WO2016137162A1 - 청력 손상 방어용 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents
청력 손상 방어용 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a peptide having hearing impairment defense efficacy and a pharmaceutical composition comprising the same. More specifically, the present invention relates to a peptide derived from telomerase, a peptide having a hearing damage defense effect by a toxic drug, and a pharmaceutical composition for preventing hearing damage.
- the anatomical structure of the ear is subdivided into the outer ear, middle ear and inner ear.
- the inner ear consists of cochlea for hearing, vestibule and semicircular canals for equilibrium, and the nerve nerves connected to it. to be.
- Hearing impairment is the result of damage to one or many parts of the outer, middle, or inner ear.
- omnic hearing loss is when there is a problem with the outside or middle ear that the sound cannot properly reach the inner ear.
- mixed hearing loss is a combination of sensorineural and prenegative hearing loss.
- neurological hearing loss occurs when the auditory nerve cannot transmit sound signals to the brain.
- Toxicity refers to a phenomenon in which the deterioration of tissues and dysfunction of inner ear, that is, peripheral organs and nerve tissues of hearing and vestibular function and tissue cells are caused by a therapeutic agent or chemical.
- Aminoglycoside antibiotics and platinum-based anticancer drugs are lethal to the kidneys and inner ear by repeated administration. In most cases, renal toxicity is often reversible, but the toxicity is permanent. Because of its toxicity, drugs that are excellent in their effectiveness are not primarily prescribed unless the effects of prescription are not severe enough to take the side effects of aminoglycoside antibiotics and platinum-based anticancer drugs.
- the mechanism of apoptosis by toxic drugs has been revealed little by little, and attempts and studies to prevent hearing loss by protecting hair cells by neutralizing ROS, inhibiting apoptosis enzymes, anti-inflammatory, and treating nerve agents have been conducted. Clinical application is insignificant due to the toxicity of the drug itself and the difficulty of delivery to the inner ear. The toxicity of aminoglycoside antibiotics progresses when the drug is absorbed into the inner ear and accumulates in the inner ear hair cells.
- Furosemide is a type of diuretic that promotes diuretic action. It is used in congestive heart failure, edema, hepatic edema, and hypertension. It has been shown to be potent diuretic and used in pregnancy toxicosis, ascites and peripheral angioedema, but has been reported to cause electrolyte imbalance and acute hypotension in large or long term administration. In addition, furosemide has also been reported to cause hearing impairment, tinnitus or hearing loss.
- telomerase-derived peptides were evaluated in toxic animal models.
- Experiments have demonstrated the effects of telomerase-derived peptides on hearing and ear endothelial damage, which are caused by stress such as toxic drugs, noise and hypoxia, and the final mechanism of hair cell damage is free radicals. Due to apoptosis, telomerase-derived peptides may be effective in repairing damaged inner ear as well as protecting against inner ear damage. Therefore, it can be applied to recovery and treatment of damaged inner ear. You can expect
- a peptide having a sequence homology of 80% or more with the amino acid sequence or a fragment thereof A composition can be provided.
- the fragment may be a fragment consisting of three or more amino acids.
- the hearing impairment may be characterized by administration of a toxic drug or treatment of a toxic drug.
- the toxic drug is at least one drug selected from the group consisting of salicylates, nonsteroidal anti-inflammatory drugs, antibiotics, diuretics, chemotherapeutic agents, quinine, mucoprotective agents, anticancer agents You can do
- the antibiotic may be an aminoglycoside antibiotic
- the anticancer agent may be a platinum-based anticancer agent
- the aminoglycoside antibiotic is kanamycin
- the platinum-based anticancer agent may be cisplatin or carboplatin.
- the diuretic may be characterized as furosemide.
- the hearing impairment may be characterized by deafness and tinnitus due to degenerative changes in peripheral organs and nervous tissues of the inner ear.
- the composition may be to provide a pharmaceutical composition.
- the composition may be to provide a food composition.
- a method for the treatment and prevention of hearing damage comprising the step of administering the composition for the treatment and prevention of hearing damage to a subject.
- the hearing damage treatment and prevention composition As according to another aspect of the invention, the hearing damage treatment and prevention composition; And kits for the treatment and prevention of hearing damage, including instructions.
- the instructions may include the content of administering the composition for the treatment and prevention of hearing damage.
- a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 for preparing the composition for the treatment and prevention of hearing impairment, at least 80% sequence homology with the amino acid sequence
- the use of peptides having peptides or fragments thereof can be provided.
- compositions capable of effectively protecting hearing damage may be provided. Therefore, the composition according to the present invention can be applied to the treatment and prevention of hearing damage, and in particular can be used for the treatment of hearing damage due to the toxic drug.
- a peptide having a sequence of SEQ ID NO: 1 according to the present invention (PEP1) or a peptide or fragment having a sequence having a homology of 80% with the sequence has a peptide for treating and preventing hearing damage.
- FIG. 1 is a photograph of hair cells at the Apical, Middle and Basal Turns of the cochlear tissue of a toxic animal model administered kanamycin.
- Figure 2 is a photograph of hair cells at the attachment, middle, and base of the cochlear tissue of an animal model administered with kanamycin and PEP1 together.
- Figure 3 is a graph showing a comparison of the number of kanamycin administered with the kanamycin and PEP1 group, the number of hair cells by the attachment, the middle part, and the basal part by count (count).
- Figure 4 is a picture of H & E staining of cochlear and swollen tissue obtained from frozen sections in a toxic animal model administered kanamycin.
- FIG. 5 is a H & E staining picture of cochlear and swollen tissue obtained from frozen sections in an animal model administered with kanamycin and PEP1.
- Figure 6 is a graph showing the hearing loss through the auditory brainstem response test (ABR) of each frequency band of the group administered with kanamycin, and the group administered with kanamycin and PEP1 by concentration.
- ABR auditory brainstem response test
- Figure 7 is a picture of the hair cells of the cochlear tissue of the control group not administered PEP1 and the groups treated with concentrations of PEP1 twice a day for 2 weeks.
- FIG. 8 is a H & E staining picture of cochlear and swollen tissue obtained from frozen sections in a control group not administered with PEP1.
- FIG. 8 is a H & E staining picture of cochlear and swollen tissue obtained from frozen sections in a control group not administered with PEP1.
- FIG. 10 is a protocol graph showing the schedule of drug administration and auditory brainstem test of an experiment conducted on a schedule of experiments D1 and D3 with a toxic animal model administered with the toxic drugs kanamycin and furosemide.
- Figure 11 shows the change in the frequency of hearing between the experimental group 1, PEX1 administration group 2, dexamethasone (dexamethasone) administration group 2 and saline control group 1 administered the toxic drug according to the schedule of experiment D1, 7 days after administration and 14 days after drug administration.
- FIG. 12 shows the changes in the frequency of hearing between the experimental group 3 administered PEP1 to the toxic animal model, the experimental group 4 administered dexamethasone, and the control group 2 administered saline according to the schedule of Experiment D3 before and after the drug administration. It is a graph showing the values measured by the auditory brainstem test at 14 days after the drug administration.
- Figure 13 shows the hearing changes by frequency of the experimental group 1 and the experimental group 3 and P3 administered to the toxic animal model according to the schedule of experiments D1 and D3 before hearing the toxic drug, 7 days after drug administration, 14 days after drug administration
- a graph showing the values measured by the brainstem response test.
- FIG. 14 shows the basal and middle portions of the cochlea by performing a biopsy of experimental group 1 to which PEP1 was administered to the toxic animal model, experimental group 2 to which dexamethasone was administered, and control group 1 to which saline was administered according to the schedule of Experiment D1. Mid) and Apex's hair cell viability under a confocal scanning microscope.
- FIG. 15 shows the basal, middle, and attached hairs of the cochlea by performing biopsies of experimental group 3 administered PEP1, experimental group 4 administered dexamethasone, and control group 2 administered saline according to the schedule of Experiment D3. Cell viability was observed with a confocal scanning microscope.
- FIG. 16 shows the base of the cochlea, the middle part, and the normal attachment of the cochlea by performing a biopsy of the experimental group 1 to which PEP1 was administered to the toxic animal model according to the schedule of Experiment D1, the experimental group to which dexamethasone was administered, and the control group to which saline was administered. It is a graph showing the quantitative analysis of the hair cell ratio.
- the present invention may be variously modified and may have various embodiments.
