WO2015170466A1 - 複室培養容器、及び細胞培養方法 - Google Patents

複室培養容器、及び細胞培養方法 Download PDF

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郷史 田中
貴彦 戸谷
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    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture technique, and more particularly to a cell culture vessel capable of culturing cells in a plurality of different culture environments and culture conditions.
  • JP 2007-175028 A Japanese Patent Laid-Open No. 2005-058103
  • lymphocytes When lymphocytes are cultured, the lymphocytes are generally activated by placing them in a flask on which an anti-CD3 antibody is immobilized, and then the activated lymphocytes are transferred to an amplification culture bag. The culture was performed.
  • an anti-CD3 antibody is immobilized on the inner surface of a culture bag made of a gas permeable film material to produce an activation culture bag, which is connected to the amplification culture bag.
  • a cell culture kit can be constructed, and lymphocytes can be cultured using an automatic cell culture apparatus.
  • the cost of such an activation culture bag is considerably higher than that of a flask, the replacement of the flask with the culture bag for activation could not be easily performed.
  • an object of the present invention is to provide a multi-chamber culture container capable of transferring cells cultured in a plurality of different culture environments and culture conditions by a simple operation, and a cell culture method using the same.
  • the multi-chamber culture container of the present invention is a multi-chamber culture container obtained by processing a gas-permeable material, and two or more culture chambers for culturing cells are formed.
  • Each culture chamber has at least one external connection for communicating with at least one other culture chamber and for communicating with the outside of the multi-chamber culture vessel.
  • the cell culture method of the present invention is a cell culture method using the above-described multi-chamber culture container, and an anti-CD3 antibody for activating lymphocytes is immobilized as the culture chamber in the multi-chamber culture container.
  • a phased activation culture chamber and an amplification culture chamber for amplifying the activated lymphocytes are formed, and the lymphocytes and the culture solution are injected into the activation culture chamber, and the activation culture chamber
  • the lymphocytes are activated, the activated lymphocytes and the culture solution are transferred from the activated culture chamber to the amplification culture chamber, and the lymphocytes are amplified in the amplification culture chamber.
  • the cell culture method of the present invention is a cell culture method using the above-described multi-chamber culture container, wherein leukocytes are separated into lymphocytes and adherent cells and adhered as the culture chamber in the multi-chamber culture container.
  • Adhesive cell culture chamber for culturing cell lines, an activated culture chamber on which an anti-CD3 antibody for activating lymphocytes is immobilized, and an amplification culture chamber for amplifying lymphocytes are formed
  • the leukocytes separated from the blood and the culture solution are injected into the adhesion-type cell culture chamber and allowed to stand, and the adhesion-type cells in the leukocytes are adhered to the bottom surface of the adhesion-type cell culture chamber, and then the adhesion-type cell culture chamber
  • the lymphocytes and the culture solution in the leukocytes are transferred from the leukocytes to the activated culture chamber to activate the lymphocytes in the activated culture chamber, and the adhesion cell culture chamber contains an inducer for dendritic cells
  • the multi-chamber culture container of the present embodiment is a multi-chamber culture container formed by processing a material having gas permeability, and two or more culture chambers for culturing cells are formed, and each culture chamber has at least It is characterized by comprising at least one external connection for communicating with one other culture chamber and communicating with the outside of the multi-chamber culture vessel.
  • the multi-chamber culture vessel 1 includes a culture chamber 11 and a culture chamber 12 as culture compartments for culturing cells.
  • the culture chamber 11 includes an external connection port 111 for communicating with the outside of the multi-chamber culture vessel 1, an inter-chamber connection port 112 for communicating with other culture chambers, and a sampling port 113 for performing sampling. It has been.
  • the external connection port 111 is connected to a culture solution supply container or the like via the tube 2 and is used for supplying the culture solution to the culture chamber 11.
  • the inter-chamber connection port 112 is connected to the inter-chamber connection port 122 of the culture chamber 12 via the tube 2 and is used to transfer the content liquid in the culture chamber 12 to the culture chamber 11.
  • the sampling port 113 is used for sampling the cells cultured in the culture chamber 11.
  • the culture chamber 12 is provided with an external connection port 121 for communicating with the outside of the multi-chamber culture vessel 1 and an inter-chamber connection port 122 for communicating with other culture chambers.
  • the external connection port 121 is connected to a cell supply container or the like via the tube 2 and is used for injecting cells into the culture chamber 12.
  • the inter-chamber connection port 122 is connected to the inter-chamber connection port 112 of the culture chamber 11 via the tube 2 and is used for transferring the content liquid in the culture chamber 12 to the culture chamber 11.
  • the multi-chamber culture vessel 1 As a material for forming the multi-chamber culture vessel 1, it is necessary to have gas permeability necessary for cell culture. Specifically, it preferably has an oxygen permeability of 5000 ml / m 2 ⁇ day ⁇ atm (37 ° C.-80% RH) or more. Moreover, it is preferable that culture container material has transparency so that the contents in the multi-chamber culture container 1 can be confirmed. Furthermore, it is preferable that the culture container material has low cytotoxicity, low dissolution property, and suitability for radiation sterilization in order to achieve high cell growth efficiency.
