WO2014183550A1

WO2014183550A1 - 含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰甾醇和/或磷脂酰甾烷醇及制备方法和应用

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Publication number: WO2014183550A1
Application number: PCT/CN2014/076313
Authority: WO
Inventors: 张雅茹; 王西岭
Original assignee: Zhang Yaru; Wang Xiling
Priority date: 2013-05-15
Filing date: 2014-04-28
Publication date: 2014-11-20
Also published as: CN103242407A

Abstract

本发明提供了富含多不饱脂肪酰基的磷脂酰甾醇和/或磷脂酰甾烷醇及其制备方法，主要解决现有植物甾醇可溶性差生物利用度低以及其酯化物制备方法中使用有毒试剂、反应条件苛刻以及无法工业化生产等技术问题。结构式如式（I）所示，式中：Sn-1、Sn-2和Sn-3分别指磷脂中甘油酯基团的1位、2位和3位；R₁和R₂为下述基团中的一种：-C₁₉H₂₉、-C₁₉H₃₁、-C₂₁H₃₁或-C₂₁H₃₃，X为甾醇或甾烷醇中的一种。本发明能够有效降低血浆中胆固醇和甘油三酯含量的功效价值，并提供了应用领域和范围。

Description

含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰留醇和 /或磷脂酰 ffi烷醇及制备方法和应用技术领域

[0001] 本发明涉及用酶催化的方法来制备富含多不饱脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰甾烷醇及其制备方法；验证了富含多不饱脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰烷醇作为功能食品或医药用于降低血浆中胆固醇和甘油三酯含量的功效价值；并确定了富含多不饱脂肪酰基的磷脂酰甾醇和 /或磷脂酰甾烷醇的应用领域和范围。

背景技术

[0002] 心血管疾病已经成为危害人类健康重要的疾病，这些疾病病因复杂，但跟脂质代谢异常有着非常密切的关系。众多研究表明，低密度脂蛋白（LDL) 胆固醇与心血管疾病的发作直接相关，而高密度脂蛋白（HDL) 胆固醇则与心血管的发作具有相反的关系。而患有联合高血脂的人甚至具有更高的发作心脏病的危险。血浆胆固醇和甘油三脂含量升高通常被认为是心血管疾病的起因和标志。而降低胆固醇含量和降低甘油三脂含量被认为是防止心血管疾病的主要策略。

[0003] 通过摄取植物醇来降低血浆胆固醇含量是一种比较有效的途径。植物醇是植物的基本化学成分，较少的存在于植物油（如玉米油、豆油或其他植物油）中。在植物油中，它们是以游离醇、脂肪酸酯和糖苷形式存在。植物醇在化学结构上与胆固醇相似，主要区别在于它们分子侧链的碳架。自然界中，最常见的植物醇包括 β-谷醇、菜籽醇、菜油甾醇、豆醇。植物醇被还原生成的饱和植物醇被称为植物烷醇，例如菜油烷醇

( campestanol) 或谷甾焼醇（sitostanol)。

[0004] 植物醇的结构与胆固醇结构类似，它们在小肠内能与胆固醇形成有限竞争关系，能替代部分胆固醇被吸收，而植物醇其本身在人体内不能被利用，因而可以达到降低血浆中低密度胆固醇的含量。但是植物醇不溶于水，在油中溶解度也很小，因而大大限制其在食品或药品中的应用。许多研究工作都围绕着植物醇的结构修饰而展开，比较常见的工作包括用化学方法和 /或酶转化方法将植物醇 3-位上的羟基与游离脂肪酸反应制备得到植物甾醇脂肪酸酯。植物醇肪酸酯在油脂中的溶解度比较高，可以较方便的运用到各种食物，而对产品最终口味、香味和物理性质没有影响。除了应用于食品配料外，植物醇酯还可以制作成软胶囊制剂在临床上用于降低胆固醇。

[0005] 磷脂 (Phospholipid)是含磷酸根的类脂化合物，结构是磷酰二甘油脂肪酸酯。磷脂按其分子结构不同，可分为甘油醇磷脂和神经醇磷脂两大类。主要包括磷脂酰丝氨酸

(Phosphatidylserine, PS)、磷脂酰胆碱（卵磷脂， Phosphatidylcholine, PC)、磷脂酰乙醇胺 (脑磷脂， Phosphatidylethanolamine , PE)、磷脂酰肌醇 ( Phosphatidylinositol , PI ) 和磷脂酸（Phosphatidic acid, PA)。磷脂是构成细胞膜的重要组成成分，它是维持生命活动的基础物质。磷脂具有改善脑功能、降低胆固醇、抗精神压力等诸多作用。

[0006] 不同来源磷脂，其脂肪酸构成明显不同。植物来源的磷脂，如大豆磷脂，其甘油基的 1位 Sn-1和 2位 Sn-2上连接的脂肪酰基多为饱和脂肪酰基或亚油酰基、亚麻酰基，并不含多饱和多烯键脂肪酰基，如二十二碳六烯酰基（Docosahexaenoic Acid, DHA)，二十碳五烯酰基（Eicosapntemacnioc Acid, EPA) 等。而动物来源的磷脂，如深海鱼、南极磷虾来源的磷脂，其甘油基的 1位 Sn-1和 2位 Sn-2上连接脂肪酰基多为多不饱和脂肪酰基，这种多不饱和脂肪酰基主要源于多不饱脂肪酸，例如动物来源的磷脂中 DHA、 EPA等脂肪酰含量较高，且具有重要生理功效。近年来大量科学研究表明，多不饱脂肪酸，例如 Omega-3 多不饱和脂肪酸 DHA、 EPA, 被证明具有显著降低血浆中甘油三酯水平的作用，且与胆固醇的代谢相关。所谓多不饱脂肪酸，本发明着重点强调花生四烯酸（AA)、二十碳五烯酸 (EPA)、二十二碳五烯酸（DPA)、二十二碳六烯酸（DHA) 等多不饱和脂肪酸以及它们的混合物。

[0007] 到目前为止，已经进行下面工作，将游离植物醇转化为其酯化形式，从而扩大应用。

[0008] US5502045公开了谷烷醇脂肪酸酯在减少胆固醇吸收方面的应用，但在制备过程中使用有毒有机溶剂，并且制备条件苛刻。

[0009] US2372990公开了通过使用二氯甲烷富集后的 β-谷醇与脂肪酸甲酯发生酯交换反应制备得到植物醇脂肪酸酯。同样的，此制备过程中使用有毒溶剂且条件苛刻。

[0010] US0068425公开了一种植物醇脂肪酸酯的制造方法，但在制造过程中应用污染较大的二氯亚砜为催化剂，而且操作条件苛刻，难以工业化生产。

[0011] 公开号 CN 1982326A公开了一种在高真空条件下使用低级醇钠为催化剂制备多不饱和脂肪酸植物醇脂的制备方法，但操作条件苛刻，难以工业化生产。

[0012] EP98122412.4公开了具有 18〜22个碳原子和至少 3个碳-碳双键的多不饱和脂肪酸的植物醇脂和 /或植物烷醇脂能有效的减少血浆胆固醇和甘油三酯。该专利公开了多不饱和多烯键脂肪酸，如 DHA、 EPA, 与植物醇结合形成醇酯及其降低血浆中胆固醇和甘油三酯含量的功效。 [0013] 上述醇酯结构是脂肪酸与醇直接通过脂肪酸的羧基与醇的羟基脱水缩合结合到一起的脂肪酸酯。

[0014] 公开号 CN102365031 A公开了一种利用脂质酰基转移酶催化植物醇 /植物烷醇和植物磷脂制备得到磷脂酰植物醇酯的方法。但该专利公开的是植物醇和植物来源的磷脂经酶催化生成的磷脂酰植物醇酯，其磷脂酯结构中，并不含多不饱脂肪酸，例如 DHA、 DPA、 EPA等。

