JPWO2013187302A1 - 検査試験紙 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明に係る検査試験紙は、第1の酵素を含む第1の試薬成分を有する第1の試薬領域を有することを必須の構成要素とするものであり、当該検査試験紙の基体である多孔質膜内に第1の試薬領域が形成されている。
本発明に係る検査試験紙は、第1の試薬成分を必須の構成要素とするものであり、前記第1の試薬成分は第1の酵素を必須に含み、必要により、第1の発色成分、第1の親水化剤、第1の親水性物質、第1の試薬安定剤および増粘剤からなる群から選択される少なくとも1種を含んでもよい。また、本発明に係る検査試験紙を比色分析による血糖値測定に用いる場合、第1の試薬成分には、第1の酵素と、第1の発色成分とを含み、必要により、第1の親水化剤、第1の親水性物質、第1の試薬安定剤および第1の増粘剤からなる群から選択される少なくとも1種を含むことがより好ましい。
本発明に係る第1の酵素は、グルコースオキシターゼ(GOD)、アスコルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ等の酵素がより好ましい。なお、これらの酵素は、単独で使用しても2種以上組み合わせて使用してもよい。
本発明に係る第1の試薬成分は、第1の発色成分を有することが好ましく、当該発色成分としては、酸化及び還元されることによってその吸収波長特性や吸収強度等が変化する発色色素もしくは発色色素の前駆体(色原体)が用いられる。すなわち、酸化剤、還元剤の量に応じて変化する色を測定することによって、被測定物質の量を定量することができる。これらの発色色素や色原体には、1分子だけで機能するものや、異なる2分子がカップリングして機能するものがある。
本発明に係る第1の親水化剤としては、界面活性剤、水溶性シリコン、グリシンおよびリジンなどのアミノ酸、ならびにレシチン等が好ましく挙げられる。また、当該界面活性剤としては、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル(例えば、エマルゲン120:花王社製〕、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル(例えば、トリトンX−100:ローム・アンド・ハース社製)、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリエチレングリコールモノラウレート、もしくはノニデット(Nonidet)P−40等のノニオン型界面活性剤や、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、もしくはアルキルベンジルジメチル等のカチオン型界面活性剤や、コール酸、デオキシコール酸、もしくはポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル硫酸ナトリウム等のアニオン型界面活性剤、ステアリルベタイン、もしくは2−アルキル−N−カルボキシメチル−N−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等のベタイン型界面活性剤等が挙げられる。
本発明に係る第1の親水性物質としては、親水性有機高分子が挙げられ、例えば、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体;ポリエチレングリコール;ポリプロピレングリコール;ポリビニルアルコール、およびポリビニルピロリドンなどのビニル性モノマーの重合体;アクリルアミド重合体;メタクリルアミド重合体;アガロース;ゼラチン;フタル化ゼラチンなどのゼラチン誘導体;ならびに寒天などが好ましく挙げられ、より好ましくはカルボキシメチルセルロースおよびポリエチレングリコールである。
本発明に係る第1の試薬安定剤としては、亜鉛等の金属や、ハイドロサルファイトナトリウム等の還元性無機塩、スクロース、トレハロース、ラクトース、およびグルコース等の糖類、N−アセチル−L−システイン(NAC)、コエンザイム−A(CoASH)、L−システイン、還元型グルタチオン、およびジチオスレイトール(DTT)等のスルフヒドリル化合物、塩化ナトリウム、および塩化カリウム等の塩類、グリシン、レシチン、公知の還元剤、ならびにリン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、およびグッド緩衝剤などの緩衝剤からなる群より選択される少なくとも一種などが挙げられる。
