WO2013161958A1 - 新規な発現ベクター - Google Patents

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WO2013161958A1
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internal ribosome
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高橋　健一
真司 柿本
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日本ケミカルリサーチ株式会社
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    • C12Y105/01003—Dihydrofolate reductase (1.5.1.3)
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    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/01—Acid-ammonia (or amine)ligases (amide synthases)(6.3.1)
    • C12Y603/01002—Glutamate-ammonia ligase (6.3.1.2)

Definitions

  • the present invention relates to a novel expression vector for efficiently expressing a recombinant protein in mammalian cells. More specifically, the present invention relates to a gene expression control site, a gene encoding a desired protein downstream thereof, and an internal ribosome downstream thereof.
  • the gene further comprises a gene encoding glutamine synthetase downstream of the binding site, and further comprises a dihydrofolate reductase gene downstream of the gene expression control site or a gene expression control site different from the gene expression control site , Relating to expression vectors.
  • a method for producing a recombinant protein using a mammalian cell transformed with an expression vector incorporating a gene encoding a desired protein is a widely used technique in industrial fields such as pharmaceutical production.
  • Galactosidase A iduronic acid 2-sulfatase, glucocerebrosidase, galsulfase, ⁇ -L-iduronidase, lysosomal enzymes such as acid ⁇ -glucosidase, tissue plasminogen activator (t-PA), blood coagulation factor VII, blood coagulation Blood coagulation factors such as factor VIII and blood coagulation factor IX, erythropoietin, interferon, thrombomodulin, follicle stimulating hormone, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), various antibody drugs, etc. are manufactured using this technology. Is commercially available.
  • a gene control site that induces strong gene expression such as a promoter derived from cytomegalovirus (CMV), an SV40 early promoter (SV40 enhancer / promoter), an elongation factor 1 ⁇ (EF-1) promoter, etc. It is common to use a product into which a gene encoding a desired protein is incorporated downstream. Mammalian cells introduced with such an expression vector express the desired protein incorporated in the expression vector, but the expression level varies depending on the individual cells and is not uniform. Therefore, in order to efficiently produce a recombinant protein, it is necessary to select a cell having a high expression level of a desired protein from mammalian cells into which an expression vector has been introduced. In order to perform this selection step, a gene that functions as a selection marker is incorporated into the expression vector.
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 enhancer / promoter SV40 enhancer / promoter
  • EF-1 elongation factor 1 ⁇
  • the most common selection marker is an enzyme (drug resistance marker) that degrades drugs such as puromycin and neomycin.
  • Mammalian cells die in the presence of the drug above a certain concentration.
  • mammalian cells into which an expression vector has been introduced can be decomposed by the drug selection marker incorporated in the expression vector, and can be detoxified or attenuated, so that it can survive even in the presence of the drug. Become. Therefore, when cells into which an expression vector has been introduced are cultured in a medium containing the drug at a certain concentration, only cells that express the drug selection marker at a high level proliferate and are selected.
  • Cells expressing a drug selectable marker at a high level tend to express a gene encoding a desired protein simultaneously incorporated into an expression vector at a high level. As a result, a mammal expressing a desired protein at a high level Cells are obtained.
  • Dihydrofolate reductase is an enzyme that reduces dihydrofolate to tetrahydrofolate.
  • MTX methotrexate
  • Glutamine synthase is an enzyme that synthesizes glutamine from glutamic acid and ammonia.
  • MSX methionine sulfoximine
  • the cells die.
  • an expression vector incorporating glutamine synthetase as a selectable marker is introduced into a mammalian cell, the expression level of glutamine synthetase increases in the cell, so that it can grow even in the presence of a higher concentration of MSX. It becomes.
  • Patent Document 1 describes that the use of the GS gene and methionine sulphoximine (MSX) can increase the copy number of vector DNA as compared with the case of using the DHFR gene and methotrexate (MTX). ing.
  • Patent Document 2 also discloses that by using the GS gene and MSX, the copy number of a different foreign gene is also increased in the host cell DNA along with the increase in the copy number of the GS gene. And thus increase the level of production of the desired polypeptide.
  • an expression vector containing a selection marker is suitable for the production of an efficient recombinant protein and is widely used.
  • a gene encoding a desired protein and a gene encoding a selection marker are generally incorporated under different gene control sites (Patent Document 3).
  • a method is also known in which a gene encoding a desired protein and a selection marker is serially incorporated under one gene control site (Patent Documents 4 to 7).
  • the desired protein and the selection marker are known.
  • An internal ribosome binding site IRS: internal ribosome entry site
  • Various internal ribosome binding sites are known, such as those derived from picornavirus, poliovirus, encephalomyocarditis virus, and chicken infectious bursal disease virus (Patent Documents 8 to 10).
  • an expression vector incorporating herpes simplex virus thymidine kinase as a selectable marker downstream of the internal ribosome binding site (Patent Document 11), 3 or more using two or more internal ribosome binding sites
  • An expression vector (Patent Document 12) in which these genes are bound is known.
  • JP-T 63-502955 Japanese Patent Publication No. 5-504050 JP 2009-273427 A JP 59-173096
  • An object of the present invention is to provide a novel expression vector for efficiently expressing a recombinant protein in mammalian cells, a mammalian cell transformed with the vector, and a method for producing the mammalian cell.
  • the present inventors have found that a gene expression control site, a gene encoding a desired protein such as human thyroid stimulating hormone (hTSH) downstream, an internal ribosome binding site downstream, and Using an expression vector further containing a gene encoding glutamine synthetase downstream and further containing a gene encoding dihydrofolate reductase downstream of the gene expression control site or another gene expression control site, The present inventors have found that a gene encoding the protein can be expressed at a high level by transforming and. That is, the present invention provides the following. 1.
  • hTSH human thyroid stimulating hormone
  • An expression vector for expressing a protein which encodes a gene expression control site (A), a gene encoding the protein downstream thereof, an internal ribosome binding site downstream, and a glutamine synthetase further downstream
  • An expression vector comprising a gene and further comprising a dihydrofolate reductase gene downstream of the gene expression control site (A) or a gene expression control site (B) different from the gene expression control site (A) .
  • the gene expression control site (A) and / or the gene expression control site (B) is selected from the group consisting of a cytomegalovirus-derived promoter, an SV40 early promoter, and an elongation factor 1 promoter. Expression vector. 3.
  • the internal ribosome binding site is a picornaviridae virus, foot-and-mouth disease virus, hepatitis A virus, hepatitis C virus, coronavirus, bovine intestinal virus, siler murine encephalomyelitis virus, coxsackie type B virus, human immunity
  • the expression vector according to 1 or 2 above which is derived from a 5 'untranslated region of a virus or gene selected from the group consisting of a globulin heavy chain binding protein gene, a Drosophila antennapedia gene, and a Drosophila ultravitracs gene. 4).
  • the drug resistance gene is a puromycin or neomycin resistance gene.
  • the gene encoding the protein is a human-derived gene. 18.
  • the gene derived from human is lysosomal enzyme, tissue plasminogen activator (t-PA), blood coagulation factor, erythropoietin, interferon, thrombomodulin, thyroid stimulating hormone (TSH), follicle stimulating hormone, granulocyte colony stimulating factor (G -CSF), and the expression vector according to 17 above, which is selected from the group consisting of genes encoding antibodies. 19. 18. The expression vector according to 17 above, wherein the human-derived gene is a gene encoding a lysosomal enzyme. 20. 19.
  • 25 (A) introducing the expression vector of any one of 1 to 21 into mammalian cells; (B) a step of selectively culturing mammalian cells into which the expression vector has been introduced in the presence of a dihydrofolate reductase inhibitor, and (c) the presence of a glutamine synthetase inhibitor in cells selected by the selective culture.
  • a method for producing a transformed cell expressing a gene encoding the protein further comprising a step of selective culturing below.
  • A introducing the expression vector of any one of 14 to 16 into a mammalian cell;
  • B a step of selectively culturing mammalian cells into which the expression vector has been introduced in the presence of a dihydrofolate reductase inhibitor; and
  • c the presence of a glutamine synthetase inhibitor in cells selected by the selective culture.
  • a method for producing a transformed cell that expresses a gene encoding the protein further comprising a step of selective culturing below, between the step (a) and the step (b), or the step (b)
  • a production method further comprising the step of selectively culturing mammalian cells into which the expression vector has been introduced during the step (c) in the presence of a drug corresponding to the drug resistance gene.
  • an expression vector for efficiently expressing a desired recombinant protein in a mammalian cell can be obtained.
  • a transformed cell that efficiently produces the recombinant protein can be obtained. If the transformed cells thus obtained are used, the production cost of the recombinant protein can be greatly reduced.
  • the flowchart which shows the construction method of a pE-neo vector The flowchart which shows the construction method of a pE-neo vector.
  • the flowchart which shows the construction method of a pE-hygr vector The flowchart which shows the construction method of a pE-hygr vector.
  • the flowchart which shows the construction method of a pE-hygr vector The flowchart which shows the construction method of a pE-hygr vector.
  • the flowchart which shows the construction method of pE-IRES-GS-puro The flowchart which shows the construction method of pE-IRES-GS-puro.
  • the flowchart which shows the construction method of pE-IRES-GS-puro The flowchart which shows the construction method of pE-IRES-GS-puro.
