WO2014007120A1 - アデノ随伴ウイルスベクターの産生細胞 - Google Patents

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扶有子 高島
榎　竜嗣
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    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to a cell that produces an adeno-associated virus vector particularly useful for gene transfer into humans at high titers in gene therapy research or clinical fields.
  • Adeno-associated virus is a linear single-stranded DNA virus that can infect a wide variety of cells, including humans, and infects non-dividing cells such as blood cells, muscles, and nerve cells that have completed differentiation.
  • AAV Adeno-associated virus
  • AAV vectors for gene transfer virus is isolated from the elements essential for virus particle formation on the wild-type AAV genome in the same manner as other viral vectors by separating those that require cis supply and those that can be supplied in trans.
  • a method for preventing wild-type AAV production and self-sustained replication at the infection destination of an AAV vector by introducing and expressing in production cells Patent Document 1.
  • Conventional AAV vector production methods include 1) introduction of an AAV vector plasmid excluding rep and cap genes, leaving ITRs at both ends of the wild type AAV genome, and 2) supplying Rep and Cap proteins to trans.
  • AAV requires the supply of accessory elements from any of adenoviruses, herpesviruses, vaccinia viruses, etc., called helper viruses, for its infectious viral particle formation 3)
  • a method using adenovirus infection has been established (Patent Document 2).
  • the AAV vector obtained by the above method is theoretically contaminated with adenovirus. This requires removal and inactivation of contaminating adenovirus, which causes a reduction in AAV vector titer.
  • helper-free system using 3 ′) introduction of a helper plasmid that expresses only the elements essential for AAV virus particle formation among adenovirus-derived elements was developed instead of 3) above (patent) Reference 3). According to this method, since no adenovirus is mixed into the produced AAV vector, safety is excellent.
  • AAV vectors intended for use in gene therapy research or clinical fields it is necessary to obtain a high-titer viral vector solution, which is derived from human-derived HeLa cells and A549 cells.
  • a constitutive expression strain of rep and cap genes is prepared, and a device for adjusting the expression level of the gene has been devised.
  • the titer of the obtained AAV vector is not sufficient, and a method for producing a higher titer AAV vector is required.
  • An object of the present invention is to provide a cell for obtaining a high-titer AAV vector solution without complicated operations, and an AAV vector production method and kit using the cell.
  • the present invention provides [1] a cell capable of producing an AAV vector and expressing an artificially introduced miRNA, [2] The cell according to [1], wherein the artificially introduced miRNA is at least one selected from the group consisting of hsa-miR-196a1, hsa-miR-324, hsa-miR-342, [3] An AAV vector-producing cell in which a nucleic acid encapsulated in a virus is introduced into the cell according to [1] or [2], [4] A method for producing an AAV vector comprising the step of culturing the cell according to [3], [5] A kit for producing an AAV vector comprising a nucleic acid that supplies miRNA and a nucleic acid that supplies elements essential for virus particle formation of the AAV vector, [6] AAV vector obtained using the method according to [4], [7] A method for selecting miRNA that can improve the AAV vector production ability of an AAV vector-producing cell by expressing it in an AAV vector-
  • the present invention provides a cell having an ability to produce an AAV vector. By using the cells, it is possible to produce an AAV vector having a higher titer than the conventional one without complicated operations. Furthermore, a method and kit for producing an AAV vector using the cells are provided.
  • a cell capable of producing the AAV vector of the present invention (hereinafter referred to as the cell of the present invention) is a cell that expresses elements necessary for AAV vector production and artificially introduced miRNA.
  • the AAV vector-producing cell of the present invention is a cell in which a nucleic acid encapsulated in a virus particle is introduced into the cell of the present invention.
  • the cell used as a material is not particularly limited.
  • the cells include mammalian cells such as humans, monkeys, and rodents, preferably 293 cells (ATCC CRL-1573) and 293T cells (ATCC) that have high transformation efficiency and constitutively express the adenovirus E1 gene. CRL-11268), 293F cells, 293FT cells (all manufactured by Life Technologies), G3T-hi cells (WO 06/035829 pamphlet), commercially available cell lines for AAV vector production, AAV293 cells (manufactured by Stratagene) Is exemplified.
  • cells modified to transiently or constitutively express some of the proteins required for AAV vector production can be used.
  • Examples of elements necessary for the production of the AAV vector include (A) AAV-derived Rep protein, Cap protein, and (B) adenovirus-derived elements such as E1a, E1b, E2, E4, and VARNA genes.
  • AAV-derived Rep protein AAV-derived Rep protein
  • Cap protein adenovirus-derived elements
  • adenovirus-derived elements such as E1a, E1b, E2, E4, and VARNA genes.
  • nucleic acids for supplying the cells essential for virus particle formation of the AAV vector to the cells of the present invention (a) a nucleic acid encoding a Rep protein, a nucleic acid encoding a Cap protein, and (b) a nucleic acid encoding an adenovirus-derived element. Illustrated.
  • nucleic acid can be introduced into a cell by mounting it on a plasmid or virus vector as one or a plurality of nucleic acid constructs that can supply each element in the cell to be used.
  • plasmids pAAV-RC1 plasmid and pHelper plasmid manufactured by Cell Biolabs
  • the nucleic acid encoding the Cap protein encodes Assembly-Activating Protein (AAP) necessary for the formation of AAV particles in a different reading frame from that encoding the Cap protein [Procedure of the National Academy of Sciences of USA (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • nucleic acid encoding a Cap protein refers to a nucleic acid that also encodes AAP.
  • a nucleic acid encoding AAP may be further introduced into the cell of the present invention.
  • the nucleic acids encoding the E1a and E1b proteins are inserted into the genome and constitutively expressed in 293 cells and the like as described above, and therefore do not need to be separately introduced. Nucleic acids encoding E1a and E1b proteins may be introduced if necessary depending on the cells used.
  • Examples of the method for introducing a nucleic acid construct include a transient or permanent introduction method.
  • the method of transient introduction is not particularly limited, and a known transient introduction method such as calcium phosphate method, lipofection method, DEAE dextran method, polyethyleneimine method, electroporation method and the like can be used.
  • Commercially available reagents such as TransIT (registered trademark) -293 Reagent, TransIT (registered trademark) -2020 (manufactured by Mirus), Lipofectamine 2000 Reagent, Lipofectamine 2000 CD Reagent (manufactured by Life Technologies), FuGene (registered trademark) Transfect Reagent (manufactured by Promega) may be used.
  • the method for constitutive introduction of nucleic acid into a cell there is no particular limitation on the method for constitutive introduction of nucleic acid into a cell, and the constitutive introduction method known in the art, for example, a method using a retrovirus vector or a method for transient introduction of a plasmid, is introduced and integrated into a chromosome.
  • a method for selecting the selected cells can be used.
  • a commercially available reagent for example, Retrovirus Constructive System (manufactured by Takara Bio Inc.) may be used.
  • miRNA capable of improving the AAV vector production ability of the AAV vector producing cell by being expressed in the AAV vector producing cell is preferably exemplified.
  • the selection method of the present invention comprises the steps of preparing a library (mixture) of AAV vectors that express different miRNAs (eg, human miRNAs) in cells and selecting AAV vectors that are highly produced in the cells from the library. .
  • a nucleic acid construct in which a nucleic acid encoding a miRNA library is linked to a nucleic acid encapsulated in a virus particle is prepared, and a known method is applied to the nucleic acid construct to mount the miRNA library.
  • a method for obtaining an AAV vector is exemplified.
  • a commercially available AAV vector plasmid, pAAV-MCS Expression Vector (manufactured by Cell Biolabs) or the like can be used.
  • cells suitable for the production of AAV vector-producing cells for example, AAV293 cells
  • AAV293 cells are infected with the AAV vector loaded with the miRNA library.
  • a nucleic acid construct encoding an element necessary for AAV vector production is transiently introduced into the cells and cultured, and an AAV vector mixture produced by the cells is obtained.
  • the above-described steps infection, culture, vector acquisition) are performed for one cycle or more.
  • the AAV vector carrying the nucleic acid expressing miRNA that improves AAV vector production is concentrated in the AAV vector mixture.
  • the base sequence of the loaded miRNA is decoded.
  • MiRNAs that are obtained by repeating the above cycle are identified, and these are regarded as miRNAs that improve AAV vector production.
  • the miRNA thus selected can be suitably used as a miRNA in the cell of the present invention, and examples thereof include hsa-miR-196a1, hsa-miR-324, and hsa-miR-342.
  • RNAs constituting the hsa-miR-196a1, hsa-miR-324 and hsa-miR-342 are known, and the DNA sequences encoding them are registered as NCBI GENE ID: 406972, 442898, 442909. Yes.
  • the miRNA expression plasmid vector carrying the sequence is commercially available and is available from Takara Bio Inc.
  • the cell of the present invention is prepared by artificially introducing a nucleic acid expressing miRNA as described above.
  • a nucleic acid expressing miRNA there are no particular limitations on the method of artificial introduction, and for example, it may be introduced transiently or permanently in the form of a nucleic acid construct such as a plasmid.
  • a nucleic acid construct such as a plasmid.
  • mounting on the nucleic acid construct and it may be mounted alone or on the same nucleic acid construct as the nucleic acid that supplies the elements necessary for AAV vector production or the nucleic acid encapsulated in the virus particle. good.
  • the nucleic acid encapsulated in the virus particle is introduced into a cell having the ability to produce the AAV vector of the present invention, thereby producing the AAV vector-producing cell of the present invention.
  • An AAV vector-producing cell thus produced is also one aspect of the present invention.
  • the nucleic acid encapsulated in the virus particle is composed of an AAV-derived ITR sequence and a nucleic acid that is desired to be mounted on an AAV vector.
  • the nucleic acid desired to be mounted on the AAV vector includes any foreign gene such as a polypeptide (enzyme, growth factor, cytokine, receptor, structural protein, etc.), antisense RNA, ribozyme, decoy, and RNA interference. Examples include nucleic acids encoding RNA and the like.
  • an appropriate promoter, enhancer, terminator or other transcription regulatory element may be inserted into the nucleic acid.
  • the nucleic acid encapsulated in the viral particle can be introduced into the cell in the form of a plasmid.
