WO2023277186A1 - 液相ペプチド合成用担体結合ペプチドの分析方法 - Google Patents
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Abstract
液相ペプチド合成用担体由来の成分と目的ペプチドなどとを同時に正確に分析できる手段を提供すること。 アルコール類を溶離液として用いる高速液体クロマトグラフィー又は超臨界流体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする、液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体由来の成分、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸及び液相ペプチド合成用担体が結合しているペプチド化合物と、目的ペプチド又は最終目的ペプチドとを同時に分析する方法。
Description
本発明は、液相ペプチド合成用担体結合ペプチドの分析方法に関する。
ペプチドの製造技術には、固相ペプチド合成法と液相ペプチド合成法とがあるが、医薬品等として用いられるペプチドを製造するには、大量生産に向いている液相ペプチド合成法が広く採用されている。そして、最近、保護アミノ酸や保護ペプチドの有機溶媒への溶解性を大きく向上させる化合物である液相ペプチド合成用担体(Tag)が報告されている(特許文献1~14)。
この液相ペプチド合成用担体を用いる液相ペプチド合成は、縮合反応及び脱保護反応を有機溶媒中で行うことができるため、各工程の反応率を分析することができるという利点がある。そして、そのような反応率や品質管理、副反応の管理、不純物の分析には、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が使用されている。非特許文献1では、液相ペプチド合成用担体を用いて合成したペプチド化合物の分析について、アセトニトリル系の溶離液でHPLC分析をおこなう技術が開示されている。この文献で分析されている物質は、液相ペプチド合成用担体を脱離させた後のペプチドであった。また、非特許文献2では、アセトニトリル系溶媒にて、液相ペプチド合成用担体であるnanostarを用いたペプチド伸長反応の反応率を、nanostarが結合した状態で分析する技術が開示されている。しかし、非特許文献2における分析は、液相ペプチド合成用担体が結合した物質どうしを分析する技術であり、液相ペプチド合成用担体が結合している物質と、結合していない物質の双方を同時に分析する技術について、言及はなかった。さらに、非特許文献3では、液相ペプチド合成用担体であるTrt(OH)-K10とペプチドとの結合反応を行った後、Trt(OH)-K10とペプチドの残存量、及びTrt(OH)-K10が結合したペプチドの生成を、アセトニトリル系の溶離液を用いたHPLCで分析をおこなう技術が開示されている。
Angew Chem Int Ed Engl. 2017,56,7803-7807
Angew Chem Int Ed Engl. 2021、60,7786-7795.
Angew Chem Int Ed Engl. 2018、57,2105-2109.
医薬品の分析は、「新有効成分含有医薬品のうち原薬の不純物に関するガイドライン」にあるように,その不純物管理について厳格に定められており、例えば、存在が予測される不純物について科学的な評価を行う必要があったり、0.05%と極微量を閾値として設定し、その不純物量を正確に分析する必要がある。そのため、複数種類の不純物を分析する際は、それぞれの不純物の特性に合わせて複数の分析法を設定することが一般的であった。
液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体の脱保護後条件下で副生する液相ペプチド合成用担体由来の成分、又は液相ペプチド合成用担体が結合したアミノ酸若しくはペプチド化合物と、液相ペプチド合成用担体を脱離させた後のペプチドとを同時にHPLCで分析することができれば、前述の通り、反応率や品質管理、副反応の管理が容易となる。しかしながら、液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体の脱保護後条件下で副生する液相ペプチド合成用担体由来の成分、又は液相ペプチド合成用担体が結合したアミノ酸若しくはペプチド化合物は、脂溶性が高く、一般的にHPLC分析で用いられるアセトニトリル系の溶離液に溶解しない場合もあった。また、液相ペプチド合成用担体が結合したペプチドはHPLCカラム固定相に吸着し、アセトニトリル系の溶離液では、溶出させることが困難であることもあった。さらに、脱保護した際には、液相ペプチド合成用担体又はそれに由来する成分と目的とするペプチド成分との極性が大きく異なる。したがって、ペプチドの品質を測定するための分析条件では液相ペプチド合成用担体又はそれに由来する成分を分析することができないため、試料中の液相ペプチド合成用担体又はそれに由来する成分の量を確認するためには、別途分析条件を検討し、検出成分毎に個別の分析条件にてHPLC分析を実施する必要があった。すなわち、一方の条件で液相ペプチド合成用担体またはそれに由来する成分の量を分析した場合は、ペプチド成分は他の夾雑物と分離しないあるいは溶出しない条件となり、他方の条件でペプチド成分の量を分析した場合は、液相ペプチド合成用担体またはそれに由来する成分は他の夾雑物と分離しないあるいは溶出しない条件になっていた。
一方、液相ペプチド合成用担体を脱離させた後のペプチドを固液分離と逆相高速液体クロマトグラフィーを組み合わせることによって精製することは可能であったが、精製とは、目的とする化合物を目標とする純度以上の品質で必要とする量を単離することが目的であり、例えば目的とする化合物以外の夾雑物同士が分離していなくてもよく、あるいはHPLCカラム固定相に吸着して溶出していなくてもよいため、目的とする化合物と夾雑物それぞれの含有量又は含有率を定量的又は定性的に観測する必要のある分析手法としては使用できるものではなかった。
従って、本発明は、液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体の脱保護後条件下で副生する液相ペプチド合成用担体由来の成分、又は液相ペプチド合成用担体が結合したアミノ酸若しくはペプチド化合物の分析及びそれらの化合物と、液相ペプチド合成用担体を脱離させた後のペプチド(以下、目的ペプチドということがある。)又は前記目的ペプチドより、N末端若しくはC末端の保護基を脱離させたペプチド、又は、前記N末端若しくはC末端の保護基を脱離させたペプチドからさらに液相合成用担体ではない一般的な保護基を脱離させた後のペプチド(以下、最終目的ペプチドということがある)などとを同時に正確に分析できる手段を提供することにある。
そこで本発明者は、液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体の脱保護後条件下で副生する液相ペプチド合成用担体由来の成分、又は液相ペプチド合成用担体が結合したアミノ酸若しくはペプチド化合物と、目的ペプチド又は最終目的ペプチドのような極性が大きく異なる成分とを同時に分析できる手段を見出すべく種々検討したところ、HPLCなどの液体クロマトグラフィーの溶離液としてアセトニトリルではなく、アルコール類を使用することにより、これらの成分の分析ができ、さらにそれらの化合物と目的ペプチドなどが同時に正確に分析できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、次の発明[1]~[7]を提供するものである。
[1]炭素数1~4のアルコールを含む溶液を溶離液として用いる高速液体クロマトグラフィー又は超臨界流体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする、液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体の脱保護後条件下で副生する液相ペプチド合成用担体由来の成分、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸及び液相ペプチド合成用担体が結合しているペプチド化合物から選ばれる1種以上の化合物と、目的ペプチド又は最終目的ペプチドとを同時に分析する方法であって、
前記液相ペプチド合成用担体が、下記の式(I)の化合物である、分析方法。
[1]炭素数1~4のアルコールを含む溶液を溶離液として用いる高速液体クロマトグラフィー又は超臨界流体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする、液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体の脱保護後条件下で副生する液相ペプチド合成用担体由来の成分、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸及び液相ペプチド合成用担体が結合しているペプチド化合物から選ばれる1種以上の化合物と、目的ペプチド又は最終目的ペプチドとを同時に分析する方法であって、
前記液相ペプチド合成用担体が、下記の式(I)の化合物である、分析方法。
[式中、環Aはヘテロ原子を含んでいてもよく、多環性でもよいC4~20の芳香環を示し;
R11は、水素原子であるか、又は環Aがベンゼン環でRbが下記式(a)で表される基である場合には、R14と一緒になって単結合を示して、環A及び環Bと共にフルオレン環を形成するか、又は酸素原子を介して環A及び環Bと共にキサンテン環を形成してもよく;p個のXは、それぞれ独立して-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-、-NHC(=O)-、又は-NR17-(R17は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)を示し;
p個のR12は、それぞれ独立して酸素原子を介して脂肪族炭化水素基で置換されている脂肪族炭化水素基、又は式(b)のいずれかである有機基を示し;
R11は、水素原子であるか、又は環Aがベンゼン環でRbが下記式(a)で表される基である場合には、R14と一緒になって単結合を示して、環A及び環Bと共にフルオレン環を形成するか、又は酸素原子を介して環A及び環Bと共にキサンテン環を形成してもよく;p個のXは、それぞれ独立して-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-、-NHC(=O)-、又は-NR17-(R17は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)を示し;
p個のR12は、それぞれ独立して酸素原子を介して脂肪族炭化水素基で置換されている脂肪族炭化水素基、又は式(b)のいずれかである有機基を示し;
但しR20は炭素数6~16の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示し、X3は酸素原子若しくは-C(=O)NR21-(R21は水素原子又は炭素数1~4のアルキル基を示す)を示し、Dはシリル基、又はシリルオキシ基が結合したアルキル基のいずれかを示す;
q個のR13は、それぞれ独立して水素原子であるか、又は酸素原子を介してシリル基若しくは脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
p、qは、それぞれ0~4の整数かつp+qが1以上4以下を示し;
環Aは、p個のXR12に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、及びハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子、又はハロゲン原子により置換されていてもよい芳香族環を示し;
Rbは、水素原子、ハロゲン原子により置換されていてもよい芳香環、又は式(a):
q個のR13は、それぞれ独立して水素原子であるか、又は酸素原子を介してシリル基若しくは脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
p、qは、それぞれ0~4の整数かつp+qが1以上4以下を示し;
環Aは、p個のXR12に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、及びハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子、又はハロゲン原子により置換されていてもよい芳香族環を示し;
Rbは、水素原子、ハロゲン原子により置換されていてもよい芳香環、又は式(a):
(式中、*は結合位置を示し;
r、sは、それぞれ0~4の整数かつr+sが4以下を示し;
r個のZは、それぞれ独立して-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-、-NHC(=O)-、又は-NR18-(R18は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)を示し;
r個のR15は、独立して脂肪族炭化水素基で置換されている脂肪族炭化水素基、又は式(b)のいずれかである有機基を示し;
r、sは、それぞれ0~4の整数かつr+sが4以下を示し;
r個のZは、それぞれ独立して-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-、-NHC(=O)-、又は-NR18-(R18は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)を示し;
r個のR15は、独立して脂肪族炭化水素基で置換されている脂肪族炭化水素基、又は式(b)のいずれかである有機基を示し;
但しR20は炭素数6~16の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示し、X3は酸素原子若しくは-C(=O)NR21-(R21は水素原子又は炭素数1~4のアルキル基を示す)を示し、Dはシリル基、又はシリルオキシ基が結合したアルキル基のいずれかを示す;
s個のR16は、それぞれ独立して酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
R14は、水素原子を示すか、R11と一緒になって単結合を示して、環A及び環Bと共にフルオレン環を形成するか,又は酸素原子を介して環A及び環Bと共にキサンテン環を形成してもよく;
環Bは、r個のZR15に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、及びハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示し;
Yは、ヒドロキシ基、チオール基、NHR19(R19は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)又はハロゲン原子を示す。]
s個のR16は、それぞれ独立して酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
R14は、水素原子を示すか、R11と一緒になって単結合を示して、環A及び環Bと共にフルオレン環を形成するか,又は酸素原子を介して環A及び環Bと共にキサンテン環を形成してもよく;
環Bは、r個のZR15に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、及びハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示し;
Yは、ヒドロキシ基、チオール基、NHR19(R19は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)又はハロゲン原子を示す。]
[2]炭素数1~4のアルコールを含む溶液を溶離液として用いる高速液体クロマトグラフィー又は超臨界流体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする、液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体の脱保護後条件下で副生する液相ペプチド合成用担体由来の成分、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸及び液相ペプチド合成用担体が結合しているペプチド化合物から選ばれる1種以上の化合物と、目的ペプチド又は最終目的ペプチドとを同時に分析する方法であって、
前記液相ペプチド合成用担体が、下記の式(1)、(13)または(14)のいずれかの化合物である、分析方法。
前記液相ペプチド合成用担体が、下記の式(1)、(13)または(14)のいずれかの化合物である、分析方法。
(式中、X2は-CH2OR44(ここでR44は水素原子、ハロゲノカルボニル基、活性エステル型カルボニル基又は活性エステル型スルホニル基を示す)、-CH2NHR45(ここで、R45は水素原子、炭素数1~6の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、又はアラルキル基を示す)、ハロゲノメチル基、ホルミル基、又はオキシムを示し、R31、R32、R33、R34及びR35のうちの少なくとも1個は式(c)
で表される基を示し、残余は水素原子、ハロゲン原子、炭素数1~4のアルキル基又は炭素数1~4のアルコキシ基を示し;
R20は炭素数6~16の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示し;
X3はO又はCONR21(ここでR21は水素原子又は炭素数1~4のアルキル基を示す)を示し;
Dは式(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)又は(12)
R20は炭素数6~16の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示し;
X3はO又はCONR21(ここでR21は水素原子又は炭素数1~4のアルキル基を示す)を示し;
Dは式(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)又は(12)
(ここで、R37、R38、R39は、同一又は異なって、炭素数1~6の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、又は置換基を有していても良いアリール基を示し;R40は単結合又は炭素数1~3の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示し、R41、R42及びR43はそれぞれ、炭素数1~3の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示す)
で表される基を示す)
で表される基を示す)
(式中、X4は-OR61(ここでR61は水素原子、活性エステル型カルボニル基又は活性エステル型スルホニル基を示す)、-NHR45、アジド、ハロゲン、イソシアネート、X5と一緒になって=N-OH又は=Oを示し、X4が-OR61、-NHR45、アジド又はハロゲンの場合X5は水素原子又は炭素数1~4の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基若しくはアルケニル基、又はシクロアルキル基を示し、X4がイソシアネートの場合X5は炭素数1~4の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基若しくはアルケニル基、又はシクロアルキル基を示し;
R51~R60のうちの少なくとも1個は式(c)で表される基を示し、残余は水素原子、ハロゲン原子、炭素数1~4のアルキル基又は炭素数1~4のアルコキシ基を示し;
X4が-OR61、-NHR45、アジド又はハロゲンであり、かつX5が水素原子のとき、若しくはX4とX5が一緒になって=Oのとき、R55とR56は酸素原子を介して結合してキサンテン環を形成していてもよい)
R51~R60のうちの少なくとも1個は式(c)で表される基を示し、残余は水素原子、ハロゲン原子、炭素数1~4のアルキル基又は炭素数1~4のアルコキシ基を示し;
X4が-OR61、-NHR45、アジド又はハロゲンであり、かつX5が水素原子のとき、若しくはX4とX5が一緒になって=Oのとき、R55とR56は酸素原子を介して結合してキサンテン環を形成していてもよい)
(式中、X6はヒドロキシ基又はハロゲン原子を示し、R71~R85のうちの少なくとも1個は式(c)で表される基を示し、残余は水素原子、ハロゲン原子、炭素数1~4のアルキル基又は炭素数1~4のアルコキシ基を示し、R80とR81は単結合で結合してフルオレン環を形成していてもよく、酸素原子を介して結合してキサンテン環を形成していてもよい)
[3]炭素数1~4のアルコールを含む溶液を溶離液として用いる高速液体クロマトグラフィー又は超臨界流体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする、液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体の脱保護後条件下で副生する液相ペプチド合成用担体由来の成分、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸及び液相ペプチド合成用担体が結合しているペプチド化合物から選ばれる1種以上の化合物と、目的ペプチド又は最終目的ペプチドとを同時に分析する方法であって、
前記液相ペプチド合成用担体が、下記の式(20)または(21)のいずれかの化合物である、分析方法。
前記液相ペプチド合成用担体が、下記の式(20)または(21)のいずれかの化合物である、分析方法。
(式中、X2は-CH2OR44(ここでR44は水素原子、ハロゲノカルボニル基、活性エステル型カルボニル基又は活性エステル型スルホニル基を示す)、-CH2NHR45(ここで、R45は水素原子、炭素数1~6の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、又はアラルキル基を示す)、ハロゲノメチル基、ホルミル基、又はオキシムを示し、R31、R32、R33、R34及びR35のうちの少なくとも1個は式(d)
で表される基を示し、残余は水素原子、ハロゲン原子、炭素数1~4のアルキル基又は炭素数1~4のアルコキシ基を示し;
R20は炭素数6~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基またはアルキレン基を示し;
X3は存在しないか、酸素原子を示し;
Eは存在しないか、炭素数6~30の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示す。)
R20は炭素数6~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基またはアルキレン基を示し;
X3は存在しないか、酸素原子を示し;
Eは存在しないか、炭素数6~30の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示す。)
(式中、X4はヒドロキシル基または-NHR90(ここで、R90は水素原子、炭素数1~6の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、又はアラルキル基を示す)を示し、X5は水素原子又はハロゲン原子で置換されていても良いフェニル基を示し;
R51~R60のうちの少なくとも1個は式(d)で表される基を示し、残余は水素原子、ハロゲン原子、炭素数1~4のアルキル基又は炭素数1~4のアルコキシ基を示す。)
R51~R60のうちの少なくとも1個は式(d)で表される基を示し、残余は水素原子、ハロゲン原子、炭素数1~4のアルキル基又は炭素数1~4のアルコキシ基を示す。)
[4]前記液相ペプチド合成用担体が、アミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドに直接またはリンカーを介して結合して、それらを有機溶媒に溶解性で水に不溶性にする化合物である[1]~[3]のいずれかに記載の分析方法。
[5]分析に用いる試料が、分析対象物に対して固液分離を行っていない反応液である[1]~[4]のいずれかに記載の分析方法。
[6]分析に用いる試料が、分析対象物に対して固液分離又はクロマトグラフィーによる精製を行った後のものである[1]~[4]のいずれかに記載の分析方法。
[7]検出された又は検出されなかった液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体の脱保護後条件下で副生する液相ペプチド合成用担体由来の成分、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸及び液相ペプチド合成用担体が結合しているペプチド化合物から選ばれる1種以上の化合物と、検出された目的ペプチド又は検出された最終目的ペプチドとを関連付けて評価する[1]~[6]のいずれかに記載の方法。
[5]分析に用いる試料が、分析対象物に対して固液分離を行っていない反応液である[1]~[4]のいずれかに記載の分析方法。
[6]分析に用いる試料が、分析対象物に対して固液分離又はクロマトグラフィーによる精製を行った後のものである[1]~[4]のいずれかに記載の分析方法。
[7]検出された又は検出されなかった液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体の脱保護後条件下で副生する液相ペプチド合成用担体由来の成分、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸及び液相ペプチド合成用担体が結合しているペプチド化合物から選ばれる1種以上の化合物と、検出された目的ペプチド又は検出された最終目的ペプチドとを関連付けて評価する[1]~[6]のいずれかに記載の方法。
本発明によれば、液相ペプチド合成用担体と結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミド(以下、液相ペプチド合成用担体結合ペプチドということがある)が溶離液に溶解しないという問題や、液相ペプチド合成用担体結合ペプチドが溶出しないという問題が解決でき、液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体の脱保護後条件下で副生する液相ペプチド合成用担体由来の成分、又は液相ペプチド合成用担体が結合したアミノ酸若しくはペプチド化合物と、目的ペプチド又は最終目的ペプチドのような極性が大きく異なる成分とを同時に分析できる。また、HPLCにおいて、溶離液にさらに酸性化合物を加えることにより、一連のペプチド合成において、全く同じ溶離液を用いた分析で各工程の反応率を把握できる。さらに、ペプチド成分の分析も同時に行うことができるので、脱保護した後の目的ペプチド又は最終目的ペプチドに液相ペプチド合成用担体由来の成分が混入していないことも判断できる。
本発明の一態様は、アルコール類を溶離液として用いる高速液体クロマトグラフィー又は超臨界流体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする、液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体由来の成分、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸及び液相ペプチド合成用担体が結合しているペプチド化合物から選ばれる1種以上の化合物の分析方法である。本発明の分析方法の好ましい一態様としては、アルコール類を溶離液として用いる高速液体クロマトグラフィー又は超臨界流体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする、液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体由来の成分、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸及び液相ペプチド合成用担体が結合しているペプチド化合物から選ばれる1種以上の化合物と、目的ペプチド又は最終目的ペプチドとを同時に分析する方法が挙げられる。
また、本発明の分析方法の一態様としては、アルコール類を溶離液として用いる高速液体クロマトグラフィー又は超臨界流体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸及び液相ペプチド合成用担体が結合しているペプチド化合物から選ばれる1種以上の化合物を用いた液相ペプチド製造方法における、各工程の反応追跡又は後処理の追跡をする分析方法が挙げられる。
本発明のより好ましい態様は、液相ペプチド合成用担体とアミノ酸、ペプチド若しくはアミノ酸アミドが結合した化合物を用いる液相ペプチド製造方法の任意の段階又は当該方法で得られた目的ペプチド又は最終目的ペプチドを含有する試料を、アルコール類を溶離液として用いる高速液体クロマトグラフィー又は超臨界流体クロマトグラフィーに付すことを特徴とする、液相ペプチド合成用担体又は液相ペプチド合成用担体由来の化合物の分析方法である。
また、本発明の分析方法の一態様としては、アルコール類を溶離液として用いる高速液体クロマトグラフィー又は超臨界流体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸及び液相ペプチド合成用担体が結合しているペプチド化合物から選ばれる1種以上の化合物を用いた液相ペプチド製造方法における、各工程の反応追跡又は後処理の追跡をする分析方法が挙げられる。
本発明のより好ましい態様は、液相ペプチド合成用担体とアミノ酸、ペプチド若しくはアミノ酸アミドが結合した化合物を用いる液相ペプチド製造方法の任意の段階又は当該方法で得られた目的ペプチド又は最終目的ペプチドを含有する試料を、アルコール類を溶離液として用いる高速液体クロマトグラフィー又は超臨界流体クロマトグラフィーに付すことを特徴とする、液相ペプチド合成用担体又は液相ペプチド合成用担体由来の化合物の分析方法である。
本明細書において、目的ペプチドの語は、液相ペプチド合成用担体が結合したアミノ酸又はペプチドを用いて行う縮合反応により得られるペプチドであって、液相ペプチド合成用担体を脱離させた後のペプチドをいう。当該目的ペプチドは、液相ペプチド合成用担体が脱離したものであり、N末端又はC末端に保護基を有するペプチドである。なお、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基などのアミノ酸(アミノ酸残基)側鎖の官能基が、tBu基などの液相合成用担体ではない一般的な保護基により保護されていても良い。
最終目的ペプチドとは、前記目的ペプチドより、N末端若しくはC末端の保護基を脱離させたペプチド、又は、前記N末端若しくはC末端の保護基を脱離させたペプチドからさらに液相合成用担体ではない一般的な保護基保護基を脱離させた後のペプチドをいう。
分析とは、対象となる物質の中に含まれている各成分を分離し、含有量または含有率を定量的又は定性的に観測することを意味する。
