WO2013187302A1 - 検査試験紙 - Google Patents

検査試験紙 Download PDF

Info

Publication number
WO2013187302A1
WO2013187302A1 PCT/JP2013/065676 JP2013065676W WO2013187302A1 WO 2013187302 A1 WO2013187302 A1 WO 2013187302A1 JP 2013065676 W JP2013065676 W JP 2013065676W WO 2013187302 A1 WO2013187302 A1 WO 2013187302A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
reagent
component
test paper
porous membrane
reagent component
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/065676
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
嘉哉 佐藤
栄次 有田
Original Assignee
テルモ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by テルモ株式会社 filed Critical テルモ株式会社
Priority to JP2014521289A priority Critical patent/JP6304819B2/ja
Publication of WO2013187302A1 publication Critical patent/WO2013187302A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/84—Systems specially adapted for particular applications
    • G01N21/8483—Investigating reagent band
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G01N33/521—Single-layer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour

Definitions

  • the concentration gradient in the film thickness direction of the first reagent component and the second reagent component in the porous membrane includes any of a stepwise, linear, or curved gradient, but the concentration of the first reagent component
  • the concentration gradients of the first reagent component and the second reagent component are set so that the graph indicating the gradient and the graph indicating the concentration gradient of the second reagent component are axisymmetric with respect to the axis including the intersection of the two graphs. It is particularly preferred to form.
  • a porous membrane having a first surface and a second surface when the first reagent component has a concentration gradient that decreases from the first surface side toward the second surface, The two reagent components have a concentration gradient that decreases from the second surface side toward the first surface.
  • the test paper according to the present invention includes a first reagent region, a second reagent region, a porous membrane having a first surface and a second surface, and the first test region is located in the first reagent region. It is preferable that the first reagent component and the second reagent component in the second reagent region are respectively supported on a porous membrane, and the first reagent component in the first reagent region is the first reagent component in the first reagent region. More preferably, the second reagent region is formed on the first surface side of the second reagent region so as to overlap the second reagent region.
  • each component and preferable form of the test paper according to the present invention will be described.
  • the test paper according to the present invention has a first reagent component as an essential component, and the first reagent component essentially contains a first enzyme, and if necessary, a first coloring component, You may contain at least 1 sort (s) selected from the group which consists of a 1st hydrophilizing agent, a 1st hydrophilic substance, a 1st reagent stabilizer, and a thickener.
  • those that function as one molecule include leuco dyes for oxidizing coloring reagents, and tetrazolium salts for reducing coloring reagents.
  • Compounds include benzidine, o-tolidine, o-dianisidine, 2,2'-amino-bis (3-ethylbenzothiazolinone-6-sulfonic acid) (ABTS), bis- (4-diethylamino) -2- Sulfophenylmethane (BSPM), bis [3-bis (4-chlorophenyl) methyl-4-dimethylaminophenyl] amine (BCMA), 10-N-methylcarbamoyl-3,7-dimethylamino-10H-phenothiazine (MCDP) 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMBZ), bis [4- (N-alkyl-N-sulfopropyl) -2,6-dimethylphenyl] methane (Bis
  • the combination is not particularly limited, but as a preferable combination when the test paper according to the present invention is used for blood glucose measurement by colorimetry, 4-aminoantipyrine (4-AA) and N-ethyl- N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOOS), 1- (4-sulfophenyl) -2,3-dimethyl-4-amino-5-pyrazolone (CP2-4) and N -Ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline (MAOS), and salts thereof.
  • 4-aminoantipyrine (4-AA) and N-ethyl- N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOOS)
  • TOOS 1- (4-sulfophenyl) -2,3-dimethyl-4-amino-5-pyrazolone
  • MAOS N -Ethyl-N- (2-hydroxy-3-
  • the content of the first reagent stabilizer in the test paper depends on the type of reagent stabilizer used, but is preferably 0.001 to 0.1% by mass with respect to the total content of the first reagent component. . Within such a range, the reagent components can be prevented from deteriorating, and thus there is a synergistic effect with the configuration of the test paper according to the present invention.
  • the porous membrane according to the present invention may have the same or different pore diameter on one surface and the other surface, but the pore diameter on one surface and the pore diameter on the other surface may be different. More preferred. Furthermore, in the porous membrane according to the present invention, when the pore diameter on one surface is different from the pore diameter on the other surface, the pore diameter has a gradient from the surface having the larger pore diameter toward the surface having the smaller pore diameter. Is more preferable. In addition, when the inspection test paper main body according to the present invention is an anisotropic porous membrane having a gradient in pore size, the surface of the porous membrane has a small pore size on the side of the inspection test paper. On the first surface (the first surface side of the porous membrane) and on the side where the pore diameter of the surface of the porous membrane is large, the second surface of the test paper (the second surface side of the porous membrane) Are preferably arranged to correspond.
  • the difference between the pore diameters on both surfaces is preferably 0.4 to 7 ⁇ m, more preferably 0.5 to 2 ⁇ m. preferable.
  • the porosity of the entire porous membrane according to the present invention is preferably 60 to 95%, more preferably 70 to 85%. If it is less than 60%, it may take a long time to penetrate the detection object and the measurement time may be long. If it exceeds 95%, the strength as a support may not be maintained.
  • a mercury porosimeter is used for measuring the porosity of the present invention.
  • the mobility of the substance can be controlled and the first reagent region and the second reagent region can be formed in the porous membrane in different distribution states. .

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

【課題】測定精度が高く、検体と試薬成分との反応効率に優れた検査試験紙を提供する。 【解決手段】第１の面および第２の面を有する多孔質膜と、第１の酵素を有する第１の試薬成分を有する第１の試薬領域と、第２の酵素を有する第２の試薬成分を有する第２の試薬領域と、を備えた検査試験紙であって、前記第１の試薬領域および第２の試薬領域が前記多孔質膜の膜厚方向において異なる分布状態で前記多孔質膜内に形成されている、検査試験紙によりかかる課題を解決する。

