WO2018190333A1 - トランスジェニックカイコ、および該カイコを用いた非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法 - Google Patents

トランスジェニックカイコ、および該カイコを用いた非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法 Download PDF

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WO2018190333A1
WO2018190333A1 PCT/JP2018/015039 JP2018015039W WO2018190333A1 WO 2018190333 A1 WO2018190333 A1 WO 2018190333A1 JP 2018015039 W JP2018015039 W JP 2018015039W WO 2018190333 A1 WO2018190333 A1 WO 2018190333A1
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WO
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amino acid
protein
acid sequence
silkworm
seq
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PCT/JP2018/015039
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English (en)
French (fr)
Inventor
英敏 寺本
桂 小島
健作 坂本
史枝 木村
芳美 山口
Original Assignee
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
国立研究開発法人理化学研究所
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a transgenic silkworm and a method for producing an unnatural amino acid-containing protein using the silkworm.
  • Silk protein is listed as a next-generation material with no fear of depletion.
  • Silk itself has many useful properties, but it is expected to be utilized industrially as a more useful material by modifying its properties. For example, the development of tough silk materials that exceed existing silk materials and the introduction of devices into silk proteins are expected as devices become wearable. In addition, silk protein with high biocompatibility is expected to be applied to medical materials and cosmetic materials.
  • site-specific unnatural amino acid introduction method Two methods are known for introducing unnatural amino acids into proteins.
  • This method requires administration of an unnatural amino acid and modification of the target protein gene sequence, and has a tRNA having an anticodon corresponding to the codon of the modified sequence, and aaRS (aminoacyl) for aminoacylating the tRNA with the unnatural amino acid.
  • aaRS aminoacyl
  • -TRNA synthetase both the target protein gene and the target aaRS gene must be modified, and the process is complicated.
  • sequence of the target protein gene must be known.
  • the “residue-specific unnatural amino acid introduction method” is known as the second method.
  • the uptake efficiency of an unnatural amino acid is improved by forced expression of a mutant aaRS in which a mutation is introduced into an amino acid binding site.
  • This residue-specific non-natural amino acid introduction method can be performed without modifying the target protein gene sequence, so it is easier to use than the site-specific non-natural amino acid introduction method, and the target protein gene sequence is unknown.
  • it since it has the advantage of being usable, it is a technology with high utility value.
  • the present inventor has improved a method for introducing a residue-specific unnatural amino acid, and has added a protein containing a certain unnatural amino acid (for example, pN 3 -Phe) such as an unnatural amino acid having a structure greatly different from that of the natural amino acid It succeeded in manufacturing in a silkworm (refer nonpatent literature 1).
  • a protein containing a certain unnatural amino acid for example, pN 3 -Phe
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, a transgenic silkworm capable of producing a non-natural amino acid-containing protein with high efficiency with a small amount of a non-natural amino acid, and a non-natural amino acid-containing protein using the transgenic silkworm A manufacturing method is provided.
  • transgenic silkworm that specifically expresses a silk gland that encodes a protein having an activity of binding a desired unnatural amino acid to tRNA.
  • the present invention provides a transgenic silkworm having the following characteristics and a method for producing an unnatural amino acid-containing protein using the transgenic silkworm.
  • DNA encoding a protein comprising a sequence containing any one of the following amino acid sequences (a) to (c) and having an activity of binding a desired unnatural amino acid to a phenylalanine-specific tRNA; and A transgenic silkworm comprising a promoter that specifically expresses the DNA as a silk gland.
  • A an amino acid sequence having a mutation at amino acid number 432 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • B an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, inserted, substituted or added at a site other than amino acid number 432 in (a);
  • C an amino acid sequence having 80% or more identity at a site other than amino acid number 432 in (a)
  • the transgenic silkworm according to (1) wherein the amino acid number 432 in (a) is alanine, valine, leucine, methionine, threonine, cysteine, or tyrosine.
  • the transgenic silkworm according to any one of (1) to (5), wherein the promoter that specifically expresses the DNA is a silk gland-specific promoter.
  • the transgenic silkworm according to any one of (1) to (6), wherein the promoter that specifically expresses the DNA is a silk fibroin L chain-derived promoter.
  • a non-natural amino acid comprising a step of administering an unnatural amino acid to the transgenic silkworm according to any one of (1) to (7) or the F1 hybrid according to (8).
  • a method for producing an amino acid-containing protein The method for producing a protein containing an unnatural amino acid according to (9), wherein the unnatural amino acid is a phenylalanine analog.
  • R represents a halogen atom, a cyano group, an azide group, or an ethynyl group.
  • transgenic silkworm that can produce an unnatural amino acid-containing protein with high efficiency with a small amount of unnatural amino acid, and a method for producing an unnatural amino acid-containing protein using the transgenic silkworm.
  • BmFRS1 silkworm ⁇ subunit gene
  • PheRS phenylalanyl-tRNA synthetase
  • An asterisk (*) attached to BmFRS1 indicates a mutant gene. Fibroin production per head of silkworms administered an amount of p-N 3 -Phe (bars), and p-N 3 p-N 3 -Phe incorporation of -Phe into fibroin in which silkworms administered is produced Amount (mass analysis peak intensity ratio) (circle plot) is shown.
  • Fibroin production per head of silkworms administered with p-N 3 -Phe different amounts (bars), and p-N 3 p-N 3 -Phe incorporation of -Phe into fibroin in which silkworms administered is produced Amount (mass analysis peak intensity ratio) (circle plot) is shown.
  • Fibroin production per head of silkworms administered with p-N 3 -Phe different amounts (bars), and p-N 3 p-N 3 -Phe incorporation of -Phe into fibroin in which silkworms administered is produced Amount (mass analysis peak intensity ratio) (circle plot) is shown.
  • the transgenic silkworm of the present invention comprises a protein comprising a sequence containing any one of the following amino acid sequences (a) to (c) and having an activity of binding a desired unnatural amino acid to a phenylalanine-specific tRNA.
  • a transgenic silkworm comprising a coding DNA and a promoter for expressing the DNA in a silk gland-specific manner.
  • A an amino acid sequence having a mutation at amino acid number 432 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
  • B an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, inserted, substituted or added at a site other than amino acid number 432 in (a);
  • C an amino acid sequence having 80% or more identity at a site other than amino acid number 432 in (a)
  • Aminoacylation of tRNA is catalyzed by aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) corresponding to each amino acid.
  • aaRS has strict substrate specificity among the 20 amino acids constituting the protein.
  • aaRS corresponding to phenylalanine is called phenylalanyl-tRNA synthetase (PheRS).
  • the DNA encoding the protein having the amino acid sequence of (a) to (c) is a DNA having a mutation in the ⁇ subunit of silkworm PheRS, and has an activity of binding a desired unnatural amino acid to a phenylalanine-specific tRNA. It is DNA which codes protein which has.
  • a protein having an activity of binding a desired unnatural amino acid to this phenylalanine-specific tRNA only needs to have this activity, and in addition to any of the sequences (a) to (c), It may further have an arbitrary sequence such as a protein tag (for example, histidine tag, HA tag, GFP, etc.).
  • a DNA encoding a protein having any one of the sequences (a) to (c) an amino acid (non-naturally occurring) that does not normally correspond to the original codon for the protein produced in the silk gland Amino acids) can be introduced.
  • the non-natural amino acid can be introduced with high efficiency into a protein produced from the silk gland with a small amount of the non-natural amino acid.
  • the amino acid number 432 in (a) is preferably alanine, valine, leucine, methionine, threonine, cysteine, or tyrosine. More preferred is methionine.
  • the transgenic silkworm of the present invention has a sequence comprising any one of the following amino acid sequences (d) to (h) and has an activity of binding a desired unnatural amino acid to a phenylalanine-specific tRNA. It preferably has a protein-encoding DNA and a promoter that allows the DNA to be expressed specifically in the silk gland.
  • the number of amino acids deleted, inserted, substituted or added is preferably 1 to 50, more preferably 1 to 20, further preferably 1 to 10, particularly preferably 1 to 5, One to two is most preferred.
  • the identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the transgenic silkworm of the present invention may have a mutation at amino acid number 407 in addition to the mutation at amino acid number 432.
  • alanine or glycine is preferable.
  • the unnatural amino acid-containing protein produced by the silk gland is not particularly limited, and silk protein produced by silkworm in the silk gland is preferable.
  • exogenous DNA encoding an arbitrary protein may be forcibly expressed in the silk gland, and the arbitrary protein may be produced in the silk gland.
  • the protein produced by the silk gland is secreted outside the silkworm body as silk thread, it can be easily recovered without using a special recovery method, and a large amount of protein can be easily obtained.
  • a promoter for expressing the DNA in the silk gland is used in the present invention.
