CN102365031A - 生产植物甾醇/植物甾烷醇磷脂酯的方法 - Google Patents

生产植物甾醇/植物甾烷醇磷脂酯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生产植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的方法，其包括a)将含至少约10％至约70％植物磷脂和至少约5％水的磷脂组合物、脂质酰基转移酶和植物甾醇和/或植物甾烷醇混合；和b)从所述混合物分开、分离或纯化至少一种植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯。本发明还涉及通过该方法产生的包含植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的组合物，所述组合物包括食品和个人护理品(化妆品)组合物。

Description

生产植物甾醇/植物甾烷醇磷脂酯的方法
技术领域
本发明涉及利用脂质酰基转移酶(lipid acyltransferase)生产植物甾醇酯和/或植物甾烷醇(phytostanol)酯的方法。本发明进一步涉及脂质酰基转移酶用于生产植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的用途。
背景技术
已经知晓，植物甾醇酯主要由于其降低胆固醇的作用而被引入至诸如蛋黄酱和人造黄油的食品中。富含植物甾醇酯或植物甾烷醇酯的食品通常被称为“功能食物”(即富含人造黄油)。个人护理品(化妆品)业也已经使用了植物甾烷醇酯和植物甾醇酯。更优选在食物和其它应用中使用甾醇酯和/或甾烷醇(stanol)酯而非游离甾醇或甾烷醇，原因是甾醇酯和/或甾烷醇酯更稳定。
传统上，通过利用脂肪酸对相应甾醇/甾烷醇化合物进行化学酯化作用而产生甾醇酯和/或甾烷醇酯。用于制备甾醇酯的酶促方法是已知的，但通常需要有机溶剂和/或分子筛。在已知产生甾醇酯和/或甾烷醇酯的方法中，在可将甾醇酯和/或甾烷醇酯用在某些应用中(尤其是食物应用中)前通常需要数个纯化步骤。
消费者和企业迫切需要可持续的，且比利用化学品和有机溶剂系统的甾醇酯和/或甾烷醇酯生产更环境友好且脂肪较少的产品和生产方法。
因此，本发明的一个目的是提供更可持续的、环境更友好的且脂肪较少的植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯生产方法。
发明内容
本发明的各方面呈现在权利要求书和以下评述中。
已经意外发现，通过将含至少约10％至约70％植物磷脂和至少约5％水的磷脂组合物与酰基转移酶和植物甾醇和/或植物甾烷醇组合而可以通过在含水环境中使用脂质酰基转移酶实现用于生产植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的高效且有效的方法。
该方法提供了可持续的、环境友好的且脂肪较少的植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯生产方法。
具体实施方式
本发明第一方面提供了一种用于生产植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的方法，所述方法包括：a)通过将含至少约10％至约70％植物磷脂的磷脂组合物、脂质酰基转移酶和植物甾醇和/或植物甾烷醇以及任选的水混合而制备反应组合物，其中所述反应组合物包含至少2％w/w水；和b)分离或纯化至少一种植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯。
本发明另一方面提供了一种生产植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的方法，所述方法包括：a)将含至少约10％至约70％植物磷脂和至少约2％水的磷脂组合物、脂质酰基转移酶和植物甾醇和/或植物甾烷醇混合；和b)从所述混合物分离或纯化至少一种植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯。
本发明的另一方面提供了脂质酰基转移酶在包含a)含至少约10％至约70％植物磷脂的磷脂组合物、b)至少约2％水和c)所加入的植物甾醇和/或植物甾烷醇的反应组合物中生产植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的用途。
本发明另一方面提供了脂质酰基转移酶在含有至少约10％至约70％植物磷脂和至少约5％水的磷脂组合物中生产植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的用途，其中植物甾醇和/或植物甾烷醇被添加至所述磷脂组合物。
本发明在另一方面进一步提供了一种生产包含植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的食品的方法，其中所述方法包括向食品和/或食物物料中加入通过本发明的任何方法和/或用途获得的植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的步骤。
在再进一步的实施方式中，本发明提供了一种生产包含植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的个人护理品(例如化妆品)的方法，其中所述方法包括向进一步的个人护理品(例如化妆品)组分中加入通过本发明的任何方法和/或用途获得的植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的步骤。
本发明的另一方面提供了一种包含通过本发明的任何方法和/或用途获得的植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的组合物。
本发明的再一方面提供了一种包含通过本发明的任何方法和/或用途获得的植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的食品。
本发明进一步提供了一种包含通过本发明的任何方法和/或用途获得的植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯和任选的化妆品稀释剂、赋形剂或载体的个人护理品(例如化妆品)组合物。
优选地，所述植物甾醇和/或植物甾烷醇以反应组合物、整个混合物或整个组合物的至少5％的量加入。
在一种实施方式中，优选地，所述植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯与食品或食物成分混合。
在另一种实施方式中，优选地，所述植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯与药物稀释剂、载体或赋形剂或者化妆品稀释剂、载体或赋形剂混合。
优选地，所述植物甾醇和/或植物甾烷醇包含一种或多种以下结构特征：
i)3-β-羟基或3-α羟基；和/或
ii)在顺式位置的A:B环或在反式位置的A:B环或者C5-C6是不饱和的。
在一种实施方式中，优选地，植物甾醇选自由以下一种或多种组成的组：α-谷甾醇(sitosterol)、β-谷甾醇、豆甾醇(stigmasterol)、麦角固醇(ergosterol)、油菜甾醇(campesterol)、5，6-二氢固醇、菜子固醇(brassicasterol)、α-菠菜甾醇(spinasterol)、β-菠菜甾醇、γ-菠菜甾醇、δ-菠菜甾醇、岩藻甾醇(fucosterol)、dimosterol、子囊甾醇(ascosterol)、serebisterol、表甾醇(episterol)、anasterol、燕麦甾醇(avenasterol)、γ-谷甾醇(clionasterol)、α-苯基丁酰胺(hyposterol)、菠菜甾醇(chondrillasterol)、链甾醇(desmosterol)、海绵甾醇(chalinosterol)、多孔甾醇(poriferasterol)、γ-谷甾醇(clionasterol)、固醇糖苷(sterol glycoside)和其它天然或合成的同分异构形式和衍生物。
在一种实施方式中，优选地，植物甾烷醇选自由以下一种或多种组成的组：α-谷甾烷醇(sitostanol)、β-谷甾烷醇、豆甾烷醇(stigmastanol)、麦角甾烷醇(ergostanol)、油菜甾烷醇(campestanol)、5，6-二氢甾烷醇、菜子甾烷醇(brassicastanol)、α-菠菜甾烷醇(spinastanol)、β-菠菜甾烷醇、γ-菠菜甾烷醇、δ-菠菜甾烷醇、岩藻甾烷醇(fucostanol)、dimostanol、子囊甾烷醇(ascostanol)、serebistanol、表甾烷醇(epistanol)、anastanol、燕麦甾烷醇(avenastanol)、γ-谷甾烷醇(clionastanol)、hypostanol、菠菜甾烷醇(chondrillastanol)、链甾烷醇(desmostanol)、海绵甾烷醇(chalinostanol)、多孔甾烷醇(poriferastanol)、γ-谷甾烷醇(clionastanol)、甾烷醇糖苷(stanolglycoside)和其它天然或合成的同分异构形式和衍生物。
合适地，用于本发明的植物甾烷醇可以通过甾醇的氢化而获得(参见，例如US 6,866,837)。
一方面，加入至磷脂组合物或与磷脂组合物混合的植物甾醇和/或植物甾烷醇可以是一种或多种植物甾醇，一种或多种植物甾烷醇或者是至少一种植物甾醇和至少一种植物甾烷醇的混合物。
优选地，所述磷脂组合物中的植物甾醇和/或植物甾烷醇是外源的(即不是天然存在的)。换句话说，所述植物甾醇和/或植物甾烷醇是被加入至磷脂组合物中的。因此，本文使用的术语“所加入的植物甾醇”或“所加入的植物甾烷醇”表示植物甾醇和/或植物甾烷醇是非天然存在于磷脂组合物中的外源植物甾醇和/或植物甾烷醇。即使一些植物甾醇和/或植物甾烷醇不天然存在于磷脂组合物中，优选将另外的外源植物甾醇和/或植物甾烷醇加入至磷脂组合物或与磷脂组合物混合。合适地，在一个方面，植物甾醇和/或植物甾烷醇的加入量可以使反应组合物，例如反应混合物和/或反应组合物以1∶1的比例包含植物磷脂和植物甾醇/植物甾烷醇。由此使磷脂和植物甾醇/植物甾烷醇均不限制反应速率。
优选地，以反应组合物或整个混合物或整个组合物的至少约5％(或至少约10％或至少约15％或至少约20％)的量加入植物甾醇和/或植物甾烷醇。
在一个方面，以反应组合物或整个混合物或整个组合物的小于约30％，合适地小于约25％，合适地小于约21％的量加入植物甾醇和/或植物甾烷醇。
在一种实施方式中，本发明的方法和用途中使用的植物甾醇和/或植物甾烷醇可以是植物甾醇和/或植物甾烷醇的天然来源，例如大豆油脱臭馏出物(SODD)。
优选地，也可以在本发明的方法或用途中产生溶血磷脂(lyso-phospholipid)。
当也产生了溶血磷脂时，优选纯化或分离所述溶血磷脂。
本发明的“磷脂组合物”可以是包含至少约10％至约70％植物磷脂的任何组合物。
合适地，所述磷脂组合物可以包含一种或多种植物磷脂。在一种实施方式中，所述磷脂组合物是两种或更多种，优选3种或更多种植物磷脂的混合物。
在一种实施方式中，所述磷脂组合物包含约10％至约65％，或者约10％至约50％，或者约10％至约40％植物磷脂。
在一个方面，所述磷脂组合物包含至少约10％植物磷脂，至少约20％植物磷脂或至少约30％植物磷脂。
在一个方面，所述磷脂组合物包含至多约70％植物磷脂，至多约60％植物磷脂，至多约50％植物磷脂，或至多约40％植物磷脂。
在一种实施方式中，本发明的“磷脂组合物”可以是包含至少约10％至约70％植物磷脂和至少2％水的任何组合物。
在一种实施方式中，所述磷脂组合物可以包含至少5％水，或者至少10％水或至少20％水。
在一种实施方式中，所述磷脂组合物可以包含至多30％水，或者至多40％水或至多50％水。
除了磷脂和水外，所述磷脂组合物可以包含一种或多种进一步的成分，例如甘油三酯或游离脂肪酸。
本发明使用的术语“植物磷脂”表示从植物获得的或可从植物获得的磷脂。合适地，植物磷脂可以是选自以下组的一种或多种磷脂：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。
所述磷脂组合物可以通过混合其组分而制备。
合适地，所述磷脂组合物可以包含来自任何植物或植物油的植物磷脂，例如来自大豆油、菜籽油(rape seed oil)、玉米油、棉籽油、棕榈油、椰子油、米麸油、花生油、橄榄油、红花油、棕榈仁油、菜籽油(canola oil)和葵花油的一种或多种。
优选地，所述磷脂组合物中的植物磷脂从大豆油、玉米油、葵花油和菜籽油(rape seed oil，canola oil)中的一种或多种获得或者可以从大豆油、玉米油、葵花油和菜籽油中的一种或多种获得。
更优选地，所述磷脂组合物中的植物磷脂可以从大豆油、葵花油或菜籽油中的一种或多种获得或者是从大豆油、葵花油或菜籽油中的一种或多种获得的。
最优选地，所述磷脂组合物中的植物磷脂可以从大豆油获得或者是从大豆油获得的。
本发明尤其有利，原因是其可以使用植物加工的副产物作为起始材料。
例如，在本发明中使用的磷脂组合物可以是脱胶的粗植物油的副产物，在这个过程中粗植物油在精炼前或者在精炼过程中脱胶以产生脱胶食用油和橡胶相(副产物)。在这个过程中，粗油被脱胶(通过例如一种或多种化学脱胶、酶促脱胶、水脱胶、整体脱胶和超级脱胶)以从油除去磷脂，即极性脂质的混合物(尤其是磷脂)，所述橡胶相因此是极性脂质、尤其是磷脂(与其它组分，例如水、甘油三酯和游离脂肪酸一起)的混合物。橡胶组合物(或橡胶相)中的水含量可以在10-40％w/w范围内。橡胶组合物(或橡胶相)中的磷脂含量可以在10-70％w/w范围内。因此，在一种实施方式中，本发明的磷脂组合物可以是由植物油脱胶获得的“橡胶相”或“橡胶组合物”或者是可以由植物油脱胶获得的“橡胶相”或“橡胶组合物”。
可选地或者除此之外，本发明中使用的磷脂组合物可以是精炼粗植物油的不同副产物，即皂料。皂料是通过用酸和/或碱(例如氢氧化钠)处理粗植物油获得的副产物。通常，对所产生的混合物进行离心以分离食用油和皂料。所述皂料因此是极性脂质、尤其是磷脂(与其它组分，例如水、甘油三酯和游离脂肪酸盐一起)的混合物。皂料中的水含量可以在10-65％或10-70％w/w的范围内。皂料中的磷脂含量可以在10-70％w/w的范围内。因此，在一种实施方式中，本发明的磷脂组合物可以是由植物油的酸和/或碱处理获得的皂料或可以由植物油的酸和/或碱处理获得的皂料。
当所述磷脂组合物是橡胶组合物(即橡胶相)或者皂料时，在将其与磷脂酰基转移酶和植物甾醇和/或植物甾烷醇和任选的水混合前，合适地可以将所述橡胶组合物或皂料纯化、或干燥、或者溶剂分级、或者这些操作中两种或更多种的组合。
在一些实施方式中，本文使用的磷脂组合物是不包含水或包含非常少水的干燥组合物。这种磷脂组合物可以包括干燥的橡胶相组合物或干燥的皂料。在这样的实施方式中，可以向反应组合物中加入水以确保所述反应组合物包含至少2％，优选至少5％，优选至少10％，更优选至少20％的水。
在其他种实施方式中，所述磷脂组合物本身(即天然地)可以包含一些水，例如其可以包含至少2％的水(优选至少5％，优选至少10％，更优选至少20％的水)。这种磷脂组合物包括还没有被干燥的橡胶相和皂料组合物。在这样的实施方式中，如在磷脂组合物本身含有足量的水从而在反应组合物中具有至少2％的水，则可以不必向反应组合物中加入额外的水。然而，如果需要，可以向反应组合物中加入额外的水以提高反应组合物中的水含量。所述反应组合物应包含至少2％的水(优选至少5％，优选至少10％，更优选至少20％的水)。
合适地，在磷脂组合物与脂质酰基转移酶和/或植物甾醇或植物甾烷醇混合前，所述磷脂组合物包含在含有植物磷脂和水的组合物中。在一种实施方式中，在将磷脂与酶和/或植物甾醇和/或植物甾烷醇混合的同时或者在将磷脂与酶和/或植物甾醇和/或植物甾烷醇混合之后，将水与磷脂混合以形成磷脂组合物。
为了避免疑问，本发明的磷脂组合物不是粗油，例如粗植物油(其通常具有小于0.2％的水含量和不高于3％的磷脂含量)；也不是精炼的食用油(其通常不含磷脂或者含磷脂非常少，通常小于100ppm的磷脂)。
合适地，所述磷脂组合物可以与脂质酰基转移酶一起在约30℃至约70℃，优选约40℃至约60℃，优选约40℃至约50℃，优选约40℃至45℃温育(或混合)。
在另一种实施方式中，合适地，本发明的方法和/或用途可以在低于约60℃，优选低于约65℃，优选低于约70℃下进行。
合适地，当所述酶与所述磷脂组合物和/或反应组合物混合时，所述磷脂组合物和/或反应组合物的温度可以是期望的反应温度。
所述磷脂植物和/或植物甾醇和/或植物甾烷醇和/或水可以在酶加入前和/或酶加入过程中加热和/或冷却至期望的温度。因此，在一种实施方式中，预期本发明的方法的进一步的步骤可以是冷却和/或加热磷脂组合物和/或植物甾醇和/或植物甾烷醇和/或水。
优选地，用于本发明的方法或用于磷脂组合物或反应组合物的水含量可以为至少约2％w/w。在一种实施方式中，优选地，用于本发明的反应组合物或磷脂组合物的水含量可以为至少约5％w/w，或至少约10％w/w，或至少约20％w/w。
在一些实施方式中，用于本发明的方法或磷脂组合物的水含量为约2％w/w至约60％w/w，例如约5％w/w至约50％w/w。
合适地，反应时间(即混合进行的时间，优选在搅拌下)为足以将来自植物磷脂的至少一个酰基基团转移至植物甾醇和/或植物甾烷醇从而提供一种或多种植物甾烷醇酯和/或植物甾醇酯的时间。
优选地，反应时间有效地确保至少5％转移酶活性，优选至少10％转移酶活性，优选至少15％、20％、25％、26％、28％、30％、40％、50％、60％、75％、85％或95％转移酶活性。可以通过下文教导的方法测定转移酶活性的百分数(即转移酶活性相对于总酶活性的百分数)。
本发明中的植物甾醇的转化百分数是至少1％，优选至少5％，优选至少10％，优选至少20％，优选至少30％，优选至少40％，优选至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％，优选至少95％。
优选地，反应时间是足以酯化混合物或反应组合物中至少50％的植物甾醇和/或植物甾烷醇，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％的植物甾醇和/或植物甾烷醇的时间。在一些实施方式中，优选地，反应时间是混合物或反应组合物中的植物甾醇和/或植物甾烷醇的至少95％或至少98％被酯化的时间。
在一种实施方式中，本发明的植物甾醇的转化百分数为至少5％，优选至少20％，优选至少50％，优选至少80％，优选至少90％。
合适地，在分离或纯化植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯前的反应时间(即反应组合物或混合物的保持时间，优选在搅拌下)可以为约10分钟至约6天，合适地为约12小时至约5天。
在一些实施方式中，反应时间可以为约10分钟至约180分钟，优选约15分钟至约180分钟，更优选约15分钟至约60分钟，甚至更优选约15分钟至约35分钟，优选约30分钟至约180分钟，优选约30分钟至约60分钟。
在一种实施方式中，优选地，反应时间可以为1天(24小时)至5天。在一种实施方式中，所述方法优选在高于约pH 4.5，高于约pH 5或者高于约pH 6下进行。
优选地，所述方法优选在约pH 4.6至约pH 10.0，更优选约pH 5.0至约pH 10.0，更优选约pH 6.0至约pH 10.0，更优选约pH 5.0至约pH 7.0，更优选约pH 5.0至约pH 6.5，甚至更优选约pH 5.5至pH 6.0下进行。
在一种实施方式中，所述方法可以在pH约5.3至8.3下进行。
在一种实施方式中，所述方法可以在pH约6至6.5，优选约6.3下进行。
合适地，在本发明的方法和/或用途中pH可以为中性(约pH5.0至约pH 7.0)。
在一种实施方式中，术语“分离”可以表示将植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯与反应混合物和/或反应组合物中的至少一种其它组分的至少一些(优选全部)分离。
在一个方面，可以将植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯与反应混合物或反应组合物的其它组分的一种或多种分离或分开。在这个方面，术语“分离”可以表示植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯至少基本不含存在于反应混合物或反应组合物中的至少一种其它组分，或者经过处理从而使其至少基本不含存在于反应混合物或反应组合物中的至少一种其它组分。
在一个方面，植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯被分离或者是分离的形式。
在另一方面，植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯可以被纯化或者是纯化的形式。
在一个方面，术语“纯化”表示植物甾烷醇酯和/或植物甾醇酯经处理使其处于相对纯的状态，例如至少约51％纯，或者至少约75％纯，或者至少约80％纯，或者至少约90％纯，或者至少约95％纯或者至少约98％纯。
可以通过任何传统的方法将植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯与混合物的其它组分分离或将其进行纯化。优选地，所述分离或纯化通过不同的单元操作，例如以下一个或多个单元操作而进行：提取、pH调整、分级、洗涤、离心和/或蒸馏。
在一种实施方式中，可以同时或基本同时将磷脂组合物、酶和植物甾醇和/或植物甾烷醇以流体抽吸通过混合仪并进入容纳罐中。
合适地，可以在所述方法的过程中和/或所述方法结束时使所述酶失活。
可以在植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的分开(或分离或纯化)前或之后使所述酶失活。
合适地，可以通过在75℃至85℃之间或高于92℃加热10分钟而使所述酶热失活。
合适地，所述酶可配制成配制范围为约0.01-100TIPU-K/g磷脂组合物；合适地，所述酶可配制成范围为约0.05-10TIPU-K/g磷脂组合物；优选约0.05-1.5TIPU-K/g磷脂组合物，更优选0.2-1TIPU-K/g磷脂组合物。
合适地，所述脂质酰基转移酶可配制成范围为约0.01TIPU-K单位/g油至5TIPU-K单位/g磷脂组合物。在一种实施方式中，所述脂质酰基转移酶可配制成范围为约0.1至约1TIPU-K单位/g磷脂组合物，更优选所述脂质酰基转移酶可配制成范围为约0.1至约0.5TIPU-K单位/g磷脂组合物，更优选所述脂质酰基转移酶可配制成范围为约0.1至约0.3TIPU-K单位/g磷脂组合物。
磷脂酶活性，TIPU-K：
底物：溶解在50mm Hepes(pH 7.0)中的1.75％L-植物磷脂酰胆碱95％(441601，Avanti Polar Lipids)、6.3％Triton X-100(#T9284，Sigma)和5mMCaCl2。
检测过程：将样本、标准物(calibration)和对照稀释在10mM HEPES(pH7.0)、0.1％Triton X-100(#T9284，Sigma)中。利用Konelab自动分析仪(Thermo，Finland)进行分析。检测在30C进行。在加入4μL样本前，将34μL底物置于自动调温器中180秒。酶促作用持续600秒。利用NEFA C试剂盒(999-75406，WAKO，Germany)计算酶促作用过程中释放的游离脂肪酸的量。加入113μL NEFAA并温育混合物300秒。之后，加入56μL NEFA B，并温育混合物300秒。然后测定OD 520nm。基于标准的酶制备计算酶活性(μmol FFA/minmL)。以测定条件下每分钟产生的游离脂肪酸(FFA)的微摩尔量计算酶活性TIPU-K。
为了便于参考，以下将在适当的部分的标题下讨论本发明的这些方面和其他方面。然而，每个部分下的教导都不一定限于各个具体的部分。