[0015] 将含有多不饱脂肪酰基的磷脂胆碱，例如甘油基的 1位 Sn-Ι和 /或 2位 Sn-2上为多不饱脂肪酰基（尤其是花生四烯酸（AA )、二十碳五烯酸（EPA )、二十二碳五烯酸 (DPA)、二十二碳六烯酸（DHA) 等多不饱和脂肪酸以及它们的混合物衍生的酰基）的磷脂胆碱，在磷脂酶 D 催化下，与植物醇或植物烷醇发生转酯化反应，生成含多不饱脂肪酰基的磷脂酰植物醇或磷脂酰植物烷醇，并且利用含多不饱脂肪酰基的磷脂酰植物甾醇或磷脂酰植物烷醇来降低血浆中胆固醇和甘油三酯，目前还没有任何文献报道，是一项非常有意义和应用价值的新颖成果。

发明内容

[0016] 本发明的目的是提供一种含多不饱脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰烷醇及其制备方法和用途，主要解决现有植物醇可溶性差、生物利用度低以及其酯化物制备方法中使用有毒试剂、反应条件苛刻以及无法工业化生产等技术问题。

[0017] 本发明的技术方案为：一种含多不饱脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰烷醇，结构式如下：

式中： Sn-1、 Sn-2和 Sn-3分别指磷脂中甘油酯基团的 1位、 2位和 3位；和 R₂为长碳链脂肪酰基， Sn-1 位的 _R1 和 Sn-2 位的 _R₂常见的有一 C₁₉H₂₉、 _ C₁₉H₃₁、一 C₂₁H₃₁、一 C₂₁H₃₃。举例若或 R₂为 _C₁₉H₂₉，则说明或 R₂来自二十碳五烯酸（即 EPA)， - C₁₉H₂₉与其相连的羰基基团构成一个二十碳五烯脂肪酰基，表示在 Sn-1或 Sn-2位是一个二十碳五烯酸与甘油分子对应的 Sn-1或 Sn-2位醇形成的酯；若其为 _C₁₉H₃₁，则说明 R₂来自二十碳四烯酸或花生四烯酸， _C₁₉H₃₁与其相连的羰基基团构成一个二十碳四烯脂肪酰基，表示在 Sn-1或 Sn-2位是一个二十碳四烯酸与甘油分子对应的 Sn-1或 Sn-2位醇形成的酯；若其为 _C₂₁H₃₁，则说明 R₂来自二十二碳六烯酸（即 DHA)，一 C₂₁H₃₁与其相连的羰基基团构成一个二十二碳六烯脂肪酰基，表示在 Sn-1或 Sn-2位是一个二十二碳六烯酸与甘油分子对应的 Sn-1 或 Sn-2 位醇形成的酯；若其为一 C₂₁H₃₃，则说明 R₂来自二十二碳五烯酸（即 DPA) , _C₂₁H₃₃与其相连的羰基基团构成一个二十二碳五烯脂肪酰基，表示在 Sn-1或 Sn-2 位是一个二十二碳五烯酸与甘油分子对应的 Sn-1或 Sn-2位醇形成的酯； Sn-3位的一 X为不同的连接基团，若一 X为醇，则该磷脂化合物为磷脂酰醇酯，在本文中，按照习惯称为磷脂酰醇；若一 X 为烷醇，则该磷脂化合物为磷脂酰烷醇酯，在本文中，按照习惯称为磷脂酰烷醇。

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田醇优选是 β-谷醇（即 Beta-谷醇）或豆醇或其混合物，最优选是 β-谷醇。烷醇优选是 β-谷甾烷醇或豆甾烷醇或其混合物，最优选是 β-谷甾烷醇（Beta-谷甾烷醇）。

[0018] 一种含多不饱脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰烷醇的制备方法，包括以下步骤：将含有多不饱脂肪酰基的磷脂胆碱，例如甘油基的 1位 Sn-1和 /或 2位 Sn-2上为多不饱脂肪酰基（尤其是花生四烯酸（AA)、二十碳五烯酸（EPA)、二十二碳五烯酸（DPA)、二十二碳六烯酸（DHA) 等多不饱和脂肪酸以及它们的混合物衍生的酰基）的磷脂胆碱，然后在水相和有机溶剂两相混合体系或含有微量水的有机溶剂单相体系中，在磷脂酶 D 催化下，与植物醇或植物烷醇发生转酯化反应，生成含多不饱脂肪酰基的磷脂酰植物醇和 /或磷脂酰植物烷醇。

[0019] 本发明制备得到的含多不饱脂肪酰基的磷脂酰植物醇或磷脂酰植物烷醇来降低血浆中胆固醇和甘油三酯能有效降低血浆中胆固醇和甘油三酯含量。

[0020] 本发明进一步涉及含本发明制备得到的含多不饱脂肪酰基的磷脂酰植物醇或磷脂酰植物烷醇的营养补充食品组合物。该营养补充食品组合物可以为软胶囊、片剂、糖浆或任何其它普通膳食补充传递系统的形式。

[0021] 本发明进一步涉及含本发明制备得到的含多不饱脂肪酰基的磷脂酰植物醇或磷脂酰植物烷醇的功能食品。这样的功能食品可选自奶制品、奶饮料、冰激淋、焙烤制品、糖果制品、饼干、豆制品、糕点和面包、能量棒、酱油、调味剂、油和脂肪、人造奶油、酱、谷物、饮料和混合饮料、婴儿食品（饼干、菜泥、果泥和谷物）、条形食品、小吃、巧克力制品。

[0022] 本发明进一步涉及含本发明制备得到的含多不饱脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰甾烷醇的药物组合物，其任选还含有至少一种药物可接受的添加剂、稀释剂或赋性剂。本发明的药物组合物任选还可含有至少一种药学活性剂。

[0023] 本发明的目的通过以下措施来实现：

一、制备含多不饱脂肪酰基的磷脂酰醇或磷脂酰烷醇：

步骤一：制备含多不饱脂肪酰基的磷脂酰胆碱：包括但不限于，通过以下几种公开的方法来生产的含多不饱脂肪酰基的磷脂酰胆碱，或购买的具有以下特征的商品：

1，采用脂肪酶或磷脂酶 A催化某种必须脂肪酸与大豆磷脂中的磷脂酰胆碱生成含必须脂肪酰基的磷脂酰胆碱；

2, 从海洋生物资源中提取的富含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰胆碱，所谓的海洋生物资源包含但不限于以下物种：磷虾，金枪鱼、鲑鱼或沙丁鱼的鱼卵，鱿鱼，深海鱼肝油，等等； 3，被孢霉属的微生物发酵制备得到的富含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰胆碱。

[0024] 步骤二：配制酶催化反应体系，所述反应体系为水相与有机溶剂相组成的两相反应体系或含微量水分的有机溶剂单相反应体系。其中反应底物之一为步骤一制备得到的富含多不饱脂肪酰基的磷脂酰胆碱，反应底物之二为植物醇和 /或植物烷醇，植物醇和 /或植物甾烷醇可以为 β-谷醇、菜籽醇、菜油醇、豆醇及其烷醇中的一种或几种，其来源为大豆油、花生油、玉米油、芝麻油、茶籽油、葵花籽油、菜籽油或其他植物油中的一种或几种；优选植物醇；更优选来源于大豆油、花生油、玉米油、芝麻油、茶籽油、葵花籽油、菜籽油或其他植物油中的植物醇混合物，这种植物醇混合物为 β-谷醇，豆醇，菜油甾醇，菜籽醇以及 β-谷烷醇，豆烷醇，菜油烷醇，菜籽烷醇等的混合物，这种植物醇混合物通常是 β-谷醇，豆醇，菜油醇，菜籽醇等醇为主要成分，而 β- 谷甾烷醇，豆烷醇，菜油烷醇，菜籽烷醇等为次要成分。

[0025] 步骤三，将步骤二的反应体系加入到反应器中，温度为 35~55 摄氏度，投入磷脂酶 D后持续机械搅拌进行反应。

[0026] 步骤四，将步骤三所得反应液重复萃取 2~3 次，液液分层后将有机溶剂相减压低温浓缩及干燥后制备得富含多不饱脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或烷醇；

