WO2018110042A1 - 脂肪蓄積抑制剤及びこれを含有する飲食品 - Google Patents

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紀道 折方
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日清食品ホールディングス株式会社
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    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents

Definitions

  • the present invention relates to a fat accumulation inhibitor. More specifically, the present invention relates to a fat accumulation inhibitor comprising an extract of red-skinned bark as an active ingredient.
  • lifestyle-related diseases caused by lifestyle habits such as eating habits, exercise habits, smoking and drinking have become a problem in Japan.
  • lifestyle-related diseases that develop due to dietary habits include diabetes, obesity, hyperlipidemia, hypertension, colon cancer, and periodontal disease.
  • lifestyle-related diseases such as diabetes, obesity, hyperlipidemia, and hypertension are closely related to the onset of arteriosclerosis that causes cerebral infarction and myocardial infarction in addition to the large number of patients. Has attracted particular attention.
  • Obesity includes visceral fat-type obesity (visceral fat accumulation) where fat accumulates in the stomach, but it has been found that visceral fat accumulation tends to cause diabetes, hyperlipidemia, and hypertension. Moreover, it has been found that the risk of advancing arteriosclerosis increases as these overlap and the number increases. Therefore, the condition where two or more of hyperglycemia, hypertension, and dyslipidemia overlap with visceral fat obesity is defined as metabolic syndrome, and early detection of metabolic syndrome and appropriate guidance can help prevent lifestyle-related diseases. Prevention and improvement are being addressed.
  • the present invention has been made in view of the above problems. That is, the present invention provides a highly safe fat accumulation inhibitor that can effectively perform fat accumulation suppression and / or fat accumulation reduction (inhibition of adipocyte hypertrophy and differentiation). Objective.
  • the present inventors investigated fat accumulation suppression and / or fat accumulation reduction effect (hereinafter simply referred to as “fat accumulation suppression effect”) for known foods. Further, the present invention has been completed by newly discovering that an extract obtained by extracting red mulberry bark, which is already known to have a gastric ulcer inhibitory effect, with water, an organic solvent, or a combination thereof, has an effect of inhibiting fat accumulation. It was.
  • the present invention provides a fat accumulation inhibitor comprising a solvent extract of Akamegawashi bark as an active ingredient.
  • the extraction solvent is preferably water, an organic solvent, or a combination thereof, and the concentration of the solvent extract of Akamegawrinkle bark is preferably 100 to 1000 ⁇ g / ml. Furthermore, it preferably has an ability to suppress differentiation from preadipocytes to adipocytes.
  • the present invention since a known food is used as a raw material, safety can be ensured. Moreover, the choice of the fat accumulation inhibitor which an ingestor selects can be increased by finding the new foodstuff which has a fat accumulation inhibitory effect.
  • Akamegawashi bark may be in the form of raw or dry matter, and may be subjected to the extraction operation as it is, or may be cut and pulverized as necessary for the extraction operation.
  • the dried product is preferably used after being pulverized.
  • red mulberry bark extract The solvent extract of red mulberry bark used in the present invention (hereinafter referred to as red mulberry bark extract) can be obtained by extracting from the above raw materials using water, an organic solvent, or a combination thereof. A known method can be used for extraction.
  • the organic solvent used for extraction is liquid at room temperature, such as lower alcohols such as methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, and n-butanol, and polyhydric alcohols such as 1,3-butylene glycol, propylene glycol, and glycerin.
  • lower alcohols such as methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, and n-butanol
  • polyhydric alcohols such as 1,3-butylene glycol, propylene glycol, and glycerin.
  • examples include alcohols; esters such as butyl acetate and ethyl acetate; ketones such as acetone and ethyl methyl ketone, and extraction can be performed using one or more of these.
  • alcohols that are liquid at room temperature particularly lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms, are preferred from the viewpoint of operability and environmental performance.
  • ethanol is more preferable from the viewpoint of safety
  • the extraction temperature is preferably from 5 ° C. to the boiling point of the solvent used, and the extraction time is preferably about 30 minutes to 72 hours, although it varies depending on the type of solvent used and the extraction conditions.
  • it is preferable to use a low-boiling solvent so that the red-crowned bark extract does not undergo denaturation or thermal decomposition.