Description

検査試験紙
　本発明は、検査試験紙に関する。特に、検体中の目的成分の量を測定する装置または当該装置に接続する成分測定用試験片に用いる検査試験紙に関するものである。
　近年、血液中の糖分、コレステロール、もしくは中性脂肪、または、尿中の糖分、蛋白もしくは潜血などの液状の検体中の検出物を定量的に測定する手段の開発が進められている。これらの検体中の検出物を定量的に測定する方法の一つに、検体中の目的の検出物と反応して呈色する検査用試験紙に光を照射して反射光の強度を測定する方法がある。
　かかる比色式検体測定に関する検査試験紙の技術としては、特許文献１が挙げられる。当該特許文献１では、大孔部からなる第１の層と小孔部からなる第２の層とを有し、それぞれの層が所定の厚み範囲、所定の空孔率、平均孔径を備えている試験紙が開示されている。かかる試験紙は、一枚の膜において膜厚方向に孔径の異なる部分を有するため検体中の濾別物を濾別する機能を有することで、検体が膜内に展開する時間を短縮できるとしている。
　その他の技術としては、特許文献２が挙げられる。当該特許文献２の発明は、従来のような第２フィルム層、第１フィルム層および透明フィルムが順次積層された多層構造の診断試験担体は、サンプルのしみだす出口側に通気性および透水性のない透明フィルムが存在するため、サンプルのしみ出しが遅くなり、測定時間がかかるという問題点を解決すべく、多孔質基材の膜の表面上に高分子と無機材料とを含む多孔質層を積層させてなる試験紙を開示している。
国際公開第２００４／０８６０３７号（米国特許出願公開第２００６／０１９４３３６号明細書） 特開２００６－２７５７１６号公報
　上記特許文献１は、試験紙を孔径の異なる二つの部分からなる１枚の多孔質体として形成する構造であり、また、上記特許文献２の発明は、多孔質基材の上に多孔質を形成する構造であるため、確かに呈色液が測定面にしみだし易く、少ない検体量で迅速に測定ができると考えられる。しかしながら、特許文献１および２の発明は、多孔質の試験紙本体に担持させる試薬成分自体は、試験紙全体、多孔質基材および多孔質層とも同一であるため、検体と試薬成分との反応効率自体は向上しないという課題がある。
　そこで、本発明は上記課題を解決するために、測定精度が高く、検体と試薬成分との反応効率に優れた検査試験紙およびその製造方法を提供する。
　上述の目的を達成するために、本発明者らは、検体中の目的の検出物と反応して呈色する際に使用される試薬成分のそれぞれの作用について検討し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明の検査試験紙は、第１の面および第２の面を有する多孔質膜と、第１の酵素を有する第１の試薬成分を有する第１の試薬領域と、第２の酵素を有する第２の試薬成分を有する第２の試薬領域と、を備えた検査試験紙であって、前記第１の試薬領域および第２の試薬領域が前記多孔質膜の膜厚方向において異なる分布状態で前記多孔質膜内に形成されている。
　本発明に係る検査試験紙は、測定精度が高く、検体と試薬成分との反応効率を向上させることができる。
本発明に係る検査試験紙に関する模式図である。 本発明に係る実施例に示す実験データである。 本発明に係る板状ダイレクトグラビア印刷装置の模式図である。
　本発明の第一は、第１の面および第２の面を有する多孔質膜と、第１の酵素を有する第１の試薬成分を有する第１の試薬領域と、第２の酵素を有する第２の試薬成分を有する第２の試薬領域と、を備えた検査試験紙であって、前記第１の試薬領域および第２の試薬領域が前記多孔質膜の膜厚方向において異なる分布状態で前記多孔質膜内に形成されている、検査試験紙である。
　すなわち、本発明に係る検査試験紙は、基材である多孔質膜と、第１の酵素を有する第１の試薬成分と、第２の酵素を有する第２の試薬成分とを必須の構成要素にするものであって、第１の酵素を含む第１の試薬成分を有する第１の試薬領域と、第２の酵素を含む第２の試薬成分を有する第２の試薬領域と、が前記多孔質膜内部に形成されている。
　また、本発明に係る検査試験紙は、多孔質膜内に存在する第１の酵素を含む第１の試薬成分を有する第１の試薬領域の分布状態と、多孔質膜内に存在する第２の酵素を含む第２の試薬成分を有する第２の試薬領域の分布状態が前記多孔質膜の膜厚方向で異なっている。本発明において、「多孔質膜内に存在する第１の酵素を含む第１の試薬成分を有する第１の試薬領域の分布状態と、多孔質膜内に存在する第２の酵素を含む第２の試薬成分を有する第２の試薬領域の分布状態が前記多孔質膜の膜厚方向で異なる」とは、後述の実施例で示すように、多孔質膜を厚さ方向に適当な厚さ（例えば、２０μｍ）毎に切断した際の切断片に含まれる第１の酵素の酵素活性の分布率と、第２の酵素活性の分布率が互いに異なることを意味する。ここで、「酵素活性の分布率」とは、多孔質膜を同じ厚さに切断した際に得られる各切断片における酵素活性を測定し、多孔質膜全体の酵素活性（各切断片における酵素活性の総和）に対する各切断片の酵素活性の割合を百分率（％）で表した値を意味する。すなわち、第１の試薬成分が多孔質膜に担持されている部分を第１の試薬領域と、第２の試薬成分が多孔質膜に担持されている部分を第２の試薬領域とし、第１の試薬成分および第２の試薬成分が前記多孔質膜の膜厚方向においてそれぞれ互いに異なる濃度勾配を有していることが好ましい。
　そのため、第１の試薬領域と、第２の試薬領域と、が前記多孔質膜の膜厚方向に重なりあっていてもよく、第１の試薬領域および第２の試薬領域が接する界面近傍においては、第１の試薬成分と第２の試薬成分とが共存していてもよい。
　多孔質膜内における第１の試薬成分および第２の試薬成分の膜厚方向の濃度勾配としては、段階的、直線的、または曲線的な勾配のいずれも含むが、第１の試薬成分の濃度勾配を示すグラフと第２の試薬成分の濃度勾配を示すグラフとが、両者のグラフの交点を含む軸に対して線対称なるように第１の試薬成分および第２の試薬成分の濃度勾配を形成することが特に好ましい。例えば、第１の面および第２の面を有する多孔質膜において、第１の面側から第２の面に向かって減少する濃度勾配を第１の試薬成分が有している場合は、第２の試薬成分は第２の面側から第１の面に向かって減少する濃度勾配を有する。
　本発明に係る検査試験紙の形状は、特に限定されず、円形、楕円形、正方形、長方形、菱形等の四角形、三角形、六角形、八角形等、必要に応じ選択して用いることができる。また、当該検査試験紙の大きさも適宜選択することができる。
　本発明に係る検査試験紙および多孔質膜は、検体中の濾別物を濾別する機能を有し、該検体中の特定成分と反応して呈色する第１（または第２）の試薬成分を担持する多孔質膜であることが好ましい。
　ここで、上記検体としては、具体的には、例えば、血液、尿、汗、リンパ液、胆汁、唾液等が挙げられる。また、上記検体中の特定成分としては、検体によっても異なるが、グルコース、コレステロール、ヘモグロビン、乳酸、ヘモグロビンＡ１Ｃ、ケトン体等が挙げられる。また、上記濾別物としては、上記検体が血液である場合、赤血球等の血球成分を含むものが挙げられる。
　本発明に係る検査試験紙は、第１の試薬領域と、第２の試薬領域と、第１の面と第２の面を有する多孔質膜とを含み、前記第１の試薬領域にある第１の試薬成分と、前記第２の試薬領域にある第２の試薬成分と、をそれぞれ担持した多孔質膜であることが好ましく、前記第１の試薬領域の第１の試薬成分が、前記第２の試薬領域の第２の試薬成分より第１の面側に第２の試薬領域と重複して形成していることがより好ましい。以下、本発明に係る検査試験紙の各構成要素や好ましい形態について説明する。
　「第１の試薬領域」
　本発明に係る検査試験紙は、第１の酵素を含む第１の試薬成分を有する第１の試薬領域を有することを必須の構成要素とするものであり、当該検査試験紙の基体である多孔質膜内に第１の試薬領域が形成されている。
　本発明に係る第１の試薬領域の多孔質膜内部構造の表面に形成される第１の試薬成分の厚みは、２０～１００ｎｍ（乾燥状態）であることが好ましく、４０～８０ｎｍであることがさらに好ましい。
　また、本発明に係る第１の試薬領域の特定は、ミクロトームで多孔質膜を厚さ方向に適当な厚さ（例えば、２０μｍ）に切断した後、切断片に含まれる第１の試薬成分を構成する試薬量あるいは酵素活性量を測定することで行う。
　以下、本発明に係る第１の試薬成分について説明する。
　［第１の試薬成分］
　本発明に係る検査試験紙は、第１の試薬成分を必須の構成要素とするものであり、前記第１の試薬成分は第１の酵素を必須に含み、必要により、第１の発色成分、第１の親水化剤、第１の親水性物質、第１の試薬安定剤および増粘剤からなる群から選択される少なくとも１種を含んでもよい。また、本発明に係る検査試験紙を比色分析による血糖値測定に用いる場合、第１の試薬成分には、第１の酵素と、第１の発色成分とを含み、必要により、第１の親水化剤、第１の親水性物質、第１の試薬安定剤および第１の増粘剤からなる群から選択される少なくとも１種を含むことがより好ましい。
　（第１の酵素）
　本発明に係る第１の酵素は、グルコースオキシターゼ（ＧＯＤ）、アスコルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ等の酵素がより好ましい。なお、これらの酵素は、単独で使用しても２種以上組み合わせて使用してもよい。
　また、本発明に係る検査試験紙を比色分析による血糖値測定に用いる場合は、前記第１の酵素としては、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）であることがより好ましい。
　本発明に係る第１の酵素の含有量は、検査試験紙の単位面積当たり１Ｕ／ｃｍ２以上であることが好ましく、１～５０Ｕ／ｃｍ２がより好ましく、１０～５０Ｕ／ｃｍ２がさらに好ましい。１Ｕ／ｃｍ２以上の範囲であると基質の処理速度の観点で好ましい。
　（発色成分）
　本発明に係る第１の試薬成分は、第１の発色成分を有することが好ましく、当該発色成分としては、酸化及び還元されることによってその吸収波長特性や吸収強度等が変化する発色色素もしくは発色色素の前駆体（色原体）が用いられる。すなわち、酸化剤、還元剤の量に応じて変化する色を測定することによって、被測定物質の量を定量することができる。これらの発色色素や色原体には、１分子だけで機能するものや、異なる２分子がカップリングして機能するものがある。
　これらのうち、１分子で機能するものには、酸化系発色試薬ではロイコ型色素等、還元系発色試薬ではテトラゾリウム塩等が上げられる。化合物としては、ベンチジン、ｏ－トリジン、ｏ－ジアニシジン、２，２’－アミノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリノン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ビス－（４－ジエチルアミノ）－２－スルホフェニルメタン（ＢＳＰＭ）、ビス［３－ビス（４－クロロフェニル）メチル－４－ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）、１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ジメチルアミノ－１０Ｈ－フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、３，３’，５，５’－テトラメチルベンチジン（ＴＭＢＺ）、ビス［４－（Ｎ－アルキル－Ｎ－スルホプロピル）－２，６－ジメチルフェニル］メタン（Ｂｉｓ－ＭＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”－ヘキサ（３－スルホプロピル）－４，４’，４”－トリアミノトリフェニルメタン（ＴＭＰ）、３，３－ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）トリジン２ナトリウム（ＳＡＴ－３）、２－（４－ヨードフェニル）－３－（４－ニトロフェニル）－５－フェニル－２Ｈ－テトラゾリウムクロライド（ＩＮＴ）、３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、３－３’［３，３’－ジメトキシ－（１，１’－ビフェニル）－４，４’－ジイル］－ビス［２－（４－ニトロフェニル）－５－フェニル－２Ｈ－テトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）、などが挙げられる。