  • the plasmid can be constructed using, for example, a commercially available AAV vector plasmid, pAAV-MCS Expression vector (manufactured by Cell Biolabs).
  • Production of the AAV vector of the present invention is carried out by culturing AAV vector-producing cells obtained by a method comprising a step of transiently or permanently introducing nucleic acids encapsulated in virus particles into the cells of the present invention. Is done.
  • the method for transiently or permanently introducing the nucleic acid There is no particular limitation on the method for transiently or permanently introducing the nucleic acid.
  • the above-described known transient or permanent introduction method described above may be used as the method for introducing the nucleic acid construct.
  • the nucleic acid expressing miRNA is preferably introduced alone or transiently by mounting it on the same expression plasmid as the nucleic acid encoding Rep protein and / or Cap protein. Demonstrate.
  • AAV vector-producing cells can be cultured under known culture conditions.
  • the culture is performed at a temperature of 30 to 37 ° C., a humidity of 95%, and a CO 2 concentration of 5 to 10%, but the present invention is not limited to such conditions.
  • the desired cell growth and AAV vector production it may be carried out at a temperature, humidity, and CO 2 concentration other than the above ranges.
  • the culture medium is not particularly limited as long as the AAV vector-producing cells of the present invention are cultured and AAV vector production is achieved.
  • a known medium or a serum-free medium such as DMEM, IMDM, Ham F12, RPMI- 1640 or the like may be used, and these can be obtained as commercial products from Lonza, Life Technologies, Sigma-Aldrich. You may add fetal bovine serum (FBS), human serum-derived albumin, etc. to a culture medium.
  • FBS fetal bovine serum
  • human serum-derived albumin etc.
  • the culture period is not particularly limited, and is preferably 12 to 72 hours, preferably 48 to 72 hours.
  • the AAV vector solution can be obtained from the supernatant of the culture supernatant or the collected cells resuspended in an appropriate buffer and crushed (cell lysate).
  • the thus obtained culture supernatant or centrifugal supernatant is used as it is, or further, for example, by filtration, or concentrated or purified by a known method to obtain an AAV vector solution. Until it is used for the desired application.
  • the AAV vector produced using the AAV vector-producing cell of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include an existing serotype or a recombinant AAV vector derived from wild-type AAV newly obtained from nature.
  • a recombinant AAV vector based on the serotype of AAV to be used can be prepared by selecting an appropriate material for producing the cell of the present invention, for example, a nucleic acid encoding a Rep protein or a nucleic acid encoding a Cap protein. it can.
  • an appropriate material for producing the cell of the present invention for example, a nucleic acid encoding a Rep protein or a nucleic acid encoding a Cap protein. it can.
  • deleting the nucleic acid encoding the Rep protein from the nucleic acid encapsulated in the virus particle insertion of DNA encapsulated in the virus particle into the target cell genome was prevented, and the insertion region of any foreign gene was increased.
  • AAV vectors are also exemplified.
  • the degree of AAV vector production is indicated using the titer of the AAV vector.
  • the titer of the AAV vector is a) the number of genomes obtained from normally formed AAV vector particles (genome titer) in a certain amount of sample, or b) the cells of the AAV vector measured experimentally. Of infectivity (infectious titer) and is clearly indicated as necessary.
  • Examples of the method for measuring the genome titer include a method of assaying the number of copies of the viral genome in the AAV vector-containing sample in which nucleic acid impurities have been degraded by nucleolytic enzyme treatment and subsequent protease treatment.
  • the as a method for measuring the infectious titer for example, a serial dilution of an AAV vector-containing sample is infected with an appropriate target cell, expression of a transgene, detection of cell shape change (cytopathy), provirus introduced into a cell
  • An example is a method of measuring the copy number.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition containing an AAV vector obtained using the AAV vector-producing cells of the present invention as an active ingredient.
  • the said pharmaceutical composition can be suitably prepared according to the manufacturing technique of the AAV vector formulation for gene therapy.
  • an AAV vector obtained by concentrating and purifying an AAV vector obtained by the production method of the present invention by a known method can be used as a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition can be used ex vivo on patient-derived cells or can be administered directly to the patient. Therefore, the present invention also provides a therapeutic method comprising administering a pharmaceutical composition containing an AAV vector obtained using the AAV vector-producing cells of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides the use of an AAV vector obtained using the AAV vector-producing cell of the present invention in the manufacture of a medicament.
  • the present invention also provides an AAV vector obtained using the AAV vector-producing cell of the present invention for use in therapy.
  • a nucleic acid that expresses miRNA used for the production of the cell of the present invention and a nucleic acid that supplies essential elements for virus particle formation of AAV vector (nucleic acid encoding Rep protein, nucleic acid encoding Cap protein, adenovirus-derived protein)
  • AAV vector nucleic acid encoding Rep protein, nucleic acid encoding Cap protein, adenovirus-derived protein
  • the above-mentioned nucleic acids can be contained in the kit as a nucleic acid construct capable of supplying a desired RNA or protein in the cell, respectively, or in an appropriate combination.
  • the kit may further contain a vector for preparing a nucleic acid encapsulated in a virus particle and appropriate cells.
  • the vector fragment and the insert fragment were ligated using DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix> (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • E. coli HST08 Premium Competent Cells manufactured by Takara Bio Inc., hereinafter referred to as E. coli
  • E. coli E. coli
  • the plasmid DNA extracted from the obtained transformant the one inserted from the upstream in the order of CMV promoter, AsRed2 coding region, multicloning site (MCS), and polyA signal was selected as pAAV-AsRed2 Vector.
  • the pAAV-AsRed2 Vector was treated with BglII (Takara Bio) and HindIII (Takara Bio).
  • a human miRNA library (manufactured by Takara Bio Inc.) cloned into pBApo-CMV DNA was treated with BamHI (manufactured by Takara Bio Inc.) and Hind III, and the resulting miRNA coding region fragment was DNA ligation kit (Takara Bio Inc.).
  • BamHI manufactured by Takara Bio Inc.
  • Hind III DNA ligation kit
  • miRNA having an internal BamHI or HindIII recognition site was ligated to pAAV-AsRed2 Vector by directional cloning using In-Fusion (registered trademark) Advantage PCR cloning kit (Clontech).
  • In-Fusion registered trademark
  • Advantage PCR cloning kit Advantage PCR cloning kit
  • Example 2 Production of AAV-miRNA Library Vector (1) Seeding of AAV293 cells AAV293 cells (Stratagene) were used in DMEM (Sigma Aldrich) containing 10% FBS (Thermo Scientific) and 2 mM sodium L-glutamate. And suspended at 2.5 ⁇ 10 5 cells / mL. 4 mL of this suspension was added to a 60 mm dish for cell culture (manufactured by IWAKI), and cultured overnight in a 37 ° C. incubator (hereinafter, 37 ° C. CO 2 incubator) in the presence of 5% CO 2 .
  • DMEM Sigma Aldrich
  • FBS Thermo Scientific
  • 2 mM sodium L-glutamate 2 mM sodium L-glutamate
  • Example 2 (2) Introduction of plasmid into AAV293 cells 4 ⁇ g each of the pAAV2-AsRed2-miRNA library plasmid obtained in Example 1 and pHelper plasmid and pAAV-RC1 plasmid (both manufactured by Cell Biolabs) were used, and the calcium phosphate method was used.
  • the AAV293 cells of Example 2- (1) were transfected. After 6 hours, the medium was completely removed, 4 mL of DMEM containing 2% FBS and 2 mM sodium L-glutamate was added, and the cells were further cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 48 hours.
  • AAV-miRNA library vector The medium was removed from the AAV293 cells cultured in Example 2- (2), and 1 mL of PBS (Nacalai Tesque) was added. AAV293 cells were collected in a 1.5 mL tube by pipetting, centrifuged at 4 ° C., 700 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was removed. After resuspending AAV293 cells in 0.1 mL of PBS, the AAV-miRNA library was repeated 3 times with ethanol / dry ice for 2 minutes, with a 37 ° C water bath for 2 minutes, and with a vortex mixer for 1 minute. The cell lysate containing the vector was collected. The cell lysate was centrifuged at 10,000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected to obtain an AAV-miRNA library vector solution.
  • PBS Nacalai Tesque
  • Example 3 Genomic titration of AAV vector
  • DNase treatment 2 ⁇ L of AAV-miRNA library vector solution, 2 ⁇ L of 10 ⁇ DNaseI buffer, 15.2 ⁇ L of water for injection (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.), DNaseI (manufactured by Takara Bio Inc.)
  • a reaction solution to which 8 ⁇ L was added was prepared.
  • TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (registered trademark) Standard manufactured by Takara Bio Inc.
  • heat treatment was performed at 99 ° C. for 10 minutes in order to inactivate DNase I, and then stored at 4 ° C. or ⁇ 20 ° C. until the treatment of Example 3- (2).
  • Real-time PCR reaction was performed using Thermal Cycler Dice (registered trademark) Real Time System Single (manufactured by Takara Bio Inc.) under the conditions recommended by the apparatus. Thereafter, the AAV vector genome was quantified according to the instructions attached to the device, and the genome titer was expressed as the number of AAV vector genomes per one AAV vector-producing cell (virtual genome / cell, hereinafter referred to as VG / cell).
  • Example 4 Screening of AAV-miRNA Library (1) Seeding of AAV293 cells AAV293 cells AAV293 cells were suspended in DMEM containing 10% FBS and 2 mM sodium L-glutamate at 2.5 ⁇ 10 5 cells / mL. 4 mL of this suspension was added to a 60 mm dish for cell culture and cultured overnight in a 37 ° C. CO 2 incubator.
  • Example 4 (2) Infection of AAV-miRNA library vector to AAV293 cells After completely removing the medium from the AAV293 cells cultured in Example 4- (1), the AAV-miRNA library vector solution prepared in Example 2 was used. 2 mL of diluted DMEM containing 2% FBS was added so that the moi (multiplicity of infection) was about 850 in terms of genome titer, and the cells were cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 2 hours. Thereafter, 2 mL of DMEM containing 2% FBS was added and cultured overnight in a CO 2 incubator at 37 ° C.