  • the silk gland is roughly classified into an anterior silk gland, a middle silk gland, and a posterior silk gland.
  • the promoter for specifically expressing the DNA in the silk gland is not particularly limited as long as it is a promoter capable of specifically expressing the DNA in the silk gland, and any one or two of the above three sites are used.
  • a promoter that can be expressed at a site consisting of the above combinations may also be used.
  • Examples of the promoter specifically expressed in the middle silk gland include a promoter of DNA encoding sericin 1 protein or sericin 2 protein.
  • an unnatural amino acid can be introduced into the protein produced in the middle silk gland.
  • An example of a protein produced in the middle silk gland of silkworm is sericin.
  • examples of the promoter specifically expressed in the posterior silk gland include a promoter of DNA encoding a fibroin L chain (FibL) protein.
  • FibL fibroin L chain
  • an unnatural amino acid can be introduced into the protein produced in the posterior silk gland.
  • the protein produced in the silkworm's posterior silk gland is fibroin, and fibroin accounts for the majority of silkworm silk protein. Therefore, by using a promoter that is specifically expressed in the silkworm's silk gland, the silk protein properties are controlled. Becomes easier.
  • sequences for controlling the expression of the DNA, the subsequent translation into the protein, etc. may be used at the same time.
  • sequences include 3′UTR (untranslated region). ) 5′UTR sequence and the like.
  • the host silkworm used for the production of the transgenic silkworm of the present invention is not particularly limited as long as it is a silkworm capable of producing a protein containing an unnatural amino acid in the method for producing an unnatural amino acid-containing protein of the present invention described later.
  • w1-pnd or the like widely used for gene recombination preparation may be used, but from the viewpoint of increasing the amount of unnatural amino acids administered as feed to silkworm individuals, artificial feed feeding properties It is preferable to use silkworms excellent in the above.
  • varieties such as day 01, day 509, day 510, day 603, day 604, medium 604, medium 605 and the like are preferable, and the amount of intake of artificial feed containing an unnatural amino acid per individual is More white / CS (system name: MCS601) is more preferable.
  • MCS601 system name: MCS601
  • the silkworm used for producing the transgenic silkworm of the present invention is not particularly limited, and either a silkworm having the property of producing non-dormant eggs or a silkworm having the property of producing dormant eggs should be used. Is possible.
  • non-dormant eggs can be laid using the “low-temperature dark blue” method. That is, the embryo is protected at about 15 ° C. after the limb development period, particularly after the bristle development stage. This low temperature period needs 10 days or more in terms of days. Keep dark from embryo reversal to head coloring.
  • Silkworm pupae obtained by rearing hatched larvae then lay non-dormant eggs. (Introduction to Species, Author: Takeo Takami, Issued: National Species Association (May 31, 1969)).
  • the eggs may be broken through dormancy by immersing the silkworm eggs.
  • a specific method of the soaking treatment is to immerse silkworm eggs 3 to 4 hours after egg collection in hydrochloric acid at room temperature for about 30 minutes, wash away the hydrochloric acid by washing with water, and then air dry the eggs.
  • the hydrochloric acid having a specific gravity of 1.11 can be used (see Ai-Chun-Zhao et.al., Insect Science (2012) Vol.19, pp.172-182.).
  • Examples of methods for producing transgenic silkworms include a method of introducing DNA into silkworm eggs.
  • DNA is introduced into silkworm eggs by, for example, a method of injecting transposon into a silkworm early development egg as a vector (Tamura, T., et. Al., Nature Biotechnology, (2000) Vol. 18, pp. 81- 84)).
  • an inverted terminal repeat of a transposon (Handler, A.M., et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1998) Vol. 95, pp. 7520-7525.
  • a vector having a DNA encoding a transposon transferase (helper vector) introduced into a silkworm egg together with a vector in which the DNA is inserted.
  • helper vector include, but are not limited to, pHA3PIG (Tamura, T., et.al., Nature Biotechnology, (2000) Vol.18, pp. 81-84.).
  • piggyBac is preferable, but is not limited thereto, and mariner, minos, and the like can be used (Shimizu, K., Insect Mol. Biol., (2000). ) Vol.9, pp.277-281.).
  • a baculovirus vector can also be used for the production of the transgenic silkworm of the present invention (see Yamao, M., et. Al., Genes Dev. (1999) Vol. 13, pp. 511-516. ).
  • the above-described method of injecting a transposon as a vector, the method of using a baculovirus vector, and other methods of introducing DNA into silkworm eggs may be used for DNA encoding a protein having the amino acid sequence.
  • a non-natural amino acid-containing protein using the transgenic silkworm of the present invention it may be used for DNA encoding any protein produced.
  • Introduction of DNA into silkworm eggs can be carried out by those skilled in the art by a general method. For example, it can be carried out by the method described in JP 2012-187123 A as follows. Although it is possible to introduce DNA directly into the egg using a tube for injecting DNA into a silkworm egg, in a preferred embodiment, a hole is physically or chemically formed in advance in the eggshell, and the DNA is removed from the hole. Introduce.
  • a method of physically making a hole in an eggshell for example, a method of making a hole using a needle, a micro laser, or the like can be mentioned.
  • a method of making a hole in the eggshell by a method using a needle is preferable.
  • the material, strength, etc. of the needles used so long as they can make holes in silkworm eggshells.
  • a method of chemically making a hole in an eggshell for example, a method of making a hole using a chemical (such as hypochlorous acid) can be mentioned.
  • the DNA introduction method includes the steps of physically or chemically making a hole in the silkworm egg, inserting a DNA injection tube into the egg through the hole, and injecting the DNA into a needle and DNA. It is preferable to use a manipulator in which an injection tube is integrated. A device having a manipulator as one of the components can be used.
  • Such devices include a dissecting microscope, an illumination device, a movable stage, a coarse manipulator fixed to the microscope with a metal fitting, a micromanipulator attached to this manipulator, and air pressure for injecting DNA.
  • the thing comprised from the injector which adjusts is mentioned.
  • the apparatus of the patent 1654050 gazette or the apparatus which improved this apparatus is mentioned.
  • Whether or not DNA has been introduced into silkworm eggs can be determined by, for example, extracting the injected DNA again from the eggs (Nagaraju, J., et. Al., Appl. Entomol. Zool, (1996) Vol. 31, pp. 589-598.) And a method for observing the expression of DNA as an injected gene in eggs (Tamura, T., et. Al., (1990) Jpn. J. Genet., Vol. .65, pp. 401-410.) And the like.
  • Whether or not the DNA introduced into the silkworm egg is integrated into the silkworm chromosome and a genetically modified silkworm is obtained is determined, for example, by mating adults raised from eggs injected with DNA (mutually or non-recombinant silkworms). And fertilized eggs, and the expression of a marker gene (for example, EGFP, DsRed, CFP, YFP, etc.) is observed with a fluorescence microscope 6-10 days after the egg laying, or a body color marker gene (for example, Bm- This is possible by visually confirming the expression of aaNAT.
  • a marker gene for example, EGFP, DsRed, CFP, YFP, etc.
  • RNA introduced into silkworm eggs is expressed in silkworms is confirmed by observing the expression of the marker gene with a fluorescence microscope for eggs (G1 generation) born from individuals that have grown from injected eggs (G0 generation) To do.
  • G1 generation a fluorescence microscope for eggs
  • G0 generation injected eggs
  • total RNA may be extracted from silkworms, and the transgene may be confirmed by RT-PCR using the extracted RNA as a template.
  • the method of confirming in which part of the silkworm individual the DNA introduced into the silkworm is expressed is, for example, a method in which the tissue is extracted from the larvae and the expression is confirmed for each tissue, CFP, GFP, EGFP, It can be confirmed by a method of observing silkworm individuals using a fluorescent microscope using a known reporter gene such as YFP or DsRED.
  • the method for producing an unnatural amino acid-containing protein of the present invention includes a step of administering an unnatural amino acid to the transgenic silkworm of the present invention.
  • the unnatural amino acid means an amino acid that does not constitute a protein.
  • the amino acids constituting the protein mean 20 standard natural amino acids, selenocysteine, and pyrrolidine. That is, in the present invention, the unnatural amino acid means an analog of these amino acids constituting the protein (modified amino acid) or any amino acid other than these amino acids constituting the protein.
  • the transgenic silkworm of the present invention has a DNA sequence encoding a protein having an activity of binding a desired unnatural amino acid to a phenylalanine-specific tRNA. Therefore, the non-natural amino acid used is preferably a phenylalanine analog.
  • the phenylalanine analog it is preferable that at least one hydrogen atom of the side chain of phenylalanine is substituted by a substituent, and it is more preferable that the hydrogen atom of the benzene ring of the phenylalanine side chain is substituted, It is particularly preferred that the para position of the benzene ring is substituted.