　また、２分子で機能する代表的なものには、カプラー化合物とトリンダー試薬とを酸化的にカップリングさせる方法がある（例えば、Ｔｒｉｎｄｅｒ，Ｐ．，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６，２４，１９６９、およびＢａｒｈａｍ，Ｄ．　ａｎｄ　Ｔｒｉｎｄｅｒ，Ｐ．，Ａｎａｌｙｓｔ（Ｌｏｎｄｏｎ），９７，１４２，１９７２　参照）。
　カプラー化合物としては、４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）、アミノジフェニルアミン、１－（４－スルホフェニル）－２，３－ジメチル－４－アミノ－５－ピラゾロン（ＣＰ２－４）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－ｍ－トルイジンまたはその誘導体などが用いられる。
　トリンダー試薬としては、例えば、フェノール誘導体、アニリン誘導体が用いられる。フェノール誘導体の例としては、フェノール、４－クロロフェノール、２，４－ジクロロフェノール、２，６－ジクロロフェノール、３，５－ジクロロフェノール、２，４－ジブロモフェノール、２，４，６－トリクロロフェノール、２，４，６－トリブロモフェノール、３，５－ジクロロ－２－ヒドロキシベンゼンスルホン酸、３－ヒドロキシ－２，４，６－トリヨードベンゾイル酸およびその塩などが挙げられる。また、アニリン誘導体の例としては、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－３－アセチルエチレンジアミン（ＥＭＡＥ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ－スクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ－（２－カルボキシエチル）－Ｎ－エチル－３－メチルアニリン（ＣＥＭＢ）、Ｎ，Ｎ－ビス－（４－スルホブチル）－３－メチルアニリン（ＴＯＤＢ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－スクシニルアミノエチル）－３－メチルアニリン（ＥＳＥＴ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＳＤＡ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシ－４－フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、およびそれらの塩などが挙げられる。
　実際の製品においては、１分子で機能する発色色素は試薬組成物とした場合の安定性が悪い場合があるため、２分子で機能する発色色素がより多く用いられる傾向にある。また、２分子で機能する発色色素のうち、カプラー化合物としては前記のうち最も安定な４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）が多く用いられ、トリンダー試薬としては揮発性の高いフェノール誘導体と比べて、安定でかつ発色強度や波長の点でより有利なアニリン誘導体が多く用いられている。また、上記発色成分は、使用する用途などに応じて適宜単独で本発明に係る検査試験紙に使用する、または２種以上を組み合わせて本発明に係る検査試験紙に使用するものであるため、その組み合わせは特に制限されることはないが、本発明に係る検査試験紙を比色分析による血糖値測定に用いる場合の好ましい組み合わせとしては、４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）およびＮ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、１－（４－スルホフェニル）－２，３－ジメチル－４－アミノ－５－ピラゾロン（ＣＰ２－４）およびＮ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、およびそれらの塩などが挙げられる。
　検査試験紙における第１の発色成分の含有量は、使用する発色成分の種類に依存するが、第１の試薬成分の全含有量に対して５～６０質量％が好ましく、１０～５０質量％がより好ましく、２０～４０質量％がさらにより好ましい。かかる範囲であれば、反応効率の観点で好ましい。
　（親水化剤）
　本発明に係る第１の親水化剤としては、界面活性剤、水溶性シリコン、グリシンおよびリジンなどのアミノ酸、ならびにレシチン等が好ましく挙げられる。また、当該界面活性剤としては、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（例えば、エマルゲン１２０：花王社製〕、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（例えば、トリトンＸ－１００：ローム・アンド・ハース社製）、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリエチレングリコールモノラウレート、もしくはノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ－４０等のノニオン型界面活性剤や、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、もしくはアルキルベンジルジメチル等のカチオン型界面活性剤や、コール酸、デオキシコール酸、もしくはポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル硫酸ナトリウム等のアニオン型界面活性剤、ステアリルベタイン、もしくは２－アルキル－Ｎ－カルボキシメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等のベタイン型界面活性剤等が挙げられる。
　検査試験紙における第１の親水化剤の含有量は、使用する親水化剤の種類に依存するが、第１の試薬成分の全含有量に対して５質量％以上１００質量％未満が好ましく、１０～９０質量％がより好ましい。かかる範囲であれば、検体の浸透を容易にすることができ、検出物の測定を迅速にすることができる。また、親水化剤として界面活性剤を使用すると、検出物が疎水性の場合に当該検出物を包含して試薬成分と反応させる化合物として使用することもできる観点から、親水化剤としては界面活性剤が好ましい。
　（親水性物質）
　本発明に係る第１の親水性物質としては、親水性有機高分子が挙げられ、例えば、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体；ポリエチレングリコール；ポリプロピレングリコール；ポリビニルアルコール、およびポリビニルピロリドンなどのビニル性モノマーの重合体；アクリルアミド重合体；メタクリルアミド重合体；アガロース；ゼラチン；フタル化ゼラチンなどのゼラチン誘導体；ならびに寒天などが好ましく挙げられ、より好ましくはカルボキシメチルセルロースおよびポリエチレングリコールである。
　検査試験紙における第１の親水性物質の含有量は、使用する親水性物質の種類に依存するが、第１の試薬成分の全含有量に対して５質量％以上１００質量％未満が好ましく、１０～９０質量％がより好ましい。かかる範囲であれば、検体の浸透を容易にすることができ、検出物の測定を迅速にすることができる。
　（試薬安定剤）
　本発明に係る第１の試薬安定剤としては、亜鉛等の金属や、ハイドロサルファイトナトリウム等の還元性無機塩、スクロース、トレハロース、ラクトース、およびグルコース等の糖類、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）、コエンザイム－Ａ（ＣｏＡＳＨ）、Ｌ－システイン、還元型グルタチオン、およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）等のスルフヒドリル化合物、塩化ナトリウム、および塩化カリウム等の塩類、グリシン、レシチン、公知の還元剤、ならびにリン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、およびグッド緩衝剤などの緩衝剤からなる群より選択される少なくとも一種などが挙げられる。
　検査試験紙における第１の試薬安定剤の含有量は、使用する試薬安定剤の種類に依存するが、第１の試薬成分の全含有量に対して０．００１～０．１質量％が好ましい。かかる範囲であれば、試薬成分の劣化を防止するにすることができるため、本発明に係る検査試験紙の構成との相乗効果を奏する。
　（増粘剤）
　本発明に係る第１の増粘剤としては、例えばゲル状物質、高粘度物質、または半固形状物質が挙げられ、より具体的には、ポリグルタミン酸およびそのナトリウム塩、カルボキシメチルセルロース、κまたはιカラギーナンと二価の金属イオン、プロピレングリコール、寒天、ゼラチン、ペクチン、グアーガム、ローカストビーンガム、コンニャクマンナン、キサンタンガムなど公知の増粘剤（金属イオンを含む）が挙げられる。
　検査試験紙における第１の増粘剤の含有量は、使用する増粘剤の種類に依存するが、第１の試薬成分の全含有量に対して０質量％を超えて５０質量％以下が好ましい。かかる範囲であれば、検体の浸透を容易にすることができ、特に検体として血液を用いた場合に血球の分離能が高くなるため好ましい。
　［第１の試薬領域の好ましい形態］
　本発明に係る第１の試薬領域は、後述する第２の試薬領域より多孔質膜の膜厚方向の一方の面側（多孔質膜の第１の面側）に形成されていることが好ましい。そのため、検査試験紙全体からみると、検査試験紙本体である多孔質膜の第１の面側に、第１の酵素やそれ以外の第１の試薬成分が偏って分布したものであることが好ましい。
　すなわち、当該検査試験紙の表面（多孔質膜の第１の面）から検査試験紙の膜厚方向内方に向かって、検査試験紙の膜厚の１０～８０％までの領域に、第１の試薬領域が形成されていることがより好ましい。
　より詳細には、本発明に係る検査試験紙において、当該検査試験紙の第１の面（多孔質膜の第１の面に対応する）である表面から膜厚５０％までの領域に前記第１の酵素の全量の７０～１００質量％が偏在していることが、光学測定や反応効率の観点で好ましい。
　これにより、例えば、本発明に係る検査試験紙を複数の酵素と検体との反応を利用する検体測定に利用する場合、第１の面側から検体を点着させると、検体が第２の試薬成分（第２の酵素を含む）よりも第１の試薬成分（第１の酵素も含む）と先に接触する確率が高くなるため、効率的な反応を期待することができ、酵素の量を低減することができると考えられる。
　また、本発明に係る第１の試薬領域は、第２の試薬領域と重複するように配置されていることが好ましく、当該第１の試薬成分は、第２の試薬成分が含まれる領域の全領域（すなわち第２の試薬領域の全体）と重複するように配置されていることがより好ましい。
　また、本発明に係る第１の酵素を含む第１の試薬成分が、多孔質膜の一方の面側（第１の面側）において当該多孔質膜内壁に直接担持された形態が好ましい。
　これにより、多孔質の空孔を完全に遮断することがないため、検体の展開が迅速に行われると考えられる。
　「第２の試薬領域」
　本発明に係る検査試験紙は、第２の酵素を含む第２の試薬成分を有する第２の試薬領域を有することを必須の構成要素とするものであり、当該検査試験紙の基体である多孔質膜内に第２の試薬領域が形成されている。本発明に係る第２の試薬領域の第２の試薬成分が配置される平均厚みは、２０～１００ｎｍであることが好ましく、４０～８０ｎｍであることがさらに好ましい。
　また、第２の試薬領域は、第１の試薬領域と重複する膜厚方向の領域を有してよい。
　以下、本発明に係る第２の試薬成分について説明する。
　［第２の試薬成分］
　本発明に係る検査試験紙は、第２の試薬成分を必須の構成要素とするものであり、前記第２の試薬成分は第２の酵素を必須に含み、必要により第２の発色成分、第２の親水化剤、第２の親水性物質、第２の試薬安定剤および第２の増粘剤からなる群から選択される少なくとも１種を含んでもよい。また、本発明に係る検査試験紙を比色分析による血糖値測定に用いる場合、第２の試薬成分には、第２の酵素と、第２の増粘剤とを含み、必要により第２の発色成分、第２の親水化剤、第２の親水性物質、および第２の試薬安定剤からなる群から選択される少なくとも１種を含むことがより好ましい。
　（第２の酵素）