步骤四所述制备取得的含多不饱脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰烷醇，可含有十几个分子系列，其中每一个分子系列的化学结构有以下相同和不同：（1 ) 在甘油基的 3位即 Sn-3 上都连接一个植物醇或植物烷醇；（2 ) 在甘油基的 1位 Sn-1和 2位 Sn-2上各自连接一个脂肪酰基，而在 1位 Sn-1和 /或 2位 Sn-2上通常连接含多不饱和键的长链脂肪酰基，其含义为 Sn-2位连接的脂肪酰基中有高于 5 %以上的脂肪酰基含有 2个以上的不饱和双键，或其含义为 Sn-2位连接的脂肪酰基中有高于 3 %以上的脂肪酰基含有 Omega-3不饱和双键，或其含义为 Sn-1位连接的脂肪酰基中有高于 5 %以上的脂肪酰基含有 2个以上的不饱和双键，或其含义为 Sn-1位连接的脂肪酰基中有高于 3 %以上的脂肪酰基含有 Omega-3不饱和双键;

( 3 ) 含有的不饱和双键脂肪酰基含 18至 22个碳原子，而双键的数目通常为三至六个，所述不饱和脂肪酰基特别强调来源于以下多不饱和脂酸的酰基：花生四烯酸（AA)、二十碳五烯酸（EPA)、二十二碳五烯酸（DPA)、二十二碳六烯酸（DHA) 等多不饱和脂肪酸以及它们的混合物。这些不饱和脂肪酰基是来源于步骤一中的富含不饱和脂肪酰的磷脂酰胆碱，可来源于酶催化改性反应，也可来源于步骤一中所谓的海洋生物资源。

[0027] 步骤二所述酶催化反应体系为水相与有机溶剂相组成的两相混合反应体系或含微量水分的有机溶剂单相反应体系，其实施过程为：先把步骤一中制备得到的富含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰胆碱，还有植物醇或 /和植物烷醇，溶入 C5-C9 烷烃有机溶剂，然后再加入短链烃醇和或短链烃酮，再加入含有钙盐的缓冲水溶液，从而形成水相和有机溶剂两相混合的反应体系或含微量水分的有机溶剂单相反应体系，所述水溶液和有机溶剂两相混合反应体系中各物质的配比关系如下：磷脂酰胆碱在每升混合反应液中加入的重量体积百分比为 0.5 %〜10 %，植物甾醇和 /或植物甾烷醇在每升反应液中加入的重量体积百分比为 1 %〜30 % , 钙盐在每升反应液中加入的重量体积百分比为 0.001 %〜10 %，缓冲溶液中缓冲盐的浓度则为 0〜2 摩尔 /升， C5— C9 烷烃有机溶剂在混合反应液中占有的体积百分比为 5 %~95 % , 短链烃醇或短链烃酮在总混合反应液中占有体积百分比为 1 %~80 %，水溶液和有机溶剂两相混合反应体系的 pH值在 4.0 8.5内。

[0028] 所述 C5— C8 烷烃有机溶剂为从下列物品中任选：戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷或它们的同分异构体中的任何一种溶剂或这些溶剂以任何比例混合形成的混合溶剂。 [0029] 所述短链烃醇或短链烃酮为从下列物品中任选：乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、丙酮、丁酮或它们的同分异构体中的任何一种溶剂或这些溶剂以任何比例混合形成的混合溶剂。

[0030] 二、含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰烷醇对于降低血浆中胆固醇和甘油三酯含量的功效

通过大鼠试验可以证实本发明制备得到的含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰甾烷醇具有降低血浆中胆固醇和甘油三酯含量的功效，应用的方法和获得的结果总结如下： 1，动物处理

在 2周的前处理中选取 30只重量为 150 ±20g的雄性 Wistar纯种大鼠提供高脂食物词养（食物成分见表 1 )。然后将他们随即分成 5个实验小组，每组 6只大鼠。为使全部实验食物具有相同含量的能量和脂肪，用 2% (重量 /重量）下列脂质代替对照组（1 组）食物中 2%脂肪含量（1%椰子油和 1%玉米油）：

1组： 2%脂肪含量（1%椰子油和 1%玉米油，重量 /重量）

2组： 2%谷甾醇混合物 /高油葵花油（1 : 1比例，重量 /重量）

3组： 2%的谷甾醇 -DHA磷脂酯，谷甾醇 -DHA磷脂酯也可称为含 DHA酰基的磷脂酰谷甾醇；

4组： 2%豆醇 -EPA磷脂酯，豆醇 -EPA磷脂酯也可称为含 EPA酰基的磷脂酰豆甾醇； 5 组： 2%植物醇和烷醇混合物 -EPA/DHA 磷脂酯（1 : 1 比例，重量 /重量），醇混合物 -EPA/DHA磷脂酯也可称为含 EPA和 /或 DHA酰基的磷脂酰植物醇和磷脂酰植物甾烷醇。

[0031] 实验食物的脂肪酸组成分析结果见表 2。词养条件为标准条件：室温（24土 ΓΟ，相对湿度（55 ± 10) %。让大鼠自由觅食和水，并且将它们保持 12 小时亮 /暗循环。每天替换笼中食物，弃去剩余食物并测定摄入量。在试验期开始时（0) 周和处理 2周后（第 2周）通过眶后穿刺术区血样（lml)。 4 周后，从腔静脉抽血致死大鼠，将血样保存在含有 EDTA 的样品管中。

[0032] 2, 脂质分析

将所得到的血样立即在 4°C、 1600g下离心 20分钟制备得到血浆。通过生化分析仪测定血浆中总胆固醇、甘油三酯和 HDL-胆固醇含量，并通过差减法计算非 HDL胆固醇含量。食物中的脂肪酸组成是通过气相色谱法测定。

[0033】 3，统计分析

所有数据均表示成平均值土 SD，并通过单项协方差（ANCOVA) 分析。全部实验是在 5%水平下进行的，并计算 95%置信区间。

[0034】 4，结果

在 4周喂食期中，所有大鼠生长状况相似。 5组大鼠平均摄食量为 19g/天 /只。食物处理对体重和食物消耗无明显有差异。

[0035] 在用植物醇处理过的所有四个实验组（第 2， 3， 4， 5 组）中，血浆胆固醇含量大大降低，即降低 44%〜47% (相对于对比组）以及降低 56%〜67% (相对于预处理期（0 周））（表 3 )。通过用植物醇处理几乎未影响 HDL胆固醇含量（表 4)。因此非 HDL胆固醇（ VLDL胆固醇 +LDL胆固醇）主要是通过植物醇处理而降低的。

[0036] 在用多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰烷醇处理过的实验组中（第 3， 4， 5 组）中，血浆中甘油三酯含量大大降低，即降低 36%〜41% (相对于对比组）以及降低 24%〜38% (相对于与处理期（0周））（表 5 )，但植物醇和植物油组合（第 2组）并未显著降低血浆中甘油三酯含量。

[0037] 表 1大鼠高脂食物的组成

表 2，试验食物的脂肪酸组成（脂肪酸甲酯 mol%)

表 3，含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰烷醇对大鼠血浆总胆固醇的效果 (mmol/L)

a, 相对于与处理的百分变化；

b，在第 2周或第 4周时与对比组显著不同（P<0.05);

c, 在第 2周或第 4周时与第 2组显著不同（PO.05);

表 4，含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰烷醇对大鼠脂蛋白的效果（mmol/L)

a，在第 2周或第 4周时与对比组显著不同（P<0.05);

b, 在第 2周或第 4周时与第 2组显著不同（PO.05);

表 5，含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰烷醇对大鼠血浆甘三酯的效果 (mmol/L)

a, 相对于与处理的百分变化；

b，在第 2周或第 4周时与对比组显著不同（P<0.05); c, 在第 2周或第 4周时与第 2组显著不同（P<0.05)。

[0038] 三、含本发明制备得到的含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰烷醇的营养补充食品组合物。