优点
本发明提供了生产甾醇酯和/或甾烷醇酯的可持续且环境友好的方式。
本发明的一个优点是反应发生的温度比用于生产甾醇酯和/或甾烷醇酯的传统方法的温度低。
本发明的另一个优点是反应发生在含水系统(即基于水的系统)中。因此，在本发明的方法中无需使用有机溶剂。与用于生产甾醇酯和/或甾烷醇酯的传统方法相比，这非常有益。具体地，含水系统的使用降低了对过度纯化和分离的需求(即除去所有有机溶剂)，原因是本发明的混合物本身常常不含被认为不适合直接用在工业组合物例如食物或饲料组合物或个人护理品(例如化妆品)组合物中的组分。因此，本发明的方法具有在使用前可以简单浓缩甾醇酯和甾烷醇酯的优势。
本发明的进一步优点是所述方法可以使用其它植物加工的副产物，由此降低废物并由较低价值的组合物产生有价值的甾醇酯和/或甾烷醇酯。例如，用于本发明用途的磷脂组合物可以是橡胶组合物或皂料(两者均为食用油精炼的副产物)。此外或者可选择地，在本发明中使用的植物甾醇和/或植物甾烷醇可以是大豆油脱臭馏出物(SODD)。
另一个优点是本发明在甾醇酯和/或甾烷醇酯的酶促形成过程中无需使用有机溶剂即可以以高产率和工业量生产甾醇酯和甾烷醇酯。
本发明的进一步优点是可以在低于传统的甾醇酯或甾烷醇酯生产方法的温度下进行甾醇酯或甾烷醇酯的生产方法。因此，一个优点是甾醇、甾烷醇、甾醇酯或甾烷醇酯所接触的氧化应力小于传统方法中生产的甾醇、甾烷醇、甾醇酯或甾烷醇酯。因此，一个优点是本发明产生的甾醇酯和/甾烷醇酯在产生的同时，从例如甾醇、甾醇酯、甾烷醇或甾烷醇酯产生比化学催化反应少的副产物。这导致较简单的纯化和分离方法。
脂质酰基转移酶
在本发明中可以使用任何脂质酰基转移酶。
例如，本发明中使用的脂质酰基转移酶可以是WO2004/064537、WO2004/064987、WO2005/066347、WO2006/008508或WO2008/090395中描述的。这些文献通过引用并入本文。
本发明任一方法和/或用途中使用的脂质酰基转移酶都可以是天然的脂质酰基转移酶或者变异脂质酰基转移酶。
本文使用的术语“脂质酰基转移酶”优选表示具有酰基转移酶活性(通常分类为E.C.2.3.1.x，例如2.3.1.43)的酶，由此所述酶能够从脂质将酰基转移至作为酰基受体分子的甾醇和/或甾烷醇，优选植物甾醇和/或植物甾烷醇。
合适地，所述脂质酰基转移酶是在酶命名分类下的一个类型(E.C.2.3.1.43)。
优选地，用于本发明任一方法和/或用途的脂质酰基转移酶是能够从磷脂(如本文定义)转移酰基至植物甾醇和/或植物甾烷醇的脂质酰基转移酶。
优选地，本发明的“酰基受体”不是水。
合适地，一些酰基受体可以天然存在于磷脂组合物中。可选地(或优选地)，可以将酰基受体加入至磷脂组合物(例如所述酰基受体可以相对于磷脂组合物为外来的或者外源的)。如果酰基受体的量对于酰基转移酶反应是限速的，则这尤其重要。
优选地，脂质酰基转移酶作用的脂质底物是以下脂质的一种或多种：磷脂，例如卵磷脂(lecithin)，如磷脂酰胆碱和/或磷脂酰乙醇胺。
这种磷脂底物在本文中可以被称为“脂质酰基受体”。本文使用的术语卵磷脂(lecithin)包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。
优选用于本发明的脂质酰基转移酶被鉴定为具有高活性，例如对含水环境中的磷脂具有高磷脂转移酶活性的酶；最优选用于本发明的脂质酰基转移酶具有高的磷脂至植物甾醇和/或植物甾烷醇转移酶活性。
适合用于本发明方法和/或用途的酶可以具有利用以下“转移酶测定(甾醇:磷脂)(TrU)”测定的脂质酰基转移酶活性。
转移酶活性的测定
“转移酶测定(甾醇:磷脂)”(TrU)
底物：将50mg β-谷甾醇(Sigma S5753)和450mg大豆磷脂酰胆碱(PC，Avanti#441601)溶解在氯仿中，并且使氯仿在40℃、真空下蒸发。
将300mg PC∶β-谷甾醇(9∶1)于40℃分散在10ml 50mM HEPES缓冲液(pH 7)中。
酶促作用：
将250μl底物加入40℃带盖的玻璃杯中。
加入25μl酶溶液并在搅拌的过程中于40℃温育10分钟。
在所述测定中，所加入的酶应酯化2-5％的β-谷甾醇。
并且对含25μl水的空白(非酶溶液)进行分析。
10分钟后，加入5ml庚烷∶异丙醇(3∶2)。
利用硬脂酸胆固醇酯(Sigma C3549)校准标准物通过HPTLC分析β-谷固醇酯的量。
以测定条件下每分钟形成的β-谷固醇酯的量计算转移酶活性。
根据上文给出的转移酶测定，将在40℃和pH 7下每分钟产生的β-谷固醇酯(μmol)定义为一个转移酶单位(TrU)。
优选地，本发明的方法和用途中使用的脂质酰基转移酶每毫克将具有具体至少25TrU/mg酶蛋白的转移酶单位(TrU)。
合适地，本发明使用的脂质酰基转移酶可以配制成每克磷脂组合物0.05至50TrU的量，合适地配制成每克磷脂组合物0.5至5TrU的量。
更优选地，适合用于本发明的方法和/或用途的酶具有下文方法所定义的脂质酰基转移酶活性。
％酰基转移酶活性测定方法
根据下文详述的方法，可以在酶促反应后利用CHCl3∶CH3OH(2∶1)对已经加入了本发明的脂质酰基转移酶(和一定量的甾醇/甾烷醇)的磷脂组合物进行提取，分离含脂质物质的有机相并通过GLC和HPLC进行分析。通过GLC和HPLC分析，测定游离脂肪酸的量和一种或多种甾醇/甾烷醇酯。以同样的方式分析没有加入本发明的酶的对照磷脂组合物。
计算：根据GLC和HPLC分析的结果，可以计算游离脂肪酸和甾醇/甾烷醇酯的增加。
Δ％脂肪酸＝％脂肪酸(酶)-％脂肪酸(对照)；
Mv脂肪酸＝脂肪酸的平均分子量；
A＝Δ％甾醇酯/Mv甾醇酯(其中Δ％甾醇酯＝％甾醇/甾烷醇酯(酶)-％甾醇/甾烷醇酯(对照)和Mv甾醇酯＝甾醇/甾烷醇酯的平均分子量)；
以总酶活性的百分数计算转移酶活性：
Figure BPA00001443891900141
对于所述测定，使用的酶量优选为0.2TIPU-K/g磷脂组合物，更优选0.08TIPU-K/g磷脂组合物，优选0.01TIPU-K/g油。优选在0.5、1、2、4和20小时后，更优选在20小时后测定所述磷脂组合物中的磷脂水平和/或甾醇的转化百分数。
优选地，当利用“％酰基转移酶活性测定方法”测定时，用于本发明的脂质酰基转移酶具有至少15％，优选至少20％，优选至少30％，更优选至少40％的转移酶活性。
为了鉴定最优选用于本发明的方法中的脂质酰基转移酶，除了或者代替评价磷脂组合物中的转移酶活性的百分数(上文)，可以采用以下题为“脂质酰基转移酶的鉴定方法”的测定。
脂质酰基转移酶的鉴定方法
本发明的脂质酰基转移酶是导致以下状况的一种转移酶：
i)除去补充有植物甾醇(1％)、水(1％)和磷脂酰胆碱(2％)油的大豆油中的磷脂(使用以下方法：在搅拌的过程中通过加热至95℃将植物甾醇、水和磷脂酰胆碱溶解在大豆油中。然后将油冷却至40℃并加入酶。在磁搅拌下将样本保持在40℃并在0.5、1、2、4和20小时后取出并通过TLC分析)；
和/或
ii)所加入的甾醇转化为甾醇酯的(％转化，利用上文i)中教导的方法)。
对于所述测定，使用的酶量可以为0.2TIPU-K/g油，优选0.08TIPU-K/g油，优选0.01TIPU-K/g油。优选在0.5、1、2、4和20小时后，更优选在20小时后测定所述油中的磷脂水平和/或甾醇的转化(％转化)。
在一些方面，用于本发明的任一个方法和/或用途的脂质酰基转移酶可以包含GDSX基序和/或GANDY基序。
优选地，所述脂质酰基转移酶被表征为具有酰基转移酶活性并且包含氨基酸序列基序GDSX的酶，其中X是以下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一个或多个。
适合地，用于本发明任一方法和/或用途的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列或脂质酰基转移酶可以获自于，优选获自于以下一个或多个属的生物：气单胞菌属(Aeromonas)、链霉菌属(Streptomyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌属(Vibrionaceae)、木杆菌属(Xylella)、硫叶菌属(Sulfolobus)、曲霉属(Aspergillus)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、李斯特菌属(Listeria)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、黄杆菌属(Xanthomonas)和假丝酵母属(Candida)。优选地，所述脂质酰基转移酶可以获自于，优选获自于气单胞菌属的生物。
在本发明的一个方面，所述脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转移酶活性并且可通过表达以下而获得的多肽：
a)包含SEQ ID No.49所示的核苷酸序列或包含与其具有75％或更高同一性(优选至少80％，更优选至少90％同一性)的核苷酸序列的核苷酸序列；
b)编码多肽的核酸，其中所述多肽与SEQ ID No.16所示的多肽序列或与SEQ ID No.68所示的多肽序列具有至少70％同一性(优选至少80％，更优选至少90％同一性)；
c)核酸，所述核酸在中等(或高)严格条件下与包含SEQ ID No.49所示的核苷酸序列的核酸探针杂交；或
d)核酸，其是a)、b)或c)中所述核酸序列的片段。
在一种实施方式中，优选用于本发明应用的脂质酰基转移酶是可以通过在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)表达核苷酸序列，尤其是本文SEQID No.49所示的核苷酸序列而获得的多肽。
在一个方面，优选用于本发明的脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转移酶活性的多肽，并且所述多肽包含下述的任何一个氨基酸序列：SEQ ID No.68、SEQ ID No.16、SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35所示的氨基酸序列或与其具有75％或更高同一性的氨基酸序列。
在一个优选方面，优选用于本发明的脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转移酶活性的多肽，并且所述多肽包含SEQ ID No.68或SEQ ID No.16所示的氨基酸序列，或者包含与其具有至少75％同一性，优选至少80％，优选至少85％，优选至少95％，优选至少98％同一性的氨基酸序列。
在一种实施方式中，用于本发明任一方法和/或用途的脂质酰基转移酶由SEQ ID No.49所示的核苷酸序列编码，或者由与其具有至少75％同一性，优选至少80％，优选至少85％，优选至少95％，优选至少98％同一性的核苷酸序列编码。
此外或者可选地，编码用于本发明任一方法和/或用途的脂质酰基转移酶的核苷酸序列编码可以包含SEQ ID No.68所示的氨基酸序列、或与其具有75％或更高同源性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。合适地，编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列编码可以包含SEQ ID No.68所示的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在一种实施方式中，优选用于本发明任一方法和/或用途的脂质酰基转移酶是通过如下方法在所述地衣芽孢杆菌中表达的脂质酰基转移酶：用SEQ ID No.49所示的核苷酸序列或者与其具有至少75％同一性(更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少95％，更优选至少98％同一性)的核苷酸序列转化地衣芽孢杆菌；培养所述地衣芽孢杆菌并分离其中产生的脂质酰基转移酶。
在本发明的一些方面，编码用于本发明任一方法和/或用途的脂质酰基转移酶的核苷酸序列编码在与SEQ ID No.35所示的杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)脂质酰基转移酶的氨基酸序列中N-80对应的位置包含天冬氨酸残基的脂质酰基转移酶。
在本发明的一些方面，用于本发明任一方法和/或用途的脂质酰基转移酶是在与SEQ ID No.35所示的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶的氨基酸序列中N-80对应的位置包含天冬氨酸残基的脂质酰基转移酶。
如上文详述，可通过与pFam00657共有序列(SEQ ID No.2)的比对，和/或与GDSX酰基转移酶(例如SEQ ID No.16)的比对来鉴定GDSX、GANDY和HPT区的存在，从而鉴定适合用于本发明方法的其他酰基转移酶。为了评估它们用于本发明的适宜性，即鉴定具有占总酶活性至少5％的转移酶活性，更优选至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少98％的转移酶活性的那些酶，使用上文详述的“％酰基转移酶活性测定方法”测试此类酰基转移酶。
优选地，可以利用以下标准表征所述脂质酰基转移酶：
所述酶具有可以被定义为酯转移活性的酰基转移酶活性，由此将脂质酰基供体的原始酯键的酰基部分转移到酰基受体以形成新的酯；和
所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。
优选地，GDSX基序的X是L或Y。更优选地，GDSX基序的X是L。因此，优选地，本发明的酶包含氨基酸序列基序GDSL。
GDSX基序由四个保守的氨基酸构成。优选地，该基序中的丝氨酸为所述脂质酰基转移酶的催化丝氨酸。适合地，GDSX基序的丝氨酸的位置可对应于Brumlik & Buckley(Journal of Bacteriology Apr.1996，Vol.178，No.7，p 2060-2064)中教导的嗜水气单胞菌((Aeromonas hydrophila))脂质酰基转移酶的Ser-16。
为了测定蛋白是否具有本发明的GDSX基序，优选根据WO2004/064537或WO2004/064987(均通过引用并入本文)中教导的方法，将序列与pfam数据库的隐马尔可夫模型谱(hidden markov model profile)(HMM谱)进行比较。
优选地，所述脂质酰基转移酶可以使用Pfam00657共有序列进行比对(有关完整的解释参见WO2004/064537或WO2004/064987)。
优选地，与pfam00657结构域家族的隐马尔可夫模型谱(HMM谱)的阳性匹配表示存在GDSL或GDSX结构域。
优选地，当与Pfam00657共有序列进行比对时，用于本发明方法和/或用途的脂质酰基转移酶可以具有至少一个，优选多于一个，更优选多于两个下述区：GDSX区、GANDY区、HPT区。适合地，所述脂质酰基转移酶可以具有GDSX区和GANDY区。或者，所述酶可以具有GDSX区和HPT区。优选地，所述酶至少包含GDSX区。更多细节请参见WO2004/064537或WO2004/064987。
优选地，GANDY基序的残基选自GANDY、GGNDA、GGNDL，最优选为GANDY。
Pfam00657GDSX结构域是区分有此结构域的蛋白和其它酶的独特标志。
图3中显示了pfam00657共有序列(SEQ ID No.2)。其源自于对第6版数据库pfam家族00657(在本文中也可以称为pfam00657.6)的鉴定。
所述共有序列可以通过使用较新版pfam数据库来升级(如参见WO2004/064537或WO2004/064987)。
在一种实施方式中，用于本发明任一方法和/或用途中的脂质酰基转移酶是可以使用以下标准进行表征的脂质酰基转移酶：
(i)所述酶具有可以被定义为酯转移活性的酰基转移酶活性，由此将脂质酰基供体的原始酯键的酰基部分转移到酰基受体以形成新的酯；
(ii)所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S；
(iii)所述酶包含His-309或在与图2和4(SEQ ID No.1或SEQ ID No.3)中所示的嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶中His-309对应的位置上包含组氨酸残基。
优选地，所述GDSX基序的氨基酸残基为L。
在SEQ ID No.3或SEQ ID No.1中，起始的18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(即包含信号序列的蛋白)中的His-309等同于蛋白的成熟部分(即不含信号序列的序列)中的His-291。
在一种实施方式中，用于本发明任一方法和/或用途中的脂质酰基转移酶为包含以下催化三联体的脂质酰基转移酶：Ser-34、Asp-306和His-309，或在与图4(SEQ ID No.3)或图2(SEQ ID No.1)中所示嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶中的Ser-34、Asp-306和His-309对应的位置上分别包含丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸残基。如上所述，在SEQ ID No.3或SEQ IDNo.1所示的序列中，起始的18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(即包含信号序列的蛋白)中的Ser-34、Asp-306和His-309等同于蛋白的成熟部分(即不含信号序列的序列)中的Ser-16、Asp-288和His-291。在图3(SEQID No.2)所示的pfam00657共有序列中，活性位点残基对应于Ser-7、Asp-345和His-348。
在一种实施方式中，用于本发明任一方法和/或用途中的脂质酰基转移酶是可以使用以下标准进行表征的脂质酰基转移酶：
所述酶具有可以被定义为酯转移活性的酰基转移酶活性，由此将第一脂质酰基供体的原始酯键的酰基部分转移到酰基受体以形成新的酯；和
所述酶至少包含Gly-32、Asp-33、Ser-34、Asp-134和His-309，或在与SEQ ID No.3或SEQ ID No.1所示嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶中的Gly-32、Asp-33、Ser-34、Asp-306和His-309对应的位置上分别包含甘氨酸残基、天冬氨酸残基、丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸残基。
合适地，用于本发明任一方法和/或用途的脂质酰基转移酶可以由以下核苷酸序列之一编码：
(a)SEQ ID No.36所示的核苷酸序列；
(b)SEQ ID No.38所示的核苷酸序列；
(c)SEQ ID No.39所示的核苷酸序列；
(d)SEQ ID No.42所示的核苷酸序列；
(e)SEQ ID No.44所示的核苷酸序列；
(f)SEQ ID No.46所示的核苷酸序列；
(g)SEQ ID No.48所示的核苷酸序列；
(h)SEQ ID No.49所示的核苷酸序列；
(i)SEQ ID No.50所示的核苷酸序列；
(j)SEQ ID No.51所示的核苷酸序列；
(k)SEQ ID No.52所示的核苷酸序列；
(l)SEQ ID No.53所示的核苷酸序列；
(m)SEQ ID No.54所示的核苷酸序列；
(n)SEQ ID No.55所示的核苷酸序列；
(o)SEQ ID No.56所示的核苷酸序列；
(p)SEQ ID No.57所示的核苷酸序列；
(q)SEQ ID No.58所示的核苷酸序列；
(r)SEQ ID No.59所示的核苷酸序列；
(s)SEQ ID No.60所示的核苷酸序列；
(t)SEQ ID No.61所示的核苷酸序列；
(u)SEQ ID No.62所示的核苷酸序列；
(v)SEQ ID No.63所示的核苷酸序列；
(w)或与SEQ ID No.36、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.42、SEQ ID No.44、SEQ ID No.46、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQID No.55、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62或SEQ ID No.63所示的任一序列具有70％或更高，优选75％或更高的同一性的核苷酸序列。
合适地，所示核苷酸序列可以与SEQ ID No.36、SEQ ID No.38、SEQID No.39、SEQ ID No.42、SEQ ID No.44、SEQ ID No.46、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62或SEQ ID No.63所示的任一序列具有80％或更高，优选85％或更高，更优选90％或更高，并且甚至更优选95％或更高同一性。
合适地，用于本发明任一方法和/或用途的脂质酰基转移酶可以是包含以下一个或多个氨基酸序列的脂质酰基转移酶：
(i)SEQ ID No.68所示的氨基酸序列；
(ii)SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；
(iii)SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；
(iv)SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；
(v)SEQ ID No.6所示的氨基酸序列；
(vi)SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；
(vii)SEQ ID No.8所示的氨基酸序列；
(viii)SEQ ID No.9所示的氨基酸序列；
(ix)SEQ ID No.10所示的氨基酸序列；
(x)SEQ ID No.11所示的氨基酸序列；
(xi)SEQ ID No.12所示的氨基酸序列；
(xii)SEQ ID No.13所示的氨基酸序列；
(xiii)SEQ ID No.14所示的氨基酸序列；
(xiv)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；
(xv)SEQ ID No.15所示的氨基酸序列；
(xvi)SEQ ID No.16所示的氨基酸序列；
(xvii)SEQ ID No.17所示的氨基酸序列；
(xviii)SEQ ID No.18所示的氨基酸序列；
(xix)SEQ ID No.34所示的氨基酸序列；
(xx)SEQ ID No.35所示的氨基酸序列；或
与SEQ ID No.68、SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14或SEQID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.34或SEQ ID No.35所示的任一序列具有75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高同一性的氨基酸序列。
一方面，用于本发明任一方法和/或用途的脂质酰基转移酶是可以为卵磷脂：胆固醇酰基转移酶(LCAT)或其变体(如由分子进化产生的变体)的脂质酰基转移酶。
适合的LCAT为本领域已知的，且可以获自于一种或多种如下的生物，如：哺乳动物、大鼠、小鼠、鸡、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、植物(包括拟南芥(Arabidopsis)和水稻(Oryza sativa))、线虫、真菌和酵母。