　本発明に係る第２の酵素は、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、ヘキソキナーゼ（ＨＸ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、乳酸デヒドロゲナーゼ、ムタロターゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、およびコレステロールオキシダーゼからなる群から選択される少なくとも一つであることが好ましく、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）であることがより好ましい。なお、これらの酵素は、単独で使用しても２種以上組み合わせて使用してもよい。
　また、本発明に係る検査試験紙を比色分析による血糖値測定に用いる場合は、前記第２の酵素としては、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、ヘキソキナーゼ（ＨＸ）、ムタロターゼであることがより好ましい。
　本発明に係る第２の酵素の含有量は、検査試験紙の単位面積当たり１Ｕ／ｃｍ２以上であることが好ましく、１～５０Ｕ／ｃｍ２がより好ましく、１０～５０Ｕ／ｃｍ２がさらに好ましい。１Ｕ／ｃｍ２以上の範囲であると基質の処理速度の観点で好ましい。
　（増粘剤）
　本発明に係る第２の試薬成分に含まれる第２の増粘剤は、ゲル状物質、高粘度物質、または半固形状物質が挙げられ、具体的には、ポリグルタミン酸およびそのナトリウム塩、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸およびそのナトリウム塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルギニン酸、κまたはιカラギーナンと二価の金属イオン、プロピレングリコール、寒天、ゼラチン、ペクチン、グアーガム、ローカストビーンガム、コンニャクマンナン、キサンタンガムなど公知の増粘剤（金属イオンを含む）が挙げられ、ポリグルタミン酸およびそのナトリウム塩、ポリアクリル酸およびそのナトリウム塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルギニン酸、カルボキシメチルセルロース、κまたはιカラギーナンと二価の金属イオン、およびプロピレングリコールが好ましく、ポリグルタミン酸、およびそのナトリウム塩がより好ましい。
　検査試験紙における第２の増粘剤の含有量は、使用する増粘剤の種類に依存するが、第２の試薬成分の全含有量に対して５質量％以上１００質量％未満が好ましく、１０～９０質量％がより好ましく、２０～７０質量％がさらに好ましく、３０～５０質量％が特に好ましい。かかる範囲であれば、検体の浸透を容易にすることができ、特に検体として血液を用いた場合に血球の分離能が高くなるため好ましい。
　（第２の試薬成分における他の任意成分）
　本発明に係る第２の試薬成分に含まれる第２の発色成分、第２の親水化剤、第２の親水性物質、および第２の試薬安定剤は、上記第１の試薬成分に含まれる物質と同一の物質であるので、物質名は省略する。この場合、第２の発色成分、第２の親水化剤、第２の親水性物質、および第２の試薬安定剤と、第１の発色成分、第１の親水化剤、第１の親水性物質、および第１の試薬安定剤とはそれぞれ同一であっても異なってもよい。
　検査試験紙における第２の発色成分の含有量は、第２の試薬成分の全含有量に対して２０～４０質量％が好ましく、第２の親水化剤の含有量は、第２の試薬成分の全含有量に対して５質量％を超えて１００質量％未満が好ましく、１０～９０質量％がより好ましく、第２の親水性物質の含有量は、第２の試薬成分の全含有量に対して５質量％を超えて１００質量％未満が好ましく、１０～９０質量％がより好ましく、第２の試薬安定剤の含有量は、第２の試薬成分の全含有量に対して０．００１～０．１質量％が好ましい。
　［第２の試薬領域の好ましい形態］
　本発明に係る第２の試薬領域の好ましい形態は、多孔質膜の膜厚方向の他方の面側（多孔質膜の第２の面側）に形成されていることが好ましい。そのため、検査試験紙全体からみると、検査試験紙本体である多孔質膜の第２の面側に、第２の酵素やそれ以外の第２の試薬成分が偏って分布したものであることが好ましい。
　すなわち、当該検査試験紙の表面（多孔質膜の第２の面）から検査試験紙の膜厚方向内方に向かって、検査試験紙の膜厚の１０～７０％までの領域に第２の試薬領域が形成されていることがより好ましい。
　より詳細には、本発明に係る検査試験紙において、当該検査試験紙の第２の面（多孔質膜の第２の面に対応する）である表面から膜厚６０％までの領域に前記第２の酵素の全量の７０～１００質量％が偏在していることが、光学測定や反応効率の観点で好ましい。
　これにより、例えば、本発明に係る検査試験紙を複数の酵素と検体との反応を利用する検体測定に利用する場合、第２の面側から検体を点着させると、検体と第２の試薬成分（第２の酵素も含む）とが最初に接触する確率が高くなるため、効率的な反応を期待することができ、酵素の量を低減することができると考えられる。
　その他としては、例えば、本発明に係る検査試験紙を比色式血糖値の測定に使用する場合、前記第２の酵素としてペルオキシターゼ（ＰＯＤ）を、前記第１の酵素を含む試薬成分としてグルコースオキシダーゼおよび発色成分を選択すると、グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼのいわゆる（ＧＯＤ／ＰＯＤ）法を利用する血糖値測定用の検査試験紙に利用することができる。すなわち、ＧＯＤの作用でグルコースが過酸化水素とグルコン酸を生成し、ＰＯＤの作用で検査試験紙中の発色成分と反応し、例えばキノン色素が生成されることによりこのキノン色素を測定することで比色定量することができる。
　また、本発明に係る第２の試薬領域は、上記の第１の試薬領域と同様に、第２の酵素を含む第２の試薬成分が、多孔質膜の他方の面側（第２の面側）において当該多孔質膜に担持された形態が好ましい。
　これにより、多孔質の空孔を完全に遮断することがないため、検体の展開が迅速に行われると考えられる。
　「多孔質膜」
　本発明に係る検査試験紙は、多孔質膜を必須の要件とするものであり、当該多孔質膜は検査試験紙の形状を維持できる支持体としての強度を有し、試薬成分を検査試験紙の第１の面（測定面）にしみ出すように多孔を有するものであれば特に制限されることはないが、以下の特性を示すことが好ましい。また、本明細書では、多孔質膜の一方の面を第１の面、他方の面を第２の面としている。
　さらに、上述したように、本発明に係る第１の試薬領域、第２の試薬領域はそれぞれ多孔質膜内厚み方向において偏在化して形成されていることが好ましく、検査試験紙において第２の試薬領域が形成している側を第２の面側とし、その反対側を第１の面側としている。またこの場合、前記第２の面側から検体を点着し、かつ前記第１の面側から検体量を測定することが好ましい。
　本発明に係る多孔質膜の材料としては有機高分子からなることが好ましく、当該有機高分子としては、例えば、ニトロセルロース、ポリビニルジフロライド、セルロースアセテート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリプロピレンなどが好ましく挙げられ、より好ましくはポリエーテルスルホンである。これらの樹脂を用いると多孔質基材に透水性および支持体としての強度を付与しつつ、多孔質膜を薄膜化でき、少ない検体量で迅速に測定できるため好ましく、ポリエーテルスルホンを用いると、特に血糖値を測定するために用いられる呈色試薬に対して効果的である。
　本発明に係る多孔質膜の厚みは５０～２００μｍが好ましく、より好ましくは５０～１３０μｍである。５０μｍよりも薄いと支持体としての強度を保つことができないおそれがあり、２００μｍを超えると必要以上に検体量が多くなってしまう虞がある。厚みは乾燥状態で測定し、厚みの測定にはマイクロメーターが好ましく用いられる。
　また、本発明に係る多孔質膜は、一方の表面の孔径と、他方の表面の孔径とが同一でも異なってもよいが、一方の表面の孔径と、他方の表面の孔径とが異なることがより好ましい。さらに、本発明に係る多孔質膜において一方の表面の孔径と、他方の表面の孔径とが異なる場合、孔径が大きい側の表面から孔径が小さい側の表面に向かって、孔径に勾配があることがより好ましい。また、本発明に係る検査試験紙本体が孔径の大きさに勾配がある異方性の多孔質膜である場合は、当該多孔質膜の表面の孔径が小さい側には、当該検査試験紙の第１の面（多孔質膜の第１の面側）、かつ当該多孔質膜の表面の孔径が大きい側には当該検査試験紙の第２の面（多孔質膜の第２の面側）が対応するように配置されることが好ましい。
　また、本発明に係る検査試験紙本体である多孔質膜が、孔径の大きさに勾配がある異方性の多孔質膜の場合は、多孔質膜の表面の孔径が小さい側を測定面、多孔質膜の表面の孔径が大きい側を検体の点着面とすることが好ましい。これにより、本発明に係る検査試験紙は血球などの濾別機能を有することができる。
　なお、本発明に係る多孔質膜の一方の表面の孔径と、他方の表面の孔径とが異なる場合、両表面における孔径の差は、０．４～７μｍが好ましく、０．５～２μｍがより好ましい。
　これにより、支持体としての強度を保ちつつ血球など測定に不要な成分の濾別機能を有することができる。
　本発明に係る多孔質膜全体の平均孔径は０．１～１０μｍが好ましく、より好ましくは０．３～３μｍである。０．１μｍよりも小さいと検出物の浸透に時間がかかり測定時間が長くなるおそれがあり、１０μｍよりも大きいと孔の部分で検査試験紙の支持体としての機能を発揮できない場合がある。本発明の平均孔径の測定にはパームポロメーター（ＡＳＴＭＦ３１６－８６、ＪＩＳ　Ｋ３８３２）を用いている。
　本発明に係る多孔質膜全体の空孔率は６０～９５％が好ましく、より好ましくは７０～８５％である。６０％よりも小さいと検出物の浸透に時間がかかり測定時間が長くなるおそれがあり、９５％を超えると支持体としての強度を保つことができないおそれがある。本発明の空孔率の測定には水銀ポロシメーターを用いている。
　本発明に係る多孔質膜は、厚みが５０～２００μｍであり、平均孔径が０．１～１０μｍであり、空孔率が６０～９５％であることが好ましく、より好ましくは厚みが５０～１３０μｍであり、平均孔径が０．３～３μｍであり、空孔率が７０～８５％である。
　また、前記多孔質膜は、後述の親水化剤を担持させる、親水性を有する膜材質から構成する、もしくは親水化処理を行う等の手法により、親水性を有することが、検体の供給、展開させる時間を短縮することができるという理由から好ましい。
　当該親水化処理としては、具体的には、プラズマ処理、グロー放電、コロナ放電、紫外線照射等の処理方法が好適に例示される。
　（多孔質膜を製造する方法）
　本発明に係る多孔質膜を製造する方法は、特に制限されることはなく、好ましくは厚みが５０～２００μｍ、平均孔径が０．１～１０μｍ、空孔率が６０～９５％である多孔質膜を製造する公知の方法が採用され、湿式製膜が好適に例示される。湿式製膜の他には、溶融製膜、乾式製膜等が知られているが、一方の表面の孔径が反対側の表面の孔径と異なる異方性膜を製造する場合、湿式製膜により製造することが好ましい。
　上記湿式製膜は、製膜原液を基材上に膜状に広げる製膜原液供給工程と、該製膜原液供給工程後の基材を凝固浴に浸漬させる凝固浴浸漬工程と、該凝固浴浸漬工程後の基材に含まれる溶剤成分および／または水溶性添加剤成分を水浴中で除去する洗浄工程と、該洗浄工程後の基材を乾燥させる乾燥工程とを具備することが好ましい。
　上記製膜原液供給工程は、製膜原液を基材上に膜状に塗布する工程であり、具体的には、製膜原液を、基材の表面に、キャスト厚調整可能なアプリケータを用いて押し広げる、もしくは塗り広げる、もしくはＴ－ダイから吐出する工程である。
　上記製膜原液としては、膜成分となる非水溶性第１成分ポリマーと被抽出成分である水溶性第２成分とを含み、非水溶性第１成分ポリマーの濃度が１２～１５ｗｔ％のものが好ましい。非水溶性第１成分ポリマーと水溶性第２成分とを含んでいれば、ポリマーの凝集を抑制し、これらの成分を抽出除去したあとの空間に孔が形成され空孔率を向上させることができるため好ましい。
　上記非水溶性第１成分ポリマーとしては、具体的には、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン、セルロースアセテート、ポリスルホン、ポリエチレン、ポリエーテルスルホン等が挙げられる。これらのうち、ポリエーテルスルホンであることが、上述したように、血糖値測定に使用する試薬を担持する場合に試薬活性の経時的劣化が最も少ない理由から好ましい。