追跡とは、時間経過と連動した化学反応の進行度を観測することをいい、当該化学反応に係る出発物質の減少、当該化学反応に係る生成物の増大等を観測することを意味する。より具体的には、アミノ保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチド(以下、アミノ基保護アミノ酸ということがある)の含量、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸又はペプチドの含量、液相ペプチド合成用担体又は液相ペプチド合成用担体由来の成分の含量、液相ペプチド合成用担体と結合した目的ペプチドや最終目的ペプチドの含量を定量的又は定性的に観測することをいう。
同時に分析するとは、HPLCカラムへの一回の試料の注入により、2以上の所望の成分を観測することをいう。より具体的には、目的ペプチドや最終目的ペプチドの含量と液相ペプチド合成用担体又は液相ペプチド合成用担体由来の成分の含量をHPLCカラムへの一回の試料の注入により定量的又は定性的に観測することをいう。
関連付けて評価するとは、例えば、検出された目的ペプチド又は検出された最終目的ペプチドと、検出された又は検出されなかった液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体由来の成分、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸及び液相ペプチド合成用担体が結合しているペプチド化合物から選ばれる1種以上の化合物との含量の比に基づき純度を算出する場合などをいう。
最終目的ペプチドとは、前記目的ペプチドより、N末端若しくはC末端の保護基を脱離させたペプチド、又は、前記N末端若しくはC末端の保護基を脱離させたペプチドからさらに液相合成用担体ではない一般的な保護基保護基を脱離させた後のペプチドをいう。
分析とは、対象となる物質の中に含まれている各成分を分離し、含有量または含有率を定量的又は定性的に観測することを意味する。
追跡とは、時間経過と連動した化学反応の進行度を観測することをいい、当該化学反応に係る出発物質の減少、当該化学反応に係る生成物の増大等を観測することを意味する。より具体的には、アミノ保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチド(以下、アミノ基保護アミノ酸ということがある)の含量、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸又はペプチドの含量、液相ペプチド合成用担体又は液相ペプチド合成用担体由来の成分の含量、液相ペプチド合成用担体と結合した目的ペプチドや最終目的ペプチドの含量を定量的又は定性的に観測することをいう。
同時に分析するとは、HPLCカラムへの一回の試料の注入により、2以上の所望の成分を観測することをいう。より具体的には、目的ペプチドや最終目的ペプチドの含量と液相ペプチド合成用担体又は液相ペプチド合成用担体由来の成分の含量をHPLCカラムへの一回の試料の注入により定量的又は定性的に観測することをいう。
関連付けて評価するとは、例えば、検出された目的ペプチド又は検出された最終目的ペプチドと、検出された又は検出されなかった液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体由来の成分、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸及び液相ペプチド合成用担体が結合しているペプチド化合物から選ばれる1種以上の化合物との含量の比に基づき純度を算出する場合などをいう。
本発明の分析方法の分析対象となる試料は、液相ペプチド合成用担体とアミノ酸、ペプチド若しくはアミノ酸アミドが結合した化合物を用いる液相ペプチド製造方法の任意の段階又は当該方法で得られた目的ペプチド又は最終目的ペプチドを含有する試料である。当該試料中には、液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体の脱保護後条件下で副生する液相ペプチド合成用担体由来の成分、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸又はペプチド、目的ペプチド、最終目的ペプチドの1種又は2種以上が含まれる。これらの試料の具体的な例としては、分析対象物に対して固液分離を行っていない反応液や分析対象物に対して固液分離又はクロマトグラフィーによる精製を行った後のものを挙げることができる。従来の方法では、分析対象物に対して固液分離を行っていない反応液を使用した場合には当然のことながら、分析対象物に対して固液分離又はクロマトグラフィーによる精製を行った後のものを試料として使用した場合であっても、本発明の態様である液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体の脱保護後条件下で副生する液相ペプチド合成用担体由来の成分、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸及び液相ペプチド合成用担体が結合しているペプチド化合物と、目的ペプチド又は最終目的ペプチドとの同時分析、特に、液相ペプチド合成用担体と最終目的ペプチドとの同時分析は困難であり、上記試料を用いた同時分析は本発明の好ましい形態の一つである。
本発明によれば、目的ペプチド又は最終目的ペプチドが含まれる組成物に対する、液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体の脱保護後条件下で副生する液相ペプチド合成用担体由来の成分、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸及び液相ペプチド合成用担体が結合しているペプチド化合物の混入の有無又は混入割合を、目的ペプチド又は最終目的ペプチドを分析するのと同時に判断することができる。
本発明によれば、目的ペプチド又は最終目的ペプチドが含まれる組成物に対する、液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体の脱保護後条件下で副生する液相ペプチド合成用担体由来の成分、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸及び液相ペプチド合成用担体が結合しているペプチド化合物の混入の有無又は混入割合を、目的ペプチド又は最終目的ペプチドを分析するのと同時に判断することができる。
まず、本発明の分析方法を好適に使用できる液相ペプチド合成用担体とアミノ酸、ペプチド若しくはアミノ酸アミドが結合した化合物を用いる液相ペプチド製造方法について説明する。
当該液相ペプチド製造方法は、次の工程a~eを含む液相ペプチド製造方法であるのが好ましい。
a.有機溶媒を含む溶媒中で、液相ペプチド合成用担体とアミノ酸、ペプチド、アミノ酸アミド又はアミノ保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸若しくはペプチドとを結合させる工程、
b.有機溶媒を含む溶媒中で、液相ペプチド合成用担体と結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドと、アミノ保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドとを縮合させる工程、
c.縮合反応後の反応液に、アミノ酸活性エステルスカベンジャーを添加する工程、
d.反応液中の前記アミノ保護基でアミノ基が保護された化合物のアミノ保護基を脱離する工程、
e.反応液に水溶液を添加した後、分液して、液相ペプチド合成用担体と結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドと、前記アミノ保護基が脱離したアミノ酸又はペプチドとの縮合体を含有する有機溶媒層を得る工程。
当該液相ペプチド製造方法は、次の工程a~eを含む液相ペプチド製造方法であるのが好ましい。
a.有機溶媒を含む溶媒中で、液相ペプチド合成用担体とアミノ酸、ペプチド、アミノ酸アミド又はアミノ保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸若しくはペプチドとを結合させる工程、
b.有機溶媒を含む溶媒中で、液相ペプチド合成用担体と結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドと、アミノ保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドとを縮合させる工程、
c.縮合反応後の反応液に、アミノ酸活性エステルスカベンジャーを添加する工程、
d.反応液中の前記アミノ保護基でアミノ基が保護された化合物のアミノ保護基を脱離する工程、
e.反応液に水溶液を添加した後、分液して、液相ペプチド合成用担体と結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドと、前記アミノ保護基が脱離したアミノ酸又はペプチドとの縮合体を含有する有機溶媒層を得る工程。
工程aに用いられる液相ペプチド合成用担体は、アミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドに直接又はリンカーを介して結合して、それらを有機溶媒に溶解性で水に不溶性にする化合物であるのが好ましい。
このような液相ペプチド合成用担体としては、例えば前記特許文献1-14に記載の化合物が挙げられる。好ましい液相ペプチド合成用担体としては、下記式(I)で表される化合物が挙げられる。
このような液相ペプチド合成用担体としては、例えば前記特許文献1-14に記載の化合物が挙げられる。好ましい液相ペプチド合成用担体としては、下記式(I)で表される化合物が挙げられる。
[式中、
環Aはヘテロ原子を含んでいてもよく、多環性でもよいC4~20の芳香環を示し;
R11は、水素原子であるか、又は環Aがベンゼン環でRbが下記式(a)で表される基である場合には、R14と一緒になって単結合を示して、環A及び環Bと共にフルオレン環を形成するか、又は酸素原子を介して環A及び環Bと共にキサンテン環を形成してもよく;
p個のXは、それぞれ独立して-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-、-NHC(=O)-、又は-NR17-(R17は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)を示し;
p個のR12は、それぞれ独立して酸素原子を介して脂肪族炭化水素基で置換されている脂肪族炭化水素基、又は式(b)のいずれかである有機基を示し;
環Aはヘテロ原子を含んでいてもよく、多環性でもよいC4~20の芳香環を示し;
R11は、水素原子であるか、又は環Aがベンゼン環でRbが下記式(a)で表される基である場合には、R14と一緒になって単結合を示して、環A及び環Bと共にフルオレン環を形成するか、又は酸素原子を介して環A及び環Bと共にキサンテン環を形成してもよく;
p個のXは、それぞれ独立して-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-、-NHC(=O)-、又は-NR17-(R17は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)を示し;
p個のR12は、それぞれ独立して酸素原子を介して脂肪族炭化水素基で置換されている脂肪族炭化水素基、又は式(b)のいずれかである有機基を示し;
但しR20は炭素数6~16の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示し、X3は酸素原子若しくは-C(=O)NR21-(R21は水素原子又は炭素数1~4のアルキル基を示す)を示し、Dはシリル基、又はシリルオキシ基が結合したアルキル基のいずれかを示す;
q個のR13は、それぞれ独立して水素原子であるか、又は酸素原子を介してシリル基若しくは脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
p、qは、それぞれ0~4の整数かつp+qが1以上4以下を示し;
環Aは、p個のXR12に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、及びハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子、又はハロゲン原子により置換されていてもよい芳香族環を示し;
Rbは、水素原子、ハロゲン原子により置換されていてもよい芳香環、又は式(a):
q個のR13は、それぞれ独立して水素原子であるか、又は酸素原子を介してシリル基若しくは脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
p、qは、それぞれ0~4の整数かつp+qが1以上4以下を示し;
環Aは、p個のXR12に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、及びハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子、又はハロゲン原子により置換されていてもよい芳香族環を示し;
Rbは、水素原子、ハロゲン原子により置換されていてもよい芳香環、又は式(a):
(式中、*は結合位置を示し;
r、sは、それぞれ0~4の整数かつr+sが4以下を示し;
r個のZは、それぞれ独立して-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-、-NHC(=O)-、又は-NR18-(R18は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)を示し;
r個のR15は、独立して脂肪族炭化水素基で置換されている脂肪族炭化水素基、又は式(b)のいずれかである有機基を示し;
r、sは、それぞれ0~4の整数かつr+sが4以下を示し;
r個のZは、それぞれ独立して-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-、-NHC(=O)-、又は-NR18-(R18は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)を示し;
r個のR15は、独立して脂肪族炭化水素基で置換されている脂肪族炭化水素基、又は式(b)のいずれかである有機基を示し;
但しR20は炭素数6~16の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示し、X3は酸素原子若しくは-C(=O)NR21-(R21は水素原子又は炭素数1~4のアルキル基を示す)を示し、Dはシリル基、又はシリルオキシ基が結合したアルキル基のいずれかを示す;
s個のR16は、それぞれ独立して酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
R14は、水素原子を示すか、R11と一緒になって単結合を示して、環A及び環Bと共にフルオレン環を形成するか,又は酸素原子を介して環A及び環Bと共にキサンテン環を形成してもよく;
環Bは、r個のZR15に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、及びハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示し;
Yは、ヒドロキシ基、チオール基、NHR19(R19は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)又はハロゲン原子を示す。]
s個のR16は、それぞれ独立して酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
R14は、水素原子を示すか、R11と一緒になって単結合を示して、環A及び環Bと共にフルオレン環を形成するか,又は酸素原子を介して環A及び環Bと共にキサンテン環を形成してもよく;
環Bは、r個のZR15に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、及びハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示し;
Yは、ヒドロキシ基、チオール基、NHR19(R19は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)又はハロゲン原子を示す。]
式(I)中の環Aは、ヘテロ原子を含んでいてもよく、単環性でも、多環性でよいC4~20の芳香環を示す。当該芳香環としては、C6~20の芳香族炭化水素環、及びC4~10の芳香族複素環が挙げられる。
具体的なC6~20の芳香族炭化水素環としては、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナントレン環、トリフェニレン環、テトラセン環、インダン環、インデン環、フルオレン環、ビフェニル環、1,1’-ビナフタレン環などが挙げられる。このうち、ベンゼン環、ナフタレン環、フェナントレン環、フルオレン環がより好ましい。ベンゼン環が最も好ましい。
C4~10の芳香族複素環としては、ヘテロ原子として窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる1~3個を含む5員環~10員環の芳香族複素環が好ましく、具体的には、ピロール環、フラン環、チオフェン環、インドール環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、カルバゾール環、ピラゾール環、インダゾール環、イミダゾール環、ピリジン環、キノリン環、イソキノリン環などが挙げられる。このうち、ヘテロ原子として窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる1~3個を含む5員環~8員環の芳香族複素環が好ましく、ピロール環、フラン環、チオフェン環、インドール環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、カルバゾール環、ピラゾール環、インダゾール環がより好ましい。
具体的なC6~20の芳香族炭化水素環としては、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナントレン環、トリフェニレン環、テトラセン環、インダン環、インデン環、フルオレン環、ビフェニル環、1,1’-ビナフタレン環などが挙げられる。このうち、ベンゼン環、ナフタレン環、フェナントレン環、フルオレン環がより好ましい。ベンゼン環が最も好ましい。
C4~10の芳香族複素環としては、ヘテロ原子として窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる1~3個を含む5員環~10員環の芳香族複素環が好ましく、具体的には、ピロール環、フラン環、チオフェン環、インドール環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、カルバゾール環、ピラゾール環、インダゾール環、イミダゾール環、ピリジン環、キノリン環、イソキノリン環などが挙げられる。このうち、ヘテロ原子として窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる1~3個を含む5員環~8員環の芳香族複素環が好ましく、ピロール環、フラン環、チオフェン環、インドール環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、カルバゾール環、ピラゾール環、インダゾール環がより好ましい。
R11は、水素原子を示すか、又は環Aがベンゼン環でRbが前記式(a)で表される基である場合には、R14と一緒になって単結合を示して、環A及び環Bと共にフルオレン環を形成するか、又は酸素原子を介して環A及び環Bと共にキサンテン環を形成してもよい。R11とR14が一緒になって形成してもよい環としては、フルオレン環又はキサンテン環が好ましい。
p個のXは、それぞれ独立して-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-、-NHC(=O)-、又は-NR17-(R17は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)を示す。-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-、又は-NR17-が好ましく、-O-、又は-NR17-がさらに好ましく、-O-又は-NHが最も好ましい。
ここで、R17としては、水素原子、C1~10のアルキル基又はC7~20のアラルキル基が好ましい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などの直鎖又は分岐鎖のC1~10のアルキル基が挙げられる。
アラルキル基としては、C7~16アラルキル基、例えば、ベンジル基、1-フェニルエチル基、2-フェニルエチル基、1-フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、1-ナフチルエチル基などが挙げられる。
ここで、R17としては、水素原子、C1~10のアルキル基又はC7~20のアラルキル基が好ましい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などの直鎖又は分岐鎖のC1~10のアルキル基が挙げられる。
アラルキル基としては、C7~16アラルキル基、例えば、ベンジル基、1-フェニルエチル基、2-フェニルエチル基、1-フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、1-ナフチルエチル基などが挙げられる。
p個のR12は、それぞれ独立して酸素原子を介して脂肪族炭化水素基で置換されている脂肪族炭化水素基、又は式(b)のいずれかである有機基を示し;
但しR20は炭素数6~16の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示し、X3は酸素原子若しくは-C(=O)NR21-(R21は水素原子又は炭素数1~4のアルキル基を示す)を示し、Dはシリル基、又はシリルオキシ基が結合したアルキル基のいずれかを示す;
q個のR13は、それぞれ独立して水素原子であるか、又は酸素原子を介してシリル基若しくは脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示す。
p、qは、それぞれ0~4の整数かつp+qが1以上4以下を示す。
q個のR13は、それぞれ独立して水素原子であるか、又は酸素原子を介してシリル基若しくは脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示す。
p、qは、それぞれ0~4の整数かつp+qが1以上4以下を示す。
本明細書において、脂肪族炭化水素基を有する有機基とは、その分子構造中に脂肪族炭化水素基を有する一価の有機基である。当該脂肪族炭化水素基を有する有機基中の脂肪族炭化水素基の部位は、特に限定されず、末端に存在してもよく、それ以外の部位に存在してもよい。
当該有機基中に存在する脂肪族炭化水素基とは、直鎖、分岐状若しくは環状の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基であり、有機溶媒溶解性の点から、C5以上の脂肪族炭化水素基が好ましく、C5~30の脂肪族炭化水素基がより好ましく、C8~30の脂肪族炭化水素基がさらに好ましい。当該脂肪族炭化水素基の具体例としては、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基等が挙げられるが、特にアルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基が好ましく、アルキル基がより好ましい。さらに、C5~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、C3~8のシクロアルキル基、C5~30の直鎖又は分岐鎖のアルケニル基が好ましく、C5~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、C3~8のシクロアルキル基がより好ましく、C5~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基がさらに好ましく、C8~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基がよりさらに好ましい。
当該有機基中に存在する脂肪族炭化水素基とは、直鎖、分岐状若しくは環状の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基であり、有機溶媒溶解性の点から、C5以上の脂肪族炭化水素基が好ましく、C5~30の脂肪族炭化水素基がより好ましく、C8~30の脂肪族炭化水素基がさらに好ましい。当該脂肪族炭化水素基の具体例としては、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基等が挙げられるが、特にアルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基が好ましく、アルキル基がより好ましい。さらに、C5~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、C3~8のシクロアルキル基、C5~30の直鎖又は分岐鎖のアルケニル基が好ましく、C5~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、C3~8のシクロアルキル基がより好ましく、C5~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基がさらに好ましく、C8~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基がよりさらに好ましい。
アルキル基の具体例としては、炭素数1~30のアルキル基が挙げられ、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、デシル基、ラウリル基、トリデシル基、ミリスチル基、セチル基、ステアリル基、アラキル基、べへニル基、テトラコサニル基、ヘキサコサニル基、イソステアリル基などの一価の基、それらから誘導される二価の基、各種ステロイド基から水酸基などを除外した基が挙げられる。
アルケニル基としては、ビニル基、1-プロぺニル基、アリル基、イソプロペニル基、ブテニル基、イソブテニル基、オレイル基などの一価の基、それらから誘導される二価の基が挙げられる。
アルキニル基としては、エチニル基、プロパルギル基、1-プロピニル基などが挙げられる。
アルケニル基としては、ビニル基、1-プロぺニル基、アリル基、イソプロペニル基、ブテニル基、イソブテニル基、オレイル基などの一価の基、それらから誘導される二価の基が挙げられる。
アルキニル基としては、エチニル基、プロパルギル基、1-プロピニル基などが挙げられる。
上記の脂肪族炭化水素基には、酸素原子を介して脂肪族炭化水素基が置換していてもよい。脂肪族炭化水素基に酸素原子を介して置換し得る脂肪族炭化水素基としては、炭素数1~20の直鎖又は分岐鎖のアルコキシ基、炭素数2~20のアルケニルオキシ基、炭素数3~6のシクロアルキルオキシ基などの一価の基、それらから誘導される二価の基などが挙げられる。また、酸素原子を介して脂肪族炭化水素基が置換している脂肪族炭化水素基に、さらに酸素原子を介して脂肪族炭化水素基が置換した繰り返し構造を有していてもよい。
具体的には、R12として12-ドコシルオキシ-1-ドデシル基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル基、2,2,2-トリス(オクタデシルオキシメチル)エチル基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロへキシルメチル基などが挙げられる。これら3種が好ましい。
具体的には、R12として12-ドコシルオキシ-1-ドデシル基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル基、2,2,2-トリス(オクタデシルオキシメチル)エチル基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロへキシルメチル基などが挙げられる。これら3種が好ましい。
上記の脂肪族炭化水素基には、酸素原子を介してシリル基若しくは脂肪族炭化水素基が置換されていてもよく、その置換基の例としては、次の式(b)で示される基が挙げられる。
ここで、R20は炭素数6~16の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示し、X3は酸素原子若しくは-C(=O)NR21-(R21は水素原子又は炭素数1~4のアルキル基を示す)を示し、Dはシリル基、又はシリルオキシ基が結合したアルキル基のいずれかである有機基が置換していてもよい。
シリル基としては、1~3個のアルキル基又は1~3個のアリール基が置換したシリル基が好ましく、炭素数1~6の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が3個置換したシリル基、置換基を有していてもよい炭素数6~10のアリール基が3個置換したシリル基がより好ましい。ここで、アリール基としては、フェニル基、ナフチル基などが挙げられる。
好ましいシリル基としては、炭素数1~6の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が3個置換したシリル基であり、より好ましくは炭素数1~4の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が3個置換したシリル基である。シリル基に置換する3個のアルキル基又はアリール基は、同一でも異なっていてもよい。
また、シリルオキシ基が結合したアルキル基としては、炭素数1~6の直鎖又は分岐鎖のアルキル基及び置換基を有していてもよいアリール基から選ばれる3個が置換したシリルオキシ基が1~3個結合した、炭素数1~13の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が好ましい。好ましいシリルオキシ基としては、炭素数1~6の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が3個置換したシリルオキシ基であり、より好ましくは炭素数1~4の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が3個置換したシリルオキシ基である。シリルオキシ基に置換する3個のアルキル基又はアリール基は、同一でも異なっていてもよい。
炭素数1~13の直鎖又は分岐鎖のアルキル基は、分岐鎖であることが好ましく、4級炭素原子を有することがさらに好ましい。
p、qは、それぞれ0~4の整数かつp+qが1以上4以下を示す。ここで、pは、1~4が好ましく、1~3がより好ましく、1~2がさらに好ましい。
環Aは、p個のXR12に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、及びハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。