  • substituents examples include substitution of halogen atoms such as fluorine, chlorine, bromine and iodine; ethynyl group; cyano group; azide group and the like. That is, as the phenylalanine analog, an amino acid represented by the following general formula (1) is preferable.
  • R represents a halogen atom, an azide group or an ethynyl group.
  • R is preferably an azide group or an ethynyl group.
  • various methods can be selected as a method for confirming the type and content of the unnatural amino acid contained in the protein. Analysis is preferably performed, and a method of measuring a mass spectrum by a MALDI-TOF-MS method is particularly preferable.
  • the present invention it is possible to improve or modify the properties and functions of the original protein in the produced non-natural amino acid-containing protein. Furthermore, new properties and functions not found in the original protein can be imparted. For example, by applying a method for introducing an unnatural amino acid to a silk protein, the unnatural amino acid can be contained in the silk protein, and properties and functions not found in the original silk can be imparted.
  • the form of the silk material is not particularly limited, and examples thereof include a solution form, a powder form, a fiber form, a sponge form, a film form, and a block form.
  • the unnatural amino acid used in the present invention can be used at the same time as a natural amino acid, and only one type of unnatural amino acid can be used, or two or more types of unnatural amino acids can be used simultaneously.
  • the silkworm breeding method of the present invention can be performed by giving a feed containing an unnatural amino acid to those skilled in the art according to a common silkworm breeding method.
  • breeding can be performed according to the method described in “Ministry of Education (1978) Soybean Manufacture. Pp193, Jikkyo Publishing Co., Tokyo”.
  • a non-natural amino acid having a functional group that causes a chemical reaction by light is fed to a silkworm, it is preferable to breed the silkworm under conditions where the non-natural amino acid is not irradiated with light.
  • a preferred breeding method there is a method of breeding silkworms in a continuous dark period environment where no light is irradiated.
  • the silkworm may be irradiated with light, and a method of rearing a silkworm under a condition in which light is not irradiated to the unnatural amino acid having a functional group that causes a chemical reaction by the light,
  • a method of rearing a silkworm under a condition in which light is not irradiated to the unnatural amino acid having a functional group that causes a chemical reaction by the light For example, the space around the food to be fed is physically shielded from the light source, the unnatural amino acid is given to the silkworm, and when the silkworm produces the protein containing the unnatural amino acid from the silk gland, A method such as rearing silkworms in an environment where no irradiation is applied.
  • the protein production method using the transgenic silkworm of the present invention is a residue-specific unnatural amino acid introduction method. Therefore, according to the present invention, a protein containing any kind of unnatural amino acid can be produced from transgenic silkworms of the same strain only by changing the kind of unnatural amino acid administered to the silkworm.
  • FIG. 1 The results are shown in FIG. In FIG. 1, the darker the color, the stronger the growth inhibition was observed. As shown in FIG. 1, it was confirmed that four of Phe432Val, Phe432Ala, Thr407Ala / Phe432Val, and Thr407Ala / Phe432Met were excellent in recognizing pN 3 -Phe.
  • a fibroin L chain (FibL) -derived promoter and 3′UTR sequence were added to the above vector on the 5 ′ and 3 ′ sides of the BmFRS1 * , respectively.
  • FibL fibroin L chain
  • Figures 3 to 4 show fibroin production per silkworm and pN 3 -Phe uptake (mass analysis peak intensity ratio).
  • the vertical axis (left) represents the amount of fibroin produced per silkworm represented by a bar graph
  • the vertical axis (right) represents pN 3 ⁇ in fibroin represented by a circle plot. The ratio of the peak intensity of Phe is shown.
  • the peak intensity of pN 3 -Phe in fibroin was calculated by the following method.
  • the silkworm layer of the transgenic silkworm was dissolved in an 8M LiBr aqueous solution at a concentration of about 50 mg / mL by heating at 35 ° C. for 40 minutes. About 4.5 mg / mL of this solution in 8M urea aqueous solution.
  • the mixture was diluted with a sample buffer containing a reducing agent, adjusted to a concentration of about 3 mg / mL, and then allowed to stand at room temperature for 30 minutes or more for reduction treatment.
  • the reduced sample solution was separated by SDS-PAGE, and the FibL band was cut out, decolorized, washed and dried, and then digested in gel at 37 ° C.
  • the N 3 group is considered to have been reduced to the NH 2 group during the reduction treatment during SDS-PAGE sample preparation and / or during the MALDI-TOF-MS measurement. From the measurement data, the relative peak intensity of the pN 3 -Phe-containing peptide fragment relative to the Phe-containing peptide fragment was determined.
  • fibroin production in H09 fed with artificial feed containing 0.1% pN 3 -Phe was equivalent to fibroin production in H03. Further, as shown in FIGS. 3 to 4, in the fibroin produced by silkworm, the amount of pN 3 -Phe incorporated was significantly higher in H06 to H09 than in H03.
  • Example 2 In the transgenic silkworms H06 and H07, the fibroin production amount per unit amount of silkworm and the uptake amount of pN 3 -Phe were confirmed when the content ratio of pN 3 -Ph in the artificial feed to be fed was changed did.
  • the results are shown in FIGS. 5 to 6, the horizontal axis represents the content of pN 3 -Phe in artificial feed (in terms of dry diet), and the vertical axis (left) represents fibroin per unit amount of silkworm expressed in a bar graph.
  • the production amount is shown, and the vertical axis (right) shows the ratio of the peak intensity of pN 3 -Phe in fibroin represented by a circle plot.
  • H06 In FIG. 5, in H06, about 0.05 mg of fibroin introduced with pN 3 -Phe can be produced and incorporated by containing 0.05% pN 3 -Phe in the synthetic feed.
  • the ratio of the peak intensity of pN 3 -Phe was about 0.15.
  • H06 requires a required content ratio of pN 3 -Phe to be 1/10 of H03, and the introduction efficiency of pN 3 -Phe is H03. 3 times.
  • Transgenic silkworm H06 was crossed with general cultivar day 509 ⁇ day 510 to obtain the hybrid H06 ⁇ (day 509 ⁇ day 510).
  • H06 ⁇ day 509 ⁇ day 510
  • male larvae and female larvae was fed with an artificial diet having a normal composition from the 5th inception to the second day, and thereafter, different pN 3 -Phe from the third day.
  • a proportion of artificial feed was fed.
  • the production amount of fibroin per unit amount of silkworm and the uptake amount of pN 3 -Phe were confirmed. The results are shown in FIG. In FIG.
  • the horizontal axis shows the content of p-N3-Phe in artificial feed (in terms of dry diet), and the vertical axis (left) shows fibroin production per unit amount of silkworm expressed in a bar graph.
  • the vertical axis (right) shows the ratio of the peak intensity of pN 3 -Phe in fibroin represented by a circle plot.
  • fibroin production in H06 ⁇ day 509 ⁇ day 510) fed with artificial diet containing 0.05% pN 3 -Phe was about 170 mg for male larvae and about 170 mg for female larvae. 160 mg, which is approximately 1.6 to 1.7 times the fibroin production in H06.
  • the uptake of pN 3 -Phe in fibroin was about 0.14 for male larvae and about 0.16 for female larvae, equivalent to H06, and no decrease in uptake due to crossing was observed. . From the above experimental results, it was shown that the production of fibroin can be improved without reducing the uptake of pN 3 -Phe by crossing the transgenic line shown in the present invention with a general variety.
  • Non-natural amino acid-containing proteins produced using the transgenic silkworms of the present invention are widely applicable in the fields of textiles, medical fields, functional materials, etc., and are more suitable for each application. Have the potential to provide modified silk. In addition, there is a possibility that new silk applications can be developed by the present invention.