  • the extract obtained in this way may be used as it is as an extract of bark wrinkle. Further, it may be dried and powdered by a method such as concentration or freeze-drying or spray-drying, if necessary, and used as a red mulberry bark extract.
  • any method may be used as long as the red-crowned bark extract is not denatured or thermally decomposed.
  • filtration, centrifugation, centrifugal filtration, spray drying, spray cooling, drum drying examples include vacuum drying and freeze-drying. These methods can be used alone or in combination.
  • the above-mentioned Akamega wrinkle bark extract is made from raw Akamega wrinkle bark, which is highly safe and can be taken alone as it is. Therefore, long-term continuous intake is easy as a fat accumulation inhibitor described later.
  • the Akamegawashi bark extract may be taken alone as a fat accumulation inhibitor alone.
  • the concentration of the extract of Akamegashi bark to be taken is preferably 100 to 1000 ⁇ g / ml, more preferably 100 to 750 ⁇ g / ml, and even more preferably 100 to 500 ⁇ g / ml.
  • additives, other known fat accumulation inhibitory substances, lipolysis promoting substances, fat metabolism improving substances, etc. may be added to the red mulberry bark extract alone or in combination. .
  • Examples of the dosage form of the fat accumulation inhibitor of the present invention include tablets, capsules, granules, powders, syrups, dry syrups, solutions, suspensions, inhalants and the like.
  • the food and drink containing the fat accumulation inhibitor is not particularly limited, and examples thereof include beverages, spreads, dressings, breads, cooked rice, noodles, sauces, and confectionery.
  • the food and drink of the present invention can further contain various nutrients, various vitamins, minerals, dietary fiber, and various additives.
  • a 50% water-containing ethanol extract of red-crowned bark used in this example was obtained as follows. 200 g of 50% water-containing ethanol was added to 10 g of commercially available red mulberry bark powder (manufactured by Nippon Powder Chemical Co., Ltd .; trade name “Akamega wrinkle powder”), subjected to ultrasonic treatment for 10 minutes, and then shaken for 30 minutes. Next, after being immersed overnight, the immersion liquid was filtered with a filter paper. The filtrate was concentrated with an evaporator to obtain about 500 mg of an extract. This extract was dissolved in ethanol and diluted to a concentration of 500 mg / ml.
  • Fat accumulation suppression action confirmation test (Oil Red O staining)
  • Oil Red O staining It was confirmed by Oil Red O staining whether a 50% water-containing ethanol extract of Akamegawashi bark has a fat accumulation inhibitory effect.
  • the amount of fat accumulated in the cells can be measured by staining the lipid droplets in the cells with Oil Red O staining solution and measuring the absorbance.
  • Oil Red O staining solution stock solution was prepared. Specifically, 0.15 g of Oil Red O staining solution powder was dissolved in 50 ml of 2-propanol. Next, it was centrifuged at 3,000 rpm for about 5 minutes. Finally, the supernatant was filtered through a 0.2-0.45 ⁇ m syringe filter to obtain a stock solution. At the time of measurement, 4 ml of water was added to 6 ml of the stock solution, allowed to stand for 1 hour, and then filtered through a 0.2-0.45 ⁇ m syringe filter as the staining solution.
  • 3T3-L1 cells which are preadipocytes, were seeded in a 12-well plate, cultured in DMEM medium supplemented with 10% NBCS for 2 days, and then differentiation induction medium (0.5 mM 1-methyl-3).
  • -Diffusion medium containing 10% NBCS containing isobutylxanthine, 0.25 ⁇ M dexamethasone, 10 ⁇ g / ml insulin
  • the medium was changed to a maturation promoting medium (10 ⁇ g / ml DMEM medium supplemented with 10% NBCS containing insulin) and cultured for 7 days.
  • 50% aqueous ethanol extract of Akamegashi bark was added to the differentiation induction medium and the maturation promotion medium so as to be 0, 50, 100, 250, and 500 ⁇ g / ml.
  • the culture solution was removed, and 10% formalin solution was added at 500 ⁇ l / well.
  • the formalin solution was added and left for 1 hour to fix the cells on the wells.
  • After removing formalin it was washed with distilled water, and OilORed O staining solution was added at 300 ⁇ l / well. The mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes to stain intracellular fat. After removing the staining solution, the cells were washed with distilled water.