  • the flowchart which shows the construction method of pE-IRES-GS-puro The flowchart which shows the construction method of pE-IRES-GS-puro.
  • the flowchart which shows the construction method of pE-IRES-GS-puro The flowchart which shows the construction method of pE-IRES-GS-puro.
  • the flowchart which shows the construction method of pE-mIRES-GS-puro The flowchart which shows the construction method of pE-mIRES-GS.
  • the flowchart which shows the construction method of pE-mIRES-GS-mNeo The flowchart which shows the construction method of pBlue-EF1 / mIRES-mNeo.
  • the flowchart which shows the construction method of pBlue-EF1 / SVpA The flowchart which shows the construction method of pE-mDHFR31.
  • the flowchart which shows the construction method of pCI-neo TH ⁇ -WAP3′UTR).
  • the flowchart which shows the construction method of pE-mIRES-GS-mNeo hTSH ⁇ ).
  • the flowchart which shows the construction method of pBlue-EF1 / mIRES-mNeo (hTSH ⁇ ).
  • the flowchart which shows the construction method of pE-mIRES-GS-mNeo-dual (hTSH).
  • the flowchart which shows the construction method of pE-mIRES-GS-mNeo-dual + mDHFR31 (hTSH).
  • the flowchart which shows the construction method of pE-mIRES-GS-mNeo-dual (RTX).
  • the flowchart which shows the construction method of pE-mIRES-GS-dual (RTX).
  • the term “gene” means a structural gene.
  • a “gene expression control site” is a region on DNA that can control (regulate) the frequency of transcription of a gene present downstream thereof, and is generally referred to as a promoter or promoter gene. is there. Gene expression control sites exist on almost all upstream sides of genes expressed in vivo, and control (regulate) the frequency of transcription, and their nucleotide sequences are diverse.
  • the gene expression control site that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it can strongly induce transcription of a gene incorporated downstream thereof in mammalian cells, but is preferably cytomegalovirus. (CMV) -derived promoters, virus-derived promoters such as the SV40 early promoter, and elongation factor 1 ⁇ (EF-1) promoter.
  • CMV cytomegalovirus
  • an “internal ribosome binding site” refers to a region (structure) within a mRNA chain, to which a ribosome can directly bind and initiate translation independent of a cap structure, or by being transcribed.
  • the “gene encoding an internal ribosome binding site” is a region (structure) of a DNA chain that is transcribed to generate the region.
  • the internal ribosome binding site is generally referred to as IRES (internal ribosome entry site), and Picornaviridae virus (poliovirus, rhinovirus, mouse encephalomyocarditis virus, etc.), foot-and-mouth disease virus, hepatitis A virus, type C Hepatitis virus, coronavirus, bovine intestinal virus, Siler's murine encephalomyelitis virus, Coxsackie B virus 5 'untranslated region, human immunoglobulin heavy chain binding protein, Drosophila antennapedia, Drosophila ultrabitrax, etc. It is found in the 5 'untranslated region of the gene.
  • the IRES is a region consisting of about 450 bp present in the 5 ′ untranslated region of mRNA.
  • the “virus 5 ′ untranslated region” is a 5 ′ untranslated region of viral mRNA, or a region (structure) of a DNA strand that is transcribed to produce this region.
  • the internal ribosome binding site is not particularly limited as long as it functions as an internal ribosome binding site in mammalian cells, particularly cells derived from the ovary of Chinese hamsters (CHO cells). Can also be used. Among them, preferably an internal ribosome binding site derived from the 5 ′ untranslated region of the virus, more preferably an internal ribosome binding site derived from the 5 ′ untranslated region of the Picornaviridae virus, more preferably mouse brain myocardium An internal ribosome binding site derived from the 5 'untranslated region of the flame virus.
  • the internal ribosome binding site having a wild-type base sequence can be used as it is.
  • a mutant internal ribosome binding site obtained by adding one or more mutations (for example, substitution, deletion, and / or insertion) to the base sequence of these wild type internal ribosome binding sites is also a mammal. Any substance can be used as long as it functions as an internal ribosome binding site in animal cells (particularly in CHO cells).
  • a chimeric internal ribosome binding site in which two or more internal ribosome binding sites are fused can also be used.
  • the expression level of the GS gene is controlled by placing a gene encoding a glutamine synthase (GS gene) under the control of the internal ribosome binding site.
  • GS gene glutamine synthase
  • the culture for selecting not only the cell into which the GS gene has been introduced but also the cell into which the selection marker has been introduced is referred to as “selective culture” and is used for selecting the introduced cells.
  • the medium is referred to as “selective medium”.
  • a suitable one is appropriately selected from various internal ribosome binding sites.
  • a wild-type internal ribosome binding site with mutations can also be used.
  • start codons ATG
  • ATG start codons
  • an internal ribosome binding site in which a part of these start codons is destroyed can be used.
  • disruption means that a certain gene sequence is mutated so that the function inherent to the gene sequence is not exhibited.
  • the start codons to be destroyed by mutation are preferably the second and third start codons from the 5 ′ side, more preferably Second start codon.
  • SEQ ID NO: 2 5′-ATGataatnnngccacaaccnnn-3 ′: n is an arbitrary base, but three n are initiation codons ATG The same shall apply hereinafter.
  • SEQ ID NO: 7 5′-ATGataannnngccacaaccnnn-3 ′
  • SEQ ID NO: 3 5′-ATGataatnnngccacaaccATG-3 ′
  • SEQ ID NO: 8 5 And the base sequence of '-ATGataannnngccacaaccATG-3').
  • the 3 ′ end is an internal ribosome binding site that is the base sequence of SEQ ID NO: 4 (5′-ATGataagcttgccacaaccATG-3 ′), and the second start codon from the 5 ′ side was destroyed by mutation.
  • the internal ribosome binding site of wild-type mouse encephalomyocarditis virus comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the base sequence of sequence number 6 is mentioned.
  • the expression level of the GS gene arranged downstream of the wild-type and / or mutant-type internal ribosome binding site can be further controlled by another method.
  • the expression level of the GS gene can be decreased.
  • the base sequence that inhibits transcription is not particularly limited, and examples thereof include a polymerase addition signal (5′-aataa-3 ′). Examples of base sequences that inhibit translation include a stop codon that induces reading through.
  • glucose synthase is not particularly limited as long as it can synthesize glutamine from glutamic acid and ammonia, and belongs to mammals, reptiles, birds, amphibians, and Lepidoptera. Bombyx mori, Spodoptera frugiperda, Geometridae, and other insects such as Drosophila belonging to Diptera, prokaryotes, nematodes, yeasts, actinomycetes, filamentous fungi, offspring Although it may be derived from any organism including cysts, basidiomycetes and plants, it is preferably a mammal, and a human or Chinese hamster (especially a CHO cell) can be suitably used.
  • the term “endogenous GS gene” refers to a glutamine synthase gene that is inherently present on the genome of the cell into which the expression vector is introduced, and the term “exogenous GS gene”. , refers to a glutamine synthase gene introduced into cells by an expression vector.
  • glucose synthase inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the activity of the above glutamine synthase, and any one can be used, but methionine sulfoximine is preferred. (MSX).
  • GS inhibitor glutamine synthetase inhibitor
  • cells with a low expression level of glutamine synthase die without being able to synthesize glutamine.
  • cells with a relatively high expression level can be selectively obtained.
  • the increase in the expression level of glutamine synthetase is mainly due to an increase in the copy number of the GS gene integrated on the chromosome due to gene duplication.
  • the gene encoding the desired protein incorporated into the expression vector together with the glutamine synthetase also increases the copy number due to gene duplication, and as a result, cells that highly express the desired protein are obtained.
  • CHO cells have an endogenous GS gene
  • this endogenous GS gene may increase the copy number due to duplication of the endogenous GS gene by a glutamine synthetase inhibitor.
  • the cells proliferate in the presence of the glutamine synthetase inhibitor, and cells that highly express the desired protein cannot be obtained.
  • This problem can be solved by further incorporating a second selectable marker gene different from the GS gene into the expression vector, and selecting cells using this second selectable marker.
  • an expression vector containing a GS gene and a second selection marker gene different from the GS gene is introduced into the cell.
  • the cells into which the expression vector has been introduced are selectively cultured with the second selection marker before being selectively cultured with the GS gene.
  • the gene encoding the desired protein and the GS gene can be increased by duplication. As a result, cells expressing the desired protein at a certain high level can be obtained.
  • the copy number of the exogenous GS gene increases due to duplication, but the endogenous GS gene does not increase due to duplication.
  • the selection medium (second selection medium) used in the selection by the second selection marker is an agent that inhibits the activity of the gene product encoded by the second selection marker, has cytotoxicity, and is used for the second selection.
  • a substance for selecting cells by a second selection marker such as a substance detoxified or attenuated by the gene product encoded by the marker, or a second selection marker introduced
  • a substance in which later cells do not exhibit auxotrophy that is, a substance in which only cells before introduction of the second selection marker exhibit auxotrophy
  • examples of selective substances added to the medium include methotrexate (MTX) and aminopterin.
  • the selection substances removed from the medium are hypoxanthine and thymidine.
  • cells with a further increased expression level of the second selection marker are obtained by increasing the concentration of the selection substance stepwise. be able to.