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Abstract

以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、フェニルアラニン特異的ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び、該ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを有することを特徴とするトランスジェニックカイコ。 （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４３２位に変異を有するアミノ酸配列、（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸番号４３２位以外の部位において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸番号４３２位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列

Description

トランスジェニックカイコ、および該カイコを用いた非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法
　本発明はトランスジェニックカイコ、および該カイコを用いた非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法に関する。
　本願は、２０１７年４月１２日に、日本に出願された特願２０１７－７９２９４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　石油、金属、セラミックス等の天然資源は、将来の枯渇が懸念されている。枯渇のおそれの無い次世代素材としてシルクタンパク質が挙げられている。
　シルクはそれ自身有用な特性を多く備えるが、その特性を改変することで、より有用な素材として産業上活用されると期待される。
　例えば、既存のシルク素材を上回る強靭なシルク素材の開発や、デバイスのウェラブル化が進む中で、シルクタンパク質へのデバイス導入等が期待されている。また、生体親和性が高いシルクタンパク質の医療材料や化粧品材料等への応用が期待されている。
　シルクの特性を改変する方法として、カイコの遺伝子組換え技術を用いてシルクタンパク質の特性を改変させる方法が挙げられる。なかでも、タンパク質への非天然アミノ酸導入法は、非天然アミノ酸を構成要素として使用でき、天然にはない特性を有するタンパク質を創出できることから注目される。
　タンパク質への非天然アミノ酸導入法には、二つの方法が知られている。一つは「部位特異的非天然アミノ酸導入法」である。この方法では、非天然アミノ酸の投与、及びターゲットタンパク質遺伝子配列の改変を必要とし、改変した配列のコドンに対応するアンチコドンを有するｔＲＮＡ、及びそのｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化するためのａａＲＳ（アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素）を用いる。しかしながら、この部位特異的非天然アミノ酸導入法では、ターゲットタンパク質遺伝子と目的のａａＲＳ遺伝子の両方を改変させなければならず工程が煩雑である。また、ターゲットタンパク質遺伝子の配列が既知のものでなくてはならないという制限がある。
　一方、二つ目の方法として「残基特異的非天然アミノ酸導入法」が知られている。この方法では、非天然アミノ酸の投与に加え、アミノ酸結合部位に変異を導入した変異型ａａＲＳの強制発現によって非天然アミノ酸の取り込み効率を向上させる。この残基特異的非天然アミノ酸導入法は、ターゲットタンパク質遺伝子の配列を改変させなくとも実施可能なため、部位特異的非天然アミノ酸導入法に比べ利用が簡便であり、ターゲットタンパク質遺伝子の配列が未知であっても利用可能という利点等があるため、利用価値の高い技術である。
　本発明者は、残基特異的非天然アミノ酸導入法を改良し、天然アミノ酸と大きく構造が異なる非天然アミノ酸等のある種の非天然アミノ酸（例えばｐ‐Ｎ３‐Ｐｈｅ）を含有するタンパク質をカイコにおいて製造することに成功した（非特許文献１参照）。
Teramoto et al. Azide-Incorporated Clickable Silk Fibroin Materials with the Ability to Photopattern. ACS Biomater. Sci. Eng., 2016, 2 (2), pp 251-258.
　更に、少量の非天然アミノ酸で、高効率に非天然アミノ酸を含有するタンパク質の製造方法が求められている。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、少量の非天然アミノ酸で、高効率に非天然アミノ酸含有タンパク質を製造できるトランスジェニックカイコ、及び該トランスジェニックカイコを用いた非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法を提供する。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを絹糸腺特異的に発現するトランスジェニックカイコを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、下記の特徴を有するトランスジェニックカイコ、及び該トランスジェニックカイコを用いた非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法を提供するものである。
（１）以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、フェニルアラニン特異的ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び、該ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを有することを特徴とするトランスジェニックカイコ。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４３２位に変異を有するアミノ酸配列、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸番号４３２位以外の部位において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸番号４３２位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（２）前記（ａ）のアミノ酸番号４３２位が、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、スレオニン、システイン、又はチロシンである前記（１）に記載のトランスジェニックカイコ。
（３）以下の（ｄ）～（ｈ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、フェニルアラニン特異的ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び、該ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを有する請求項１又は２に記載のトランスジェニックカイコ。
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号２～配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４３２位以外の部位において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号２～配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４３２位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（４）さらに、前記（ａ）～（ｈ）のアミノ酸番号４０７位に変異を有する前記（１）～（３）のいずれか一つに記載のトランスジェニックカイコ。
（５）前記アミノ酸番号４０７位の変異が、アラニン又はグリシンである前記（４）に記載のトランスジェニックカイコ。
（６）前記ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターは、前記ＤＮＡを後部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターである前記（１）～（５）のいずれか一つに記載のトランスジェニックカイコ。
（７）前記ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターは、フィブロインＬ鎖由来のプロモーターである前記（１）～（６）のいずれか一つに記載のトランスジェニックカイコ。
（８）前記（１）～（７）のいずれか一つに記載のトランスジェニックカイコと、実用系統とを交配してなることを特徴とするＦ１交雑種。
（９）前記（１）～（７）のいずれか一つに記載のトランスジェニックカイコ又は前記（８）に記載のＦ１交雑種に非天然アミノ酸を投与する工程を有することを特徴とする非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法。
（１０）前記非天然アミノ酸は、フェニルアラニン類縁体である前記（９）に記載の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法。
（１１）前記非天然アミノ酸は、下記一般式（１）で表されるアミノ酸である前記（９）又は（１０）に記載の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
［式中、Ｒはハロゲン原子、シアノ基、アジド基、又はエチニル基を表す。］
（１２）前記Ｒはアジド基又はエチニル基である前記（１１）に記載の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法。
　本発明によれば、少量の非天然アミノ酸で、高効率に非天然アミノ酸含有タンパク質を製造できるトランスジェニックカイコ、及び該トランスジェニックカイコを用いた非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法を提供できる。
各変異体の増殖阻害をまとめた表である。 カイコＰｈｅＲＳ（フェニルアラニル－ｔＲＮＡ合成酵素）のαサブユニット遺伝子（ＢｍＦＲＳ１）を後部絹糸腺で発現するトランスジェニックカイコを作出するためのｐｉｇｇｙＢａｃベクターマップである。ＢｍＦＲＳ１に付けたアスタリスク（＊）は変異体遺伝子であることを示す。 一定量のｐ－Ｎ３－Ｐｈｅを投与したカイコの一頭当たりのフィブロイン生産量（棒グラフ）、及びｐ－Ｎ３－Ｐｈｅを投与したカイコが生産したフィブロイン中へのｐ－Ｎ３－Ｐｈｅの取り込み量（質量分析ピークの強度比）（丸プロット）を示す。 一定量のｐ－Ｎ３－Ｐｈｅを投与したカイコの一頭当たりのフィブロイン生産量（棒グラフ）、及びｐ－Ｎ３－Ｐｈｅを投与したカイコが生産したフィブロイン中へのｐ－Ｎ３－Ｐｈｅの取り込み量（質量分析ピークの強度比）（丸プロット）を示す。 異なる量のｐ－Ｎ３－Ｐｈｅを投与したカイコの一頭当たりのフィブロイン生産量（棒グラフ）、及びｐ－Ｎ３－Ｐｈｅを投与したカイコが生産したフィブロイン中へのｐ－Ｎ３－Ｐｈｅの取り込み量（質量分析ピークの強度比）（丸プロット）を示す。 異なる量のｐ－Ｎ３－Ｐｈｅを投与したカイコの一頭当たりのフィブロイン生産量（棒グラフ）、及びｐ－Ｎ３－Ｐｈｅを投与したカイコが生産したフィブロイン中へのｐ－Ｎ３－Ｐｈｅの取り込み量（質量分析ピークの強度比）（丸プロット）を示す。 異なる量のｐ－Ｎ３－Ｐｈｅを投与したカイコの一頭当たりのフィブロイン生産量（棒グラフ）、及びｐ－Ｎ３－Ｐｈｅを投与したカイコが生産したフィブロイン中へのｐ－Ｎ３－Ｐｈｅの取り込み量（質量分析ピークの強度比）（丸プロット）を示す。