用于本发明任一方法和/或用途的脂质酰基转移酶可以是从单胞菌种(Aeromonas spp.)，优选嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)或杀鲑气单胞菌，最优选杀鲑气单胞菌或其变体分离的脂质酰基转移酶。
本领域技术人员可以理解，优选地，酰基转移酶的信号肽在转移酶的表达过程中已被切割掉。SEQ ID No.1、3、4、15和16的信号肽为氨基酸1-18。因此，最优选的区域为SEQ ID No.1和SEQ ID No.3(嗜水气单胞菌)中的氨基酸19-335，和SEQ ID No.4、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16(杀鲑气单胞菌)中的氨基酸19-336。当用于测定氨基酸序列同一性或同源性时，优选使用成熟序列进行本文所述的比对。
因此，确定同源性(同一性)的最优选区域为SEQ ID No.1和3(嗜水气单胞菌)的氨基酸19-335，和SEQ ID No.4、15和16(杀鲑气单胞菌)的氨基酸19-336。SEQ ID No.34和35是来分别来自嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶的成熟蛋白序列，其可以经历或可以未经历翻译后修饰。
用于本发明任一方法和用途的脂质酰基转移酶可以是还可分离自嗜热裂孢菌(Thermobifida)，优选褐色嗜热裂孢菌(T.fusca)，最优选SEQ IDNo.s 27、28、38、40或47中所示的或由包含核苷酸序列SEQ ID No.39或48的核酸编码的脂质酰基转移酶。
用于本发明任一方法和用途的脂质酰基转移酶可以是还可分离自链霉菌属，优选为阿维链霉菌(S.avermitis)的脂质酰基转移酶，最优选包含SEQ ID No.32的脂质酰基转移酶。用于本发明的来自链霉菌的其它可能的酶包括包含SEQ ID No.5、6、9、10、11、12、13、14、26、31、33、36、37、43或45所示的序列的那些酶或由SEQ ID No.52、53、56、57、58、59、60或61所示的核苷酸序列编码的那些酶。
用于本发明的酶也可以分离自棒状杆菌属(Corynebacterium)，优选为C.efficiens，最优选包含SEQ ID No.29或SEQ ID No.41中所示的序列，或由SEQ ID No.42中所示的核苷酸序列编码。
在一种实施方式中，根据本发明的脂质酰基转移酶可以是可获自于，优选获自于链霉菌株L130或L131的脂质酰基转移酶，所述链霉菌株L130或L131由丹麦哥本哈根(Langebrogade 1，DK-1001 Copenhagen K)的Danisco A/S根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约保藏在位于大不列颠联合王国苏格兰Aberdeen郡Machar街(23St.MacharStreet，Aberdeen Scotland，GB)的工业、海洋及食品细菌菌种保藏中心(NCIMB，National Collection of Industrial，Marine and Food Bacteria)，保藏日为2004年6月23日，保藏号分别为NCIMB 41226和NCIMB 41227。
在一种实施方式中，本发明的酶可优选不是磷脂酶，如被归类为E.C.3.1.1.32的磷脂酶A1或被归类为E.C.3.1.1.4的磷脂酶A2。
脂质酰基转移酶变体
在一种优选的实施方式中，编码用于本发明任一方法和/或用途的脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以编码是脂质酰基转移酶变体的脂质酰基转移酶。
可以使用对磷脂具有提高的活性，例如提高的水解活性和/或提高的转移酶活性，优选对磷脂具有提高的转移酶活性的变体。
优选地，所述脂质酰基转移酶变体是通过上文定义的脂质酰基转移酶的一个或多个氨基酸修饰而制备的。
合适地，用于本发明任一方法和用途的脂质酰基转移酶可以是可以为脂质酰基转移酶变体的脂质酰基转移酶，在这种情况下所述酶的特征可以在于所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一个或多个，并且其中所述酶变体与亲本序列相比在第2组或第4组或第6组或第7组(如WO2005/066347和下文的定义)中所定义的任意一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸修饰。
例如，所述脂质酰基转移酶变体的特征可以在于所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一个或多个，并且其中所述变体酶与亲本序列相比在通过使所述亲本序列与本文定义的P10480结构模型进行结构比对鉴定出的，优选通过P10480晶体结构同等物与WO2005/066347和下文定义的1IVN.PDB和/或1DEO.PDB的结构比对获得的第2组或第4组或第6组或第7组(如WO2005/066347或下文的定义)详述的任意一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸修饰。
在进一步的实施方式中，用于本发明任一方法和/或用途的脂质酰基转移酶可以是具有以下特征的脂质酰基转移酶变体：所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X为以下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一个或多个，并且其中所述变体酶与亲本序列相比在当使所述亲本序列与pfam共有序列(SEQ ID No.2-图3)进行比对时鉴定出的第2组中教导的并且根据P10480结构模型修饰以确保如WO2005/066347和下文定义的最佳撞击重叠的一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸修饰。
合适地，用于本发明任一方法和用途的脂质酰基转移酶可以是可以包含以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶变体，其中，所述氨基酸序列如SEQID No.34、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33或SEQ IDNo.35所示，除了在通过与SEQ ID No.34的序列比对鉴定出的第2组或第4组或第6组或第7组(如WO2005/066347和下文的定义)中定义的任意一个或多个氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰外。
可选地，所述脂质酰基转移酶可以为包含以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶变体，其中，所述氨基酸序列如SEQ ID No.34、SEQ ID No.3、SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQID No.32、SEQ ID No.33或SEQ ID No.35所示，除了在如WO2005/066347和下文定义的第2组或第4组或第6组或第7组中定义的，通过所述亲本序列与本文定义的P10480结构模型进行结构比对鉴定出的，优选通过P10480晶体结构同等物与如WO2005/066347和下文教导的1IVN.PDB和/或1DEO.PDB的结构比对获得的任意一个或多个氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰外。
可选地，所述脂质酰基转移酶可以是包含以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶变体，其中，所述氨基酸序列如SEQ ID No.34、SEQ ID No.3、SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、、SEQID No.32、SEQ ID No.33或SEQ ID No.35所示，除了在通过与pfam共有序列(SEQ ID No.2)比对鉴定出的第2组中教导的并且根据P10480结构模型修饰以确保如WO2005/066347和下文教导的最佳撞击重叠的一个或多个氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰外。
优选地，所述亲本酶是包含SEQ ID No.34和/或SEQ ID No.15和/或SEQ ID No.35所示的氨基酸序列或与其同源的酶。
优选地，所述脂质酰基转移酶可以是包含以下氨基酸序列的变体酶，其中，所述氨基酸序列如SEQ ID No.34或SEQ ID No.35所示，除了在如WO2005/066347和下文中定义的第2组或第4组或第6组或第7组中定义的任意一个或多个氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰外。
其它适合用于本发明方法/用途的脂质酰基转移酶变体是PCT/IB2009/054535中描述的那些。
所述脂质酰基转移酶的三维结构已经揭示了可以使脂质酰基转移酶被较成功地工程化的不常见且有趣的结构。特别地，脂质酰基转移酶的三维结构已经揭示了残基形成的“穴”和“峡谷”结构，这些结构如下文所定义。
“穴”区的变化可以(例如)改变例如酶的底物链长度特异性。
已经发现“峡谷”中的变化(尤其是一些优选的重要修饰)在例如增强或改变酶的底物特异性中是重要的。
特别地，本发明人已经发现“峡谷”中有多个修饰，其排列高且产生具有改良的性质的有趣变体，这些修饰可以存在于第31、27、85、86、119和120位。在一些实施方式中，高度优选第31和/或27位。
这些脂质酰基转移酶变体可以由与编码亲本脂质酰基转移酶的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列编码，并且在在所编码的氨基酸序列中与位于a)酶的“峡谷”区和/或b)插入位点1和/或c)插入位点2的氨基酸对应的位置包含至少一个修饰(合适地为至少两个修饰)，其中所述酶的“峡谷”区、插入位点1和/或插入位点2被定义为当基于初级或三级结构比对时对应于本文显示为SEQ ID No.16或下文描述为SEQ ID No.68的酶的“峡谷”区、插入位点1或插入位点2的区域。
在一种实施方式中，优选地，位于“峡谷”和/或插入位点1和/或插入位点2的位置的修饰与位于在所编码的氨基酸序列中与位于“峡谷”区和/或插入位点1和/或插入位点2外的氨基酸对应的位置的至少一个修饰组合。
在一种实施方式中，所述脂质酰基转移酶在所编码的氨基酸序列中与位于第27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236位(优选在第27、31、85、86、119和/或120位，更优选在第27和/或31位)的氨基酸对应的位置包含至少一个修饰(合适地为至少两个修饰)，其中所述位置编号被定义为当基于初级或三级结构进行比对时与本文SEQ IDNo.16所示的酶的相同位置对应的位置。
在进一步的实施方式中，所述脂质酰基转移酶变体在所编码的氨基酸序列中对应于位于第27和/或31位的氨基酸的位置包含至少一个修饰和至少一个进一步的修饰，其中所述位置编号被定义为当基于初级或三级结构进行比对时与本文SEQ ID No.16所示的酶的相同位置对应的位置。
合适地，所述至少一个进一步的修饰可以位于以下一个或多个位置：第85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207、130位，其中所述位置编号被定义为当基于初级或三级结构进行比对时与本文SEQ ID No.16所示的酶的相同位置对应的位置。
用于本发明的所述脂质酰基转移酶氨基酸序列可以包含经修饰的骨架，从而在所编码的氨基酸序列中与位于a)酶的“峡谷”区和/或b)插入位点1和/或c)插入位点2的氨基酸对应的位置进行至少一个修饰(合适地为至少两个修饰)，其中所述酶的“峡谷”区、插入位点1和/或插入位点2被定义为当基于初级或三级结构比对时分别对应于本文表示为SEQ ID No.16或SEQ ID No.68所示的酶的“峡谷”区、插入位点1或插入位点2的区域。
在一种实施方式中，优选地，位于“峡谷”和/或插入位点1和/或插入位点2的位置的修饰与位于在所编码的氨基酸序列中与位于“峡谷”区和/或插入位点1和/或插入位点2外的氨基酸对应的位置的至少一个修饰组合。
优选地，所述脂质酰基转移酶氨基酸序列骨架经过修饰，从而在所编码的氨基酸序列中与位于第27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236位(优选在第27、31、85、86、119和/或120位，更优选在第27和/或31位)的氨基酸对应的位置进行至少一个修饰(合适地为至少两个修饰)，其中所述位置编号被定义为当基于初级或三级结构进行比对时与本文SEQ ID No.16所示的酶的相同位置对应的位置。
在进一步优选的实施方式中，所述脂质酰基转移酶氨基酸序列骨架在在所编码的氨基酸序列中对应于位于第27、31位的氨基酸的位置包含至少一个修饰(合适地，至少两个修饰)和至少一个进一步的修饰，其中所述位置编号被定义为当基于初级或三级结构进行比对时与本文SEQ ID No.16所示的酶的相同位置对应的位置。
合适地，所述至少一个进一步的修饰可以位于以下一个或多个位置：第85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207、130位，其中所述位置编号被定义为当基于初级或三级结构进行比对时与本文SEQ ID No.16所示的酶的相同位置对应的位置。
本发明进一步提供了用于本发明的改变的脂质酰基转移酶或脂质酰基转移酶变体，其包含与本文SEQ ID No.16或68所示的来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中位于所述改变的脂质酰基转移酶的催化三联体的Asp残基紧N-末端的底物链长特异性决定片段具有相对于来自杀鲑气单胞菌的如本文SEQ ID No.16或68所示的脂质酰基转移酶的改变的长度。
优选地，所述改变包括所述底物链长特异性决定片段的氨基酸插入或缺失，例如利用不同的脂质酰基转移酶的底物链长特异性决定片段取代所述亲本酶的所述底物链长特异性决定片段，以产生所述改变的脂质酰基转移酶。优选地，所述改变提高了所述脂质酰基转移酶可以转移的酰基链的长度。
优选地，所述改变的脂质酰基转移酶包括与来自杀鲑气单胞菌的如本文SEQ ID No.16或68所示的脂质酰基转移酶具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在修饰前编码所述脂质酰基转移酶变体的核苷酸序列是本文如SEQID No.69、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63或SEQ ID No.24所示的核苷酸序列；或者是与本文如SEQ ID No.69、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ IDNo.62、SEQ ID No.63或SEQ ID No.24所示的核苷酸序列具有至少70％同一性(优选至少80％同一性，更优选至少90％同一性，甚至更优选至少95％同一性)的核苷酸序列；或者是由于遗传密码的简并性而与SEQ ID No.69、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.24有关的核苷酸序列；或者是在中等严谨或高等严谨性条件下与本文如SEQ ID No.69、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63或SEQ ID No.24所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
在一种优选的实施方式中，所述脂质酰基转移酶变体是由在中等或高等严谨条件下在SEQ ID No.49或SEQ ID No.69或SEQ ID No.49或SEQID No.69的互补体的基本全长上杂交的核酸(优选分离的或重组的核酸)序列编码的，其中所编码的多肽包含选自以下的一个或多个氨基酸残基：第31位的Q、H、N、T、F、Y或C；在第86位的R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C或L；在第27位的R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S或F；在第85位的H、R、D、E；在第119位的T或I；在第120位的K或E；在第122位的S、L、A、F、W、Y、R、H、M或C；在第201位的R；在第245位的S；在第235位的A或V；在第232位的G或S；在第236位的G或E，其中所述位置是SEQ ID No.16的相当的氨基酸位置。
所述脂质酰基转移酶变体可以包括具有脂质酰基转移酶活性，包含下述氨基酸序列的前肽或多肽：与所示SEQ ID No.16或68的氨基酸序列具有至少90％同一性(优选至少95％，更优选至少98％，更优选至少99％同一性)，并且在以下一个或多个位置包含一个或多个修饰：27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236(优选在第27、31、85、86、119和/或120位，更优选在第27和/或31位)。
在一种实施方式中，所述变体包括这样的前肽或多肽：所述前肽或多肽具有脂质酰基转移酶活性，并且包含除了在以下一个或多个位置的一个或多个修饰外如SEQ ID No.16或68所示的氨基酸序列：27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236(优选在第27、31、85、86、119和/或120位，更优选在第27和/或31位)。
在另一种实施方式中，所述脂质酰基转移酶包含这样的前肽或多肽：所述前肽或多肽具有脂质酰基转移酶活性，包含与SEQ ID No.16或68所示的氨基酸序列具有至少90％同一性(优选至少95％，更优选至少98％，更优选至少99％同一性)的氨基酸序列，并且在第27位和/或31位包含一个或多个修饰和至少一个进一步的修饰，其中所述位置编号定义为当基于初级或三级结构比对时与本文SEQ ID No.6所示的酶的相同位置对应的位置。
合适地，所述至少一个进一步的修饰可以位于以下一个或多个位置：第85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207、130位，其中所述位置编号被定义为当基于初级或三级结构进行比对时与本文SEQ ID No.16所示的酶的相同位置对应的位置。
在一种优选的实施方式中，所述脂质酰基转移酶包括这样的前肽或多肽：所述前肽或多肽具有脂质酰基转移酶活性，并且包含除了在以下一个或多个位置的一个或多个修饰和至少一个进一步的修饰外如SEQ ID No.16或68所示的氨基酸序列：第27和/或31位。
合适地，所述至少一个进一步的修饰可以位于以下一个或多个位置：第85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207和/或130位，其中所述位置编号被定义为当基于初级或三级结构进行比对时与本文SEQ ID No.16所示的酶的相同位置对应的位置。
所述脂质酰基转移酶可以是经历进一步的翻译后修饰以成为成熟肽(即具有脂质酰基转移酶活性的多肽)的前肽。作为实例，仅SEQ ID No.68与SEQ ID No.16相同，除了SEQ ID No.68具有所经历的翻译后修饰和/或转录后修饰以除去一些氨基酸，更尤其是38个氨基酸。因此，本文SEQ ID No.16所示的多肽可能在一些情况下(即在一些宿主细胞中)被认为是前肽，其通过翻译后和/或转录后修饰进一步被加工成成熟肽。对于翻译后和/或转录后修饰，精确的修饰(例如切割位点)可以根据宿主种类而略微改变。在一些宿主种类中，可以没有翻译后和/或转录后修饰，因此所述前肽可等价于成熟肽(即具有脂质酰基转移酶活性的多肽)。不希望受理论限制，与通过参考与SEQ ID No.16相比的SEQ ID No.68所示的切割位点相比，所述切割位点可以在任一个方向移动数个残基(例如1、2或3个残基)。换句话说，不是例如在第235-ATR位至273(RRSAS)位的切割，所述切割可以在，例如残基232、233、234、235、236、237或238开始。另外或者可选择地，所述切割可以在，例如残基270、271、272、273、274、275或276位结束。另外或者可选择地，所述切割可以导致约38个氨基酸的去除，在一些实施方式中，所述切割可导致30-45个残基，例如34-42个残基，例如36-40个残基，优选38个残基去除。
在一些实施方式中，为了确定初级结构的同源性，脂质酰基转移酶的氨基酸序列可以直接与本文如SEQ ID No.16或68初级序列所示的脂质酰基转移酶直接比较，并且尤其与已知在序列已知的所有或多数脂质酰基转移酶中均不变的一组残基比较。在比对保守残基后，为了保持比对(即避免在任意删除和插入过程中除去保守残基)允许必要的插入和删除，对与初级序列SEQ ID No.16或68中的特定氨基酸等价的残基进行定义。在优选的实施方式中，保守残基的比对保存了100％的此种残基。然而，大于75％或少至50％的保守残基的比对也足以定义等价残基。在优选的实施方式中，维持了催化丝氨酸和组氨酸残基的保守性。利用保守残基定义SEQ ID No.16或68中所示的脂质酰基转移酶在其它脂质酰基转移酶(例如来自其它气单胞菌以及任何其它生物)中的对应等价氨基酸残基。
为了比对亲本脂质酰基转移酶和SEQ ID No.16或SEQ ID No.68(参考序列)，可以利用序列比对，例如双序列比对(http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)。由此，可以确定并修饰可选的亲本脂质酰基转移酶多肽中的等价氨基酸，其对应于参考SEQ ID No.68或SEQ ID No.16定义的一个或多个氨基酸。如本领域技术人员将容易理解的，当使用emboss双序列比对时，标准背景通常满足。为了进行覆盖两个序列的整个长度的比对，可以利用“针”鉴定对应的残基。然而，利用“水”也可能发现两个序列之间的最佳相似区。
可选地，尤其是当亲本脂质酰基转移酶与SEQ ID No.16或SEQ ID No.68具有低的初级序列同源性的情况下，可以通过与SEQ ID No.68或SEQID No.16，优选SEQ ID No.68的结构模型的结构比对来确定在可选的亲本脂质酰基转移酶中与参考SEQ ID No.16或SEQ ID No.68定义的一个或多个氨基酸对应的相应氨基酸。
因此，可以通过在脂质酰基转移酶的三级结构的水平上确定同源性而定义等价残基，其中已经通过X射线结晶学测定了所述三级结构。在这种情况下，“等价残基”被定义为这样的残基：在比对后如本文SEQ ID No.16或68所示的脂质酰基转移酶的特定氨基酸残基的两个或更多个主链原子(N:N，CA:CA，C:C，以及O:O)的原子坐标在0.13nm内，优选0.1nm内。在对最佳模型定向并定位以产生所讨论的脂质酰基转移酶的非氢蛋白原子的原子坐标与本文如SEQ ID No.16或68所示的脂质酰基转移酶的最大重叠后，实现比对。现有技术已知，最佳模型是在可获得的最高分辨率产生用于实验衍射数据的最低R因子的晶形模型。与本文如SEQ ID No.16或68所示的脂质酰基转移酶的特定残基在功能上和/或结构上类似的等价残基被定义为脂质酰基转移酶的这些氨基酸：其优选采用使其改变、修饰或调节蛋白结构的构象，以影响底物特异性的变化，例如以所定义的并导致本文如SEQ ID No.16或68所示的脂质酰基转移酶的特定残基的模式影响底物结合和/或催化的构象。此外，它们是脂质酰基转移酶(在通过X-射线晶体学已经获得了三级结构的情况下)的以以下程度占据类似位置的这些残基：虽然给定残基的主要链原子在占据同源位置的基础上可不满足等价的标准，但所述残基的至少两个侧链原子的原子坐标位于本文如SEQ IDNo.16或68所示的脂质酰基转移酶的相应侧链原子的0.13nm内。