  • AAV-miRNA library vector The medium was removed from the AAV293 cells cultured in Example 4- (3), and 1 mL of PBS was added. AAV293 cells were collected in a 1.5 mL tube by pipetting, centrifuged at 4 ° C., 700 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was removed. After resuspending the cells in 0.1 mL of PBS, repeat the treatment for 3 minutes with ethanol / dry ice for 2 minutes, with a 37 ° C water bath for 2 minutes, and with a vortex mixer for 1 minute to obtain an AAV-miRNA library vector. The cell lysate containing was collected. The cell lysate was centrifuged at 10,000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected to obtain an AAV-miRNA library vector solution.
  • Example 5 Selection of miRNA to improve AAV vector production (1) Preparation of AAV-miRNA vector genome Example 3- (1) using 2 ⁇ L of the AAV-miRNA library vector solution collected in each round of Example 4. AAV-miRNA library vector genome solution was obtained by the same method as in (2).
  • Example 6 Evaluation of Acquired miRNA (1) Preparation of miRNA Expression Plasmid hsa-miR-196a1, hsa-miR-324, hsa-miR-342 were inserted from the human miRNA library cloned into pBApo-CMV DNA. Plasmids were selected, and each was used to transform E. coli. Nucleobond Xtra Midi EF (manufactured by Mach liner gel) was used for plasmid preparation. The obtained plasmids were named pBapo-miR196a1, pBapo-miR324, and pBapo-miR342, respectively.
  • Example 6- (1) Production of AAV vector
  • the plasmid obtained in Example 6- (1) was transfected into AAV293 cells simultaneously with pAAV-AsRed2-C1 vector, pAAV-RC1 plasmid, and pHelper plasmid.
  • a group transfected with pBApo-CMV instead of the plasmid obtained in Example 6- (1) was also set.
  • the operations up to transfection and AAV vector recovery were performed in the same manner as in Example 2- (1) to (3).
  • Example 7 Evaluation of pRC-miR342 Plasmid (1) Preparation of pRC-miR342 Plasmid Using pBApo-miR342 as a template, primers described in SEQ ID NO: 5 (Forward primer 3) and SEQ ID NO: 6 (Reverse primer 3) were used. A region including the CMV promoter to the miR342 coding region was amplified by the PCR method used. The obtained fragment was ligated to pAAV-RC1 plasmid treated with SnaBI (manufactured by Takara Bio Inc.) using In-Fusion (registered trademark) Advantage PCR cloning kit. After decoding the base sequence of the obtained recombinant plasmid and confirming that the CMV-miR342 fragment was inserted, a plasmid was prepared. The obtained plasmid was designated as pRC-miR342.
  • Example 7- (1) Evaluation of pRC-miR342 pRC-miR342 obtained in Example 7- (1) was transfected into AAV293 simultaneously with pAAV-AsRed2 vector and pHeler plasmid. As a control, a group transfected with pAAV-RC1 plasmid instead of pRC-miR342 was also set.
  • the AAV vector-producing cells thus obtained were named 293-RC-miR342 cells and 293-RC cells. The transfection method and the operation up to the recovery of the AAV vector were performed in the same manner as in Example 2- (1) to (3).
  • Example 8 Evaluation of the obtained AAV vector (1) Inoculation of target cells AAV293 cells were suspended in DMEM containing 10% FBS, 2 mM sodium L-glutamate at 4 ⁇ 10 4 cells / mL. 1 mL of this suspension was added to a 24-well plate for cell culture (manufactured by Corning) and cultured overnight in a CO 2 incubator at 37 ° C.
  • Example 8- (1) Virus infection After removing the medium from the AAV293 cells of Example 8- (1), 500 ⁇ L of DMEM containing 10% FBS and 2 mM sodium L-glutamate was added, and obtained in Example 7- (2). 1 ⁇ L of AAV vector solution was added. After culturing in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 6 hours, the medium was removed, 500 ⁇ L of DMEM containing 10% FBS and 2 mM sodium L-glutamate was added, and cultured overnight.
  • Example 8- (2) Flow cytometer analysis and calculation of infectious titer
  • the medium was removed from the AAV293 cells cultured in Example 8- (2), and 500 ⁇ L of PBS was added. After trypsin treatment, 500 ⁇ L of medium was added, and AAV293 cells were collected in a 1.5 mL tube by pipetting.
  • the AsRed2 positive rate of the obtained cell suspension was measured with a flow cytometer Cytoics FC500 (manufactured by Beckman Coulter). Based on the obtained value, the infectious titer was calculated and indicated by the number of infectious AAV vectors per mL of AAV vector solution (Infectious viral particles / mL, hereinafter referred to as ivp / mL). The results are shown in Table 5.
  • the AAV vector produced using pRC-miR342 has not only a genome titer but also a high infectious titer. Since pRC-miR342 was introduced into AAV vector-producing cells, It was revealed that the ability to produce infectious AAV vectors was improved.
  • Example 9 Evaluation of pRC6-miR342 and pRC9-miR342 plasmids (1) Preparation of pRC-miRNA plasmid pAAV-RC1 was treated with SmiI and SnaBI, and the same site of the cap gene of type 9 AAV was ligated after artificial synthesis. PRC9 was constructed. A fragment containing the CMV promoter to miR342 coding region amplified in Example 7- (1) was ligated to pRC9 treated with SnaBI by the same method as in Example 7- (1) to obtain pRC9-miR342.
  • pRC9-miR342 is a helper plasmid containing the type 9 AAV Cap gene and the CMV-miR342 fragment.
  • pBapo-miR342 as a template, a region including the region from the CMV promoter to the miR342 coding region by PCR using the primers described in SEQ ID NO: 7 (Forward primer 4) and SEQ ID NO: 8 (Reverse primer 4) in the sequence listing Amplified separately.
  • This fragment was ligated to pRep-Cap AAV6 plasmid (Applied Viromics) treated with SmaI (Takara Bio) using In-Fusion® Advantage PCR cloning kit to obtain pRC6-miR342.
  • pRC6-miR342 is a helper plasmid containing the type 6 AAV Cap gene and the CMV-miR342 fragment.
  • Example 9- (1) Evaluation of pRC-miRNA
  • the plasmid or control plasmid obtained in Example 9- (1) was transfected into AAV293 at the same time as pAAV-AsRed2 and pHeler plasmid.
  • the transfection method and the operation up to the recovery of the AAV vector were performed in the same manner as in Example 2- (1) to (3).