ハロゲン原子としては、塩素原子、フッ素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、トリフルオロメチル基などが挙げられる。ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、sec-ブチルオキシ基、tert-ブチルオキシ基、トリクロロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基などが挙げられる。
ハロゲン原子としては、塩素原子、フッ素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、トリフルオロメチル基などが挙げられる。ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、sec-ブチルオキシ基、tert-ブチルオキシ基、トリクロロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基などが挙げられる。
Raは、水素原子、又はハロゲン原子により置換されていてもよい芳香族環を示す。
ここで、芳香族環としては、C6~18の芳香族炭化水素環、及びC4~10の芳香族複素環が挙げられる。
具体的なC6~18の芳香族炭化水素環としては、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナントレン環、トリフェニレン環、テトラセン環、インダン環、インデン環、フルオレン環、ビフェニル環などが挙げられる。このうち、ベンゼン環、ナフタレン環、フェナントレン環、フルオレン環がより好ましい。ベンゼン環が最も好ましい。
C4~10の芳香族複素環としては、ヘテロ原子として窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる1~3個を含む5員環~10員環の複素環が好ましく、具体的には、ピロール環、フラン環、チオフェン環、インドール環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、カルバゾール環、ピラゾール環、インダゾール環、イミダゾール環、ピリジン環、キノリン環、イソキノリン環などが挙げられる。このうち、ヘテロ原子として窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる1~3個を含む5員環~8員環の複素環が好ましく、ピロール環、フラン環、チオフェン環、インドール環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、カルバゾール環、ピラゾール環、インダゾール環がより好ましい。
Raの芳香族環には、1~3個のハロゲン原子が置換していてもよい。
ここで、芳香族環としては、C6~18の芳香族炭化水素環、及びC4~10の芳香族複素環が挙げられる。
具体的なC6~18の芳香族炭化水素環としては、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナントレン環、トリフェニレン環、テトラセン環、インダン環、インデン環、フルオレン環、ビフェニル環などが挙げられる。このうち、ベンゼン環、ナフタレン環、フェナントレン環、フルオレン環がより好ましい。ベンゼン環が最も好ましい。
C4~10の芳香族複素環としては、ヘテロ原子として窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる1~3個を含む5員環~10員環の複素環が好ましく、具体的には、ピロール環、フラン環、チオフェン環、インドール環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、カルバゾール環、ピラゾール環、インダゾール環、イミダゾール環、ピリジン環、キノリン環、イソキノリン環などが挙げられる。このうち、ヘテロ原子として窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる1~3個を含む5員環~8員環の複素環が好ましく、ピロール環、フラン環、チオフェン環、インドール環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、カルバゾール環、ピラゾール環、インダゾール環がより好ましい。
Raの芳香族環には、1~3個のハロゲン原子が置換していてもよい。
Rbは、水素原子、ハロゲン原子により置換されていてもよい芳香族環、又は前記式(a)で表される基を示す。
式(a)中のr、sは、それぞれ0~4の整数かつr+sが0~4を示す。
rは、0~4が好ましく、1~3がより好ましく、1~2がさらに好ましい。
式(a)中のr、sは、それぞれ0~4の整数かつr+sが0~4を示す。
rは、0~4が好ましく、1~3がより好ましく、1~2がさらに好ましい。
r個のZは、それぞれ独立して-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-、-NHC(=O)-、又は-NR18-(R18は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)を示す。-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-、又は-NR17-が好ましく、-O-、又は-NR17-がさらに好ましく、-O-又は-NHが最も好ましい。
ここで、R18としては、水素原子、C1~10のアルキル基又はC7~20のアラルキル基が好ましい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。
アラルキル基としては、C7~16アラルキル基、例えば、ベンジル基、1-フェニルエチル基、2-フェニルエチル基、1-フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、1-ナフチルエチル基などが挙げられる。
ここで、R18としては、水素原子、C1~10のアルキル基又はC7~20のアラルキル基が好ましい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。
アラルキル基としては、C7~16アラルキル基、例えば、ベンジル基、1-フェニルエチル基、2-フェニルエチル基、1-フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、1-ナフチルエチル基などが挙げられる。
r個のR15は、独立して酸素原子を介して脂肪族炭化水素基で置換されている脂肪族炭化水素基、又は式(b)のいずれかである有機基を示し;
但しR20は炭素数6~16の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示し、X3は酸素原子若しくは-C(=O)NR21-(R21は水素原子又は炭素数1~4のアルキル基を示す)を示し、Dはシリル基、又はシリルオキシ基が結合したアルキル基のいずれかを示す。
s個のR16は、それぞれ独立して酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示す。
R15及びR16で表される酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基は、前記のR12及びR13と同じものが挙げられ、前記のR12及びR13と同じものが好ましい。
R15及びR16で表される酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基は、前記のR12及びR13と同じものが挙げられ、前記のR12及びR13と同じものが好ましい。
R14は、水素原子を示すか、R11と一緒になって単結合を示して、環A及び環Bと共にフルオレン環を形成するか,又は酸素原子を介して環A及び環Bと共にキサンテン環を形成してもよい。
環Bは、r個のZR15に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、及びハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。
ハロゲン原子としては、塩素原子、フッ素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、トリフルオロメチル基などが挙げられる。ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、sec-ブチルオキシ基、tert-ブチルオキシ基、トリクロロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基などが挙げられる。
ハロゲン原子としては、塩素原子、フッ素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、トリフルオロメチル基などが挙げられる。ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、sec-ブチルオキシ基、tert-ブチルオキシ基、トリクロロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基などが挙げられる。
Yは、ヒドロキシ基、チオール基、NHR19(R19は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)又はハロゲン原子を示す。
ここで、R19としては、水素原子、C1~10のアルキル基又はC7~20のアラルキル基が好ましい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。
アラルキル基としては、C7~16アラルキル基、例えば、ベンジル基、1-フェニルエチル基、2-フェニルエチル基、1-フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、1-ナフチルエチル基などが挙げられる。
ここで、R19としては、水素原子、C1~10のアルキル基又はC7~20のアラルキル基が好ましい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。
アラルキル基としては、C7~16アラルキル基、例えば、ベンジル基、1-フェニルエチル基、2-フェニルエチル基、1-フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、1-ナフチルエチル基などが挙げられる。
前記の式(I)の化合物のうち、好ましい液相ペプチド合成用担体の具体例としては、下記式(1)、(13)又は(14)で表される化合物が挙げられる。その一つとしては、式(1)で表される化合物を用いることができる(特許文献6、7)。
(式中、X2は-CH2OR44(ここでR44は水素原子、ハロゲノカルボニル基、活性エステル型カルボニル基又は活性エステル型スルホニル基を示す)、-CH2NHR45(ここで、R45は水素原子、炭素数1~6の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、又はアラルキル基を示す)、ハロゲノメチル基、ホルミル基、又はオキシムを示し、R31、R32、R33、R34及びR35のうちの少なくとも1個は式(c)
で表される基を示し、残余は水素原子、ハロゲン原子、炭素数1~4のアルキル基又は炭素数1~4のアルコキシ基を示し;
R20は炭素数6~16の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示し;
X3はO又はCONR21(ここでR21は水素原子又は炭素数1~4のアルキル基を示す)を示し;
Dは式(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)又は(12)
R20は炭素数6~16の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示し;
X3はO又はCONR21(ここでR21は水素原子又は炭素数1~4のアルキル基を示す)を示し;
Dは式(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)又は(12)
(ここで、R37、R38、R39は、同一又は異なって、炭素数1~6の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、又は置換基を有していても良いアリール基を示し;R40は単結合又は炭素数1~3の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示し、R41、R42及びR43はそれぞれ、炭素数1~3の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示す)
で表される基を示す)
で表される基を示す)
また、液相ペプチド合成用担体としては、式(13)で表される化合物を用いることができる(特許文献8、9、12)。
(式中、X4は-OR61(ここでR61は水素原子、活性エステル型カルボニル基又は活性エステル型スルホニル基を示す)、-NHR45、アジド、ハロゲン、イソシアネート、X5と一緒になって=N-OH又は=Oを示し、X4が-OR61、-NHR45、アジド又はハロゲンの場合X5は水素原子又は炭素数1~4の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基若しくはアルケニル基、又はシクロアルキル基を示し、X4がイソシアネートの場合X5は炭素数1~4の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基若しくはアルケニル基、又はシクロアルキル基を示し;
R51~R60のうちの少なくとも1個は式(c)で表される基を示し、残余は水素原子、ハロゲン原子、炭素数1~4のアルキル基又は炭素数1~4のアルコキシ基を示し;
X4が-OR61、-NHR45、アジド又はハロゲンであり、かつX5が水素原子のとき、若しくはX4とX5が一緒になって=Oのとき、R55とR56は酸素原子を介して結合してキサンテン環を形成していてもよい)
R51~R60のうちの少なくとも1個は式(c)で表される基を示し、残余は水素原子、ハロゲン原子、炭素数1~4のアルキル基又は炭素数1~4のアルコキシ基を示し;
X4が-OR61、-NHR45、アジド又はハロゲンであり、かつX5が水素原子のとき、若しくはX4とX5が一緒になって=Oのとき、R55とR56は酸素原子を介して結合してキサンテン環を形成していてもよい)
また、液相ペプチド合成用担体としては、式(14)で表される化合物を用いることができる(特許文献10、11)。
(式中、X6はヒドロキシ基又はハロゲン原子を示し、R71~R85のうちの少なくとも1個は式(c)で表される基を示し、残余は水素原子、ハロゲン原子、炭素数1~4のアルキル基又は炭素数1~4のアルコキシ基を示し、R80とR81は単結合で結合してフルオレン環を形成していてもよく、酸素原子を介して結合してキサンテン環を形成していてもよい)
さらに、前記の式(I)の化合物のうち、好ましい液相ペプチド合成用担体の具体例としては、下記式(20)又は(21)で表される化合物が挙げられる。その一つとしては、式(20)で表される化合物を用いることができる(特許文献2、5)。
(式中、X2はヒドロキシル基または-NHR90(ここで、R90は水素原子、炭素数1~6の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、又はアラルキル基を示す)を示し、R31、R32、R33、R34及びR35のうちの少なくとも1個は式(d)
で表される基を示し、残余は水素原子、ハロゲン原子、炭素数1~4のアルキル基又は炭素数1~4のアルコキシ基を示し;
R20は炭素数6~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基またはアルキレン基を示し;
X3は存在しないか、酸素原子を示し;
Eは存在しないか、炭素数6~30の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示す)
R20は炭素数6~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基またはアルキレン基を示し;
X3は存在しないか、酸素原子を示し;
Eは存在しないか、炭素数6~30の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示す)
また、液相ペプチド合成用担体としては、式(21)で表される化合物を用いることができる(特許文献3、4)。
(式中、X4はヒドロキシル基または-NHR90(ここで、R90は水素原子、炭素数1~6の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、又はアラルキル基を示す)を示し、X5は水素原子又はハロゲン原子で置換されていても良いフェニル基を示し;
R51~R60のうちの少なくとも1個は式(d)で表される基を示し、残余は水素原子、ハロゲン原子、炭素数1~4のアルキル基又は炭素数1~4のアルコキシ基を示す)
R51~R60のうちの少なくとも1個は式(d)で表される基を示し、残余は水素原子、ハロゲン原子、炭素数1~4のアルキル基又は炭素数1~4のアルコキシ基を示す)
本発明の製造法に用いられる原料の一つである、液相ペプチド合成用担体に結合したアミノ酸又は液相ペプチド合成用担体に結合したペプチドとは、アミノ酸又はペプチドの反応性基の一つが前記の液相ペプチド合成用担体と結合しており、少なくとも一つのアミノ基が反応性の状態であるアミノ酸又はペプチドをいう。好ましくは、アミノ酸又はペプチドのカルボキシル基が前記の液相ペプチド合成用担体と結合し、一方、アミノ基は保護されておらず反応性であるものである。液相ペプチド合成用担体と結合したアミノ酸アミドとは、アミノ酸アミドの少なくとも一つのアミド基が前記の液相ペプチド合成用担体と結合し、少なくとも一つのアミノ基は保護されておらず反応性であるアミノ酸アミドをいう。
なお、液相ペプチド合成用担体と結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドが、水酸基、アミノ基、グアニジル基、カルボキシル基、チオール基、インドール基、イミダゾール基等の反応性に富む官能基を有する場合、これらの官能基にペプチド合成で用いられる一般的な保護基が導入されていてもよく、反応終了後に、必要に応じて保護基を除去することで目的化合物を得ることができる。その場合の水酸基の保護基としてはtBu基、Trt基、Bz基、アセチル基、シリル基等が挙げられ、アミノ基の保護基としては、Boc基、Fmoc基、Cbz基、Trt基、Mmt基、ivDde基等が挙げられ、グアニジル基の保護基としては、Pbf基、Pmc基、ニトロ基等が挙げられ、カルボキシル基の保護基としてはtBu基、メチル基、エチル基、Bz基等が挙げられ、チオール基の保護基としては、Trt基、Acm基、tBu基、S-tBu基等が挙げられ、インドール基の保護基としては、Boc基等が挙げられ、イミダゾール基の保護基としては、Boc基、Bom基、Bum基、Trt基等を挙げることができる。
なお、液相ペプチド合成用担体と結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドが、水酸基、アミノ基、グアニジル基、カルボキシル基、チオール基、インドール基、イミダゾール基等の反応性に富む官能基を有する場合、これらの官能基にペプチド合成で用いられる一般的な保護基が導入されていてもよく、反応終了後に、必要に応じて保護基を除去することで目的化合物を得ることができる。その場合の水酸基の保護基としてはtBu基、Trt基、Bz基、アセチル基、シリル基等が挙げられ、アミノ基の保護基としては、Boc基、Fmoc基、Cbz基、Trt基、Mmt基、ivDde基等が挙げられ、グアニジル基の保護基としては、Pbf基、Pmc基、ニトロ基等が挙げられ、カルボキシル基の保護基としてはtBu基、メチル基、エチル基、Bz基等が挙げられ、チオール基の保護基としては、Trt基、Acm基、tBu基、S-tBu基等が挙げられ、インドール基の保護基としては、Boc基等が挙げられ、イミダゾール基の保護基としては、Boc基、Bom基、Bum基、Trt基等を挙げることができる。
液相ペプチド合成用担体は、アミノ酸又はペプチドのカルボキシル基に、直接又はリンカーを介して結合するように導入される。
ここでいうリンカーとは、リンカーの一方がカルボキシル基と結合し、他方が液体ペプチド合成用担体と結合する2つの反応基をもつ有機基である。好ましいリンカーは、分子量が約2000以下(好ましくは約1500以下、より好ましくは約1000以下)の有機基であって、反応基として、同じでも異なってもよく、アミノ基、カルボキシル基、及びハロメチル基からなる群より選ばれる少なくとも2つの基を分子内にもつ化合物である。例えば、以下の化合物を挙げることができる。
ここでいうリンカーとは、リンカーの一方がカルボキシル基と結合し、他方が液体ペプチド合成用担体と結合する2つの反応基をもつ有機基である。好ましいリンカーは、分子量が約2000以下(好ましくは約1500以下、より好ましくは約1000以下)の有機基であって、反応基として、同じでも異なってもよく、アミノ基、カルボキシル基、及びハロメチル基からなる群より選ばれる少なくとも2つの基を分子内にもつ化合物である。例えば、以下の化合物を挙げることができる。
(式中、tは1~6、好ましくは1~4の整数である)
(式中、X9はハロゲン原子、好ましくは塩素又は臭素である)
(式中、uは2~40、好ましくは2~35、より好ましくは、2~28の整数である)
(上記リンカーの構造式は、カルボキシル基等に結合する前の状態かつ液体ペプチド合成用担体と結合する前の状態を示す)
(上記リンカーの構造式は、カルボキシル基等に結合する前の状態かつ液体ペプチド合成用担体と結合する前の状態を示す)
上記リンカーを含む液相ペプチド合成用担体のカルボキシル基への導入は、上記リンカーの一方をカルボキシル基に結合した後に他方を液相ペプチド合成用担体に結合しても良く、あるいは、上記リンカーの一方を液相ペプチド合成用担体に結合した後に他方をカルボキシル基に結合してもよい。これらのリンカーのカルボキシル基への導入手段は、公知の方法を適宜参照して行うことができる。例えば、ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCI)/HOBtによるアミド化を挙げることができる。また、上記リンカーの一方と液相ペプチド合成用担体との結合は、互いに結合するリンカーの基及び液体ペプチド合成用担体の基に応じて、公知の方法を適宜参照して行うことができる。例えば、DIPCIによるエステル化を挙げることができる。
前記の液相ペプチド合成用担体と結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドは、液相ペプチド合成用担体をTHF等の有機溶媒に溶解し、例えばBoc保護アミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミド及び縮合剤、例えば、DIPCIを添加して縮合を行い、アミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドのカルボキシル基に液相ペプチド合成用担体が結合した中間体であるN-Boc-液相合成用担体保護アミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドを製造できる。
もう一方の原料である、アミノ保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドとは、アミノ酸又はペプチドのアミノ基がアミノ保護基で保護されており、一方、カルボキシル基は保護されておらず反応性であるアミノ酸又はペプチドを意味する。アミノ酸又はペプチドが1以上のアミノ基を有する場合は、少なくとも一つのアミノ基がアミノ保護基で保護されていれば良い。
アミノ保護基としては、Fmоc基、Bоc基、Cbz基、Ac基などが挙げられ、このうち塩基性条件で脱保護できるFmоc基がより好ましい。
なお、アミノ保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドが、水酸基、アミノ基、グアニジル基、カルボキシル基、チオール基、インドール基、イミダゾール基等の反応性に富む官能基を有する場合、これらの官能基にペプチド合成で用いられる一般的な保護基が導入されていてもよく、反応終了後の任意の時点で、必要に応じて保護基を除去することで目的化合物を得ることができる。
水酸基の保護基としてはtBu基、Trt基、Bz基、アセチル基、シリル基等が挙げられ、アミノ基の保護基としては、Boc基、Fmoc基、Cbz基、Trt基、Mmt基、ivDde基等が挙げられ、グアニジル基の保護基としては、Pbf基、Pmc基、ニトロ基等が挙げられ、カルボキシル基の保護基としてはtBu基、メチル基、エチル基、Bz基等が挙げられ、チオール基の保護基としては、Trt基、Acm基、tBu基、S-tBu基等が挙げられ、インドール基の保護基としては、Boc基等が挙げられ、イミダゾール基の保護基としては、Boc基、Bom基、Bum基、Trt基等を挙げることができる。
アミノ保護基としては、Fmоc基、Bоc基、Cbz基、Ac基などが挙げられ、このうち塩基性条件で脱保護できるFmоc基がより好ましい。
なお、アミノ保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドが、水酸基、アミノ基、グアニジル基、カルボキシル基、チオール基、インドール基、イミダゾール基等の反応性に富む官能基を有する場合、これらの官能基にペプチド合成で用いられる一般的な保護基が導入されていてもよく、反応終了後の任意の時点で、必要に応じて保護基を除去することで目的化合物を得ることができる。
水酸基の保護基としてはtBu基、Trt基、Bz基、アセチル基、シリル基等が挙げられ、アミノ基の保護基としては、Boc基、Fmoc基、Cbz基、Trt基、Mmt基、ivDde基等が挙げられ、グアニジル基の保護基としては、Pbf基、Pmc基、ニトロ基等が挙げられ、カルボキシル基の保護基としてはtBu基、メチル基、エチル基、Bz基等が挙げられ、チオール基の保護基としては、Trt基、Acm基、tBu基、S-tBu基等が挙げられ、インドール基の保護基としては、Boc基等が挙げられ、イミダゾール基の保護基としては、Boc基、Bom基、Bum基、Trt基等を挙げることができる。
アミノ保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドは、例えば、アミノ保護基でアミノ基を保護したいアミノ酸又はペプチドに、例えばTHFなどの溶媒中でクロロギ酸9-フルオレニルメチルエステルを縮合剤の存在下に反応させることにより、製造することができる。
本発明の工程bは前記の化合物を縮合させる工程であり、工程bに用いられる反応溶媒は有機溶媒を含む溶媒である。本発明で用いる前記の液相ペプチド合成用担体でアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドを保護すれば、当該液相ペプチド合成用担体で保護されたアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドが、有機溶媒に溶解するようになるため、液相ペプチド合成が可能となる。
そのような有機溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン(THF)、ジメチルホルムアミド(DMF)、シクロヘキサン、シクロペンチルメチルエーテル(CPME),メチル-tert-ブチルエーテル(MTBE)、2-メチルTHF、4-メチルテトラヒドロピラン(4-メチルTHP)、酢酸イソプロピル、クロロホルム、ジクロロメタン、N-メチルピロリドンを挙げることができ、好ましくは、THF、DMF、シクロヘキサン、CPME,MTBE、2-メチルTHF、4-メチルTHP、酢酸イソプロピル、N-メチルピロリドンである。さらに、上記溶媒の2種以上の混合溶媒でもよい。
そのような有機溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン(THF)、ジメチルホルムアミド(DMF)、シクロヘキサン、シクロペンチルメチルエーテル(CPME),メチル-tert-ブチルエーテル(MTBE)、2-メチルTHF、4-メチルテトラヒドロピラン(4-メチルTHP)、酢酸イソプロピル、クロロホルム、ジクロロメタン、N-メチルピロリドンを挙げることができ、好ましくは、THF、DMF、シクロヘキサン、CPME,MTBE、2-メチルTHF、4-メチルTHP、酢酸イソプロピル、N-メチルピロリドンである。さらに、上記溶媒の2種以上の混合溶媒でもよい。
縮合反応は、前記有機溶媒を含む溶媒中で、液相ペプチド合成用担体結合ペプチドと、アミノ基保護アミノ酸と、縮合剤とを混合することにより行うことができる。
液相ペプチド合成用担体結合ペプチドに対する、アミノ基保護アミノ酸の使用量は、液相ペプチド合成用担体結合ペプチドに対して、通常1.01~4当量、好ましくは1.03~3当量、より好ましくは1.05~2当量、さらに好ましくは1.1~1.5当量である。本発明のペプチド製造法では、未反応のアミノ酸の活性エステルをその後に添加するスカベンジャーで捕捉して不活性化することができる。そのため、過剰のアミノ基保護アミノ酸を用いても、残存の問題が生じない。
縮合剤としては、ペプチド合成において一般的に用いられる縮合剤を、本発明においても用いることができる、例えば、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホニウムクロリド(DMT-MM)、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU)、O-(6-クロロベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU(6-Cl))、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TBTU)、O-(6-クロロベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TCTU)、(1-シアノ-2-エトキシ-2-オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ-モルホリノ-カルベニウムヘキサフルオロリン酸塩(COMU)、ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCI)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、及び1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(WSC)を挙げることができる。好ましくは、DMT-MM、HBTU、HATU、又はCOMUである。縮合剤の使用量は、液相ペプチド合成用担体結合ペプチドに対して、好ましくは1~4当量、より好ましくは1~2当量、さらに好ましくは1.05~1.3当量である。