  • the increase in the expression level of the second selectable marker is mainly due to the increase in the copy number of the second selectable marker due to gene duplication. Therefore, by this method, other genes incorporated into the expression vector, that is, the GS gene And the gene encoding the desired protein can be increased more efficiently by duplication.
  • the selection marker is switched to the GS gene to select cells.
  • the copy number of the exogenous GS gene is increased compared to that of the endogenous GS gene. Therefore, at this point, by selecting the cell by switching the selection marker to the GS gene, the exogenous GS gene that is dominant in number may be amplified by duplication as compared with the endogenous GS gene. Is probabilistically higher.
  • the duplication of the endogenous GS gene can be suppressed and the duplication of the exogenous GS gene can be promoted during the selection by the GS gene. Can do. As a result, cells that highly express the desired protein can be efficiently obtained.
  • the second selectable marker is provided with a gene expression control site (second gene expression control site) separate from the gene expression control site for controlling the expression of the recombinant protein, and downstream thereof. May be incorporated.
  • the second selectable marker is provided with a second internal ribosome binding site upstream thereof, through which a gene encoding the desired recombinant protein and an internal ribosome binding site downstream of the gene are encoded. May be incorporated in the region between or in the region downstream of the GS gene. Thereby, the expression level of the second selection marker can be controlled by the second internal ribosome binding site.
  • the second internal ribosome binding site may have the same base sequence as the internal ribosome binding site upstream of the GS gene, or may have a different base sequence. Further, the second internal ribosome binding site can be arbitrarily selected from the various internal ribosome binding sites described above.
  • the second selectable marker is not particularly limited as long as it is a selectable marker different from the GS gene, but in principle, the gene conferring drug resistance to mammalian cells (drug resistant gene) is the second selectable marker. Not included in selection marker. However, when a third selectable marker gene described later is incorporated into an expression vector and mammalian cells are further selected using this gene, a drug resistance gene can be used as the second selectable marker.
  • the dihydrofolate reductase (DHFR) gene can be suitably used as the second selection marker.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • Lepidoptera It may be derived from any organism including insects such as Drosophila, prokaryotes, nematodes, yeasts, actinomycetes, filamentous fungi, ascomycetes, basidiomycetes and plants, but preferably from mammals Yes, those derived from humans, mice or Chinese hamsters (particularly those derived from CHO cells) can be preferably used.
  • insects such as Drosophila, prokaryotes, nematodes, yeasts, actinomycetes, filamentous fungi, ascomycetes, basidiomycetes and plants
  • mammals Yes those derived from humans, mice or Chinese hamsters (particularly those derived from CHO cells)
  • mutant enzymes in which mutations are introduced into these wild-type enzymes can be used as long as they have enzyme activity, and these are also included in “dihydrofolate reductase”.
  • Such mutant enzymes include, for example, those having different enzyme activities and those having different sensitivities to dihydrofolate reductase inhibitors compared to wild-type enzymes.
  • dihydrofolate reductase that can be preferably used include mouse wild-type DHFR and mutant DHFR in which phenylalanine at position 31 from the N-terminal of mouse wild-type DHFR is substituted with tryptophan (Mclvor RS et al., Nucleic Acids). Research, 18 (23), 7025-32 (1990)).
  • nucleotide sequence and amino acid sequence of mouse wild-type DHFR are shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10
  • nucleotide sequence and amino acid sequence of the mutant DHFR are shown in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12.
  • endogenous DHFR gene refers to a DHFR gene inherently present on the genome of a cell into which an expression vector is introduced
  • exogenous DHFR gene refers to expression. This refers to the DHFR gene introduced into cells by a vector.
  • dihydrofolate reductase inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the activity of the dihydrofolate reductase (DHFR), and any of them can be used.
  • a folic acid antagonist more preferably methotrexate (MTX) and aminopterin.
  • DHFR inhibitor dihydrofolate reductase inhibitor
  • tetrahydrofolate is synthesized in cells with low DHFR expression. Since they die without being able to do so, cells with a relatively high expression level of DHFR will be selectively obtained.
  • concentration of the DHFR inhibitor stepwise, cells with a higher expression level of DHFR can be obtained.
  • the increase in the expression level of DHFR is mainly due to the fact that the DHFR gene integrated on the chromosome increases the copy number due to gene duplication.
  • the copy number of other genes incorporated into the expression vector that is, the GS gene and the gene encoding the desired protein
  • the copy number of other genes incorporated into the expression vector that is, the GS gene and the gene encoding the desired protein
  • a cell can be obtained in which the desired protein is highly expressed to some extent and the copy number of the exogenous GS gene is increased compared to that of the endogenous GS gene.
  • the exogenous GS gene that is predominant in number may be amplified by duplication compared to the endogenous GS gene. Become expensive.
  • cells that highly express the desired protein can be efficiently obtained.
  • the maximum concentration is preferably 0.25 to 5 ⁇ M, more preferably 0.5 to 1.5 ⁇ M when the DHFR inhibitor is methotrexate, Preferably it is about 1.0 ⁇ M.
  • a third selection marker may be further introduced into the expression vector in addition to the GS gene and the second selection marker.
  • the drug resistance gene can be suitably used as the third selection marker gene.
  • the drug resistance gene that can be used as the third selectable marker is not particularly limited as long as it is a gene that can confer drug resistance to mammalian cells.
  • the cell is purified with puromycin, hygromycin, It is a gene that can confer resistance to drugs such as blasticidin and neomycin.
  • drugs such as puromycin, hygromycin, blasticidin, and neomycin are “drugs corresponding to drug resistance genes”, respectively.
  • These drug resistance genes include puromycin resistance gene, hygromycin resistance gene, blasticidin resistance gene, and neomycin resistance gene.
  • the third selectable marker is provided by providing a gene expression control site (third gene expression control site) separate from the gene expression control site where the recombinant protein is controlled and incorporating it downstream of the gene expression control site. , The amount of expression can be controlled.
  • the third selectable marker has a second internal ribosome binding site upstream thereof (if a second internal ribosome binding site is provided upstream of the second selectable marker, It may be incorporated into a region between the gene encoding the recombinant protein and the internal ribosome binding site, a region downstream of the GS gene, or the like via an internal ribosome binding site. Thereby, the expression level of the third selection marker can be controlled by the second internal ribosome binding site.
  • the second internal ribosome binding site may be the same as the internal ribosome binding site upstream of the GS gene and the internal ribosome binding site upstream (if provided) of the second selectable marker, Another thing may be used.
  • the second internal ribosome binding site upstream of the third selectable marker can be arbitrarily selected from the above various internal ribosome binding sites. Also, the second internal ribosome binding site may be optimized by adding mutation as appropriate, as described above.
  • the drug resistance gene used as the third selection marker gene here is selected from drug resistance genes other than the second selection marker.
  • the third selection marker can amplify the GS gene without duplicating the endogenous GS gene. Accordingly, the exogenous GS gene is duplicated without duplicating the endogenous GS gene by selecting cells with the third selectable marker prior to or after selection with the second selectable marker. be able to. As a result, cells that highly express the desired protein can be obtained more efficiently.
  • the animal species of the gene encoding the recombinant protein incorporated into the expression vector is not particularly limited, including those derived from mammals including humans.
  • the gene when the vector of the present invention is used for the production of a medical drug, it is generally derived from a human, and when it is used for the production of a drug for livestock, it is generally Is a gene derived from the same species of livestock as the subject of treatment.
  • the type of gene encoding the recombinant protein is not particularly limited, but preferably ⁇ -galactosidase A, iduronic acid 2-sulfatase, glucocerebrosidase, galsulfase, ⁇ -L-iduronidase, acid ⁇ - Lysosomal enzymes such as glucosidase, tissue plasminogen activator (t-PA), blood coagulation factor VII, blood coagulation factor VIII, blood coagulation factor IX and other blood coagulation factors, erythropoietin, interferon, thrombomodulin, follicle stimulating hormone , Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), DNase I, thyroid stimulating hormone (TSH) or a gene encoding various antibody drugs.
  • antibody drugs include mouse antibodies, humanized mouse antibodies, human / mouse chimeric antibodies, human antibodies, and the like, for example, rituximab which is a human / mouse chimeric anti
  • the gene encoding either the antibody heavy chain or the antibody light chain is incorporated into a vector so that its expression is controlled by a gene expression control site that controls the expression of the GS gene.
  • the gene encoding the other strand is incorporated so that its expression is controlled by a gene expression control site arranged in the vector separately.
  • the gene expression site used at this time is preferably the same type of gene expression site so that the antibody heavy chain and the antibody light chain are expressed at the same level.
  • the expression of a gene encoding any subunit that forms the heterodimer is controlled by a gene expression control site that controls the expression of the GS gene.
  • the gene encoding the other subunit is incorporated so that its expression is controlled by a gene expression control site arranged in the vector separately.
  • the gene expression site used at this time is preferably the same type of gene expression site so that the two types of subunits are expressed at the same level. Proteins that form such heterodimers include follicle-stimulating hormone and thyroid-stimulating hormone (TSH).
  • introduction of an expression vector into a mammalian cell is performed for the purpose of expressing a gene encoding the recombinant protein in the mammalian cell, and any method can be used as long as this object can be achieved. May be used.