  • an AAV vector having a higher titer than conventional can be produced.
  • the AAV vector produced using the cells of the present invention and a composition comprising the AAV vector as an active ingredient are very useful as gene transfer methods in gene therapy research or clinical fields.
  • SEQ ID NO: 1 Forward primer 1 SEQ ID NO: 2: Reverse primer 1 SEQ ID NO: 3: Forward primer 2 SEQ ID NO: 4: Reverse primer 2 SEQ ID NO: 5: Forward primer 3 SEQ ID NO: 6: Reverse primer 3 SEQ ID NO: 7: Forward primer 4 SEQ ID NO: 8: Reverse primer 4

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Description

アデノ随伴ウイルスベクターの産生細胞
　本発明は、遺伝子治療の研究又は臨床の分野において、ヒトへの遺伝子導入に特に有用なアデノ随伴ウイルスベクターを高力価で産生する細胞に関する。
　現在、先天性遺伝子疾患の治療のほか、癌や感染症の治療を目的としてウイルスベクターを用いた遺伝子治療が多数試みられている。ウイルスベクターとしては、従来、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターが多く用いられている。
　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は線状１本鎖ＤＮＡウイルスで、ヒトを含む広範な種の細胞に感染可能であり、血球、筋、神経細胞など分化を終えた非分裂細胞にも感染する。また、ヒトに対する病原性がないため副作用の心配が低いこと、ウイルス粒子が安定であることなどから近年遺伝子導入用のベクターとして開発が進んできた。
　遺伝子導入用のＡＡＶベクターの製造には他のウイルスベクターと同様、野生型ＡＡＶゲノム上にあるウイルス粒子形成に必須な要素のうち、シス供給を要するものとトランス供給可能なものを分離してウイルス産生用の細胞に導入し、発現させることで、野生型ＡＡＶ産生とＡＡＶベクターの感染先での自立複製を防ぐ方法がとられる（特許文献１）。
　従来のＡＡＶベクターの製造方法としては、１）野生型ＡＡＶゲノムの両端のＩＴＲを残して、ｒｅｐ、ｃａｐ遺伝子を除いたＡＡＶベクタープラスミドの導入、２）Ｒｅｐ、Ｃａｐタンパク質をトランスに供給するためのｒｅｐ、ｃａｐ遺伝子発現プラスミドの導入、加えてＡＡＶはその感染性ウイルス粒子形成にヘルパーウイルスと呼ばれる、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルスなどのいずれかからの補助要素の供給を要するため、３）アデノウイルス感染、を用いる方法が確立している（特許文献２）。
　しかし上記方法によって得られるＡＡＶベクターは、理論上アデノウイルスが混入する。このことは、混入アデノウイルスの除去・不活性化の作業を要するため、ＡＡＶベクター力価の低減の要因となる。更に、ヒトに投与した場合にアデノウイルス感染症、炎症などの副作用の発生の懸念が残る。そこで、上記３）に代わって３’）アデノウイルス由来要素のうち、ＡＡＶウイルス粒子形成に必須な要素のみを発現するヘルパープラスミドの導入、を用いる製造方法（ヘルパーフリー系）が開発された（特許文献３）。この方法によれば、製造されたＡＡＶベクターへのアデノウイルスの混入がないため、安全性に優れる。
　一方、遺伝子治療の研究又は臨床の分野に使用することを目的としたＡＡＶベクターの製造では、高力価のウイルスベクター液の取得が必要とされており、ヒト由来ＨｅＬａ細胞やＡ５４９細胞をもとにｒｅｐ、ｃａｐ遺伝子の恒常発現株を作製して、当該遺伝子の発現量を調節する工夫などが行われている。しかし、得られるＡＡＶベクターの力価は充分でなく、更に高力価のＡＡＶベクターの製造方法が求められている。
米国特許第６０９３５７０号明細書 国際公開第９７／０６２７２号パンフレット 国際公開第９７／１７４５８号パンフレット
　本発明の目的は、煩雑な操作なく高力価のＡＡＶベクター液を得るための細胞、及び当該細胞を用いたＡＡＶベクター製造方法、キットを提供することにある。
　上述のとおり、遺伝子治療の研究又は臨床に使用することを目的としたＡＡＶベクターの製造においては、より高力価なＡＡＶベクターの製造が可能となる方法が求められている。本発明者らは鋭意研究の結果、人為的に導入されたｍｉＲＮＡ、例えばｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ１、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２を発現する細胞をＡＡＶベクター製造に使用することにより、従来よりも高力価のＡＡＶベクターが得られることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明を概説すれば、本発明は
［１］ＡＡＶベクターを産生する能力を有する細胞であって、人為的に導入されたｍｉＲＮＡを発現している細胞、
［２］人為的に導入されたｍｉＲＮＡが、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ１、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２からなる群より選択された少なくとも１種である、［１］に記載の細胞、
［３］［１］又は［２］に記載の細胞にウイルスに封入される核酸を導入したＡＡＶベクター産生細胞、
［４］ＡＡＶベクターの製造方法であって、［３］に記載の細胞を培養する工程を含む方法、
［５］ｍｉＲＮＡを供給する核酸と、ＡＡＶベクターのウイルス粒子形成に必須な要素を供給する核酸を含むＡＡＶベクター製造用のキット、
［６］［４］に記載の方法を用いて得られるＡＡＶベクター、
［７］ＡＡＶベクター産生細胞内で発現することによってＡＡＶベクター産生細胞のＡＡＶベクター産生能力を向上させることが可能なｍｉＲＮＡの選択方法であって、ｍｉＲＮＡを発現するＡＡＶベクターの混合物を作製し、細胞において高産生されるＡＡＶベクターを選抜する工程を包含する選択方法、
［８］下記工程（ａ）～（ｅ）を包含する［７］に記載の選択方法であって、
（ａ）ｍｉＲＮＡを発現するＡＡＶベクター混合物を得る工程、
（ｂ）ｍｉＲＮＡを発現するＡＡＶベクター混合物を細胞へ感染させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を培養し、当該細胞より産生されたＡＡＶベクター混合物を取得する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られたＡＡＶベクター混合物を使用した上記（ｂ）、（ｃ）の工程を１回以上繰り返す工程、及び
（ｅ）工程（ｄ）により得られたＡＡＶベクター混合物中のｍｉＲＮＡをコードする核酸を得る工程、
に関する。
　本発明により、ＡＡＶベクターを産生する能力を有する細胞が提供される。当該細胞を使用することにより、煩雑な操作なく従来に比べて高力価のＡＡＶベクターを製造することが可能となる。更に、当該細胞を用いたＡＡＶベクターの製造方法、キットが提供される。
　本発明のＡＡＶベクターを産生する能力を有する細胞（以下、本発明の細胞）は、ＡＡＶベクター産生に必要な要素、並びに人為的に導入したｍｉＲＮＡを発現する細胞である。また本発明のＡＡＶベクター産生細胞は、前記本発明の細胞にウイルス粒子に封入される核酸を導入した細胞である。
　本発明の細胞の作製において、材料として使用する細胞には特に限定はない。前記細胞としては、ヒト、サル、げっ歯類などの哺乳動物細胞、好適には形質転換効率が高く、アデノウイルスＥ１遺伝子を恒常的に発現する２９３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１５７３）や２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１１２６８）、２９３Ｆ細胞、２９３ＦＴ細胞（いずれもライフテクノロジーズ社製）、Ｇ３Ｔ－ｈｉ細胞（国際公開第０６／０３５８２９号パンフレット）、市販のＡＡＶベクター産生用細胞株、ＡＡＶ２９３細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）が例示される。またＡＡＶベクター産生に必要なタンパク質のいくつかを一過的もしくは恒常的に発現するように改変した細胞が使用できる。
　前記ＡＡＶベクター産生に必要な要素として、（Ａ）ＡＡＶ由来Ｒｅｐタンパク質、Ｃａｐタンパク質、（Ｂ）アデノウイルス由来要素、例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２、Ｅ４、ＶＡＲＮＡ遺伝子、などが例示される。本発明の細胞にＡＡＶベクターのウイルス粒子形成に必須な要素を供給する核酸として、（ａ）Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸、Ｃａｐタンパク質をコードする核酸、（ｂ）アデノウイルス由来要素をコードする核酸が例示される。これらの核酸の形態には限定はなく、使用される細胞においてそれぞれの要素を供給可能な１又は複数の核酸構築物として、プラスミドやウイルスベクターに搭載して、細胞に導入することができる。例えば市販のプラスミドであるｐＡＡＶ－ＲＣ１　ｐｌａｓｍｉｄ、ｐＨｅｌｐｅｒ　ｐｌａｓｍｉｄ（Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）の使用が例示される。Ｃａｐタンパク質をコードする核酸は、Ｃａｐタンパク質をコードするものとは異なる読取り枠でＡＡＶ粒子の形成に必要なＡｓｓｅｍｂｌｙ－Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＡＰ）をコードしている［プロシーディング　オブ　ザ　ナショナル　アカデミー　オブ　サイエンシーズ　オブ　ジ　ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ）、第１０７巻、第１０２２０～１０２２５頁（２０１０）］。特に断らない限り、本明細書に記載された「Ｃａｐタンパク質をコードする核酸」はＡＡＰをもコードしている核酸を指す。Ｃａｐタンパク質をコードする核酸においてＡＡＰの機能が失われるような変異が（自然発生的に、もしくは人為的に）生じている場合には、さらにＡＡＰをコードする核酸を本発明の細胞に導入すればよい。Ｅ１ａ、Ｅ１ｂタンパク質をコードする核酸は、先述の通り２９３細胞などにおいてはゲノム中に挿入され、恒常発現しているため、別途導入する必要はない。Ｅ１ａ、Ｅ１ｂタンパク質をコードする核酸は、使用する細胞に応じて必要であれば導入すればよい。
　核酸構築物の導入の方法としては、一過性、又は恒常的な導入方法が例示される。一過性に導入する方法は特に限定はなく、公知の一過性導入方法、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、ポリエチレンイミン法、エレクトロポレーション法などが使用可能である。また市販の試薬、例えばＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３　Ｒｅａｇｅｎｔ、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２０２０（Ｍｉｒｕｓ社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００　Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００ＣＤ　Ｒｅａｇｅｎｔ（以上、ライフテクノロジーズ社製）、ＦｕＧｅｎｅ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ社製）などを用いてもよい。
　また核酸を細胞に恒常的に導入する方法は特に限定はなく、公知の恒常的導入方法、例えばレトロウイルスベクターを用いる方法、プラスミドの一過性導入方法と同様の方法で導入し、染色体に組み込まれた細胞を選択する方法などが使用可能である。レトロウイルスベクターを用いる方法においては、市販の試薬、例えばＲｅｔｏｒｏｖｉｒｕｓ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製）を用いてもよい。
　本発明におけるｍｉＲＮＡとしては、ＡＡＶベクター産生細胞内で発現することによってＡＡＶベクター産生細胞のＡＡＶベクター産生能力を向上させることが可能なｍｉＲＮＡが好適に例示される。
　前記ＡＡＶベクター産生細胞内で発現することによってＡＡＶベクター産生細胞のＡＡＶベクター産生能力を向上させることが可能なｍｉＲＮＡは、本明細書に開示される選択方法（以下、本発明の選択方法）によって、当業者であれば容易に選択可能である。本発明の選択方法は、細胞中で各々異なるｍｉＲＮＡ（例えばヒトｍｉＲＮＡ）を発現するＡＡＶベクターのライブラリー（混合物）を作製し、その中から細胞において高産生されるＡＡＶベクターを選抜する工程を含む。