[0039] 本发明的新成分可以在各种产物中传递和利用。这样的产物包括食品添加剂、功能食品、药学传递系统等。

[0040] 本发明制备得到的含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰烷醇可被加工成营养补充食品组合物，并可以为软胶囊、片剂、糖浆或任何其它普通膳食补充传递系统的形式。该营养补充食品组合物目的旨在降低人的血浆胆固醇和甘油三酯含量。本发明的营养补充食品组合物优选以每天 0.2〜200 克的量应用。优选的植物甾醇有 β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽醇或它们的任何比例混合物。更优选的有 β-谷醇和豆醇或其混合物。最优选的是 β-谷醇。优选的植物烷醇有 β-谷烷醇和菜油烷醇或其混合物。更优选的是 β-谷烷醇。优选的多不饱和脂肪酰基的磷脂是指含有花生四烯酸（ΑΑ)、二十碳五烯酸 (ΕΡΑ)、二十二碳五烯酸（DPA)、二十二碳六烯酸（DHA) 等多不饱和脂肪酸以及它们的混合物所形成的脂肪酰基磷脂。最优选的是 DHA和 EPA衍生的脂肪酰基磷酯。这里指的磷酯是磷脂酰胆碱和磷脂酰植物醇和磷酯酰植物烷醇。

[0041] 四、含本发明制备得到的含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰烷醇的功能食品。

[0042] 本发明制备得到的醇酯和 /或植物烷醇酯可被作为功能性成分，添加到普通食品中制备成具有降低人血浆胆固醇和甘油三酯含量的功能食品。这样的功能食品可选自奶制品、奶饮料、冰激淋、焙烤制品、糖果制品、饼干、豆制品、豆浆饮料、糕点和面包、能量棒、酱油、调味剂、油和脂肪、人造奶油、酱、谷物、饮料和混合饮料、婴儿食品（饼干、菜泥、果泥和谷物）、条形食品、小吃、巧克力制品、膨化食品等。

[0043] 这样的功能食品优选以每天 0.1〜100 克多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰甾烷醇的总量应用。优选的植物醇有 β-谷醇、豆醇、菜油醇、菜籽醇或它们的混合物。更优选的有 β-谷醇、豆醇或其混合物。最优选的是 β-谷醇。优选的植物甾烷醇有 β-谷烷醇、菜油烷醇、菜籽烷醇或它们的混合物。更优选的是 β-谷烷醇。优选的多不饱和脂肪酰基磷脂是指含有花生四烯酸（ΑΑ)、二十碳五烯酸（ΕΡΑ)、二十二碳五烯酸（DPA)、二十二碳六烯酸（DHA) 等多不饱和脂肪酸以及它们的混合物所形成的脂肪酰基磷脂。最优选的是 DHA和 EPA衍生的脂肪酰基磷酯。这是指的磷酯是磷脂酰胆碱和磷脂酰植物醇和磷酯酰植物烷醇。 [0044] 五、含本发明制备得到的多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰烷醇的药物组合物。

[0045] 药物组合物的制备在本领域内众所周知，在许多文献和参考书中都有描述，参加例如 Gemiaro A. R. 编辑 ( 1990 ) Remington ' s Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 作为药用产品，本发明制备得到的药物组合物可口服、静脉内或通过其他任何常规或特殊给予途径传递。

[0046] 容易理解，本发明制备得到的多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰烷醇不需要以纯态化合物形式来应用。可应用这些酯的混合物。同样可应用这些含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰烷醇的其他脂肪族酯的混合物。本发明制备得到的产品可以为液态油、粉末、颗粒、蜡、糊、油性或水性乳浊液的形式，以及能够使其用于目标用途的任何其他形式。

[0047] 与现有技术相比，本发明具有如下优点： 1 ) 本发明利用公开技术制备得到的含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰胆碱，例如来源于南极磷虾油鱼籽等的含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰胆碱和来源于大豆的植物醇为反应物，利用磷脂酶 D 生物转化方法制备得到富含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰植物醇和磷脂酰植物烷醇。产品原料易得，反应条件温和、简单实用。并且，该类目标化合物到目前为止没有任何文献报道。 2 ) 本发明制备得到的多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰烷醇能同时有效降低血浆中胆固醇和甘油三酯含量。 3 ) 本发明制备得到的多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰植物烷醇可广泛的在食品添加剂、功能食品、药学传递系统中得到使用。

具体实施方式

[0048] 为了便好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

[0049] 一种制备含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰烷醇的方法，制备经过下列步骤：

步骤一，制备含多不饱脂肪酰基的磷脂酰胆碱：包括但不限于，通过 "发明内容"部分提及的多种方法。这里仅以来自南极磷虾油或金枪鱼卵中的磷脂酰胆碱，这种富含多不饱和脂肪酰基磷脂酰胆碱原料，为例说明对富含多不饱和脂肪酰基磷脂酰胆碱原料进行精制，以脂肪酶或磷酯酶 A1 或磷酯酶 A2来制备含多不饱脂肪酰基的磷脂酰胆碱，原理简单，任何具有生物学或催化背景的技术人员，均可按常规酶催化反应，以多不饱和脂肪酸和磷脂酰胆碱 (或含磷脂酰胆碱的卵磷脂）为底物，催化合成，因此这里不再赘述。 [0050] 采用溶剂萃取制备得到磷脂酰胆碱。所述溶剂可在下列物品中任选：食品安全级的正庚烷或正已烷、食用乙醇或丙酮、或者是它们的混合物。所述萃取为南极磷虾油或金枪鱼卵与溶剂在反应器混合后在氮气环境中、 0~30摄氏度下，经机械搅拌，反应 0.5 15 小时，过滤后将固体冷冻干燥得磷脂酰胆碱。所述取得的磷脂酰胆碱是富含多不饱和脂肪酰基的磷脂族，该磷脂酰胆碱族含有十几个磷脂酰胆碱分子系列，其中每一个分子系列的化学结构有以下相同和不同：（1 ) 在甘油基的 3位即 Sn-3上都连接一个胆碱；（2 ) 在甘油基的 1位 Sn- 1和 2位 Sn-2上各自连接一个脂肪酰基，而在 1位 Sn-1和 /或 2位 Sn-2上可连接一个含多不饱和多烯键的长链脂肪酰基，所述的富含多不饱和多烯键脂肪酰基，其含义为 Sn-1 和 /或 Sn-2位连接的脂肪酰基中有高于 5 %以上的脂肪酰基含有 2个以上的不饱和双键，或其含义为 Sn-1 和 /或 Sn-2位连接的脂肪酰基中有高于 3 %以上的脂肪酰基含有 Omega-3不饱和双键；（3 ) 含有的不饱和双键脂肪酰基含 18至 22个碳原子，而双键的数目通常为四至六个，所述不饱和脂肪酰基特别强调来源于以下多不饱和脂酸的酰基：花生四烯酸（AA)、二十碳五烯酸（EPA)、二十二碳五烯酸（DPA)、二十二碳六烯酸（DHA) 等多不饱和脂肪酸以及它们的混合物。