  • Expression vectors are usually circular plasmids, which can be introduced into cells even if they remain circular or after being cleaved with a restriction enzyme to form a straight chain.
  • the mammalian cells into which the expression vector is introduced are not particularly limited as long as the target recombinant protein can be expressed, but organs, muscle tissues, skin tissues, connective tissues, nerves removed from the living body. It may be any of primary culture cells, subculture cells, and cells established so that the traits are stable even when subcultured, from cells collected from tissues, blood, bone marrow, and the like. Further, the cells may be normal cells or cancerous cells. Cells that can be used particularly preferably are CHO cells derived from Chinese hamster ovary, human fibroblasts, and COS cells derived from African green monkey kidney fibroblasts.
  • the mammalian cell into which the expression vector is introduced may be a cell having a mutation in the endogenous gene corresponding to the second selection marker.
  • the mutation of the endogenous gene corresponding to the second selectable marker is one that reduces or eliminates the expression of the gene, or reduces or loses the function of the protein encoded by the endogenous gene.
  • the selection pressure by the selection substance is strongly applied to the exogenous second selection marker, and the duplication of the second selection marker is further promoted.
  • the second selectable marker is a DHFR gene
  • the mutation of the endogenous DHFR gene decreases the expression level of dihydrofolate reductase or deletes the dihydrofolate reductase
  • the DHFR gene is selected at the time of selection with the DHFR gene. Selection pressure by the inhibitor is exclusively applied to the exogenous DHFR gene, and duplication of the exogenous DHFR gene is further promoted.
  • Mammalian cells into which the expression vector has been introduced are cultured in a selection medium for selecting cells with the second selection marker prior to selection with the GS gene.
  • the medium at this time is a medium to which a DHFR inhibitor is added when the second selection marker is DHFR.
  • aminopterin and methotrexate (MTX) are preferably used as DHFR inhibitors.
  • the second selection marker is a drug resistance gene, it is a drug corresponding to the drug resistance gene.
  • a mammalian cell into which an expression vector is introduced can have a mutation in the endogenous DHFR gene that reduces or deletes the expression level of DHFR.
  • An example of such cells is the DG44 strain.
  • the DG44 strain does not express the endogenous DHFR gene. Therefore, when the cell line is used, the selective pressure in selective culture is applied only to the exogenous DHFR gene, so that the exogenous DHFR gene is efficiently increased by duplication. Can be made.
  • the selective culture can be performed in a selective medium containing a DHFR inhibitor such as aminopterin and methotrexate (MTX).
  • MTX methotrexate
  • the maximum concentration is preferably 0.25 to 5 ⁇ M, more preferably 0.5 to 1.5 ⁇ M when the DHFR inhibitor is methotrexate, Preferably it is about 1.0 ⁇ M.
  • the culture for maintaining or growing the cells is carried out in a medium to which these are added.
  • cells introduced with the exogenous DHFR gene do not have to be auxotrophic for hypoxanthine and thymidine, so it is not necessary to add them to the medium. Therefore, when an expression vector containing a DHFR gene as a second selection marker is introduced into a cell having no or almost no DHFR activity derived from the endogenous DHFR gene due to deletion of the endogenous DHFR gene, etc.
  • Hypoxanthine and thymidine-free medium can also be used to selectively culture cells into which an exogenous DHFR gene has been introduced.
  • the culture medium which added the DHFR inhibitor to the hypoxanthine and the thymidine-free culture medium can also be used as a selective culture medium.
  • the expression vector-introduced cells are cultured in a medium for selecting cells into which the GS gene has been introduced.
  • the medium at this time is a glutamine-free or low glutamine medium supplemented with a glutamine synthetase inhibitor (for example, MSX).
  • the concentration of the GS inhibitor added to the selective medium By gradually increasing the concentration of the GS inhibitor added to the selective medium, it is possible to select an expression vector-introduced cell having a higher expression level of the GS gene. This is because only the expression vector-introduced cells in which the number of GS genes incorporated into the genome of the expression vector-introduced cell increased due to duplication and the expression level of the GS gene increased relatively during the selective culture process. Caused by proliferation. At this time, since the number of copies of the gene encoding the recombinant protein incorporated in the expression vector also increases, the expression level of the gene also increases.
  • the expression vector-introduced cell thus selected is referred to as a transformed cell.
  • the maximum concentration is preferably 100 to 1000 ⁇ M when the GS inhibitor is methionine sulfoximine (MSX). More preferably 200 to 500 ⁇ M, and still more preferably about 300 ⁇ M.
  • the cells into which the expression vector has been introduced are added to the selective culture by the second selective culture, and the selective medium for selecting with the third selective marker. It can also be selectively cultured.
  • the selective culture using the third selection marker may be performed either before or after the second selective culture.
  • the third selectable marker is a drug resistance gene. Therefore, a drug corresponding to the drug resistance gene is added to the selective medium. At this time, cells with a higher expression level of the drug resistance gene can be obtained by increasing the concentration of the drug in the selective medium stepwise.
  • the maximum concentration is preferably 3 to 30 ⁇ M, more preferably 5 to 20 ⁇ M, more preferably about 10 ⁇ M.
  • the maximum concentration is preferably 0.4 to 1.5 mg / mL, more preferably 0.8 to 1.2 mg / mL, and further preferably about 1 mg / mL.
  • the pE-neo vector was digested with SfiI and BstXI, and an approximately 1 kbp region containing a neomycin resistance gene was excised (FIG. 2-1).
  • the hygromycin gene was amplified by PCR reaction using pcDNA3.1 / Hygro (+) (Invitrogen) as a template and using the primer Hyg-Sfi5 ′ (SEQ ID NO: 13) and primer Hyg-BstX3 ′ (SEQ ID NO: 14). ( Figure 2-2).
  • the amplified hygromycin gene was digested with SfiI and BstXI and inserted into the above pE-neo vector to construct a pE-hygr vector (FIG. 2-3).
  • Base from 5 ′ end including binding site (IRES), hygromycin resistance gene (Hygr gene), and polyadenylation region (mPGKpA) of mouse phosphoglycerate kinase (mPGK)
  • the region consisting of 1 to 6 is the “XhoI site”
  • the bases 120 to 715 followed by the bases 716 to 718 (atg) are the “internal ribosome binding site derived from the 5 ′ untranslated region of mouse encephalomyocarditis virus
  • a region consisting of bases 716 to 1741 containing bases 716 to 718 (atg) is a "base sequence encoding a hygromycin resistance gene”
  • a region consisting of bases 1747 to 2210 is "mouse phosphoglycerate kinase" (mPGK) polyadeni Bases sequence containing a region ", and 3 'regions of six bases (bases 2211-2216) of the terminal is" BamHI site
  • a DNA fragment containing a part of EMCV IRES was amplified by PCR using pBSK (IRES-Hygr-mPGKpA) as a template and using primer IRES5 ′ (SEQ ID NO: 17) and primer IRES3 ′ (SEQ ID NO: 18).
  • This DNA fragment is digested with restriction enzymes (XhoI and HindIII) and pBSK This was inserted between the XhoI and HindIII sites of (IRES-Hygr-mPGKpA) and designated pBSK (NotI-IRES-Hygr-mPGKpA) (FIG. 3-2).
  • pBSK NotI-IRES-Hygr-mPGKpA
  • restriction enzymes NotI and BamHI
  • This DNA fragment was digested with restriction enzymes (BglII and EcoRI) and inserted between the BglII and EcoRI sites of pCI-neo (Promega) to obtain pPGK-neo (FIGS. 3-4).
  • pE-IRES-Hygr was digested with restriction enzymes (NotI and BamHI) to cut out a DNA fragment (IRES-Hygr) and inserted between NotI and BamHI sites of pPGK-neo, which was designated as pPGK-IRES-Hygr ( Fig. 3-5).
  • CDNA was prepared from CHO-K1 cells, and using this as a template, a DNA fragment containing the GS gene was amplified by PCR using primer GS5 ′ (SEQ ID NO: 22) and primer GS3 ′ (SEQ ID NO: 23). This DNA fragment was digested with restriction enzymes (BalI and BamHI) and inserted between the BalI and BamHI sites of pPGK-IRES-Hygr to obtain pPGK-IRES-GS- ⁇ polyA (FIGS. 3-6).
  • restriction enzymes BalI and BamHI
  • pCAGIPuro (Miyahara Puromycin resistance by PCR using M. et.al., J. Biol. Chem. 275,613-618 (2000)) as template and primer puro5 ′ (SEQ ID NO: 24) and primer puro3 ′ (SEQ ID NO: 25).
  • puro r gene of the base sequence (SEQ ID NO: 26.5 'end including a base region consisting of 2-7' AflII site "region consisting of bases 8-607 followed this" puromycin resistance gene ( puro r gene) a nucleotide sequence encoding a ", and, the next region consisting of bases 608 to 619 is" BstXI site ".) was from consisting DNA fragment was amplified (the amino acid corresponding to puro r gene The sequence is that shown in SEQ ID NO: 27).
  • This DNA fragment was digested with restriction enzymes (AflII and BstXI) and inserted between the AflII and BstXI sites of the expression vector pE-neo to obtain pE-puro (FIGS. 3-7).