本発明に係る第1の増粘剤としては、例えばゲル状物質、高粘度物質、または半固形状物質が挙げられ、より具体的には、ポリグルタミン酸およびそのナトリウム塩、カルボキシメチルセルロース、κまたはιカラギーナンと二価の金属イオン、プロピレングリコール、寒天、ゼラチン、ペクチン、グアーガム、ローカストビーンガム、コンニャクマンナン、キサンタンガムなど公知の増粘剤(金属イオンを含む)が挙げられる。
本発明に係る第1の試薬領域は、後述する第2の試薬領域より多孔質膜の膜厚方向の一方の面側(多孔質膜の第1の面側)に形成されていることが好ましい。そのため、検査試験紙全体からみると、検査試験紙本体である多孔質膜の第1の面側に、第1の酵素やそれ以外の第1の試薬成分が偏って分布したものであることが好ましい。
本発明に係る検査試験紙は、第2の酵素を含む第2の試薬成分を有する第2の試薬領域を有することを必須の構成要素とするものであり、当該検査試験紙の基体である多孔質膜内に第2の試薬領域が形成されている。本発明に係る第2の試薬領域の第2の試薬成分が配置される平均厚みは、20〜100nmであることが好ましく、40〜80nmであることがさらに好ましい。
本発明に係る検査試験紙は、第2の試薬成分を必須の構成要素とするものであり、前記第2の試薬成分は第2の酵素を必須に含み、必要により第2の発色成分、第2の親水化剤、第2の親水性物質、第2の試薬安定剤および第2の増粘剤からなる群から選択される少なくとも1種を含んでもよい。また、本発明に係る検査試験紙を比色分析による血糖値測定に用いる場合、第2の試薬成分には、第2の酵素と、第2の増粘剤とを含み、必要により第2の発色成分、第2の親水化剤、第2の親水性物質、および第2の試薬安定剤からなる群から選択される少なくとも1種を含むことがより好ましい。
本発明に係る第2の酵素は、ペルオキシダーゼ(POD)、ヘキソキナーゼ(HX)、グルコースオキシダーゼ(GOD)、グルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)、乳酸デヒドロゲナーゼ、ムタロターゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、およびコレステロールオキシダーゼからなる群から選択される少なくとも一つであることが好ましく、ペルオキシダーゼ(POD)であることがより好ましい。なお、これらの酵素は、単独で使用しても2種以上組み合わせて使用してもよい。
本発明に係る第2の試薬成分に含まれる第2の増粘剤は、ゲル状物質、高粘度物質、または半固形状物質が挙げられ、具体的には、ポリグルタミン酸およびそのナトリウム塩、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸およびそのナトリウム塩、ポリエチレングリコール(PEG)、アルギニン酸、κまたはιカラギーナンと二価の金属イオン、プロピレングリコール、寒天、ゼラチン、ペクチン、グアーガム、ローカストビーンガム、コンニャクマンナン、キサンタンガムなど公知の増粘剤(金属イオンを含む)が挙げられ、ポリグルタミン酸およびそのナトリウム塩、ポリアクリル酸およびそのナトリウム塩、ポリエチレングリコール(PEG)、アルギニン酸、カルボキシメチルセルロース、κまたはιカラギーナンと二価の金属イオン、およびプロピレングリコールが好ましく、ポリグルタミン酸、およびそのナトリウム塩がより好ましい。
本発明に係る第2の試薬成分に含まれる第2の発色成分、第2の親水化剤、第2の親水性物質、および第2の試薬安定剤は、上記第1の試薬成分に含まれる物質と同一の物質であるので、物質名は省略する。この場合、第2の発色成分、第2の親水化剤、第2の親水性物質、および第2の試薬安定剤と、第1の発色成分、第1の親水化剤、第1の親水性物質、および第1の試薬安定剤とはそれぞれ同一であっても異なってもよい。