[0051] 步骤二，酶催化反应体系。所述反应体系为水相与有机溶剂相组成的两相反应体系，其实施过程为：先把步骤一中制备得到的富含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰胆碱，还有植物甾醇或 /和植物烷醇，溶入 C5-C9 烷烃有机溶剂，然后再加入短链烃醇和或短链烃酮，再加入含有钙盐的缓冲水溶液，从而形成水相和有机溶剂两相混合的反应体系或含微量水分的有机溶剂单相反应体系。所述水溶液和有机溶剂混合反应体系中各物质的配比关系如下：磷脂酰胆碱在每升混合反应液中加入的重量体积百分比为 0.5 %〜10 %，醇和 /或烷醇在每升反应液中加入的重量体积百分比为 1 %〜30 %，钙盐在每升反应液中加入的重量体积百分比为 0.001 %〜10 %，缓冲溶液中缓冲盐的浓度则为 0〜2摩尔 /升， C5 -C9烷烃有机溶剂在混合反应液中占有的体积百分比为 5 %~95 %，短链烃醇或短链烃酮在总混合反应液中占有体积百分比为 1 %~80 %，水溶液和有机溶剂两相混合反应体系的 pH值在 4.0 8.5 内。所述含微量水分的有机溶剂单相反应体系，其实施过程为：把步骤一中制备得到的富含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰胆碱，还有植物醇或 /和植物烷醇，溶入经脱水处理的 C5-C9 烷烃有机溶剂，可选择加入或不加入经脱水处理的短链烃醇和或短链烃酮，再加入含有钙盐的磷脂酶 D 干粉。所述含有微量水的有机溶剂单相体系中各物质的配比关系如下：磷脂酰胆碱在每升混合反应液中加入的重量体积百分比为 0.5 %〜10 %，醇和 /或烷醇在每升反应液中加入的重量体积百分比为 1 %〜30 %，钙盐在每升反应液中加入的重量体积百分比为 0.001 %〜10 %， C5— C9烷烃有机溶剂在混合反应液中占有的体积百分比为 50 %~95 %，短链烃醇或短链烃酮在总混合反应液中占有体积百分比为 0 %~50 %，在该体系中水的含量极低，无法与有机相分层形成水相层。

[0052] 所述 C5-C8 烷烃有机溶剂为从下列物品中任选：戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷或它们的同分异构体中的任何一种溶剂或这些溶剂以任何比例混合形成的混合溶剂。本步骤优选正庚烷和正已烷或它们的同分异构体。

[0053] 所述短链烃醇或短链烃酮为从下列物品中任选：乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、丙酮、丁酮或它们的同分异构体中的任何一种溶剂或这些溶剂以任何比例混合形成的混合溶剂。本步骤优选异丙醇或丙酮。

[0054] 本步骤中，植物醇：商品化的生物产品可为从如大豆油、菜籽油、棕榈油、棉籽油等植物油中提取出来的植物醇，其中 β-谷醇含量大于 40%，豆醇含量大于 5%，菜油醇大于 5%，和菜籽醇含量在 0〜10%，总醇含量可达 90%; 钙盐：无机和有机钙盐均可，本实施例采用的是氯化钙和硫酸钙，在水中的浓度可为 0.01 克每升至 100 克每升；缓冲液：为常规水缓冲液，例如磷酸盐水缓冲液或醋酸盐水缓冲液，一般为 0至 2摩尔每升盐浓度体系。

[0055] 步骤三，将步骤二的反应体系加入到反应器中，在氮气环境中、温度为 35~55 °C，投入磷脂梅 D后持续机械搅拌，搅拌时间为 1~24小时。

[0056] 本步骤中，磷脂酶 D: 是一种蛋白酶，是来源于微生物和 /或植物的商品化酶制剂，如 Sigma-Aldrich 公司（St. Louis, MO, U.S.A. ) 出售的磷脂酶 D (phospholipase D) , 该酶也可纯化自微生物的发酵液。磷脂酶 D 可以是干粉状酶制剂，也可以是液态酶制剂。对于含微量水的有机溶剂单相反应体系，所用磷脂酶 D为含有钙盐的干粉酶制剂。

[0057] 步骤四，将步骤三所得反应液重复萃取 1~3 次，液 -液分层后，将有机相减压浓缩冷冻干燥制备得到富含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或烷醇，完成制备。本步骤中萃取溶剂及萃取方法与步骤一中相同。

[0058] 按此方法制备的含多不饱和多烯键脂肪酰基的磷脂酰植物醇和 /或烷醇酯质量百分含量能高于 5%，经后精制加工，质量百分含量达到 5%至 95%。

[0059] 以下对本发明在具体应用中的最佳实施例进行详细说明，这些实施例并非对本发明的范围进行约束。

[0060] 实施例 1 : 制备富含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰胆碱。

[0061] 称取 20公斤鱼肝油，其含： EPA为 18.6 ± 1.4%， DHA为 12.3 ±2.1%， PC含量为 46.0±3.0%， 80升丙酮，将上述两种原料加入到 100升反应器中，向反应器中充入氮气，持续机械搅拌， 2 小时后，过滤，将固体冷冻干燥得到富含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰胆碱约 13.1 ±2.4 公斤，其中： EPA 为 26.5 ±2.1%， DHA 为 17.8 ±2.2%， PC 含量为 67.3土 3.2%。

[0062] 实施例 2: 制备富含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰胆碱。

[0063] 称取 20公斤南极磷虾油，其含： EPA为 14.2 ±2.8%， DHA为 8.8 ±2.3%， PC含量为 40.4±3.6%， 60 升丙酮，将上述两种原料加入到 100 升反应器中，向反应器中充入氮气，持续机械搅拌， 4 小时后，过滤，将固体冷冻干燥得到富含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰胆碱约 11.8±2.2公斤，其中： EPA为 19.1±3.6%， DHA为 12.2±3.0%， PC含量为 68.8土 4.2%。

[0064] 实施例 3: 制备富含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰胆碱。

[0065] 称取 20公斤金枪鱼卵，其含： EPA为 10.6±1.3%， DHA为 22.3± 1.9%， PC含量为 44.0±1.0%， 80升丙酮，将上述两种原料加入到 100升反应器中，向反应器中充入氮气，持续机械搅拌， 2 小时后，过滤，将固体冷冻干燥得到富含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰胆碱约 14.1 ±1.4 公斤，其中： EPA 为 16.5 ±2.3%， DHA 为 27.8 ±2.5%， PC 含量为 54.3土 3.2%。

[0066] 实施例 4: 制备富含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰胆碱。

[0067] 称取 20 公斤大豆磷脂（PC 含量 50%±5.0%)，在反应器中溶于正已烷中，充入氮气，加入 20公斤微生物源的 DHA和 EPA脂肪酸（ DHA/EPA约为 3/2 )，充分搅拌后，加入商用脂肪酶适量， 45 摄氏度下，反应适当时间后检测反应产物，若含多不饱和脂肪酰基的磷脂达到总磷脂 50%左右，则停止反应，加入 100 升丙酮，持续机械搅拌， 3 小时后，过滤，将固体冷冻干燥得到富含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰胆碱约 17.8±1.4 公斤，其中： EPA为 15.1±0.4%， DHA为 10.2±0.3%， PC含量为 56.5 ±0.5%。

[0068] 实施例 5: 制备含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇或磷脂酰烷醇

在 1000升反应器中，加入 300公斤正庚烷中，加入异丙醇 100公斤，然后将 30公斤质量百分浓度 90%植物醇（来源于玉米，其中 β-谷醇 40.6%，豆醇： 23.9%，菜油甾醇： 24.9%，菜籽甾醇含量 0.6%) 与实施例 1 制备得到的 13.1 公斤含多不饱和脂肪酰基磷脂酰胆碱加入反应器中，溶解 0.05公斤氯化钙， 600升 ρΗ5.6的水溶液，在氮气保护下，投入 4 万单位磷脂酶 D，于 40摄氏度，持续机械搅拌，反应 8小时停止搅拌，结束反应，静置分层，取有机相，依照反应时的正庚烷和异丙醇的比例，按与 1:1 的关系，重复萃取剩余母液 1 到 2次，集合有机萃取液，在 40摄氏度下减压浓缩至基本无有机溶剂，加入适量纯水，乳化，过滤去除不溶物，再加入 40升丙酮，过滤回收沉淀，沉淀再用 40升丙酮浸泡一段时间，过滤回收并干燥获得 12.5 ± 0.5 公斤沉淀物，其中磷脂酰醇含量为 40.4± 1.2%，沉淀物中不饱和脂肪酸含量经检测 EPA为 24.7 ± 1.8%， DHA为 16.4 ± 1.2%。