  • a polyethylene resin is preferable.
  • the polyethylene resin include polyethylene, ethylene / ⁇ -olefin copolymer, ethylene / vinyl acetate copolymer, ionomer using ethylene / acrylic acid / methacrylic acid copolymer and metal ion, and the like. it can. Further, polyolefin, styrene elastomer, polyester thermoplastic elastomer, silicone thermoplastic elastomer, silicone resin and the like can also be used.
  • the multi-chamber culture container 1 of the present embodiment can be manufactured by forming such a gas-permeable material into a sheet such as heat sealing, pressure forming, or vacuum forming.
  • the shape of the multi-chamber culture container 1 of this embodiment is not specifically limited, A substantially rectangular thing can be used suitably and the shape of each culture chamber formed in the inside is also made into a substantially rectangular shape. Is preferred.
  • each culture chamber is provided with a different culture substrate so that cell culture can be performed in different culture environments and culture conditions.
  • all the culture chambers may be provided with different culture substrates, or some of the culture chambers may be provided with different culture substrates.
  • the culture application by the multi-chamber culture container 1 of the present embodiment is not particularly limited.
  • the culture chamber 11 When culturing lymphocytes, the culture chamber 11 is used as an amplification culture chamber for amplifying lymphocytes without any special treatment on the inner surface, and the culture chamber 12 is coated with an anti-CD3 antibody on the inner surface. (Solid phase) can be used as an activation culture chamber for activating lymphocytes.
  • channel opening / closing means such as a clip is attached to the tube 2 connecting the culture chamber 11 and the culture chamber 12 to control the opening / closing of the channel in the tube 2.
  • a pinch valve or a two-way cock can be used as the channel opening / closing means.
  • lymphocytes and a culture solution are injected into the culture chamber 12 and the lymphocytes are activated in the culture chamber 12.
  • the lymphocytes injected into the culture chamber 12 are activated by the stimulation of the anti-CD3 antibody for about 3 days.
  • the flow path in the tube 2 is opened, the activated lymphocytes and the culture solution are transferred from the culture chamber 12 to the culture chamber 11, and the lymphocytes are amplified in the culture chamber 11.
  • a culture solution is added to the culture chamber 11, and a large amount of T lymphocytes activated in about 4 to 10 days can be obtained.
  • the cells can be transferred to the culture chamber 11 and amplified.
  • the culture chamber 11 is used as an ES cell culture chamber for amplifying ES cells by performing matrigel coating on the inner surface
  • the culture chamber 12 is a MEF (with mitomycin C treatment).
  • Mouse fetal fibroblasts and can be used as a MEF culture chamber for culturing MEFs.
  • the culture medium is washed with the culture medium for human ES cells, and the culture chamber 12 is filled with the culture medium for human ES cells. Under conditions, MEFs are cultured overnight. The next day, the flow path in the tube 2 is opened, and the culture supernatant is transferred from the culture chamber 12 to the culture chamber 11.
  • the culture chamber 11 can be used as a culture chamber equipped with a MEF-conditioned culture solution.
  • human ES cells prepared in advance are seeded in the culture chamber 11 and cultured in a MEF-conditioned medium (bFGF added) at 37 ° C. and 2% carbon dioxide concentration. Can be amplified.
  • the occurrence of contamination can be prevented, and the culture chamber 11 and the culture chamber 12 can be handled integrally.
  • the operation of transferring cells to 12 can be performed very easily.
  • the multi-chamber culture container and the cell culture method according to the second embodiment of the present invention will be described with reference to FIG.
  • the multi-chamber culture container 1a of this embodiment is further provided with a culture chamber 13, as shown in FIG.
  • the culture chamber 13 is provided with an external connection port 131 for communicating with the outside of the multi-chamber culture vessel 1a and an inter-chamber connection port 132 for communicating with other culture chambers.
  • the external connection port 131 is connected to a cell supply container or the like via the tube 2 and is used for injecting cells into the culture chamber 13.
  • the inter-chamber connection port 132 is connected to the inter-chamber connection port 112 of the culturing chamber 11 and the inter-chamber connection port 122 of the culturing chamber 12 via the tube 2 to transfer the content liquid in the culturing chamber 13 to the culturing chamber 12 or the like.
  • the external connection port 121 in the culture chamber 12 is connected to a culture solution supply container or the like via the tube 2 and can be used to supply the culture solution to the culture chamber 12.
  • it can be set as the structure similar to the multi-chamber culture container 1 of 1st embodiment.
  • the culture chamber 11 is used as an amplification culture chamber for amplifying lymphocytes without any special treatment on the inner surface, and the culture chamber 12 is coated with an anti-CD3 antibody on the inner surface to activate the lymphocytes. It is used as an activated culture chamber for
  • the culture chamber 13 is used as an adhesion cell culture chamber by performing a surface treatment for culturing adhesion cells on the inner surface thereof.
  • This adhesion type cell culture chamber is used for culturing adhesion type cells by separating leukocytes into lymphocytes and adhesion type cells. Then, as shown in FIG. 2, channel opening / closing means such as a clip is attached on the tube 2 connecting the culture chamber 11 and the culture chamber 12 and on the tube 2 connecting the culture chamber 12 and the culture chamber 13. 2 controls the opening and closing of the flow path.