　前記ＡＡＶベクターライブラリーの作製方法としては、ｍｉＲＮＡライブラリーをコードする核酸をウイルス粒子に封入される核酸に連結した核酸構築物を作製し、この核酸構築物に公知の方法を適用してｍｉＲＮＡライブラリー搭載ＡＡＶベクターを取得する方法が例示される。前記の核酸構築物の作製は、例えば市販のＡＡＶベクタープラスミドであるｐＡＡＶ－ＭＣＳ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等を利用することができる。次に上記ｍｉＲＮＡライブラリー搭載ＡＡＶベクターをＡＡＶベクター産生細胞の作製に適した細胞（例えばＡＡＶ２９３細胞）に感染させる。ついでこの細胞にＡＡＶベクター産生に必要な要素をコードする核酸構築物を一過性に導入して培養し、当該細胞が産生するＡＡＶベクター混合物を取得する。ここで得られたＡＡＶベクターを用いて上述の工程（感染、培養、ベクター取得）を１サイクル以上行う。このサイクルを繰り返すことで、ＡＡＶベクター混合物中にＡＡＶベクター産生を向上させるｍｉＲＮＡを発現する核酸を搭載するＡＡＶベクターが濃縮されていく。こうして得られたＡＡＶベクター混合物中のＡＡＶベクターについて、搭載されたｍｉＲＮＡの塩基配列の解読を行う。上記サイクルを繰り返すことにより得られる頻度が高くなるｍｉＲＮＡを同定し、それらをＡＡＶベクター産生を向上させるｍｉＲＮＡとみなす。このようにして選択されるｍｉＲＮＡは、本発明の細胞におけるｍｉＲＮＡとして好適に利用でき、例えばｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ１、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４、及びｈｓａ－ｍｉＲ－３４２が例示される。
　前記ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ１、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２を構成するＲＮＡの塩基配列は公知であり、それぞれをコードするＤＮＡ配列はＮＣＢＩ　ＧＥＮＥ　ＩＤ：４０６９７２、４４２８９８、４４２９０９として登録されている。当該配列を搭載したｍｉＲＮＡ発現プラスミドベクターは市販されており、タカラバイオ社などから入手可能である。
　本発明の細胞は、前述のようなｍｉＲＮＡを発現する核酸が人為的に導入されて作製されている。人為的に導入する方法には特に限定はなく、例えばプラスミド等の核酸構築物の形態で一過性又は恒常的に導入される。又、核酸構築物への搭載の形態にも限定はなく、単独で、あるいはＡＡＶベクター産生に必要な要素を供給する核酸、又はウイルス粒子に封入される核酸と同一の核酸構築物に搭載されていても良い。
　本発明のＡＡＶベクターを産生する能力を有する細胞にウイルス粒子に封入される核酸が導入されることにより、本発明のＡＡＶベクター産生細胞が作製される。こうして作製されるＡＡＶベクター産生細胞も本発明の態様の一つである。前記のウイルス粒子に封入される核酸は、ＡＡＶ由来のＩＴＲ配列とＡＡＶベクターに搭載することが望まれる核酸で構成される。前記のＡＡＶベクターに搭載することが望まれる核酸としては、任意の外来遺伝子、例えばポリペプチド（酵素、成長因子、サイトカイン、レセプター、構造タンパク質など）、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、デコイ、ＲＮＡ干渉を起こすＲＮＡなどをコードする核酸が例示される。前記の外来遺伝子の発現の制御のため、適当なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターやその他の転写調節要素が前記の核酸に挿入されていてもよい。ウイルス粒子に封入される核酸はプラスミドの形態で細胞に導入することができる。前記のプラスミドは、例えば市販のＡＡＶベクタープラスミドであるｐＡＡＶ－ＭＣＳ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ等（Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を使用して構築することができる。
　本発明のＡＡＶベクターの製造は、本発明の細胞にウイルス粒子に封入される核酸を一過性又は恒常的に導入する工程を含む方法により得られた、ＡＡＶベクター産生細胞を培養することで実施される。核酸を一過性又は恒常的に導入する方法としては、特に限定はなく、例えば、核酸構築物の導入方法として上記した公知の一過性導入方法又は恒常的導入方法を用いてもよい。
　好適にはｍｉＲＮＡを発現する核酸は、単独で、もしくはＲｅｐタンパク質及び／又はＣａｐタンパク質をコードする核酸と同一の発現プラスミドに搭載して一過性に導入することにより、本発明はより高い効果を発揮する。
　本発明によるＡＡＶベクターの製造において、ＡＡＶベクター産生細胞の培養は、公知の培養条件で行うことができる。例えば温度３０～３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５～１０％での培養が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。所望の細胞の増殖、ＡＡＶベクターの産生が達成できるのであれば前記の範囲以外の温度、湿度、ＣＯ２濃度で実施してもよい。
　培養用培地は、本発明のＡＡＶベクター産生細胞が培養されＡＡＶベクター製造が達成される物であれば特に限定はなく、例えば公知の培地や無血清培地、例えばＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ハムＦ１２、ＲＰＭＩ－１６４０などを使用してもよく、これらはＬｏｎｚａ社、ライフテクノロジーズ社、シグマ・アルドリッチ社などから市販品として入手することができる。培地には、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）やヒト血清由来のアルブミン等を添加してもよい。
　培養期間は特に限定はなく、例えば１２～７２時間、好適には４８～７２時間が好ましい。また、ＡＡＶベクター液は、培養上清や回収した細胞を適当な緩衝液に再懸濁して破砕したもの（細胞破砕液）の遠心上清から取得することができる。本発明では、こうして得られた培養上清や遠心上清は、そのまま、あるいは更に、例えばフィルターろ過して、又は公知の方法により濃縮もしくは精製してＡＡＶベクター液とし、適切な方法、例えば凍結して所望の用途に使用するまで保存される。
　本発明のＡＡＶベクター産生細胞を用いて製造するＡＡＶベクターには特に限定はなく、既存の血清型もしくは天然から新たに取得した野生型ＡＡＶに由来する組換えＡＡＶベクターが例示される。本発明の細胞を作製する際に適切な材料、例えばＲｅｐタンパク質をコードする核酸やＣａｐタンパク質をコードする核酸を選択することにより、使用したい血清型のＡＡＶに基づく組換えＡＡＶベクターを作成することができる。またウイルス粒子に封入される核酸からＲｅｐタンパク質をコードする核酸を欠損させることで、ウイルス粒子に封入されたＤＮＡの標的細胞ゲノムへの挿入を防止し、任意の外来遺伝子の挿入領域を増加させたＡＡＶベクターも例示される。
　本明細書では、ＡＡＶベクター産生の程度はＡＡＶベクターの力価を用いて示される。前記ＡＡＶベクターの力価は、一定量の試料におけるａ）正常に形成されたＡＡＶベクター粒子から得られたゲノムの個数（ゲノム力価）、又はｂ）実験的に測定されるＡＡＶベクターの細胞への感染能力（感染力価）のいずれかであり、必要に応じて明記して示される。
　ゲノム力価の測定方法としては、例えば核酸分解酵素処理とそれに引き続くプロテアーゼ処理を行うことで核酸不純物が分解されたＡＡＶベクター含有試料中のウイルスゲノムのコピー数をＰＣＲ法で検定する方法が例示される。
　感染力価の測定方法としては、例えばＡＡＶベクター含有試料の系列希釈液を適当な標的細胞に感染させ、導入遺伝子の発現、細胞の形状変化（細胞変性）の検出、細胞に導入されたプロウイルスのコピー数の測定、といった方法が例示される。
　本発明により、本発明のＡＡＶベクター産生細胞を用いて取得したＡＡＶベクターを有効成分として含有する医薬組成物も提供される。当該医薬組成物は、遺伝子治療用ＡＡＶベクター製剤の製造技術に従って適宜調製することができる。例えば、本発明の製造方法により得られたＡＡＶベクターを公知の方法で濃縮、精製して得られたＡＡＶベクターを医薬組成物とすることができる。当該医薬組成物は、患者由来の細胞に体外で使用するか、もしくは患者へ直接投与することもできる。
　したがって、本発明は、本発明のＡＡＶベクター産生細胞を用いて取得したＡＡＶベクターを有効成分として含有する医薬組成物を投与することを特徴とする治療方法も提供する。さらに、本発明は、医薬の製造における、本発明のＡＡＶベクター産生細胞を用いて取得したＡＡＶベクターの使用を提供する。また、本発明は、治療において使用するための、本発明のＡＡＶベクター産生細胞を用いて取得したＡＡＶベクターを提供する。
　本発明の細胞の作製に使用されるｍｉＲＮＡを発現する核酸と、ＡＡＶベクターのウイルス粒子形成に必須な要素を供給する核酸（Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸、Ｃａｐタンパク質をコードする核酸、アデノウイルス由来タンパク質をコードする核酸）を組み合わせることにより、ＡＡＶベクター産生細胞作製用のキットとすることができる。前記の核酸はそれぞれ、もしくは適宜組み合わせて、細胞内で所望のＲＮＡやタンパク質を供給可能な核酸構築物としてキットに含有させることができる。当該キットには、更にウイルス粒子に封入される核酸を作成するためのベクターや適切な細胞を含有させてもよい。
　以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１　ｐＡＡＶ－ＡｓＲｅｄ２－ｍｉＲＮＡライブラリープラスミドの構築
　ｐＡｓＲｅｄ２－Ｃ１　Ｖｅｃｔｏｒ（クロンテック社製）の、ＣＭＶプロモーターからｐｏｌｙＡシグナルにわたる約１．６ｋｂの断片をＰＣＲ法によって得た。この際、ＮｏｔＩの認識部位を有する増幅用プライマーを使用し、ＰＣＲ産物の両端にＮｏｔＩの認識部位を付加した。この断片をＮｏｔＩ（タカラバイオ社製）で処理して、インサート断片とした。一方ｐＡＡＶ－ＭＣＳ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）をＮｏｔＩで処理して約２．９ｋｂの断片を得、これをベクター断片とした。このベクター断片とインサート断片をＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて連結し、得られた組換えプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０８　Ｐｒｅｍｉｕｍ　Ｃｏｍｐｉｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製、以下大腸菌と記載する）を形質転換した。得られた形質転換体から抽出したプラスミドＤＮＡのうち、上流からＣＭＶプロモーター、ＡｓＲｅｄ２コード領域、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、ｐｏｌｙＡシグナルの順に挿入されたものを選んでｐＡＡＶ－ＡｓＲｅｄ２　Ｖｅｃｔｏｒとした。
　ｐＡＡＶ－ＡｓＲｅｄ２　ＶｅｃｔｏｒをＢｇｌＩＩ（タカラバイオ社製）とＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で処理した。一方、ｐＢＡｐｏ－ＣＭＶ　ＤＮＡにクローニングされたヒトｍｉＲＮＡライブラリー（タカラバイオ社製）をＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）とＨｉｎｄＩＩＩで処理し、得られたｍｉＲＮＡコード領域の断片をＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（タカラバイオ社製）を用いて前記のｐＡＡＶ－ＡｓＲｅｄ２　Ｖｅｃｔｏｒに連結した。ただし、内部にＢａｍＨＩ又はＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を持つｍｉＲＮＡに関しては、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲクローニングキット（クロンテック社製）を用いたディレクショナルクローニングによりｐＡＡＶ－ＡｓＲｅｄ２　Ｖｅｃｔｏｒに連結した。こうして得られた組換えプラスミドをｐＡＡＶ－ＡｓＲｅｄ２－ｍｉＲＮＡライブラリープラスミドとして以下の実験に使用した。
実施例２　ＡＡＶ－ｍｉＲＮＡライブラリーベクターの製造
　（１）ＡＡＶ２９３細胞の播種
　ＡＡＶ２９３細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を１０％ＦＢＳ（サーモサイエンティフィック社製）、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ（シグマ・アルドリッチ社製）に２．５ｘ１０５細胞／ｍＬとなるように懸濁した。この懸濁液４ｍＬを細胞培養用６０ｍｍディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製）に添加し、５％ＣＯ２存在下、３７℃のインキュベーター（以下３７℃のＣＯ２インキュベーター）で一夜培養した。
　（２）ＡＡＶ２９３細胞へのプラスミド導入
　実施例１で得たｐＡＡＶ２－ＡｓＲｅｄ２－ｍｉＲＮＡライブラリープラスミド及びｐＨｅｌｐｅｒ　ｐｌａｓｍｉｄとｐＡＡＶ－ＲＣ１　ｐｌａｓｍｉｄ（いずれもＣｅｌｌ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）をそれぞれ４μｇずつ使用し、リン酸カルシウム法を用いて実施例２－（１）のＡＡＶ２９３細胞にトランスフェクションした。６時間後、培地を完全に除去し、２％ＦＢＳ及び２ｍＭ　Ｌ－グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ　４ｍＬを添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで更に４８時間培養した。