　上記水溶性第２成分としては、具体的には、後述する溶媒には溶解し、後述する凝固浴浸漬工程後に容易に抽出除去できるポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース等が挙げられる。これらのうち、ポリビニルピロリドンは、ニトロセルロース、ポリビニルジフロライド、セルロースアセテート、ポリスルホン、ポリエチレン、ポリエーテルスルホンなどの前記非水溶性第１成分ポリマーは溶解せず、極性溶媒に溶解し、凝固後には水により抽出除去できるといった特性を有するため好ましい。
　非水溶性第１成分ポリマーと水溶性第２成分との溶解を目的とする製膜原液の溶媒としては、具体的には、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド等の有機極性溶媒が挙げられ、Ｎ－メチル－２－ピロリドンであることが好ましい。
　製膜原液において、上記非水溶性第１成分ポリマーと上記水溶性第２成分との仕込み比(質量比)は、１：１～１：３であることが好ましい。仕込み比がこの範囲であると、小孔部からなる第２の層が、多孔質膜において膜厚の半分以上の部分を占め、空孔率を保ち、さらに検体のしみ出しを妨げない理由から好ましい。
　なお、上記製膜原液が基材上に塗布される時に調整されるキャスト厚は、７０～２６０μｍであることが、得られる多孔質膜の膜厚が上述した好適範囲に収まる理由から好ましい。
　上記基材は、従来公知のものを用いることができ、上記製膜原液を塗布する面に凸凹の表面を有する基材であることが好ましい。このような基材としては、具体的には、光沢度が１２以下である板ガラス、光沢度１２以下のマットフィルム、ポリエチレンテレフタレート製の光沢度が１２以下である艶消しフィルム（例えば、光沢度１２以下のマットフィルム）をコートした板ガラス等が、得られる多孔質膜の第２の層の表面に該基材の凸凹が転写されることになるため好適に例示される。ここで光沢度は、ＪＩＳ　Ｚ８７４１に準拠する。
　上記凝固浴浸漬工程は、上記製膜原液供給工程後の基材を水を含有する凝固浴に浸漬させる工程であり、具体的には、上記製膜原液が塗布された基材を凝固浴に浸漬させて、上記非水溶性第１成分ポリマーを該基材上に析出させる工程である。
　凝固浴としては、６０～８５ｗ／ｗ％、好ましくは７０～８０ｗ／ｗ％の上記製膜原液の溶媒を含有する水系凝固浴が好適に例示され、具体的には、Ｎ－メチル－２－ピロリドンを６０～８５ｗ／ｗ％含有する水溶液であることが好ましい。溶媒の含有率がこの範囲であれば、上記非水溶性第１成分ポリマーの緩慢な凝固が実現し、多孔質構造の膜が形成される。また、凝固浴中の製膜原液の溶媒の濃度が６０ｗ／ｗ％を下回ると、上述した製膜原液の溶媒の添加効果が得られず、８５ｗ／ｗ％を越えると膜が凝固しない。
　また、上記凝固浴への基材の浸漬は、該凝固浴の温度が１０～５０℃、好ましくは２０～４０℃で、３～２０分間、好ましくは５～１０分間浸漬させることが好ましい。凝固浴の温度がこの範囲であれば、非水溶性第１成分ポリマーの析出速度が適当となり多孔質構造の膜が形成される。また、浸漬させる時間が３分より短いと非水溶性第１成分ポリマーが全て析出しないため膜が形成されず、時間が２０分より長いと膜構造は変化せず生産効率が低下してしまう。
　上記洗浄工程は、上記凝固浴浸漬工程後の基材に含まれる溶剤成分および／または水溶性添加剤成分を水浴中で除去する工程であり、具体的には、非水溶性第１成分ポリマーが析出されて形成される膜（以下、単に「第１成分ポリマーからなる膜」という）を、水浴中に１０～１０００分間、好ましくは１５～６０分間浸漬させることで、上記溶剤成分および／または上記水溶性添加剤成分（例えば、上記溶媒、上記水溶性第２成分）等を抽出除去する工程である。
　上記乾燥工程は、上記洗浄工程後の第１成分ポリマーからなる膜を乾燥させる工程であり、具体的には、自然乾燥や電気オーブン等を用いて、３０～１００℃、好ましくは４０～８０℃で、１分～２４時間、好ましくは１分～２時間乾燥させる方法が例示される。
　このような製造方法により製造される多孔質膜は、異方性の多孔質膜として、検体が供給される表面を有し膜断面に観察される比較的大きい孔径をする第１の層と、該検体がしみ出し測定される表面を有し膜断面に観察される比較的小さい孔径を有する第２の層とを有し、該第１の層と該第２の層との境界が、該第１の層の表面から上記多孔質膜の膜厚の１／５乃至１／２までの範囲にあるため有用である。
　＜本発明に係る検査試験紙＞
　本発明に係る検査試験紙の好ましい実施形態を以下説明する。本発明に係る検査試験紙の好適な実施形態は、対象とする検体によって適宜選択されるものであるが、以下例示として比色式の血糖値測定検査に使用する一例を説明する。一般に、比色式の血糖値測定検査は、比色分析に影響を及ぼす赤血球を検査試験紙の片面で濾別することで除去し、かつ血液中のグルコース量に応じて呈色する検査試験紙の呈色の度合いを反対側の面から光を照射しその反射光の強度をセンサーで測定することにより行われている。
　そのため、本発明に係る検査試験紙を比色式の血糖値測定検査に使用する形態おいて、本発明に係る検査試験紙は、第１の酵素としてグルコースオキシダーゼと、発色成分と、必要により親水化剤、親水性物質、および試薬安定剤からなる群から選択される少なくとも１種とを含む第１の試薬成分、第２の酵素としてペルオキシダーゼと、増粘剤とを含む第２の試薬成分、ならびに第１の面および第２の面を有する多孔質膜を有し、前記第１の試薬成分および前記第２の試薬成分がそれぞれ前記多孔質膜内に層状に担持され形成されていることが好ましい。すなわち、前記第１の試薬成分からなる第１の試薬領域と、前記第２の試薬成分からなる第２の試薬領域とが前記多孔質膜内で積層されている構造であることが好ましい。また、前記第２の試薬領域は多孔質膜の第２の面側に形成されており、前記第１の試薬領域は、前記第２の試薬領域より第１の面側に位置し、かつ前記第２の試薬領域を覆うように形成されていることが好ましい。
　すなわち、上記本発明に係る検査試験紙１の実施形態について図１を用いて説明すると、検査試験紙１の本体である多孔質膜４内に、第２の試薬領域２が血液を点着する第２の面６の表面近傍に偏在しており、第１の試薬領域３が第１の面５側に形成されている。　このように、２つの酵素の層を多孔質膜に形成することにより測定感度が増大する。すなわち、血液中にはＨ２Ｏ２と反応性の高いカタラーゼ（ＣＡＴ）が存在するため、グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼのいわゆる（ＧＯＤ／ＰＯＤ）法を利用する血糖値測定用の検査試験紙の場合は、グルコースオキシダーゼにより発生したＨ２Ｏ２がＣＡＴに奪われるとＰＯＤと反応するＨ２Ｏ２が減少するため測定感度が低下するという問題がある。しかし、図１に示すように、血液の点着面側にグルコースオキシダーゼより溶解度が低いペルオキシダーゼを配置し、光を照射する測定面側にグルコースオキシダーゼおよび発色成分を配置するといった、試験紙の厚み方向にグルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを偏在化させることにより、血液は溶解度が低いペルオキシダーゼと先に接触した後にグルコースオキシダーゼと接触するため、ペルオキシダーゼが溶解する時間を稼ぐことができる。これにより、グルコースオキシダーゼの作用で生成したＨ２Ｏ２が血液中のＣＡＴに奪われにくくなるため、結果として効率的な反応を行うことができると考えられる。
　そのため、ペルオキシダーゼを含む第２の試薬成分が偏在して形成されている第２の面側を検体の点着面とし、かつグルコースオキシダーゼおよび発色成分を含む第１の試薬成分が偏在して形成されている第１の面側から検体量を測定することが好ましい。
　また、図１に示すように、本発明に係る第１の試薬成分は、第２の試薬成分の全面を重複して測定面側である第１の面側に形成されている。
　さらに、本発明に係る検査試験紙または多孔質膜は、上述した試薬およびその他の成分以外に、所望により電解質（例えば、リン酸塩、フタル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩）、有機物（例えば、グリシン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン）を担持していてもよい。
　本発明の検査試験紙は、検体中の特定成分の測定装置に脱着可能なチップに組み込んだり、あるいは測定装置自体に挿入して使用することが好ましい。測定装置としては、血液中の血糖、コレステロール、および中性脂肪、ならびに尿中の糖分、蛋白および潜血などを、定量的あるいは定性的に測定する装置が挙げられる。
　以下、本発明に係る検査試験紙の製造方法について説明する。
　＜本発明に係る検査試験紙の製造方法＞
　本発明の第二は、第１の酵素を含む第１の試薬成分を溶媒に添加して第１の試薬成分溶液を調製する工程（１）と、第２の酵素を含む第２の試薬成分を溶媒に添加して第２の試薬成分溶液を調製する工程（２）と、多孔質膜の一方の面から第１の試薬成分溶液を塗布し乾燥する工程（３）と、前記一方の面から第２の試薬成分溶液を塗布し乾燥する工程（４）と、を有する検査試験紙の製造方法であって、前記第２の試薬成分溶液の粘度が第１の試薬成分溶液の粘度より高いことを特徴とする、検査試験紙の製造方法である。
　粘度の異なる試薬成分を含有する溶液を利用することで、物質の移動度をコントロールして多孔質膜内に第１の試薬領域および第２の試薬領域を互いに異なる分布状態で形成することができる。
　また、前記本発明に係る検査試験紙の製造方法における工程（３）および工程（４）の順序は、工程（３）の後工程（４）を行っても、工程（４）の後工程（３）を行っても、または工程（３）と工程（４）をと同時に行ってもよく、所望する第１の試薬成分および第２の試薬成分の濃度分布によって適宜選択されるが、工程（３）後工程（４）を行う工程（５）：多孔質膜の一方の面から第１の試薬成分溶液を塗布し乾燥させた後、第２の試薬成分溶液を塗布し乾燥することが好ましい。
　すなわち、本発明に係る検査試験紙の好ましい製造方法は、第１の酵素を含む第１の試薬成分を溶媒に添加して第１の試薬成分溶液を調製する工程（１）と、第２の酵素を含む第２の試薬成分を溶媒に添加して第２の試薬成分溶液を調製する工程（２）と、多孔質膜の一方の面から第１の試薬成分溶液を塗布し乾燥させた後、第２の試薬成分溶液を塗布し乾燥する工程（５）と、を有する検査試験紙の製造方法であって、前記第２の試薬成分溶液の粘度が第１の試薬成分溶液の粘度より高いことを特徴とする。
　粘度の異なる試薬成分を含有する溶液を利用することで、物質の移動度をコントロールして多孔質膜内に一方の面には第１の試薬成分が多く偏在し、かつ他方の面には第２の試薬成分が多く偏在する（いわゆる二層状）の試薬成分を形成することができる。以下、各工程について説明する。
　［工程（１）］
　本発明に係る検査試験紙の製造方法における工程（１）は、第１の酵素を含む第１の試薬成分を溶媒に添加して第１の試薬成分溶液を調製するものである。
　具体的には、第１の試薬成分として、第１の酵素が１０～５０質量％、発色成分が１～１０質量％、親水化剤が１～３０質量％、親水性物質が０．１～１０質量％、および試薬安定剤が０．０００１～０．１質量％になるように、それぞれを溶媒に添加して第１の試薬成分溶液を調製することが好ましい。
　当該溶媒としては、水、緩衝溶液（炭酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＴＲＩＳバッファー、クエン酸バッファー、コハク酸バッファーなど）、メタノール、エタノール、プロパノールなどの低級アルコールなどが挙げられる。また、溶媒として緩衝溶液を使用する場合、イオン強度を調節するため適宜公知の塩（水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）を添加してもよい。
　当該第１の試薬成分溶液のｐＨは、２５℃において、５～８であることが好ましい。
　また、第１の試薬成分溶液の粘度は、第２の試薬成分溶液の粘度より低く、具体的には、２５℃において、１～５ｍＰａ・ｓであることが好ましく、１～３ｍＰａ・ｓであることがさらに好ましい。
　［工程（２）］
　本発明に係る検査試験紙の製造方法における工程（２）は、第２の酵素を含む第２の試薬成分を溶媒に添加して第２の試薬成分溶液を調製するものである。