  • DNA fragment containing SV40 late polyadenylation region was amplified by PCR using pE-puro as a template and primer SV40polyA5 ′ (SEQ ID NO: 28) and primer SV40polyA3 ′ (SEQ ID NO: 29).
  • This DNA fragment was digested with restriction enzymes (NotI and HpaI) and inserted between NotI and HpaI sites of the expression vector pE-puro, which was designated as pE-puro (XhoI) (FIGS. 3-8).
  • pPGK-IRES-GS- ⁇ polyA is digested with restriction enzymes (NotI and XhoI), a DNA fragment containing the IRES-GS region is excised, and inserted between NotI and XhoI sites of the expression vector pE-puro (XhoI). This was designated as pE-IRES-GS-puro ( Figure 3-9).
  • This DNA fragment is digested with restriction enzymes (NotI and PstI), and the excised DNA fragment is inserted between NotI and PstI sites of the expression vector pE-IRES-GS-puro, which is inserted into pE-mIRES-GS-puro. (FIG. 4).
  • a DNA fragment containing the SV40 late polyA region was amplified by PCR using the expression vector pE-neo as a template and the primer SV40polyA5'-2 (SEQ ID NO: 32) and primer SV40polyA3'-2 (SEQ ID NO: 33). This DNA fragment was digested with restriction enzymes (XhoI and BamHI) and inserted between the XhoI and BamHI sites of pE-mIRES-GS-puro to obtain pE-mIRES-GS (FIG. 5).
  • restriction enzymes XhoI and BamHI
  • a DNA fragment containing the mNeo r gene was amplified by PCR using the primer mNeoB5 ′ (SEQ ID NO: 36) and primer mNeoB3 ′ (SEQ ID NO: 37) using the pCI-mNeo vector as a template.
  • This DNA fragment was digested with restriction enzyme (EagI) and pUC57-IE1 (Gene It was inserted into NotI of Script Corp. and called pUC57-IE1-mNeo.
  • the pCI-neo as a template a region using the primers MNeoC5 '(SEQ ID NO: 38) and primer MNeoC3' (SEQ ID NO: 39), containing the 3 'region and synthetic poly A signal of the neomycin-resistant gene by PCR (neo r gene) This was used as a mega primer (neo-polyA).
  • pUC57-IE1-mNeo as a template and using primer mNeoD5 '(SEQ ID NO: 40) and megaprimer (neo-polyA)
  • a region containing the mNeo r gene and synthetic poly A signal was amplified by PCR. .
  • the obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes (AflII and BamHI) and inserted between the AflII and BamHI sites of pE-mIRES-GS-puro to obtain pE-mIRES-GS-mNeo (FIG. 6).
  • pE-mIRES-GS-mNeo was digested with a restriction enzyme (PvuI), and a DNA fragment containing the mutant neomycin resistance gene (mNeo r gene) and a DNA fragment containing the SV40 late polyA region were excised.
  • mNeo r gene mutant neomycin resistance gene
  • mNeo r gene mutant neomycin resistance gene
  • DNA fragment containing the SV40 late polyA region was excised.
  • the DNA fragment containing the SV40 late polyA region as a template, using the primer SVpA-Mega-F (SEQ ID NO: 41) and primer SVpA-BstXI-R (SEQ ID NO: 42), the DNA fragment containing the SV40 late polyA region by PCR was amplified.
  • This gene fragment and the DNA fragment containing the mNeo r gene were joined together by PCR to produce a DNA fragment containing the SV40 late polyA region downstream of the mNeo r gene.
  • This DNA fragment was digested with a restriction enzyme (BstXI) and inserted between the BstXI sites of pBlue-EF1 / mIRES to obtain pBlue-EF1 / mIRES-mNeo (FIG. 7).
  • pGEM mDHFR31
  • F31W restriction enzymes
  • the region consisting of bases 1 to 6 is the “MluI site”, and the region consisting of bases 14 to 364 is “coding the hTSH ⁇ chain And a region comprising bases 365 to 372 following this is a “NotI site”), and a DNA containing the human thyroid stimulating hormone ⁇ chain (hTSH ⁇ ) gene (SEQ ID NO: 47, 5 ′ end)
  • the region consisting of bases 1 to 6 is the “MluI site”
  • the region consisting of bases 14 to 433 is the “base sequence encoding the TSH ⁇ chain”
  • the subsequent region consisting of bases 434 to 441 is the “NotI site” And incorporated into pUC57, respectively, to form pUC57-hTSH ⁇ and pUC57-hTSH ⁇ (Shanghai ShineGene Molecular Biotech).
  • a DNA (SEQ ID NO: 48) containing the 3 'untranslated region (WAP3'UTR) of rabbit whey acidic protein (WAP) was synthesized and incorporated into pUC57 to obtain pUC57-WAP3'UTR (Shanghai ShineGene Molecular Biotech).
  • PUC57- including WAP3'UTR A DNA fragment having the TSH ⁇ gene and WAP3′UTR downstream thereof was amplified by PCR using WAP3′UTR as a template and megaprimer TSH ⁇ and primer WAP3 ′ (SEQ ID NO: 53) (hTSH ⁇ -WAP3′UTR).
  • a DNA fragment having TSH ⁇ gene and WAP3'UTR downstream was amplified by PCR using pUC57-WAP3'UTR containing WAP3'UTR as a template and megaprimer TSH ⁇ and primer WAP3 '(hTSH ⁇ -WAP3 'UTR).
  • Each obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes (MluI and NotI) and inserted between the MluI and NotI sites of pCI-neo, and pCI-neo (hTSH ⁇ -WAP3'UTR) and pCI-neo (hTSH ⁇ -WAP3, respectively) 'UTR) (FIGS. 10-1 and 10-2).
  • restriction enzymes MluI and NotI
  • pCI-neo (hTSH ⁇ )
  • pCI-neo (hTSH ⁇ -WAP3′UTR)
  • pCI-neo (hTSH ⁇ -WAP3′UTR)
  • MluI and NotI restriction enzymes
  • a DNA fragment containing the hTSH ⁇ gene and WAP3′UTR was excised. This DNA fragment was inserted between the MluI and NotI sites of pE-mIRES-GS-mNeo to obtain pE-mIRES-GS-mNeo (hTSH ⁇ ) (FIG. 11).
  • pCI-neo (hTSH ⁇ )
  • pCI-neo (hTSH ⁇ -WAP3′UTR)
  • MluI and NotI restriction enzymes
  • a DNA fragment containing the hTSH ⁇ gene and WAP3′UTR was excised. This DNA fragment was inserted between the MluI and NotI sites of pBlue-EF1 / mIRES-mNeo to obtain pBlue-EF1 / mIRES-mNeo (hTSH ⁇ ) (FIG. 12).
  • This DNA fragment was inserted between the ClaI and BamHI sites of pE-mIRES-GS-mNeo (hTSH ⁇ ), and this was inserted into the human thyroid stimulating hormone (hTSH) expression vector pE-mIRES-GS-mNeo-dual (hTSH). (FIG. 13).
  • the obtained DNA fragment was digested with a restriction enzyme (BbsI) and inserted between the BsmBI sites of pE-mIRES-GS-mNeo-dual (hTSH), which was then inserted into the human thyroid stimulating hormone (hTSH) expression vector pE- It was set as mIRES-GS-mNeo-dual + mDHFR31 (hTSH) (FIG. 14).
  • BbsI restriction enzyme
  • hTSH human thyroid stimulating hormone
  • This DNA is digested with restriction enzymes (MluI and NotI), and the resulting DNA fragment is inserted between the MluI and NotI sites of pE-mIRES-GS-mNeo, which is inserted into pE-mIRES-GS-mNeo (RTX-H (FIG. 15).
  • This DNA is digested with restriction enzymes (MluI and NotI), and the resulting DNA fragment is inserted between the MluI and NotI sites of pBlue-EF1 / mIRES-mNeo, which is inserted into pBlue-EF1 / mIRES-mNeo (RTX-L ) (FIG. 16).
  • pE-mIRES-GS-mNeo-dual (RTX) pBlue-EF1 / mIRES-mNeo (RTX-L) is digested with restriction enzymes (ClaI and BglII), and the resulting DNA fragment is inserted between the ClaI and BamHI sites of pE-mIRES-GS-mNeo (RTX-H) This was designated pE-mIRES-GS-mNeo-dual (RTX) as a rituximab expression vector (FIG. 17).
  • pBlue-EF1 / SVpA (RTX-L) is digested with restriction enzymes (ClaI and BglII), and the resulting DNA fragment is inserted between the ClaI and BamHI sites of pE-mIRES-GS-mNeo (RTX-H). This was designated as pE-mIRES-GS-dual (RTX) (FIG. 18-2).
  • SV40 early promoter (SV40 enhancer / promoter, mutant DHFR (F31W) by PCR using pE-mDHFR31 as a template and primer dE-BbsI-F (SEQ ID NO: 58) and primer SynpA-BbsI-R (SEQ ID NO: 59) And a DNA fragment containing a synthetic polyadenylation signal, which was digested with a restriction enzyme (BbsI) and inserted between the BsmBI sites of pE-mIRES-GS-dual (RTX), which was expressed by rituximab
  • the vector for use was pE-mIRES-GS-dual + mDHFR31 (RTX) (FIG. 18-3).