如本文SEQ ID No.68(其是包含N80D突变的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶)所示的脂质酰基转移酶的三维结构的坐标描述在PCT/IB2009/054535中，并且发现在三级结构的水平上确定等价残基中的应用。
当与结构类似的大肠杆菌的硫酯酶相比时，在杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶的最后的β链和ASP-X-X HIS基序之间具有大的插入。这个插入形成了大的空腔(下文称为与酰基酶中间体的脂肪链结合的“穴”。调整该区域的序列和大小形成酰基酶中间体的脂肪链(即通过酶转移的酰基链)的较小或较大的“穴”或“空腔”。因此，这个家族的酶可被工程化以优选转移不同长度的酰基链。
相对于大肠杆菌硫酯酶(PDB entry 1IVN)，在杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶中发现了四个插入物(insertion)，其连接这两个结构共有的共同二级结构元件。
本文SEQ ID No.68所示的脂质酰基转移酶中的这些插入物的氨基酸同等物列于下表：
表：脂质酰基转移酶中的插入物
如PCT/IB2009/054535中详述的，在脂质酰基转移酶中具有用于底物结合的大表面，所述表面可以被分成由Ser 16和His 291分离的两个区域，其中Ser 16和His 291以及Asp288形成了特征性催化三联体。这两个区域可以被表征为深沟或“峡谷”——在下文中被称为“峡谷”——其导致封口空腔或“穴”穿过分子。
形成“峡谷”的残基列在下表中：
表：“峡谷”残基：
Figure BPA00001443891900331
形成“穴”的残基列于下表。
表：“穴”残基：
Figure BPA00001443891900332
片段3和4分别先于插入物3和4，片段5紧随插入物4。插入物4和5还导致形成“穴”的表面封口，因此所述“穴”与“峡谷”的区别在于插入物1和2形成“峡谷”的内层，而插入物3和4形成覆盖结构。插入物3和插入物4覆盖了“穴”。
在一种实施方式中，用于本发明的脂质酰基转移酶可以通过修饰“峡谷”、“穴”、插入1物、插入物2、插入物3或插入物4中一个或多个内的氨基酸残基而改变。
在一种实施方式中，用于本发明的脂质酰基转移酶可以通过修饰“峡谷”、插入物1或插入物2中一个或多个内的氨基酸残基而改变。
在一种实施方式中，脂质酰基转移酶的酰基链结合“空洞”的大小可以通过改变为形成较大“穴”的氨基酸残基而改变。这可以通过调节如上文所讨论的连接二级结构的共同特征的区域的大小而实现。特别地，可以通过改变酶的最后(第五)β链和形成部分催化三联体的Asp-X-X-His基序之间的区域内的氨基酸而改变“穴”的大小。
脂质酰基转移酶的底物链长特异性决定片段是位于酶的β5β-链和酶的催化三联体的Asp残基(Asp残基是Asp-Xaa-Xaa-His基序一部分)之间的连续氨基酸区域。
杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶和大肠杆菌硫酯酶(以登录号1IVN_A；GID：33357066保藏在NCBI Genbank数据库)的三级结构允许确定各脂质酰基转移酶的底物链长特异性决定片段，其中，所述三级结构均显示标志性三层α/β/α结构，且其中β-片层由五个平行链组成。
杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶的底物链长特异性决定片段位于所述酶的催化三联体的Asp残基的紧N-末端。然而，底物链长特异性决定片段的长度可以根据酶的Asp残基和β5β-链之间的距离而变化。例如，脂质酰基转移酶的底物链长特异性决定片段的长度分别为约13个氨基酸，19个氨基酸和约70个氨基酸。因此，根据脂质酰基转移酶，底物链长特异性决定片段可以为10-70个氨基酸长度，例如10-30个氨基酸长度，30-50个氨基酸长度，或50-70个氨基酸。
下表提供了脂质酰基转移酶的底物链长特异性决定片段的示例序列。
杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶(GCAT)
AEMLRDPQNFGLSDVENPCYDGGYVWKPF SEQ ID No.73
ATRSVSTDRQLSASPQERLAIAGNPLLAQA
VASPMARRSASPLNCEGKMF
在某些实施方式中，底物链长特异性决定片段的氨基酸序列可以为或可以不为野生型酶的氨基酸序列。在某些实施方式中，底物链长特异性决定片段可以具有与野生型脂质酰基转移酶的底物链长特异性决定片段具有至少70％，例如至少80％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
合适地，可以利用定点诱变法制备所述变体酶。
优选的修饰位于以下一个或多个位置：
L031、I086、M027、V085、A119、Y120、W122、E201、F235、W232、A236和/或Q245。
特别地，重要修饰包括以下一个或多个修饰：L31Q、H、N、T、F、Y或C(优选L31Q)；M27R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S或F(优选M27V)；V85H、R、D或E；I86R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C或L(优选I86S或A)；A119T或I；Y120K或E；W122S、L或A(优选W122L)；E201R；Q245S；F235A或V；W232G或S；和/或A236G或E。
在一种实施方式中，当至少一个修饰是在“峡谷”内进行的时，所述修饰在以下一个或多个位置进行：31、27、85、86、119、120。
特别地，“峡谷”内的重要修饰包括以下一个或多个修饰：L31Q、H、N、T、F、Y或C(优选L31Q)；M27R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S或F(优选M27V)；V85H、R、D或E；I86R，Y、S、V、I、A、T、M、F、C或L(优选I86S或A)；A119T或I；Y120K或E，其可以与另一个修饰组合和/或与进一步的修饰组合。
在一种实施方式中，优选地，当修饰位于插入位点1时，在31和/或27的一个或多个位置进行修饰。合适地，所述修饰可以为L31Q、H、N、T、F、Y或C(优选L31Q)和/或M27R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S或F(优选M27V)。
在一种实施方式中，优选地，当在插入位点2进行修饰时，在第085、086位进行修饰。合适地，所述修饰可以为V85H、R、D或E和/或I86R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C或L。
在一种实施方式中，优选地，当修饰位于插入位点4时，在第245位进行修饰。合适地，所述修饰可以为Q245S。
在一种实施方式中，优选地，所述修饰至少位于插入位点4。
在另一种实施方式中，优选地，修饰位于至少插入位点1，并与在插入位点2和/或4和/或一个或多个以下位点119、120、122、201、77、130、82、120、207、167、227、215、230、289的进一步的修饰组合。
在进一步的实施方式中，优选地，修饰位于至少“峡谷”区域内，并与在插入位点4和/或一个或多个以下位点122、201、77、130、82、120、207、167、227、215、230、289的进一步的修饰组合。
优选的修饰在特定位点：
R130R、V、Q、H、A、D、L、I、K、N、C、Y、G、S、F、T或M；
K82R、N、H、S、L、E、T、M或G；
G121S、R、G、E、K、D、N、V、Q或A；
Y74Y或W；
Y83F或P；
I77T、M、H、Q、S、C、A、E、L、Y、F、R或V；
A207E；
Q167T、H、I、G、L或M；
D227L、C、S、E、F、V、I、T、Y、P、G、R、D、H或A；
N215G；
Y230A、G、V、R、I、T、S、N、H、E、D、Q、K；或
N289P。
与第31、27、85、86、119、120、122、201、245、235、232和/或236位的一个或多个修饰(例如所述修饰可以为以下一个或多个：L31Q、H、N、T、F、Y或C(优选L31Q)；M27R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S或F(优选M27V)；V85H、R、D或E；I86R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C或L(优选I86S或A)；A119T或I；Y120K或E；W122S、L或A(优选W122L)；E201R；Q245S；F235A或V；W232G或S；和/或A236G或E))组合，合适地所述脂质酰基转移酶变体可以在以下位点130、82、121、74、83、77、207、167、227、215、230、289中的一个或多个进行额外的修饰(例如所述额外的修饰可以为以下一个或多个：R130R、V、Q、H、A、D、L、I、K、N、C、Y、G、S、F、T或M；K82R、N、H、S、L、E、T、M或G；G121S、R、G、E、K、D、N、V、Q或A；Y74Y或W；Y83F或P；I77T、M、H、Q、S、C、A、E、L、Y、F、R或V；A207E；Q167T、H、I、G、L或M；D227L、C、S、E、F、V、I、T、Y、P、G、R、D、H或A；N215G；Y230A、G、V、R、I、T、S、N、H、E、D、Q、K；和/或N289P)，优选所述脂质酰基转移酶变体可以在至少一个或多个以下位置130、82、77或227进行额外的修饰。
为了避免怀疑，当与本文如SEQ ID No.16所示的脂质酰基转移酶进行比对(在初级或三级基础上)，所述脂质酰基转移酶骨架优选在第80位具有D。因此，发明人在本文教导的多个组合中都显示N80D作为修饰。如果N80D没有作为合适的修饰被提及且亲本骨架在第80位不含D，则应将N80D额外修饰引入至脂质酰基转移酶变体以确保所述变体在第80位包含D。
当骨架或亲本脂质酰基转移酶已经含有N80D修饰时，可以不参考N80D修饰而表示其它修饰，即，例如可将L31Q、N80D、W122L表示为L31Q、W122L。
然而，重要的是，要注意到N80D修饰是优选修饰并且优选使用在第80位已经具有氨基酸D的骨架酶或亲本酶。然而，如果使用位置中不含氨基酸D的骨架(例如本文如SEQ ID No.1、3、4、15、34或35所示的一个或多个脂质酰基转移酶)，优选包括N80D的额外修饰。
合适地，通过比对亲本序列和SEQ ID No.68或SEQ ID No.16鉴定的第31位的取代可以是选自由Q、H、Y和F，优选Q组成的组的氨基酸残基的取代。
合适地，所述变体多肽在通过比对亲本序列和SEQ ID No.68而鉴定的任意一个或多个氨基酸残基位置27、77、80、82、85、85、86、121、122、130、167、207、227、230和289包含一个或多个进一步的修饰。合适地，所述一个或多个进一步修饰的至少之一可以位于通过比对亲本序列和SEQ ID No.68而鉴定的第86、122或130位氨基酸残基。
合适地，所述脂质酰基转移酶变体包含一个或多个以下进一步取代：I86(A、C、F、L、M、S、T、V、R、I或Y)；W122(S、A、F、W、C、H、L、M、R或Y)；R130(A、C、D、G、H、I、K、L、M、N、Q、T、V、R、F或Y)；或它们的任意组合。
所述脂质酰基转移酶变体可以包含所述修饰的以下一个组合(其中所述亲本骨架已经在第80位包含氨基酸D，并且所述修饰可以不参考N80D而表示)：
L31Q，N80D，I86S，W122F
L31Q，N80D，W122L
L31Q，N80D，I86V，W122L
L31Q，N80D，I86I，W122L
L31Q，N80D，I86S，R130R
L31Q，N80D，K82R，I86A
L31Q，N80D，I86S，W122W
L31Q，N80D，I86S，W122Y
M27V，L31Q，N80D
L31Q，N80D，I86A，W122L
L31Q，N80D，W122L
L31Q，N80D，I86S，G121S
L31Q，N80D，I86S
L31Q，N80D，K82R，I86S
L31Q，N80D，I86S，W122L，R130Y
L31Q，N80D，I86S，W122L，R130V
L31Q，N80D，I86S
L31Q，N80D，I86T，W122L
L31Q，N80D，I86S，W122L
L31Q，N80D，W122L，R130Q
L31Q，N80D，I86S，W122L，R130R
L31Q，N80D，I86S
L31Q，N80D，G121R
L31Q，N80D，I86A
M27C，L31Q，N80D
M27Q，L31Q，N80D
L31Q，N80D，G121S
L31Q，N80D，I86S，W122R
L31Q，N80D，R130Q
L31Q，N80D，I86S，W122H
L31Q，N80D，I86M，W122L
L31Q，N80D，R130N
L31Q，N80D，I86S，W122L
L31Q，N80D，K82N
L31Q，N80D，I86S，W122M
L31Q，N80D，W122L
L31Q，N80D，K82H
L31Q，N80D，R130H
L31Q，N80D，R130A
L31Q，N80D，G121S
L31Q，N80D，I86S，W122L，R130D
L31Q，N80D，I86M
L31Q，Y74Y，N80D
L31Q，N80D，R130L
L31Q，N80D，Y83F
L31Q，N80D，K82S
L31Q，I77T，N80D
L31Q，N80D，I86S，W122L，R130I
L31Q，N80D，I86S，W122L
L31Q，N80D，I86F，W122L
M27N，L31Q，N80D
L31Q，N80D，Y83P
L31Q，N80D，R130K
L31Q，N80D，K82R，I86S，W122L
L31Q，N80D，K82L
L31Q，N80D，I86S，G121G
L31Q，N80D，I86A，R130Q
M27H，L31Q，N80D
L31Q，N80D，W122L，A207E
L31Q，N80D，W122L，R130L
L31Q，N80D，K82E
L31Q，N80D，G121E
L31Q，N80D，W122L，R130R
L31Q，I77M，N80D
L31Q，N80D，K82T
L31Q，N80D，W122L
L31Q，N80D，W122H
L31Q，N80D，Q167T
L31Q，I77H，N80D
L31Q，N80D，G121K
L31Q，I77Q，N80D
L31Q，N80D，W122L，R130N
L31Q，N80D，W122L
L31Q，N80D，G121D
L31Q，N80D，R130T
L31Q，N80D，R130T
L31Q，N80D，K82M
L31Q，N80D，Q167H
L31Q，N80D，I86T
L31Q，N80D，Q167I
L31Q，N80D，I86C
L31Q，N80D，Q167G
M27L，L31Q，N80D
L31Q，N80D，I86S，G121R
L31Q，I77S，N80D
L31Q，I77C，N80D
L31Q，N80D，G121N
L31Q，I77A，N80D
L31Q，N80D，R130M
L31Q，N80D，W122F
M27G，L31Q，N80D
L31Q，N80D，K82G
L31Q，N80D，I86S，W122L，R130K
L31Q，N80D，R130A
L31Q，N80D，I86I
L31Q，I77E，N80D
L31Q，N80D，D227L
L31Q，N80D，V85H，N215G
L31Q，N80D，I86A，W122L，R130N
L31Q，I77R，N80D
L31Q，N80D，I86F
L31Q，N80D，I86Y，W122L
M27K，L31Q，N80D
L31Q，N80D，D227C
L31Q，N80D，R130L
L31Q，N80D，I86C，W122L
L31Q，N80D，Q167L
L31Q，N80D，V85H
L31Q，N80D，Q167M
M27D，L31Q，N80D
L31Q，N80D，I86L
L31Q，N80D，Y230A
L31Q，N80D，W122R
L31Q，N80D，Y230G
L31Q，N80D，D227S
L31Q，N80D，W122L，A207E，N289P
L31Q，N80D，W122Y
L31Q，N80D，I86L，W122L
L31Q，N80D，K82R，I86S，G121S，R130Q
L31Q，Y74W，N80D
L31Q，N80D，R130F
L31Q，N80D，G121V
L31Q，N80D，W122L，R130M
L31Q，N80D，R130V
L31Q，N80D，Y230V
L31Q，N80D，N215G
L31Q，N80D，I86S，W122L，R130N
L31Q，N80D，Y230R
M27E，L31Q，N80D
L31Q，N80D，Y230I
L31Q，N80D，I86S，W122L，R130S
L31Q，N80D，K82R
L31Q，N80D，D227E
L31Q，N80D，K82R，I86A，G121S
L31Q，N80D，R130G
L31Q，I77V，N80D
L31Q，N80D，G121G
L31Q，N80D，Y230T
L31Q，N80D，K82R，I86S，R130N
L31Q，N80D，D227F
L31Q，N80D，I86A，G121R
L31Q，N80D，I86S，R130N
L31Q，N80D，W122C
L31Q，N80D，Y230S
L31Q，N80D，R130Y
L31Q，N80D，R130C
L31Q，I77L，N80D
A119T，N80D
A199A，N80D
G67A，N80D，V85H
其中，所述位置是通过比对亲本序列和SEQ ID No.68或SEQ ID No.16而鉴定的。
合适地，所述脂质酰基转移酶变体可以与亲本脂质酰基转移酶相同，除了在通过比对亲本序列和SEQ ID No.68或SEQ ID No.16而鉴别的第31位的修饰和任选的在任意一个或多个氨基酸残基位置27、77、80、82、85、85、86、121、122、130、167、207、227、230和289的一个或多个进一步修饰外。
合适地，所述脂质酰基转移酶变体可以与亲本脂质酰基转移酶相同，除了在通过比对亲本序列和SEQ ID No.68或SEQ ID No.16而鉴别的第31位的修饰和任选的在任意一个或多个氨基酸残基位置86、122或130的一个或多个进一步修饰外。
在一种实施方式中，当亲本序列为SEQ ID No.16或SEQ ID No.68或者当亲本序列由SEQ ID No.49或SEQ ID No.69编码时，所述变体多肽除了在第80位外具有上文详述的任意一个修饰。在这个方面，当通过比对亲本序列和SEQ ID No.16鉴定所述位置时，SEQ ID No.16、SEQ ID No.68或由SEQ ID No.49或SEQ ID No.69编码的多肽将在第80位已经具有天冬氨酸。
合适地，所述脂质酰基转移酶变体或所述脂质酰基转移酶变体可以与亲本脂质酰基转移酶具有至少75％同一性，合适地，所述脂质酰基转移酶变体可以与亲本脂质酰基转移酶具有至少75％或至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％同一性。
本发明还涉及具有脂质酰基转移酶活性的变体多肽，其中所述变体与亲本脂质酰基转移酶相比至少在第31位包含修饰，其中第31位是通过与SEQ ID No.68或SEQ ID No.16比对鉴别的。
在一种实施方式中，优选地，所述脂质酰基转移酶变体具有以下修饰和/或以下修饰是在本发明的方法中形成的：
L31Q、N80D、W122L(其可以被表示为L31Q、W122L，
其中的骨架酶在第80位已经具有D)；
M27V、L31Q、N80D(其可以被表示为N27V、L31Q，其
中的骨架酶在第80位已经具有D)；
L31Q、N80D、K82R、I86A(其可以被表示为L31Q、
K82R、I86A，其中的骨架酶在第80位已经具有D)；和/或
L31Q、N80D、I86S、W122F(其可以被表示为L31Q、
I86S、W122F，其中的骨架酶在第80位已经具有D)；
改良的性质
用于本发明的脂质酰基转移酶变体与亲本(即骨架)或未修饰的脂质酰基转移酶相比具有至少一个改良的性质。
本文使用的术语“改良的性质”可以包括a)例如脂质酰基转移酶的改变的底物特异性，并且仅作为实例i)酶利用某些化合物作为受体的改变的能力，例如利用碳水化合物作为受体分子由此提高酶产生碳水化合物酯的能力的改良的能力或ii)利用饱和的或不饱和的脂肪酸作为底物的改变的能力或iii)改变的特异性从而使脂质酰基转移酶变体优选利用来自脂质底物的Sn1或Sn2位的脂肪酸或iv)在变体酶中改变的底物链长特异性；b)酶的改变的动力学；和/或c)脂质酰基转移酶变体进行水解反应同时保持或增强酶进行酰基转移酶反应的能力的降低的能力。
其它改良的性质可以为，例如涉及pH和/或温度稳定性和/或去污剂和/或氧化稳定性的改良和/或变化。确实，认为可以根据本发明制备在一个或多个这些性质(pH、温度、蛋白水解稳定性、去污稳定性和/或氧化稳定性)中具有不同程度的稳定性的酶。
野生型(例如亲本脂质酰基转移酶)和突变体(例如脂质酰基转移酶变体)蛋白的表征是通过任何合适的方式并且优选基于感兴趣性质的评价而实现的。
在一些实施方式中，当与亲本酶比较时，所述酶变体可以具有提高的转移酶活性并且具有相同或较低的水解活性。换句话说，合适地，与亲本酶相比，变体酶可以具有较高的转移酶活性比水解活性(例如转移酶∶水解活性)。合适地，所述变体酶可以优选从脂质(包括磷脂、半乳糖脂或三酰基甘油)转移酰基至酰基受体而非简单地水解所述脂质。
合适地，当与亲本酶比较时，用于本发明的脂质酰基转移酶可以是对极性脂质，优选磷脂和/或糖脂具有增强的酶活性的变体。优选地，此变体还对溶血极性脂质具有低活性或没有活性。对极性脂质，优选磷脂和/或糖脂具有增强的活性可以是水解活性和/或转移酶活性或两者组合的结果。优选地，对极性脂质的增强的活性是转移酶活性的结果。
与亲本酶相比，用于本发明的脂质酰基转移酶变体可以对甘油三酯和/或甘油一酯和/或甘油二酯具有降低的活性。
合适地，所述变体酶可以对甘油三酯和/或甘油一酯和/或甘油二酯没有活性。
组的定义
第1组氨基酸组：
第1组氨基酸(注意这些是1IVN中的氨基酸——图53和图54)
Gly8、Asp9、Ser10、Leu11、Ser12、Tyr15、Gly44、Asp45、Thr46、Glu69、Leu70、Gly71、Gly72、Asn73、Asp74、Gly75、Leu76、Gln106、Ile107、Arg108、Leu109、Pro110、Tyr113、Phe121、Phe139、Phe140、Met141、Tyr145、Met151、Asp154、His157、Gly155、Ile156、Pro158。
可以从第1组取消高度保守的基序，例如GDSx和催化残基(带下划线的残基)。为了避免怀疑，第1组定义了在1IVN模型的活性位点内甘油的中心碳原子的
Figure BPA00001443891900461
以内的氨基酸残基。
第2组氨基酸组：
第2组氨基酸(注意氨基酸的编号指P10480成熟序列内的氨基酸)：
Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289和Val290。
与第2组相比第1组中选择的残基示于表1中。
Figure BPA00001443891900462
Figure BPA00001443891900471
Figure BPA00001443891900481
表1
第3组氨基酸：