  • GM-CSF Gramulocyte Macrophage colony-stimulating Factor
  • 50 ng / ml IL-4 Interleukin-4
  • a culture medium (AIM-V, manufactured by Life Technologies, etc.) to which dendritic cells are added) is added, and the adherent cells are cultured under conditions of 37 ° C. and 5% carbon dioxide concentration. Incubate for about 5 days.
  • immature dendritic cells derived from adherent cells can be presented with cancer antigens and cultured for about 2 days to obtain mature dendritic cells.

Abstract

複数の異なる培養条件で培養した細胞を、簡便な作業で移し変え可能な培養容器を提供する。ガス透過性を有する材料を加工してなる複室培養容器（１）であって、細胞を培養するための培養室が二つ以上形成され、各培養室（１１，１２）は、少なくとも一つの他の培養室と連通し、かつ複室培養容器の外部と連通するための外部接続部（１１１，１２１）を少なくとも一つ備えた複室培養容器とする。

Description

複室培養容器、及び細胞培養方法
　本発明は、細胞の培養技術に関し、特に複数の異なる培養環境、培養条件にて細胞を培養可能な細胞培養容器に関する。
　近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
　細胞や組織などの培養の過程においては、複数の異なる培養環境や培養条件が必要になる場合がある。また、複数の異なる培養環境や培養条件で培養した細胞を、後の工程で混合する場合もある。これらの場合には、培養された細胞を複数の容器間で移し替る必要があった。
　しかしながら、このような細胞の移し替えを開放系で行うと、コンタミネーションを生じる危険性があるため、細胞の移し替えを手作業で行う場合は、無菌環境下にて作業を行う必要があった。さらに、このように細胞を複数の容器間で移し替る場合には、溶液がこぼれるおそれがあり、また容器の対応関係を厳密に管理しなければならず、取り扱いが煩雑であるという問題があった。
　ここで、細胞の移し替えや培養液の追加の際におけるコンタミネーションを防止可能な技術として、複数の培養容器を接続することによって密閉系の細胞培養キットを構成し、これを用いて細胞培養を行うことが提案されている（特許文献１，２参照）。
特開２００７－１７５０２８号公報 特開２００５－０５８１０３号公報
　しかしながら、このような細胞培養キットを用いても、その取り扱いの煩雑さを、十分に改善することはできなかった。
　すなわち、このような細胞培養キットを用いた場合、接続する培養容器の数が多くなると、チューブが絡まったり、あるいは培養容器が入り乱れてどれがどれかがわからなくなったりするなど、やはりその取り扱いが煩雑になるという問題があった。
　また、最近では、自動細胞培養装置を用いた細胞培養方法も提案されているが、このような複数の容器からなる細胞培養キットの自動細胞培養装置への取付け作業は、非常に煩雑になってしまうという問題もあった。
　また、リンパ球の培養を行う場合、従来は一般的に抗ＣＤ３抗体を固相化したフラスコにリンパ球を入れて活性化させた後、活性化したリンパ球を増幅用の培養バッグに移し変えて培養が行われていた。
　現在は、技術的には、ガス透過化性を有するフィルム材からなる培養バッグの内面に抗ＣＤ３抗体を固相化して活性化用の培養バッグを作製し、これを増幅用の培養バッグに接続して細胞培養キットを構成し、自動細胞培養装置を用いてリンパ球の培養を行うことも可能になっている。
　しかしながら、このような活性化用の培養バッグは、フラスコに比べてコストが相当大きくなるため、フラスコから活性化用の培養バッグへの置き換えは、簡単に行うことができなかった。
　そこで、本発明者らは鋭意研究して、一つの培養バッグ内に複数の培養室を形成して、これらを連通することで、製造コストが低く、かつ取り扱いが極めて簡便な培養容器を製造することに成功し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、複数の異なる培養環境や培養条件で培養した細胞を、簡便な作業で移し変え可能な複室培養容器、及びこれを用いた細胞培養方法の提供を目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明の複室培養容器は、ガス透過性を有する材料を加工してなる複室培養容器であって、細胞を培養するための培養室が二つ以上形成され、各培養室は、少なくとも一つの他の培養室と連通し、かつ前記複室培養容器の外部と連通するための外部接続部を少なくとも一つ備えた構成としてある。