　（３）ＡＡＶ－ｍｉＲＮＡライブラリーベクターの回収
　実施例２－（２）で培養したＡＡＶ２９３細胞より培地を除去し、ＰＢＳ（ナカライテスク社製）を１ｍＬ添加した。ピペッティングでＡＡＶ２９３細胞を１．５ｍＬチューブに回収し、４℃、７００×ｇ、５分間遠心後、上清を除去した。ＰＢＳ　０．１ｍＬにＡＡＶ２９３細胞を再懸濁後、エタノール／ドライアイスで２分間、３７℃のウォーターバスで２分間、ボルテックス・ミキサーでの撹拌１分間の処理を３回繰り返し、ＡＡＶ－ｍｉＲＮＡライブラリーベクターを含む細胞破砕液を回収した。この細胞破砕液を４℃、１０，０００×ｇ、１０分間遠心後、上清を回収しＡＡＶ－ｍｉＲＮＡライブラリーベクター液とした。
実施例３　ＡＡＶベクターのゲノム力価測定
　（１）ＤＮａｓｅ処理
　ＡＡＶ－ｍｉＲＮＡライブラリーベクター液２μＬに、１０ｘＤＮａｓｅＩバッファー２μＬ、注射用水（大塚製薬社製）１５．２μＬ、ＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社製）０．８μＬを添加した反応液を調製した。ＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（登録商標）　Ｓｔａｎｄａｒｄ（タカラバイオ社製）を用いて３７℃で一時間インキュベートし、遊離のゲノムやプラスミドを分解した。その後、ＤＮａｓｅＩを不活化するために９９℃、１０分間の熱処理した後、実施例３－（２）の処理まで４℃あるいは－２０℃にて保存した。
　（２）Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ処理
　実施例３－（１）で得られた反応液２０μＬに、注射用水１５μＬ、１０×Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋバッファー（０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　（ｐＨ７．８）、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ、５％　ＳＤＳ）４μＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（タカラバイオ社製）１μＬを加え、ＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（登録商標）　Ｓｔａｎｄａｒｄを用いて５５℃で一時間インキュベートし、ＡＡＶベクターのゲノムを遊離させた。その後、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを不活化するためにこの溶液を９５℃で１０分間処理した。こうして調製した溶液をＡＡＶ－ｍｉＲＮＡライブラリーベクターゲノム液として、リアルタイムＰＣＲに供するまで４℃又は－２０℃にて保存した。
　（３）リアルタイムＰＣＲ
　実施例３－（２）で調製したＡＡＶベクターゲノム液を注射用水で５０倍希釈したもの２μＬを鋳型とし、配列表の配列番号１（Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　１）及び配列番号２（Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　１）に記載のプライマー、ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｐｒｅｍｉｘ　ＥｘＴａｑＩＩ　（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。反応液調製はキットに添付の説明書に従った。標準品として、ＡＡＶベクターゲノム液に替えて、ｐＡＡＶ－ＡｓＲｅｄ２をＥｃｏＲＩで処理して線状化したＤＮＡ液を用いた。リアルタイムＰＣＲ反応はＴｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（登録商標）　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｓｉｎｇｌｅ（タカラバイオ社製）を用い、装置推奨の条件で行った。その後、装置添付の説明書に従ってＡＡＶベクターゲノムの定量を行い、ゲノム力価をＡＡＶベクター産生細胞１個当たりのＡＡＶベクターゲノム数（ｖｉｒａｌ　ｇｅｎｏｍｅ／ｃｅｌｌ、以下ＶＧ／ｃｅｌｌ）で表した。
実施例４　ＡＡＶ－ｍｉＲＮＡライブラリーのスクリーニング
　（１）ＡＡＶ２９３細胞の播種
　ＡＡＶ２９３細胞を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭに２．５ｘ１０５細胞／ｍＬとなるように懸濁した。この懸濁液４ｍＬを細胞培養用６０ｍｍディッシュに添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで一夜培養した。
　（２）ＡＡＶ－ｍｉＲＮＡライブラリーベクターのＡＡＶ２９３細胞への感染
　実施例４－（１）で培養したＡＡＶ２９３細胞より培地を完全に除去した後、実施例２で調製したＡＡＶ－ｍｉＲＮＡライブラリーベクター溶液をゲノム力価換算値でｍｏｉ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）約８５０になるように２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに希釈して２ｍＬ添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２時間培養した。その後、２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを２ｍＬ添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで一夜培養した。
　（３）ｐＡＡＶ－ＲＣ１　ｐｌａｓｍｉｄ及びｐＨｅｌｐｅｒ　ｐｌａｓｍｉｄのＡＡＶ２９３細胞へのトランスフェクション
　実施例４－（２）で培養したＡＡＶ２９３細胞に、リン酸カルシウム法を用いて、ｐＡＡＶ－ＲＣ１　ｐｌａｓｍｉｄ及びｐＨｅｌｐｅｒ　ｐｌａｓｍｉｄを４μｇずつトランスフェクションした。６時間後、培地を完全に除去した後に２％ＦＢＳ及び２ｍＭ　Ｌ－グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ　４ｍＬを添加した細胞を、３７℃のＣＯ２インキュベーターで更に４８時間培養した。
　（４）ＡＡＶ－ｍｉＲＮＡライブラリーベクターの再回収
　実施例４－（３）で培養したＡＡＶ２９３細胞より培地を除去し、ＰＢＳを１ｍＬ添加した。ピペッティングでＡＡＶ２９３細胞を１．５ｍＬチューブに回収し、４℃、７００×ｇ、５分間遠心後、上清を除去した。ＰＢＳ　０．１ｍＬに細胞を再懸濁後、エタノール／ドライアイスで２分間、３７℃のウォーターバスで２分間、ボルテックス・ミキサーでの撹拌１分間の処理を３回繰り返し、ＡＡＶ－ｍｉＲＮＡライブラリーベクターを含む細胞破砕液を回収した。この細胞破砕液を４℃、１０，０００×ｇ、１０分間遠心後、上清を回収しＡＡＶ－ｍｉＲＮＡライブラリーベクター液とした。
　（５）ＡＡＶ－ｍｉＲＮＡライブラリーベクターの濃縮
　上記実施例４－（１）～（４）を計８回繰り返し、ＡＡＶ－ｍｉＲＮＡライブラリーベクターを濃縮した。各ラウンドにおける感染時ウイルス量（ｍｏｉ）及び回収ウイルス量をゲノム力価換算値を用いて表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記の表より、ラウンド５以降はＡＡＶ－ｍｉＲＮＡウイルスが複製しやすくなっており、ＡＡＶベクター産生を向上させるｍｉＲＮＡが濃縮されたと考えられた。
実施例５　ＡＡＶベクター産生を向上させるｍｉＲＮＡの選択
　（１）ＡＡＶ－ｍｉＲＮＡベクターゲノムの調製
　実施例４の各ラウンドで回収したＡＡＶ－ｍｉＲＮＡライブラリーベクター液２μＬを用いて実施例３－（１）、（２）と同様の方法でＡＡＶ－ｍｉＲＮＡライブラリーベクターゲノム液を得た。
　（２）ｍｉＲＮＡのクローニング
　実施例５－（１）で得たＡＡＶ－ｍｉＲＮＡライブラリーベクターゲノム液を鋳型とし、配列表の配列番号３（Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　２）及び配列番号４（Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　２）に記載のプライマー、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　ＧＸＬ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてｍｉＲＮＡコード領域周辺をＰＣＲ法により増幅させた。反応は、９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃３０秒を３０サイクル繰り返した後、更に同じ条件を１回繰り返した。得られた断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲクローニングキットを用いてＨｉｎｃＩＩ（タカラバイオ社製）及びＢＡＰ（タカラバイオ社製）処理済のｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）に連結した。
　（３）ｍｉＲＮＡの塩基配列の解読
　実施例５－（２）で得られた組換えプラスミドで大腸菌を形質転換後、アンピシリンを含むＬＢプレートに播種して３７℃で一夜培養し、コロニーを多数得た。コロニーをいくつか選び、それぞれをアンピシリンを含むＬＢ液体培地で一夜培養し、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミドについて塩基配列の解読を行い、プラスミド上にコードされているｍｉＲＮＡ名を同定した。その結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記の表に示す通り、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ１、３２４、３４２等が複数回同定されたことから、ラウンドを繰返すことで、ＡＡＶベクター産生を向上させるｍｉＲＮＡが取得されたと考えられた。
実施例６　取得したｍｉＲＮＡの評価
　（１）ｍｉＲＮＡ発現プラスミドの調製
　ｐＢＡｐｏ－ＣＭＶ　ＤＮＡにクローニングされたヒトｍｉＲＮＡライブラリーからｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ１、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２が挿入されたプラスミドを選択し、それぞれを用いて大腸菌を形質転後、プラスミドを大量調製した。プラスミド調製にはＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄ　Ｘｔｒａ　Ｍｉｄｉ　ＥＦ（マッハライナーゲル社製）を用いた。得られたプラスミドをそれぞれｐＢａｐｏ－ｍｉＲ１９６ａ１、ｐＢａｐｏ－ｍｉＲ３２４、ｐＢａｐｏ－ｍｉＲ３４２と名付けた。
　（２）ＡＡＶベクターの製造
　実施例６－（１）で得られたプラスミドを、ｐＡＡＶ－ＡｓＲｅｄ２－Ｃ１　ｖｅｃｔｏｒ、ｐＡＡＶ－ＲＣ１　ｐｌａｓｍｉｄ、ｐＨｅｌｐｅｒ　ｐｌａｓｍｉｄと同時にＡＡＶ２９３細胞にトランスフェクションした。コントロールとして、実施例６－（１）で得られたプラスミドに替えてｐＢＡｐｏ－ＣＭＶをトランスフェクションした群も設定した。トランスフェクション及びＡＡＶベクター回収までの操作は、実施例２－（１）～（３）と同様の方法で行った。
　（３）ＡＡＶベクターのゲノム力価測定
　得られたＡＡＶベクターのゲノム力価を実施例３と同様の方法で測定した。その結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　上記の表に示すとおり、ｐＢＡｐｏ－ｍｉＲ３２４、ｐＢＡｐｏ－ｍｉＲ１９６ａ１、ｐＢＡｐｏ－ｍｉＲ３４２を用いたところ、コントロールと比較して高いゲノム力価のＡＡＶベクターが得られた。とくにｐＢＡｐｏ－ｍｉＲ３２４では数倍高いゲノム力価のＡＡＶベクターが得られた。
実施例７　ｐＲＣ－ｍｉＲ３４２プラスミドの評価
　（１）ｐＲＣ－ｍｉＲ３４２プラスミドの調製
　ｐＢＡｐｏ－ｍｉＲ３４２を鋳型として、配列表の配列番号５（Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　３）及び配列番号６（Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　３）に記載のプライマーを用いたＰＣＲ法によりＣＭＶプロモーターからｍｉＲ３４２コード領域までを含む領域を増幅した。得られた断片を、ＳｎａＢＩ（タカラバイオ社製）処理したｐＡＡＶ－ＲＣ１　ｐｌａｓｍｉｄにＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲクローニングキットを用いて連結した。得られた組換えプラスミドの塩基配列を解読しＣＭＶ－ｍｉＲ３４２断片が挿入されていることを確認後、プラスミドを調製した。得られたプラスミドをｐＲＣ－ｍｉＲ３４２とした。
　（２）ｐＲＣ－ｍｉＲ３４２の評価
　実施例７－（１）で得られたｐＲＣ－ｍｉＲ３４２を、ｐＡＡＶ－ＡｓＲｅｄ２　ｖｅｃｔｏｒ、ｐＨｅｌｐｅｒ　ｐｌａｓｍｉｄと同時にＡＡＶ２９３にトランスフェクションした。コントロールとして、ｐＲＣ－ｍｉＲ３４２に替えてｐＡＡＶ－ＲＣ１　ｐｌａｓｍｉｄをトランスフェクションクションした群も設定した。こうして得られたＡＡＶベクター産生細胞を２９３－ＲＣ－ｍｉＲ３４２細胞、２９３－ＲＣ細胞と名付けた。トランスフェクションの方法及びＡＡＶベクター回収までの操作は、実施例２－（１）～（３）と同様の方法で行った。