  • 2-propanol was added at 500 ⁇ l / well to extract the dye from the cells. Then, the absorbance of the extract was measured with a plate reader (490 nm).
  • the amount of fat in the cells is decreased by adding 50% aqueous ethanol extract of Akamegashi bark.
  • concentration of 50% aqueous ethanol extract of Akamegawashi bark is 100 ⁇ g / ml or more, the amount of fat in the cell decreases in proportion to the concentration, and when the concentration is 500 ⁇ g / ml, the amount of fat in the cell is 50% of the water content of Akamegawashi bark. The amount was reduced to about 1/4 compared with the case where no ethanol extract was added.
  • 3T3-L1 cells were seeded in a 12-well plate, cultured in DMEM medium supplemented with 10% NBCS for 2 days, and then differentiation induction medium (0.5 mM 1-methyl-3-isobutylxanthine, 0.25 ⁇ M).
  • differentiation induction medium 0.5 mM 1-methyl-3-isobutylxanthine, 0.25 ⁇ M.
  • Dexamethasone 10% NBCS-added DMEM medium containing 10 ⁇ g / ml insulin
  • the medium was changed to a maturation promoting medium (10% NBCS-added DMEM medium containing 10 ⁇ g / ml insulin) and cultured for 7 days.
  • 50% aqueous ethanol extract of Akamegashi bark was added to the differentiation induction medium and the maturation promotion medium so as to be 0, 50, 100, 250, and 500 ⁇ g / ml.
  • RNA was prepared from each cultured cell, and cDNA was obtained by reverse transcription reaction.
  • the expression level of the PPAR ⁇ gene was measured by quantitative PCR using LightCycler (Roche Life Science).
  • the measured expression level of the PPAR ⁇ gene was corrected by an internal standard ( ⁇ -actin gene expression level).
  • a measurement result is shown by the relative value when the expression level of 0 ⁇ g / ml of 50% hydrous ethanol extract added to red bark bark is 100.
  • Test 3 Anti-differentiation activity confirmation test of preadipocytes (GPDH activity)” Based on the result of Test 2, it was confirmed whether differentiation from preadipocytes to adipocytes was actually suppressed. Here, it is known that GPDH activity increases rapidly when preadipocytes differentiate into adipocytes.
  • 3T3-L1 cells were seeded in a 12-well plate, cultured in DMEM medium supplemented with 10% NBCS for 2 days, and then differentiation induction medium (0.5 mM 1-methyl-3-isobutylxanthine, 0.25 ⁇ M).
  • the cells were cultured in dexamethasone, 10 ⁇ g / ml insulin-containing 10% NBCS-added DMEM medium) for 2 days to induce differentiation into adipocytes. Thereafter, the medium was changed to a maturation promoting medium (10 ⁇ g / ml DMEM medium supplemented with 10% NBCS containing insulin) and cultured for 7 days.
  • 50% aqueous ethanol extract of Akamegashi bark was added to the differentiation induction medium and the maturation promotion medium so as to be 0, 50, 100, 250, and 500 ⁇ g / ml.
  • the culture solution of the cultured cells was removed and washed twice with PBS ( ⁇ ). Then, 0.5 ml of the enzyme extract was added, and the cells were detached from the well by pipetting. The peeled cells were put together with the enzyme extract into a sampling tube, and this sampling tube was centrifuged at 10,000 rpm and 4 ° C. for 5 minutes, and the supernatant was collected.
  • a measurement result also shows the relative value when the GDPH activity of the addition amount of 0 ⁇ g / ml of 50% hydrous ethanol extract of red mulberry bark is defined as 100.
  • 3T3-L1 cells were seeded in a 12-well plate, cultured in DMEM medium supplemented with 10% NBCS for 2 days, and then differentiation induction medium (0.5 mM 1-methyl-3-isobutylxanthine, 0.25 ⁇ M).
  • differentiation induction medium 0.5 mM 1-methyl-3-isobutylxanthine, 0.25 ⁇ M.
  • Dexamethasone 10% NBCS-added DMEM medium containing 10 ⁇ g / ml insulin
  • a cell counting kit manufactured by Dojindo Laboratories was added at 20 ⁇ l / well. Moreover, it added to each well so that the density
  • 3T3-L1 cells (ATCC) were seeded in a 12-well plate and cultured in DMEM medium supplemented with 10% NBCS for 2 days.