  • CHO-K1 cells derived from Chinese hamster ovary were electroporated (Invitrogen), pE-mIRES-GS-mNeo-dual (hTSH), pE-mIRES-GS-mNeo-dual + mDHFR31 (hTSH) , PE-mIRES-GS-mNeo-dual (RTX) and pE-mIRES-GS-dual + mDHFR31 (RTX), respectively.
  • the transformed cells were subjected to selective culture using a selective medium to obtain hTSH-expressing cells and RTX-expressing cells.
  • pE-mIRES-GS-mNeo-dual + mDHFR31 TSH
  • pE-mIRES-GS-dual + mDHFR31 RTX
  • CD Opti CHO medium Invitrogen
  • WAKO methotrexate
  • WAKO methotrexate
  • the medium was replaced with CD Opti CHO medium (Invitrogen) containing methionine sulphoximine (SIGMA), and cultured while gradually increasing the concentration of methionine sulphoximine contained in the medium.
  • the cells were cultured in a medium containing methionine sulfoximine at a concentration of 300 ⁇ M, and cells resistant to methionine sulfoximine were selectively grown.
  • the cells obtained here were used as bulk cells.
  • the bulk cells obtained by the above selective culture were seeded in a 96-well plate at 1 to 3 cells / well, and cultured for about 2 weeks until colonies were formed in CD-Opti-CHO medium (Invitrogen).
  • the concentration of hTSH and RTX in the culture supernatant was measured to obtain highly expressed clonal cells.
  • methionine sulfoximine was added to the medium at a concentration of 300 ⁇ M.
  • the clonal cells with high expression thus obtained were subjected to the following experiment as hTSH-expressing cells and RTX-expressing cells.
  • mouse anti-hTSH-beta monoclonal antibody (Leinco Technologies) solution was added to a 96-well plate and allowed to stand at room temperature for 1 hour to immobilize the antibody on the plate. Discard the solution and wash the plate 3 times with TBS-T solution (Tris: 0.05M, NaCl: 0.138 M, KCl: 0.0027M, 0.05% Tween20, pH 8.0), then plate with 1% BSA / TBS-T solution. 200 ⁇ L each was added to the plate and allowed to stand at room temperature for 1 hour to block the plate.
  • TBS-T solution Tris: 0.05M, NaCl: 0.138 M, KCl: 0.0027M, 0.05% Tween20, pH 8.0
  • the plate was washed 3 times with TBS-T solution, and 100 ⁇ L of the sampled culture supernatant was added to the plate as a specimen and allowed to stand at room temperature for 1 hour. At this time, the culture supernatant was diluted with TBS-T solution as necessary. Also, hTSH (NIBSC) with TBS-T solution 0.244-62.5 A solution diluted to a concentration of ng / mL was added as a standard solution to the plate in the same manner as the sample, and allowed to stand.
  • TBS-T solution 100 ⁇ L of the sampled culture supernatant was added to the plate as a specimen and allowed to stand at room temperature for 1 hour. At this time, the culture supernatant was diluted with TBS-T solution as necessary.
  • hTSH (NIBSC) with TBS-T solution 0.244-62.5 A solution diluted to a concentration of ng / mL was added as a standard solution to the plate in the same manner as the sample, and allowed to stand.
  • the plate was washed 3 times with TBS-T solution, and 100 ⁇ L of HRP-labeled mouse anti-hTSH-alpha monoclonal antibody (Leinco Technologies) was added to the plate as a secondary antibody and allowed to stand at room temperature for 1 hour. .
  • the plate was washed 3 times with TBS-T solution, HRP substrate (WAKO) was added, and the plate was allowed to stand at room temperature for 15 minutes, and then the reaction was stopped by adding sulfuric acid.
  • the absorbance at 490 nm was measured with a microwell plate reader, and the measured value of the sample was interpolated into the calibration curve obtained from the measured value of the absorbance of the standard solution to obtain the concentration of hTSH contained in the sample.
  • Rituximab expression was measured using the Human IgG ELISA Quantitation Set (Bethyl Laboratories). 100 ⁇ L each of goat anti-hIgG antibody (Bethyl Laboratories) solution was added to a 96-well plate and allowed to stand at room temperature for 1 hour to immobilize the antibody on the plate. After discarding the solution and washing the plate 3 times with TBS-T solution, 200 ⁇ L of 1% BSA / TBS-T solution was added to the plate and allowed to stand at room temperature for 1 hour to block the plate.
  • the plate was washed 3 times with TBS-T solution, and 100 ⁇ L of the sampled culture supernatant was added to the plate as a specimen and allowed to stand at room temperature for 1 hour. At this time, the culture supernatant was diluted with TBS-T solution as necessary.
  • rituximab (Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) diluted with TBS-T solution to a concentration of 3.9 to 500 ng / mL was added as a standard solution to the plate and allowed to stand.
  • the plate was washed three times with TBS-T solution, 100 ⁇ L of HRP-labeled goat anti-hIgG antibody (Bethyl Laboratories) was added to the plate as a secondary antibody, and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • the plate was washed 3 times with TBS-T solution, HRP substrate (WAKO) was added, and the plate was allowed to stand at room temperature for 15 minutes, and then the reaction was stopped by adding sulfuric acid. 490 with a microwell plate reader The absorbance at nm was measured, and the measured value of the sample was interpolated into a calibration curve obtained from the measured value of the absorbance of the standard solution, thereby obtaining the concentration of rituximab contained in the sample.
  • pE-mIRES-GS which is an expression vector for hTSH containing the elongation factor 1 promoter (EF-1p), hTSH gene, mutant internal ribosome binding site (mIRES), and GS gene as a first selection marker in this order.
  • hTSH pE-mIRES-GS-mNeo-dual + mDHFR31
  • hTSH pE-mIRES-GS-mNeo-dual + mDHFR31
  • RTX -mNeo-dual
  • RTX pE-mIRES-GS-dual + mDHFR31