　（３）ＡＡＶベクターのゲノム力価測定
　実施例７－（２）で得られた各ＡＡＶベクター産生細胞から得られたＡＡＶベクターのゲノム力価を実施例３と同様の方法で測定した。その結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記の表に示すように、ｐＲＣ－ｍｉＲ３４２を用いて作製したＡＡＶベクター産生細胞からは、コントロールと比較して６割高いゲノム力価のＡＡＶベクターが得られたことが示された。
実施例８　得られたＡＡＶベクターの評価
　（１）標的細胞の播種
　ＡＡＶ２９３細胞を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭに４ｘ１０４細胞／ｍＬとなるように懸濁した。この懸濁液１ｍＬを細胞培養用２４ウェルプレート（コーニング社製）に添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで一夜培養した。
　（２）ウイルス感染
　実施例８－（１）のＡＡＶ２９３細胞より培地を除去した後、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭ　Ｌ－グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭを５００μＬ添加し、実施例７－（２）で得られたＡＡＶベクター溶液を１μＬ添加した。３７℃のＣＯ２インキュベーターで６時間培養後、培地を除去し、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭ　Ｌ－グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭを５００μＬ添加し、一夜培養した。
　（３）フローサイトメーター解析と感染力価の算出
　実施例８－（２）で培養したＡＡＶ２９３細胞より培地を除去し、ＰＢＳを５００μＬ添加した。トリプシン処理後、培地を５００μＬ添加しピペッティングでＡＡＶ２９３細胞を１．５ｍＬチューブに回収した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメーターＣｙｔｏｍｉｃｓ　ＦＣ５００（ベックマン・コールター社製）でＡｓＲｅｄ２陽性率を測定した。得られた値をもとに感染力価を算出し、ＡＡＶベクター液１ｍＬ当たりの感染性ＡＡＶベクター数（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｖｉｒａｌ　ｐａｒｔｉｃｌｅ／ｍＬ、以下ｉｖｐ／ｍＬ）で示した。その結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　上記の表に示すように、ｐＲＣ－ｍｉＲ３４２を用いて製造したＡＡＶベクターは、ゲノム力価だけでなく、感染力価も高く、ｐＲＣ－ｍｉＲ３４２はＡＡＶベクター産生細胞に導入されたことで、正常な感染能を持ったＡＡＶベクターの産生能力を向上させることが明らかとなった。
実施例９　ｐＲＣ６-ｍｉＲ３４２、ｐＲＣ９-ｍｉＲ３４２プラスミドの評価
　（１）ｐＲＣ-ｍｉＲＮＡプラスミドの作製
　ｐＡＡＶ―ＲＣ１をＳｍｉＩとＳｎａＢＩで処理し、９型ＡＡＶのＣａｐ遺伝子の同部位を人工合成の上、連結して、ｐＲＣ９を構築した。実施例７－（１）で増幅したＣＭＶプロモーターからｍｉＲ３４２コード領域まで含む断片を、ＳｎａＢＩ処理したｐＲＣ９に実施例７－（１）と同様の方法により連結し、ｐＲＣ９－ｍｉＲ３４２を得た。即ち、ｐＲＣ９－ｍｉＲ３４２は９型ＡＡＶのＣａｐ遺伝子及びＣＭＶ－ｍｉＲ３４２断片を含むヘルパープラスミドである。また、ｐＢａｐｏ－ｍｉＲ３４２を鋳型として、配列表の配列番号７（Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　４）及び配列番号８（Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　４）に記載のプライマーを用いたＰＣＲ法によりＣＭＶプロモーターからｍｉＲ３４２コード領域までを含む領域を別途増幅した。この断片を、ＳｍａＩ（タカラバイオ社製）処理したｐＲｅｐ－Ｃａｐ　ＡＡＶ６プラスミド（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｖｉｒｏｍｉｃｓ社製）にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲクローニングキットを用いて連結し、ｐＲＣ６－ｍｉＲ３４２を得た。即ち、ｐＲＣ６－ｍｉＲ３４２は６型ＡＡＶのＣａｐ遺伝子及びＣＭＶ－ｍｉＲ３４２断片を含むヘルパープラスミドである。
　（２）ｐＲＣ-ｍｉＲＮＡの評価
　実施例９－（１）で得られたプラスミドまたはコントロールプラスミドを、ｐＡＡＶ－ＡｓＲｅｄ２、ｐＨｅｌｐｅｒ　ｐｌａｓｍｉｄと同時にＡＡＶ２９３へトランスフェクションした。トランスフェクションの方法及びＡＡＶベクター回収までの操作は、実施例２－（１）～（３）と同様の方法で行った。
　（３）ＡＡＶベクターのゲノム力価測定
　実施例３と同様の方法で、製造したＡＡＶベクターのゲノム力価を定量した。その結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示すように、ｍｉＲ３４２を挿入したｐＲＣを用いると、６型及び９型ＡＡＶであってもコントロールと比較して高いゲノム力価のＡＡＶベクターが得られることが示された。
　本発明の細胞を用いることにより、従来に比べ高力価のＡＡＶベクターを製造することができる。本発明の細胞を用いて製造されたＡＡＶベクターや当該ＡＡＶベクターを有効成分とする組成物は、遺伝子治療の研究又は臨床の分野における遺伝子導入方法として非常に有用である。
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Claims (8)

  1. 　ＡＡＶベクターを産生する能力を有する細胞であって、人為的に導入されたｍｉＲＮＡを発現している細胞。
  2. 　人為的に導入されたｍｉＲＮＡが、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ１、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２からなる群より選択された少なくとも１種である、請求項１に記載の細胞。
  3. 　請求項１又は２に記載の細胞にウイルスに封入される核酸を導入したＡＡＶベクター産生細胞。
  4. 　ＡＡＶベクターの製造方法であって、請求項３に記載の細胞を培養する工程を含む方法。
  5. 　ｍｉＲＮＡを供給する核酸と、ＡＡＶベクターのウイルス粒子形成に必須な要素を供給する核酸を含むＡＡＶベクター製造用のキット。
  6. 　請求項４に記載の方法を用いて得られるＡＡＶベクター。
  7. 　ＡＡＶベクター産生細胞内で発現することによってＡＡＶベクター産生細胞のＡＡＶベクター産生能力を向上させることが可能なｍｉＲＮＡの選択方法であって、ｍｉＲＮＡを発現するＡＡＶベクターの混合物を作製し、細胞において高産生されるＡＡＶベクターを選抜する工程を包含する選択方法。
  8. 　下記工程（ａ）～（ｅ）を包含する請求項７に記載の選択方法：
    （ａ）ｍｉＲＮＡを発現するＡＡＶベクター混合物を得る工程；
    （ｂ）ｍｉＲＮＡを発現するＡＡＶベクター混合物を細胞へ感染させる工程；
    （ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を培養し、当該細胞より産生されたＡＡＶベクター混合物を取得する工程；
    （ｄ）工程（ｃ）で得られたＡＡＶベクター混合物を使用した上記（ｂ）、（ｃ）の工程を１回以上繰り返す工程；及び
    （ｅ）工程（ｄ）により得られたＡＡＶベクター混合物中のｍｉＲＮＡをコードする核酸を得る工程。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015005430A1 (ja) * 2013-07-11 2015-01-15 タカラバイオ株式会社 非エンベロープウイルスの製造方法
CN107208142A (zh) * 2014-11-28 2017-09-26 优尼科Ip有限公司 包含细小病毒病毒体的组合物中的dna杂质
US10023846B2 (en) 2014-07-10 2018-07-17 Takara Bio Inc. Production method for non-enveloped virus particles
US10415020B2 (en) 2015-01-09 2019-09-17 Takara Bio Inc. Method for producing non-enveloped viral particles
JP2020507331A (ja) * 2017-02-17 2020-03-12 ロンザ リミテッドＬｏｎｚａ Ｌｉｍｉｔｅｄ アデノ随伴ウイルスを生産するための哺乳動物細胞
JPWO2022138869A1 (ja) * 2020-12-25 2022-06-30
JP2023512688A (ja) * 2020-02-03 2023-03-28 ラトガース，ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュー ジャージー 脊髄損傷後の機能回復を促進するためのマイクロｒｎａ－７組成物およびその使用方法
WO2024147331A1 (ja) * 2023-01-06 2024-07-11 株式会社カネカ タンパク質発現増強用核酸

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3151866B1 (en) 2014-06-09 2023-03-08 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
RU2716991C2 (ru) 2014-11-05 2020-03-17 Вояджер Терапьютикс, Инк. Полинуклеотиды aadc для лечения болезни паркинсона
WO2016077687A1 (en) 2014-11-14 2016-05-19 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
KR20230145206A (ko) 2014-11-14 2023-10-17 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
US11697825B2 (en) 2014-12-12 2023-07-11 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scAAV
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
KR20240056729A (ko) 2016-05-18 2024-04-30 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
KR102427379B1 (ko) 2016-05-18 2022-08-02 보이저 테라퓨틱스, 인크. 헌팅톤 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법
WO2018044933A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
JP2020518259A (ja) 2017-05-05 2020-06-25 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． ハンチントン病治療組成物および方法
JP2020518258A (ja) 2017-05-05 2020-06-25 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）治療組成物および方法
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
CA3070087A1 (en) 2017-07-17 2019-01-24 Voyager Therapeutics, Inc. Trajectory array guide system
EP3808849A1 (en) 2017-08-03 2021-04-21 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
AU2018338728B2 (en) 2017-09-29 2025-01-02 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Rescue of central and peripheral neurological phenotype of Friedreich's Ataxia by intravenous delivery
TW202413649A (zh) 2017-10-16 2024-04-01 美商航海家醫療公司 肌萎縮性脊髓側索硬化症(als)之治療
EP3697908A1 (en) 2017-10-16 2020-08-26 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
KR20210019996A (ko) 2018-05-15 2021-02-23 보이저 테라퓨틱스, 인크. 파킨슨병의 치료를 위한 조성물 및 방법