  • a cell counting kit (manufactured by Dojindo Laboratories) was added at 20 ⁇ l / well.
  • concentration of the 50% water-containing ethanol extract of red-skinned wrinkle might be 0, 50, 100, 250, 500 microgram / ml.
  • the light absorbency was measured with the plate reader (450 nm).
  • a measurement result is shown by the relative value when the cell viability when the added amount of the 50% aqueous ethanol extract of the red bark bark is 0 ⁇ g / ml is defined as 100.
  • a 50% aqueous ethanol extract of red algae bark has a novel effect of suppressing differentiation from preadipocytes to adipocytes.
  • a well-known foodstuff is used as a raw material, while ensuring safety
  • this invention is not limited to 50% water-containing ethanol extract.
  • the water extract of Akamegasiwa bark has the same effect as a 50% aqueous ethanol extract.
  • the organic solvent extract of Akamegawashi bark has a fat accumulation suppressing effect although it is slightly less effective than the 50% aqueous ethanol extract.

Abstract

メタボリックシンドロームの一因である内臓脂肪型肥満を予防するために、脂肪蓄積抑制および／または脂肪蓄積量低減（脂肪細胞の肥大化の抑制や分化の抑制）を効果的に行うことができる安全性の高い脂肪蓄積抑制剤を提供する。 ［解決手段］アカメガシワ樹皮の溶媒抽出物を有効成分とすることを特徴とする脂肪蓄積抑制剤である。また、アカメガシワ樹皮の溶媒抽出物濃度が１００～１０００μｇ／ｍｌであることが好ましい。

Description

脂肪蓄積抑制剤及びこれを含有する飲食品
　本発明は脂肪蓄積抑制剤に関する。より詳しくは、アカメガシワ樹皮の抽出物を有効成分とする脂肪蓄積抑制剤に関する。
　近年、日本では、食生活、運動習慣、喫煙、飲酒などの生活習慣により引き起こされる生活習慣病が問題となっている。例えば、食習慣が理由で発症する生活習慣病としては、糖尿病、肥満症、高脂血症、高血圧症、大腸がん、歯周病などがある。なかでも、糖尿病、肥満症、高脂血症、高血圧症と言った生活習慣病は、患者数が多いことに加えて、脳梗塞や心筋梗塞の原因となる動脈硬化症の発症と密接に関連していることから特に注目されている。
　肥満にはお腹に脂肪がたまる内臓脂肪型肥満（内臓脂肪蓄積）があるが、内臓脂肪蓄積があると、糖尿病や高脂血症・高血圧などがおこりやすくなることがわかっている。しかも、これらが重複し、さらにその数が多くなるほど、動脈硬化を進行させるリスクが高まることもわかっている。そこで、内臓脂肪型肥満に高血糖、高血圧および脂質異常症のうち２つ以上が重なっている状態をメタボリックシンドロームと定義し、メタボリックシンドロームを早期発見・適切な指導を行うことで、生活習慣病の予防や改善が取り組まれている。
　ところで、肥満には脂肪細胞が重要な役割を果たしており、脂肪細胞中に蓄えられる油滴の肥大化と新しい脂肪細胞への分化の繰り返しが肥満につながるとされている。この脂肪細胞の肥大化や分化を抑制する物質として、トレハロース（特許文献１）、酢酸又は酢酸塩（特許文献２）、イネ科植物の種子及び／又は地上部茎葉から抽出される成分（特許文献３）などの食品由来成分が報告されており、これらを添加した飲食品も開発されている。
国際公開第２００４／０８９９６４号 特開２０１０－１１１５８５公報 特開２００５－２４７６９５公報
　しかし、上記物質に限ったことではないが、人によっては体質等の影響で効果が得られにくいこともある。そのため、脂肪蓄積抑制および／または脂肪蓄積量低減（脂肪細胞の肥大化の抑制や分化の抑制）を効果的に行うことができる安全性の高い脂肪蓄積抑制剤の開発が引き続き望まれている。