第3组氨基酸与第2组相同，但是指杀鲑气单胞菌(SEQ ID No.35)编码序列，即第3组中的氨基酸残基编号大18，这反映了成熟蛋白(SEQ ID No.35)中的氨基酸编号与包括信号序列的蛋白(SEQ ID No.4)的蛋白相比的差异。
杀鲑气单胞菌GDSX的成熟蛋白(SEQ ID No.35)和嗜水气单胞菌GDSX(SEQ ID No.34)在五个氨基酸中具有差别。这些是Thr3Ser、LYS182Gln、Glu309Ala、Thr310Asn和Gly318-，其中杀鲑菌残基被列于第一且嗜水菌残基被列于最后。嗜水菌蛋白的长度仅为317个氨基酸并且在第318位缺乏残基。与嗜水气单胞菌蛋白相比，杀鲑气单胞菌GDSX对诸如糖脂底物的极性脂质具有相当高的活性。对所有五个氨基酸位置进行位点扫描。
第4组氨基酸：
第4组氨基酸是S3、Q182、E309、S310和-318。
第5组氨基酸：
F13S、D15N、S18G、S18V、Y30F、D116N、D116E、D157N、Y226F、D228N、Y230F。
第6组氨基酸：
第6组氨基酸是Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn 87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、-318。
第6组中的氨基酸的编号指P10480(SEQ ID No.3)中的氨基酸残基——可以通过与P10480和/或1IVN的同源比对和/或结构比对确定在其它序列骨架中的对应氨基酸。
第7组氨基酸：
第7组氨基酸是Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、-318、Y30X(其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W)、Y226X(其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W)、Y230X(其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W)、S18X(其中X选自A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W或Y)、D157X(其中X 选自A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y)。
第7组中的氨基酸的编号指P10480(SEQ ID No.3)中的氨基酸残基——可以通过与P10480和/或1IVN的同源比对和/或结构比对确定在其它序列骨架中的对应氨基酸。
合适地，与亲本酶相比，所述变体酶包含以下一个或多个氨基酸修饰：S3E、A、G、K、M、Y、R、P、N、T或GE309Q、R或A，优选Q或R-318Y、H、S或Y，优选Y。
优选地，GDSX基序中的X为L。因此，优选地，所述亲本酶包含氨基酸基序GDSL。
合适地，所述第一亲本脂质酰基转移酶可以包含任意一个以下氨基酸序列：SEQ ID No.34、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33或SEQ ID No.35。
合适地，所述第二相关脂质酰基转移酶可以包含任意一个以下氨基酸序列：SEQ ID No.3、SEQ ID No.34、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33或SEQ ID No.35。
与亲本酶相比，所述变体酶必须包含至少一个氨基酸修饰。在一些实施方式中，与亲本酶相比，所述变体酶可以包含至少2个，优选至少3个、优选至少4个、优选至少5个、优选至少6个、优选至少7个、优选至少8个、优选至少9个、优选至少10个氨基酸修饰。
当参考本文的特定氨基酸残基时，所述编号是从变体序列与如SEQ IDNo.34或SEQ ID No.35所示的参考序列的比对获得的。
一方面，优选地，所述变体酶包含一个或多个以下氨基酸取代：
S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或
L17A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
S18A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W或Y；和/或
K22A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
M23A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Y30A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
G40A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N80A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
P81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
K82A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
W111A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或
A114C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Y117A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
L118A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
P156A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
G159A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Q160A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或
N161A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
P162A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
S163A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或
A164C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
R165A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y；和/或
S166A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或
Q167A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或
K168A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
V169A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或
V170A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或
E171A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
A172C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
H180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N181A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Q182A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y，优选K；和/或
M209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
L210A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
R211A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Y226A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
Y230A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
K284A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
M285A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或
V290A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或
E309A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y。
另外或可选择地，可以具有一个或多个C-末端延伸。优选地，所述额外的C-末端延伸包含在一个或多个脂肪族氨基酸中，优选非极性氨基酸，更优选I、L、V或G。因此，本发明进一步提供了包含一个或多个以下C-末端延伸的变体酶：318I、318L、318V、318G。
优选的变体酶可以相对于磷脂例如磷脂酰胆碱(PC)具有降低的水解活性，还可以具有提高的从磷脂的转移酶活性。
优选的变体酶可以具有提高的从磷脂例如磷脂酰胆碱(PC)的转移酶活性，这些还可以具有针对磷脂的提高的水解活性。
一个或多个以下残基的修饰可形成针对磷脂具有提高的绝对转移酶活性的变体酶：
S3、D157、S310、E309、Y179、N215、K22、Q289、M23、H180、M209、L210、R211、P81、V112、N80、L82、N88；N87。
可以提供具有改良的从磷脂的转移酶活性的变体酶的具体优选的修饰可以选自以下一个或多个：
S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；优选N、E、K、R、A、P或M，最优选S3A；
D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；优选D157S、R、E、N、G、T、V、Q、K或C；
S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；优选S310T；
-318E；
E309A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；优选E309R、E、L、R或A；
Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；优选Y179D、T、E、R、N、V、K、Q或S，更优选E、R、N、V、K或Q；
N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；优选N215S、L、R或Y；
K22A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；优选K22E、R、C或A；
Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；优选Q289R、E、G、P或N；
M23A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；优选M23K、Q、L、G、T或S；
H180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；优选H180Q、R或K；
M209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；优选M209Q、S、R、A、N、Y、E、V或L；
L210A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；优选L210R、A、V、S、T、I、W或M；
R211A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y；优选R211T；
P81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；优选P81G；
V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；优选V112C；
N80A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；优选N80R、G、N、D、P、T、E、V、A或G；
L82A、C、D、E、F、G、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；优选L82N、S或E；
N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；优选N88C；
N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；优选N87M或G。
一个或多个以下残基的优选修饰形成针对磷脂具有提高的绝对转移酶活性的变体酶：
S3N、R、A、G；
M23K、Q、L、G、T、S；
H180R；
L82G；
Y179E、R、N、V、K或Q；
E309R、S、L或A。
一个优选的修饰是N80D。当使用参考序列SEQ ID No.35作为骨架时，尤其如此。因此，参考序列可以是SEQ ID No.16。这个修饰可以与一个或多个进一步的修饰组合。因此，在本发明的优选的实施方式中，编码用于本发明任一方法和用途的脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以编码包含SEQ ID No.35或与SEQ ID No.35具有75％或更高，优选85％或更高，更优选90％或更高，甚至更优选95％或更高，甚至更优选98％或更高，或者甚至更优选99％或更高同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
如上文所述，当参考本文的特定氨基酸残基时，所述编号是从变体序列与如SEQ ID No.34或SEQ ID No.35所示的参考序列的比对获得的。
更优选地，编码用于本发明任一方法和用途的脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以编码包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列或SEQ ID No.68所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID No.16或SEQ ID No.68具有70％或更高，优选75％或更高，优选85％或更高，更优选90％或更高，甚至更优选95％或更高，甚至更优选98％或更高，或者甚至更优选99％或更高同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。该酶可以被认为是变体酶。
在优选的实施方式中，所述变体酶包含SEQ ID No.70、SEQ ID No.71或SEQ ID No.72之一。
同一性的程度基于相同序列元素的数量。可以通过本领域已知的计算机程序，例如Vector NTI 10(Invitrogen Corp.)适当地测定本发明的氨基酸序列的同一性程度。对于成对比对，所使用的打分优选BLOSUM62，其中的空隙开放罚分为10.0，空隙延伸罚分为0.1。
合适地，在至少20个连续氨基酸上，优选在至少30个连续氨基酸上，优选在至少40个连续氨基酸上，优选在至少50个连续氨基酸上，优选在至少60个连续氨基酸上测定氨基酸序列的同一性程度。
合适地，可以在整个序列上测定氨基酸序列的同一性程度。
合适地，编码脂质酰基转移酶或用于本发明的脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以是可获得的，优选获自一个或多个以下属的生物：气单胞菌属(Aeromonas)、链霉菌属(Streptomyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌属(Vibrionaceae)、木杆菌属(Xylella)、硫叶菌属(Sulfolobus)、曲霉属(Aspergillus)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、李斯特菌属(Listeria)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、雷尔氏菌属、黄杆菌属(Xanthomonas)、假丝酵母属(Candida)、嗜热裂孢菌(Thermobifida)和棒杆菌属(Corynebacterium)。
合适地，编码脂质酰基转移酶或用于本发明的脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以是可获得的，优选获自一个或多个以下生物：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、Streptomyces thermosacchari，阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、脱卤脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium dehalogenans)、芽孢杆菌(Bacillus sp)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、弧菌科(Vibrionaceae)、苛养木杆菌(Xylellafastidiosa)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、土曲霉(Aspergillus terreus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、无害李斯特菌(Listeria mnocua)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocutogenes)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、百脉中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)、褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)和Corynebacteriumefficiens。
一方面，优选地，编码用于本发明任一方法和/或用途的脂质酰基转移酶的核苷酸序列编码本发明的脂质酰基转移酶，其是可以获得的，优选获自或源自气单胞菌种、嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌中的一种或多种。
一方面，优选地，用于本发明任一方法和/或用途的脂质酰基转移酶是可以获得的，优选获自或源自气单胞菌种、嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌中的一种或多种。
可以利用下文教导的测定方法常规鉴定其功能是本发明的脂质酰基转移酶的酶。
本文使用的术语“转移酶”可以与术语“脂质酰基转移酶”互用。
合适地，本文定义的脂质酰基转移酶催化一个或多个以下反应：酯交换、酯转移、醇解、水解。
术语“酯交换”指脂质供体和脂质受体之间由酶催化的酰基转移，其中所述脂质供体不是游离的酰基基团。
本文使用的术语“酯转移”表示由脂质供体(非游离脂肪酸)至酰基受体(非水)的由酶催化的酰基转移。
本文使用的术语“醇解”指酸衍生物的共价键通过与醇ROH反应的酶促裂解，从而使一个产物结合醇的H，而另一个产物结合醇的OR基团。
本文使用的术语“醇”指含羟基的烷化合物。
本文使用的术语“水解”指酰基从脂质至水分子的OH基团的酶促催化转移。
本文使用的术语“没有增加或者基本没有增加游离脂肪酸”表示优选本发明的脂质酰基转移酶具有100％转移酶活性(即从酰基供体转移100％酰基至酰基受体，没有水解活性)；然而，所述酶可以转移存在于脂质酰基供体的小于100％酰基至酰基受体。在这种情况下，优选地，酰基转移酶活性占总酶活性的至少5％，更优选至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，且更优选至少98％。可以通过上文的“转移酶活性测定”测定转移酶活性的百分数(即转移酶活性相对于总酶活性的百分数)。
在本发明的一些方面，本文使用的术语“基本没有增加游离脂肪酸”表示在用本发明的脂质酰基转移酶处理的食用油中游离脂肪酸的量小于已经使用除本发明的脂质酰基转移酶外的其它酶的食用油中产生的游离脂肪酸的量，例如与已经使用了传统的磷脂酶，例如Lecitase UltraTM(Novozymes A/S，Denmark)产生的游离脂肪酸的量相比。
组合
用于本发明的酶可以与一个或多个其它合适的酶一起使用。因此，除了用于本发明的脂质酰基转移酶外至少一种其他酶也在本发明的反应组合物中，这也在本发明的范围内。所述其他酶包括淀粉降解酶、例如内淀粉酶或外淀粉酶，支链淀粉酶(pullulanases)，脱支酶，半纤维素酶(包括木聚糖酶)，纤维素酶，氧化还原酶，如过氧化物酶、酚氧化酶，葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、巯基氧化酶，或碳水化合物氧化酶，如氧化麦芽糖的氧化酶，如己糖氧化酶(HOX)、脂肪酶、磷脂酶、糖脂酶、半乳糖脂酶(galactolipases)，和蛋白酶。
在一种实施方式中，所述脂质酰基转移酶与具有一种或多种以下脂肪酶活性的脂肪酶组合存在：糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)、三酰甘油酯酶活性(E.C.3.1.1.3)、磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)。合适地，所述脂肪分解酶是本领域熟知的并且包括例如以下脂肪水解酶：LIPOPAN
Figure BPA00001443891900591
F，LIPOPAN
Figure BPA00001443891900592
XTRA和/或LECITASE
Figure BPA00001443891900593
ULTRA(NovozymesA/S，Denmark)，磷脂酶A2(例如来自Biocatalysts的LIPOMODTM 22L、来自Genencor的LIPOMAXTM的磷脂酶A2)，LIPOLASE(NovozymesA/S，Denmark)，YIELDMAXTM(Chr.Hansen，Denmark)，PANAMORETM(DSM)，WO 03/97835，EP 0 977 869或EP 1 193 314中教导的脂肪酶。
脂质酰基转移酶的使用还可以在磷脂酶，例如磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C和/或磷脂酶D的存在下进行。