本発明に係る第2の試薬領域の好ましい形態は、多孔質膜の膜厚方向の他方の面側(多孔質膜の第2の面側)に形成されていることが好ましい。そのため、検査試験紙全体からみると、検査試験紙本体である多孔質膜の第2の面側に、第2の酵素やそれ以外の第2の試薬成分が偏って分布したものであることが好ましい。
本発明に係る検査試験紙は、多孔質膜を必須の要件とするものであり、当該多孔質膜は検査試験紙の形状を維持できる支持体としての強度を有し、試薬成分を検査試験紙の第1の面(測定面)にしみ出すように多孔を有するものであれば特に制限されることはないが、以下の特性を示すことが好ましい。また、本明細書では、多孔質膜の一方の面を第1の面、他方の面を第2の面としている。
本発明に係る多孔質膜を製造する方法は、特に制限されることはなく、好ましくは厚みが50〜200μm、平均孔径が0.1〜10μm、空孔率が60〜95%である多孔質膜を製造する公知の方法が採用され、湿式製膜が好適に例示される。湿式製膜の他には、溶融製膜、乾式製膜等が知られているが、一方の表面の孔径が反対側の表面の孔径と異なる異方性膜を製造する場合、湿式製膜により製造することが好ましい。
本発明に係る検査試験紙の好ましい実施形態を以下説明する。本発明に係る検査試験紙の好適な実施形態は、対象とする検体によって適宜選択されるものであるが、以下例示として比色式の血糖値測定検査に使用する一例を説明する。一般に、比色式の血糖値測定検査は、比色分析に影響を及ぼす赤血球を検査試験紙の片面で濾別することで除去し、かつ血液中のグルコース量に応じて呈色する検査試験紙の呈色の度合いを反対側の面から光を照射しその反射光の強度をセンサーで測定することにより行われている。
本発明の第二は、第1の酵素を含む第1の試薬成分を溶媒に添加して第1の試薬成分溶液を調製する工程(1)と、第2の酵素を含む第2の試薬成分を溶媒に添加して第2の試薬成分溶液を調製する工程(2)と、多孔質膜の一方の面から第1の試薬成分溶液を塗布し乾燥する工程(3)と、前記一方の面から第2の試薬成分溶液を塗布し乾燥する工程(4)と、を有する検査試験紙の製造方法であって、前記第2の試薬成分溶液の粘度が第1の試薬成分溶液の粘度より高いことを特徴とする、検査試験紙の製造方法である。
本発明に係る検査試験紙の製造方法における工程(1)は、第1の酵素を含む第1の試薬成分を溶媒に添加して第1の試薬成分溶液を調製するものである。
本発明に係る検査試験紙の製造方法における工程(2)は、第2の酵素を含む第2の試薬成分を溶媒に添加して第2の試薬成分溶液を調製するものである。
本発明に係る検査試験紙の製造方法における工程(3)は、多孔質膜の一方の面から第1の試薬成分溶液を塗布し乾燥する工程(3)である。
本発明に係る検査試験紙の製造方法における工程(4)は、前記一方の面から第2の試薬成分溶液を塗布し乾燥する工程(4)である。
本発明に係る検査試験紙の好ましい製造方法における工程(5)は、多孔質膜の一方の面から第1の試薬成分溶液を塗布し乾燥させた後、第2の試薬成分溶液を塗布し乾燥するものである。
(第1試薬成分含有混合溶液の調製)
グルコースオキシダーゼ0.55g、4−アミノアンチピリン0.016g、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメチルアニリン0.026g、およびトリトンX0.1gをそれぞれ秤量し、混合した後、337.5mMのコハク酸バッファー(pH=5.0)1mLに溶解して第1試薬成分含有混合溶液を調製した(5.0mPa・s)。
ペルオキシダーゼ0.43g、およびポリグルタミン酸0.03gをそれぞれ秤量し、混合した後、337.5mMのコハク酸バッファー(pH=5.0)1mLに溶解して第2試薬成分含有混合溶液を調製した(108.8mPa・s)。
WO2004/086037号の実施例1〜7に記載の方法で製造した異方性を有する多孔質のPES膜(WO2004/086037号の実施例3のPES膜 厚さ130μm)を15cm×9.5cmの大きさに切り取り、図3 Aに示す板状ダイレクトグラビア印刷装置のゴムローラ表面に当該多孔質のPES膜8を巻回した(図3 A参照)。この際、異方性を有する多孔質11のPES膜8(以下、異方性多孔質膜と称する)において、当該膜の孔径が小さい面とローラー面とが当接するように粘着テープで貼り付けることにより固定した。すなわち、図3 Aに示すように、異方性多孔質膜の孔径が大きい面側が外側に向いた状態になるようにゴムローラ表面に巻回した。