《トランスジェニックカイコ》
　本発明のトランスジェニックカイコは、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、フェニルアラニン特異的ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び、該ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを有することを特徴とするトランスジェニックカイコである。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４３２位に変異を有するアミノ酸配列、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸番号４３２位以外の部位において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸番号４３２位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
　ｔＲＮＡのアミノアシル化は、それぞれのアミノ酸に対応するアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）によって触媒される。ａａＲＳはタンパク質を構成する２０種のアミノ酸間で厳密な基質特異性を有している。例えば、フェニルアラニンに対応するａａＲＳは、フェニルアラニル－ｔＲＮＡ合成酵素（ＰｈｅＲＳ）と呼ばれる。前記（ａ）～（ｃ）のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、カイコＰｈｅＲＳのαサブユニットに変異を有するＤＮＡであって、フェニルアラニン特異的ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
　このフェニルアラニン特異的ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質は、該活性を有していればよいのであって、前記（ａ）～（ｃ）のいずれかの配列に加えて、タンパク質タグ等の任意の配列（例えば、ヒスチジンタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰ等）をさらに有していてもよい。
　前記（ａ）～（ｃ）のいずれかの配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡを絹糸腺で発現させることで、絹糸腺で作られるタンパク質に対し本来のコドンとは通常は対応しないアミノ酸（非天然アミノ酸）を導入することが可能である。更に、絹糸腺で作られるタンパク質に対し、少量の該非天然アミノ酸で、高効率に該非天然アミノ酸を導入することができる。
　実施例において後述するように、本発明のトランスジェニックカイコは、前記（ａ）のアミノ酸番号４３２位が、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、スレオニン、システイン、又はチロシンであることが好ましく、アラニン、バリン、メチオニンがより好ましい。
　即ち、本発明のトランスジェニックカイコは、以下の（ｄ）～（ｈ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、フェニルアラニン特異的ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び、該ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを有することが好ましい。
（ｄ）配列番号２（Ｐｈｅ４３２Ｖａｌ）に示されるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号３（Ｐｈｅ４３２Ａｌａ）に示されるアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号４（Ｐｈｅ４３２Ｍｅｔ）に示されるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号２～配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４３２位以外の部位において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号２～配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４３２位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
　ここで、欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸の数としては、１～５０個が好ましく、１～２０個がより好ましく、１～１０個が更に好ましく、１～５個が特に好ましく、１～２個が最も好ましい。
　同一性としては、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が更に好ましく、９９％以上が特に好ましい。
　更に、本発明のトランスジェニックカイコは、アミノ酸番号４３２位の変異に加えて、アミノ酸番号４０７位に変異を有していてもよい。アミノ酸番号４０７位における変異としては、アラニン又はグリシンが好ましい。
　前記絹糸腺で作られる非天然アミノ酸含有タンパク質は特に制限されることはなく、カイコが絹糸腺において生産するシルクタンパク質が好ましい。また、絹糸腺において任意のタンパク質をコードする外来性のＤＮＡを強制発現させ、任意のタンパク質を絹糸腺に生産させてもよい。
　絹糸腺で作られるタンパク質は繭糸としてカイコ体外に分泌されるため、特別の回収方法を用いずとも回収が容易であり、また多量のタンパク質を容易に得ることができる。
　また、前記ＤＮＡをトランスジェニックカイコ全体に発現させることによって生じる毒性を回避するという観点から、本発明においては、絹糸腺において前記ＤＮＡを発現させるプロモーターが用いられる。絹糸腺は、前部絹糸腺、中部絹糸腺及び後部絹糸腺に大別される。ここで前記ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターとしては、前記ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させることができるプロモーターであれば特に制限されず、上記三つの部位のいずれか一つ又は二つ以上の組み合わせからなる部位で発現させることができるプロモーターであってもよい。
　中部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターとして、例えば、セリシン１タンパク質またはセリシン２タンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターが挙げられる。中部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを用いることにより、中部絹糸腺で生産されるタンパク質に非天然アミノ酸を導入することができる。カイコの中部絹糸腺で生産されるタンパク質としてはセリシンが挙げられる。
　また、後部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターとしてはフィブロインＬ鎖（ＦｉｂＬ）タンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターが挙げられる。後部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを用いることにより、後部絹糸腺で生産されるタンパク質に非天然アミノ酸を導入することができる。カイコの後部絹糸腺で生産されるタンパク質はフィブロインであり、フィブロインがカイコの繭糸タンパク質の大部分を占めているため、後部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを用いることで、シルクタンパク質の性質の制御がより容易となる。
　前記プロモーターを用いる際には、同時に、前記ＤＮＡの発現、その後のタンパク質への翻訳等を制御するための他の配列を用いてもよく、そのような配列としては例えば３’ＵＴＲ（非翻訳領域）、５’ＵＴＲ配列等が挙げられる。
　本発明のトランスジェニックカイコの作出に用いるホストのカイコとしては、後述する本発明の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法において、非天然アミノ酸を含むタンパク質を製造できるカイコであれば特に制限されず、例えば、遺伝子組換え作成用として広く用いられるｗ１－ｐｎｄ等の系統を用いても構わないが、飼料として投与された非天然アミノ酸のカイコ個体への取り込み量を増加させるという観点から、人工飼料摂食性に優れたカイコを用いることが好ましい。例えば、日０１号、日５０９号、日５１０号、日６０３号、日６０４号、中６０４号、中６０５号等の品種が好ましく、非天然アミノ酸を含む人工飼料の１個体あたりの摂食量が多い白／ＣＳ（系統名：ＭＣＳ６０１）がより好ましい。
　また、本発明のトランスジェニックカイコを実用系統と交配したＦ１交雑種を作出してもよい。実用系統としては、日５０９号×日５１０号、日６０３号×日６０４号、中５０９号×中５１０号、中６０４号×中６０５号等が挙げられる。
　また、本発明のトランスジェニックカイコの作出に用いるカイコとしては、前述のとおり特に制限されず、非休眠卵を産下する性質のカイコまたは休眠卵を産下する性質のカイコの、どちらも用いることが可能である。休眠卵を産下する性質のカイコを用いる場合には、「低温暗催青法」を用いて非休眠卵を産下させることができる。すなわち、胚子を胸肢発生期以後、特に剛毛発生期以後を１５℃程度に保護する。この低温期間は、日数にして１０日以上必要である。胚の反転から頭部着色の頃までを暗黒に保つ。その後孵化した幼虫を飼育して得たカイコ蛾は非休眠卵を産下する。（蚕種総論　著者：高見丈夫　発行：全国蚕種協会　（昭和４４年５月３１日））。
　低温暗催青法以外の方法として、幼虫期の光条件をコントロールすることで非休眠卵を産下させる方法（特開２００３－８８２７４参照）を採択してもよい。
　低温暗催青法等の方法を用いても非休眠卵が得られないカイコを使用する場合は、カイコ卵を浸酸処理することで、卵を休眠打破してもよい。前記浸酸処理の具体的な方法として、採卵から３～４時間後のカイコ卵を室温で３０分間程度塩酸に浸漬させ、水洗により塩酸を洗い流した後、卵を風乾させることが挙げられる。前記塩酸は、例えば比重１．１１のものを用いることができる（Ａｉ－Ｃｈｕｎ Ｚｈａｏ ｅｔ.ａｌ．， Ｉｎｓｅｃｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１２） Ｖｏｌ．１９， ｐｐ．１７２-１８２．参照）。