EP3856762A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Voyager Therapeutics, Inc. Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof
CN111647625A (zh) * 2019-12-25 2020-09-11 深圳三智医学科技有限公司 一种提高人凝血因子ix表达水平的方法
CN114075609B (zh) * 2020-08-10 2024-08-02 北京荷塘生华医疗科技有限公司 测定重组腺病毒感染滴度的方法
CN118871575A (zh) 2022-02-21 2024-10-29 学校法人日本医科大学 病毒载体生产增强剂及产生病毒载体的方法
WO2023157977A1 (ja) 2022-02-21 2023-08-24 学校法人日本医科大学 ウイルスベクター生産性増強剤及びウイルスベクターの製造方法
CN114657153A (zh) * 2022-05-24 2022-06-24 上海健士拜生物科技有限公司 rAAV重组包装质粒、用于rAAV包装的质粒系统和rAAV的制备方法
EP4628576A1 (en) * 2024-04-07 2025-10-08 Ascend Advanced Therapies GmbH Microrna molecules for use in methods for improving recombinant aav production

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997006272A2 (en) 1995-08-03 1997-02-20 Avigen, Inc. High efficiency helper system for aav vector production
US6093570A (en) 1995-06-07 2000-07-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
WO2001032899A1 (en) * 1999-10-29 2001-05-10 Takara Shuzo Co., Ltd. Gene transfer method
JP2001517454A (ja) * 1997-09-19 2001-10-09 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 組換えアデノ随伴ウイルスの産生に有用な方法および細胞株
JP2001520051A (ja) * 1997-10-21 2001-10-30 ターゲテッド ジェネティックス コーポレイション 組換えａａｖベクターの産生のための増幅可能アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）パッケージングカセット
WO2006035829A1 (ja) 2004-09-29 2006-04-06 Takara Bio Inc. レトロウイルスベクター産生用細胞
WO2009148137A1 (ja) * 2008-06-04 2009-12-10 協和発酵キリン株式会社 肥満細胞の脱顆粒を制御する核酸

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5622856A (en) 1995-08-03 1997-04-22 Avigen High efficiency helper system for AAV vector production
US6004797A (en) 1995-11-09 1999-12-21 Avigen, Inc. Adenovirus helper-free recombinant AAV Virion production
US6642051B1 (en) 1997-10-21 2003-11-04 Targeted Genetics Corporation Amplifiable adeno-associated virus(AAV) packaging cassettes for the production of recombinant AAV vectors
EP2302055B1 (en) * 2004-11-12 2014-08-27 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules
US8729041B2 (en) * 2008-12-03 2014-05-20 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treating hepatic neoplasia
CN101787373B (zh) * 2009-01-23 2013-06-19 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 一种携带外源基因在包装细胞中高效生产的重组病毒载体、其构建方法及其用途
CN101967496A (zh) * 2009-02-16 2011-02-09 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 Aav病毒反向感染技术及aav病毒阵列
CN101532024A (zh) 2009-04-30 2009-09-16 许瑞安 一种用于基因治疗的新型细胞特异性内含microRNA结合序列的基因HAAVmir
US9163261B2 (en) * 2010-02-22 2015-10-20 Koteswara Rao KOLLIPARA Adeno-associated virus 2/8—micro RNA-101 therapy for liver cancer
CN101906417B (zh) * 2010-04-19 2012-09-05 北京三元基因工程有限公司 针对乙肝病毒的shRNA及携带其的重组腺相关病毒基因治疗载体
CN102311973A (zh) * 2010-07-05 2012-01-11 北京五加和分子医学研究所有限公司 一种新型miRNA和编码蛋白基因共表达载体
US9290759B2 (en) * 2010-08-25 2016-03-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Optimized miRNA constructs

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6093570A (en) 1995-06-07 2000-07-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
WO1997006272A2 (en) 1995-08-03 1997-02-20 Avigen, Inc. High efficiency helper system for aav vector production
JP2001517454A (ja) * 1997-09-19 2001-10-09 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 組換えアデノ随伴ウイルスの産生に有用な方法および細胞株
JP2001520051A (ja) * 1997-10-21 2001-10-30 ターゲテッド ジェネティックス コーポレイション 組換えａａｖベクターの産生のための増幅可能アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）パッケージングカセット
WO2001032899A1 (en) * 1999-10-29 2001-05-10 Takara Shuzo Co., Ltd. Gene transfer method
WO2006035829A1 (ja) 2004-09-29 2006-04-06 Takara Bio Inc. レトロウイルスベクター産生用細胞
WO2009148137A1 (ja) * 2008-06-04 2009-12-10 協和発酵キリン株式会社 肥満細胞の脱顆粒を制御する核酸

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
APARICIO, O. ET AL.: "Adenovirus virus- associated RNA is processed to functional interfering RNAs involved in virus production", J. VIROL., vol. 80, no. 3, 2006, pages 1376 - 1384, XP055181585 *
HUSSAIN, M. ET AL.: "West Nile virus encodes a microRNA-like small RNA in the 3' untranslated region which up-regulates GATA4 mRNA and facilitates virus replication in mosquito cells", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 40, no. 5, 2011, pages 2210 - 2223, XP055181588 *
KAMBARA, H. ET AL.: "Establishment of a novel permissive cell line for the propagation of hepatitis C virus by expression of microRNA miR122", J. VIROL., vol. 86, no. 3, 2011, pages 1382 - 1393, XP055181583 *
MUNSON, D. J. ET AL.: "A novel miRNA produced during lytic HSV-1 infection is important for efficient replication in tissue culture", ARCH. VIROL., vol. 157, June 2012 (2012-06-01), pages 1677 - 1688, XP035105657 *
OZAWA, K.: "Gene therapy using AAV (adeno- associated virus) vectors", VIRUS, vol. 53, no. 2, 2003, pages 163 - 170, XP055181594 *
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 107, 2010, pages 10220 - 10225
RANDALL, G. ET AL.: "Cellular cofactors affecting hepatitis C virus infection and replication", PROC. NATL. ACAD. SCI. U S A., vol. 104, no. 31, 2007, pages 12884 - 12889, XP002532652 *
See also references of EP2871239A4

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10072250B2 (en) 2013-07-11 2018-09-11 Takara Bio Inc. Method for manufacturing non-enveloped virus
WO2015005430A1 (ja) * 2013-07-11 2015-01-15 タカラバイオ株式会社 非エンベロープウイルスの製造方法
US10023846B2 (en) 2014-07-10 2018-07-17 Takara Bio Inc. Production method for non-enveloped virus particles
CN107208142B (zh) * 2014-11-28 2024-03-26 优尼科Ip有限公司 包含细小病毒病毒体的组合物中的dna杂质
CN107208142A (zh) * 2014-11-28 2017-09-26 优尼科Ip有限公司 包含细小病毒病毒体的组合物中的dna杂质
US10415020B2 (en) 2015-01-09 2019-09-17 Takara Bio Inc. Method for producing non-enveloped viral particles
JP2020507331A (ja) * 2017-02-17 2020-03-12 ロンザ リミテッドＬｏｎｚａ Ｌｉｍｉｔｅｄ アデノ随伴ウイルスを生産するための哺乳動物細胞
JP2023081927A (ja) * 2017-02-17 2023-06-13 ロンザ リミテッド アデノ随伴ウイルスを生産するための哺乳動物細胞
JP7637470B2 (ja) 2017-02-17 2025-02-28 ロンザ リミテッド アデノ随伴ウイルスを生産するための哺乳動物細胞
JP7731388B2 (ja) 2017-02-17 2025-08-29 ロンザ リミテッド アデノ随伴ウイルスを生産するための哺乳動物細胞
JP2023512688A (ja) * 2020-02-03 2023-03-28 ラトガース，ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュー ジャージー 脊髄損傷後の機能回復を促進するためのマイクロｒｎａ－７組成物およびその使用方法
JPWO2022138869A1 (ja) * 2020-12-25 2022-06-30
WO2024147331A1 (ja) * 2023-01-06 2024-07-11 株式会社カネカ タンパク質発現増強用核酸

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