[0069] 实施例 6: 制备含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇或磷脂酰烷醇

在 1000升反应器中，加入 300公斤正庚烷中，加入异丙醇 50公斤，然后将 40公斤质量百分浓度 90%植物醇（来源于大豆，其中 β-谷醇： 44.2%，豆醇： 26.3%，菜油甾醇： 22.3%，菜籽甾醇含量 1.7%) 与实施例 2制备得到的 11.8公斤含多不饱和脂肪酰基磷脂酰胆碱加入反应器中，溶解 0.1公斤氯化钙， 300升 ρΗ5.6的水溶液，在氮气保护下，投入 5万单位磷脂酶 D，于 48 摄氏度，持续机械搅拌，反应 4 小时停止搅拌，结束反应，静置分层，取有机相，依照反应时的正庚烷和异丙醇的比例，按与 1 : 1 的关系，重复萃取剩余母液 1 到 2次，集合有机萃取液，在 40摄氏度下减压浓缩至基本无有机溶剂，加入适量纯水，乳化，过滤去除不溶物，再加入 50升丙酮，过滤回收沉淀，沉淀再用 50升丙酮浸泡一段时间，过滤回收并干燥获得 11.2 ± 0.6公斤沉淀物，其中磷脂酰醇含量为 41.1 ± 1.2%，沉淀物中不饱和脂肪酸含量经检测 EPA为 16.3 ± 1.47 %%， DHA为 10.1 ± 1.5%。

[0070] 实施例 7: 制备含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇或磷脂酰烷醇

在 1000升反应器中，加入 300公斤正庚烷中，加入异丙醇 50公斤，然后将 40公斤质量百分浓度 90%植物醇（来源于大豆，其中 β-谷醇： 44.2%，豆醇： 26.3%，菜油甾醇： 22.3%，菜籽甾醇含量 1.7%) 与实施例 3制备得到的 14.1 公斤含多不饱和脂肪酰基磷脂酰胆碱加入反应器中，溶解 0.1 公斤氯化钙， 300升 ρΗ5.6的水溶液，在氮气保护下，投入 5 万单位磷脂酶 D，于 48摄氏度，持续机械搅拌，反应 4小时停止搅拌，结束反应，静置分层，取有机相，依照反应时的正庚烷和异丙醇的比例，按与 1 : 1 的关系，重复萃取剩余母液 1 到 2次，集合有机萃取液，在 40摄氏度下减压浓缩至基本无有机溶剂，加入适量纯水，乳化，过滤去除不溶物，再加入 50升乙醇，过滤回收沉淀，沉淀再用 50升乙醇浸泡一段时间，过滤回收并干燥获得 12.3 ± 0.5 公斤沉淀物，其中磷脂酰醇含量为 40.1 ± 1.3%，沉淀物中不饱和脂肪酸含量经检测 EPA为 16.9 ± 1.6%%， DHA为 10.8 ± 1.3%。

[0071] 实施例 8: 制备含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇或磷脂酰烷醇

在 1000升反应器中，加入 300公斤正庚烷中，加入异丙醇 50公斤，然后将 60公斤质量百分浓度 90%植物醇（来源于葵花籽，其中 β-谷醇 42.8%，豆醇： 21.7%，菜油甾醇： 24.1%, 菜籽甾醇含量 1.4%) 与实施例 4 中得到的 10.0 公斤磷脂酰胆碱加入反应器中，溶解 0.5公斤氯化钙在氮气保护下，投入 5万单位磷脂酶 D，于 40摄氏度范围内，持续机械搅拌，反应 12小时停止搅拌，结束反应，在 40摄氏度下减压浓缩至基本无有机溶剂，加入 50升乙醇，搅拌浸泡 12小时，过滤回收并干燥获得 14.2 ± 0.5 公斤沉淀物，其中磷脂酰甾醇含量为 38.1 ± 1.5%，沉淀物中不饱和脂肪酸含量经检测 EPA 为 14.6 ± 1.4%%， DHA 为 9.2 ± 1.1%。

[0072】实施例 9: 制备含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇或磷脂酰烷醇

在 1000升反应器中，加入 300公斤正庚烷中，加入异丙醇 60公斤，然后将 60公斤质量百分浓度 90%植物醇（来源于大豆，其中 β-谷醇： 44.2%，豆醇： 26.3%，菜油甾醇： 22.3%, 菜籽甾醇含量 1.7%) 与实施例 3 中得到的 10.0 公斤磷脂酰胆碱加入反应器中，溶解 0.5公斤氯化钙在氮气保护下，投入 5万单位磷脂酶 D，于 48摄氏度，持续机械搅拌，反应 4小时停止搅拌，结束反应，在 40摄氏度下减压浓缩至基本无有机溶剂，加入 50升乙醇，搅拌浸泡 4小时，过滤回收并干燥获得 13.8 ± 0.5 公斤沉淀物，其中磷脂酰醇含量为 38.4 + 1.4%, 沉淀物中不饱和脂肪酸含量经检测 EPA为 14.5 ± 1.1%%， DHA为 9.3 ± 1.0%。

[0073】实施例 10: 制备含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇或磷脂酰烷醇

在 1000升反应器中，加入 300公斤正庚烷中，加入异丙醇 75公斤，然后将 50公斤质量百分浓度 90%植物醇（来源于花生，其中 β-谷醇 43.1%，豆醇： 22.3%，菜油甾醇： 24.1%, 菜籽甾醇含量 0.5%) 与实施例 4制备得到的 17.8 公斤含多不饱和脂肪酰基磷脂酰胆碱加入反应器中，溶解 0.3公斤氯化钙， 500升 ρΗ5.6的水溶液，在氮气保护下，投入 10 万单位磷脂酶 D，于 45摄氏度，持续机械搅拌，反应 6小时停止搅拌，结束反应，静置分层，取有机相，依照反应时的正庚烷和异丙醇的比例，按与 1 : 1 的关系，重复萃取剩余母液 2 次，集合有机萃取液，在 40 摄氏度下减压浓缩至基本无有机溶剂，加入 50 升纯水，乳化，过滤去除不溶物，再加入 80 升丙酮，过滤回收沉淀，沉淀再用 50 升丙酮浸泡一段时间，过滤回收并干燥获得 16.7 ± 0.5 公斤沉淀物，其中磷脂酰醇含量为 48.1 ±2.2%，沉淀物中不饱和脂肪酸含量经检测 EPA为 14.9 ± 1.5%%， DHA为 10.4 ± 1.3%。

[0074】实施例 11 : 制备含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇或磷脂酰烷醇

在 1000升反应器中，加入 300公斤正庚烷中，加入异丙醇 60公斤，然后将 60公斤质量百分浓度 50%植物烷醇（来源于大豆，其中 β-谷烷醇： 29.6%，豆烷醇： 11.3%，菜油甾烷醇： 8.3%，菜籽甾烷醇含量 0.8%) 与实施例 3中得到的 10.0公斤磷脂酰胆碱加入反应器中，溶解 0.5公斤氯化钙在氮气保护下，投入 5万单位磷脂酶 D，于 50摄氏度，持续机械搅拌，反应 4小时停止搅拌，结束反应，在 40摄氏度下减压浓缩至基本无有机溶剂， 30 升丙酮，搅拌浸泡 4小时，过滤回收并干燥获得 14.8 ±0.2公斤沉淀物，其中磷脂酰烷醇含量为 38.6 ± 1.4%，沉淀物中不饱和脂肪酸含量经检测 EPA为 14.3 ± 1.1%%， DHA为 9.5 ± 1.2%。

[0075] 实施例 12: 二十二碳六烯（DHA) 酰磷脂酰谷甾醇的制备

在 250ml反应器中，在氮气保护下，于 45摄氏度，持续机械搅拌，加入 200ml正庚烷，加入 lg 二十二碳六烯酸酰磷脂酰胆碱（PC 纯度： 90%， DHA含量为 42.1%)、 5g谷甾醇 (纯度： 95% ) 溶解，加入 O.lg 氯化钙，和 40ml 异丙醇， 200ml pH5.6 范围内的水缓冲液，投入 2万单位磷脂酶 D，反应 4小时停止搅拌，结束反应，静置分层，取有机相，依照前述方法重复萃取 2次，集合有机萃取液，在 20摄氏度下减压浓缩，加水乳化过滤，水相加 100ml丙酮沉淀， 200ml丙酮浸洗沉淀，过滤干燥获得 1.08 ± 0.09g二十二碳六烯酸酰磷脂酰豆甾醇酯，其中其 DHA含量经 GC检测为 39.8%，磷脂酰谷甾醇含量为 45.6 ±2.3%。