　トランスジェニックカイコの作出方法としては、例えばカイコ卵へＤＮＡを導入する方法が挙げられる。カイコ卵へのＤＮＡの導入は、例えば、カイコの発生初期卵へ、トランスポゾンをベクターとして注射する方法（Ｔａｍｕｒａ，Ｔ. ,ｅｔ．ａｌ.,Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,（２０００）Ｖｏｌ．１８, ｐｐ.８１－８４.参照）に従って行うことができる。
　例えば、トランスポゾンの逆位末端反復配列（Ｈａｎｄｌｅｒ，Ａ.Ｍ.,ｅｔ．ａｌ., Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．,（１９９８）Ｖｏｌ．９５, ｐｐ.７５２０－７５２５.参照。）の間に上記ＤＮＡを挿入したベクターとともに、トランスポゾン転移酵素をコードするＤＮＡを有するベクター（ヘルパーベクター）をカイコ卵に導入する方法が挙げられる。ヘルパーベクターとしては、ｐＨＡ３ＰＩＧ （Ｔａｍｕｒａ, Ｔ., ｅｔ．ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,（２０００）Ｖｏｌ．１８, ｐｐ.８１－８４.参照。）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
　本発明におけるトランスポゾンとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃが好ましいが、これに限定されるものではなく、マリナー（ｍａｒｉｎｅｒ）、ミノス（ｍｉｎｏｓ）等を用いることもできる（Ｓｈｉｍｉｚｕ,Ｋ．，Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（２０００）Ｖｏｌ．９，ｐｐ.２７７－２８１.参照。）。
　また、本発明のトランスジェニックカイコの作出にはバキュロウイルスベクターを使用することもできる（Ｙａｍａｏ，Ｍ．,ｅｔ．ａｌ., Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（１９９９）Ｖｏｌ．１３，ｐｐ.５１１－５１６.参照。）。
　上述したトランスポゾンをベクターとして注射する方法、バキュロウイルスベクターを使用する方法、及びその他のカイコ卵へのＤＮＡの導入方法は前記アミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡに対して用いてもよく、また、本発明のトランスジェニックカイコを用いた非天然アミノ酸含有タンパク質の製造において、製造される任意のタンパク質をコードするＤＮＡに対して用いてもよい。
　カイコ卵へのＤＮＡの導入は、当業者においては一般的な方法により実施することができる。例えば、以下のように、特開２０１２－１８７１２３号公報に記載の方法で実施することができる。
　カイコ卵へＤＮＡ注入用の管を使用して直接卵内へＤＮＡを導入することが可能であるが、好ましい態様としては、前もって物理的または化学的に卵殻に穴を空け、該穴からＤＮＡを導入する。
　本発明において、物理的に卵殻に穴を空ける方法としては、例えば針、微小レーザー等を用いて穴を空ける方法が挙げられる。中でも、針を用いた方法によって卵殻に穴を空ける方法が好ましい。用いられる針としては、カイコの卵殻に穴を空けることができるものであれば、その材質、強度等は、特に制限されない。一方、化学的に卵殻に穴を空ける方法としては、例えば薬品（次亜塩素酸等）等を用いて穴を空ける方法が挙げられる。
　本発明において、ＤＮＡ導入方法としては、上記のカイコ卵に物理的または化学的に穴を空け、ＤＮＡ注入用の管を該穴から卵内に挿入し、ＤＮＡを注入する工程を、針とＤＮＡ注入用の管が一体型となったマニュピュレーターを使用して行うことが好ましい。マニュピュレーターを構成要素の１つとする装置を使用できる。
　このような装置しては、解剖顕微鏡、照明装置、可動式のステージ、顕微鏡に金具で固定した粗動マニュピュレーター、このマニュピュレーターに付けたマイクロマニュピュレーター、ＤＮＡを注射するための空気圧を調整するインジェクターから構成されるものが挙げられる。なお、使用される装置としては、特許第１６５４０５０号公報に記載の装置または該装置を改良した装置が挙げられる。
　カイコ卵にＤＮＡが導入されたか否かは、例えば、注射したＤＮＡを卵から再度抽出して測定する方法（Ｎａｇａｒａｊｕ，Ｊ., ｅｔ．ａｌ., Ａｐｐｌ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．Ｚｏｏｌ.,（１９９６）Ｖｏｌ．３１,ｐｐ.５８９－５９８.参照。）や、注射した遺伝子としてのＤＮＡの卵内での発現を見る方法（Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．，ｅｔ．ａｌ.,（１９９０）Ｊｐｎ． Ｊ． Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．６５，ｐｐ.４０１－４１０.参照。）等によって確認することができる。カイコ卵に導入されたＤＮＡが、カイコの染色体に組込まれ、遺伝子組換えカイコが得られたか否かは、たとえばＤＮＡを注射した卵から育った成虫を交配し（相互に、あるいは非組換えカイコと）受精卵を得、その産卵後６～１０日にマーカー遺伝子（たとえば、ＥＧＦＰや、ＤｓＲｅｄ，ＣＦＰ，ＹＦＰなど）の発現を蛍光顕微鏡で観察することや、体色マーカー遺伝子（たとえば、Ｂｍ－ａａＮＡＴなど）の発現を目視で確認することによって可能である。
　カイコ卵に導入したＤＮＡがカイコにおいて発現しているかどうかは、インジェクションした卵（Ｇ０世代）から成長した個体が産んだ卵（Ｇ１世代）については、マーカー遺伝子の発現を蛍光顕微鏡で観察して確認する。なお、カイコからトータルＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡをテンプレートに、ＲＴ－ＰＣＲにより導入遺伝子の確認をしてもよい。
　また、カイコに導入したＤＮＡがカイコ個体のどの部位で発現しているのかを確認する方法は、例えば、幼虫から組織を摘出し、各組織別に発現を確認する方法や、ＣＦＰ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲＥＤ等の既知のレポーター遺伝子等を用い、蛍光顕微鏡を用いてカイコ個体を観察する方法等によって確認することができる。
《非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法》
　本発明の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法は、本発明のトランスジェニックカイコに非天然アミノ酸を投与する工程を有する。ここで非天然アミノ酸とは、タンパク質を構成しないアミノ酸を意味する。タンパク質を構成するアミノ酸とは、２０種の標準天然アミノ酸、セレノシステイン、及びピロリジンを意味する。すなわち、本発明において、非天然アミノ酸とは、タンパク質を構成するこれらアミノ酸の類縁体（修飾アミノ酸）、又はタンパク質を構成するこれらアミノ酸以外の任意のアミノ酸を意味する。
　本発明のトランスジェニックカイコはフェニルアラニン特異的ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有する。そのため、用いられる非天然アミノ酸はフェニルアラニン類縁体であることが好ましい。フェニルアラニン類縁体としては、フェニルアラニンの側鎖の少なくとも一つ以上の水素原子が置換基によって置換されていることが好ましく、フェニルアラニン側鎖のベンゼン環の水素原子が置換されていることがより好ましく、前記ベンゼン環のパラ位が置換されていることが特に好ましい。前記置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子；エチニル基；シアノ基；アジド基等の置換が挙げられる。
　即ち、フェニルアラニン類縁体としては、下記一般式（１）で表されるアミノ酸が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
［式中、Ｒはハロゲン原子、アジド基、又はエチニル基を表す。］
　中でも、前記Ｒはアジド基又はエチニル基が好ましい。
　本発明のトランスジェニックカイコを用いた非天然アミノ酸含有タンパク質の製造にあたって、タンパク質に含有される非天然アミノ酸の種類及び含有量を確認する方法としては、種々の方法を選択できるが、質量分析法による分析を行うのが好ましく、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ法により質量スペクトルを測定する方法が特に好ましい。
　本発明によれば、製造される非天然アミノ酸含有タンパク質に、本来のタンパク質の性質や機能を向上又は改変させることができる。更には、本来のタンパク質にない新たな性質や機能を付与することができる。例えば、非天然アミノ酸の導入手法をシルクタンパク質に適用することで、シルクタンパク質に非天然アミノ酸を含有させ、本来のシルクにはない性質や機能を付与することができる。
　本発明の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法を用いることで、従来の改変手法における問題点を解決できる。例えば、化学反応にともなう毒性の懸念が小さい、「後加工」であるため機能性分子が失活しないなどの利点があり、特異的な化学反応が可能な官能基の導入により、従来の「化学的方法」によらない精密かつクリーンなタンパク質の化学改変を行うことが可能である。例えば、アジド基又はエチニル基を有する非天然アミノ酸をシルクタンパク質にとりこませることで、エチニル基又はアジド基との反応を介して、任意のタンパク質、ペプチド、薬剤、色素、糖鎖、架橋分子、キレート分子等の分子をシルクに結合させることが可能である。このような改変により、シルクの物性そのものを変化させることが可能である。従って、カイコが絹糸腺において生産するタンパク質の有用性を飛躍的に増大させる。また、シアノ基やフッ素など特徴的な赤外吸収や核磁気共鳴を示す原子（団）を残基特異的に導入することで、これまで不可能であった局所的なシルクの構造情報が得られる。
　前記シルク材料の形態は特に制限されず、例えば、溶液状、パウダー状、繊維状、スポンジ状、フィルム状、ブロック状などの形態が挙げられる。
　本発明で用いる非天然アミノ酸は、天然アミノ酸と同時に用いることができ、用いる非天然アミノ酸は１種類のみでもよく、２種類以上の非天然アミノ酸を同時に用いることもできる。
　本発明におけるカイコの飼育方法は、当業者において一般的なカイコの飼育方法に従い、非天然アミノ酸を含有する飼料を与え、行うことができる。例えば、「文部省（１９７８） 蚕種製造.ｐｐ１９３、実教出版社、東京」に記載の方法に従って飼育を行うことができる。
　また、光によって化学反応が引き起こされる官能基を有する非天然アミノ酸をカイコに給餌する場合、非天然アミノ酸に光が照射されない条件下で、カイコを飼育することが好ましい。好ましい飼育方法として、光を一切照射しない連続暗期環境下でカイコを飼育する方法が挙げられる。または、カイコには光が照射されていてもよいが、前記の光によって化学反応が引き起こされる官能基を有する非天然アミノ酸には光が照射されない条件下で、カイコを飼育する方法が挙げられ、例えば、給餌する餌の周囲の空間を物理的に光源から遮蔽し、該非天然アミノ酸をカイコに与え、さらに、カイコが絹糸腺から該非天然アミノ酸を含有するタンパク質を生産する際に、該タンパク質に光が照射されない環境でカイコを飼育する等の方法が挙げられる。