　また、本発明の細胞培養方法は、上記の複室培養容器を用いた細胞培養方法であって、前記複室培養容器における前記培養室として、リンパ球を活性化させるための抗ＣＤ３抗体が固相化された活性化培養室と、活性化されたリンパ球を増幅させるための増幅培養室とが形成され、リンパ球及び培養液を前記活性化培養室に注入して、前記活性化培養室においてリンパ球を活性化させ、前記活性化培養室から前記増幅培養室に活性化されたリンパ球及び培養液を移送して、前記増幅培養室においてリンパ球を増幅させる方法としてある。
　さらに、本発明の細胞培養方法は、上記の複室培養容器を用いた細胞培養方法であって、前記複室培養容器における前記培養室として、白血球をリンパ球と接着系細胞に分離して接着系細胞を培養するための接着系細胞培養室と、リンパ球を活性化させるための抗ＣＤ３抗体が固相化された活性化培養室と、リンパ球を増幅するための増幅培養室とが形成され、
　血液から分離した白血球及び培養液を前記接着系細胞培養室に注入して静置し、前記白血球における接着系細胞を前記接着系細胞培養室内の底面に接着させ、次いで、前記接着系細胞培養室から前記活性化培養室に、前記白血球におけるリンパ球と培養液を移送して、前記活性化培養室においてリンパ球を活性化させ、前記接着系細胞培養室に樹状細胞への誘導因子を含む培養液を注入して前記接着系細胞を培養し、前記接着系細胞を樹状細胞に誘導し、前記活性化培養室から前記増幅培養室に活性化されたリンパ球及び培養液を移送して、前記増幅培養室においてリンパ球を増幅させる方法としてある。
　本発明によれば、複数の異なる培養条件で培養した細胞を簡便な作業で移し変え可能な複室培養容器、及びこれを用いた細胞培養方法を提供することが可能となる。
本発明の第一実施形態に係る複室培養容器を示す図である。 本発明の第二実施形態に係る複室培養容器を示す図である。 本発明の第三実施形態に係る複室培養容器を示す図である。 本発明の第三実施形態に係る複室培養容器を用いた内容物の移送方法を示す図である。 本発明の第四実施形態に係る複室培養容器を示す図である。 本発明の第五実施形態に係る複室培養容器を示す図である。
　以下、本発明の複室培養容器及び細胞培養方法の実施形態について、詳細に説明する。
［第一実施形態］
　まず、本発明の第一実施形態に係る複室培養容器及び細胞培養方法について、図１を参照して説明する。
　本実施形態の複室培養容器は、ガス透過性を有する材料を加工してなる複室培養容器であって、細胞を培養するための培養室が二つ以上形成され、各培養室は、少なくとも一つの他の培養室と連通し、かつ複室培養容器の外部と連通するための外部接続部を少なくとも一つ備えたことを特徴とする。
　具体的には、図１において、複室培養容器１は、細胞を培養するための培養区画として、培養室１１と培養室１２を備えている。
　培養室１１には、複室培養容器１の外部と連通するための外部接続ポート１１１と、他の培養室と連通するための室間接続ポート１１２と、サンプリングを行うためのサンプリングポート１１３が備えられている。
　外部接続ポート１１１は、図示しないが、チューブ２を介して培養液供給容器等に接続され、培養室１１への培養液の供給のためなどに用いられる。
　室間接続ポート１１２は、培養室１２の室間接続ポート１２２にチューブ２を介して接続され、培養室１２の内容液を培養室１１に移送するために用いられる。
　サンプリングポート１１３は、培養室１１で培養された細胞のサンプリングを行うために用いられる。
　培養室１２には、複室培養容器１の外部と連通するための外部接続ポート１２１と、他の培養室と連通するための室間接続ポート１２２が備えられている。
　外部接続ポート１２１は、図示しないが、チューブ２を介して細胞供給容器等に接続され、培養室１２への細胞の注入のためなどに用いられる。
　室間接続ポート１２２は、培養室１１の室間接続ポート１１２にチューブ２を介して接続され、培養室１２の内容液を培養室１１に移送するために用いられる。
　複室培養容器１を形成する材料としては、細胞の培養に必要なガス透過性を有していることが必要である。具体的には、5000ml／m2・day・atm（37℃－80％RH）以上の酸素透過率を有することが好ましい。また、培養容器材料は、複室培養容器１における内容物を確認できるように、透明性を有していることが好ましい。さらに、培養容器材料は、高い細胞増殖効率を実現するために、低細胞毒性、低溶出性、及び放射線滅菌適性を有することが好ましい。
　このような条件を満たす材料としては、ポリエチレン系樹脂が好ましい。ポリエチレン系樹脂としては、例えばポリエチレン、エチレンとα－オレフィンの共重合体、エチレンと酢酸ビニルの共重合体、エチレンとアクリル酸やメタクリル酸共重合体と金属イオンを用いたアイオノマー等を挙げることができる。また、ポリオレフィン、スチレン系エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、シリコーン樹脂等を用いることもできる。
　このようなガス透過性材料をヒートシール加工や圧空成形、真空成形などのシート成形することによって、本実施形態の複室培養容器１を製造することができる。
　本実施形態の複室培養容器１の形状は、特に限定されないが、略長方形状のものを好適に用いることができ、その内部に形成される各培養室の形状も、略長方形状にすることが好ましい。
　本実施形態の複室培養容器１において、各培養室に、それぞれ異なる培養基材を備えて、それぞれ異なる培養環境、培養条件での細胞培養を行えるようにすることも好ましい。培養室が、三つ以上ある場合には、全部の培養室にそれぞれ異なる培養基材を備えても、一部の培養室にそれぞれ異なる培養基材を備えても良い。