　第２の試薬成分として、第２の酵素が１～３０質量％、増粘剤が１０～５０質量％、親水化剤が０～３０質量％、親水性物質が０～１０質量％、および試薬安定剤が０～０．１質量％になるように、それぞれを溶媒に添加して第２の試薬成分溶液を調製することが好ましい。
　当該溶媒としては、上記の第１の試薬成分溶液と同一の溶媒であるため、ここでは省略する。なお、工程（１）および（２）の順序はいずれが先でもよい。
　当該第２の試薬成分溶液のｐＨは、２５℃において、５～８であることが好ましい。
　また、第２の試薬成分溶液の粘度は、第１の試薬成分溶液の粘度より高く、その差が５～２００ｍＰａ・ｓ程度あれば多孔質膜内に２層の試薬領域を形成することができ、具体的には、２５℃において、好ましくは、１０～２３２ｍＰａ・ｓ、より好ましくは、１６～１５４ｍＰａ・ｓ、更に好ましくは、６４～１０９ｍＰａ・ｓである。
　当該第２の試薬成分溶液の粘度が１０～２３２ｍＰａ・ｓの範囲であると、ある程度の流動性を備えるため、多孔質膜内に第２の試薬領域である第２の試薬成分を有する第２の層および第１の試薬領域である第１の試薬成分を有する第１の層を積層して形成することができる。
　［工程（３）］
　本発明に係る検査試験紙の製造方法における工程（３）は、多孔質膜の一方の面から第１の試薬成分溶液を塗布し乾燥する工程（３）である。
　第１の試薬成分溶液を多孔質膜に塗布する方法としては特に制限されず、公知の塗布方法を採用することができ、例えば、含浸法、スプレーコーティング、ローラーコーティング、はけ塗り方法、グラビア印刷法、ダイレクトグラビア印刷法、インクジェット法、スピンコーティング、デッピングの後高速回転による塗布方法が挙げられる。
　例えば、第１の試薬領域が多孔質膜の膜厚方向に対して濃度勾配を有し、かつ第１の試薬成分と第２の試薬成分とがいわゆる層状に形成しない場合は、インクジェット法などにより第１の試薬成分溶液を滴下する滴下スピードを調整する方法や、本工程（３）および後述する工程（４）を同時に行うことで、多孔質膜の膜厚方向における第１の試薬領域の濃度勾配やその量をコントロールすることができる。
　すなわち、粘度の異なる試薬成分や互いに異なる溶媒を含有する第１の試薬成分溶液および第２の試薬成分溶液を利用することで、それぞれの物質の移動度をコントロールすることができるため、互いに混合する状態を抑制することができると考えられる。
　また、多孔質膜内の一方の面側には第１の試薬成分が、他方の面側には第２の試薬成分が多く偏在し、かつ膜厚方向に第１の試薬領域および第２の試薬領域が重なって形成された検査試験紙を製造する場合は、後述の工程（５）が好ましい。
　［工程（４）］
　本発明に係る検査試験紙の製造方法における工程（４）は、前記一方の面から第２の試薬成分溶液を塗布し乾燥する工程（４）である。
　第２の試薬成分溶液を多孔質膜に塗布する方法としては、上記工程（３）と同様の方法を採用することができる。
　［工程（５）］
　本発明に係る検査試験紙の好ましい製造方法における工程（５）は、多孔質膜の一方の面から第１の試薬成分溶液を塗布し乾燥させた後、第２の試薬成分溶液を塗布し乾燥するものである。
　第１の試薬成分溶液を多孔質膜の一方の面から塗布し乾燥させた後、当該多孔質膜に第２の試薬成分溶液を塗布する際に、前記第１の試薬成分溶液を塗布した面側から第２の試薬成分溶液を塗布しても、または他方の面側から第２の試薬成分溶液を塗布してもよいが、多孔質膜として、上記で説明したように、孔径勾配を有する異方性の多孔質膜を使用する場合、孔径が大きい表面側から第１の試薬成分溶液を塗布し乾燥させた後、さらにその上に孔径が大きい表面側から第２の試薬成分溶液を塗布することが好ましい。
　このように、異方性多孔質膜を使用すると、毛管現象により容易に多孔質膜内に試薬を分散させることができる。
　第１の試薬成分溶液および第２の試薬成分溶液を多孔質膜に塗布する方法としては特に制限されず、公知の塗布方法を採用することができ、例えば、含浸法、スプレーコーティング、ローラーコーティング、はけ塗り方法、グラビア印刷法、ダイレクトグラビア印刷法、インクジェット法、スピンコーティング、デッピングの後高速回転による塗布方法が挙げられる。
　第１の試薬成分溶液を塗布した後、２０～４０℃で０．１５～１時間乾燥することが好ましく、２５～３７℃で０．２５～０．５時間乾燥することがより好ましい。
　また、第２の試薬成分溶液は、第１の試薬成分溶液を塗布した後０．２５～０．５時間経過後、塗布することが好ましい。また、第２の試薬成分溶液を塗布した後、２０～４０℃で０．１５～１時間乾燥することが好ましく、２５～３７℃で０．２５～０．５時間乾燥することがより好ましい。
　以下、本発明の具体例を以下の実施例に示すが、本発明の範囲はこれらに限定されることはない。
　「検査試験紙の製造」
　（第１試薬成分含有混合溶液の調製）
　グルコースオキシダーゼ０．５５ｇ、４－アミノアンチピリン０．０１６ｇ、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン０．０２６ｇ、およびトリトンＸ０．１ｇをそれぞれ秤量し、混合した後、３３７．５ｍＭのコハク酸バッファー（ｐＨ＝５．０）１ｍＬに溶解して第１試薬成分含有混合溶液を調製した（５．０ｍＰａ・ｓ）。
　（第２試薬成分含有塗布液の調製）
　ペルオキシダーゼ０．４３ｇ、およびポリグルタミン酸０．０３ｇをそれぞれ秤量し、混合した後、３３７．５ｍＭのコハク酸バッファー（ｐＨ＝５．０）１ｍＬに溶解して第２試薬成分含有混合溶液を調製した（１０８．８ｍＰａ・ｓ）。
　（検査試験紙の製造）
　ＷＯ２００４／０８６０３７号の実施例１～７に記載の方法で製造した異方性を有する多孔質のＰＥＳ膜（ＷＯ２００４／０８６０３７号の実施例３のＰＥＳ膜　厚さ１３０μｍ）を１５ｃｍ×９．５ｃｍの大きさに切り取り、図３　Ａに示す板状ダイレクトグラビア印刷装置のゴムローラ表面に当該多孔質のＰＥＳ膜８を巻回した（図３　Ａ参照）。この際、異方性を有する多孔質１１のＰＥＳ膜８（以下、異方性多孔質膜と称する）において、当該膜の孔径が小さい面とローラー面とが当接するように粘着テープで貼り付けることにより固定した。すなわち、図３　Ａに示すように、異方性多孔質膜の孔径が大きい面側が外側に向いた状態になるようにゴムローラ表面に巻回した。
　なお、前記板状ダイレクトグラビア印刷装置は、図３　Ａに示すように、平坦な面を有する台座と、ゴムローラ９とが取り付けられており、ゴムローラの回転により当該ゴムローラと台座とが圧着することで、ゴムローラ９が直線状に回転自在な構造となっている。本実施例では、当該ゴムローラ９を圧胴とし、かつ凹凸構造を有する板状の基板（グラビア）７を版胴として使用している。
　次いで、版胴である板状グラビア７（メッシュ容量：使用する多孔膜の単位面積当たりの空孔容量より少ない２．２６μＬ／ｃｍ２）を、板状ダイレクトグラビア印刷装置の台座上に設置した後、当該グラビア７のメッシュ（またはセル）内に第１試薬成分含有混合溶液１０をまんべんなく充填し、ゴムローラを板状グラビア上で回転させることでメッシュ内の第１試薬成分含有混合溶液１０をゴムローラ９に巻回した異方性多孔質膜８上に転写した。その後、第１試薬成分含有混合溶液１０が表面に転写された異方性多孔質膜を取り外して、３７℃で０．５時間放置することにより当該膜を乾燥した。
　その後、第１試薬成分含有塗布液をコートし乾燥させた異方性多孔質膜を、上記と同様に孔径の大きな面を上にして圧胴であるゴムローラに巻回し、版胴である板状グラビア（メッシュ容量：第１試薬成分含有混合液の塗付に使用したものよりも少ない１．５３μＬ／ｃｍ２）を台座上に設置した後、当該グラビアのセル内に第２試薬成分含有混合溶液をまんべんなく充填し、ゴムローラを板状グラビア上で回転させることでセル内の第２試薬成分含有混合溶液を、既に第１試薬成分含有塗布液をコートし乾燥させた異方性多孔質膜に転写した。その後、第２試薬成分含有混合溶液が表面に転写された異方性多孔質膜を取り外して、３７℃で０．５時間放置することにより当該膜を乾燥し、さらに第１試薬成分含有混合溶液および第２試薬成分含有混合溶液をコート乾燥した異方性多孔質膜をシリカゲルと共にデシケーターに入れ３７℃で１８時間乾燥して本発明に係る試験紙を得た。また、乾燥した膜の状態を示す模式図が図３　Ｂである。
　「検査試験紙の評価」
　（サンプルの作製）
　検査試験紙の評価に使用する試験紙切片の作製は大和光機工業株式会社製のミクロトーム（リトラームＲＥＭ－７００）を使用し作製した。
　すなわち、試験紙を所定サイズ（Φ５．８ｍｍ）に切り出した後、木片をミクロトームに設置して次の工程で試験紙と密着する当たり面が平坦になるまで、当該木片をスライスした。そして、木片上の平坦な当たり面に、多孔質の孔径が小さい面を上になるよう試験紙を接着した後、厚さ２０μｍで試験紙をスライスした。なお、試験紙の厚さが、約１３０μｍであるため、２０μｍの切片を約６枚作成することができた。以下、この厚さ２０μｍでスライスした試験紙切片をサンプルと称する。
　（ＰＯＤ活性測定）
　〔発色試薬溶液の調製〕
　４－アミノアンチピリン２．０３ｇを１００ｍＬのＲＯ水に溶解してＣＰ２溶液を調製した。一方、ＭＡＯＳ　６．５４ｇを１Ｌのトリスバッファーに溶解してＭＡＯＳ溶液（ｐＨ８．０　１０ｍＭ）を調製した。その後、前記ＣＰ２溶液と前記ＭＡＯＳ溶液とを１：１００の体積割合で混合して発色試薬溶液を調製した。
　〔Ｈ２Ｏ２溶液の調製〕
　３０質量％のＨ２Ｏ２液（和光純薬）をＲＯ水で２０００倍希釈してＨ２Ｏ２溶液を調製した。
　〔サンプル溶液の調製〕
　上記厚さ２０μｍでスライスした６個のサンプルについて、それぞれ１個につき２ｍＬのトリスバッファーで抽出したサンプル抽出液を、ボルテックスミキサーで５分間攪拌を行い、上清をサンプル溶液として使用した。
　〔測定方法〕
　３ｍＬのセルに発色試薬溶液２ｍＬ、Ｈ２Ｏ２溶液１００μＬ、サンプル溶液１００μＬ添加し発色反応を行い（ブランク：２ｍＬの発色試薬溶液とＨ２Ｏ２溶液１００μＬ）、生成した色素の単位時間での増加量を分光光度計（６３０ｎｍ）にて１分間測定した。その結果を図２に示す。
　（ＧＯＤ活性測定）
　〔発色試薬溶液の調製〕
　４－アミノアンチピリン２．０３ｇを１００ｍＬのＲＯ水に溶解してＣＰ２溶液を調製した。また、ＭＡＯＳ　６．５４ｇ、およびＰＯＤ　０．２ｇを１Ｌのトリスバッファーに溶解してＭＡＯＳ－ＰＯＤ溶液（ｐＨ８．０　１０ｍＭ）を調製した。その後、前記ＣＰ２溶液と前記ＭＡＯＳ－ＰＯＤ溶液とを１：１００の体積割合で混合して発色試薬溶液を調製した。
　〔グルコース溶液の調製〕
　グルコース（Ｄ－グルコース）１５０ｍｇを１００ｍＬのＲＯ水に溶解し、グルコース溶液を調製した。
　〔サンプル溶液の調製〕
　上記厚さ２０μｍでスライスした６個のサンプルについて、それぞれ１個につき２ｍＬのトリスバッファーで抽出したサンプル抽出液を、ボルテックスミキサーで５分間攪拌を行い、上清をサンプル溶液として使用した。
　〔測定方法〕
　３ｍＬのセルに発色試薬溶液２ｍＬ、グルコース溶液１００μＬ、サンプル溶液１ｍＬ添加し発色反応を行い（ブランク：２ｍＬの発色試薬溶液とグルコース溶液１００μＬ）、生成した色素の単位時間での増加量を分光光度計（６３０ｎｍ）にて１分間測定した。その結果を図２に示す。
　図２に示すとおり、本発明にかかる検査試験紙は、ペルオキシダーゼを含む第２の試薬成分が第２の面側に偏在して形成され、かつグルコースオキシダーゼを含む第１の試薬成分が第１の面側に偏在して形成されている。
　第１試薬成分含有混合溶液が、板状グラビアから多孔質膜へ転写されると、第１試薬成分含有混合溶液の粘度が比較的小さいため、使用した多孔質膜の比較的孔径の小さな孔を有する第１の面側に吸収され、第１の試薬成分が第１の面側に偏って分布し、比較的粘度の大きい第２試薬成分含有混合溶液が、板状グラビアから多孔質膜へ転写されると、比較的孔径の小さな孔を有する第１の面側へは移動せず、第２の試薬成分は、転写面である第２の面側へ偏って分布したものと考えられる。
　粘度の異なる複数の試薬成分溶液を使用し、多孔質膜の細孔状態、試薬成分溶液の供給面を選択することにより、複数の試薬成分が偏在した試験紙を作製することが可能となった。
　なお、本出願は、２０１２年６月１４日に出願された日本国特許出願第２０１２－１３５１７２号に基づいており、その開示内容は、参照により全体として引用されている。
１　検査試験紙、
２　第２の試薬領域、
３　第１の試薬領域、
４　多孔質膜、
５　第１の面、
６　第２の面、
７　板状グラビア、
８　ＰＥＳ膜（異方性多孔質膜）、
９　ゴムローラ、
１０　第１試薬成分含有混合溶液、
１１　多孔質。