(サンプルの作製)
検査試験紙の評価に使用する試験紙切片の作製は大和光機工業株式会社製のミクロトーム(リトラームREM−700)を使用し作製した。
〔発色試薬溶液の調製〕
4−アミノアンチピリン2.03gを100mLのRO水に溶解してCP2溶液を調製した。一方、MAOS 6.54gを1Lのトリスバッファーに溶解してMAOS溶液(pH8.0 10mM)を調製した。その後、前記CP2溶液と前記MAOS溶液とを1:100の体積割合で混合して発色試薬溶液を調製した。
30質量%のH2O2液(和光純薬)をRO水で2000倍希釈してH2O2溶液を調製した。
上記厚さ20μmでスライスした6個のサンプルについて、それぞれ1個につき2mLのトリスバッファーで抽出したサンプル抽出液を、ボルテックスミキサーで5分間攪拌を行い、上清をサンプル溶液として使用した。
3mLのセルに発色試薬溶液2mL、H2O2溶液100μL、サンプル溶液100μL添加し発色反応を行い(ブランク:2mLの発色試薬溶液とH2O2溶液100μL)、生成した色素の単位時間での増加量を分光光度計(630nm)にて1分間測定した。その結果を図2に示す。
〔発色試薬溶液の調製〕
4−アミノアンチピリン2.03gを100mLのRO水に溶解してCP2溶液を調製した。また、MAOS 6.54g、およびPOD 0.2gを1Lのトリスバッファーに溶解してMAOS−POD溶液(pH8.0 10mM)を調製した。その後、前記CP2溶液と前記MAOS−POD溶液とを1:100の体積割合で混合して発色試薬溶液を調製した。
グルコース(D−グルコース)150mgを100mLのRO水に溶解し、グルコース溶液を調製した。
上記厚さ20μmでスライスした6個のサンプルについて、それぞれ1個につき2mLのトリスバッファーで抽出したサンプル抽出液を、ボルテックスミキサーで5分間攪拌を行い、上清をサンプル溶液として使用した。
3mLのセルに発色試薬溶液2mL、グルコース溶液100μL、サンプル溶液1mL添加し発色反応を行い(ブランク:2mLの発色試薬溶液とグルコース溶液100μL)、生成した色素の単位時間での増加量を分光光度計(630nm)にて1分間測定した。その結果を図2に示す。
2 第2の試薬領域、
3 第1の試薬領域、
4 多孔質膜、
5 第1の面、
6 第2の面、
7 板状グラビア、
8 PES膜(異方性多孔質膜)、
9 ゴムローラ、
10 第1試薬成分含有混合溶液、
11 多孔質。
Claims (5)
- 第1の面および第2の面を有する多孔質膜と、
第1の酵素を有する第1の試薬成分を有する第1の試薬領域と、
第2の酵素を有する第2の試薬成分を有する第2の試薬領域と、を備えた検査試験紙であって、
前記第1の試薬領域および第2の試薬領域が前記多孔質膜の膜厚方向において異なる分布状態で前記多孔質膜内に形成されている、検査試験紙。 - 前記第2の試薬領域は、前記多孔質膜の第2の面側に分布しており、
前記第1の試薬領域は、前記第2の試薬領域より第1の面側に偏って分布している、請求項1に記載の検査試験紙。 - 前記第2の面側から検体を点着し、かつ前記第1の面側から前記検体量を測定する、請求項1または2に記載の検査試験紙。
- 前記第2の酵素は、ペルオキシダーゼであり、前記第1の酵素はグルコースオキシダーゼである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の検査試験紙。
- 第1の酵素を含む第1の試薬成分を溶媒に添加して第1の試薬成分溶液を調製する工程と、第2の酵素を含む第2の試薬成分を溶媒に添加して第2の試薬成分溶液を調製する工程と、多孔質膜の一方の面から第1の試薬成分溶液を塗布し乾燥する工程と、前記一方の面から第2の試薬成分溶液を塗布し乾燥する工程と、を有する検査試験紙の製造方法であって、
前記第2の試薬成分溶液の粘度が第1の試薬成分溶液の粘度より高いことを特徴とする、検査試験紙の製造方法。
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