- the present invention will be described in more detail. However, this is not intended to limit the present invention to specific embodiments, it should be understood to include all transformations, equivalents, and substitutes included in the spirit and scope of the present invention.
- the detailed description of the related known technology may obscure the gist of the present invention, the detailed description thereof will be omitted.
- Telomere is a genetic material repeatedly present at the end of a chromosome and is known to prevent damage to the chromosome or binding to another chromosome. Each time a cell divides, the telomeres become slightly shorter. After a certain number of cell divisions, the telomeres become very short, and the cells stop dividing and die. On the other hand, elongation of telomeres is known to prolong cell life. For example, cancer cells secrete an enzyme called telomerase, which prevents telomeres from shortening, so that cancer cells can continue to proliferate without dying. The inventors have confirmed that peptides derived from telomerase are effective in inhibiting angiogenesis and have completed the present invention.
- Peptides disclosed herein can include peptides having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% homology.
- the peptides disclosed herein, peptides or fragments thereof comprising SEQ ID NO: 1 and one or more amino acids, two or more amino acids, three or more amino acids, four or more amino acids, five or more amino acids, six or more amino acids Or peptides with seven or more amino acids changed.
- amino acid changes belong to the property that allows the physicochemical properties of the peptide to be altered.
- amino acid changes can be made, such as improving the thermal stability of the peptide, altering substrate specificity, changing the optimal pH, and the like.
- a peptide having a sequence of SEQ ID NO: 1, a peptide which is a fragment of SEQ ID NO: 1, or a peptide having a sequence homology of 80% or more with the peptide sequence has low intracellular toxicity and stability in vivo according to an aspect of the present invention. This has the advantage of being high.
- SEQ ID NO: 1 in the present invention is a telomerase-derived peptide consisting of 16 amino acids as follows.
- the peptide described in SEQ ID NO: 1 is shown in Table 1 below.
- the "name” in Table 1 below is to distinguish peptides.
- the peptide set forth in SEQ ID NO: 1 represents the entire peptide of human telomerase.
- a peptide having a sequence of SEQ ID NO: 1, a peptide that is a fragment of SEQ ID NO: 1, or a peptide having a sequence homology of 80% or more with the peptide sequence corresponds to a peptide included in telomerase.
- synthetic peptides selected and synthesized at the positional peptides.
- SEQ ID 2 shows the amino acid sequence of the entire telomerase.
- Kanamycin used in the experiments of the present invention is an aminoglycoside antibiotic.
- Aminoglycosides are administered by injection because only 3% of the dose is absorbed by the stomach, and most of the drugs administered are excreted in the urine through glomerular filtration of the kidneys, and during renal failure the excretion is reduced and excessively in the perilymph fluid of the inner ear Accumulation is likely to cause toxicities such as nephrotoxicity.
- Kanamycin, together with neomycin, amikacin, sisomycin, and ribodomycin initially destroys the hair cells of the cochlear basal rotator and proceeds to the tip as the administration continues. It is a cochlear toxin that expands the fracture area.
- Furosemide used in the experiments of the present invention is used to treat hypertension or edema by removing unnecessarily accumulated water and salts as a diuretic. Furosemide has reported cases of tinnitus, hearing impairment, and hearing loss in the presence of high doses, hypoproteinemia, and in combination with other toxic drugs.
- Dexamethasone used in the experiment of the present invention is a synthetic corticosteroid (corticosteroid), it is used as an anti-inflammatory, immunosuppressant. It is used for the treatment of various inflammatory diseases and immunosuppressive agents, and it is effective in tinnitus, hearing damage and vestibular dysfunction. However, it has been reported that excessive administration excessively suppresses the immune action and has serious side effects in patients with eye or ear fungal infections.
- Auditory brainstem response used to examine hearing damage in the experiment of the present invention is a precision that determines the threshold of hearing by the average of the brain waves coming from the central part of the brain that can be obtained by sound stimulation Hearing test. Increasing the threshold value implies hearing loss.
- a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (comprising), a peptide having a hearing loss therapeutic efficacy which is a peptide or a fragment thereof having a sequence homology of 80% or more with the amino acid sequence as an active ingredient It provides a pharmaceutical composition.
- Hearing loss treatment efficacy composition is a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in one aspect, a peptide having a sequence homology of 80% or more with the amino acid sequence of 0.01g / L To 1kg / L, specifically 0.1g / L to 100g / L, more specifically may be included in the content of 1g / L to 10g / L, but if the difference in effect according to the dose can be adjusted appropriately.
- composition according to one aspect of the present invention can be applied to all animals including humans, dogs, chickens, pigs, cows, sheep, guinea pigs or monkeys.
- the composition provides a pharmaceutical composition comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a peptide that is at least 80% sequence homology with the amino acid sequence or a fragment thereof.
- the pharmaceutical composition according to one aspect of the present invention may be administered orally, rectal, transdermal, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intramedullary, intradural or subcutaneous.
- Formulations for oral administration may be, but are not limited to, tablets, pills, soft or hard capsules, granules, powders, solutions or emulsions.
- Formulations for parenteral administration may be, but are not limited to, injections, drops, lotions, ointments, gels, creams, suspensions, emulsions, suppositories, patches or sprays.
- compositions according to one aspect of the invention may include additives such as diluents, excipients, lubricants, binders, disintegrants, buffers, dispersants, surfactants, colorants, flavoring or sweetening agents as needed.
- additives such as diluents, excipients, lubricants, binders, disintegrants, buffers, dispersants, surfactants, colorants, flavoring or sweetening agents as needed.
- Pharmaceutical compositions according to one aspect of the invention may be prepared by conventional methods in the art.
- the active ingredient of the pharmaceutical composition according to one aspect of the present invention will vary depending on the age, sex, weight, pathology and severity of the subject to be administered, the route of administration or the judgment of the prescriber. Dosage determination based on these factors is within the level of one of skill in the art and its daily dosage may be, for example, 10 ng / kg / day to 100 g / kg / day, specifically 0.1 ⁇ g / kg / day to 10 g / kg / day, More specifically, it may be 1 ⁇ g / kg / day to 1 g / kg / day, and more specifically, 2 ⁇ g / kg / day to 100 mg / kg / day. I can regulate it.
- the pharmaceutical composition according to an aspect of the present invention may be administered once to three times a day, but is not limited thereto.
- the composition provides a food composition comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (comprising), a peptide having a sequence homology of 80% or more with the amino acid sequence or a fragment thereof as a active ingredient do.
- the formulation of the food composition according to one aspect of the present invention is not particularly limited, but may be, for example, formulated into tablets, granules, powders, solutions, solid preparations, and the like.
- Each formulation may be appropriately selected and formulated by those skilled in the art according to the formulation or purpose of use, in addition to the active ingredient, and may be synergistic when applied simultaneously with other raw materials.
- Preferred embodiments of the invention include the most optimal mode known to the inventors for carrying out the invention. Variations of the preferred embodiments may become apparent to those skilled in the art upon reading the foregoing description. The inventors expect those skilled in the art to make appropriate use of such variations, and the inventors expect the invention to be practiced in a manner different from that described herein. Accordingly, the invention includes all modifications and equivalents of the subject matter referred to in the appended claims, as permitted by patent law. Moreover, any combination of the abovementioned elements within all possible variations is included in the invention unless expressly stated to the contrary or apparently contradictory in context. While the invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments, those skilled in the art will understand that various changes in form and detail may be made without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the following claims .
- PEP 1 The peptide of SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to as "PEP 1") was prepared according to the solid phase peptide synthesis known in the art. Specifically, peptides were synthesized by coupling amino acids one by one from the C-terminus through Fmoc solid phase synthesis (SPPS) using ASP48S (Peptron, Inc., Daejeon, Korea). As follows, the first amino acid at the C-terminus of the peptides was attached to the resin. For example:
- Coupling reagent is HBTU [2- (1H-Benzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate] / HOBt [N-Hydroxxybenzotriazole] / NMM [4-Methylmorpholine] It was. Fmoc removal was performed using piperidine in DMF in 20% of DMF.
- Each peptide was synthesized by repeating a process of reacting the amino acids with each other, washing with a solvent, and then deprotecting the amino acid using the state in which the amino acid protecting group was bound to the solid support.
- the synthesized peptide was separated from the resin and then purified by HPLC, and confirmed by MS and lyophilized.