縮合工程において、反応を促進し、ラセミ化などの副反応を抑制するために、好ましくは、活性化剤が添加される。ここで活性化剤とは、縮合剤との共存化で、アミノ酸を、対応する活性エステル、対称酸無水物などに導いて、ペプチド結合(アミド結合)を形成させやすくする試薬である。活性化剤としては、ペプチド合成において一般的に用いられる活性化剤を用いることができる。例えば、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、1-ヒドロキシ-1H-1,2,3-トリアゾールカルボン酸エチル(HOCt)、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAt)、3-ヒドロキシ-4-ケトベンゾトリアジン(HOOBt)、N-ヒドロキシコハク酸イミド(HOSu)、N-ヒドロキシフタルイミド(HOPht)、N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド(HONb)、ペンタフルオロフェノール、シアノ(ヒドロキシイミノ)酢酸エチル(Oxyma)等を挙げることができる。好ましくは、HOBt、HOOBt、HOCt、HOAt、HONb、HOSu、Oxymaである。活性化剤の使用量は、液相ペプチド合成用担体結合ペプチドに対して、好ましくは1~4当量、より好ましくは1~2当量、さらに好ましくは1.05~1.3当量である。
前記溶媒の使用量は、液相ぺプチド合成用担体結合ペプチド等を溶解した濃度が、好ましくは0.1mM~1Mとなる量であり、より好ましくは1mM~0.5Mとなる量である。
反応温度は、ペプチド合成において一般的に用いられる温度が、例えば、-20~40℃が好ましく、より好ましくは0~30℃である。反応時間(1サイクルの時間)は、通常0.5~30時間である。
反応温度は、ペプチド合成において一般的に用いられる温度が、例えば、-20~40℃が好ましく、より好ましくは0~30℃である。反応時間(1サイクルの時間)は、通常0.5~30時間である。
工程cは、縮合反応後の反応液に、アミノ酸活性エステルスカベンジャーを添加する工程である。
アミノ酸活性エステルスカベンジャーとしては、有機溶媒中で反応を継続する観点から、アミノ基含有化合物が好ましく、特に2価以上の水溶性アミン、アルキルアミン、芳香族アミン、ヒドロキシルアミン、アミノスルホン酸類、アミノ硫酸類、アミノホスホン酸類、アミノリン酸類及びアミノアルコール類から選ばれるアミノ基含有化合物が好ましい。
アミノ酸活性エステルスカベンジャーとしては、有機溶媒中で反応を継続する観点から、アミノ基含有化合物が好ましく、特に2価以上の水溶性アミン、アルキルアミン、芳香族アミン、ヒドロキシルアミン、アミノスルホン酸類、アミノ硫酸類、アミノホスホン酸類、アミノリン酸類及びアミノアルコール類から選ばれるアミノ基含有化合物が好ましい。
2価以上の水溶性アミンとしては、例えば、1-メチルピペラジン、4-アミノピペリジン、ジエチレントリアミン、トリアミノエチルアミン、1-エチルピペラジン、N,N-ジメチルエチレンジアミン、エチレンジアミン、ピペラジンを挙げることができ、好ましくは、1-メチルピペラジン、4-アミノピペリジン、ジエチレントリアミン、N,N-ジメチルエチレンジアミン、エチレンジアミンであり、より好ましくは、1-メチルピペラジン、4-アミノピペリジン、N,N-ジメチルエチレンジアミン、ジエチレントリアミンであり、さらに好ましくは、1-メチルピペラジンである。
用いることができるアルキルアミンとしては、例えば、炭素数1~14のアルキルアミンを挙げることができ、好ましくは炭素数2~10のアルキルアミン、より好ましくは炭素数2~8のアルキルアミン、さらに好ましくは炭素数3~4のアルキルアミンである。また本発明で用いることができる芳香族アミンとしては、たとえば炭素数6~14の芳香族アミンを挙げることができ、好ましくは炭素数6~10の芳香族アミンである。具体的なアルキルアミン、芳香族アミン、ヒドロキシルアミンとしては、これに限定されないが、例えば、プロピルアミン、ブチルアミン、ヘキシルアミン、アニリン、トルイジン、2,4,6-トリメチルアニリン、アニシジン、フェネチジン、ヒドロキシルアミンをあげることができ、特に好ましくは、プロピルアミンである。
アミノスルホン酸類、アミノ硫酸類、アミノホスホン酸類、アミノリン酸類及びアミノアルコール類としては、下記の一般式(15)~(17)で示される化合物が好ましい。
すなわち、次の一般式(15)で表されるアミノスルホン酸類及びアミノ硫酸類;
アミノスルホン酸類、アミノ硫酸類、アミノホスホン酸類、アミノリン酸類及びアミノアルコール類としては、下記の一般式(15)~(17)で示される化合物が好ましい。
すなわち、次の一般式(15)で表されるアミノスルホン酸類及びアミノ硫酸類;
(R91は炭素数1~10の2価の有機基を示し、X7は単結合又は酸素原子を示す)
一般式(16)で表されるアミノホスホン酸類及びアミノリン酸類;
一般式(16)で表されるアミノホスホン酸類及びアミノリン酸類;
(R92は炭素数1~10の2価の有機基を示し、X8は単結合又は酸素原子を示す)
一般式(17)で表されるアミノアルコール類が好ましい。
一般式(17)で表されるアミノアルコール類が好ましい。
(nは0~20の整数を示し、R93、R94はそれぞれ独立して水素原子、メチル基、エチル基、又はヒドロキシメチル基を示す)
一般式(15)中のR91及び一般式(16)のR92は、独立して、炭素数1~10の2価の有機基であり、好ましくは、炭素数1~10の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基、炭素数6~10のアリーレン基が挙げられる。具体的には、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、プロピレン基、テトラメチレン基、ブチレン基、ペンタメチレン基、フェニレン基、ナフチレン基などが挙げられる。
このうち、これらの化合物の溶解性の点から、炭素数1~6の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基、炭素数6~8のアリーレン基がより好ましく、炭素数1~6の直鎖又は分岐際のアルキレン基がさらに好ましく、炭素数1~5の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基がよりさらに好ましい。
一般式(15)において、X7が単結合の場合はアミノスルホン酸類であり、X7が酸素原子の場合はアミノ硫酸類である。
一般式(16)において、X8が単結合の場合はアミノホスホン酸類であり、X8が酸素原子の場合はアミノリン酸類である。
このうち、これらの化合物の溶解性の点から、炭素数1~6の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基、炭素数6~8のアリーレン基がより好ましく、炭素数1~6の直鎖又は分岐際のアルキレン基がさらに好ましく、炭素数1~5の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基がよりさらに好ましい。
一般式(15)において、X7が単結合の場合はアミノスルホン酸類であり、X7が酸素原子の場合はアミノ硫酸類である。
一般式(16)において、X8が単結合の場合はアミノホスホン酸類であり、X8が酸素原子の場合はアミノリン酸類である。
一般式(17)中のnは、0~20の整数を示す。このうちnは、0~20が好ましく、0~6がより好ましく、0~4がさらに好ましい。一般式(17)中のR93、R94は、水素原子またはヒドロキシルメチル基が好ましい。
前記アミノ基含有化合物のうち、アミノ酸活性エステルスカベンジャーとしてアミノスルホン酸類、アミノ硫酸類、アミノホスホン酸類、アミノリン酸類及びアミノアルコール類から選ばれる化合物を用いるのがより好ましい。これらの化合物をスカベンジャーとして用いることにより、アミノ酸活性エステルが除去できるだけでなく、酸性条件とすることなくジベンゾフルベン(DBF)などの副生成物を除去できるため、ペプチドの液相製造を単離操作をせずにワンポットで合成することが可能になる。
工程cにおけるアミノ基含有化合物の添加量は、理論上残存する活性アミノ酸エステル1当量に対して、好ましくは1~10当量、より好ましくは1~6当量、さらに好ましくは1~4当量である。アミノ基含有化合物の添加量が少なすぎると、アミノ酸活性エステルのスカベンジ(捕捉)が不充分となり、残存したアミノ酸活性エステルと工程dで生成したアミノ基が反応するダブルヒットが起こり、純度、収率を低下させる。一方、多すぎると、同時に脱アミノ保護基反応が進行し、残存しているアミノ酸活性エステルが再生したアミノ基と反応するダブルヒットが起こり、純度、収率を低下させる。
工程dは、反応液中の前記アミノ保護基でアミノ基が保護された化合物のアミノ保護基を脱離する工程である。
当該アミノ保護基の脱離工程は、アミノ保護基の種類により相違する。例えば、アミノ保護基がFmoc基の場合は反応液を塩基性条件とすればよい。アミノ保護基がBoc基の場合は反応液を酸性条件とすればよい。アミノ保護基がCbz基の場合は接触還元すればよい。アミノ保護基がAc基の場合は、強酸又は強塩基条件で脱保護すればよい。このうち、ワンポット液相合成とするには、アミノ保護基をFmoc基とするのがより好ましい。
当該アミノ保護基の脱離工程は、アミノ保護基の種類により相違する。例えば、アミノ保護基がFmoc基の場合は反応液を塩基性条件とすればよい。アミノ保護基がBoc基の場合は反応液を酸性条件とすればよい。アミノ保護基がCbz基の場合は接触還元すればよい。アミノ保護基がAc基の場合は、強酸又は強塩基条件で脱保護すればよい。このうち、ワンポット液相合成とするには、アミノ保護基をFmoc基とするのがより好ましい。
アミノ保護基がFmoc基の場合のアミノ保護基の脱離工程について説明する。
Fmoc脱離工程は、反応液を塩基性にできればよいが、アミン化合物、例えば、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(DBU)、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]-5-ノネン(DBN)、1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]-オクタン(DABCO)、トリエチルアミン、トリブチルアミンなどの3級アミン類;1-メチルピペラジン、4-アミノピペリジン、ジエチレントリアミン、トリアミノエチルアミン、1-エチルピペラジン、N,N-ジメチルエチレンジアミン、エチレンジアミン、ピぺリジン、ピペラジンなどの1級又は2級のアミノ基を少なくとも1つ持つ2価以上の水溶性アミン類を用いることができる。好ましくは、DBU、ピぺリジン、1-メチルピペラジン、4-アミノピペリジン、ジエチレントリアミンであり、より好ましくは、DBU、ピぺリジン、1-メチルピペラジンであり、さらに好ましくはDBUである。本明細書において、工程cにおいて使用する塩基をアミン化合物ということがある。
工程cにおいて添加するアミン化合物の当量は、系に存在するFmoc基の量に対して、1~30当量、好ましくは4~20当量、より好ましくは4~10当量である。
Fmoc脱離工程は、反応液を塩基性にできればよいが、アミン化合物、例えば、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(DBU)、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]-5-ノネン(DBN)、1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]-オクタン(DABCO)、トリエチルアミン、トリブチルアミンなどの3級アミン類;1-メチルピペラジン、4-アミノピペリジン、ジエチレントリアミン、トリアミノエチルアミン、1-エチルピペラジン、N,N-ジメチルエチレンジアミン、エチレンジアミン、ピぺリジン、ピペラジンなどの1級又は2級のアミノ基を少なくとも1つ持つ2価以上の水溶性アミン類を用いることができる。好ましくは、DBU、ピぺリジン、1-メチルピペラジン、4-アミノピペリジン、ジエチレントリアミンであり、より好ましくは、DBU、ピぺリジン、1-メチルピペラジンであり、さらに好ましくはDBUである。本明細書において、工程cにおいて使用する塩基をアミン化合物ということがある。
工程cにおいて添加するアミン化合物の当量は、系に存在するFmoc基の量に対して、1~30当量、好ましくは4~20当量、より好ましくは4~10当量である。
また、前記アミン化合物に加えて、脱Fmoc反応により生じるDBF(ジベンゾフルベン)のトラッピング剤を添加するのが好ましい。ここで用いられるDBFのトラッピング剤としては、メルカプト化合物が挙げられる。用いることができるメルカプト化合物としては、メルカプト基を有する酸、例えばメルカプト脂肪酸又はそのアルカリ金属塩、下記の一般式(18)又は(19)
(式中、L1及びL2は、それぞれ2価の有機基を示し、Mは水素原子又はアルカリ金属を示す)
で表される化合物が挙げられる。
で表される化合物が挙げられる。
メルカプト脂肪酸又はそのアルカリ金属塩としては、メルカプトC1~20脂肪酸又はそのアルカリ金属塩が好ましく、メルカプトC1~6脂肪酸又はそのアルカリ金属塩がより好ましい。
一般式(18)又は(19)中L1及びL2は、それぞれ2価の有機基を示す。当該2価の有機基としては、炭素数1~10の2価の有機基が好ましく、より好ましくは、メルカプト基を有していてもよい炭素数1~10の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基、メルカプト基を有していてもよい炭素数6~10のアリーレン基、メルカプト基を有していてもよい炭素数4~9のヘテロアリーレン基が挙げられる。具体的には、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、プロピレン基、メルカプトトリメチレン基、メルカプトプロピレン基、テトラメチレン基、ブチレン基、ペンタメチレン基、フェニレン基、ナフチレン基、インドール基、ベンズイミダゾール基、キノリル基、イソキノリン基などが挙げられる。
Mは水素原子又はアルカリ金属を示す。具体的には、水素原子、ナトリウム、カリウムが挙げられる。
具体的には、メルカプトメタンスルホン酸ナトリウム、2-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、2-メルカプトエタンスルホン酸、3-メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム、1,3-ジメルカプトプロパンスルホン酸、2-メルカプトベンズイミダゾール-5-スルホン酸ナトリウム、メルカプトメタンホスホン酸ナトリウム、メルカプトエタンホスホン酸、3-メルカプトプロパンホスホン酸ナトリウム、1,3-ジメルカプトプロパンホスホン酸ナトリウムなどが挙げられる。
一般式(18)又は(19)中L1及びL2は、それぞれ2価の有機基を示す。当該2価の有機基としては、炭素数1~10の2価の有機基が好ましく、より好ましくは、メルカプト基を有していてもよい炭素数1~10の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基、メルカプト基を有していてもよい炭素数6~10のアリーレン基、メルカプト基を有していてもよい炭素数4~9のヘテロアリーレン基が挙げられる。具体的には、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、プロピレン基、メルカプトトリメチレン基、メルカプトプロピレン基、テトラメチレン基、ブチレン基、ペンタメチレン基、フェニレン基、ナフチレン基、インドール基、ベンズイミダゾール基、キノリル基、イソキノリン基などが挙げられる。
Mは水素原子又はアルカリ金属を示す。具体的には、水素原子、ナトリウム、カリウムが挙げられる。
具体的には、メルカプトメタンスルホン酸ナトリウム、2-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、2-メルカプトエタンスルホン酸、3-メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム、1,3-ジメルカプトプロパンスルホン酸、2-メルカプトベンズイミダゾール-5-スルホン酸ナトリウム、メルカプトメタンホスホン酸ナトリウム、メルカプトエタンホスホン酸、3-メルカプトプロパンホスホン酸ナトリウム、1,3-ジメルカプトプロパンホスホン酸ナトリウムなどが挙げられる。
メルカプト化合物の添加量は、理論上副生するDBFの量に対して1~30当量が好ましく、1~10当量がより好ましく、1~5当量がさらに好ましい。
前記アミン化合物とメルカプト化合物は、同時に添加してもよく、メルカプト化合物、次いでアミン化合物の順に添加してもよく、アミン化合物を加えFmoc基を除去したのちにメルカプト化合物を加えてもよい。
Fmoc脱離工程は、-20~40℃の温度で、5分~5時間行えばよい。
前記アミン化合物とメルカプト化合物は、同時に添加してもよく、メルカプト化合物、次いでアミン化合物の順に添加してもよく、アミン化合物を加えFmoc基を除去したのちにメルカプト化合物を加えてもよい。
Fmoc脱離工程は、-20~40℃の温度で、5分~5時間行えばよい。
工程eは、反応液に水溶液を添加した後、分液して、液相ペプチド合成用担体が結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドと、前記アミノ保護基が脱離したアミノ酸又はペプチドとの縮合体を含有する有機溶媒層を得る工程である。
工程dの反応液に水溶液を添加した後、水層と有機溶媒層を分液する。
水層には、アミノ保護基が脱離したアミノ酸又はペプチドと活性エステルスカベンジャーとの縮合体と、DBF-トラッピング剤付加体が含まれる。すなわち、アミノ保護基の脱離工程で副生するDBF-トラッピング剤付加体は、工程eの水溶液の添加だけで、容易に水層に抽出される。
一方、有機溶媒層には、液相ペプチド合成用担体に結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドと、前記アミノ保護基が脱離したアミノ酸又はペプチドとの縮合体が含まれる。
ここで、用いられる水溶液としては、水、塩化ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、リン酸水素二ナトリウム水溶液、リン酸三ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、炭酸水素カリウム水溶液、リン酸水素二カリウム水溶液、リン酸三カリウム水溶液等が挙げられる。
このように、本発明の工程eによれば、単に水溶液を添加して分液するだけで、酸性水溶液を使用する必要がないので、アミノ酸活性エステルと生成物であるペプチドとの分液不良が起こることがない。また、固液分離を必要としないので、ペプチドの液相製造を単離せずにワンポット合成が可能になる。
また、得られた有機溶媒層は、さらに任意のアミノ酸との縮合反応に利用できる。
工程dの反応液に水溶液を添加した後、水層と有機溶媒層を分液する。
水層には、アミノ保護基が脱離したアミノ酸又はペプチドと活性エステルスカベンジャーとの縮合体と、DBF-トラッピング剤付加体が含まれる。すなわち、アミノ保護基の脱離工程で副生するDBF-トラッピング剤付加体は、工程eの水溶液の添加だけで、容易に水層に抽出される。
一方、有機溶媒層には、液相ペプチド合成用担体に結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドと、前記アミノ保護基が脱離したアミノ酸又はペプチドとの縮合体が含まれる。
ここで、用いられる水溶液としては、水、塩化ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、リン酸水素二ナトリウム水溶液、リン酸三ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、炭酸水素カリウム水溶液、リン酸水素二カリウム水溶液、リン酸三カリウム水溶液等が挙げられる。
このように、本発明の工程eによれば、単に水溶液を添加して分液するだけで、酸性水溶液を使用する必要がないので、アミノ酸活性エステルと生成物であるペプチドとの分液不良が起こることがない。また、固液分離を必要としないので、ペプチドの液相製造を単離せずにワンポット合成が可能になる。
また、得られた有機溶媒層は、さらに任意のアミノ酸との縮合反応に利用できる。
本発明の分析対象となる試料としては、液相ペプチド合成用担体とアミノ酸、ペプチド若しくはアミノ酸アミドが結合した化合物を用いる液相ペプチド製造方法の任意の段階、すなわち前記工程a~工程eの任意の段階における反応液、その濃縮物又はその抽出物などが挙げられる。
また、当該方法で得られた目的ペプチド又は最終目的ペプチドを含有する試料としては、工程eの反応液、その抽出液、分液、及び工程eの後にすべての保護基を脱離させた後の反応液、その抽出液、分液、固液分離により得られた固体又はろ液などが挙げられる。
また、当該方法で得られた目的ペプチド又は最終目的ペプチドを含有する試料としては、工程eの反応液、その抽出液、分液、及び工程eの後にすべての保護基を脱離させた後の反応液、その抽出液、分液、固液分離により得られた固体又はろ液などが挙げられる。
分析手段は、HPLC又は超臨界液体クロマトグラフィーであり、本発明では、これらの液体クロマトグラフィーの溶離液として、アセトニトリルではなく、アルコール類を使用する。アルコール類を使用すれば、種々のペプチドだけでなく液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体結合ペプチドなどが溶解し、これらの成分を同時に分析することができる。
用いられるアルコール類としては、炭素数1~4のアルコール、例えばエタノール、イソプロパノール、n-ブタノール、が挙げられ、エタノール、イソプロパノールがより好ましく、イソプロパノールがさらに好ましい。なお、溶離液としては、これらのアルコール類を含む溶液であればよく、アルコール類に加えて各種の有機溶媒、酸、塩基、塩、対イオン形成物などを含有していてもよい。
用いられるアルコール類としては、炭素数1~4のアルコール、例えばエタノール、イソプロパノール、n-ブタノール、が挙げられ、エタノール、イソプロパノールがより好ましく、イソプロパノールがさらに好ましい。なお、溶離液としては、これらのアルコール類を含む溶液であればよく、アルコール類に加えて各種の有機溶媒、酸、塩基、塩、対イオン形成物などを含有していてもよい。
本発明の分析方法においては、操作自体は、通常のHPLC又は超臨界液体クロマトグラフィーの操作に従っておこなえばよい。
HPLCは、逆相HPLCが好ましく、固定相(カラム充填剤)は、通常使用されるもののなかから分析対象試料に含有される目的ペプチドの長さ、液相ペプチド合成用担体の物性等を勘案し、適宜に選択することが可能である。好適な一例としては、オクタデシルシリカ(ODS)を挙げることができ、充填剤粒子の粒形、孔の大きさ、ODSの密度等についても適宜に選択することができる。前記ODSを固定相とする市販品のカラムとしては、MonoBisカラム 低圧ODSエンドキャップ(メソポア11nm) 3.2x150mm(京都モノテック)、KinetexEVO C18 4.6x150mm 粒子径2.6μm(Phenomenex社製)などが挙げられる。
超臨界流体クロマトグラフィーに用いるカラムとしては、BEH C18 1.7μm 2.1x50mm 130Å(Waters)等の市販品を使用することができる。
本発明によれば、液相ペプチド合成用担体結合ペプチドが溶離液に溶解しないという問題や液相ペプチド合成用担体結合ペプチドが溶出しないという問題が解決できる。また、溶離液に酸性化合物を加えることにより、一連のペプチド合成において、全く同じ溶離液を用いた分析で各工程の反応率を把握できる。さらに、ペプチド成分の分析も同時に行うことができるので、脱保護した後の目的ペプチド(最終目的ペプチド)に液相ペプチド合成用担体由来の成分の混入の有無及び混入していた場合の混入割合を判断できる。
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
なお、液相ペプチド合成用担体として、以下に示す化合物を使用した。
・TIPS2-OH(C11)型ベンジル化合物(積水メディカル社製)(以下、B-STagと記すことがある)。但し、TIPSは、トリイソプロピルシリル基を示す。
・TIPS2-OH(C11)型ベンジル化合物(積水メディカル社製)(以下、B-STagと記すことがある)。但し、TIPSは、トリイソプロピルシリル基を示す。
・TIPS2-OH(C11)型ジフェニルメタン化合物(積水メディカル社製)(以下、D-STagと記すことがある)。但し、TIPSは、トリイソプロピルシリル基を示す。
Fmoc-NH-(D-STag)は、D-STagのアミノ基がFmoc基で保護された化合物である。
・TIPS2-OH(C11)型キサンテン化合物(積水メディカル社製)(以下、X-STagと記すことがある)。但し、TIPSは、トリイソプロピルシリル基を示す。
・TIPS2-OH(C11)型キサンテン化合物(積水メディカル社製)(以下、X-STagと記すことがある)。但し、TIPSは、トリイソプロピルシリル基を示す。
Fmoc-NH-(X-STag)は、X-STagのアミノ基がFmoc基で保護された化合物である。
また、以下の実施例では、B-STagがFmoc保護tBu保護グルタミン酸(Fmoc-Glu(OtBu)-OH)と結合した化合物を、Fmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)と表記し、下記の構造を示すものとする。Fmoc-Glu(OtBu)-OHに限らず、他のアミノ酸と結合した場合も、これに準ずる表記とする。
また、D-STagがFmoc保護tBu保護スレオニン(Fmoc-Thr(tBu)-OH))と結合した化合物を、Fmoc-Thr(tBu)-NH-(D-STag)と表記し、これは下記の構造を示すものとする。
また、X-STagがFmoc保護tBu保護スレオニン(Fmoc-Thr(tBu)-OH))と結合した化合物をFmoc-Thr(tBu)-NH-(X-STag)と表記し、これは下記の構造を示すものとする。
分析条件1(HPLC)
カラム:MonoBisカラム 低圧ODSエンドキャップ(メソポア11nm) 3.2x150mm(京都モノテック)
移動相A:0.1% ギ酸含有 5% イソプロパノール水溶液
移動相B:0.1% ギ酸含有 95% イソプロパノール水溶液
流速:1.0mL/分
カラム温度:60℃
検出波長:220nm
グラジエント条件:5%B(0分)→5%B(2分)→95%B(12分)→95%B(17.5分)→5%B(18分)→5%B(24分)
カラム:MonoBisカラム 低圧ODSエンドキャップ(メソポア11nm) 3.2x150mm(京都モノテック)
移動相A:0.1% ギ酸含有 5% イソプロパノール水溶液
移動相B:0.1% ギ酸含有 95% イソプロパノール水溶液
流速:1.0mL/分
カラム温度:60℃
検出波長:220nm
グラジエント条件:5%B(0分)→5%B(2分)→95%B(12分)→95%B(17.5分)→5%B(18分)→5%B(24分)
分析条件2(SFC)
カラム:BEH C18 1.7μm 2.1 x 50mm 130Å(Waters
)
移動相A:CO2
移動相B:メタノール/イソプロパノール/28%アンモニア水溶液(500/500/1)溶液
圧力(ABPR):2000psi
流速:1.1mL/分
カラム温度:45℃
検出波長:220nm
グラジエント条件:5%B(0分)→15%B(5分)→25%B(6分)→25%B(7分)→5%B(8分)→5%B(10分)
カラム:BEH C18 1.7μm 2.1 x 50mm 130Å(Waters
)
移動相A:CO2
移動相B:メタノール/イソプロパノール/28%アンモニア水溶液(500/500/1)溶液
圧力(ABPR):2000psi
流速:1.1mL/分
カラム温度:45℃
検出波長:220nm
グラジエント条件:5%B(0分)→15%B(5分)→25%B(6分)→25%B(7分)→5%B(8分)→5%B(10分)
分析条件3(HPLC)
カラム:KinetexEVO C18 4.6x150mm 粒子径2.6μm(Phenomenex社製)
移動相A:0.025% TFA含有水溶液
移動相B:0.025% TFA含有アセトニトリル溶液
流速:1.0mL/分
カラム温度:60℃
検出波長:220nm
グラジエント条件:5%B(0分)→5%B(2分)→99%B(12分)→99%B(65分)→5%B(66分)→5%B(80分)
カラム:KinetexEVO C18 4.6x150mm 粒子径2.6μm(Phenomenex社製)
移動相A:0.025% TFA含有水溶液
移動相B:0.025% TFA含有アセトニトリル溶液
流速:1.0mL/分
カラム温度:60℃
検出波長:220nm
グラジエント条件:5%B(0分)→5%B(2分)→99%B(12分)→99%B(65分)→5%B(66分)→5%B(80分)
実施例1
H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OHの合成
1)H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)の合成
B-STag 2.40g(3.0mmol)をCPME6mL、THF9mLに溶解し、Fmoc-Glu(OtBu)-OH 3.21g(7.5mmol)、WSCI・HCl 1.44g(7.5mmol)、4-ジメチルアミノピリジン36.8mg(0.3mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。分析条件1にてB-STagが生成物のFmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.94g(7.5mmol)、DMSO 38mLを加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.42g(8.6mmol)を添加し、DBU5.1mL(34mmol)を加え、20分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸ナトリウム水溶液75mLを滴下し、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水17mL、5%炭酸ナトリウム水溶液6mL、DMF 1.2mLを加え、分液した。有機層を濃縮したのち、残渣にCPME27mL加え、H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):B-STag:13.8分;Fmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag):14.1分;H-Glu(OtBu)-O-(B-STag):12.2分
H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OHの合成