　本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものである。すなわち、本発明は、脂肪蓄積抑制および／または脂肪蓄積量低減（脂肪細胞の肥大化の抑制や分化の抑制）を効果的に行うことができる安全性の高い脂肪蓄積抑制剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは、既知の食品について脂肪蓄積抑制および／または脂肪蓄積量低減効果（以下、単に「脂肪蓄積抑制効果」と言う。）について調べた。そして、胃潰瘍抑制効果が既に知られているアカメガシワ樹皮を水、有機溶媒またはこれらの組み合わせのいずれかで抽出した物には脂肪蓄積抑制効果があることを新たに見出し、本発明を完成するに至った。
　上記課題解決のため、本発明は、アカメガシワ樹皮の溶媒抽出物を有効成分とする脂肪蓄積抑制剤を提供する。
　また、前記した構成において、抽出溶媒が水、有機溶媒またはこれらの組み合わせのいずれかであることが好ましく、アカメガシワ樹皮の溶媒抽出物濃度が１００～１０００μｇ／ｍｌであることが好ましい。さらに、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化抑制能を有することが好ましい。
　さらには、前記した脂肪蓄積抑制剤を含有する飲食品であることが好ましい。
　本発明によれば、既に公知の食材を原料にすることから、安全性を確保することができる。また、脂肪蓄積抑制効果を有する新たな食材を見出すことにより、摂取者が選択する脂肪蓄積抑制剤の選択肢を増やすことができる。
　　以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
　アカメガシワ樹皮は生あるいは乾燥物いずれの形態でもよく、そのまま抽出操作に供してもよいし、必要に応じて切断、粉砕して抽出操作に供することもできる。本発明においては、乾燥物を粉砕して用いることが好ましい。
　本発明に用いられるアカメガシワ樹皮の溶媒抽出物（以下、アカメガシワ樹皮抽出物という。）は、上記の原料から水、有機溶媒またはこれらの組み合わせのいずれかを用いて抽出して得ることができる。また、抽出には公知の方法が使用できる。
　抽出に用いられる有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール等の低級アルコール、１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコールなどの室温で液体であるアルコール類；酢酸ブチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類等を挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いて抽出を行うことができる。このうち、操作性や環境性の点から、室温で液体であるアルコール類、特に、炭素原子数１～４の低級アルコールが好ましい。また、残留溶媒による安全性の観点からはエタノールがより好ましい。
　具体的な抽出方法としては、例えば、常圧あるいは加圧下で室温あるいは加温した水、有機溶媒またはこれらの組み合わせのいずれかの溶媒中にアカメガシワ樹皮を加え、浸漬や攪拌しながら抽出する方法や、水、有機溶媒またはこれらの組み合わせのいずれかの溶媒中で還流しながら抽出する方法などが挙げられる。その際、抽出温度は５℃から使用する溶媒の沸点以下の温度とするのが好ましく、抽出時間は使用する溶媒の種類や抽出条件によっても異なるが、３０分～７２時間程度とするのが好ましい。還流操作により抽出を行う場合は、アカメガシワ樹皮抽出物が変性や熱分解を起こさないように低沸点の溶媒を用いるのが好ましい。
　このようにして得られた抽出液をそのままアカメガシワ樹皮抽出物として用いてもよい。また、必要に応じて濃縮あるいは凍結乾燥やスプレードライなどの方法により、乾燥、粉末化して、アカメガシワ樹皮抽出物として使用してもよい。
　具体的な乾燥方法としては、アカメガシワ樹皮抽出物が変性や熱分解を起こさない条件であればどのような方法でもよく、例えば、濾過、遠心分離、遠心濾過、スプレードライ、スプレークール、ドラムドライ、真空乾燥、凍結乾燥等が挙げられる。これらの方法を単独または組み合わせて用いることができる。
　なお、上記アカメガシワ樹皮抽出物は、食経験のあるアカメガシワ樹皮を原料としており、安全性が高く、そのまま単独でも摂取することが可能である。そのため、後述する脂肪蓄積抑制剤として長期間の継続的摂取が容易である。