Claims (5)

  1. 　第１の面および第２の面を有する多孔質膜と、
    第１の酵素を有する第１の試薬成分を有する第１の試薬領域と、
    第２の酵素を有する第２の試薬成分を有する第２の試薬領域と、を備えた検査試験紙であって、
    前記第１の試薬領域および第２の試薬領域が前記多孔質膜の膜厚方向において異なる分布状態で前記多孔質膜内に形成されている、検査試験紙。
  2. 　前記第２の試薬領域は、前記多孔質膜の第２の面側に分布しており、
    前記第１の試薬領域は、前記第２の試薬領域より第１の面側に偏って分布している、請求項１に記載の検査試験紙。
  3. 　前記第２の面側から検体を点着し、かつ前記第１の面側から前記検体量を測定する、請求項１または２に記載の検査試験紙。
  4. 　前記第２の酵素は、ペルオキシダーゼであり、前記第１の酵素はグルコースオキシダーゼである、請求項１～３のいずれか１項に記載の検査試験紙。
  5. 　第１の酵素を含む第１の試薬成分を溶媒に添加して第１の試薬成分溶液を調製する工程と、第２の酵素を含む第２の試薬成分を溶媒に添加して第２の試薬成分溶液を調製する工程と、多孔質膜の一方の面から第１の試薬成分溶液を塗布し乾燥する工程と、前記一方の面から第２の試薬成分溶液を塗布し乾燥する工程と、を有する検査試験紙の製造方法であって、
    　前記第２の試薬成分溶液の粘度が第１の試薬成分溶液の粘度より高いことを特徴とする、検査試験紙の製造方法。
PCT/JP2013/065676 2012-06-14 2013-06-06 検査試験紙 WO2013187302A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014521289A JP6304819B2 (ja) 2012-06-14 2013-06-06 検査試験紙