1)H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)の合成
B-STag 2.40g(3.0mmol)をCPME6mL、THF9mLに溶解し、Fmoc-Glu(OtBu)-OH 3.21g(7.5mmol)、WSCI・HCl 1.44g(7.5mmol)、4-ジメチルアミノピリジン36.8mg(0.3mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。分析条件1にてB-STagが生成物のFmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.94g(7.5mmol)、DMSO 38mLを加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.42g(8.6mmol)を添加し、DBU5.1mL(34mmol)を加え、20分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸ナトリウム水溶液75mLを滴下し、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水17mL、5%炭酸ナトリウム水溶液6mL、DMF 1.2mLを加え、分液した。有機層を濃縮したのち、残渣にCPME27mL加え、H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):B-STag:13.8分;Fmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag):14.1分;H-Glu(OtBu)-O-(B-STag):12.2分
2)H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)の合成
上記のH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にDMF7mL、Fmoc-Cys(Trt)-OH 2.38g(4.1mmol)、COMU 1.67g(3.9mmol)、DIEPA 2.1mLを加え、室温で2時間撹拌した。分析条件1にてH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.55g(3.9mmol)、DMSO 16mLを加え、室温で2時間撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.19g(3.9mmol)を添加し、DBU2.7mL(18mmol)を加え、20分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液9.6mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液60mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水38mL、5%炭酸ナトリウム水溶液13mL、DMF 2.7mLを加え、分液した。H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):14.6分;H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):13.1分
上記のH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にDMF7mL、Fmoc-Cys(Trt)-OH 2.38g(4.1mmol)、COMU 1.67g(3.9mmol)、DIEPA 2.1mLを加え、室温で2時間撹拌した。分析条件1にてH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.55g(3.9mmol)、DMSO 16mLを加え、室温で2時間撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.19g(3.9mmol)を添加し、DBU2.7mL(18mmol)を加え、20分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液9.6mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液60mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水38mL、5%炭酸ナトリウム水溶液13mL、DMF 2.7mLを加え、分液した。H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):14.6分;H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):13.1分
3)H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)の合成
上記のH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME2mL、DMF7mL、Fmoc-Asn(Trt)-OH 2.43g(4.1mmol)、COMU 1.67g(3.9mmol)、DIEPA 2.1mLを加え、室温で2時間撹拌した。分析条件1にてH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.55g(3.9mmol)、DMSO 16mLを加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.19g(3.9mmol)を添加し、DBU2.7mL(18mmol)を加え、1時間撹拌した。分析条件1にてFmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸ナトリウム水溶液60mLを滴下し、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水38mL、5%炭酸ナトリウム水溶液13mL、DMF 2.7mLを加え、分液した。H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):14.7分;H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):13.0分
上記のH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME2mL、DMF7mL、Fmoc-Asn(Trt)-OH 2.43g(4.1mmol)、COMU 1.67g(3.9mmol)、DIEPA 2.1mLを加え、室温で2時間撹拌した。分析条件1にてH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.55g(3.9mmol)、DMSO 16mLを加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.19g(3.9mmol)を添加し、DBU2.7mL(18mmol)を加え、1時間撹拌した。分析条件1にてFmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸ナトリウム水溶液60mLを滴下し、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水38mL、5%炭酸ナトリウム水溶液13mL、DMF 2.7mLを加え、分液した。H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):14.7分;H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):13.0分
4)H-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)の合成
上記のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME2mL、DMF7mL、Fmoc-Ala-OH一水和物 1.33g(4.1mmol)、COMU 1.67g(3.9mmol)、DIEPA 2.1mLを加え、室温で1時間半撹拌した。分析条件1にてH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.55g(3.9mmol)、DMSO 16mLを加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.19g(3.9mmol)、DMF 1.3mLを添加し、DBU2.7mL(18mmol)を加え、1時間撹拌した。分析条件1にてFmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液9.6mLを滴下した後、5%炭酸ナトリウム水溶液60mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水38mL、5%炭酸ナトリウム水溶液13mL、DMF 2.7mLを加え、分液した。H-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):14.5分;H-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):12.7分
上記のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME2mL、DMF7mL、Fmoc-Ala-OH一水和物 1.33g(4.1mmol)、COMU 1.67g(3.9mmol)、DIEPA 2.1mLを加え、室温で1時間半撹拌した。分析条件1にてH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.55g(3.9mmol)、DMSO 16mLを加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.19g(3.9mmol)、DMF 1.3mLを添加し、DBU2.7mL(18mmol)を加え、1時間撹拌した。分析条件1にてFmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液9.6mLを滴下した後、5%炭酸ナトリウム水溶液60mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水38mL、5%炭酸ナトリウム水溶液13mL、DMF 2.7mLを加え、分液した。H-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):14.5分;H-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):12.7分
5)H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)の合成
上記のH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME2mL、DMF7mL、Fmoc-Asp(OtBu)-OH 1.67g(4.1mmol)、COMU 1.67g(3.9mmol)、DIEPA 2.1mLを加え、室温で1時間撹拌した。分析条件1にてH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.55g(3.9mmol)、DMSO 16mLを加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.19g(3.9mmol)、DMF 1.3mLを添加し、DBU2.7mL(18mmol)を加え、40分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液9.6mLを滴下した後、5%炭酸ナトリウム水溶液60mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水38mL、5%炭酸ナトリウム水溶液13mL、DMF 2.7mLを加え、分液した。H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
得られたCPME溶液を減圧下で濃縮し、残渣にMeCN 40mLを加え析出した固体をろ取し、得られた固体を30℃で減圧乾燥した。H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag) 4.58gを得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):14.5分;H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):13.1分
上記のH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME2mL、DMF7mL、Fmoc-Asp(OtBu)-OH 1.67g(4.1mmol)、COMU 1.67g(3.9mmol)、DIEPA 2.1mLを加え、室温で1時間撹拌した。分析条件1にてH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.55g(3.9mmol)、DMSO 16mLを加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.19g(3.9mmol)、DMF 1.3mLを添加し、DBU2.7mL(18mmol)を加え、40分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液9.6mLを滴下した後、5%炭酸ナトリウム水溶液60mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水38mL、5%炭酸ナトリウム水溶液13mL、DMF 2.7mLを加え、分液した。H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
得られたCPME溶液を減圧下で濃縮し、残渣にMeCN 40mLを加え析出した固体をろ取し、得られた固体を30℃で減圧乾燥した。H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag) 4.58gを得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):14.5分;H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):13.1分
6)H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OHの合成
H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)962mg(0.50mmol)にトリフルオロ酢酸9.5mL、水0.29mL、トリイソプロピルシラン0.29mL、ジチオトレイトール865mg、アニソール0.58mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、ジイソプロピルエーテル72mLをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物をジイソプロピルエーテル10mLで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OH 275mgを得た。得られたH-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OHを分析条件1にて分析し、純度は80.1%であり、B-STag及びB-STagをトリフルオロ酢酸で処理することで生成するB-STag由来の化合物は検出されなかった。
保持時間(分析条件1):H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OH:0.9分
なお純度は、保持時間0~19分までの総ピーク面積に対する目的ペプチドのピーク面積比として算出した。以下の実施例でも同様である。
H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)962mg(0.50mmol)にトリフルオロ酢酸9.5mL、水0.29mL、トリイソプロピルシラン0.29mL、ジチオトレイトール865mg、アニソール0.58mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、ジイソプロピルエーテル72mLをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物をジイソプロピルエーテル10mLで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OH 275mgを得た。得られたH-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OHを分析条件1にて分析し、純度は80.1%であり、B-STag及びB-STagをトリフルオロ酢酸で処理することで生成するB-STag由来の化合物は検出されなかった。
保持時間(分析条件1):H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OH:0.9分
なお純度は、保持時間0~19分までの総ピーク面積に対する目的ペプチドのピーク面積比として算出した。以下の実施例でも同様である。
実施例2
H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OHの合成
1)H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)の合成
B-STag 0.79g(1.0mmol)をCPME2mL、THF3mLに溶解し、Fmoc-Glu(OtBu)-OH 1.06g(2.5mmol)、WSCI・HCl 0.48g(2.5mmol)、4-ジメチルアミノピリジン12.2mg(0.1mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。分析条件2にてB-STagが生成物のFmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール150μL(2.5mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.74g(4.5mmol)、DMSO 4.5mLを添加し、DBU1.7mL(11.3mmol)を加え、1時間撹拌した。分析条件2にてFmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液6mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液19mLを加えた後、室温まで昇温し分液した。得られた有機層に20%食塩水20mLを加え、分液した。有機層を濃縮したのち、残渣にCPME9mL加え、H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件2):B-STag:2.1分;Fmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag):3.1分;H-Glu(OtBu)-O-(B-STag):3.8分
H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OHの合成
1)H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)の合成
B-STag 0.79g(1.0mmol)をCPME2mL、THF3mLに溶解し、Fmoc-Glu(OtBu)-OH 1.06g(2.5mmol)、WSCI・HCl 0.48g(2.5mmol)、4-ジメチルアミノピリジン12.2mg(0.1mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。分析条件2にてB-STagが生成物のFmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール150μL(2.5mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.74g(4.5mmol)、DMSO 4.5mLを添加し、DBU1.7mL(11.3mmol)を加え、1時間撹拌した。分析条件2にてFmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液6mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液19mLを加えた後、室温まで昇温し分液した。得られた有機層に20%食塩水20mLを加え、分液した。有機層を濃縮したのち、残渣にCPME9mL加え、H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件2):B-STag:2.1分;Fmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag):3.1分;H-Glu(OtBu)-O-(B-STag):3.8分
2)H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)の合成
上記のH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にDMF2mL、Fmoc-Cys(Trt)-OH 0.79g(1.4mmol)、COMU 0.57g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mLを加え、室温で1時間撹拌した。分析条件2にてH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール81μL(1.4mmol)を加え、室温で1時間半撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(1.3mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、25分撹拌した。分析条件2にてFmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件2):Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):4.4分;H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):5.0分
上記のH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にDMF2mL、Fmoc-Cys(Trt)-OH 0.79g(1.4mmol)、COMU 0.57g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mLを加え、室温で1時間撹拌した。分析条件2にてH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール81μL(1.4mmol)を加え、室温で1時間半撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(1.3mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、25分撹拌した。分析条件2にてFmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件2):Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):4.4分;H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):5.0分
3)H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)の合成
上記のH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Asn(Trt)-OH 0.81g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mLを加え、室温で55分撹拌した。分析条件2にてH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール81μL(1.4mmol)を加え、室温で25分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、75分撹拌した。分析条件2にてFmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件2):Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):5.6分;H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):6.6分
上記のH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Asn(Trt)-OH 0.81g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mLを加え、室温で55分撹拌した。分析条件2にてH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール81μL(1.4mmol)を加え、室温で25分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、75分撹拌した。分析条件2にてFmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件2):Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):5.6分;H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):6.6分
4)H-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)の合成
上記のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Ala-OH・一水和物 0.47g(1.5mmol)、COMU 0.64g(1.5mmol)、DIEPA 0.78mL(4.5mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。分析条件2にてH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール89μL(1.5mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.5mmol)、DMSO 2.5mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、1時間撹拌した。分析条件2にてFmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件2):Fmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):6.1分;H-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):7.2分
上記のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Ala-OH・一水和物 0.47g(1.5mmol)、COMU 0.64g(1.5mmol)、DIEPA 0.78mL(4.5mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。分析条件2にてH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール89μL(1.5mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.5mmol)、DMSO 2.5mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、1時間撹拌した。分析条件2にてFmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件2):Fmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):6.1分;H-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):7.2分
5)H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)の合成
上記のH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Asp(OtBu)-OH 0.56g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。分析条件2にてH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール81μL(1.4mmol)を加え、室温で70分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、75分撹拌した。分析条件2にてFmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、水 3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
得られたCPME溶液を減圧下で濃縮し、残渣にMeCN 40mLを加え析出した固体をろ取し、得られた固体を30℃で減圧乾燥した。H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag) 1.56gを得た。
保持時間(分析条件2):Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):6.3分;H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):7.0分
上記のH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Asp(OtBu)-OH 0.56g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。分析条件2にてH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール81μL(1.4mmol)を加え、室温で70分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、75分撹拌した。分析条件2にてFmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、水 3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