  • the present invention can express a recombinant protein at a high level using mammalian cells, it can be used for reducing the production cost of a product containing the recombinant protein, for example, a pharmaceutical product containing the recombinant protein. can do.
  • LacZ promoter 2 mPGK promoter 3 Internal ribosome binding site derived from wild-type mouse encephalomyocarditis virus containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (EMCV-IRES) 3a Internal ribosome binding site derived from a mutant mouse encephalomyocarditis virus containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 (EMCV-mIRES) 4 Polyadenylation region of mPGK (mPGKpA) 5 Base sequence containing EF-1p and first intron 6 SV40 late polypolyadenylation region 7 Region containing SV40 early promoter (SV40 enhancer / promoter) 8 Synthetic polypolyadenylation region 9 Region containing cytomegalovirus promoter 10 Glutamine synthase gene
  • Sequence number 2 Modified murine encephalomyocarditis virus
  • n is a, c, g, or t
  • Sequence number 3 Modified murine encephalomyocarditis virus
  • n is a, c, g, or t
  • Sequence number 4 Modified murine encephalomyocarditis virus
  • Sequence number 6 Modified murine encephalomyocarditis virus
  • Sequence number 7 Modified murine encephalomyocarditis virus
  • n is a, c, g, or t
  • Sequence number 8 Modified murine encephalomyocarditis virus
  • n is a, c, g, or t
  • Sequence number 11 Modified Mus musculus DHFR
  • Sequence number 12 Synthetic Construct Sequence number 13: Primer Hyg-Sfi5 ', synthetic sequence Sequence number 14: Primer Hyg-BstX3 ', synthetic sequence Sequence number

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Abstract

　組換え体蛋白質を哺乳動物細胞内で効率よく発現させるための新規な発現ベクター，該ベクターで形質転換された哺乳動物細胞，及び該哺乳動物細胞の製造方法が開示されている。当該発現ベクターは，蛋白質を発現させるための発現ベクターであって，遺伝子発現制御部位，並びに，その下流に該蛋白質をコードする遺伝子，更に下流に内部リボソーム結合部位，及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み，且つ，該遺伝子発現制御部位の又は該遺伝子発現制御部位とは別の遺伝子発現制御部位の下流にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を更に含んでなる。

Description

新規な発現ベクター
　本発明は，組換え体蛋白質を哺乳動物細胞内で効率よく発現させるための新規な発現ベクターに関し，詳しくは，遺伝子発現制御部位，その下流に所望の蛋白質をコードする遺伝子，更に下流に内部リボソーム結合部位，及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み，且つ該遺伝子発現制御部位又は該遺伝子発現制御部位とは別の遺伝子発現制御部位の下流に，ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を更に含んでなる，発現ベクターに関する。
　所望の蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞を用いて，組換え体蛋白質を製造する方法は，医薬品製造等の産業分野で広く普及した技術であり，α-ガラクトシダーゼＡ，イズロン酸2-スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，ガルスルファーゼ，α-L-イズロニダーゼ，酸性α-グルコシダーゼ等のリソソーム酵素，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-PA），血液凝固第VII因子，血液凝固第VIII因子，血液凝固第IX因子等の血液凝固因子，エリスロポエチン，インターフェロン，トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン，顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF），各種抗体医薬等がこの技術を用いて製造され，医薬品として市販されている。
　このとき，発現ベクターとして，強力な遺伝子発現を誘導する遺伝子制御部位，例えば，サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶ４０エンハンサー／プロモーター），伸長因子１α（ＥＦ－１）プロモーターなどの下流に，所望の蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだものを用いるのが一般的である。このような発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は，発現ベクターに組み込んだ所望の蛋白質を発現するようになるが，その発現量は個々の細胞により異なり一様ではない。従って，組換え体蛋白質を効率よく生産するためには，発現ベクターが導入された哺乳動物細胞から，所望の蛋白質の発現レベルが高い細胞を選択するステップが必要となる。この選択ステップを行うために，発現ベクターには選択マーカーとして働く遺伝子が組み込まれている。
　選択マーカーとして最も一般的なものはピューロマイシン，ネオマイシン等の薬剤を分解する酵素（薬剤耐性マーカー）である。哺乳動物細胞は一定濃度以上の上記薬剤の存在下で死滅する。しかし，発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は，発現ベクターに組み込んだ薬剤選択マーカーによりに上記薬剤を分解し，これを無毒化又は弱毒化することができるので，上記薬剤存在下でも生存可能となる。従って，発現ベクターが導入された細胞を，上記薬剤をある一定濃度含む培地中で培養すると，薬剤選択マーカーを高レベルで発現する細胞のみが増殖して，それらが選択される結果となる。薬剤選択マーカーを高レベルで発現する細胞は，発現ベクターに同時に組み込んだ所望の蛋白質をコードする遺伝子も高レベルに発現する傾向があるので，結果として，所望の蛋白質を高レベルで発現する哺乳動物細胞が得られる。
　所望の蛋白質を高レベルで発現する哺乳動物細胞を得る方法として，ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を選択マーカーとして利用する方法も知られている（非特許文献１）。ジヒドロ葉酸レダクターゼは，ジヒドロ葉酸をテトラヒドロ葉酸に還元する酵素である。哺乳動物細胞をＤＨＦＲの阻害剤である一定濃度以上のメトトレキサート（MTX）存在下で，チミジン・ヒポキサンチン欠乏培地で培養すると，細胞は死滅する。しかし，選択マーカーとしてＤＨＦＲ遺伝子が組み込まれた発現ベクターを哺乳動物細胞に導入すると，該細胞では，ＤＨＦＲの発現レベルが上昇するようになるので，より高濃度のMTX存在下でも増殖可能となる。このとき，MTXの濃度を徐々に上昇させながら培養を続けると，一層高濃度のMTX存在下でも増殖可能な細胞が得られる。この現象は，哺乳動物細胞のゲノム内に組み込まれた該発現ベクターが，ゲノム内で重複してコピー数を増やすことにより引き起こされると考えられている。すなわち，該発現ベクターのコピー数が増えることにより，一つの細胞中のゲノム内にあるＤＨＦＲの遺伝子数が増加することになり，相対的にＤＨＦＲの発現量が増加する。このとき，発現ベクターに同時に組み込んだ所望の蛋白質をコードする遺伝子のコピー数も重複して増加するので，所望の蛋白質を高レベルで発現する哺乳動物細胞が得られる。
　選択マーカーとして，グルタミン合成酵素（ＧＳ）を用いる発現ベクターも知られている（特許文献１，２）。グルタミン合成酵素は，グルタミン酸とアンモニアからグルタミンを合成する酵素である。哺乳動物細胞をグルタミン合成酵素の阻害剤である一定濃度以上のメチオニンスルホキシミン（MSX）存在下で，グルタミン欠乏培地で培養すると，細胞は死滅する。しかし，選択マーカーとしてグルタミン合成酵素が組み込まれた発現ベクターを哺乳動物細胞に導入すると，該細胞では，グルタミン合成酵素の発現レベルが上昇するようになるので，より高濃度のMSX存在下でも増殖可能となる。このとき，MSXの濃度を徐々に上昇させながら培養を続けると，より高濃度のMSX存在下でも増殖可能な細胞が得られる。この現象は，選択マーカーとしてＤＨＦＲを利用したときと同様の機構により起こる。従って，発現ベクターに，ＧＳ遺伝子とともに所望の蛋白質をコードする遺伝子を組み込むことにより，所望の蛋白質を高レベルで発現する哺乳動物細胞が得られる。例えば，特許文献１には，ＧＳ遺伝子とメチオニンスルホキシミン（MSX）を用いることにより，ＤＨＦＲ遺伝子とメトトレキセート（MTX）を使用する場合よりも，ベクターＤＮＡのコピー数を増加し得ることが記載されている。また，特許文献２には，ＧＳ遺伝子とMSXを用いることにより，ホスト細胞のＤＮＡ中で，ＧＳ遺伝子のコピー数の増加に付随して，これと異なる異系遺伝子のコピー数をも増加させることができ，かくして所望のポリペプチドの生産のレベルを増大できることが記載されている。
　このように，選択マーカーを含む発現ベクターは，効率の良い組換え体蛋白質の製造に適しており，広く用いられている。発現ベクター上で，所望の蛋白質をコードする遺伝子と選択マーカーをコードする遺伝子は，一般に，それぞれ別の遺伝子制御部位下に組み込まれる（特許文献３）。しかし，一つの遺伝子制御部位下に，所望の蛋白質と選択マーカーをコードする遺伝子を直列に組み込んで発現させる方法も知られており（特許文献４～７），このとき，所望の蛋白質と選択マーカーをコードする遺伝子の間には，内部リボソーム結合部位（IRES: internal ribosome entry site）などが挿入され，これにより，一つの遺伝子制御部位から2つの遺伝子の発現が可能となる。内部リボソーム結合部位は種々知られており，例えば，ピコルナウイルス，ポリオウイルス，脳心筋炎ウイルス，鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス，由来のものがある（特許文献８～１０）。
　内部リボソーム結合部位を応用した発現ベクターとして，内部リボソーム結合部位の下流に選択マーカーとして単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼを組み込んだ発現ベクター（特許文献１１），２以上の内部リボソーム結合部位を用いて３種以上の遺伝子を結合させた発現ベクター（特許文献１２）が知られている。
　上記のように，種々の発現ベクターの開発により，哺乳動物細胞を用いて組換え体蛋白質を製造する方法が，エリスロポエチン等の医薬品の製造において実用化されているが，その製造コストを低減するため，より効率のよい発現ベクターの開発が常に求められている。
特表昭６３－５０２９５５号公報 特表平５－５０４０５０号公報 特開２００９－２７３４２７号公報 特開昭５９－１７３０９６号公報 特開昭６０－１９９３８７号公報 特表平４－５００００４号公報 特開平８－２５６７７６号公報 特表平６－５０９７１３号公報 特表平８－５０２６４４号公報 特開平１０－３２７８７１号公報 特表２００８－５３９７８５号公報 特表２００４－５２００１６号公報