　本発明のトランスジェニックカイコを用いたタンパク質製造方法は、残基特異的非天然アミノ酸導入法である。したがって、本発明によれば該カイコに投与する非天然アミノ酸の種類を変えるだけで、同一の系統のトランスジェニックカイコから任意の種類の非天然アミノ酸を含有するタンパク質を製造することができる。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［変異型カイコＰｈｅＲＳの作製］
　ｐ－Ｎ３－Ｐｈｅの認識に優れる変異型カイコＰｈｅＲＳを作製するため、ヒトＰｈｅＲＳの立体構造解析（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ: ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｋｉｎｇｄｏｍ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ｔＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ. Ｆｉｎａｒｏｖ Ｉ, Ｍｏｏｒ Ｎ, Ｋｅｓｓｌｅｒ Ｎ, Ｋｌｉｐｃａｎ Ｌ, Ｓａｆｒｏ ＭＧ. Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ. ２０１０ Ｍａｒ １０;１８（３）:３４３－５３.）の情報から、Ａｓｎ４０４→Ａｌａ、Ｐｒｏ４０５→Ｇｌｙ、Ｔｙｒ４０６→Ａｌａ、Ｇｌｕ４０８→Ａｌａ、Ｐｈｅ４３２→Ａｌａの５つの変異体を作製し、これらの変異体がＰｈｅＲＳとしての活性を有しているか調べたところ、全てＰｈｅＲＳとしての活性を有していることが認められた。
　これらの変異型カイコＰｈｅＲＳ、又はＴｈｒ４０７Ｇｌｙ、若しくはＴｈｒ４０７Ａｌａの変異型カイコＰｈｅＲＳと、酵母ｔＲＮＡＰｈｅと、を共発現する大腸菌を、ｐ－Ｎ３－Ｐｈｅを含む培地で培養した。大腸菌に増殖阻害が認められれば、ｐ－Ｎ３－Ｐｈｅがタンパク質合成に取り込まれたものと判断できる。作製した変異体の中で、Ｔｈｒ４０７Ｇｌｙ、Ｔｈｒ４０７Ａｌａ、Ｐｈｅ４３２Ａｌａで顕著な増殖阻害が認められた。　更に、Ｐｈｅ４３２Ｘ（Ｘ＝２０種類のアミノ酸）、とＴｈｒ４０７Ｘ’（Ｘ’＝Ｔｈｒ,Ｇｌｙ,Ａｌａ）組み合わせた変異体を作製し、各変異体の増殖阻害を検討した。結果を図１に示す。図１中、色が濃いほど強い増殖阻害が認められたことを示す。
　図１に示すように、Ｐｈｅ４３２Ｖａｌ, Ｐｈｅ４３２Ａｌａ, Ｔｈｒ４０７Ａｌａ／Ｐｈｅ４３２Ｖａｌ, Ｔｈｒ４０７Ａｌａ／Ｐｈｅ４３２Ｍｅｔの４つがｐ－Ｎ３－Ｐｈｅの認識に優れていることが確認された。
［組み換えベクターの作製］
　当業者の常識の範囲である既存の手法に準じ、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（配列番号７）を用いて、配列番号２（Ｐｈｅ４３２Ｖａｌ）、配列番号３（Ｐｈｅ４３２Ａｌａ）、配列番号５（Ｔｈｒ４０７Ａｌａ／Ｐｈｅ４３２Ｖａｌ）、及び配列番号６（Ｔｈｒ４０７Ａｌａ／Ｐｈｅ４３２Ｍｅｔ）に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（ＢｍＦＲＳ１＊；（配列番号８：配列番号２（Ｐｈｅ４３２Ｖａｌ）に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、配列番号９：配列番号３（Ｐｈｅ４３２Ａｌａ）に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、配列番号１０：配列番号５（Ｔｈｒ４０７Ａｌａ／Ｐｈｅ４３２Ｖａｌ）、配列番号１１：配列番号６（Ｔｈｒ４０７Ａｌａ／Ｐｈｅ４３２Ｍｅｔ）に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ））を有するｐｉｇｇｙＢａｃベクター（５塩基の５’ＵＴＲ配列を含む）（図２）をそれぞれ作製した。なお、上記ベクターにはフィブロインＬ鎖（ＦｉｂＬ）由来のプロモーターおよび３’ＵＴＲ配列をそれぞれ、上記ＢｍＦＲＳ１＊の５’および３’側に付加した。ＦｉｂＬ由来のプロモーター配列を付加することにより、目的遺伝子を後部絹糸腺で特異的に発現させることが可能である。これにより、変異型遺伝子が幼虫の全身で発現することで生じると想定される幼虫の発育不全を回避することができた。
［トランスジェニックカイコの作出と組換え遺伝子の発現確認］
　受精卵へのｐｉｇｇｙＢａｃベクターのインジェクションおよびその後の組換え体のスクリーニング等は、当業者の常識の範囲である既存の方法に準じて行った。なお、白／ＣＳ（系統名：ＭＣＳ６０１）は休眠卵を産下し、前述の低温暗催青法による非休眠化ができない系統であるため、前述の浸酸処理によって卵の休眠打破を行った。ゲノム中に挿入された変異型遺伝子のコピー数を、リアルタイムＰＣＲ法を用いて解析し、変異型遺伝子をホモで有するトランスジェニックカイコの系統を確立した。これらのトランスジェニックカイコの系統を、それぞれＨ０６（Ｐｈｅ４３２Ｖａｌ）、Ｈ０７（Ｐｈｅ４３２Ａｌａ）、Ｈ０８（Ｔｈｒ４０７Ａｌａ／Ｐｈｅ４３２Ｖａｌ）、Ｈ０９（Ｔｈｒ４０７Ａｌａ／Ｐｈｅ４３２Ｍｅｔ）と名付けた。
［ｐ－Ｎ３－Ｐｈｅ含有シルクタンパク質の製造］
（実験例１）
　上記トランスジェニックカイコＨ０６～Ｈ０９を、５齢起蚕から２日目まで通常組成の人工飼料を給餌した後、３日目以降、０．１％（ｄｒｙ　ｄｉｅｔ換算）のｐ－Ｎ３－Ｐｈｅ（一般式（１）で表されるアミノ酸において、Ｒ＝Ｎ３）を含む人工飼料を給餌した。３日目以降のカイコの飼育は、ｐ－Ｎ３－Ｐｈｅの光反応を避けるため、遮光条件下にて行った。対照として、Ｈ０３（Ｔｈｒ４０７Ａｌａ）を用いた。カイコの一頭当たりのフィブロイン生産量とｐ－Ｎ３－Ｐｈｅの取り込み量（質量分析ピークの強度比）を図３～４に示す。
　図３～４において、縦軸（左）は、棒グラフで表されたカイコの一頭当たりのフィブロイン生産量を示し、縦軸（右）は、丸プロットで表されたフィブロイン中のｐ－Ｎ３－Ｐｈｅのピーク強度の割合を示す。
　フィブロイン中のｐ－Ｎ３－Ｐｈｅのピーク強度は、以下の方法で算出した。
　トランスジェニックカイコの繭層を約５０ ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ ＬｉＢｒ水溶液に３５℃で４０分間加熱して溶解させた。この溶解液を８Ｍ 尿素水溶液に約４．５ ｍｇ／ｍＬ
の濃度になるように希釈し、さらに還元剤を含むサンプルバッファーと混合して約３ ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した後、室温で３０分以上静置して還元処理を行った。還元処理した試料液をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＦｉｂＬのバンドを切り出して脱色・洗浄・乾燥処理した後、トリプシンにより３７℃で一晩ゲル内消化した。生じたペプチド断片を抽出して乾燥固化した後、０．１％ＴＦＡ水溶液とアセトニトリルの２：１混合液に溶解した。この溶解液をＨＣＣＡで飽和させた０．１％ＴＦＡ水溶液とアセトニトリルの２：１混合液と混合し、ＭＡＬＤＩターゲットプレート上に滴下して乾燥させ、測定データを取得した。
　ｐ－Ｎ３－Ｐｈｅを投与したトランスジェニックカイコにおいて、Ｐｈｅからｐ－ＮＨ２－Ｐｈｅへの置換にともなう質量増加（理論値：１４Ｎ１Ｈ１Ｈ-１Ｈ ＝ ＋１５．０１ Ｄａ）が観察される。Ｎ３基はＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル調製時の還元処理及び／あるいはＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ測定中にＮＨ２基へ還元されたと考えられる。係る測定データからＰｈｅ含有ペプチド断片に対するｐ－Ｎ３－Ｐｈｅ含有ペプチド断片の相対的ピーク強度を求めた。
　図４に示されるように、０．１％のｐ－Ｎ３－Ｐｈｅを含む人工飼料を与えたＨ０９におけるフィブロインの生産量は、Ｈ０３におけるフィブロインの生産量と同等であった。　更に、図３～４に示されるように、カイコが生産したフィブロイン中のｐ－Ｎ３－Ｐｈｅの取り込み量は、Ｈ０６～Ｈ０９がＨ０３に対して優位に多かった。
（実験例２）
　トランスジェニックカイコＨ０６、Ｈ０７において、給餌する人工飼料中のｐ－Ｎ３－Ｐｈの含有割合を変えたときのカイコの単位量当たりのフィブロイン生産量、及びｐ－Ｎ３－Ｐｈｅの取り込み量を確認した。結果を図５～６に示す。図５～６において、横軸は、人工飼料中のｐ－Ｎ３－Ｐｈｅの含有割合（ｄｒｙ　ｄｉｅｔ換算）を示し、縦軸（左）は、棒グラフで表されたカイコの単位量当たりのフィブロイン生産量を示し、縦軸（右）は、丸プロットで表されたフィブロイン中のｐ－Ｎ３－Ｐｈｅのピーク強度の割合を示す。
　図５において、Ｈ０６では、合成飼料中に０．０５％のｐ－Ｎ３－Ｐｈｅを含有することで、ｐ－Ｎ３－Ｐｈｅを導入したフィブロインを約１００ｍｇ産生することができ、取り込まれたｐ－Ｎ３－Ｐｈｅのピーク強度の割合が約０．１５であった。非特許文献１におけるＨ０３の結果と比較すると、Ｈ０６は、必要なｐ－Ｎ３－Ｐｈｅの含有割合が、Ｈ０３の１／１０で済み、かつ、ｐ－Ｎ３－Ｐｈｅの導入効率が、Ｈ０３の３倍であった。
　同様に、図６において、Ｈ０７では、合成飼料中に０．０５％のｐ－Ｎ３－Ｐｈｅを含有することで、フィブロイン生産量は約８０ｍｇに減少したが、取り込まれたｐ－Ｎ３－Ｐｈｅのシグナル強度の割合が約０．１６であった。
（実験例３）
トランスジェニックカイコＨ０６を一般品種日５０９×日５１０と交配し、その交雑種Ｈ０６×（日５０９×日５１０）を得た。Ｈ０６×（日５０９×日５１０）の雄幼虫および雌幼虫それぞれに対し、５齢起蚕から２日目まで通常組成の人工飼料を給餌した後、３日目以降、異なるｐ－Ｎ３－Ｐｈｅ含有割合の人工飼料を給餌した。それぞれの条件について、カイコの単位量当たりのフィブロイン生産量、及びｐ－Ｎ３－Ｐｈｅの取り込み量を確認した。結果を図７に示す。図７において、横軸は、人工飼料中のｐ－Ｎ３－Ｐｈｅの含有割合（ｄｒｙ　ｄｉｅｔ換算）を示し、縦軸（左）は、棒グラフで表されたカイコの単位量当たりのフィブロイン生産量を示し、縦軸（右）は、丸プロットで表されたフィブロイン中のｐ－Ｎ３－Ｐｈｅのピーク強度の割合を示す。
　図７に示されるように、０．０５％のｐ－Ｎ３－Ｐｈｅを含む人工飼料を与えたＨ０６×（日５０９×日５１０）におけるフィブロイン生産量は雄幼虫で約１７０ｍｇ、雌幼虫で約１６０ｍｇと、Ｈ０６におけるフィブロイン生産量の約１．６～１．７倍であった。一方で、フィブロイン中のｐ－Ｎ３－Ｐｈｅの取り込み量は雄幼虫で約０．１４、雌幼虫で約０．１６と、Ｈ０６と同等であり、交雑による取り込み量の減少は見られなかった。
　上記の実験結果から、本発明に示すトランスジェニック系統を一般品種と交雑することによって、ｐ－Ｎ３－Ｐｈｅの取り込み量を減少させることなくフィブロイン生産量を向上させられることが示された。
　以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