得られたCPME溶液を減圧下で濃縮し、残渣にMeCN 40mLを加え析出した固体をろ取し、得られた固体を30℃で減圧乾燥した。H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag) 1.56gを得た。
保持時間(分析条件2):Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):6.3分;H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag):7.0分
6)H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OHの合成
H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)962mg(0.50mmol)にトリフルオロ酢酸7.5mL、水0.21mL、トリイソプロピルシラン0.21mL、3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオール0.42mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、MTBE60mLをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物をMTBE10mLで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OH 275mgを得た。得られたH-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OHを分析条件1にて分析し、純度は74.2%であり、B-STagは検出されず、B-STagをトリフルオロ酢酸で処理することで生成するB-STag由来の化合物が0.6%検出した。
H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)962mg(0.50mmol)にトリフルオロ酢酸7.5mL、水0.21mL、トリイソプロピルシラン0.21mL、3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオール0.42mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、MTBE60mLをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物をMTBE10mLで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OH 275mgを得た。得られたH-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OHを分析条件1にて分析し、純度は74.2%であり、B-STagは検出されず、B-STagをトリフルオロ酢酸で処理することで生成するB-STag由来の化合物が0.6%検出した。
実施例3
B-STag0.16g(0.2mmol)にトリフルオロ酢酸3.2mL、水0.09mL、トリイソプロピルシラン0.09mL、3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオール0.18mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応液を分析条件1及び分析条件2にて分析し、B-STag由来の化合物を検出した。
保持時間(分析条件1):11.2分;11.6分;12.3分;12.4分;12.6分
保持時間(分析条件2): 0.2分;0.4分;0.6分;1.1分;2.1分
実施例2ではB-STag等の脱保護後に目的物ペプチドをMTBEを用いて晶出させ分離精製したため、B-STag由来の化合物はわずかしか検出されなかったが、晶出操作前の混合液中のB-STag由来の化合物は、分析条件1、2いずれを用いても分離性能良く検出できることがわかった。
B-STag0.16g(0.2mmol)にトリフルオロ酢酸3.2mL、水0.09mL、トリイソプロピルシラン0.09mL、3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオール0.18mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応液を分析条件1及び分析条件2にて分析し、B-STag由来の化合物を検出した。
保持時間(分析条件1):11.2分;11.6分;12.3分;12.4分;12.6分
保持時間(分析条件2): 0.2分;0.4分;0.6分;1.1分;2.1分
実施例2ではB-STag等の脱保護後に目的物ペプチドをMTBEを用いて晶出させ分離精製したため、B-STag由来の化合物はわずかしか検出されなかったが、晶出操作前の混合液中のB-STag由来の化合物は、分析条件1、2いずれを用いても分離性能良く検出できることがわかった。
実施例4
H-Ser-Met―Ile-Leu-Glu-OHの合成
1)H-Glu(O-B-STag)-OtBuの合成
B-STag 1.59g(2.0mmol)をCPME4mL、THF6mLに溶解し、Fmoc-Glu-OtBu 2.13g(5.0mmol)、WSCI・HCl 0.96g(5.0mmol)、4-ジメチルアミノピリジン 24.5mg(0.2mmol)を加え、室温で5時間撹拌した。分析条件1にてB-STagが生成物のFmoc-Glu(O-B-STag)-OtBuに対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール(AE)300μL(5.0mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.48g(9.0mmol)、DMSO 9mLを添加し、DBU3.4mL(22.5mmol)を加え、20分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Glu(O-B-STag)-OtBuが生成物のH-Glu(O-B-STag)-OtBuに対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液12mLを滴下した後、5%炭酸ナトリウム水溶液38mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水10mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.8mLを加え、分液した。有機層を減圧濃縮し、残渣にCPME 6mLを加えH-Glu(O-B-STag)-OtBuを含むCPME溶液15.2gを得た。
保持時間(分析条件1):B-STag:13.8分;Fmoc-Glu(O-B-STag)-OtBu:14.3分;H-Glu(O-B-STag)-OtBu:12.3分
H-Ser-Met―Ile-Leu-Glu-OHの合成
1)H-Glu(O-B-STag)-OtBuの合成
B-STag 1.59g(2.0mmol)をCPME4mL、THF6mLに溶解し、Fmoc-Glu-OtBu 2.13g(5.0mmol)、WSCI・HCl 0.96g(5.0mmol)、4-ジメチルアミノピリジン 24.5mg(0.2mmol)を加え、室温で5時間撹拌した。分析条件1にてB-STagが生成物のFmoc-Glu(O-B-STag)-OtBuに対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール(AE)300μL(5.0mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.48g(9.0mmol)、DMSO 9mLを添加し、DBU3.4mL(22.5mmol)を加え、20分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Glu(O-B-STag)-OtBuが生成物のH-Glu(O-B-STag)-OtBuに対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液12mLを滴下した後、5%炭酸ナトリウム水溶液38mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水10mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.8mLを加え、分液した。有機層を減圧濃縮し、残渣にCPME 6mLを加えH-Glu(O-B-STag)-OtBuを含むCPME溶液15.2gを得た。
保持時間(分析条件1):B-STag:13.8分;Fmoc-Glu(O-B-STag)-OtBu:14.3分;H-Glu(O-B-STag)-OtBu:12.3分
2)H-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuの合成
上記のH-Glu(O-B-STag)-OtBuを含むCPME溶液7.6g(1mmol相当)にCMPE 1.9mL、DMF2mL、Fmoc-Leu-OH 0.48g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。分析条件1にてH-Glu(O-B-STag)-OtBuが生成物のFmoc-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuに対し5%以下になったことを確認後、AE 81μL(1.4mmol)を加え、室温で90分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2,4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、20分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuが生成物のH-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuに対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuを含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBu:14.2分;H-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBu:12.4分
上記のH-Glu(O-B-STag)-OtBuを含むCPME溶液7.6g(1mmol相当)にCMPE 1.9mL、DMF2mL、Fmoc-Leu-OH 0.48g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。分析条件1にてH-Glu(O-B-STag)-OtBuが生成物のFmoc-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuに対し5%以下になったことを確認後、AE 81μL(1.4mmol)を加え、室温で90分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2,4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、20分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuが生成物のH-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuに対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuを含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBu:14.2分;H-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBu:12.4分
3)H-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuの合成
上記のH-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuを含むCPME溶液にCPME1mL、DMF2mL、Fmoc-Ile-OH 0.48g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で55分撹拌した。分析条件1にてH-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuが生成物のFmoc-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuに対し5%以下になったことを確認後、AE 81μL(1.4mmol)を加え、室温で25分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2,4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、75分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuが生成物のH-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuに対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuを含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBu:14.3分;H-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBu:12.4分
上記のH-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuを含むCPME溶液にCPME1mL、DMF2mL、Fmoc-Ile-OH 0.48g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で55分撹拌した。分析条件1にてH-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuが生成物のFmoc-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuに対し5%以下になったことを確認後、AE 81μL(1.4mmol)を加え、室温で25分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2,4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、75分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuが生成物のH-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuに対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuを含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBu:14.3分;H-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBu:12.4分
4)H-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuの合成
上記のH-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuを含むCPME溶液にCPME1mL、DMF2mL、Fmoc-Met-OH 0.56g(1.5mmol)、COMU 0.65g(1.5mmol)、DIEPA 0.78mL(4.5mmol)を加え、室温で50分撹拌した。分析条件1にてH-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuが生成物のFmoc-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuに対し5%以下になったことを確認後、AE 89μL(1.5mmol)を加え、室温で25分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2,4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、1時間撹拌した。分析条件1にてFmoc-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuが生成物のH-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuに対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuを含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBu:14.1分;H-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBu:12.5分
上記のH-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuを含むCPME溶液にCPME1mL、DMF2mL、Fmoc-Met-OH 0.56g(1.5mmol)、COMU 0.65g(1.5mmol)、DIEPA 0.78mL(4.5mmol)を加え、室温で50分撹拌した。分析条件1にてH-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuが生成物のFmoc-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuに対し5%以下になったことを確認後、AE 89μL(1.5mmol)を加え、室温で25分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2,4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、1時間撹拌した。分析条件1にてFmoc-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuが生成物のH-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuに対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuを含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBu:14.1分;H-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBu:12.5分
5)H-Ser(tBu)-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuの合成
上記のH-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuを含むCPME溶液にCPME1mL、DMF2mL、Fmoc-Ser(tBu)-OH 0.52g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.4mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。分析条件1にてH-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuが生成物のFmoc-Ser(tBu)-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuに対し5%以下になったことを確認後、AE 81μL(1.4mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2,4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、75分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Ser(tBu)-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuが生成物のH-Ser(tBu)-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuに対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Ser(tBu)-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuを含むCPME溶液を得た。
得られたCPME溶液を減圧下で濃縮し、残渣として、H-Ser(tBu)-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBu 1.64gを得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Ser(tBu)-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBu:14.1分;H-Ser(tBu)-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBu:12.6分
上記のH-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuを含むCPME溶液にCPME1mL、DMF2mL、Fmoc-Ser(tBu)-OH 0.52g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.4mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。分析条件1にてH-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuが生成物のFmoc-Ser(tBu)-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuに対し5%以下になったことを確認後、AE 81μL(1.4mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2,4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、75分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Ser(tBu)-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuが生成物のH-Ser(tBu)-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuに対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Ser(tBu)-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBuを含むCPME溶液を得た。
得られたCPME溶液を減圧下で濃縮し、残渣として、H-Ser(tBu)-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBu 1.64gを得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Ser(tBu)-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBu:14.1分;H-Ser(tBu)-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBu:12.6分
6)H-Ser-Met―Ile-Leu-Glu-OHの合成
上記のH-Ser(tBu)-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBu 1.64g(1.0mmol相当)にトリフルオロ酢酸14.3mL、水0.36mL、トリイソプロピルシラン0.36mL、3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオール0.71mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、MTBE 81mLをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物をMTBE 14mLで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H-Ser-Met―Ile-Leu-Glu-OH 523mgを得た。得られたH-Ser-Met―Ile-Leu-Glu-OHを分析条件1にて分析し、純度は62.3%であり、B-STag及びB-STagをトリフルオロ酢酸で処理することで生成するB-STag由来の化合物は検出されなかった。
分析条件1によるHPLC分析結果を図1に示した。1.9分のピークが目的物であるH-Ser-Met―Ile-Leu-Glu-OHを示す。実施例3で検出したB-STag由来の化合物(保持時間11.2分~12.6分)は検出されなかった。
保持時間(分析条件1):H-Ser-Met―Ile-Leu-Glu-OH:1.9分
上記のH-Ser(tBu)-Met-Ile-Leu-Glu(O-B-STag)-OtBu 1.64g(1.0mmol相当)にトリフルオロ酢酸14.3mL、水0.36mL、トリイソプロピルシラン0.36mL、3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオール0.71mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、MTBE 81mLをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物をMTBE 14mLで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H-Ser-Met―Ile-Leu-Glu-OH 523mgを得た。得られたH-Ser-Met―Ile-Leu-Glu-OHを分析条件1にて分析し、純度は62.3%であり、B-STag及びB-STagをトリフルオロ酢酸で処理することで生成するB-STag由来の化合物は検出されなかった。
分析条件1によるHPLC分析結果を図1に示した。1.9分のピークが目的物であるH-Ser-Met―Ile-Leu-Glu-OHを示す。実施例3で検出したB-STag由来の化合物(保持時間11.2分~12.6分)は検出されなかった。
保持時間(分析条件1):H-Ser-Met―Ile-Leu-Glu-OH:1.9分
実施例5
H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2の合成
1)H-Thr(tBu)-NH-(D-STag)の合成
Fmoc-NH-(D-STag) 1.09g(1.0mmol)をCPME9mL、DMF2mLに溶解し、0℃に冷却した後、DIEPA 0.32mL(1.9mmol)、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.30g(1.8mmol)を添加し、DBU0.67mL(4.5mmol)を滴下した。0℃で1時間撹拌し、分析条件1にてFmoc-NH-(D-STag)が生成物のNH2-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液2.4mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液10mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水25mL、5%炭酸ナトリウム水溶液8mL、DMF 1.8mLを加え、分液し、NH2-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
このNH2-(D-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.6mL、DMF2mL、Fmoc-Thr(tBu)-OH 0.55g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で70分撹拌した。分析条件1にてNH2-(D-STag)が生成物のFmoc-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エタノール(AEEE)62μL(0.5mmol)を加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、70分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のH-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水25mL、5%炭酸ナトリウム水溶液8mL、DMF 1.8mLを加え、分液したH-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-NH-(D-STag):14,5分;NH2-(D-STag):12.0分;Fmoc-Thr(tBu)-NH-(D-STag):14.5分;H-Thr(tBu)-NH-(D-STag):12.4分
H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2の合成
1)H-Thr(tBu)-NH-(D-STag)の合成
Fmoc-NH-(D-STag) 1.09g(1.0mmol)をCPME9mL、DMF2mLに溶解し、0℃に冷却した後、DIEPA 0.32mL(1.9mmol)、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.30g(1.8mmol)を添加し、DBU0.67mL(4.5mmol)を滴下した。0℃で1時間撹拌し、分析条件1にてFmoc-NH-(D-STag)が生成物のNH2-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液2.4mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液10mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水25mL、5%炭酸ナトリウム水溶液8mL、DMF 1.8mLを加え、分液し、NH2-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