- C57 / BL6 mice (4 weeks-6 weeks old, 15-25 g weight, males) were prepared for the experiment.
- kanamycin in the form of kanamycin sulfate (sulfate) was dissolved in saline solution at a concentration of 40 mg / ml, prepared as a preparation for 800 mg / kg injection administration, and PEP1, a peptide synthesized by the method according to Example 1, was 10 ml PBS. It was prepared as a preparation for injection administration by dissolving at a concentration of 100 mg of sugar.
- the toxic drug kanamycin and the peptide PEP1 according to the present invention were administered to the prepared experimental animals by dividing the experimental groups as follows.
- Experimental Group 1 Kanamycin 800 mg / kg S.C. (Subcutaneous injection) + saline 0.1 ml / 10g mouse I.P. (Abdominal injection)
- Experimental Group 2 Kanamycin 800 mg / kg S.C. + PEP1 10 mg / kg I.P.
- mice were euthanized, blood was collected and perfused with 4% paraformaldehyde (pH 7.4) diluted with 0.1 M phosphate buffered saline and organs (temporal bone) was taken.
- Tissue blocks were prepared by using an optimal cutting temperature compound (OCT compound), and then stored at ⁇ 80 ° C. to make slides, followed by H & E staining.
- OCT compound optimal cutting temperature compound
- the left temporal bone prepares the whole mount of the cochlea for quantitative analysis. Using microscopic instruments and microscopy, the bony labyrinth of the cochlea is carefully separated from the membraneous labyrinth, and the attachment and base are separated. Each is separated into side walls with vessels and basement membrane with cochlea and fixed with 4% paraformaldehyde. After 1 hour of reaction with 0.3% Triton-X, Alexa 488 phalloidin and 1% Bovine serum albumin (BSA) are prepared. Mix Alexa 488 paloidine dissolved in methanol with 1% bovine serum albumin to a ratio of 1: 100.
- BSA Bovine serum albumin
- the auditory brainstem test was performed before injection, 1 week after injection, 2 weeks after injection, and 3 weeks after injection.
- the stimulus was given 4 kHz, 8 kHz, 16 kHz, and 32 kHz negative stimuli, and the threshold value was determined as the smallest stimulus intensity in which 5 waveforms appeared in the ABR.
- Basal hearing was measured in all groups prior to the start of drug administration, and was performed after anesthesia by intraperitoneal injection of isoprene (isoflorane).
- the auditory brainstem test thresholds were summed for each frequency, and the hearing thresholds in experimental group 1 and group 2 were verified using the Mann-Whitney test.
- the auditory brainstem test showed changes in hearing over time after drug administration.
- the threshold value increased with time, but in experimental group 2, the threshold value was insignificant. (See FIG. 6).
- the difference in outcome between the two groups was statistically significant (* is p ⁇ 0.001).
- mice C57 / BL6 mice (4 weeks-6 weeks old, weight 15-25 g, male) were prepared for the experiment.
- PEP1 synthesized by the method according to Example 1 and saline as a control group were prepared.
- PEP1 was prepared by setting the basic 10mg / ml concentration in 1 solution unit.
- Control group and concentration-specific PEP1 administration group was prepared by dividing into the following experimental group.
- Intraperitoneal injection at a dose of 0.1 ml / 10 g mouse weight at a time in each concentration of the experimental group. Injections were made twice daily (9 am and 5 pm) for 7 days.
- C57 / BL6 mice (5 weeks old, 15-25 g, female) were administered kanamycin (1000 mg / kg) by intraperitoneal administration with an ototoxicity animal model and furosemide (100 mg / kg) within 30 minutes. kg) was prepared by injection.
- the experiment name was designated as D1 (see FIG. 10).
- Experimental group 1 8 toxic animal models subcutaneous injection subcutaneously injected with PEP1 (10 mg / kg) at 1, 2, and 3 days after kanamycin and furosemide
- Experimental group 2 8 toxic animal models subcutaneously administered dexamethasone (15 mg / kg) at 1, 2, and 3 days after kanamycin and furosemide
- Control 1 Eight toxic animal models administered saline each 1, 2, and 3 days after kanamycin and furosemide
- Experimental Group 3 Eight Toxicity Animal Models Subcutaneous Injection Subcutaneously Injected with PEP1 (10mg / kg) at Days 3, 4 and 5 After Kanamycin and Furosemide Administration
- Experimental group 4 8 toxic animal models subcutaneously administered dexamethasone (15 mg / kg) at 3, 4 and 5 days after kanamycin and furosemide
- Control 2 Eight toxic animal models with saline at 3, 4 and 5 days after kanamycin and furosemide
- Auditory brainstem test was performed before kanamycin and furosemide (Day 0), 7 days after dosing, and 14 days after dosing (same tests were conducted for both Experiments D1 and D3).
- the stimulus was given a stimulus of 8 kHz, 16 kHz, and 32 kHz, and the threshold value was determined as the smallest stimulus intensity of 5 waveforms in the ABR.
- Basal hearing was measured in all groups prior to the start of drug administration, and was performed after anesthesia by intraperitoneal injection of isoprene (isoflorane).
- mice After 14 days of kanamycin and furosemide, mice were euthanized after the auditory brainstem test, and then otic capsules were harvested and the degree of hair cells damage was observed by confocal scanning microscopy. .
- Hearing threshold measured by auditory brainsensor test and hair group values measured by histological examination were statistically processed to confirm the significance. ANOVA test was used here.
- experiment D3 the hearing change according to the frequency of administration was observed, and experimental group 3, which was administered with PEP1, was measured 14 days after kanamycin and furosemide compared to experimental group 2, which was treated with saline and dexamethasone.
- Experiment D1 saline was observed from viability of basal, mid, and apex of the cochlea by histological examination on day 14 after kanamycin and furosemide administration.
- control group 1 administered overall damage of the hair cells was observed in the base, middle, and attachment of the cochlea, and normal hair cells were observed in the experimental group 1 administered with PEP1 and the experimental group 2 administered with dexamethasone (see FIG. 14).
- experiment D3 the viability of hair cells in basal, middle, and attachment of the cochlea was examined by histological examination performed on day 14 after kanamycin and furosemide. The overall damage of the hair cells was observed in, and normal hair cells were observed in the experimental group 3 administered with PEP1 and the experimental group 4 administered with dexamethasone (see FIG. 15).
- experiment D1 the quantitative analysis of hair cell survival rate showed that the percentage of normal hair cells in experimental group 1, which was treated with PEP1 at the base and middle part of the cochlea, was higher than that of control group 1, which was treated with saline.
- the ratio of normal hair cells in experimental group 1 to which PEP1 was administered tended to be higher than that of experimental group 2 to which dexamethasone was administered (see FIG. 16).
- experiment D3 the quantitative analysis of hair cell survival rate showed that the percentage of normal hair cells in experimental group 3, which was treated with PEP1 at the base and middle part of the cochlea, was higher than that of control group 2, which was treated with saline.
- the ratio of normal hair cells in the experimental group 3 to which PEP1 was administered showed a higher tendency than the experimental group 4 to which dexamethasone was administered (see FIG. 17).
- PEP1 prevents damage to organs and tissues for hearing and hearing from drugs causing hearing impairment. PEP1 prevents hearing damage, but does not show toxicity to hearing organs following administration. In addition, the administration of PEP1 protects the hearing from the toxic hearing damage caused by the administration of two or more substances showing the toxicity through the experiment in Example 4, in particular, dexamethasone known as a conventional hearing damage improvement agent Compared to the case of administration, it can be seen that administration of PEP1 has a better prevention and improvement of hearing damage symptoms.
- the composition containing PEP1 is not toxic by administration while preventing and improving hearing damage, and can be used to treat and prevent hearing damage as a more effective and safe pharmaceutical composition for the treatment and prevention of hearing damage. It can be seen.
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Abstract
본 발명은 청력 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 텔로머라제로부터 유래된 펩타이드를 포함하는 조성물로서 이독성 약물에 의한 청력 손상의 치료 및 예방에 효과적인 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 서열번호의 서열을 갖는 펩티드 또는 상기 서열과 80%의 상동성을 갖는 서열을 갖는 펩티드 또는 단편인 펩티드는 이독성 약물에 의한 청력 손상 및 예방에 우수한 효과를 가진다.