　アカメガシワ樹皮抽出物は、そのまま単独で脂肪蓄積抑制剤として摂取してもよい。ここで、摂取するアカメガシワ樹皮抽出物濃度としては１００～１０００μg／ｍｌが好ましく、１００～７５０μｇ／ｍｌがより好ましく、１００～５００μｇ／ｍｌがさらにより好ましい。また、本発明の効果を阻害しない限り、アカメガシワ樹皮抽出物に、添加剤、他の公知の脂肪蓄積抑制物質、脂肪分解促進物質、脂肪代謝改善物質等を単独または複数組み合わせて配合してもよい。
　本発明の脂肪蓄積抑制剤の剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、液剤、懸濁剤、吸入剤などが挙げられる。
　脂肪蓄積抑制剤を含有する飲食品としては特に制限されず、例えば、飲料、スプレッド類、ドレッシング類、パン類、米飯類、麺類、ソース類、菓子などが挙げられる。
　本発明の飲食品は、各種栄養素、各種ビタミン、ミネラル、食物繊維、種々の添加剤をさらに配合することができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明する。
　本実施例で用いるアカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物は次のようにして得た。市販のアカメガシワ樹皮粉末（日本粉末薬品株式会社製；商品名「アカメガシワ末」）１０ｇに５０％含水エタノール２００ｍｌを加え、１０分間超音波処理をした後、３０分間振とう処理した。次に、一晩浸漬した後、浸漬液をろ紙でろ過した。ろ液をエバポレータで濃縮して抽出物約５００ｍｇを得た。この抽出物をエタノールに溶解させ、５００ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。
『試験１：脂肪蓄積抑制作用確認試験（Ｏｉｌ Ｒｅｄ　Ｏ染色）』
　アカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物に脂肪蓄積抑制効果があるかについて、Ｏｉｌ Ｒｅｄ　Ｏ染色により確認した。Ｏｉｌ Ｒｅｄ　Ｏ染色液で細胞内の脂肪滴を染色して吸光度測定することで、細胞中に蓄積されている脂肪量の測定が行える。
　まず、Ｏｉｌ Ｒｅｄ　Ｏ染色液原液を調整した。具体的には、Ｏｉｌ Ｒｅｄ　Ｏ染色液粉末０．１５ｇを２－プロパノール５０ｍｌに溶解した。次に、３，０００ｒｐｍで５分間程度遠心分離した。最後に、上清を０．２～０．４５μｍのシリンジフィルターでろ過することで、原液を得た。測定時には、原液６ｍｌに水４ｍｌを加えて１時間静置後、０．２～０．４５μｍのシリンジフィルターで濾過したものを染色液として用いた。
　細胞については、脂肪前駆細胞である３Ｔ３－Ｌ１細胞（ＡＴＣＣ）を、１２ウェルプレートに播種し、１０％ＮＢＣＳ添加ＤＭＥＭ培地で２日間培養した後、分化誘導培地（０．５ｍＭ　１－メチル－３－イソブチルキサンチン、０．２５μＭ　デキサメタゾン、１０μｇ／ｍｌ　インスリンを含む１０％ＮＢＣＳ添加ＤＭＥＭ培地）で２日間培養し、脂肪細胞に分化誘導した。その後、成熟促進培地（１０μｇ／ｍｌ　インスリンを含む１０％ＮＢＣＳ添加ＤＭＥＭ培地）に変えて７日間培養した。この際、上記分化誘導培地および成熟促進培地に、アカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物を０、５０、１００、２５０、５００μg／ｍｌとなるように添加した。
　続いて、培養液を除去し、１０％ホルマリン溶液を５００μｌ／ウェルで添加した。ホルマリン溶液添加してから１時間放置し、細胞をウェル上に固定した。ホルマリン除去後、蒸留水で洗浄し、Ｏｉｌ Ｒｅｄ　Ｏ染色液を３００μｌ／ウェルで添加した。室温で１５分間静置し、細胞内の脂肪を染色した。染色液除去後、蒸留水で細胞を洗浄した。最後に、２－プロパノールを５００μｌ／ウェルで添加し、細胞から色素を抽出した。そして、抽出液の吸光度をプレートリーダー（４９０ｎｍ）で測定した。
　結果を、表１に示す。なお、測定結果はアカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物添加量が０μg／ｍｌの吸光度を１００としたときの相対値で示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１から明らかなように、アカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物を添加することによって、細胞内の脂肪量が減少していることがわかる。アカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物の濃度が１００μｇ／ｍｌ以上では濃度に比例して細胞中の脂肪量減っており、濃度が５００μｇ／ｍｌでは、細胞中の脂肪量はアカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物無添加の場合に比べて約１／４の量に減っていた。
『試験２：脂肪細胞への分化に関わる遺伝子発現量確認試験（ＰＰＡＲγの発現量確認）』