このNH2-(D-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.6mL、DMF2mL、Fmoc-Thr(tBu)-OH 0.55g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で70分撹拌した。分析条件1にてNH2-(D-STag)が生成物のFmoc-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エタノール(AEEE)62μL(0.5mmol)を加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、70分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のH-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水25mL、5%炭酸ナトリウム水溶液8mL、DMF 1.8mLを加え、分液したH-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-NH-(D-STag):14,5分;NH2-(D-STag):12.0分;Fmoc-Thr(tBu)-NH-(D-STag):14.5分;H-Thr(tBu)-NH-(D-STag):12.4分
2)H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)の合成
上記のH-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.7mL、DMF2mL、Fmoc-Arg(Pbf)-OH 0.88g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。分析条件1にてH-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のFmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、AEEE62μL(0.5mmol)を加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、50分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のH-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを滴下した後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag):14,0分;H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag):12.5分
上記のH-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.7mL、DMF2mL、Fmoc-Arg(Pbf)-OH 0.88g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。分析条件1にてH-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のFmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、AEEE62μL(0.5mmol)を加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、50分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のH-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを滴下した後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag):14,0分;H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag):12.5分
3)H-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)の合成
上記のH-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Arg(Pbf)-OH 0.88g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。分析条件1にてH-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のFmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、AEEE62μL(0.5mmol)を加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、65分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のH-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを滴下した後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag):14,0分;H-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag):12.6分
上記のH-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Arg(Pbf)-OH 0.88g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。分析条件1にてH-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のFmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、AEEE62μL(0.5mmol)を加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、65分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のH-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを滴下した後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag):14,0分;H-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag):12.6分
4)H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)の合成
上記のH-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Trp(Boc)-OH 0.71g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で70分撹拌した。分析条件1にてH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のFmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、AEEE62μL(0.5mmol)を加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DMF 0.4mL、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、65分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag):14,0分;H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag):12.8分
上記のH-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Trp(Boc)-OH 0.71g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で70分撹拌した。分析条件1にてH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のFmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、AEEE62μL(0.5mmol)を加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DMF 0.4mL、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、65分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag):14,0分;H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag):12.8分
5)H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)の合成
上記のH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Gln(Trt)-OH 0.82g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。分析条件1にてH-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のFmoc-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、AEEE62μL(0.5mmol)を加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 3.0mLを添加し、DMF 0.4mL、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、65分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のH-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
得られたCPME溶液を減圧下で濃縮し、残渣にMeCN 24mL、IPA18mL、CPME6mL、水12mLを加え、析出した固体をろ取し、得られた固体を30℃で減圧乾燥した。H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag) 1.84gを得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag):14,2分;H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag):12.8分
上記のH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Gln(Trt)-OH 0.82g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。分析条件1にてH-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のFmoc-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、AEEE62μL(0.5mmol)を加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 3.0mLを添加し、DMF 0.4mL、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、65分撹拌した。分析条件1にてFmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のH-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
得られたCPME溶液を減圧下で濃縮し、残渣にMeCN 24mL、IPA18mL、CPME6mL、水12mLを加え、析出した固体をろ取し、得られた固体を30℃で減圧乾燥した。H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag) 1.84gを得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag):14,2分;H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag):12.8分
6)H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2の合成
H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)1.14g(0.50mmol)にトリフルオロ酢酸9.5mL、水0.25mL、トリイソプロピルシラン0.25mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、MTBE70mLをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物をMTBE10mLで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2 227mgを得た。得られたH-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2を分析条件1にて分析し、純度は71.0%であり、D-STag及びD-STagをトリフルオロ酢酸で処理することで生成するD-STag由来の化合物は検出されなかった。
保持時間(分析条件1):H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2:0.9分
H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)1.14g(0.50mmol)にトリフルオロ酢酸9.5mL、水0.25mL、トリイソプロピルシラン0.25mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、MTBE70mLをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物をMTBE10mLで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2 227mgを得た。得られたH-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2を分析条件1にて分析し、純度は71.0%であり、D-STag及びD-STagをトリフルオロ酢酸で処理することで生成するD-STag由来の化合物は検出されなかった。
保持時間(分析条件1):H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2:0.9分
実施例6
Fmoc-NH-(D-STag) 0.22g(0.2mmol)にトリフルオロ酢酸3.2mL、水0.09mL、トリイソプロピルシラン0.09mL、3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオール0.18mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応液を分析条件1および分析条件2にて分析し、D-STag由来の化合物を検出した。
保持時間(分析条件1):11.8分;11.9分;12.6分;13.0分
保持時間(分析条件2):0.5分;1.4分;2.0分;2.5分
実施例3と同様に、D-STagにおいても、D-STag等の脱保護後条件下で副生するD-STag由来の化合物は、分析条件1、2いずれを用いても分離性能良く検出できることがわかった。
Fmoc-NH-(D-STag) 0.22g(0.2mmol)にトリフルオロ酢酸3.2mL、水0.09mL、トリイソプロピルシラン0.09mL、3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオール0.18mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応液を分析条件1および分析条件2にて分析し、D-STag由来の化合物を検出した。
保持時間(分析条件1):11.8分;11.9分;12.6分;13.0分
保持時間(分析条件2):0.5分;1.4分;2.0分;2.5分
実施例3と同様に、D-STagにおいても、D-STag等の脱保護後条件下で副生するD-STag由来の化合物は、分析条件1、2いずれを用いても分離性能良く検出できることがわかった。
実施例7
H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2の合成
1)H-Thr(tBu)-NH-(X-STag)の合成
Fmoc-NH-(X-STag) 1.11g(1.0mmol)をCPME8mL、DMF2mLに溶解し、0℃に冷却した後、DIEPA 0.33mL(1.9mmol)、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.30g(1.8mmol)を添加し、DBU0.67mL(4.5mmol)を滴下した。0℃で1時間撹拌し、分析条件1および分析条件2にてFmoc-NH-(X-STag)が生成物のNH2-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液2.4mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液9mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水23mL、5%炭酸ナトリウム水溶液8mL、DMF 1.6mLを加え、分液し、NH2-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
このNH2-(X-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Thr(tBu)-OH 0.54g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で110分撹拌した。分析条件1および分析条件2にてNH2-(X-STag)が生成物のFmoc-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、アミノメタンホスホン酸0.15g(1.4mmol)、DMSO 2.4mLを加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)を添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、100分撹拌した。分析条件1および分析条件2にてFmoc-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のH-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸水素カリウム水溶液20mLを滴下した後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水15mL、DMF 1.6mLを加え、分液した。H-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-NH-(X-STag):15.0分;NH2-(X-STag):14.6分;Fmoc-Thr(tBu)-NH-(X-STag):14.8分;H-Thr(tBu)-NH-(X-STag):12.5分
保持時間(分析条件2):Fmoc-NH-(X-STag):3.2分;NH2-(X-STag):2.0分;Fmoc-Thr(tBu)-NH-(X-STag):3.6分;H-Thr(tBu)-NH-(X-STag):5.0分
H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2の合成
1)H-Thr(tBu)-NH-(X-STag)の合成
Fmoc-NH-(X-STag) 1.11g(1.0mmol)をCPME8mL、DMF2mLに溶解し、0℃に冷却した後、DIEPA 0.33mL(1.9mmol)、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.30g(1.8mmol)を添加し、DBU0.67mL(4.5mmol)を滴下した。0℃で1時間撹拌し、分析条件1および分析条件2にてFmoc-NH-(X-STag)が生成物のNH2-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液2.4mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液9mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水23mL、5%炭酸ナトリウム水溶液8mL、DMF 1.6mLを加え、分液し、NH2-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
このNH2-(X-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Thr(tBu)-OH 0.54g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で110分撹拌した。分析条件1および分析条件2にてNH2-(X-STag)が生成物のFmoc-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、アミノメタンホスホン酸0.15g(1.4mmol)、DMSO 2.4mLを加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)を添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、100分撹拌した。分析条件1および分析条件2にてFmoc-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のH-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸水素カリウム水溶液20mLを滴下した後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水15mL、DMF 1.6mLを加え、分液した。H-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-NH-(X-STag):15.0分;NH2-(X-STag):14.6分;Fmoc-Thr(tBu)-NH-(X-STag):14.8分;H-Thr(tBu)-NH-(X-STag):12.5分
保持時間(分析条件2):Fmoc-NH-(X-STag):3.2分;NH2-(X-STag):2.0分;Fmoc-Thr(tBu)-NH-(X-STag):3.6分;H-Thr(tBu)-NH-(X-STag):5.0分
2)H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)の合成
上記のH-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.6mL、DMF2mL、Fmoc-Arg(Pbf)-OH 0.88g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.47mL(2.7mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。分析条件1および分析条件2にてH-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のFmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール(AE)81μL(1.4mmol)を加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、90分撹拌した。分析条件1および分析条件2にてFmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のH-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸水素カリウム水溶液13mLを滴下した後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):14.1分;H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):12.6分
保持時間(分析条件2):Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):7.0分;H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):7.8分
上記のH-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.6mL、DMF2mL、Fmoc-Arg(Pbf)-OH 0.88g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.47mL(2.7mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。分析条件1および分析条件2にてH-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のFmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール(AE)81μL(1.4mmol)を加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、90分撹拌した。分析条件1および分析条件2にてFmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のH-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸水素カリウム水溶液13mLを滴下した後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):14.1分;H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):12.6分
保持時間(分析条件2):Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):7.0分;H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):7.8分
3)H-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)の合成
上記のH-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Glu(OtBu)-OH 0.57g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で75分撹拌した。分析条件1および分析条件2にてH-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のFmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、アミノメタンホスホン酸0.15g(1.4mmol)、DMSO 2.4mLを加え、室温で105分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)を添加し、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、85分撹拌した。分析条件1および分析条件2にてFmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のH-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸水素カリウム水溶液16mLを滴下した後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):14.1分;H-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):12.6分
保持時間(分析条件2):Fmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):7.0分;H-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):7.6分
上記のH-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Glu(OtBu)-OH 0.57g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で75分撹拌した。分析条件1および分析条件2にてH-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のFmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、アミノメタンホスホン酸0.15g(1.4mmol)、DMSO 2.4mLを加え、室温で105分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)を添加し、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、85分撹拌した。分析条件1および分析条件2にてFmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のH-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸水素カリウム水溶液16mLを滴下した後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):14.1分;H-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):12.6分