　本発明のトランスジェニックカイコを用いて製造された非天然アミノ酸含有タンパク質、例えば非天然アミノ酸含有シルクタンパク質は、テキスタイル・医療分野・機能性材料等の分野に広く適用可能であり、それぞれの用途により適した改変シルクを提供できる可能性を有している。また、本発明によって新たなシルクの用途を開拓できる可能性がある。

Claims (12)

  1. 　以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、フェニルアラニン特異的ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び、該ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを有することを特徴とするトランスジェニックカイコ。
    （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４３２位に変異を有するアミノ酸配列、
    （ｂ）前記（ａ）のアミノ酸番号４３２位以外の部位において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
    （ｃ）前記（ａ）のアミノ酸番号４３２位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
  2. 　前記（ａ）のアミノ酸番号４３２位が、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、スレオニン、システイン、又はチロシンである請求項１に記載のトランスジェニックカイコ。
  3. 以下の（ｄ）～（ｈ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、フェニルアラニン特異的ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び、該ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを有する請求項１又は２に記載のトランスジェニックカイコ。
    （ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、
    （ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列、
    （ｆ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、及び、
    （ｇ）配列番号２～配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４３２位以外の部位において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
    （ｈ）配列番号２～配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４３２位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
  4. 　さらに、前記（ａ）～（ｈ）のアミノ酸番号４０７位に変異を有する請求項１～３のいずれか一項に記載のトランスジェニックカイコ。
  5. 　前記アミノ酸番号４０７位の変異が、アラニン又はグリシンである請求項４に記載のトランスジェニックカイコ。
  6. 　前記ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターは、前記ＤＮＡを後部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターである請求項１～５のいずれか一項に記載のトランスジェニックカイコ。
  7. 　前記ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターは、フィブロインＬ鎖由来のプロモーターである請求項１～６のいずれか一項に記載のトランスジェニックカイコ。
  8. 　請求項１～７のいずれか一項に記載のトランスジェニックカイコと、実用系統とを交配してなることを特徴とするＦ１交雑種。
  9. 　請求項１～７のいずれか一項に記載のトランスジェニックカイコ又は請求項８に記載のＦ１交雑種に非天然アミノ酸を投与する工程を有することを特徴とする非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法。
  10. 　前記非天然アミノ酸は、フェニルアラニン類縁体である請求項９に記載の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法。
  11. 　前記非天然アミノ酸は、下記一般式（１）で表されるアミノ酸である請求項９又は１０に記載の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ｒはハロゲン原子、アジド基、又はエチニル基を表す。］
  12. 　前記Ｒはアジド基又はエチニル基である請求項１１に記載の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020111157A1 (ja) * 2018-11-29 2020-06-04 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 導電材料及びその製造方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015015927A (ja) * 2013-07-11 2015-01-29 独立行政法人農業生物資源研究所 トランスジェニックカイコ、および該カイコを用いた非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015015927A (ja) * 2013-07-11 2015-01-29 独立行政法人農業生物資源研究所 トランスジェニックカイコ、および該カイコを用いた非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FINAROV I. ET AL.: "Structure of Human Cytosolic Phenylalanyl-tRNA Synthetase: Evidence for Kingdom-Specific Design of the Active Sites and tRNA Binding Patterns", STRUCTURE, vol. 18, no. 3, 10 March 2010 (2010-03-10), pages 343 - 353, XP026941379, Retrieved from the Internet <URL:doi:10.1016/j.str.2010.01.002> *
KIRSHENBAUM K. ET AL.: "Biosynthesis of Proteins Incorporating a Versatile Set of Phenylalanine Analogues", CHEMBIOCHEM, vol. 3, no. 2-3, 7 March 2002 (2002-03-07), pages 235 - 237, XP055559440, Retrieved from the Internet <URL:https://doi.org/10.1002/1439-7633(20020301)3:2/3<235::AID-CBIC235>3.0.CO;2-7> *
KWON L ET AL.: "Design of a Bacterial Host for Site-Specific Incorporation of p- Bromophenylalanine into Recombinant Proteins", J AM CHEM SOC, vol. 128, no. 36, 13 September 2006 (2006-09-13), pages 11778 - 11783, XP055559436, Retrieved from the Internet <URL:DOI:10.1021/ja0626281> *
TERAMOTO H. ET AL.: "Azide-Incorporated Clickable Silk Fibroin Materials with the Ability to Photopattern", ACS BIOMATER SCI ENG, vol. 2, no. 2, 11 January 2016 (2016-01-11), pages 251 - 258, XP055559433, Retrieved from the Internet <URL:DOI:10.1021/acsbiomaterials.5b00469> *
TERAMOTO H. ET AL.: "Cloning of Bombyx mori phenylalanyl-tRNA synthetase and the generation of its mutant with relaxed amino acid specificity", J. INSECT BIOTECHNOL. SERICOL., vol. 79, no. 2, 2010, pages 2-53 - 2-65, XP055559426, Retrieved from the Internet <URL:https://doi.org/10.11416/jibs.79.2_053> *
TERAMOTO H. ET AL.: "Production of Bombyx mori Silk Fibroin Incorporated with Unnatural Amino Acids", BIOMACROMOLECULES, vol. 15, no. 7, 2 June 2014 (2014-06-02), pages 2682 - 2690, XP055226031, Retrieved from the Internet <URL:DOI:10.1021/bm5005349> *
TERAMOTO H. ET AL.: "Residue-specific incorporation of phenylalanine analogues into protein biosynthesis in silkworm cultured cells", J INSECT BIOTECHNOL SERICOL, vol. 82, no. 3, 2013, pages 3-61 - 3-69, XP055559429, Retrieved from the Internet <URL:https://doi.org/10.11416/jibs.82.3_061> *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020111157A1 (ja) * 2018-11-29 2020-06-04 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 導電材料及びその製造方法
JPWO2020111157A1 (ja) * 2018-11-29 2021-11-25 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 導電材料及びその製造方法
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