所述酰基转移酶和一种或多种其它合适的酶的使用可以顺次或同时进行，例如脂质酰基转移酶处理可以在用一种或多种其它合适的酶的酶处理前、同时或随后发生。
在顺次酶处理的情况下，在一些实施方式中，例如通过在用第二(和/或第三等)酶处理前的热失活或者通过使用固定化酶除去第一酶，这可能是有利的。
应进一步理解，额外酶的存在可以是蓄意添加酶的结果，或者可选择地，额外的酶可以作为污染物存在或者可以以由磷脂组合物已经暴露于其中的早期过程引起的残留水平存在。
转录后和翻译后修饰
适合地，本发明的脂质酰基转移酶可以由本文教导的任一个核苷酸序列编码。
根据所使用的宿主细胞，可以进行转录后和/或翻译后修饰。可以理解，用于本发明方法和/或用途的脂质酰基转移酶包括已经经历转录后和/或翻译后修饰的脂质酰基转移酶。
仅作为举例，本文SEQ ID No.49(参见图45)所示的核苷酸序列在宿主细胞(例如地衣芽孢杆菌)中的表达引起转录后和/或翻译后修饰，从而产生本文SEQ ID No.68所示的氨基酸序列。
SEQ ID No.68与SEQ ID No.16相同，只是SEQ ID No.68已经历了翻译后和/或转录后修饰从而除去了一些氨基酸，更尤其是38个氨基酸。显著地，分子的N-末端和C-末端部分通过两个半胱氨酸之间的S-S桥键连接。氨基酸残基236和SEQ ID No.38的236在翻译后修饰后没有共价连接。所形成的两个肽通过一个或多个S-S桥键而保持在一起。
翻译后和/或转录后修饰的准确切割位点可以略有变化，从而作为实例仅所除去的38个氨基酸(与SEQ ID No.16相比，如SEQ ID No.68中所示)可以略有变化。不希望受理论限制，与通过参考与SEQ ID No.16相比的SEQ ID No.68所示的切割位点相比，切割位点可以在任意方向移动数个残基(例如1、2或3个残基)。换句话说，不是在例如第235-ATR位至第273(RRSAS)位的切割，切割可以在例如残基232、233、234、235、236、237或238开始。此外或可选择地，切割可导致约38个氨基酸的去除，在一些实施方式中，切割可导致30-45个残基，例如34-42个残基，例如36-40个残基，优选38个残基去除。
分离的
一方面，所述脂质酰基转移酶是回收的/分离的脂质酰基转移酶。因此，所制备的脂质酰基转移酶可以是分离的形式。
另一方面，编码用于本发明的脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以是分离的形式。
术语“分离的”表示序列或蛋白至少基本不包含至少一种其它组分，所述其它组分原本与所述序列或蛋白天然结合，并且原本在一起存在。
在一个方面，所述植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯可以从反应混合物或反应组合物的其它组分分离或分开。因此，术语“分离的(或分离)”表示所述植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯至少基本不含在存在于反应混合物或反应组合物中的至少一种其它组分或者经处理使其至少基本不含存在于反应混合物或反应组合物的至少一种其它组分。
在一个方面，所述植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯是分离的形式。
纯化的
一方面，所述脂质酰基转移酶可以是纯化的形式。
另一方面，编码用于本发明的脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以是纯化的形式。
进一步的方面，所述植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯可以是纯化的形式。
术语“纯化的”是指所述酶或植物甾烷醇酯或植物甾醇酯处于相对纯的状态，如至少约51％纯，或至少约75％纯，或至少约80％纯，或至少约90％纯，或至少约95％纯，或至少约98％纯。
一方面，术语“纯化”表示所述植物甾烷醇酯和/或植物甾醇酯经处理以使其处于相对纯的状态，例如至少约51％纯，或至少约75％纯，或至少约80％纯，或至少约90％纯，或至少约95％纯，或至少约98％纯。
食品
本文中所用的术语“食品”指适合人和/或动物消耗的物质。因此，本文使用的术语“食物”或“食品”包括“饲料”(“feed”和“feedstuff”)。
适宜地，本文中所用的术语“食品”可指做好消耗准备的形式的食品。可是，或者/另外，本文中所用的的术语“食品”可指用于制备食品的一种或多种食物材料。仅作为示例，术语“食品”涵盖由生面团产生的焙烤品以及用于制备所述焙烤品的生面团。
在一个优选的方面，本发明提供上文定义的食品，其中所述食品选自以下一种或多种：蛋，基于蛋的产品，包括但不限于蛋黄酱，色拉调味品，沙司，冰激凌，蛋粉，改良蛋黄及其制成品；焙烤品，包括面包，蛋糕，甜面团(sweet dough)产品，叠层面团产品(laminated dough)，液态面糊(batter)，松饼，油炸圈饼，饼干，薄脆饼干和曲奇饼；糖品(confectionary)，包括巧克力，糖果，焦糖，halawa，胶皮糖(gum)，包括无糖和加糖胶皮糖，泡泡糖，软泡泡糖，口香糖和布丁；冷冻产品，包括冰糕(sorbet)，优选冷冻乳制品，包括冰激凌和冰奶；乳制品，包括奶酪，黄油，奶，咖啡稀奶油，生奶油，蛋奶羹(custard cream)，乳饮料和酸奶；奶油冻(mousse)，经搅打的蔬菜奶油(whipped vegetable cream)，肉制品，包括经加工的肉制品；食用油和脂肪，搅打起泡和不起泡的产品，水包油乳剂，油包水乳剂，人造黄油，起酥油和涂抹物，包括低脂肪的和极低脂肪的涂抹物；调味品，蛋黄酱，蘸料(dip)，基于奶油的沙司，基于奶油的汤，饮料，香料乳剂(spice emulsion)和沙司。
适宜地，根据本发明的食品可以是“精制食物”，包括蛋糕、面粉糕饼、糖果、巧克力、奶油软糖(fudge)等。
在一个方面，根据本发明的食品可以是生面团产品或焙烤产品，诸如面包、油炸产品、小吃、蛋糕、馅饼、核仁巧克力饼、曲奇饼、面条、小吃诸如薄脆饼干、全麦薄脆饼干、椒盐脆饼干、和薯片、和意大利面(pasta)。
在另一方面，根据本发明的食品可以是植物衍生的食物产品，诸如面粉、预混合料、油、脂肪、可可油、调咖啡用白油(coffee whitener)、色拉调味品、人造黄油、涂抹物、花生酱、起酥油、冰激凌、烹调油。
在另一方面，根据本发明的食品可以是乳制品，包括黄油，奶，奶油，奶酪诸如各种形式的(包括切碎的、整块的、切片的或搓碎的)天然的、经加工的、和人造的干酪，奶油干酪，冰激凌，冷冻甜品，酸奶，酸奶饮料，黄油脂肪，脱水乳脂肪，其它乳制品。
在另一方面，根据本发明的食品可以是含有动物衍生成分的食品，诸如经加工的肉制品、烹调油、起酥油。
在另一方面，根据本发明的食品可以是饮料、水果、水果什锦、蔬菜或葡萄酒。在有些情况中，饮料可含多达20g/l外加的植物甾醇。
在另一方面，根据本发明的食品可以是动物饲料。动物饲料可被强化了植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯，优选强化了β-谷甾醇/甾烷醇酯。适宜地，动物饲料可以是家禽饲料。当食品是家禽饲料时，本发明可用于降低以根据本发明的食品喂养的家禽所产蛋的胆固醇含量。
在一个方面，优选食品选自以下一种或多种：蛋，基于蛋的产品，包括蛋黄酱，色拉调味品，沙司，冰激凌，蛋粉，改良蛋黄及其制成品。
在再一方面，食品优选为人造黄油或蛋黄酱。
本文使用的术语“食物材料”表示食品的至少一个成分或至少一个组分。
个人护理品
植物甾醇和植物甾烷醇是具有强的皮肤病学(消炎和抗红斑)和生物学(高胆固醇血)活性并且有兴趣用于皮肤化妆品和营养产品的化合物。
由本发明方法和用途制备的植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯包括任何化妆品或人用化妆乳液、包括肥皂、护肤霜、面霜、面膜、皮肤清洁剂、牙膏、唇膏、香水、化妆品(make-up)、粉底、腮红、睫毛膏、眼影、防晒露、护发素和染发剂。
药物组合物
本发明还提供了包含通过本发明的方法或用途产生的甾醇酯和/或甾烷醇酯以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂(包括它们的组合)的药物组合物。
所述药物组合物可在人和牲畜医药中用于人或动物用途并且通常包含任意一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。用于治疗应用的可接受的载体或稀释剂是药学领域熟知的并且描述在例如Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中。药学载体、赋形剂或稀释剂的选择可根据预定的用药途径和标准的药学实践而选择。所述药物组合物可以包含，或除了载体、赋形剂或稀释剂外可包含任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、涂覆剂、助溶剂。
在所述药物组合物中可以提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至是调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。还可以使用抗氧化剂和助悬剂。
根据不同的递送系统而可以具有不同的组合/配制要求。例如，可以将本发明的药物组合物配制成利用迷你泵或通过粘膜途径，例如，作为鼻喷雾或用于吸入的气溶胶或可摄取溶液而递送，或者通过肠胃外递送，其中以用于例如通过静脉内、肌内或皮下途径的可注射形式配制所述组合物。
当所述试剂通过胃肠粘膜粘膜递送时，其应能够在穿过胃肠道的过程中保持稳定，例如其应该抵抗蛋白水解降解、在酸性pH下稳定并且抵抗胆汁的去污作用。
适当地，所述药物组合物可以通过吸入施用，以栓剂或阴道栓剂的形式施用，以洗液、溶液、霜、膏或扑粉的形式通过而局部施用，通过使用皮肤贴施用，通过以含赋形剂(例如淀粉或乳糖)的片剂的形式、或者以单独或混合有赋形剂的胶囊或胚珠(ovule)、或者以含调味剂或着色剂的酏剂、溶液或悬浮液的形式口服，或者它们可以经肠胃外注射，例如静脉内、肌内或皮下注射。对于肠胃外施用，所述组合物最好以无菌含水溶液的形式使用，所述无菌含水溶液可以含有其它物质，例如足够的盐或单糖以使溶液与血液等渗。对于口腔含化或舌下含化施用，所述组合物可以以能够以常规方式配制的片剂或锭剂的形式施用。
优选地，所述药物组合物是适合经口递送的形式。
克隆编码本发明多肽的核苷酸序列
编码具有如本文所定义的特定性质的多肽或适合修饰的多肽的核苷酸序列可以从产生所述多肽的任何细胞或生物中分离得到。用于分离核苷酸序列的各种方法都是本领域熟知的。
例如，可以使用产生所述多肽的生物的染色体DNA或信使RNA来构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果所述多肽的氨基酸序列是已知的，可以合成经标记的寡核苷酸探针，并将其用于从由该生物制备的基因组文库中鉴定编码多肽的克隆。或者，也可以使用包含与另一已知多肽基因同源的序列的经标记寡核苷酸探针来鉴定编码多肽的克隆。在后一种情况下，使用严谨性较低的杂交和清洗条件。
或者，可以通过如下方式鉴定编码多肽的克隆：将基因组DNA的片段插入到表达载体(如质粒)中，使用所得的基因组DNA文库转化酶为阴性的细菌，并随后将转化的细菌涂布在包含被所述多肽抑制的酶的琼脂上，由此可以鉴定出表达所述多肽的克隆。
再者，也可以通过建立的标准方法通过合成来制备编码所述多肽的核苷酸序列，如Beucage S.L.et al(1981)Tetrahedron Letters 22，第1859-1869页描述的亚磷酰胺法，或Matthes et al(1984)EMBO J.3，第801-805页描述的方法。在亚磷酰胺法中，在如自动DNA合成仪上合成寡核苷酸，然后将其纯化、退火、连接并克隆到适当的载体中。
所述核苷酸序列可以是源自混合的基因组和合成来源、混合的合成和cDNA来源、或混合的基因组和cDNA来源，其根据标准技术通过连接源自合成的、基因组的或cDNA的片段(根据需要)而制得。每个连接的片段对应于整个核苷酸序列的不同部分。所述DNA序列也可以使用特定引物通过聚合酶链式反应(PCR)来制备，如US 4,683,202或Saiki R K et al(Science(1988)239，第487-491页)中所述。
核苷酸序列
本发明还涵盖编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列。本文所用的术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列和其变体、同源物、片段和衍生物(如其部分)。所述核苷酸序列可以是源自基因组的或合成的或重组的，其可以是双链的或单链的(无论其代表正义链还是反义链)。
本发明的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。优选地，其指DNA，更优选为编码序列的cDNA。
在优选的实施方式中，编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列本身不涵盖存在于其天然环境中的天然核苷酸序列，此时该序列与同处于其天然环境中其天然结合序列相连接。为了便于参考，我们将此优选实施方式称为“非天然核苷酸序列”。由此，术语“天然核苷酸序列”是指处于其天然环境中并与其天然结合的完整启动子(同处于其天然环境中)可操作地连接的完整核苷酸序列。因此，可以利用核苷酸序列在其天然生物中表达本发明的多肽，但是其中所述核苷酸序列不受所述生物中与其天然结合的启动子的控制。
优选地，所述多肽不是天然多肽。由此，术语“天然多肽”是指处于其天然环境中并已经由其天然核苷酸序列表达的完整多肽。
通常，使用重组DNA技术(即重组的DNA)制备编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列。然而，在本发明的另一个可选实施方式中，可以使用本领域已知的化学方法来合成全部或部分核苷酸序列(参见Caruthers MH et al(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T et al(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。
分子进化
分离出编码酶的核苷酸序列或鉴定出编码推定酶的核苷酸序列后，需要对所选择的核苷酸序列进行修饰，例如需要对所述序列进行突变以制备本发明的酶。
可以使用合成的寡核苷酸来引入突变。这些寡核苷酸包含目标突变位点侧翼的核苷酸序列。
Morinaga et al.，(Biotechnology(1984)2，第646-649页)中公开了适合的方法。Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，第147-151页)中描述了向编码酶的核苷酸序列中引入突变的另一种方法。
除了如上文所述的定点诱变，可以随机引入突变，如使用商品试剂盒，如来自Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒，或来自Clontech的Diversify PCR随机诱变试剂盒。EP 0 583 265提到基于PCR的诱变的优化方法，其也可以结合使用DNA突变类似物，如EP 0 866 796中所述的那些。易错PCR技术也适用于制备具有优选性质的脂质酰基转移酶变体。WO0206457提到了脂肪酶的分子进化。
获得新型序列的第三种方法是使用任何数量的限制性酶或如Dnase I的酶将非全同的(non-identical)核苷酸序列片段化，并重新组装成编码功能性蛋白的全长核苷酸序列。或者，可以使用一个或多个非全同的核苷酸序列，并在重新组装全长核苷酸序列时引入突变。DNA改组(shuffling)和家族改组技术适用于制备具有优选性质的脂质酰基转移酶变体。适合进行“改组”的方法可以参见EP0 752 008、EP1 138 763、EP1 103 606。改组也可以与如US 6,180,406和WO 01/34835中所述的其它形式的DNA诱变相结合。
因此，有可能在体内或体外在核苷酸序列中产生大量定点突变或随机突变，并随后通过多种手段筛选功能性得到改进的编码多肽。可以使用例如计算机分析(in silico)和核酸外切酶介导(exo-mediated)的重组方法(参见WO 00/58517、US 6,344,328、US 6,361,974)进行分子进化，其中所产生的变体保留了与已知酶或蛋白的很低的同源性。由此获得的所述变体可与已知的转移酶具有显著的结构类似性，但却具有很低的氨基酸序列同源性。
此外，如在非限定性实例中，多核苷酸序列的突变体或天然变体也可以与野生型或其它突变体或天然变体重组以生产新的变体。也可以筛选所述新的变体以获得功能性得到改进的编码多肽。
应用以上以及类似的分子进化方法能够在没有关于蛋白结构或功能的任何现有知识的情况下鉴定和选择具有优选特性的本发明的酶变体，并能够产生不可预测的但有益的突变体或变体。在本领域中应用分子进化来优化或改变酶活性的实例有很多，所述实例包括但不限于以下的一种或多种：优化在宿主细胞或体外的表达和/或活性、增加酶活性、改变底物和/或产物特异性、增加或降低酶稳定性或结构稳定性、改变在优选环境条件(如温度、pH、底物)中酶的活性/特异性。
使用分子进化工具可以改变酶以提高该酶的功能性，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
适合地，用于本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以编码脂质酰基转移酶变体，即当与亲本酶比较时，所述脂质酰基转移酶可以包含至少一个氨基酸的取代、缺失或添加。变体酶与亲本酶保持至少1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％的同一性。适合的亲本酶可以包括具有酯酶或脂肪酶活性的任何酶。优选地，亲本酶与pfam00657共有序列相比对。
在优选的实施方式中，脂质酰基转移酶变体保留或掺入了存在于GDSX、GANDY和HPT区中的至少一个或多个pfam00657共有序列氨基酸残基。
可以利用分子进化工具使酶(例如在含水环境中没有或具有低的脂质酰基转移酶活性的脂肪酶)进行突变，以引入或增强转移酶活性，由此产生具有适用于本发明的组合物和方法的显著的转移酶活性的脂质酰基转移酶。
适合地，编码用于本发明任一方法和/或用途的脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以编码脂质酰基转移酶变体，与亲本酶相比，该变体对极性脂质(优选为磷脂)具有增强的酶活性。
可选地，所述变体酶可以具有提高的热稳定性。
脂质酰基转移酶变体是已知的，且一种或多种所述变体可以适用于本发明的方法和用途，和/或本发明的酶组合物。仅举例来说，根据本发明可以使用以下文献中阐述的脂质酰基转移酶变体：Hilton & Buckley J Biol.Chem.1991 Jan 15：266(2)：997-1000；Robertson et al.，J.Biol.Chem.1994Jan 21；269(3)：2146-50；Brumlik et al.，J.Bacteriol 1996 Apr；178(7)：2060-4；Peelman et al.，Protein Sci.1998 Mar；7(3)：587-99。
氨基酸序列
本发明还涵盖由用于本发明任一方法和/或用途中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
本文所使用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。
所述氨基酸序列可以从适合的来源制备/分离，或其可以通过合成制备、或其可以使用重组DNA技术制备。
适合地，所述氨基酸序列可以通过标准技术从本文教导的分离多肽获得。
一种适合测定来自分离多肽的氨基酸序列的方法如下：
可以将纯化的多肽冻干，并将100μg的冻干原料溶解于8M尿素和0.4M碳酸氢铵(pH 8.4)的50μl混合物中。在覆盖氮气并加入5μl 45mM二硫苏糖醇后，可以将溶解的蛋白在50℃变性并还原15分钟。冷却至室温后，可以加入5μl 100mM碘乙酰胺，从而使半胱氨酸残基在室温、避光和氮气下衍生15分钟。
可以向以上反应混合物中加入135μl水和含5μg内切蛋白酶Lys-C的5μl水溶液，并在37℃氮气保护下消化24小时。
可以使用溶剂A(0.1％TFA的水溶液)和溶剂B(0.1％TFA的乙腈溶液)在VYDAC C18柱(0.46x15cm；10μm；The Separation Group，California，USA)上通过反相HPLC分离所得到的肽。在N-末端测序前，可以使用相同的溶剂体系在Develosil C18柱上对所选择的肽进行重新层析。可以使用AppliedBiosystems 476A测序仪，根据生产商的说明书(Applied Biosystems，California，USA)使用脉冲液态快速循环来完成测序。
序列同一性或序列同源性
在此，术语“同源物”是指与目标氨基酸序列和目标核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可以等同于“同一性”。
所述同源氨基酸序列和/或核苷酸序列可以提供和/或编码保留所述酶的功能活性和/或增强所述酶的活性的多肽。
在本文中，认为同源序列包括可以与目标序列有至少75％、85％或90％同一性，优选为至少95％或98％同一性的氨基酸序列。通常，同源物将包含与目标氨基酸序列相同的活性位点等。虽然同源性也可以被视为相似性(即氨基酸残基具有相似的化学性质/功能)，但是在本发明的内容中，优选以序列同一性来表示同源性。
在本文中，认为同源序列包括可以与编码本发明多肽的核苷酸序列(目标序列)有至少75％、85％或90％同一性的核苷酸序列，优选为至少95％或98％同一性的核苷酸序列。通常，同源物将包括与目标序列相同的活性位点编码序列等。虽然同源性也可以被视为相似性(即氨基酸残基具有相似的化学性质/功能)，但是在本发明的内容中，优选以序列同一性来表示同源性。
可以通过目测进行同源性比较，或者更通常是借助易于获得的序列比较程序进行同源性比较。这些商业性计算机程序可以计算两个或多个序列间的同源性％。
可以在连续的序列中计算同源性％，即一个序列与其它序列比对，且将一个序列中的每个氨基酸与其它序列中的相应氨基酸直接比较，每次比较一个残基。这被称为“无缺口”比对。通常所述无缺口比对仅在数量相对少的残基中进行。
虽然这是非常简单且稳定的方法，但是其未能考虑到如在其它方面相同的成对序列中，一个插入或缺失将引起随后的氨基酸残基无法比对，因此可能导致在进行整体比对时的同源性％大大降低。因此，大部分序列比对方法被设计成产生考虑了可能的插入和缺失而不过度地对整体同源性得分进行罚分的最佳比对。这可以通过在比对序列中插入“缺口”以试图使局部同源性最大化而实现。
然而，这些更加复杂的方法给比对中出现的每个缺口赋予“缺口罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽量少缺口的序列比对(反映了两个比较的序列间更高的相关性)将比具有许多缺口的序列比对具有更高的得分。通常使用“仿射缺口罚分”(Affine gap cost)，即对缺口的存在处以较高罚分，而对缺口中的每个后续残基处以较小罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分将无疑产生具有更少缺口的优化比对。大多数比对程序允许修正缺口罚分。然而，当使用所述软件进行序列比较时，优选使用默认值。