　本実施形態の複室培養容器１による培養用途は特に限定されないが、例えば、リンパ球の培養、ＤＣ－ＬＡＫ療法（樹状細胞、リンパ球の培養）、ＥＳ細胞の培養、ｉＰＳ細胞の培養などに好適に用いることが可能である。
　以下、本実施形態の複室培養容器１において、複数の異なる培養環境、培養条件を設けた場合の細胞培養について、具体例を挙げて説明する。
［リンパ球の培養］
　リンパ球の培養を行う場合、培養室１１は、その内面に特別な処理を行うことなく、リンパ球を増幅させるための増幅培養室として用い、培養室１２は、その内面に抗ＣＤ３抗体をコーティング（固相化）して、リンパ球を活性化させるための活性化培養室として用いることができる。
　そして、図１に示すように、培養室１１と培養室１２を接続するチューブ２にクリップなどの流路開閉手段を取付けて、チューブ２における流路の開閉を制御する。なお、流路開閉手段としては、例えばピンチバルブや二方活栓などを用いることもできる。
　そして、リンパ球及び培養液を培養室１２に注入して、培養室１２においてリンパ球を活性化させる。培養室１２に注入したリンパ球は、約３日間程度の抗ＣＤ３抗体の刺激によって、活性化される。
　その後、チューブ２における流路を開放して、培養室１２から培養室１１に活性化されたリンパ球及び培養液を移送し、培養室１１においてリンパ球を増幅させる。
　このとき、リンパ球の増幅に併せて、培養室１１に培養液を追加し、約４日から１０日間程度で活性化されたＴリンパ球を大量に得ることができる。
　なお、培養室１２の内面にその他の生理活性物質をコーティングして、その他の細胞を活性化させた後、これを培養室１１に移送して、増幅させることもできる。
［ＥＳ細胞の培養］
　ＥＳ細胞の培養を行う場合、培養室１１は、その内面にマトリゲルコート処理を行って、ＥＳ細胞を増幅させるためのＥＳ細胞培養室として用い、培養室１２は、マイトマイシンＣ処理を施したＭＥＦ（マウス胎児線維芽細胞）を充填し、ＭＥＦを培養するためのＭＥＦ培養室として用いることができる。
　次に、培養室１２からＭＥＦ用培養液を除去した後、ヒトＥＳ細胞用培養液で洗浄し、培養室１２にヒトＥＳ細胞用培養液を充填して、３７℃、２％二酸化炭素濃度の条件下で、ＭＥＦを一晩培養する。翌日、チューブ２における流路を開放して、培養室１２から培養室１１に培養上清を移送する。これによって、培養室１１をMEF-conditioned培養液を備えた培養室として使用することができる。
　そして、予め準備したヒトＥＳ細胞を培養室１１に播種して、MEF-conditioned培養液（bFGFを添加しておく）により３７℃、２％二酸化炭素濃度の条件下で培養して、ヒトＥＳ細胞を増幅させることができる。
　このように、本実施形態の複室培養容器１によれば、コンタミネーションの発生を防止でき、また培養室１１と培養室１２とを一体的に取り扱うことができるため、培養室１１から培養室１２への細胞の移し変え作業を、極めて容易に行うことが可能になっている。
［第二実施形態］
　次に、本発明の第二実施形態に係る複室培養容器及び細胞培養方法について、図２を参照して説明する。
　本実施形態の複室培養容器１ａは、同図に示すように、培養室１１と培養室１２に加えて、さらに培養室１３を備えている。
　培養室１３には、複室培養容器１ａの外部と連通するための外部接続ポート１３１と、他の培養室と連通するための室間接続ポート１３２が備えられている。
　外部接続ポート１３１は、図示しないが、チューブ２を介して細胞供給容器等に接続され、培養室１３への細胞の注入のためなどに用いられる。室間接続ポート１３２は、培養室１１の室間接続ポート１１２及び培養室１２の室間接続ポート１２２にチューブ２を介して接続され、培養室１３の内容液を培養室１２等に移送するために用いることができる。培養室１２における外部接続ポート１２１は、図示しないが、チューブ２を介して培養液供給容器等に接続され、培養室１２に培養液を供給するためなどに用いることができる。
　その他の点については、第一実施形態の複室培養容器１と同様の構成にすることができる。
　また、本実施形態の複室培養容器１ａは、各培養室にそれぞれ異なる培養基材を備えることによって、様々な細胞培養を行う場合に用いることができる。例えば、次のような方法で、樹状細胞とリンパ球を培養することができる。
［樹状細胞とリンパ球の培養］
　培養室１１は、その内面に特別な処理を行うことなく、リンパ球を増幅させるための増幅培養室として用い、培養室１２は、その内面に抗ＣＤ３抗体をコーティングして、リンパ球を活性化させるための活性化培養室として用いる。また、培養室１３は、その内面に接着系細胞を培養するための表面処理を行って、接着系細胞培養室として用いる。この接着系細胞培養室は、白血球をリンパ球と接着系細胞に分離して接着系細胞を培養するために用いられる。そして、図２に示すように、培養室１１と培養室１２を接続するチューブ２上と、培養室１２と培養室１３を接続するチューブ２上にクリップなどの流路開閉手段を取付けて、チューブ２における流路の開閉を制御する。
　そして、培養室１３に血液から分離した白血球（細胞浮遊液）と培養液を注入して、３７℃で約２時間静置させる。これによって、白血球における接着系細胞は、培養室１３の底面に接着する。