Description
본 발명은 청력 손상 방어 효능을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 텔로머라제로부터 유래된 펩티드로서, 이독성 약물에 의한 청력 손상 방어 효능을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 청력 손상 방어용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
귀의 해부학적 구조는 외이, 중이 및 내이로 세부 구분되며, 내이는 청각을 위한 와우 (cochlea)와 평형감각을 위한 전정 (vestibule) 및 삼반규반 (semicircular canals)으로 구성되고, 여기에 청신경이 연결된 구조이다.
청력 손상은 외이, 중이 또는 내이 중 하나 또는 다수의 부분에 손상이 생긴 결과이다. 청력 손상에는 네 가지 유형이 있다. 첫 번째 가장 흔한 유형은 감각신경성 청력손실로써 내이를 구성하고 있는 와우 내의 청각세포(유모 세포, hair cell)가 손실 또는 손상된 결과로 발생한다. 두 번째, 전음성 청력상실은 외이나 중이에 문제가 있어서 소리가 적합하게 내이로 전도되지 못하는 경우이다. 세 번째, 혼합성 청력 손실은 감각신경성 및 전음성 청력 손실이 복합된 경우이다. 마지막으로, 신경성 청력손실은 청신경이 뇌에 소리 신호를 전달할 수 없는 경우에 발생한다.
이독성이란 치료제 혹은 화학물질로 인하여 내이, 즉 청력 및 전정기능의 말초기관과 신경조직의 기능장애 및 조직세포의 퇴행성 변화가 오는 현상을 가리키는 용어이다.
아미노글리코사이드 항생제와 백금계 항암제는 반복적인 투여에 의해 신장과 내이에 치명적인 독성을 보이는데 대개의 경우 신독성은 가역적인 경우가 많지만 이독성은 영구적으로 나타난다. 효과면에서 탁월한 약물들이 이러한 독성 때문에 약물처방으로 인한 효과가 아미노글리코사이드 항생제와 백금계 항암제의 부작용을 감수할 만큼 심각하지 않다면 일차적으로 처방되지 못하고 있다. 이독성약물에 의한 세포사멸의 기전이 조금씩 밝혀지며 ROS의 중화, 세포사멸 효소의 억제, 항염, 향신경물질 처치 등의 방법으로 유모세포를 보호하여 청력저하를 방지하기 위한 시도와 연구가 이어져 왔으나 약물자체의 독성과 내이까지 전달방법의 어려움으로 임상적용은 미미한 실정이다. 아미노글리코사이드 항생제의 이독성은 약물이 내이에 흡수되고 내이 유모세포에 축적되며 진행된다.
푸로세미드(furosemide)는 이뇨작용을 촉진하는 이뇨제의 일종으로 울혈성 심부전, 신성부종, 간성부종, 고혈압 환자 등에게 사용된다. 강력한 이뇨작용을 보이며, 임신 중독증, 복수, 말초 혈관성 부종에도 사용되지만, 다량 투여 또는 장기 투여시 전해질 불균형, 급성 저혈압을 일으키는 것이 보고되었다. 이에 더하여, 푸로세미드는 청각장애, 이명 또는 난청을 일으키는 것으로도 보고되어 있다.
추가적으로 이독성을 발생시킬 수 있는 몇 가지 위험인자들이 알려져 있다. 일반적으로 이독성 약제의 투여용량이 많을수록 사용기간이 길어질수록 이독성의 가능성은 높아지나 환자의 연령(특히 65세 이상의 고령), 같이 투여하고 있는 이독성 약제, 과거 이독성 약제의 사용여부, 과거 소음 노출 여부, 기존의 청각 및 평형질환, 신기능저하, 간기능, 발열, 저혈량증, 균혈증 등도 이독성의 정도에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
이에 본 연구에서는 이독성 유발 동물 모델에서 텔로머라제 유래 펩타이드의 유효성과 안전성을 평가하였다. 실험을 통하여 텔로머라제 유래 펩타이드의 이독성에 대한 청력 및 내이 손상 방지 효과를 입증하였으며, 이는 내이 손상이 이독성 약물, 소음, 저산소증과 같은 스트레스에 의해 이루어지고 유모세포 손상의 최종 기전은 활성 산소에 의한 세포사멸이므로 텔로머라제 유래 펩타이드가 내이 손상에 대한 보호뿐 아니라 손상된 내이의 회복에도 효과가 있을 수 있어, 손상된 내이 회복 및 치료에도 적용이 가능하여 부작용 없는 청력 손상 치료에 큰 도움이 될 것으로 기대할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 측면에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 포함하는 청력 손상 치료 및 예방용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물에 있어서, 상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물에 있어서, 상기 청력 손상은 이독성 약물의 투여 또는 이독성 약물 치료에 의한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물에 있어서, 상기 이독성 약물은 살리실산염, 비스테로이드성 소염제, 항생제, 이뇨제, 화학치료제, 퀴닌, 점막보호제, 항암제를 포함하여 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 약물인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물에 있어서, 상기 항생제는 아미노글리코사이드계 항생제이며, 상기 항암제는 백금계 항암제인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물에 있어서, 상기 아미노글리코사이드계 항생제는 카나마이신이며, 상기 백금계 항암제는 시스플라틴 또는 카보플라틴인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물에 있어서, 상기 이뇨제는 푸로세미드인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면에 따른 조성물에 있어서, 상기 청력 손상은 내이의 말초기관 및 신경조직의 퇴행성 변화에 따른 난청 및 이명현상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면에 따르면, 상기 조성물은 약학 조성물을 제공하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면에 따르면, 상기 조성물은 식품 조성물을 제공하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면에 따르면, 상기 청력 손상 치료 및 예방용 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 청력 손상 의 치료 및 예방방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면에 따르면, 상기 청력 손상 치료 및 예방용 조성물; 및 설명서를 포함하는 청력 손상의 치료 및 예방용 키트가 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면에 따른 키트에 있어서, 상기 설명서는 상기 청력 손상 치료 및 예방용 조성물을 투여하는 내용을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면에 따르면, 청력 손상에 있어, 상기 청력 손상 치료 및 예방용 조성물을 제조하기 위한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드의 용도가 제공될 수 있다.
본 발명에 따르면 효과적으로 청력 손상 보호가 가능한 조성물이 제공될 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 조성물은 청력 손상 치료 및 예방에 적용될 수 있고, 특히 이독성 약물로 인한 청력 손상의 치료를 위하여 사용될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 서열번호 1의 서열을 갖는 펩티드(PEP1) 또는 상기 서열과 80%의 상동성을 갖는 서열을 갖는 펩티드 또는 단편인 펩티드는 청력 손상 치료 및 예방 효능을 가진다.
도 1 은 카나마이신을 투여한 이독성 동물 모델의 와우 조직의 첨부(Apical turn), 중간부(Middle turn), 기저부(Basal turn)에서 유모세포의 사진이다.
도 2 는 카나마이신과 PEP1을 함께 투여한 동물 모델의 와우 조직의 첨부, 중간부, 기저부에서 유모세포의 사진이다.
도 3 은 카나마이신을 투여한 군과, 카나마이신과 PEP1을 함께 투여한 군의 첨부, 중간부, 기저부별 유모세포수를 계수(count)하여 비율로 나타낸 것을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 4 는 카나마이신을 투여한 이독성 동물 모델에서 동결절편으로 얻은 와우와 팽대부 조직의 H&E 염색 사진이다.
도 5 는 카나마이신과 PEP1을 함께 투여한 동물 모델에서 동결절편으로 얻은 와우와 팽대부 조직의 H&E 염색 사진이다.
도 6 은 카나마이신을 투여한 군과, 카나마이신 및 농도별 PEP1을 함께 투여한 군의 각각의 주파수대별 청성뇌간반응검사(ABR)를 통한 청력 소실 정도를 나타낸 그래프이다.
도 7 은 PEP1을 투여하지 않은 대조군 및 농도별 PEP1을 하루 2번, 매일 2주간 처치한 군들의 와우 조직의 유모세포 사진이다.
도 8 은 PEP1을 투여하지 않은 대조군에서 동결절편으로 얻은 와우와 팽대부 조직의 H&E 염색 사진이다.
도 9 는 PEP1을 농도별로 투여한 각 실험군에서 동결절편으로 얻은 와우와 팽대부 조직의 H&E 염색 사진이다.