　Ｏｉｌ Ｒｅｄ　Ｏ染色の結果が、脂肪細胞への脂肪蓄積抑制によるものか、脂肪細胞へ分化抑制によるものかについて、ＰＰＡＲγの発現量について確認を行った。ここで、ＰＰＡＲγは脂肪細胞分化のマスターレギュレーターとして知られている。
　まず、３Ｔ３－Ｌ１細胞（ＡＴＣＣ）を、１２ウェルプレートに播種し、１０％ＮＢＣＳ添加ＤＭＥＭ培地で２日間培養した後、分化誘導培地（０．５ｍＭ　１－メチル－３－イソブチルキサンチン、０．２５μＭ　デキサメタゾン、１０μｇ／ｍｌ　インスリンを含む１０％ＮＢＣＳ添加ＤＭＥＭ培地）で２日間培養し、脂肪細胞に分化誘導した。その後、成熟促進培地（１０μｇ／ｍｌインスリンを含む１０％ＮＢＣＳ添加ＤＭＥＭ培地）に変えて７日間培養した。この際、上記分化誘導培地および成熟促進培地に、アカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物を０、５０、１００、２５０、５００μg／ｍｌとなるように添加した。



　次に、各培養細胞からＴｏｔａｌ　ＲＮＡを調製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロシュ・ライフサイエンス社）を用いた定量的ＰＣＲによりＰＰＡＲγ遺伝子の発現量を測定した。測定したＰＰＡＲγ遺伝子の発現量は、内部標準（βアクチン遺伝子発現量）により補正した。なお、測定結果はアカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物添加量が０μｇ／ｍｌの発現量を１００としたときの相対値で示す。
　結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２から明らかなように、アカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物の添加濃度が５０μｇ／ｍｌ以上になるとＰＰＡＲγの遺伝子発現量に低下が認められた。さらに、添加濃度が５００μｇ／ｍｌになるとＰＰＡＲγの遺伝子発現量は添加していないものの約１／４以下となった。以上のことから、アカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物は５０μｇ／ｍｌ以上の濃度において、脂肪細胞の分化を遺伝子レベルで抑制していることが示唆された。
『試験３：脂肪前駆細胞の分化抑制活性確認試験（ＧＰＤＨ活性）』
　試験２の結果に基づき、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化が実際に抑制されているかについて確認を行った。ここでＧＰＤＨ活性は脂肪前駆細胞が脂肪細胞に分化した際に急増することが知られている。
　まず、３Ｔ３－Ｌ１細胞（ＡＴＣＣ）を、１２ウェルプレートに播種し、１０％ＮＢＣＳ添加ＤＭＥＭ培地で２日間培養した後、分化誘導培地（０．５ｍＭ　１－メチル－３－イソブチルキサンチン、０．２５μＭ　デキサメタゾン、１０μｇ／ｍｌ　インスリンを含む１０％ＮＢＣＳ添加ＤＭＥＭ培地）で２日間培養し、脂肪細胞に分化誘導した。その後、成熟促進培地（１０μｇ／ｍｌ　インスリンを含む１０％ＮＢＣＳ添加ＤＭＥＭ培地）に変えて７日間培養した。この際、上記分化誘導培地および成熟促進培地に、アカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物を０、５０、１００、２５０、５００μg／ｍｌとなるように添加した。
　次に、培養細胞の培養液を除去し、ＰＢＳ（－）で２回洗浄した。そして、酵素抽出液を０．５ｍｌ加え、ピペッティングにより、細胞をウェルから剥がした。剥がした細胞をサンプリングチューブに酵素抽出液ごと入れ、このサンプリングチューブを１０，０００ｒｐｍ、４℃で、５分間遠心分離し、上清を回収した。
　次に、ＧＰＤＨ測定キット（タカラバイオ株式会社）の反応基質溶液１００μｌを９６ウェルプレートに入れ、３０℃で約３０分間加温した。加温後、ウェルに各上清を２５μｌ加え、よく撹拌した。撹拌後、プレートリーダー（３４０ｎｍ）で吸光度を１分おきに１０分間測定した。そして、得られた測定値から１分間当たりの吸光度の変化量（ΔＯ．Ｄ．（３４０ｎｍ）／分）を求めた。得られた吸光度の変化量を下記式に当てはめ、ＧＰＤＨ活性を決定した。なお、測定結果はアカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物添加量０μｇ／ｍｌのＧＤＰＨ活性を１００としたときの相対値も併せて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　その結果を、表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表３から明らかなように、アカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物の添加濃度が５０μｇ／ｍｌ以上になるとＧＰＤＨ活性に低下が認められた。さらに、５００μｇ／ｍｌになるとＧＰＤＨ活性がほぼないという結果になった。したがって、アカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物は５０μｇ／ｍｌ以上の濃度において、脂肪細胞の分化を抑制していることがこの試験においても明らかとなった。
