l <SEP> 60 <SEP> g <SEP> pro <SEP> l
<tb> Hefe <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1 <SEP> 2gprol <SEP>
<tb>
Zu diesen Medien wurden in getrennten Ansätzen verschiedene Mengen von CuSO. 5H O gegeben.
Die Medien wurden in entsprechenden Mengen in Kolben verteilt, die 3%. (v/v) Schmalzöl enthielten, sterilisiert, mit einer vegetativen Impfkultur von S. aureofaciens (Stamm ED-2047) inokuliert und auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 250C 160 Stunden inkubiert.
Der Ertrag der Maischen war wie folgt :
<Desc/Clms Page number 7>
Tabelle 10
EMI7.1
<tb>
<tb> Medium <SEP> A <SEP> Medium <SEP> B
<tb> CuSO4 <SEP> . <SEP> 5H2O <SEP> A-VIII* <SEP> A-IX** <SEP> % <SEP> A-IX** <SEP> A-VIII* <SEP> A-IX** <SEP> % <SEP> A-IX**
<tb> Teile <SEP> pro <SEP> Million <SEP> γ/ml <SEP> γ/ml <SEP> γ/ml <SEP> γ/ml
<tb> 100 <SEP> 5135 <SEP> 815 <SEP> 14 <SEP> 3080 <SEP> 1510 <SEP> 33
<tb> 200---3825 <SEP> 1585 <SEP> 29
<tb> 300---4725 <SEP> 1705 <SEP> 27
<tb> 400---5490 <SEP> 1660 <SEP> 23
<tb> 500---5480 <SEP> 1540 <SEP> 22
<tb>
*7-Chlor-6-desmethyltetracyclin
EMI7.2
Beispiel 11 : Zwei Sojabohnenölmehlmedien steigender Konzentration wurden wie folgt hergestellt :
EMI7.3
<tb>
<tb> Medium <SEP> A <SEP> Medium <SEP> B
<tb> Stärke <SEP> 40, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1 <SEP> 45,0 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> CaCO3 <SEP> 9, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1 <SEP> 10,5 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> NH4Cl <SEP> 1. <SEP> 3 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1 <SEP> 1,5 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb> Sojabohnenölmehl <SEP> 40, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> pro <SEP> l <SEP> 45, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> pro <SEP> l
<tb> Hefe <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1 <SEP> 1,5 <SEP> g <SEP> pro <SEP> 1
<tb>
Zu diesen Medien wurden in getrennten Ansätzen verschiedene Mengen CuSO.. 5 . O gegeben.
Die Medien wurden in entsprechenden Mengen in Kolben verteilt, die 3% (v/v) Schmalzöl enthielten, sterilisiert, mit einer vegetativen Impfkultur von S. aureofaciens (Stamm ED-2047) inokuliert und auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung 160 Stunden bei 25 C inkubiert. Der Ertrag der Maischen war wie folgt :
Tabelle 11
EMI7.4
<tb>
<tb> Medium <SEP> A <SEP> Medium <SEP> B
<tb> CuSO4 <SEP> . <SEP> 5H2O <SEP> A-VIII* <SEP> A-IX** <SEP> % <SEP> A-IX** <SEP> A-VIII* <SEP> A-IX** <SEP> %A-IX**
<tb> Teile <SEP> pro <SEP> Million <SEP> γ/ml <SEP> γ/ml <SEP> γ/ml <SEP> γ/ml
<tb> 300 <SEP> 3520 <SEP> 1710 <SEP> 33 <SEP> 2470 <SEP> 1730 <SEP> 41
<tb> 400 <SEP> 3685 <SEP> 1635 <SEP> 30 <SEP> 2970 <SEP> 189039
<tb> 50 <SEP> 3090 <SEP> 1515 <SEP> 33 <SEP> 2900 <SEP> 1830 <SEP> 39
<tb> 700 <SEP> 2635 <SEP> 1185 <SEP> 31 <SEP> 3180 <SEP> 1705 <SEP> 35
<tb>
*7-Chlor-6-desmethyltetracyclin
6-DesmethyltetracycUn