도 10은 이독성 약물인 카나마이신 및 푸로세마이드를 투여한 이독성 동물모델을 가지고 실험 D1 및 D3 일정으로 진행한 실험의 약물 투여 및 청성뇌간반응검사의 일정을 나타낸 프로토콜 그래프이다.
도 11은 실험 D1의 일정에 따라 이독성 동물 모델에 PEP1을 투여한 실험군 1, 덱사메타손(dexamethasone)을 투여한 실험군 2 및 식염수를 투여한 대조군 1의 주파수별 청력변화를 이독성 약물 투여 전, 약물 투여 후 7일, 약물 투여 후 14일에 청성뇌간반응검사로 측정한 값을 나타낸 그래프이다.
도 12는 실험 D3의 일정에 따라 이독성 동물 모델에 PEP1을 투여한 실험군 3, 덱사메타손을 투여한 실험군 4 및 식염수를 투여한 대조군 2의 주파수별 청력변화를 이독성 약물 투여 전, 약물 투여 후 7일, 약물 투여 후 14일에 청성뇌간반응검사로 측정한 값을 나타낸 그래프이다.
도 13은 실험 D1 및 D3의 일정에 따라 이독성 동물 모델에 PEP1을 투여한 실험군 1 및 실험군 3의 주파수별 청력변화를 이독성 약물 투여 전, 약물 투여 후 7일, 약물 투여 후 14일에 청성뇌간반응검사로 측정하여 비교한 값을 나타낸 그래프이다.
도 14는 실험 D1의 일정에 따라 이독성 동물 모델에 PEP1을 투여한 실험군 1, 덱사메타손을 투여한 실험군 2 및 식염수를 투여한 대조군 1의 조직검사를 수행하여 와우의 기저부(Basal), 중간부(Mid), 첨부(Apex)의 유모세포 생존력(viability)을 공초점 스캔 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 15는 실험 D3의 일정에 따라 이독성 동물 모델에 PEP1을 투여한 실험군 3, 덱사메타손을 투여한 실험군 4 및 식염수를 투여한 대조군 2의 조직검사를 수행하여 와우의 기저부, 중간부, 첨부의 유모세포 생존력을 공초점 스캔 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 16은 실험 D1의 일정에 따라 이독성 동물 모델에 PEP1을 투여한 실험군 1, 덱사메타손을 투여한 실험군 2 및 식염수를 투여한 대조군 1의 조직검사를 수행하여 와우의 기저부, 중간부, 첨부의 정상유모세포 비율을 정량적으로 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 17은 실험 D3의 일정에 따라 이독성 동물 모델에 PEP1을 투여한 실험군 3, 덱사메타손을 투여한 실험군 4 및 식염수를 투여한 대조군 2의 조직검사를 수행하여 와우의 기저부, 중간부, 첨부의 정상유모세포 비율을 정량적으로 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 18은 실험 D1 및 D3의 일정에 따라 이독성 동물 모델에 PEP1을 투여한 실험군 1 및 실험군 3의 조직검사를 수행하여 와우의 기저부, 중간부, 첨부의 정상유모세포 비율을 정량적으로 비교 분석하여 나타낸 그래프이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
텔로미어(telomere)는 염색체의 말단에 반복적으로 존재하는 유전 물질로서, 해당 염색체의 손상이나 다른 염색체와의 결합을 방지한다고 알려져 있다. 세포가 분열할 때마다 텔로미어의 길이는 조금씩 짧아지는데, 일정한 횟수 이상의 세포 분열이 있게 되면 텔로미어는 매우 짧아지고, 그 세포는 분열을 멈추고 죽게 된다. 반면 텔로미어를 길게 하면 세포의 수명이 연장된다고 알려져 있으며, 그 예로 암세포에서는 텔로머라제(telomerase)라는 효소가 분비되어 텔로미어가 짧아지는 것을 막기 때문에, 암세포가 죽지 않고 계속 증식할 수 있다고 알려져 있다. 본 발명자들은 텔로머라제로부터 유래되는 펩티드가 혈관신생 억제에 효과적임을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 명세서에 개시된 펩티드는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 펩티드는, 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그 단편들과 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산 또는 7개 이상의 아미노산이 변화된 펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 아미노산 변화는 펩티드의 물리화학적 특성이 변경되도록 하는 성질에 속한다. 예를 들어, 펩티드의 열안정성을 향상시키고, 기질 특이성을 변경시키고, 최적의 pH를 변화시키는 등의 아미노산 변화가 수행될 수 있다.
또한 본 발명의 일 측면에 따른 서열 번호 1의 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 세포 내 독성이 낮고, 생체 내 안정성이 높다는 장점을 가진다. 본 발명에서의 서열번호 1은 텔로머라제 유래 펩티드로서 하기와 같이 16개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다.
서열 번호 1에 기재된 펩티드는 아래 표 1과 같다. 아래 표 1의 "이름"은 펩티드를 구별하기 위해 명명한 것이다. 본 발명의 일 측면에서, 서열 번호 1에 기재된 펩티드는 인간 텔로머라제의 전체 펩티드를 나타낸다. 본 발명의 다른 일 측면에서, 서열 번호 1의 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 텔로머라제에 포함된 펩티드 중 해당 위치의 펩티드를 선별해 합성한 "합성 펩티드"를 포함한다. 서열번호 2는 전체 텔로머라제의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
본 발명의 실험에서 사용된 카나마이신(kanamycin)은 아미노글리코사이드계 항생제이다. 아미노글리코사이드는 투여량의 3%만이 위장에서 흡수되므로 주사로 투여되며, 투여된 약물은 대부분이 신장의 사구체 여과를 거쳐 소변으로 배설되고, 신부전시에는 배설이 감소되고 내이의 외림프액 내에 과다하게 축적되어 신독성과 같이 이독성이 유발되기 쉽다. 카나마이신은 상세히는 네오마이신(neomycin), 아미카신(amikacin), 시소마이신(sisomycin), 리보도마이신(livodomycin)들과 함께 초기에 와우 기저 회전부의 외유모세포를 파괴하고 투여가 계속됨에 따라 첨단부로 파괴부위를 확대하는 와우 독성 제재이다.
본 발명의 실험에서 사용된 푸로세미드(furosemide)는 이뇨제로서 몸안에 불필요하게 축적된 수분과 염을 제거하여 고혈압이나 부종을 치료할 때 사용한다. 푸로세미드는 고용량의 사용, 저단백혈증 등이 있는 경우, 다른 이독성 약물과의 병용의 경우에 이명, 청각 손상, 난청 사례가 보고되었다.
본 발명의 실험에서 사용된 덱사메타손(dexamethasone)은 합성 코르티코스테로이드(corticosteroid)제로서, 항염제, 면역억제제로 사용된다. 다양한 염증질환의 치료 및 면역억제제로 사용되며, 이명, 청력손상, 전정기관 이상증세에도 효과를 나타낸다. 그러나, 과도한 투여시 면역 작용을 과하게 억제하며, 눈 또는 귀의 진균감염 질환 환자에게는 심각한 부작용을 나타내는 것이 보고되어 있다.
본 발명의 실험에서 청력 손상을 알아보기 위하여 사용된 청성뇌간반응검사(ABR, Auditory brainstem response)는 소리 자극에 의해 얻을 수 있는 뇌의 중추부로부터 나오는 뇌파를 평균 가산하여 청력의 역치값을 판정하는 정밀청력검사이다. 역치값이 증가할수록 청력이 손상됨을 의미한다.
본 발명의 일 측면에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 청력 손실 치료 효능을 가지는 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따른 청력 손실 치료 효능 조성물은 일 측면에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 0.01g/L 내지 1kg/L, 구체적으로 0.1g/L 내지 100g/L, 더 구체적으로 1g/L 내지 10g/L의 함량으로 포함할 수 있으나 용량에 따른 효과의 차이를 보이는 경우 이를 적절히 조절할 수 있다. 상기 범위 또는 그 이하의 범위로 포함하는 경우 본 발명의 의도한 효과를 나타내기에 적절할 뿐만 아니라, 조성물의 안정성 및 안전성을 모두 만족할 수 있으며, 비용 대비 효과의 측면에서도 상기 범위로 포함하는 것이 적절할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 인간, 개, 닭, 돼지, 소, 양, 기니아피그 또는 원숭이를 포함하는 모든 동물에 적용될 수 있다.