　次に、培養室１２と培養室１３を接続するチューブ２における流路を開放して、培養室１３から培養室１２に、白血球における浮遊系細胞（リンパ球）と培養液を移送する。そして、培養室１２において、リンパ球を活性化させる。
　次いで、培養室１３に、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ（Granulocyte　Macrophage　colony-stimulating　Factor，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）と５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４（Interleukin-4，インターロイキン－４）（これらを樹状細胞への誘導因子と称する場合がある。）を添加した培養液（AIM-V，Life　Technologies社製等）を加えて、接着系細胞を３７℃、５％二酸化炭素濃度の条件下で、約５日間培養する。
　このようにして接着系細胞から誘導された未熟樹状細胞に、癌抗原を提示して約２日間培養し、成熟した樹状細胞を得ることができる。
　一方、培養室１２に移動したリンパ球は、約３日間程度の抗ＣＤ３抗体の刺激によって、活性化される。
　その後、培養室１１と培養室１２を接続するチューブ２における流路を開放して、培養室１２から培養室１１に活性化されたリンパ球及び培養液を移送し、培養室１１においてリンパ球を増幅させる。このとき、リンパ球の増幅に併せて、培養室１１に培養液を追加し、約４日間程度で活性化されたＴリンパ球（Ｔ細胞）を大量に得ることができる。
　最終的には、これらの細胞を調製して、樹状細胞とリンパ球をそれぞれヒトに投与することができる。
　このように、本実施形態の複室培養容器１ａによれば、培養室を三つ以上備えている場合でも、これらを一つの培養容器内に備えることによって、一体的に取り扱うことができるため、細胞の移し変え作業を容易に行うことができ、複雑な培養工程を簡単な操作で実施することが可能になる。
［第三実施形態］
　次に、本発明の第三実施形態に係る複室培養容器及び細胞培養方法について、図３，及び図４を参照して説明する。
　本実施形態の複室培養容器は、その一つの辺に、チューブを用いて接続された二つ以上の室間接続部が備えられ、各培養室における室間接続部が備えられた辺と、複室培養容器における当該一つの辺との距離が、各培養室の並び順に大きく又は小さくなるように、各培養室が形成されたことを特徴とする。その他の点については、第一実施形態の複室培養容器１と同様の構成にすることができる。
　具体的には、図３に示すように、室間接続ポート１１２と１２２が備えられた複室培養容器１ｂにおける辺と、培養室１１における室間接続ポート１１２が備えられた辺との距離ｄ１と、室間接続ポート１１２と１２２が備えられた複室培養容器１における辺と、培養室１２における室間接続ポート１２２が備えられた辺との距離ｄ２との差が、所定の大きさｄとなるように、培養室１１及び培養室１２が形成されている。このｄ（＝ｄ２－ｄ１）は、３ｍｍ以上とすることが好ましく、５ｍｍ～５０ｍｍとすることがより好ましく、７ｍｍ～２０ｍｍとすることがさらに好ましい。
　これによって、複室培養容器１ｂを傾けるだけで、培養室１２から培養室１１への内容物の移送を、好適に行うことが可能となる。
　すなわち、本実施形態の複室培養容器１ｂを、各培養室１１と１２における室間接続部１１２と１２２が備えられた辺と、室間接続ポート１１２と１２２が備えられた複室培養容器１ｂにおける辺との距離が大きい培養室ほど上方に位置させ、かつ室間接続部１１２と１２２が備えられた複室培養容器１ｂにおける辺が下向きになるようにしつつ、複室培養容器１ｂの一つの角が最下端に位置するように複室培養容器１ｂを傾けて、上方に位置する培養室から下方に位置する培養室に向けて、内容物の移送を行う。
　具体的には、図４に示すように、室間接続ポート１１２と１２２が備えられた複室培養容器１における辺と、室間接続ポートが備えられた培養室の辺との距離がより大きい培養室１２を、上方に位置させ、かつ室間接続ポート１１２と１２２が備えられた複室培養容器１ｂにおける辺が斜め下向きになるようにしつつ、複室培養容器１ｂの一つの角が最下端に位置するように複室培養容器１ｂを傾ける。これによって、培養室１２の内容物を、チューブ２を介して、培養室１１に自然に移送させることが可能になる。
　一方、例えば、第一実施形態における複室培養容器１を、図４のように傾けた場合は、培養室１２から培養室１１へ内容物を移送させるために十分な圧力差が得られず、培養室１２内に内容物が残ってしまうという問題があった。
　これに対して、本実施形態の複室培養容器１ｂによれば、培養室１２における内容物の残存を大きく低減することが可能になっている。
［第四実施形態］
　次に、本発明の第四実施形態に係る複室培養容器及び細胞培養方法について、図５を参照して説明する。
　本実施形態の複室培養容器は、各培養室を他の培養室と連通するための流路が、複室培養容器内において、フィルム材をヒートシール加工して形成されたことを特徴とする。
　具体的には、図５に示すように、複室培養容器１ｃにおいて、培養室１１と培養室１２を連通する移送流路３が、形成されている。このため、培養室１１と培養室１２から、室間接続ポートが省略されている。その他の点については、第一実施形態の複室培養容器１と同様の構成にすることができる。