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012-135172 2012-06-14
JP2012135172 2012-06-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013187302A1 true WO2013187302A1 (ja) 2013-12-19

Family

ID=49758127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/065676 WO2013187302A1 (ja) 2012-06-14 2013-06-06 検査試験紙

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP6304819B2 (ja)
WO (1) WO2013187302A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103966899A (zh) * 2014-05-07 2014-08-06 重庆锐今生物制品有限公司 一种成膜材料及配制方法及用该成膜材料成膜的带膜试纸

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06258319A (ja) * 1993-03-04 1994-09-16 L T T Kenkyusho:Kk 尿中オキシプリン検出用試験紙
JP2001330605A (ja) * 2000-03-17 2001-11-30 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd 試験紙
WO2004086037A1 (ja) * 2003-03-27 2004-10-07 Terumo Kabushiki Kaisha 試験紙および多孔質膜
WO2005100988A1 (ja) * 2004-04-16 2005-10-27 Ngk Insulators, Ltd. 分析用試験片
JP2006275716A (ja) * 2005-03-29 2006-10-12 Terumo Corp 試験紙

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06258319A (ja) * 1993-03-04 1994-09-16 L T T Kenkyusho:Kk 尿中オキシプリン検出用試験紙
JP2001330605A (ja) * 2000-03-17 2001-11-30 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd 試験紙
WO2004086037A1 (ja) * 2003-03-27 2004-10-07 Terumo Kabushiki Kaisha 試験紙および多孔質膜
WO2005100988A1 (ja) * 2004-04-16 2005-10-27 Ngk Insulators, Ltd. 分析用試験片
JP2006275716A (ja) * 2005-03-29 2006-10-12 Terumo Corp 試験紙

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103966899A (zh) * 2014-05-07 2014-08-06 重庆锐今生物制品有限公司 一种成膜材料及配制方法及用该成膜材料成膜的带膜试纸

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2013187302A1 (ja) 2016-02-04
JP6304819B2 (ja) 2018-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102757893B (zh) 肌酸酐测定用干式试验片及肌酸酐测定法
JP3686326B2 (ja) 高密度リポタンパク質（ｈｄｌ）コレステロール測定用試験片
FI89108C (fi) Testningsfoerfarande foer helblod maetningsanordning foer maetning av koncentrationen av en blodkomponent
JP3220486B2 (ja) 血液グルコース濃度用可視試験片
JP4646475B2 (ja) コレステロールセンサおよびコレステロールの定量方法
JP2008505337A (ja) 電気化学センサのための電極
WO2005066638A1 (ja) 試薬部の配置を改良した分析用具および分析方法
JP2003232789A (ja) 安定化したテトラゾリウム試薬組成物およびこれを使用するための方法
JP4641303B2 (ja) 高密度リポタンパク質に関連する血清コレステロールを測定するためのアッセイデバイス中の多孔性および生物学的活性を保持する接着膜
EP1836311A1 (en) Hdl cholesterol sensor
EP2108961B1 (en) Dry analytical element for measurement of high density lipoprotein cholesterol
CN1159578C (zh) 生物传感器及其制造方法
JPS584555B2 (ja) アスコルビン酸の検出組成物、検出方法及び検出素子
JPS584557B2 (ja) 乳酸またはラクテ−ト分析用組成物
US20110062616A1 (en) Test paper and porous membrane
JP6304819B2 (ja) 検査試験紙
JP4493535B2 (ja) 試験紙
JP4889670B2 (ja) 溶血の影響を低減した体液成分測定用乾式分析素子
JPH1084991A (ja) 試験片
WO2006035875A1 (ja) 多層分析要素の製造方法
JP5912742B2 (ja) 多孔質膜の製造方法
EP2474620B1 (en) Method for removing high density lipoprotein in blood
JP2001165930A (ja) 試験紙
JP2001164029A (ja) 多孔質膜およびその製造方法
Calucho et al. Reduced graphene oxide electrodes meet lateral flow assays: A promising path to advanced point-of-care diagnostics

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13804170

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014521289

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13804170

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1