본 발명의 일 측면에서 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 측면에 따른 약학 조성물은 경구, 직장, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내 또는 피하 등으로 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면에 따른 약학 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 측면에 따른 약학 조성물은 당업계의 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 약학 조성물의 유효 성분은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 10ng/kg/일 내지 100g/kg/일, 구체적으로는 0.1㎍/kg/일 내지 10g/kg/일, 더 구체적으로는 1㎍/kg/일 내지 1g/kg/일, 보다 더 구체적으로는 2㎍/kg/일 내지 100mg/kg/일이 될 수 있으나, 용량에 따른 효과의 차이를 보이는 경우 이를 적절히 조절할 수 있다. 본 발명의 일 측면에 따른 약학 조성물은 1일 1회 내지 3회 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면에서 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따른 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 액제, 고형 제제 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어들은 특정 구체예들을 설명하기 위한 목적으로만 의도된 것이지 본 발명을 한정하고자 하는 의도가 아니다. 명사 앞에 개수가 생략된 용어는 수량을 제한하고자 하는 것이 아니라 언급된 명사 물품이 하나 이상 존재하는 것을 나타내는 것이다. 용어 "포함하는", "갖는", 및 "함유하는"은 열린 용어로 해석된다(즉, "포함하지만 이에 한정되지는 않는"의 의미).
수치의 범위를 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 수치들을 개별적으로 언급하는 것을 대신하는 쉬운 방법이기 때문이며, 그것이 아님이 명시되어 있지 않는, 각 별개의 수치는 마치 개별적으로 명세서에 언급되어 있는 것처럼 본 명세서에 통합된다. 모든 범위의 끝 값들은 그 범위 내에 포함되며 독립적으로 조합 가능하다.
본 명세서에 언급된 모든 방법들은 달리 명시되어 있거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 적절한 순서로 수행될 수 있다. 어느 한 실시예 및 모든 실시예 또는 예시적 언어 (예컨대, "~과 같은")를 사용하는 것은, 청구범위에 포함되어 있지 않는 한, 단지 본 발명을 더 잘 기술하기 위함이지 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 명세서의 어떤 언어도 어떤 비청구된 구성요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 해석되어서는 아니된다. 다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용되는 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 사람에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
본 발명의 바람직한 구체예들은 본 발명을 수행하기 위해 발명자에게 알려진 가장 최적의 모드를 포함한다. 바람직한 구체예들의 변이들이 앞선 기재를 읽으면 당업자에게 명백하게 될 수 있다. 본 발명자들은 당업자들이 그러한 변이를 적절히 이용하길 기대하고, 발명자들은 본 명세서에 기재된 것과 다른 방식으로 본 발명이 실시되기를 기대한다. 따라서, 본 발명은, 특허법에 의해 허용되는 것과 같이, 첨부된 특허청구범위에서 언급된 발명의 요지의 균등물 및 모든 변형들을 포함한다. 더욱이, 모든 가능한 변이들 내에서 상기 언급된 구성요소들의 어떤 조합이라도 여기서 반대로 명시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 예시적인 구체예들을 참조하여 구체적으로 나타내어지고 기술되었지만, 당업자들은 하기 청구범위에 의해 정의되는 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서도 형태 및 디테일에서 다양한 변화가 행해질 수 있음을 잘 이해할 것이다 .
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 펩티드의 합성
서열번호 1의 펩티드(이하 "PEP 1"이라 함)를 종래에 알려진 고상 펩티드 합성법에 따라 제조하였다. 구체적으로, 펩티드들은 ASP48S(Peptron, Inc., 대한민국 대전)를 이용하여 Fmoc 고상 합성법(solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통해 C-말단부터 아미노산 하나씩 커플링함으로써 합성하였다. 다음과 같이, 펩티드들의 C-말단의 첫번째 아미노산이 수지에 부착된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:
NH2-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin
NH2-Ala-2-chloro-Trityl Resin
NH2-Arg(Pbf)-2-chloro-Trityl Resin
펩티드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-term이 Fmoc으로 보호(protection)되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu (t-butylester), Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyl dihydro-benzofuran-5-sulfonyl) 등으로 보호된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, Trt-Mercaptoacetic acid.
커플링 시약(Coupling reagent)으로는 HBTU[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate] / HOBt [N-Hydroxxybenzotriazole] /NMM [4-Methylmorpholine] 를 사용하였다. Fmoc 제거는 20%의 DMF 중 피페리딘(piperidine in DMF)을 이용하였다. 합성된 펩티드를 Resin에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) [TFA (trifluoroacetic acid) /TIS (triisopropylsilane) / EDT (ethanedithiol) / H2O=92.5/2.5/2.5/2.5] 를 사용하였다.
아미노산 보호기가 결합된 출발 아미노산이 고상 지지체에 결합되어 있는 상태를 이용하여 여기에 해당 아미노산들을 각각 반응시키고 용매로 세척한 후 탈보호하는 과정을 반복함으로써 각 펩티드를 합성하였다. 합성된 펩티드를 수지로부터 끊어낸 후 HPLC로 정제하고, 합성 여부를 MS로 확인하고 동결 건조하였다.
본 실시예에 사용된 펩티드에 대해 고성능 액체 크로마토그래피 결과, 모든 펩티드의 순도는 95% 이상이었다.
펩티드 PEP 1 제조에 관한 구체적인 과정을 설명하면 다음과 같다.
1) 커플링
NH2-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin 에 보호된 아미노산(8당량)와 커플링 시약 HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량) 을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
2) Fmoc 탈보호
20%의 DMF 중의 피페리딘(piperidine in DMF) 을 가하고 상온에서 5분 간 2회 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
3) 1과 2의 반응을 반복적으로 하여 펩티드 기본 골격 NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-chloro-Trityl Resin)을 만들었다.
4) 절단(Cleavage): 합성이 완료된 펩티드 Resin에 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) 을 가하여 펩티드를 Resin에서 분리하였다.
5) 얻어진 mixture에 Cooling diethyl ether를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 펩티드를 침전시킨다.
6) Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 powder로 제조하였다.
실시예 2: 이독성 약물에 의한 청력 손상에 대한 PEP1의 효능 확인
실험 동물 및 주사제 준비
실험을 위하여C57/BL6 생쥐를 (4주-6주령, 몸무게 15-25g, 수컷) 준비하였다. 이독성 약물로 카나마이신 설페이트(sulfate) 형태의 카나마이신을 40mg/ml의 농도로 식염수 용액에 용해하여 800mg/kg 주사 투여용 제제로 준비하고, 실시예 1에 따른 방법으로 합성된 펩타이드인 PEP1은 10ml PBS 당 100mg의 농도로 용해하여 주사 투여용 제제로 준비하였다.
이독성 약물 투여 및 이독성 약물과 PEP1 투여 실험군의 분류
이독성 약물인 카나마이신과 본 발명에 따른 펩티드인 PEP1을 다음과 같이 실험군을 나누어 준비된 실험 동물에 투여하였다.
실험군 1: 카나마이신 800 mg/kg S.C. (피하주사) + 식염수 (saline) 0.1 ml/10g 마우스 I.P. (복강주사)
실험군 2: 카나마이신 800 mg/kg S.C. + PEP1 10mg/kg I.P.
상기 실험군별로 각각의 투여량을 하루 2회 14일간 주사하였다.
조직 검사
실험을 시작한지 3주째에 마우스를 안락사 시킨 후 혈액을 채취하고 0.1M 인산염 완충 식염수 (phosphate buffered saline)로 희석한 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde, pH 7.4)를 이용하여 관류고정하고 장기(측두골)를 채취하였다.
와우와 전정의 전반적인 구조를 보기 위해 4℃에서 24시간동안 4% 파라포름알데히드(pH 7.4)에 고정시킨 후, 0.135M EDTA에 3일 동안 두어 탈회(decalcification)을 시켰다. 동결 포매제 (Optimal cutting temperature compound, OCT compound)를 이용하여 조직 블록을 만든 후 -80℃에 보관 후 슬라이드를 만들어서 H&E 염색하였다.