[0076] 实施例 13 : 二十碳五烯（EPA) 酰磷脂酰谷甾醇的制备

在 250ml反应器中，在氮气保护下，于 40摄氏度，持续机械搅拌，加入 200ml正庚烷，加入 lg二十碳五烯酸酰磷脂酰胆碱（PC纯度： 90%， DHA含量为 42.1%)、 3g谷醇（纯度： 95%) 溶解，加入 O.lg氯化钙，和 60ml异丙醇， 400ml pH6.0的水缓冲液，投入 2万单位磷脂酶 D，反应 8小时停止搅拌，结束反应，静置分层，取有机相，依照前述方法重复萃取 2次，集合有机萃取液，在 20摄氏度下减压浓缩，加水乳化过滤，水相加 100ml丙酮沉淀， 200ml 丙酮浸洗沉淀，过滤干燥获得 1.01 ± 0.14g 二十碳五烯酸酰磷脂酰豆甾醇酯，其中其 DHA含量经 GC检测为 40.6%，磷脂酰谷甾醇含量为 46.6 ±2.0%。

[0077] 实施例 14: 二十二碳六烯（DHA) 酰磷脂酰谷甾烷醇的制备

在 250ml反应器中，在氮气保护下，于 47摄氏度，持续机械搅拌，加入 200ml正庚烷，加入 lg二十二碳六烯酸酰磷脂酰胆碱（PC纯度： 90%， DHA含量为 42.1%)、 5g谷甾烷醇 (纯度大于 90%) 溶解，加入 O.lg氯化钙，和 40ml异丙醇， 200ml pH5.6范围内的水缓冲液，投入 2万单位磷脂酶 D，反应 4小时停止搅拌，结束反应，静置分层，取有机相，依照前述方法重复萃取 2次，集合有机萃取液，在 20摄氏度下减压浓缩，加水乳化过滤，水相加 100ml丙酮沉淀， 200ml丙酮浸洗沉淀，过滤干燥获得 1.07 ± 0.22g二十二碳六烯酸酰磷脂酰豆甾烷醇酯，其中其 DHA含量经 GC 检测为 39.5%，磷脂酰谷甾烷醇含量为 45.1土 2.0%。

[0078] 实施例 15 : 二十碳五烯（EPA) 酰磷脂酰谷甾烷醇的制备

在 250ml反应器中，在氮气保护下，于 40摄氏度，持续机械搅拌，加入 200ml正庚烷，加入 lg 二十碳五烯酸酰磷脂酰胆碱（PC 纯度： 90%， DHA 含量为 42.1%)、 3g 谷甾烷醇 (纯度： 95%) 溶解，加入 O.lg氯化钙，和 50ml异丙醇， 400ml pH6.0的水缓冲液，投入 2 万单位磷脂酶 D，反应 8小时停止搅拌，结束反应，静置分层，取有机相，依照前述方法重复萃取 2次，集合有机萃取液，在 20摄氏度下减压浓缩，加水乳化过滤，水相加 100ml丙酮沉淀， 200ml 丙酮浸洗沉淀，过滤干燥获得 1.02 ± 0.12g 二十碳五烯酸酰磷脂酰豆烷醇酯，其中其 DHA含量经 GC检测为 39.7%，磷脂酰谷甾烷醇含量为 46.1 ± 1.5%。

[0079] 实施例 16: 二十碳五烯（EPA) 酰磷脂酰菜油甾醇的制备

在 250ml反应器中，在氮气保护下，于 50摄氏度，持续机械搅拌，加入 200ml正庚烷，加入 lg二十碳五烯酸酰磷脂酰胆碱（PC 纯度： 90%， DHA含量为 42.1%)、 10g菜油甾醇 (纯度： 90%) 溶解，加入 O.lg氯化钙，和 30ml异丙醇， 300ml pH6.5的水缓冲液，投入 2 万单位磷脂酶 D，反应 6小时停止搅拌，结束反应，静置分层，取有机相，依照前述方法重复萃取 2次，集合有机萃取液，在 20摄氏度下减压浓缩，加水乳化过滤，水相加 100ml丙酮沉淀， 200ml 丙酮浸洗沉淀，过滤干燥获得 1.05 ± 0.14g 二十碳五烯酸酰磷脂酰菜油甾醇酯，其中其 DHA含量经 GC检测为 41.3%，磷脂酰菜油甾醇含量为 48.1 ± 1.3%。

[0080] 实施例 17: 二十碳五烯（EPA) 酰磷脂酰菜油甾烷醇的制备

在 250ml反应器中，在氮气保护下，于 45摄氏度，持续机械搅拌，加入 200ml正庚烷，加入 lg二十碳五烯酸酰磷脂酰胆碱（PC纯度： 90%， DHA含量为 42.1%)、 10g菜油烷醇 (纯度： 95%) 溶解，加入 O.lg氯化钙，和 70ml异丙醇， 300ml pH6.5的水缓冲液，投入 2 万单位磷脂酶 D，反应 5小时停止搅拌，结束反应，静置分层，取有机相，依照前述方法重复萃取 2次，集合有机萃取液，在 30摄氏度下减压浓缩，加水乳化过滤，水相加 100ml丙酮沉淀， 200ml 丙酮浸洗沉淀，过滤干燥获得 1.09 ± 0.11g 二十碳五烯酸酰磷脂酰菜油甾烷醇酯，其中其 DHA含量经 GC检测为 40.5%，磷脂酰菜油甾烷醇含量为 46.6 ± 1.1%。

[0081] 实施例 18: 二十二碳五烯（DPA) 酰磷脂酰菜油甾烷醇的制备

在 250ml反应器中，在氮气保护下，于 45摄氏度，持续机械搅拌，加入 200ml正庚烷，加入 lg二十二碳五烯酸酰磷脂酰胆碱（PC纯度： 90%， DPA含量为 40.8%)、 10g菜油甾烷醇（纯度： 95%) 溶解，加入 O.lg氯化钙，和 70ml异丙醇， 300ml pH6.5 的水缓冲液，投入 2万单位磷脂酶 D，反应 5小时停止搅拌，结束反应，静置分层，取有机相，依照前述方法重复萃取 2 次，集合有机萃取液，在 30 摄氏度下减压浓缩，加水乳化过滤，水相加 100ml丙酮沉淀， 200ml丙酮浸洗沉淀，过滤干燥获得 1.15 ± 0.21g二十碳五烯酸酰磷脂酰菜油甾烷醇酯，其中其 DPA 含量经 GC 检测为 40.3%，磷脂酰菜油甾烷醇含量为 44.9土 1.3%。

[0082] 实施例 19: 花生四烯酸（AA) 酰磷脂酰菜油烷醇的制备

在 250ml反应器中，在氮气保护下，于 45摄氏度，持续机械搅拌，加入 200ml正庚烷，加入 lg花生四烯酸（AA) 酰磷脂酰胆碱（PC纯度： 90%， AA含量为 44.5%)、 10g菜油甾烷醇（纯度： 95%) 溶解，加入 O.lg氯化钙，和 70ml异丙醇， 300ml pH6.5 的水缓冲液，投入 2万单位磷脂酶 D，反应 5小时停止搅拌，结束反应，静置分层，取有机相，依照前述方法重复萃取 2 次，集合有机萃取液，在 30 摄氏度下减压浓缩，加水乳化过滤，水相加 100ml丙酮沉淀， 200ml丙酮浸洗沉淀，过滤干燥获得 1.05 ± 0.17g花生四烯酸酰磷脂酰菜油甾烷醇酯，其中其 AA含量经 GC检测为 42.6%，磷脂酰菜油甾烷醇含量为 43.8 ± 1.1%。