保持時間(分析条件2):Fmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):7.0分;H-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):7.6分
4)H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)の合成
上記のH-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Trp(Boc)-OH 0.71g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で75分撹拌した。分析条件1および分析条件2にてH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のFmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、3-アミノプロパンスルホン酸0.19g(1.4mmol)、DMSO 2.4mLを加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)を添加し、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、100分撹拌した。分析条件1および分析条件2にてFmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸水素カリウム水溶液16mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):14.2分;H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):12.8分
保持時間(分析条件2):Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):7.1分;H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):7.6分
上記のH-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Trp(Boc)-OH 0.71g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で75分撹拌した。分析条件1および分析条件2にてH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のFmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、3-アミノプロパンスルホン酸0.19g(1.4mmol)、DMSO 2.4mLを加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)を添加し、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、100分撹拌した。分析条件1および分析条件2にてFmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸水素カリウム水溶液16mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):14.2分;H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):12.8分
保持時間(分析条件2):Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):7.1分;H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):7.6分
5)H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)の合成
上記のH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を濃縮して得た残渣2,36gのうち0.47g(0.2mmol相当)をはかり取り、2-メチルテトラヒドロフラン1.8mL、DMF0.4mL、Fmoc-Gln(Trt)-OH 0.17g(0.3mmol)、COMU 0.11g(0.3mmol)、DIEPA 0.14mL(0.8mmol)を加え、室温で75分撹拌した。分析条件1および分析条件2にてH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のFmoc-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、硫酸水素2-アミノエチル38mg(0.3mmol)、DMSO 0.6mLを加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、3-メルカプト-1-プロパンホスホン酸(参考例1にて合成)76mg(0.5mmol)を添加し、DBU 0.18mL(1.2mmol)を加え、2時間撹拌した。分析条件1および分析条件2にてFmoc-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のH-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸水素カリウム水溶液5mL、CPME1mL、THF1mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水3mL、DMF 0.2mLを加え、分液した。H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
得られたCPME溶液を減圧下で濃縮し、残渣にMeCN 4mL、IPA1mLを加え、析出した固体をろ取し、得られた固体を減圧乾燥した。H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag) 0.31gを得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):14.9分;H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):12.9分
保持時間(分析条件2):Fmoc-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):7.4分;H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):7.8分
上記のH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を濃縮して得た残渣2,36gのうち0.47g(0.2mmol相当)をはかり取り、2-メチルテトラヒドロフラン1.8mL、DMF0.4mL、Fmoc-Gln(Trt)-OH 0.17g(0.3mmol)、COMU 0.11g(0.3mmol)、DIEPA 0.14mL(0.8mmol)を加え、室温で75分撹拌した。分析条件1および分析条件2にてH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のFmoc-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、硫酸水素2-アミノエチル38mg(0.3mmol)、DMSO 0.6mLを加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、3-メルカプト-1-プロパンホスホン酸(参考例1にて合成)76mg(0.5mmol)を添加し、DBU 0.18mL(1.2mmol)を加え、2時間撹拌した。分析条件1および分析条件2にてFmoc-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のH-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸水素カリウム水溶液5mL、CPME1mL、THF1mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水3mL、DMF 0.2mLを加え、分液した。H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
得られたCPME溶液を減圧下で濃縮し、残渣にMeCN 4mL、IPA1mLを加え、析出した固体をろ取し、得られた固体を減圧乾燥した。H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag) 0.31gを得た。
保持時間(分析条件1):Fmoc-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):14.9分;H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):12.9分
保持時間(分析条件2):Fmoc-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):7.4分;H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag):7.8分
6)H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2の合成
H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)0.25g(0.11mmol)にトリフルオロ酢酸3.2mL、水0.09mL、トリイソプロピルシラン0.09mL、3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオール0.18mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、MTBE30mLをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物をMTBE5mLで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2 78mgを得た。得られたH-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2を分析条件1にて分析し、純度は82.0%であり、X-STagは検出されず、X-STagをトリフルオロ酢酸で処理することで生成するX-STag由来の化合物を0.2%検出した。
保持時間(分析条件1):H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2:0.9分
H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)0.25g(0.11mmol)にトリフルオロ酢酸3.2mL、水0.09mL、トリイソプロピルシラン0.09mL、3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオール0.18mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、MTBE30mLをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物をMTBE5mLで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2 78mgを得た。得られたH-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2を分析条件1にて分析し、純度は82.0%であり、X-STagは検出されず、X-STagをトリフルオロ酢酸で処理することで生成するX-STag由来の化合物を0.2%検出した。
保持時間(分析条件1):H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2:0.9分
実施例8
Fmoc-NH-(X-STag) 0.22g(0.2mmol)にトリフルオロ酢酸3.2mL、水0.09mL、トリイソプロピルシラン0.09mL、3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオール0.18mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応液を分析条件1および分析条件2にて分析し、X-STag由来の化合物を検出した。
保持時間(分析条件1):11.4分;12.0分;12.3分;12.7分;13.4分
保持時間(分析条件2):0.5分;2.4分;2.8分;4.1分;4.9分
実施例7ではX-STag等の脱保護後に目的物ペプチドをMTBEを用いて晶出させ分離精製したため、X-STag由来の化合物はわずかしか検出されなかったが、晶出操作前の混合液中のX-STag由来の化合物は、分析条件1、2いずれを用いても分離性能良く検出できることがわかった。
Fmoc-NH-(X-STag) 0.22g(0.2mmol)にトリフルオロ酢酸3.2mL、水0.09mL、トリイソプロピルシラン0.09mL、3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオール0.18mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応液を分析条件1および分析条件2にて分析し、X-STag由来の化合物を検出した。
保持時間(分析条件1):11.4分;12.0分;12.3分;12.7分;13.4分
保持時間(分析条件2):0.5分;2.4分;2.8分;4.1分;4.9分
実施例7ではX-STag等の脱保護後に目的物ペプチドをMTBEを用いて晶出させ分離精製したため、X-STag由来の化合物はわずかしか検出されなかったが、晶出操作前の混合液中のX-STag由来の化合物は、分析条件1、2いずれを用いても分離性能良く検出できることがわかった。
参考例1
3-メルカプト-1-プロパンホスホン酸の合成
3-ブロモ-1-プロパンホスホン酸ジエチル777mg(3mmol)をアセトニトリル6mLに溶解し、トリフェニルメタンチオール1.66g(6mmol)、トリエチルアミン0.54mL(3.9mmol)を加え、50℃で18時間撹拌した。MTBE20mL、水20mLを加え分液し、有機層を20%塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。得られた有機層を濃縮し、濃縮残渣2.39gを得た。残渣をヘプタン/酢酸エチル(2/1)に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、3-(トリフェニルメチルチオ)-1-プロパンホスホン酸ジエチル1.36gを定量的収率で得た。
上記で得た3-(トリフェニルメチルチオ)-1-プロパンホスホン酸ジエチル1.36gをアセトニトリル10mLに溶解し、トリメチルシリルブロミド1,95mL(15mmol)を加え、室温で18時間撹拌した。メタノール4mLを加え、過剰なトリメチルシリルブロミドと反応させたのち、減圧濃縮した。濃縮残渣にアセトニトリル15mLを加え、溶解していない固体を濾別した。ろ液を濃縮し、濃縮残渣2.32gを得た。得られた残渣にトリフルオロ酢酸22.8mL、水0.6mL、トリイソプロピルシラン0.6mLを加え、室温で2時間撹拌した。反応液にMTBE24mLを加え、析出した固体を濾別したのち、ろ液を濃縮し、濃縮残渣3.30gを得た。残渣にMTBE35mL、ヘプタン12mL、水10mLを加え、分液した。有機層から水5mLで2回再抽出したのち、水層を合わせ減圧濃縮した。濃縮残渣0.72gを得た。残渣を水に溶解し、HPLCカラムクロマトグラフィ(カラム:YMC社製ODS-AQ-HG;10mm×250mm)で精製し、目的とする3-メルカプト-1-プロパンホスホン酸0.30gを得た。
1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)σ=1.60(2H,m)、1.71(2H,m)、2.32(1H,br)、2.53(2H,m)
LC-MS m/z 157.00[M+H+]
3-メルカプト-1-プロパンホスホン酸の合成
3-ブロモ-1-プロパンホスホン酸ジエチル777mg(3mmol)をアセトニトリル6mLに溶解し、トリフェニルメタンチオール1.66g(6mmol)、トリエチルアミン0.54mL(3.9mmol)を加え、50℃で18時間撹拌した。MTBE20mL、水20mLを加え分液し、有機層を20%塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。得られた有機層を濃縮し、濃縮残渣2.39gを得た。残渣をヘプタン/酢酸エチル(2/1)に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、3-(トリフェニルメチルチオ)-1-プロパンホスホン酸ジエチル1.36gを定量的収率で得た。
上記で得た3-(トリフェニルメチルチオ)-1-プロパンホスホン酸ジエチル1.36gをアセトニトリル10mLに溶解し、トリメチルシリルブロミド1,95mL(15mmol)を加え、室温で18時間撹拌した。メタノール4mLを加え、過剰なトリメチルシリルブロミドと反応させたのち、減圧濃縮した。濃縮残渣にアセトニトリル15mLを加え、溶解していない固体を濾別した。ろ液を濃縮し、濃縮残渣2.32gを得た。得られた残渣にトリフルオロ酢酸22.8mL、水0.6mL、トリイソプロピルシラン0.6mLを加え、室温で2時間撹拌した。反応液にMTBE24mLを加え、析出した固体を濾別したのち、ろ液を濃縮し、濃縮残渣3.30gを得た。残渣にMTBE35mL、ヘプタン12mL、水10mLを加え、分液した。有機層から水5mLで2回再抽出したのち、水層を合わせ減圧濃縮した。濃縮残渣0.72gを得た。残渣を水に溶解し、HPLCカラムクロマトグラフィ(カラム:YMC社製ODS-AQ-HG;10mm×250mm)で精製し、目的とする3-メルカプト-1-プロパンホスホン酸0.30gを得た。
1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)σ=1.60(2H,m)、1.71(2H,m)、2.32(1H,br)、2.53(2H,m)
LC-MS m/z 157.00[M+H+]
比較例1
B-STag 0.79g(1.0mmol)をCPME2mL、THF3mLに溶解し、Fmoc-Glu(OtBu)-OH 1.06g(2.5mmol)、WSCI・HCl 0.48g(2.5mmol)、4-ジメチルアミノピリジン12.2mg(0.1mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。分析条件3にて分析したところ、B-STag及び生成物のFmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)の両方が検出されなかった。
B-STag 0.79g(1.0mmol)をCPME2mL、THF3mLに溶解し、Fmoc-Glu(OtBu)-OH 1.06g(2.5mmol)、WSCI・HCl 0.48g(2.5mmol)、4-ジメチルアミノピリジン12.2mg(0.1mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。分析条件3にて分析したところ、B-STag及び生成物のFmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)の両方が検出されなかった。
比較例2
Fmoc-NH-(D-STag) 1.09g(1.0mmol)をCPME9mL、DMF2mLに溶解し、0℃に冷却した後、DIEPA 0.32mL(1.9mmol)、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.30g(1.8mmol)を添加し、DBU0.67mL(4.5mmol)を滴下した。0℃で1時間撹拌し、分析条件3にて分析したところ、Fmoc-NH-(D-STag)及び生成物のNH2-(D-STag)の両方が検出されなかった。
Fmoc-NH-(D-STag) 1.09g(1.0mmol)をCPME9mL、DMF2mLに溶解し、0℃に冷却した後、DIEPA 0.32mL(1.9mmol)、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.30g(1.8mmol)を添加し、DBU0.67mL(4.5mmol)を滴下した。0℃で1時間撹拌し、分析条件3にて分析したところ、Fmoc-NH-(D-STag)及び生成物のNH2-(D-STag)の両方が検出されなかった。
比較例3
Fmoc-NH-(X-STag) 1.11g(1.0mmol)をCPME8mL、DMF2mLに溶解し、0℃に冷却した後、DIEPA 0.33mL(1.9mmol)、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.30g(1.8mmol)を添加し、DBU0.67mL(4.5mmol)を滴下した。0℃で1時間撹拌し、分析条件3にて分析したところ、Fmoc-NH-(X-STag)及び生成物のNH2-(X-STag)の両方が検出されなかった。
Fmoc-NH-(X-STag) 1.11g(1.0mmol)をCPME8mL、DMF2mLに溶解し、0℃に冷却した後、DIEPA 0.33mL(1.9mmol)、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.30g(1.8mmol)を添加し、DBU0.67mL(4.5mmol)を滴下した。0℃で1時間撹拌し、分析条件3にて分析したところ、Fmoc-NH-(X-STag)及び生成物のNH2-(X-STag)の両方が検出されなかった。
比較例1~3に示したように、分析条件3においては、Fmocの結合の有無によらずB-STag、?-STag、X-STagのいずれも検出することができなかった。従って、アセトニトリルを使用したHPLC測定系では、これらの液相ペプチド合成用担体それ自体及び、液相ペプチド合成用担体とアミノ酸、ペプチド若しくはアミノ酸アミドが結合した化合物を検出することはできず、また目的ペプチド又は最終目的ペプチドと液相ペプチド合成用担体及び液相ペプチド合成用担体由来の不純物を同時に分析検出することもできない。一方、実施例1~8に示したように、溶離液にイソプロパノールを使用した分析条件1、2では、液相ペプチド合成用担体それ自体及び、液相ペプチド合成用担体とアミノ酸、ペプチド若しくはアミノ酸アミドが結合した化合物を検出することができ、また目的ペプチド又は最終目的ペプチドと、液相ペプチド合成用担体由来の不純物も分析検出することができた。
Claims (7)
- 炭素数1~4のアルコールを含む溶液を溶離液として用いる高速液体クロマトグラフィー又は超臨界流体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする、液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体の脱保護後条件下で副生する液相ペプチド合成用担体由来の成分、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸及び液相ペプチド合成用担体が結合しているペプチド化合物から選ばれる1種以上の化合物と、目的ペプチド又は最終目的ペプチドとを同時に分析する方法であって、
前記液相ペプチド合成用担体が、下記の式(I)の化合物である、分析方法。
R11は、水素原子であるか、又は環Aがベンゼン環でRbが下記式(a)で表される基である場合には、R14と一緒になって単結合を示して、環A及び環Bと共にフルオレン環を形成するか、又は酸素原子を介して環A及び環Bと共にキサンテン環を形成してもよく;p個のXは、それぞれ独立して-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-、-NHC(=O)-、又は-NR17-(R17は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)を示し;
p個のR12は、それぞれ独立して酸素原子を介して脂肪族炭化水素基で置換されている脂肪族炭化水素基、又は式(b)のいずれかである有機基を示し;
q個のR13は、それぞれ独立して水素原子であるか、又は酸素原子を介してシリル基若しくは脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
p、qは、それぞれ0~4の整数かつp+qが1以上4以下を示し;
環Aは、p個のXR12に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、及びハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子、又はハロゲン原子により置換されていてもよい芳香族環を示し;
Rbは、水素原子、ハロゲン原子により置換されていてもよい芳香環、又は式(a):
r、sは、それぞれ0~4の整数かつr+sが4以下を示し;
r個のZは、それぞれ独立して-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-、-NHC(=O)-、又は-NR18-(R18は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)を示し;
r個のR15は、独立して脂肪族炭化水素基で置換されている脂肪族炭化水素基、又は式(b)のいずれかである有機基を示し;
s個のR16は、それぞれ独立して酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
R14は、水素原子を示すか、R11と一緒になって単結合を示して、環A及び環Bと共にフルオレン環を形成するか,又は酸素原子を介して環A及び環Bと共にキサンテン環を形成してもよく;
環Bは、r個のZR15に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、及びハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示し;
Yは、ヒドロキシ基、チオール基、NHR19(R19は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)又はハロゲン原子を示す。] - 炭素数1~4のアルコールを含む溶液を溶離液として用いる高速液体クロマトグラフィー又は超臨界流体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする、液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体の脱保護後条件下で副生する液相ペプチド合成用担体由来の成分、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸及び液相ペプチド合成用担体が結合しているペプチド化合物から選ばれる1種以上の化合物と、目的ペプチド又は最終目的ペプチドとを同時に分析する方法であって、
前記液相ペプチド合成用担体が、下記の式(1)、(13)または(14)のいずれかの化合物である、分析方法。
R20は炭素数6~16の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示し;
X3はO又はCONR21(ここでR21は水素原子又は炭素数1~4のアルキル基を示す)を示し;
Dは式(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)又は(12)
で表される基を示す)
R51~R60のうちの少なくとも1個は式(c)で表される基を示し、残余は水素原子、ハロゲン原子、炭素数1~4のアルキル基又は炭素数1~4のアルコキシ基を示し;
X4が-OR61、-NHR45、アジド又はハロゲンであり、かつX5が水素原子のとき、若しくはX4とX5が一緒になって=Oのとき、R55とR56は酸素原子を介して結合してキサンテン環を形成していてもよい)
- 炭素数1~4のアルコールを含む溶液を溶離液として用いる高速液体クロマトグラフィー又は超臨界流体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする、液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体の脱保護後条件下で副生する液相ペプチド合成用担体由来の成分、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸及び液相ペプチド合成用担体が結合しているペプチド化合物から選ばれる1種以上の化合物と、目的ペプチド又は最終目的ペプチドとを同時に分析する方法であって、
前記液相ペプチド合成用担体が、下記の式(20)または(21)のいずれかの化合物である、分析方法。
R20は炭素数6~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基またはアルキレン基を示し;
X3は存在しないか、酸素原子を示し;
Eは存在しないか、炭素数6~30の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を示す。)
R51~R60のうちの少なくとも1個は式(d)で表される基を示し、残余は水素原子、ハロゲン原子、炭素数1~4のアルキル基又は炭素数1~4のアルコキシ基を示す。) - 前記液相ペプチド合成用担体が、アミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドに直接またはリンカーを介して結合して、それらを有機溶媒に溶解性で水に不溶性にする化合物である請求項1~3のいずれか1項に記載の分析方法。
- 分析に用いる試料が、分析対象物に対して固液分離を行っていない反応液である請求項1~4のいずれか1項に記載の分析方法。
- 分析に用いる試料が、分析対象物に対して固液分離又はクロマトグラフィーによる精製を行った後のものである請求項1~4のいずれか1項に記載の分析方法。
- 検出された又は検出されなかった液相ペプチド合成用担体、液相ペプチド合成用担体の脱保護後条件下で副生する液相ペプチド合成用担体由来の成分、液相ペプチド合成用担体が結合しているアミノ酸及び液相ペプチド合成用担体が結合しているペプチド化合物から選ばれる1種以上の化合物と、検出された目的ペプチド又は検出された最終目的ペプチドとを関連付けて評価する請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
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