좌측 측두골은 정량분석을 위해 와우의 전량(whole mount)을 준비한다. 미세기구 및 현미경을 이용하여 와우의 골성미로 (bony labyrinth)를 막성 미로 (membraneous labyrinth)로부터 조심스럽게 분리하고 첨부와 기저부를 분리한다. 각각 혈관조가 있는 측벽과 와우가 있는 기저막 부분으로 분리한 후 4% 파라포름알데히드로 고정시킨다. 0.3% 트리톤-X (Triton-X)로 1시간 동안 반응시킨 후 알렉사 488 팔로이딘 (Alexa 488 phalloidin) 및 1% 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA)을 준비한다. 메탄올로 용해된 알렉사 488 팔로이딘과 1% 소혈청알부민을 1:100이 되도록 섞는다. 이를 조직에 분주하고 셰이커 (shaker) 에서 한 시간 동안 반응시킨 다음 세척 후 4% 파라포름알데히드로 고정시킨다. 슬라이드 글라스에 벡터 (vector)를 한 방울 떨어뜨리고 분리한 조직을 분주 하여 얹은(mount) 후에 커버 글라스로 고정시킨다. 대조군과 실험군의 모든 와우 조직과 신장 조직은 같은 강도의 조건 하에서 공초점 현미경으로 관찰하였다.
청성뇌간반응검사 실시
주사 전, 주사 후 1주, 주사 후 2주, 주사 후 3주에 청성뇌간반응검사를 실시하였다. 청각의 평가를 위해 자극으로 4kHz, 8kHz, 16kHz, 32kHz 음 자극을 주고 청성뇌간반응 (ABR) 에서 5번 파형이 나타나는 가장 작은 자극 강도를 역치로 판정하였다. 약물 투여 시작 전 모든 군에서 기저청력을 측정하였으며, 측정시 이소프로렌 (isoflorane)을 복강 내 주사하여 마취 후 시행하였다.
통계 처리
청성뇌간반응검사 역치를 각 주파수 별로 합산, 실험군 1과 실험군 2에서의 청력 역치를 만-휘트니 테스트 (Mann-Whitney test)를 이용하여 통계적 유의성을 확인하였다.
기저부, 중간부, 첨부의 와우 부위별로 손상되지 않은 유모세포의 개수를 합산, 실험군 1과 실험군 2에서의 유모세포 개수를 만-휘트니 테스트를 이용하여 통계적 유의성을 확인하였다.
조직 검사 결과 분석
조직 검사를 통하여 와우의 기저부, 중간부, 첨부에서 유모세포를 관찰한 결과 실험군 1에서는 모든 부위에서 유모세포의 전반적인 손상이 관찰되었다 (도 1 참조). 이와 대조적으로 실험군 2 에서는 모든 부위에서 유모세포의 손상이 관찰되지 않았다 (도 2 참조).
또한 조직 검사에서 유모세포 계수를 한 결과 와우의 중간부와 기저부에서 실험군 1보다 실험군 2에서 통계적으로 유의하게 (*는 p<0.001) 더 많은 유모세포를 확인할 수 있었다 (도 3 참조).
또한 조직 검사에서 동결 절편으로 얻은 와우와 팽대부 조직의 H&E 염색 결과 실험군 1에서는 와우의 유모세포가 손실되어 있었고, 팽대부의 정상감각상피는 없어지고 공포형성(vacuolization)이 많이 일어난 것이 관찰되었다 (도 4 참조). 이와 대조적으로 실험군 2에서는 와우의 정상유모세포와 팽대부의 정상감각상피가 보존되어 있음이 관찰되었다 (도 5 참조).
청성뇌간반응검사 결과 분석
청성뇌간반응검사를 통하여 약물 투여 후 시간이 지남에 따라 청력의 변화를 관찰한 결과 실험군 1에서는 시간이 지남에 따라 역치값이 증가하였으나, 실험군 2에서는 시간이 지나도 역치값의 변화가 미미하게 나타남을 보였다 (도 6 참조). 두 군간의 결과 차이는 통계적으로 유의하였다 (*는 p<0.001).
실시예 3: PEP1의 투여에 따른 이독성 청력 손상 여부 확인
실험 동물, 주사제의 실험군별 준비
실험을 위하여 C57/BL6 생쥐를 (4주-6주령, 몸무게 15-25g, 수컷) 준비하였다. PEP1을 농도별로 투여하기 위하여 실시예 1에 따른 방법으로 합성된 PEP1과 대조군인 식염수를 준비하였다. PEP1은 기본 10mg/ml 농도를 1용액단위로 설정하여 준비하였다. 대조군 및 농도별 PEP1 투여군은 아래의 실험군으로 나누어 준비하였다.
실험군 3: 대조군으로서, 식염수 투여 (생리식염수 10ml)
실험군 4: PEP1농도 0.1mg/kg 로 투여 (1용액단위 1ml + PBS 9ml)
실험군 5: PEP1농도 1mg/kg 로 투여 (10용액단위 1ml + PBS 9ml)
실험군 6: PEP1농도 10mg/kg 로 투여 (100용액단위 1ml + PBS 9ml)
실험군 7: PEP1농도 100mg/kg 로 투여 (PEP1 100mg + PBS 10ml)
상기 실험군 각각의 농도로 1회에 0.1ml/10g 마우스 중량의 투여량으로 복강주사(I.P.)하였다. 하루 2회 (오전 9시 및 오후 5시) 7일간 주사하였다.
조직 검사
실험 시작일로부터 2주 뒤에 동물들을 안락사시키고 실시예 2에서와 같은 방법으로 조직 검사를 위한 샘플 채취를 실시하였다.
조직 검사 결과 분석
조직 검사를 통하여 와우의 기저부, 중간부, 첨부에서 유모세포를 관찰한 결과 모든 실험군에서 와우의 유모세포 손상은 관찰되지 않았다 (도 7참조).
또한 조직 검사에서 동결 절편으로 얻은 와우와 팽대부 조직을 H&E 염색한 것을 관찰한 결과 대조군인 실험군 2는 와우의 유모세포와 혈관저, 팽대부의 유모세포가 모두 정상소견을 보였다 (도 8 참조). 농도별 PEP1을 처리한 실험군 4 내지 7에서도 와우 조직을 관찰한 결과 와우 구조의 손상이 관찰되지 않았다 (도 9 참조).
실시예 4: 두가지 이독성 약물에 의한 청력 손상에 대한 PEP1의 효능 확인 및 기존 약물과의 비교
실험 동물 모델 준비
실험을 위하여, 이독성(ototoxicity) 동물모델로 C57/BL6 생쥐 (5주령, 몸무게 15-25g, 암컷)에 복강내 투여로 카나마이신(1000mg/kg)을 투여하고 30분 이내로 푸로세미드(100mg/kg) 을 주사하여 준비하였다.
실험 대상 물질 투여 실험군 분류 및 준비, 반복실험
이독성 동물모델 24마리를 다음과 같이 실험군 및 대조군으로 분류하여 실험을 진행하였다. 실험명을 D1이라고 표기하였다(도10 참조).
실험군 1: 카나마이신 및 푸로세미드 투여 후 1, 2, 및 3일 차에 각각 PEP1(10mg/kg)을 피하투여한(subcutaneous injection) 이독성 동물모델 8마리
실험군 2: 카나마이신 및 푸로세미드 투여 후 1, 2, 및 3일 차에 각각 덱사메타손(15mg/kg)을 피하투여한 이독성 동물모델 8마리
대조군 1: 카나마이신 및 푸로세미드 투여 후 1, 2, 및 3일 차에 각각 식염수를 투여한 이독성 동물모델 8마리
추가로 이독성 동물모델에 이독성 약물을 투여하고 이독성이 진행되는 시간을 좀더 준 뒤에 실험 결과(즉, 실험 물질의 투여 시기별 효과차이)를 알아보기 위하여, 이독성 동물모델 24마리를 다음과 같이 실험군 및 대조군으로 분류하여 실험을 진행하였다. 실험명을 D3이라고 표기하였다(도10 참조)
실험군 3: 카나마이신 및 푸로세미드 투여 후 3, 4 및 5일 차에 각각 PEP1(10mg/kg)을 피하투여한(subcutaneous injection) 이독성 동물모델 8마리
실험군 4: 카나마이신 및 푸로세미드 투여 후 3, 4 및 5일 차에 각각 덱사메타손(15mg/kg)을 피하투여한 이독성 동물모델 8마리
대조군 2: 카나마이신 및 푸로세미드 투여 후 3, 4 및 5일 차에 각각 식염수를 투여한 이독성 동물모델 8마리
청성뇌간반응검사 실시
카나마이신 및 푸로세미드 투여 전(0일차), 투여 후7일차, 투여 후 14일차에 청성뇌간반응검사를 실시하였다(실험 D1과 D3 모두 동일하게 검사를 실시). 청각의 평가를 위해 자극으로 8kHz, 16kHz, 32kHz 음 자극을 주고 청성뇌간반응 (ABR) 에서 5번 파형이 나타나는 가장 작은 자극 강도를 역치로 판정하였다. 약물 투여 시작 전 모든 군에서 기저청력을 측정하였으며, 측정시 이소프로렌 (isoflorane)을 복강 내 주사하여 마취 후 시행하였다.