因此，最大同源性％的计算首先需要在考虑缺口罚分下产生最佳的比对。适合用于进行所述比对的计算机程序为Vector NTI AdvanceTM 11(Invitrogen Corp.)。可以进行序列比较的其它软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等，1999Short Protocols in Molecular Biology，第4版，第18章)和FASTA(Altschul等，1990 J.Mol.Biol.403-410)。BLAST和FASTA均可进行离线和在线搜索(参见Ausubel等1999，7-58页至7-60页)。然而，对于一些应用，优选使用Vector NTI AdvanceTM 11程序。也可以将称为BLAST 2 Sequences的新型工具用于比较蛋白和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)：247-50；和FEMS Microbiol Lett 1999177(1)：187-8)。
虽然可以根据同一性来测定最终的同源性％，但是比对方法本身通常不是基于全是或全非的成对比较。作为代替，通常使用尺度相似性评分矩阵(scaled similarity score matrix)，基于化学相似性或进化距离对每对比较评分。通常所用的此矩阵的实例为BLOSUM62矩阵(BLAST程序套的默认矩阵)。Vector NTI程序通常使用公开的默认值，或者也可能使用所提供的自定义符号比较表(详见用户手册)。对于一些应用，优选使用Vector NTIAdvanceTM 11软件包的默认值。
或者，也可以使用基于与CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244)类似的算法的Vector NTI AdvanceTM 11(InvitrogenCorp.)中的多重比对特征来计算同源性％。
一旦软件生成了最佳比对，就可以计算同源性％，优选为序列同一性％。软件通常将其作为序列比较的一部分来执行，并生成数值结果。
在确定序列同一性时应使用空隙罚分，因此优选利用所述程序的默认参数进行成对比对。例如，以下参数是目前用于BLAST 2成对比对的默认参数：
Figure BPA00001443891900711
在一种实施方式中，优选地，可以利用具有如上定义的打分参数设置的BLAST2(blastn)确定所述核苷酸序列和/或氨基酸序列的序列同一性。
出于本发明的目的，同一性的程度基于相同的序列元素的数量。可以通过本领域熟知的计算机软件Vector NTI AdvanceTM 11(Invitrogen Corp.)适当地确定本发明的氨基酸序列的同一性的程度。对于成对比对，所使用的打分参数优选为BLOSUM62，其中空隙存在罚分为11，空隙延伸罚分为1。
适合地，在至少20个连续的核苷酸中，优选为在至少30个连续的核苷酸中，优选为在至少40个连续的核苷酸中，优选为在至少50个连续的核苷酸中，优选为在至少60个连续的核苷酸中，优选为在至少100连续的核苷酸中测定核苷酸序列的同一性程度。
适合地，在全序列中测定核苷酸序列的同一性程度。
所述序列也可以具有产生沉默改变和产生功能等价物的氨基酸残基的缺失、插入或取代。可以根据残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质上的相似性来进行谨慎的氨基酸取代，只要该物质的次要结合活性被保持即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性质的不带电荷的极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
例如可以根据下表进行保守取代。在第二列中相同栏中的氨基酸，优选在第三列中相同行中的氨基酸可以相互取代：
Figure BPA00001443891900721
本发明还涵盖可以发生的同源取代(本文所用的取代和替换均指现存氨基酸残基与可选残基的互换)，即相似取代，如碱性氨基酸取代碱性氨基酸、酸性氨基酸取代酸性氨基酸、极性氨基酸取代极性氨基酸等。也可以发生非同源取代，即从一类残基变成另一类残基，或涉及非天然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯基甘氨酸。
也可以使用非天然氨基酸进行替换。
氨基酸变体序列可以包含可以在序列的任何两个氨基酸残基间插入的适合的间隔子基团，除氨基酸间隔子如甘氨酸或β-丙氨酸残基外，还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。本领域的技术人员可充分理解其它形式的变异，其涉及以类肽(peptoid)形式存在的一个或多个氨基酸残基。为了避免争议，“类肽形式”用来指α-碳取代基基团在残基的氮原子上而非在α-碳上的氨基酸残基变体。制备类肽形式的肽的方法是本领域内已知的，如Simon RJ等，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，TrendsBiotechnol.(1995)13(4)，132-134。
本发明所使用的或编码具有本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列可以在其内部包含合成的或修饰的核苷酸。本领域中已知对寡核苷酸的许多不同类型的修饰。这些修饰包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架和/或在分子的3’末端和/或5’末端添加吖啶或多赖氨酸链。出于本发明的目的，应该理解可以用本领域中可用的任何方法来修饰本文所述的核苷酸序列。可以进行所述修饰以增强核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明还涵盖与本文所讨论的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的应用。如果序列与其片段互补，此序列可以被用作探针以鉴定其它生物等中相似的编码序列。
可以以多种方式获得与本发明的序列并非100％同源但却落入本发明范围中的多核苷酸。可以通过例如探测由一系列个体(如来自不同种群的个体)制备的DNA文库来获得本文所述序列的其它变体。此外，可以获得其它病毒/细菌或细胞同源物，特别是存在于哺乳动物细胞(如大鼠、小鼠、牛和灵长类细胞)中的细胞同源物，且所述同源物和其片段将通常能够选择性地与本文序列表中所示的序列杂交。可以通过探测从其它动物物种制备的cDNA文库或基因组DNA文库，并在中度至高度严谨条件下使用包含所附序列表中任何一个序列的全部或部分的探针探测所述文库来获得所述序列。类似的考虑用于获得本发明多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。
也可以使用简并PCR来获得变体和株系/物种同源物，所述简并PCR将使用设计为靶向变体和同源物中编码本发明序列中的保守氨基酸序列的引物。例如可以通过比对来自多个变体/同源物的氨基酸序列来预测保守序列。可以使用本领域已知的计算机软件进行序列比对。例如广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。
简并PCR中所用的引物可包含一个或多个简并位点，且其使用条件的严谨性可低于使用针对已知序列的单一序列引物克隆序列所用的那些条件。
或者，也可以通过已表征序列的定点诱变来获得所述多核苷酸。例如当需要沉默密码序列的改变，从而为表达多核苷酸序列的特定宿主细胞优化密码子偏爱性时，这可能是有用的。可能需要其它序列改变，以引入限制性多肽识别位点，或改变由多核苷酸编码的多肽的性质或功能。
可以使用本发明的多核苷酸(核苷酸序列)制备引物，如PCR引物，用于可选扩增反应的引物；探针，如使用放射性或非放射性标记物通过常规方法用显色标记物标记的探针；或可以将多核苷酸克隆到载体中。所述引物、探针和其它片段的长度可以是至少15个，优选为至少20个、如至少25个、30个或40个核苷酸，且其也涵盖在如本文所用的术语“多核苷酸”之内。
可以重组、合成或通过本领域技术人员可利用的任何方法来制备根据本发明的多核苷酸(如DNA多核苷酸)和探针。它们也可以通过标准技术进行克隆。
通常，可通过合成方法来制备引物，该方法包括以每次一个核苷酸的方式逐步制备所需要的核酸序列。本领域中易于获得使用自动化技术来实现上述方法的技术。
通常使用重组方法，如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术来制备较长的多核苷酸。这包括制备位于所需要克隆的脂质靶向序列区域侧翼的一对引物(如约15至30个核苷酸)，使引物接触从动物或人细胞获得的mRNA或cDNA，在可以使所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，并回收扩增的DNA。可以将引物设计成使其包含适合的限制性酶识别位点，以便可以将扩增的DNA克隆到适合的克隆载体中。
杂交
本发明还涵盖与本发明的序列互补的序列，或能够与本发明的序列杂交或与其互补序列杂交的序列的应用。
本文所用的术语“杂交”包括“一条核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”，以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行扩增的过程。
本发明还涵盖所述核苷酸序列的应用，所述核苷酸序列能够和与本文所讨论的目标序列、或其任何衍生物、片段或衍生物互补的序列杂交。
本发明还涵盖能够与本文所讨论的核苷酸序列杂交的序列的互补序列。
杂交条件基于核苷酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，Vol.152，Academic Press，San Diego CA)中所教导，且给出了如下文所解释的定义的“严谨性”。
最高严谨性通常出现在约(Tm-5)℃(比探针的Tm低5℃)；高严谨性比Tm低约5℃至10℃；中等严谨性比Tm低约10℃至20℃；且低严谨性比Tm低约20℃至25℃。如本领域技术人员的理解，最高严谨性杂交可以用于鉴定或检测相同的核苷酸序列，而中等(或低)严谨性杂交可以用于鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。
优选地，本发明涵盖能够在高严谨性条件或中等严谨性条件下与编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列杂交的序列的互补序列的应用。
更优选地，本发明涵盖能够在高严谨性条件(如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH 7.0})下与编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列发生杂交的序列的互补序列的应用。
本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括本文讨论的那些序列的互补序列)杂交的核苷酸序列的应用。
本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括本文讨论的那些序列的互补序列)杂交的序列的互补核苷酸序列的应用。
本发明的范围还包括能够在中等至最高严谨性条件下与本文所讨论的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列的应用。
在优选的方面，本发明涵盖能够在严谨性条件(如50℃和0.2xSSC)下与本文所讨论的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的应用。
在更优选的方面，本发明涵盖能够在高严谨性条件(如65℃和0.1xSSC)下与本文所讨论的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的应用。
多肽的表达
可以将用于本发明的核苷酸序列或用于编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列引入重组的复制型载体中。载体可以用于在相容的宿主细胞中和/或从相容的宿主细胞复制并以多肽形式表达所述核苷酸序列。可以使用控制序列来控制表达，所述控制序列包括含启动子/增强子和其它表达调控信号。可以使用原核生物的启动子和在真核细胞中有功能的启动子。可以使用组织特异的或刺激特异性启动子。也可以使用包含来自上述两个或更多不同启动子的序列元件的嵌合启动子。
根据所用的序列和/或载体，通过由宿主重组细胞表达核苷酸序列而产生的多肽可以被分泌，或被包含在细胞内。编码序列经设计可以具有信号序列，该信号序列指导编码序列物质通过特定的原核生物或真核细胞膜分泌。
构建体
术语“构建体”，与术语如“缀合物”、“盒(cassette)”和“杂合体(hybrid)”同义，其包含依照本发明使用的编码具有本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列，且其直接或间接地与启动子连接。间接连接的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列之间提供适合的间隔子基团，如内含子序列，如Sh1内含子或ADH内含子。本发明中的相关术语“融合”也是如此，其包括直接或间接连接。在一些情况中，这些术语不涵盖编码所述蛋白的核苷酸序列与其通常连接的野生型基因启动子的天然组合(此时这两者均处于其天然环境中)。
所述构建体甚至可以包含或表达允许选择基因构建体的标记物。
对于一些应用，优选构建体至少包含本发明的核苷酸序列，或编码具有如本文定义的特定性质的多肽且可操作地与启动子连接的核苷酸序列。
生物
与本发明有关的术语“生物”包括可包含本发明的核苷酸序列或编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物的任何生物。
与本发明有关的术语“转基因生物”包括任何包含编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物的生物，和/或其中启动子能够允许编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列在所述生物内表达。优选核苷酸序列被引入到生物的基因组中。
术语“转基因生物”不涵盖在处于自身天然环境中并同时受到其同处于自身天然环境中的天然启动子控制的天然核苷酸编码序列。
因此，本发明的转基因生物包括包含以下任何一种或其组合的生物：编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列、本文定义的构建体、本文定义的载体、本文定义的质粒、本文定义的细胞或其产物。例如，所述转基因生物还可以包含编码具有如本文定义的特定性质的多肽且受到启动子控制的核苷酸序列，其中所述启动子原本并不与脂质酰基转移酶编码基因相连。
宿主细胞
可以通过在宿主生物中表达核苷酸序列而产生脂质酰基转移酶，其中所述宿主生物可以是原核或真核生物。
在本发明的一种实施方式中，本发明的脂质脂质酰基转移酶在宿主细胞，例如在细菌细胞，例如杆菌种，例如地衣芽孢杆菌宿主细胞中表达(如WO2008/090395中的教导，通过引用并入本文)。
可选择的宿主细胞可以是，例如真菌、酵母或植物。
宿主细胞/生物的转化
所述宿主生物可以是原核或真核生物。
合适的原核宿主的实例包括细菌，例如大肠杆菌和地衣芽孢杆菌，优选地衣芽孢杆菌。用编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列转化地衣芽孢杆菌在通过引用并入本文的WO2008/090395中有教导。
其它原核宿主的转化的教导在本领域中有详细的记载，例如参见Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，1989，ColdSpring Harbor Laboratory Press)。如果使用原核宿主，则在转化前需要适当地修饰核苷酸序列，例如去除内含子。
在另一种实施方式中，所述转基因生物可以为酵母。
可以利用本领域已知的多种方法转化丝状真菌细胞，例如包括原生质体形成和原生质体转化，然后以已知的方式重建细胞壁的方法。在EP 0 238023中公开了曲霉(Aspergillus)作为宿主微生物的应用。
另一种宿主生物可以为植物。用于转化植物的常用技术的概述可见于Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant MoI Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)。关于植物转化的其它教导可见于EP-A-0449375。
下文将参照以下附图和实施例，仅以举例的方式描述本发明。
附图说明
图1显示了突变的杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列，该突变体具有Asn80Asp突变(注意，第80位氨基酸位于成熟序列中)(SEQ ID No.16)；
图2显示了来自嗜水气单胞菌(ATCC#7965)的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.1)；
图3显示了来自第6版数据库的pfam00657共有序列(SEQ ID No.2)；
图4显示了从生物嗜水气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.3)(P10480；GI：121051)；
图5显示了从生物杀鲑气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.4)(AAG098404；GI：9964017)；
图6显示了从生物天蓝色链霉菌A3(2)获得的氨基酸序列(SEQ ID No.5)(Genbank登录号NP_631558)；
图7显示了从生物天蓝色链霉菌A3(2)获得的氨基酸序列(SEQ ID No.6)(Genbank登录号CAC42140)；
图8显示了从生物酿酒酵母获得的氨基酸序列(SEQ ID No.7)(Genbank登录号P41734)；
图9显示了从生物雷尔氏菌属获得的氨基酸序列(SEQ ID No.8)(Genbank登录号AL646052)；
图10显示了SEQ ID No.9。Scoel NCBI蛋白登录号CAB39707.1GI：4539178的保守的推定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图11显示了如SEQ ID No.10所示的氨基酸。Scoe2NCBI蛋白登录号CAC01477.1GI：9716139的保守的推定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图12显示了氨基酸序列(SEQ ID No.11)。Scoe3NCBI蛋白登录号CAB88833.1 GI：7635996的推定分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图13显示了氨基酸序列(SEQ ID No.12)。Scoe4NCBI蛋白登录号CAB89450.1 GI：7672261推定分泌蛋白。[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图14显示了氨基酸序列(SEQ ID No.13)。Scoe5NCBI蛋白登录号CAB62724.1 GI：6562793的推定脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图15显示了氨基酸序列(SEQ ID No.14)。Sriml NCBI蛋白登录号AAK84028.1 GI：15082088的GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌]；
图16显示了来自杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.Salmonicida)(ATCC#14174)的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.15)；
图17显示了SEQ ID No.19。Scoe1NCBI蛋白登录号CAB39707.1GI：4539178保守的推定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图18显示了用于对嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶基因突变的融合构建体的氨基酸序列(SEQ ID No.25)。带下划线的氨基酸是木聚糖酶信号肽；
图19显示了来自链霉菌属的脂质酰基转移酶的多肽序列(SEQ ID No.26)；
图20显示了来自嗜热裂孢菌的脂质酰基转移酶的多肽序列(SEQ IDNo.27)；
图21显示了来自嗜热裂孢菌的脂质酰基转移酶的多肽序列(SEQ IDNo.28)；
图22显示了来自Corynebacterium efficiens GDSx 300氨基酸的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.29)；
图23显示了来自Novosphingobium aromaticivorans GDSx 284氨基酸的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.30)；
图24显示了来自天蓝色链霉菌GDSx 269aa的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.31)；
图25显示了来自阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)\GDSx 269氨基酸的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.32)；
图26显示了来自链霉菌属的脂质酰基转移酶的多肽序列(SEQ ID No.33)；
图27显示了从生物嗜水气单胞菌(P10480；GI：121051)获得的氨基酸序列(SEQ ID No.34)(特别地，这是成熟序列)；
图28显示了突变杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列(SEQ ID No.35)(特别地，这是成熟序列)；
图29显示了来自Streptomyces thermosacchari的核苷酸序列(SEQ IDNo.36)；
图30显示了来自Streptomyces thermosacchari的氨基酸序列(SEQ IDNo.37)；
图31显示了来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)/GDSx 548氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID No.38)；
图32显示了来自褐色嗜热裂孢菌的核苷酸序列(SEQ ID No.39)；
图33显示了来自褐色嗜热裂孢菌/GDSx的氨基酸序列(SEQ ID No.40)；
图34显示了来自Corynebacterium efficiens/GDSx 300氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID No.41)；
图35显示了来自Corynebacterium efficiens的核苷酸序列(SEQ ID No.42)；
图36显示了来自天蓝色链霉菌/GDSx 268氨基酸的氨基酸序列(SEQID No.43)；
图37显示了来自天蓝色链霉菌的核苷酸序列(SEQ ID No.44)；
图38显示了来自阿维链霉菌(S.avermitilis)的氨基酸序列(SEQ ID No.45)；
图39显示了来自阿维链霉菌的核苷酸序列(SEQ ID No.46)；
图40显示了来自褐色嗜热裂孢菌/GDSx的氨基酸序列(SEQ ID No.47)；
图41显示了来自褐色嗜热裂孢菌/GDSx的核苷酸序列(SEQ ID No.48)；