　移送流路３は、物理的手段により開閉を制御できる。この物理的手段としては、例えば押圧部材などを用いることができ、その押込量を制御することで、移送流路３を開閉することができる。
　このような本実施形態の複室培養容器１ｃによれば、培養室１１と培養室１２をチューブ２で接続する必要がなく、また各培養室における室間接続ポートを省略することができ、より構造の簡単な複室培養容器を得ることが可能になる。また、各培養室間を接続するチューブがないため、その取り扱いが非常に簡単であり、自動培養装置に取付ける場合にも極めて容易に行うことが可能である。
［第五実施形態］
　次に、本発明の第五実施形態に係る複室培養容器及び細胞培養方法について、図６を参照して説明する。
　本実施形態の複室培養容器１ｄは、図６に示すように、細胞を活性化させるための活性化培養室である培養室１２と、細胞を増幅させるための増幅培養室である培養室１１と、細胞をサンプリングするためのサンプリング室１４と、細胞を回収するための回収室１５とを備えている。
　そして、培養室１２と培養室１１を連通する移送流路３が形成されると共に、培養室１１とサンプリング室１４との間、及び培養室１１と回収室１５との間にも、移送流路３が、フィルム材をヒートシール加工して形成されている。
　さらに、サンプリング室１４と回収室１５の周囲には、これらをそれぞれ容易に切り離し可能にするための、ミシン目、スリット、スコア、切欠等からなる易切断部４が設けられている。また、このような易切断部４を、各培養室を切り離すために設けても良い。
　本実施形態の複室培養容器１ｄは、例えば以下のようにして、リンパ球の培養などに用いることができる。
　第一実施形態と同様に、培養室１１を、その内面に特別な処理を行うことなく、リンパ球を増幅させるための増幅培養室として用い、培養室１２を、その内面に抗ＣＤ３抗体を固相化して、リンパ球を活性化させるための活性化培養室として用いる。
　また、サンプリング室１４を、培養室１１における培養細胞をサンプリングするために用い、回収室１５を、培養室１１における培養細胞の一定量を回収するために用いる。
　そして、培養室１２と培養室１１を連通する移送流路３を物理的手段により閉めた後、培養室１２にリンパ球と培養液を注入して、リンパ球を活性化させる。また、サンプリング室１４と培養室１１、及び回収室１５と培養室１１を連通する移送流路３も物理的手段により閉めておく。
　リンパ球を活性化した後、培養室１２と培養室１１間の移送流路３を開放して、培養室１２からリンパ球と培養液を培養室１１に押し出して、活性化したリンパ球を培養室１１に移送させ、培養室１１においてリンパ球を増幅させる。このとき、リンパ球の増幅に併せて、外部接続ポート１１１を介して、培養液供給容器から培養室１１に必要な培養液を追加することができる。この培養液の追加は、無菌接合装置などを用いることで無菌的に行うことも可能である。また、培養液の成分を改良し、培養室１１に追加培養液を予め充填しておくようにすることもできる。さらに、本実施形態の複室培養容器１ｄに培養液供給室を形成して、培養液供給室から培養室１１に培養液を追加可能にすることもできる。
　また、培養室１１において培養された細胞をサンプリングする場合には、サンプリング室１４と培養室１１間の移送流路３を開放して、培養室１１からサンプリング室１４へリンパ球と培養液を少量移送した後、サンプリング室１４と培養室１１間の移送流路３をヒートシール等で溶断し、サンプリング室１４を易切断部４に沿って切り取って、細胞解析や検査等に用いることができる。
　さらに、培養細胞の一部を回収して、２回に分けて投与する医療方法などを行う場合には、回収室１５と培養室１１間の移送流路３を開放して、培養室１１から回収室１５へリンパ球と培養液を必要量移送した後、回収室１５と培養室１１間の移送流路３をヒートシール等で溶断して、回収室１５を易切断部４に沿って切り取って、回収室１５に収容されたリンパ球を投与などに用いることが可能である。
　このように、本実施形態の複室培養容器１ｄによれば、これらの作業を全て閉鎖系の複室培養容器１ｄ内において実施できるため、無菌性を担保した状態で、細胞培養を簡便に行うことが可能となる。
　また、本実施形態の複室培養容器１ｄは、流路が一体化された複室培養容器であるため、シールバーの設計を行うのみで、種々の室や流路を簡便に低コストで作製することが可能である。また、自動培養装置にセットする際にも、複雑なチューブの取り付けが不要になることから、作業効率が高まるだけでなく、取り付けミス等のリスクも低減することが可能になっている。
　本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
　例えば、上記各実施形態を組み合わせたものにしたり、接着系細胞の移送のために、接着系細胞を培養室の内面から剥離するための酵素溶液を培養室に供給するための酵素溶液供給容器、及びその酵素の働きを阻害するための阻害剤溶液を培養室に供給するための阻害剤溶液供給容器を備えたものにしたりするなど、適宜変更することが可能である。
　本発明は、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、閉鎖系の培養容器を用いて、細胞を培養する場合に好適に利用することが可能である。