『試験４：安全性確認試験』
　最後に、アカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物の安全性について確認を行った。安全性については分化細胞および未分化細胞それぞれについて試験を行った。
（分化細胞の生存率）
　まず、３Ｔ３－Ｌ１細胞（ＡＴＣＣ）を、１２ウェルプレートに播種し、１０％ＮＢＣＳ添加ＤＭＥＭ培地で２日間培養した後、分化誘導培地（０．５ｍＭ　１－メチル－３－イソブチルキサンチン、０．２５μＭ　デキサメタゾン、１０μｇ／ｍｌ　インスリンを含む１０％ＮＢＣＳ添加ＤＭＥＭ培地）で２日間培養し、脂肪細胞に分化誘導した。その後、成熟促進培地（１０μｇ／ｍｌ　インスリンを含む１０％ＮＢＣＳ添加ＤＭＥＭ培地）に変えて７日間培養した。次に、セルカウンティングキット（同仁化学研究所製）を２０μｌ／ウェルとなるように添加した。また、アカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物の濃度が０、５０、１００、２５０、５００μｇ／ｍｌとなるように各ウェルに添加した。そして、３７℃で４時間培養した後、プレートリーダー（４５０ｎｍ）で吸光度を測定した。なお、測定結果はアカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物添加量が０μｇ／ｍｌの細胞生存率を１００としたときの相対値で示す。
（未分化細胞の生存率）
　まず、３Ｔ３－Ｌ１細胞（ＡＴＣＣ）を、１２ウェルプレートに播種し、１０％ＮＢＣＳ添加ＤＭＥＭ培地で２日間培養した。次に、セルカウンティングキット（同仁化学研究所製）を２０μｌ／ウェルとなるように添加した。また、アカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物の濃度が０、５０、１００、２５０、５００μｇ／ｍｌとなるように各ウェルに添加した。そして、３７℃で４時間培養した後、プレートリーダー（４５０ｎｍ）で吸光度を測定した。なお、測定結果はアカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物添加量が０μｇ／ｍｌの細胞生存率を１００としたときの相対値で示す。
　結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表４から明らかなように、アカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物を添加しても、各濃度における分化細胞および未分化細胞の生存率は高いままであった。したがって、安全性に問題ないことがわかる。
　以上説明したように、アカメガシワ樹皮の５０％含水エタノール抽出物には、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化を抑制するという新規な効果が認められた。これにより、既に公知の食材を原料にすることから、安全性を確保するとともに、摂取者が選択する脂肪蓄積抑制剤の選択肢を増やすことができる。
　なお、上記実施例では５０％含水エタノール抽出物の場合について述べたが、本願発明は５０％含水エタノール抽出物に限られない。例えば、アカメガシワ樹皮の水抽出物には、５０％含水エタノール抽出物と同等の効果があることを確認している。また、アカメガシワ樹皮の有機溶媒抽出物には、５０％含水エタノール抽出物と比較すると若干効果は弱いものの、脂肪蓄積抑制効果があること確認している。

Claims (5)

  1. 　アカメガシワ樹皮の溶媒抽出物を有効成分とする脂肪蓄積抑制剤。
  2. 　前記抽出溶媒が水、有機溶媒またはこれらの組み合わせのいずれかである、請求項１記載の脂肪蓄積抑制剤。
  3. 　アカメガシワ樹皮の溶媒抽出物濃度が１００～１０００μｇ／ｍｌである、請求項１または２に記載の脂肪蓄積抑制剤。
  4. 　脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化抑制能を有する、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の脂肪蓄積抑制剤。
  5. 　請求項１乃至４のいずれか一項に記載の脂肪蓄積抑制剤を含有する飲食品。
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