图42显示了L131和来自阿维链霉菌和褐色嗜热裂孢菌的同源物的比对说明了GDSx基序(L131和阿维链霉菌和褐色嗜热裂孢菌中的GDSY)、GANDY盒(其为GGNDA或GGNDL)和HPT区(被认为是保守的催化组氨酸)的转化。这三个保守区被标出；
图43显示了来自近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的脂质酰基转移酶的氨基酸序列SEQ ID No 17；
图44显示了来自近平滑假丝酵母的脂质酰基转移酶的氨基酸序列SEQ ID No 18；
图45显示了包括信号序列的来自杀鲑气单胞菌的核苷酸序列(SEQ IDNo.49)(preLAT-第1-87位)；
图46显示了从生物嗜水气单胞菌获得的编码本发明的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.50)；
图47显示了从生物杀鲑气单胞菌获得的编码本发明的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.51)；
图48显示了从生物天蓝色链霉菌A3(2)获得的编码本发明的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.52)(Genbank登录号NC_003888.1：8327480..8328367)；
图49显示了从生物天蓝色链霉菌A3(2)获得的编码本发明的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.53)(Genbank登录号AL939131.1：265480..266367)；
图50显示了从生物酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)获得的编码本发明的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.54)(Genbank登录号Z75034)；
图51显示了从生物雷尔氏菌属获得的编码本发明的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.55)；
图52显示了编码NCBI蛋白登录号CAB39707.1 GI：4539178保守推定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]的SEQ ID No.56所示的核苷酸序列；
图53显示了编码Scoe2NCBI蛋白登录号CAB39707.1 GI：9716139保守推定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]的SEQ ID No.57所示的核苷酸序列；
图54显示了编码Scoe3NCBI蛋白登录号CAB88833.1 GI：7635996推定分泌蛋白的如SEQ ID No.58所示的核苷酸序列[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图55显示了编码Scoe4NCBI蛋白登录号CAB89450.1 GI：7672261推定分泌蛋白的如SEQ ID No.59所示的核苷酸序列[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图56显示了编码Scoe5NCBI蛋白登录号CAB62724.1 GI：6562793推定脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]的SEQ ID No.60所示的核苷酸序列；
图57显示了编码Srim1 NCBI蛋白登录号AAK84028.1GI：15082088 GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌]的如SEQ ID No.61所示的核苷酸序列；
图58显示了编码来自嗜水气单胞菌(ATCC#7965)的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.62)；
图59显示了编码来自杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.63)(ATCC#14174)；；
图60显示了编码包含木聚糖酶信号肽的来自嗜水气单胞菌的酶的核苷酸序列(SEQ ID No.24)；
图61显示了具有Asn80Asp突变的突变杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列(SEQ ID No.68)(特别地，氨基酸80在成熟序列中)并且在经历翻译后修饰后，SEQ ID No.68的氨基酸残基235和236在翻译后修饰后没有被共价连接。所形成的两个肽由一个或多个S-S桥键连接在一起。SEQ ID No.68的氨基酸236对应于本文SEQ ID No.16所示的氨基酸残基编号274。
图62显示了甾醇橡胶相反应产物的TLC分析。
图63显示了编码来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.69)；
图64显示了本文如SEQ ID No.16所示的具有Asn80Asp突变的突变杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列(特别地，氨基酸80在成熟序列中)，并且在经历如SEQ ID No.70的翻译后修饰后，SEQ IDNo.70的氨基酸残基235和236在翻译后修饰后没有共价连接；所形成的两个肽通过一个或多个S-S桥键连接在一起；SEQ ID No.70中的氨基酸236对应于本文所示SEQ ID No.16中的氨基酸残基编号275；
图65显示了本文如SEQ ID No.16所示的具有Asn80Asp突变的突变杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列(特别地，氨基酸80在成熟序列中)，并且在经历如SEQ ID No.71的翻译后修饰后，SEQ IDNo.71的氨基酸残基235和236在翻译后修饰后没有共价连接；所形成的两个肽通过一个或多个S-S桥键连接在一起；SEQ ID No.71中的氨基酸236对应于本文所示SEQ ID No.16中的氨基酸残基编号276；
图66显示了本文如SEQ ID No.16所示的具有Asn80Asp突变的突变杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列(特别地，氨基酸80在成熟序列中)，并且在经历如SEQ ID No.72的翻译后修饰后，SEQ IDNo.72的氨基酸残基235和236在翻译后修饰后没有共价连接；所形成的两个肽通过一个或多个S-S桥键连接在一起；SEQ ID No.72中的氨基酸236对应于本文所示SEQ ID No.16中的氨基酸残基编号277；
图67显示了在活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的带状示意图。利用Deep View Swiss-PDB viewer制作该图。
图68显示了使用Deep View Swiss-PDB viewer显示的活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的侧视图，活性位点甘油的
Figure BPA00001443891900831
以内的残基以黑色表示；
图69显示了使用Deep View Swiss-PDB viewer显示的活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的俯视图，活性位点甘油的
Figure BPA00001443891900832
以内的残基以黑色表示；
图70显示了比对1；
图71显示了比对2；
图72和73修饰了1IVN与P10480的比对(P10480是用于嗜水气单胞菌酶的数据库序列)，此比对从PFAM数据库获得并用在模型构建过程中；和
图74显示了其中P10480为嗜水气单胞菌数据库序列的比对。此序列用于模型构建和位点选择(注意，绘制出了完整的蛋白(SEQ ID No.25)，成熟蛋白(等同于SEQ ID No.34)起始于第19位残基。A.sal为杀鲑气单胞菌的GDSX脂肪酶(SEQ ID No.4)，A.hyd为嗜水气单胞菌的GDSX脂肪酶(SEQ ID No.34)；所列序列间的差异位置在共有序列中用*表示。
实施例1
已经发现了植物甾醇酯和植物甾烷醇酯在工业中的数个应用，包括在食品业中作为具有降低胆固醇作用的功能成分。
通过化学催化合成植物甾醇酯和植物甾烷醇酯非常复杂，其常常利用有机溶剂进行，并且常常需要数个纯化步骤以分离所形成的酯。
发明人发现，脂质酰基转移酶可以用作酶促催化剂用于由植物甾醇合成植物甾醇酯和由植物甾烷醇合成植物甾烷醇酯。
脂质供体是磷脂组合物。适合地，所述磷脂组合物可以是来自大豆油的水脱胶的橡胶相。优选地，植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯由反应组合物或混合物分离或纯化并且用作分离的植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯。然而，特别地，所述反应组合物或混合物通常不含有害组分(例如有机溶剂等)并且因此可以省略植物甾醇酯或植物甾烷醇酯的复杂纯化和/或分离的需要。
材料和方法
KLM3’-甘油磷脂胆固醇酰基转移酶(FoodPro LysoMaxOil)(KTP08015)——活性1300LATU/g(可获自Danisco A/S)；
来自巴西大豆的水脱胶的橡胶相(被称为来自Solae Aarhus的SYP)；
干燥橡胶相，在旋转蒸发仪上干燥的SYP；
植物甾醇—来自德国汉高的Generol 122N。
HPTLC分析
利用HPTLC分析植物甾醇和植物甾醇酯样本。
点样器：自动TLC取样器，CAMAG
HPTLC板：20x 10cm，Merck no.1.05641。使用前在160℃活化10分钟。
点样：
将橡胶和植物甾醇的0.2g反应混合物溶解在3ml己烷∶异丙烷(3∶2)；
将0.3μl或0.5μl或1μl样本点样在HPTLC板上；
将含0.1％油酸、0.1％胆固醇和0.1％胆固醇酯的标准溶液(第17号)点样(0.1、0.3、0.5、0.8和1.5μl)并用于反应混合物中植物甾醇和植物甾醇酯的计算。
TLC点样器
5号工作缓冲液：对乙醚∶甲基叔丁基酮∶乙酸(70∶30∶1)
洗脱：利用来自Camag的Automatic Developing Chamber ADC2洗脱7cm的板。
显色：
将平板在Camag TLC Plate Heater III于160℃干燥6分钟，冷却，并浸入含6％乙酸铜的16％H3PO4中。另外，在160℃干燥10分钟并直接评价。
通过Camag TLC Scanner 3分析在TLC板上的成分的密度。
试验：
利用表1中所示的配方进行植物甾醇酯的酶促合成。
表1.甾醇酯的合成用配方
Figure BPA00001443891900851
将各橡胶相和Generol 122N混合在一起。在样本1中，大部分植物甾醇溶解。在样本2中，植物甾醇仅部分溶解。加入酶(和水(如果加入水的话))，将样本在55℃温育并在1天和4天后将样本取出。4天后，样本1是没有植物甾醇的均质液体。样本2也是几乎均质的，但该样本不是液体。
样本1的反应混合物中的总水含量为约2.2％w/w水，并且样本2的反应混合物中的总水含量为约28.5％w/w水。
通过TLC分析样本并计算植物甾醇的转化，结果示于表2和图62。
表2：作为反应时间的函数的酯化植物甾醇百分数
Figure BPA00001443891900861
图62显示了植物甾醇橡胶相反应产物的TLC分析。
表2中的结果证明脂质酰基转移酶(例如KLM3’)在两个样本中均产生植物甾醇至植物甾醇酯的非常高的转化。在样本1中观察到＞90％的转化，并且产物呈现为是所有甾醇酯均溶解的均质液体产物。在样本2中也观察到植物甾醇至植物甾醇酯的良好转化。
通过酶用量的适当调整，可能具有甚至更高的转化和更短的温育时间。
可以利用任何常规的分离或纯化方法分离或纯化所述甾醇酯。然后可以将所述甾醇酯用在本领域已知的食物组合物或食品或个人护理品中。
在一些实施方式中，可以使用至100℃的热处理使酶失活，并可以在食品应用或个人护理品中直接使用甾醇酯磷脂样本用于甾醇的富集(即没有任何分离或纯化)。
结论：
试验已经表明可能通过由脂质酰基转移酶催化的酶促反应由植物甾醇和磷脂组合物(例如由油的水脱胶获得的橡胶相)产生植物甾醇酯。植物甾醇至植物甾醇酯的大于90％转化是可能的。
实施例2
Figure BPA00001443891900871
将来自水脱胶的橡胶相加热至55℃。在搅拌过程中加入分离自树木的植物甾烷醇。加入脂质酰基转移酶(KLM3’)并在搅拌下在55℃温育反应混合物。20小时后，将反应混合物加热至95℃以使酶失活，并且通过HPTLC分析样本的甾烷醇和甾烷醇酯。在1号和3号样本中，大于50％的甾烷醇被酯化并且在2号样本中没有形成甾烷醇酯。
以上说明书提到的全部出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所述方法和体系的各种改进和改变对本领域的技术人员来说都是显而易见的。尽管已参照具体优选实施方式描述了本发明，但是应该理解所主张的发明不仅限于所述具体实施方式。实际上，用于实施本发明的所述模式的各种修改对于生物化学和生物工程或相关领域的技术人员来说都是显而易见的，均应落入本发明权利要求书的范围。
布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
国际局表格
1当适用于细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位的资格被认定的日期。BP/4表(只此一页)
布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
国际局表格
Figure BPA00001443891900891
1指的是初始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于那些法规10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
BP/9表(第1页)
4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。
BP/9表(第2页且最后一页)
布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
国际局表格
Figure BPA00001443891900911
1当适用于细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位的资格被认定的日期。
BP/4表(只此一页)
布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
国际局表格
Figure BPA00001443891900921
1指的是初始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于那些法规10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
BP/9表(第1页)
Figure BPA00001443891900931
4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。
BP/9表(第2页且最后一页)
Figure IPA00001443891400011
Figure IPA00001443891400031
Figure IPA00001443891400041
Figure IPA00001443891400051
Figure IPA00001443891400091
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Figure IPA00001443891400901
Figure IPA00001443891400911
Figure IPA00001443891400921
Figure IPA00001443891400931
Figure IPA00001443891400941
Figure IPA00001443891400951
Figure IPA00001443891400961
Figure IPA00001443891400981
Figure IPA00001443891400991
Figure IPA00001443891401001
Figure IPA00001443891401011
Figure IPA00001443891401031
Figure IPA00001443891401041
Figure IPA00001443891401051
PCT/RO/134表
 申请人或申请单位的提交号P036169WO   国际申请号
关于微生物或其它生物材料保藏的说明
(PCT细则13之二)
Figure QPA00001443891300011
PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月再版)
 申请人或申请单位的提交号P036169WO   国际申请号
关于微生物或其它生物材料保藏的说明
(PCT细则13之二)
Figure QPA00001443891300021
PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月再版)

Claims (25)

1.一种生产植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的方法，其包括：
a)通过将含至少约10％至约70％植物磷脂的磷脂组合物、脂质酰基转移酶和植物甾醇和/或植物甾烷醇以及任选的水混合而制备反应组合物，其中所述反应组合物包含至少2％w/w水；和
b)分离或纯化至少一种植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯。
2.如权利要求1所述的方法，其中，以总反应混合物的至少5％的量加入所述植物甾醇和/或植物甾烷醇。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，将所述植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯与食品或食物组分混合。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中，将所述植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯与药物稀释剂、载体或赋形剂或化妆品稀释剂、载体或赋形剂混合。
5.脂质酰基转移酶在反应组合物中生产植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的用途，其中所述反应组合物包含：a)含至少约10％至约70％植物磷脂的磷脂组合物，b)至少约2％水和c)所加入的植物甾醇和/或植物甾烷醇。
6.如权利要求5所述的用途，其中，以所述反应组合物的至少5％的量加入所述植物甾醇和/或植物甾烷醇。
7.如权利要求1-4所述的方法或权利要求5-6所述的用途，其中，所述植物甾醇和/或植物甾烷醇包含一个或多个以下结构特征：
i)3-β-羟基或3-α羟基；和/或
ii)在顺式位置的A:B环或在反式位置的A:B环或者C5-C6是不饱和的。
8.如权利要求1-4或7所述的方法或权利要求5-6或7所述的用途，其中，所述植物甾醇是选自由以下组成的组中的一种或多种：α-谷甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇、麦角固醇、油菜甾醇、5，6-二氢固醇、菜子固醇、α-菠菜甾醇、β-菠菜甾醇、γ-菠菜甾醇、δ-菠菜甾醇、岩藻甾醇、dimosterol、子囊甾醇、serebisterol、表甾醇、anasterol、α-苯基丁酰胺、菠菜甾醇、链甾醇、海绵甾醇、多孔甾醇、γ-谷甾醇、固醇糖苷和其它天然或合成的同分异构形式和衍生物。
9.如权利要求1-4或7-8所述的方法或权利要求5-6或7-8所述的用途，其中，还产生了溶血磷脂。
10.如权利要求9所述的方法或用途，其中，所述溶血磷脂是纯化的或分离的。
11.如权利要求1-4或7-10任一项所述的方法或权利要求4-5或6-9任一项所述的用途，其中，所述脂质酰基转移酶包含GDSX基序和/或GANDY基序。
12.如权利要求1-4或7-11任一项所述的方法或权利要求5-6或7-11任一项所述的用途，其中，所述脂质酰基转移酶的特征在于，其是具有酰基转移酶活性并且其包含氨基酸序列基序GDSX的酶，其中X是以下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一个或多个。
13.如权利要求1-4或7-12任一项所述的方法或权利要求5-6或7-12任一项所述的用途，其中，当利用“％酰基转移酶活性测定方法”测定时，所述脂质酰基转移酶具有至少15％的转移酶活性。
14.如权利要求1-4或7-13任一项所述的方法或权利要求5-6或7-13任一项所述的用途，其中，所述脂质酰基转移酶是可以通过在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中表达核苷酸序列而获得的多肽。
15.如权利要求1-4或7-14任一项所述的方法或权利要求5-6或7-14任一项所述的用途，其中，所述磷脂组合物是通过食用油或粗食用油的脱胶(例如化学脱胶、酶促脱胶、整体脱胶、高级脱胶、水脱胶或这些操作的两种或更多种的组合)获得的橡胶相。
16.如权利要求1-4或7-15任一项所述的方法或权利要求5-6或7-15任一项所述的用途，其中，所述磷脂组合物是通过利用酸和/或碱(例如氢氧化钠)处理粗食用油或食用油并分离皂料部分而获得的皂料。
17.如权利要求15或16所述的方法或用途，其中，在将所述橡胶相或所述皂料与所述脂质酰基转移酶和植物甾醇和/或植物甾烷醇以及任选的水混合前，将所述橡胶相或所述皂料纯化、或干燥、或溶剂分离、或者这些操作的两种或更多种的组合。
18.一种组合物，其包含通过权利要求1-4或7-17任一项所述的方法或权利要求5-6或7-17任一项所述的用途获得的植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯。
19.一种食品，其包含通过权利要求1-4或7-17任一项所述的方法或权利要求5-6或7-17任一项所述的用途获得的植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯。
20.一种个人护理品(例如化妆品)组合物，其包含通过权利要求1-4或7-17任一项所述的方法或权利要求5-6或7-17任一项所述的用途获得的植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯和任选的化妆品稀释剂、赋形剂或载体。
21.一种生产包含植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的食品的方法，其中，所述方法包括加入权利要求18所述的组合物至食品和/或食物材料中的步骤。
22.一种生产包含植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的个人护理品(例如化妆品)的方法，其中，所述方法包括加入权利要求18所述的组合物至进一步的个人护理品(例如化妆品)组分中的步骤。
23.参考实施例和附图基本如上文所述的方法。
24.参考实施例和附图基本如上文所述的用途。
25.参考实施例和附图基本如上文所述的组合物。
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