조직 검사
카나마이신 및 푸로세미드 투여 후 14일차에 청성뇌간반응검사를 마친 마우스를 안락사 시킨 후 이낭(otic capsule)을 수확하여 공초점 현미경(confocal scanning microscopy)으로 유모세포(hair cells)의 손상 정도를 관찰하였다.
통계 처리
청성뇌관반응검사에서 측정된 청력 역치값 및 조직검사에서 측정된 유모세포의 각 군별 값들은 통계적으로 처리하여 유의성을 확인하였다. 여기에 ANOVA 테스트가 사용되었다.
청성뇌간반응검사 결과 분석
실험 D1에서, 투여 약물에 따른 주파수별 청력변화를 관찰한 결과 PEP1을 투여한 실험군 1이 식염수를 투여한 대조군 1에 비해 카나마이신 및 푸로세미드 투여 후 14일차에 측정한 청력 역치값이 낮게 나타났으며, 특히 32kHz에서 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p=0.008, 도 11참조).
실험 D3에서, 투여 약물에 따른 주파수별 청력변화를 관찰한 결과 PEP1을 투여한 실험군 3이 식염수를 투여한 대조군 2 및 덱사메타손을 투여한 실험군 4에 비해 카나마이신 및 푸로세미드 투여 후 14일차에 측정한 청력 역치값이 낮게 나타났으며, 특히 8kHz 및 16kHz에서 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p=0.014, 도 12 참조)
실험 D1과 D3을 비교하여 PEP1의 투약시기에 따른 주파수별 청력변화를 관찰한 결과, 카나마이신 및 푸로세미드 투여 전, 투여 후 7일차, 투여 후 14일차에 각각 측정한 청력 역치값은 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 13 참조).
조직 검사 결과 분석
실험 D1에서, 카나마이신 및 푸로세미드 투여 후 14일차에 실시한 조직검사를 통하여 와우의 기저부(basal), 중간부(Mid), 첨부(apex)에서 유모세포의 생존력(viability)을 관찰한 결과 식염수를 투여한 대조군 1에서는 와우 기저부와 중간부, 첨부에서 유모세포의 전반적인 손상이 관찰되었으며, PEP1을 투여한 실험군 1 및 덱사메타손을 투여한 실험군 2에서는 정상적인 유모세포가 관찰되었다(도면 14 참조).
실험 D3에서, 카나마이신 및 푸로세미드 투여 후 14일차에 실시한 조직검사를 통하여 와우의 기저부, 중간부, 첨부에서 유모세포의 생존력을 관찰한 결과 식염수를 투여한 대조군 2에서는 와우 기저부와 중간부, 첨부에서 유모세포의 전반적인 손상이 관찰되었으며, PEP1을 투여한 실험군 3 및 덱사메타손을 투여한 실험군 4에서는 정상적인 유모세포가 관찰되었다(도면 15 참조).
실험 D1에서, 유모세포 생존율을 정량적으로 분석한 결과, 와우 기저부와 중간부, 첨부에서 PEP1을 투여한 실험군 1의 정상유모세포 비율이 식염수를 투여한 대조군 1에 비해 높은 경향을 보였으며 이러한 차이는 중간부와 기저부에서 통계적으로 유의하였다(p=0.006). 또한 PEP1을 투여한 실험군 1의 정상유모세포 비율은 덱사메타손을 투여한 실험군 2에 비하여도 높은 경향을 보였다(도 16 참조).
실험 D3에서, 유모세포 생존율을 정량적으로 분석한 결과, 와우 기저부와 중간부, 첨부에서 PEP1을 투여한 실험군 3의 정상유모세포 비율이 식염수를 투여한 대조군 2에 비해 높은 경향을 보였으며 이러한 차이는 중간부와 기저부에서 통계적으로 유의하였다(p=0.011). 또한 PEP1을 투여한 실험군 3의 정상유모세포 비율은 덱사메타손을 투여한 실험군 4에 비하여도 높은 경향을 보였다(도 17 참조).
실험 D1과 D3을 비교하여 PEP1의 투약시기에 따른 정상유모세포의 비율을 분석한 결과, 카나마이신 및 푸로세미드 투여 후 14일차에 실시한 조직검사에 따른 정상유모세포의 비율은 유의한 차이가 관찰되지 않았다(도 18 참조).
실시예들의 결과를 종합하면, 실시예 2에서의 실험을 통하여 PEP1이 청력 손상을 일으키는 약물로부터 청각 및 청각을 위한 관련 기관 및 조직의 손상을 방지하는 것을 알 수 있고, 실시예 3에서의 실험을 통하여 PEP1이 청력 손상을 방지하면서도 투여에 따른 청각 기관에 이독성이 나타나지 않아 안전한 것을 알 수 있다. 또한 실시예 4에서의 실험을 통하여 이독성을 나타내는 물질을 2개 이상 투여하였을 때 나타나는 이독성 청력손상으로부터 PEP1의 투여가 청력을 보호하는 기능을 나타내며, 특히 기존의 청력손상 증상 개선제로 알려진 덱사메타손을 투여할 경우에 비하여 PEP1을 투여할 때가 더 우수한 청력손상 증상 방지 및 개선효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
결론적으로, PEP1을 포함한 조성물은 청력 손상을 방지 및 개선하면서도 투여에 따른 독성이 없으며, 기존 약물에 비하여도 더 효과적이고 안전한 청력 손상 치료 및 예방용 약학적 조성물로서 청력 손상 치료 및 예방에 사용될 수 있음을 알 수 있다.
Claims (14)
- 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 포함하는 청력 손상 치료 및 예방용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편인 청력 손상 치료 및 예방용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 청력 손상은 이독성 약물의 투여 또는 이독성 약물 치료에 의한 것을 특징으로 하는 청력 손상 치료 및 예방용 조성물.
- 제 3 항에 있어서, 상기 이독성 약물은 살리실산염, 비스테로이드성 소염제, 항생제, 이뇨제, 화학치료제, 퀴닌, 점막보호제, 항암제를 포함하여 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 약물인 것을 특징으로 하는 청력 손상 치료 및 예방용 조성물.
- 제 4 항에 있어서, 상기 항생제는 아미노글리코사이드계 항생제이며, 상기 항암제는 백금계 항암제인 것을 특징으로 하는 청력 손상 치료 및 예방용 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 아미노글리코사이드계 항생제는 카나마이신이며, 상기 백금계 항암제는 시스플라틴 또는 카보플라틴인 것을 특징으로 하는 청력 손상 치료 및 예방용 조성물.
- 제 4 항에 있어서 상기 이뇨제는 푸로세미드인 것을 특징으로 하는 청력 손상 치료 및 예방용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 청력 손상은 내이의 말초기관 및 신경조직의 퇴행성 변화에 따른 난청 및 이명현상인 것을 특징으로 하는 청력 손상 치료 및 예방용 조성물.
- 제 1 내지 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 제약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함하는 약학 조성물인 청력 손상 치료 및 예방용 조성물.
- 제 1 내지 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물인 청력 손상 치료 및 예방용 조성물.
- 제 1 내지 8 항 중 어느 한 항에 따른 청력 손상 치료 및 예방용 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 청력 손상 치료 및 예방방법.
- 제 1 내지 8 항 중 어느 한 항에 따른 청력 손상 치료 및 예방용 조성물; 및 설명서를 포함하는 청력 손상의 치료 및 예방용 키트.
- 제 12 항에 있어서, 상기 설명서는 상기 청력 손상 치료 및 예방용 조성물을 투여하는 내용을 포함하는 청력 손상의 치료 및 예방용 키트.
- 청력 손상에 있어, 제 1항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 청력 손상 치료 및 예방용 조성물을 제조하기 위한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드의 용도.
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