　１，１ａ，１ｂ，１ｃ，１ｄ　複室培養容器
　１１　　培養室
　１１１　　外部接続ポート
　１１２　　室間接続ポート
　１１３　　サンプリングポート
　１２　　培養室
　１２１　　外部接続ポート
　１２２　　室間接続ポート
　１３　　培養室
　１３１　　外部接続ポート
　１３２　　室間接続ポート
　１４　　サンプリング室
　１４１　　外部接続ポート
　１５　　回収室
　１５１　　外部接続ポート
　２　　　移送チューブ
　３　　　移送流路
　４　　　易切断部

Claims (11)

  1. 　ガス透過性を有する材料を加工してなる複室培養容器であって、細胞を培養するための培養室が二つ以上形成され、各培養室は、少なくとも一つの他の培養室と連通し、かつ前記複室培養容器の外部と連通するための外部接続部を少なくとも一つ備えたことを特徴とする複室培養容器。
  2. 　前記各培養室に、前記他の培養室と連通するための室間接続部がそれぞれ備えられ、前記室間接続部同士がチューブを用いて接続されたことを特徴とする請求項１記載の複室培養容器。
  3. 　前記各培養室を前記他の培養室と連通するための流路が、前記複室培養容器内において、ガス透過性を有するフィルム材をヒートシール加工して形成されたことを特徴とする請求項１記載の複室培養容器。
  4. 　前記培養室として、少なくとも、細胞を活性化させるための活性化培養室と、細胞を増幅させるための増幅培養室とを備えたことを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の複室培養容器。
  5. 　前記培養室として、細胞を活性化させるための活性化培養室と、細胞を増幅させるための増幅培養室とを備えると共に、細胞をサンプリングするためのサンプリング室と、細胞を回収するための回収室とを備え、前記活性化培養室と前記増幅培養室を連通する前記流路が形成され、前記増幅培養室と前記サンプリング室間、及び前記増幅培養室と前記回収室間のそれぞれに、流路が、前記複室培養容器内において、ガス透過性を有するフィルム材をヒートシール加工して形成されたことを特徴とする請求項３記載の複室培養容器。
  6. 　前記各培養室、前記サンプリング室、及び前記回収室からなる群から選択された少なくともいずれかの室を切り離すための易切断部を設けたことを特徴とする請求項５記載の複室培養容器。
  7. 　全部又は一部の前記培養室に、それぞれ異なる培養基材を備えたことを特徴とする請求項１～６のいずれかに記載の複室培養容器。
  8. 　前記複室培養容器が略長方形状であり、前記複室培養容器の一つの辺に、チューブを用いて接続された二つ以上の前記室間接続部が備えられ、前記各培養室における前記室間接続部が備えられた辺と、前記複室培養容器の一つの辺との距離が、前記各培養室の並び順に大きく又は小さくなるように、前記各培養室が形成されたことを特徴とする請求項１～７のいずれかに記載の複室培養容器。
  9. 　請求項８に記載の複室培養容器を用いた細胞培養方法であって、
    　前記各培養室における前記室間接続部が備えられた辺と、前記複室培養容器の一つの辺との距離が大きい培養室ほど上方に位置させ、かつ前記室間接続部が備えられた前記複室培養容器における辺が斜め下向きになるようにしつつ、前記複室培養容器の一つの角が最下端に位置するように前記複室培養容器を傾けて、上方に位置する培養室から下方に位置する培養室に向けて、内容物の移送を行うことを特徴とする細胞培養方法。
  10. 　請求項１～３のいずれかに記載の複室培養容器を用いた細胞培養方法であって、
    　前記複室培養容器における前記培養室として、リンパ球を活性化させるための抗ＣＤ３抗体が固相化された活性化培養室と、リンパ球を増幅させるための増幅培養室とが形成され、
    　リンパ球及び培養液を前記活性化培養室に注入して、前記活性化培養室においてリンパ球を活性化させ、
    　前記活性化培養室から前記増幅培養室に活性化されたリンパ球及び培養液を移送して、前記増幅培養室においてリンパ球を増幅させることを特徴とする細胞培養方法。
  11. 　請求項１～３のいずれかに記載の複室培養容器を用いた細胞培養方法であって、
    　前記複室培養容器における前記培養室として、白血球をリンパ球と接着系細胞に分離して接着系細胞を培養するための接着系細胞培養室と、リンパ球を活性化させるための抗ＣＤ３抗体が固相化された活性化培養室と、リンパ球を増幅するための増幅培養室とが形成され、
    　血液から分離した白血球及び培養液を前記接着系細胞培養室に注入して静置し、前記白血球における接着系細胞を前記接着系細胞培養室内の底面に接着させ、
    　次いで、前記接着系細胞培養室から前記活性化培養室に、前記白血球におけるリンパ球と培養液を移送して、前記活性化培養室においてリンパ球を活性化させ、
    　前記接着系細胞培養室に樹状細胞への誘導因子を含む培養液を注入して前記接着系細胞を培養し、前記接着系細胞を樹状細胞に誘導し、
    　前記活性化培養室から前記増幅培養室に活性化されたリンパ球及び培養液を移送して、前記増幅培養室においてリンパ球を増幅させることを特徴とする細胞培養方法。
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