[0083] 实施例 20: 花生四烯酸（AA) 酰磷脂酰谷醇的制备

在 250ml反应器中，在氮气保护下，于 40摄氏度，持续机械搅拌，加入 200ml正庚烷，加入 lg花生四烯酸（AA) 酰磷脂酰胆碱（PC纯度： 90%， AA含量为 44.5%)、 3g谷甾醇 (纯度： 95%) 溶解，加入 O.lg氯化钙，和 60ml异丙醇， 400ml pH6.0的水缓冲液，投入 2 万单位磷脂酶 D，反应 8小时停止搅拌，结束反应，静置分层，取有机相，依照前述方法重复萃取 2次，集合有机萃取液，在 20摄氏度下减压浓缩，加水乳化过滤，水相加 100ml丙酮沉淀， 200ml 丙酮浸洗沉淀，过滤干燥获得 1.17 ± 0.14g 花生四烯酸酰磷脂酰豆甾醇酯，其中其 AA含量经 GC检测为 41.6%，磷脂酰谷甾醇含量为 45.6 ±2.0%。

[0084] 实施例 21 : 二十二碳五烯（DPA) 酰磷脂酰谷醇的制备

在 250ml反应器中，在氮气保护下，于 40摄氏度，持续机械搅拌，加入 200ml正庚烷，加入 lg二十二碳五烯酸酰磷脂酰胆碱（PC纯度： 90%， DPA含量为 40.8%)、 3g谷醇（纯度： 95%) 溶解，加入 O.lg氯化钙，和 60ml异丙醇， 400ml pH6.0的水缓冲液，投入 2万单位磷脂酶 D，反应 8小时停止搅拌，结束反应，静置分层，取有机相，依照前述方法重复萃取 2次，集合有机萃取液，在 20摄氏度下减压浓缩，加水乳化过滤，水相加 100ml丙酮沉淀， 200ml 丙酮浸洗沉淀，过滤干燥获得 1.01 ± 0.17g 二十碳五烯酸酰磷脂酰豆甾醇酯，其中其 DPA含量经 GC检测为 40.1%，磷脂酰谷甾醇含量为 44.3 ±2.0%。

[0085]

实施例 22: —种含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇的食用调和油

称取玉米油 400g，大豆油 250g，菜籽油 50g，葵花油 90g，米糠油 50g，花生油 50g，多不饱和脂肪酰基磷脂酰醇 50至 500g，抗氧化剂 TBHQ0.05g，搅拌均匀即可。

[0086] 实施例 23 : —种含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇的膨化食品称取富含多不饱和脂肪酰基磷脂酰醇 20-300g，食盐 3g，淀粉 1000g，调味剂 70g，维生素 E0.5g，先将磷脂酰醇，食盐，淀粉，维生素 E等放在一起搅匀，然后将其放入膨化主机内膨化，定型，将调味剂放入调味机内，然后将膨化、定型好的食品放入调味机内调味后即可。

[0087] 实施例 24: —种含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇的液体奶制品

称取牛奶 992g，乳化剂 lg，含多不饱和脂肪酰基磷脂酰醇酯 5-200g，维生素 Elg，抗坏血酸棕榈酸酯 lg，经过配料，巴氏杀菌或超高温灭菌，无菌灌装得到奶制品。

[0088] 实施例 25 : —种含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇的液体豆奶制品

称取 1kg大豆进行 12小时水浸，加入 7倍的水后磨碎，将豆渣分离后，在 100°C加热脱臭后，离心分离后，对所得液体部分进行冷却，得到豆乳，将豆乳用水调制，使其大豆固体含量达到 10%，在其中加入含多不饱和脂肪酰基磷脂酰甾醇酯 10-200g，维生素 E0.5g，抗坏血酸棕榈酸酯 0.5g，用均质机搅拌均匀即可。

[0089] 实施例 26: —种含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇的木菠萝饮料

称取 500g水，加入乳化剂 5g，维生素 E0.2g，抗坏血酸棕榈酸酯 0.3g，富含多不饱和多烯键脂肪酰基磷脂酰醇酯 10-200g，制取水包油乳状液，加入三梨酸钾 lg，木糖醇 50g，木菠萝香料 1.5g，嗜酸乳杆菌 0.2g，水补足 1000g搅拌均匀即可。

[0090] 在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围，一个有本专业知识的普通技术人员，仍可以根据本专利所传授的技术，在本发明的范围内产生其它的实施例，但是凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

权利要求书

-种含多不饱脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰垸醇，结构式如下:

式中： Sn-1、 Sn-2和 Sn-3分别指磷脂中甘油酯基团的 1位、 2位和 3位；和为下述基团中的一种：一C₁₉H₂₉、一C₁₉H₃₁、一 C₂₁H₃₁或一 C₂₁H₃₃， X为甾醇或甾垸醇中的一种。

2. 根据权利要求 1 所述的含多不饱脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰垸醇，其特征是：甾醇和 /或垸醇选自下述结构式的化合物或混合物：

3. 根据权利要求 2所述的含多不饱脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰垸醇，其特征是：所述醇为 β-谷醇或豆醇或其混合物。

4. 根据权利要求 3 所述的含多不饱脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰垸醇，其特征是：所述甾醇为 β-谷甾醇。

5. 根据权利要求 2所述的含多不饱脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰垸醇，其特征是：所述垸醇为 β-谷垸醇或豆垸醇或其混合物。

6. 根据权利要求 5 所述的含多不饱脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰垸醇，其特征是：所述垸醇为 β-谷垸醇。

7. 一种制备权利要求 1 所述含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰垸醇的方法，其特征是，包括以下步骤：首先制备得到含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰胆碱，然后在水相和有机溶剂两相混合体系或含有微量水分的有机溶剂单相体系中，再加入植物醇或植物甾垸醇或它们的混合物，利用磷脂酶 D 生物催化制备成含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰垸醇。

8. 根据权利要求 7 所述的制备含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰垸醇的方法，其特征是，水相和有机溶剂两相混合体系或含有微量水分的有机溶剂单相体系制备：含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰胆碱，还有植物醇或 /和植物垸醇，溶入 C5-C9 垸烃有机溶剂，然后再加入短链烃醇和或短链烃酮，再加入含有钙盐的缓冲水溶液，从而形成水相和有机溶剂两相混合体系或含微量水分的有机溶剂单相体系。

9. 根据权利要求 8 所述的制备含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰垸醇的方法，其特征是，所述水相和有机溶剂两相混合体系中各物质的配比关系如下：磷脂酰胆碱在每升混合反应液中加入的重量体积百分比为 0.5 %〜10%，植物醇和 /或植物垸醇在每升反应液中加入的重量体积百分比为 1 %〜30%，钙盐在每升反应液中加入的重量体积百分比为 0.001 %〜10%，缓冲溶液中缓冲盐的浓度则为 0〜2摩尔 /升， C5— C9垸烃有机溶剂在混合反应液中占有的体积百分比为 5 % ~95 %，短链烃醇或短链烃酮在总混合反应液中占有体积百分比为 1 %~80%，水溶液和有机溶剂两相混合反应体系的 pH值在 4.0~8.5内。

10. 根据权利要求 8 所述的制备含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰垸醇的方法，其特征是，所述 C5-C8 垸烃有机溶剂为从下列化合物中任选：戊垸、己垸、环己垸、庚垸、辛垸、壬垸、癸垸或它们的同分异构体中的任何一种溶剂或这些溶剂以任何比例混合形成的混合溶剂；所述短链烃醇或短链烃酮为从下列化合物中任选：乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、丙酮、丁酮或它们的同分异构体中的任何一种溶剂或这些溶剂以任何比例混合形成的混合溶剂。

11. 根据权利要求 10所述的制备含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和 /或磷脂酰垸醇的方法，其特征是，所述 C5-C8 垸烃有机溶剂为正庚垸和正已垸或它们的同分异构体；所述短链烃醇或短链烃酮为丙醇或丙酮。

12. 含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰醇和磷脂酰垸醇作为添加剂在降低人血浆中胆固醇和甘油三酯含量的功能食品、烹饪料、饮料中的应用。