Kaufman RJ. et al., Mol Cel Biol. 2, 1304-19 (1982)
　組換え体蛋白質を哺乳動物細胞内で効率よく発現させるための新規な発現ベクター，該ベクターで形質転換された哺乳動物細胞，及び該哺乳動物細胞の製造方法を提供することを目的とする。
　上記目的に向けた研究において，本発明者らは，遺伝子発現制御部位，並びに，その下流にヒト甲状腺刺激ホルモン（hTSH）等の所望の蛋白質をコードする遺伝子，更に下流に内部リボソーム結合部位，及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み，且つ該遺伝子発現制御部位の又は別の遺伝子発現制御部位の下流にジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子を更に含んだ発現ベクターを用いて，哺乳動物細胞を形質転換させることにより，該蛋白質をコードする遺伝子を高レベルで発現させることができることを見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を提供する。
　１．蛋白質を発現させるための発現ベクターであって，遺伝子発現制御部位（Ａ），並びに，その下流に該蛋白質をコードする遺伝子，更に下流に内部リボソーム結合部位，及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み，且つ，該遺伝子発現制御部位（Ａ）の又は該遺伝子発現制御部位（Ａ）とは別の遺伝子発現制御部位（Ｂ）の下流にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を更に含んでなる，発現ベクター。
　２．該遺伝子発現制御部位（Ａ）及び／又は該遺伝子発現制御部位（Ｂ）が，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，伸長因子１プロモーターからなる群から選択されるものである，上記１の発現ベクター。
　３．該内部リボソーム結合部位が，ピコルナウイルス科のウイルス，口蹄疫ウイルス，Ａ型肝炎ウイルス，Ｃ型肝炎ウイルス，コロナウイルス，ウシ腸内ウイルス，サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス，コクサッキーＢ型ウイルス，ヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質遺伝子，ショウジョウバエアンテナペディア遺伝子，ショウジョウバエウルトラビトラックス遺伝子からなる群から選択されるウイルス又は遺伝子の5'非翻訳領域に由来するものである，上記１又は２の発現ベクター。
　４．該内部リボソーム結合部位が，ピコルナウイルス科のウイルスの5'非翻訳領域に由来するものである，上記１又は２の発現ベクター，
　５．該内部リボソーム結合部位が，マウス脳心筋炎ウイルスの5'非翻訳領域に由来するものである，上記１又は２の発現ベクター。
　６．該内部リボソーム結合部位が，野生型の内部リボソーム結合部位の塩基配列に，１又は２以上の変異を加えたものである，上記１ないし５の何れかの発現ベクター，
　７．該野生型の内部リボソーム結合部位の塩基配列が複数の開始コドンを含み，該変異により，それら複数の開始コドンのうち一部が破壊されたものである，上記６の発現ベクター。
　８．該内部リボソーム結合部位が，配列番号１の塩基配列を含むものである，上記５の発現ベクター。
　９．該内部リボソーム結合部位が，配列番号２の塩基配列を含むものである，上記５の発現ベクター。
　１０．該内部リボソーム結合部位が，配列番号３の塩基配列を含むものである，上記５の発現ベクター。
　１１．該内部リボソーム結合部位が，配列番号４の塩基配列を含むものである，上記５の発現ベクター。
　１２．該内部リボソーム結合部位が，配列番号５の塩基配列を含むものである，上記５の発現ベクター。
　１３．該内部リボソーム結合部位が，配列番号６の塩基配列を含むものである，上記５の発現ベクター。
　１４．該蛋白質をコードする該遺伝子と該内部リボソーム結合部位との間の領域又はグルタミン合成酵素をコードする該遺伝子の下流の領域において，該内部リボソーム結合部位とは別の内部リボソーム結合部位及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる，上記１ないし１３の何れかの発現ベクター。
　１５．該遺伝子発現制御部位（Ａ）及び遺伝子発現制御部位（Ｂ）とは別に，更なる遺伝子発現制御部位（Ｃ）及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる，上記１ないし１３の何れかの発現ベクター。
　１６．該薬剤耐性遺伝子が，ピューロマイシン又はネオマイシン耐性遺伝子である，上記１４又は１５の発現ベクター。
　１７．該蛋白質をコードする該遺伝子が，ヒト由来の遺伝子である上記１ないし１６の何れかの発現ベクター。
　１８．ヒト由来の該遺伝子が，リソソーム酵素，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-PA），血液凝固因子，エリスロポエチン，インターフェロン，トロンボモジュリン，甲状腺刺激ホルモン（TSH），卵胞刺激ホルモン，顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF），及び抗体をコードする遺伝子からなる群から選択されるものである，上記１７の発現ベクター。
　１９．ヒト由来の該遺伝子が，リソソーム酵素をコードする遺伝子である，上記１７の発現ベクター。
　２０．該リソソーム酵素が，α-ガラクトシダーゼＡ，イズロン酸2-スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，ガルスルファーゼ，α-L-イズロニダーゼ，及び酸性α-グルコシダーゼからなる群から選択されるものである，上記１９の発現ベクター。
　２１．ヒト由来の該遺伝子が，エリスロポエチンをコードする遺伝子である上記１７の発現ベクター。
　２２．上記１ないし２１の何れかの発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞。
　２３．該哺乳動物細胞が，内因性のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を欠損したものである，上記２２の細胞。
　２４．該哺乳動物細胞が，ＣＨＯ細胞である，上記２２又は２３の細胞。
　２５．（ａ）上記１ないし２１の何れかの発現ベクターを，哺乳動物細胞に導入するステップ，
　（ｂ）該発現ベクターが導入された哺乳動物細胞を，ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤の存在下で選択培養するステップ，及び
　（ｃ）該選択培養により選択された細胞を，グルタミン合成酵素阻害剤の存在下で更に選択培養するステップ
を含む，該蛋白質をコードする遺伝子を発現する形質転換細胞の製造方法。
　２６．（ａ）上記１４ないし１６の何れかの発現ベクターを，哺乳動物細胞に導入するステップ，
　（ｂ）該発現ベクターが導入された哺乳動物細胞を，ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤の存在下で選択培養するステップ，及び
　（ｃ）該選択培養により選択された細胞を，グルタミン合成酵素阻害剤の存在下で更に選択培養するステップ
を含む，該蛋白質をコードする遺伝子を発現する形質転換細胞の製造方法であって，該ステップ（ａ）と該ステップ（ｂ）の間，又は該ステップ（ｂ）と該ステップ（ｃ）の間に，該発現ベクターが導入された哺乳動物細胞を，該薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤の存在下で選択培養するステップを更に含む，製造方法。
　本発明によれば，哺乳動物細胞内で，所望の組換え体蛋白質を効率よく発現させるための，発現ベクターを得ることができる。該発現ベクターを哺乳動物細胞に導入し，次いで選択培養することにより，該組換え体蛋白質を効率よく生産する形質転換細胞を得ることができる。こうして得た形質転換細胞を用いれば，該組換え体蛋白質の製造コストを大幅に低減することができる。
pE-neoベクターの構築方法を示す流れ図。 pE-neoベクターの構築方法を示す流れ図。 pE-hygrベクターの構築方法を示す流れ図。 pE-hygrベクターの構築方法を示す流れ図。 pE-hygrベクターの構築方法を示す流れ図。 pE-IRES-GS-puroの構築方法を示す流れ図。 pE-IRES-GS-puroの構築方法を示す流れ図。 pE-IRES-GS-puroの構築方法を示す流れ図。 pE-IRES-GS-puroの構築方法を示す流れ図。 pE-IRES-GS-puroの構築方法を示す流れ図。 pE-IRES-GS-puroの構築方法を示す流れ図。 pE-IRES-GS-puroの構築方法を示す流れ図。 pE-IRES-GS-puroの構築方法を示す流れ図。 pE-IRES-GS-puroの構築方法を示す流れ図。 pE-mIRES-GS-puroの構築方法を示す流れ図。 pE-mIRES-GSの構築方法を示す流れ図。 pE-mIRES-GS-mNeoの構築方法を示す流れ図。 pBlue-EF1/mIRES-mNeoの構築方法を示す流れ図。 pBlue-EF1/SVpAの構築方法を示す流れ図。 pE-mDHFR31の構築方法を示す流れ図。 pCI-neo(TSHα-WAP3'UTR)の構築方法を示す流れ図。 pCI-neo(TSHβ-WAP3'UTR)の構築方法を示す流れ図。 pE-mIRES-GS-mNeo(hTSHβ)の構築方法を示す流れ図。 pBlue-EF1/mIRES-mNeo(hTSHα)の構築方法を示す流れ図。 pE-mIRES-GS-mNeo-dual(hTSH)の構築方法を示す流れ図。 pE-mIRES-GS-mNeo-dual+mDHFR31(hTSH)の構築方法を示す流れ図。 pE-mIRES-GS-mNeo(RTX-H)の構築方法を示す流れ図。 pBlue-EF1/mIRES-mNeo(RTX-L)の構築方法を示す流れ図。 pE-mIRES-GS-mNeo-dual(RTX)の構築方法を示す流れ図。 pBlue-EF1/SVpA(RTX-L)の構築方法を示す流れ図。 pE-mIRES-GS-dual(RTX)の構築方法を示す流れ図。 pE-mIRES-GS-dual+mDHFR31(RTX)の構築方法を示す流れ図。
　本発明において，「遺伝子」の語は，構造遺伝子を意味する。また，「遺伝子発現制御部位」とは，その下流に存在する遺伝子の転写の頻度を制御（調節）することができるＤＮＡ上の領域のことであり，一般にプロモーター又はプロモーター遺伝子と称されるものである。遺伝子発現制御部位は，生体内で発現する遺伝子のほぼ全ての上流側に存在し，その転写の頻度を制御（調節）するものであり，その塩基配列は多様である。本発明において用いることのできる遺伝子発現制御部位は，その下流に組み込んだ遺伝子の転写を，哺乳動物細胞内において強力に誘導することができるものである限り特に限定はないが，好ましくはサイトメガロウイルス（CMV）由来のプロモーター，SV40 初期プロモーター等のウイルス由来のプロモーター，及び伸長因子１α(EF-1)プロモーターなどである。
　本発明において，「内部リボソーム結合部位」とは，mRNA鎖の内部に存在する，リボソームが直接結合し且つキャップ構造非依存性に翻訳を開始し得る領域（構造），又は転写されることにより該領域を生じるDNA鎖の領域（構造）である。また，本発明において，「内部リボソーム結合部位をコードする遺伝子」とは，転写されることにより該領域を生じるDNA鎖の領域（構造）である。内部リボソーム結合部位は，一般に，IRES（internal ribosome entry site）と称され，ピコルナウイルス科のウイルス（ポリオウイルス，ライノウイルス，マウス脳心筋炎ウイルスなど），口蹄疫ウイルス，Ａ型肝炎ウイルス，Ｃ型肝炎ウイルス，コロナウイルス，ウシ腸内ウイルス，サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス，コクサッキーＢ型ウイルス等のウイルスの5'非翻訳領域，ヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質，ショウジョウバエアンテナペディア，ショウジョウバエウルトラビトラックス等の遺伝子の5'非翻訳領域に見出されている。ピコルナウイルスの場合，そのIRESは，mRNAの5'非翻訳領域に存在する約450bpからなる領域である。ここで「ウイルスの5'非翻訳領域」とは，ウイルスのmRNAの5'非翻訳領域，又は転写されることにより該領域を生じるDNA鎖の領域（構造）である。
　本発明において，内部リボソーム結合部位は，哺乳動物細胞内，特にチャイニーズハムスターの卵巣に由来する細胞（ＣＨＯ細胞）内で，内部リボソーム結合部位として機能するものである限り特に限定はなく，何れのものをも使用することができる。それらのうち，好ましくはウイルスの5'非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位，より好ましくはピコルナウイルス科のウイルスの5'非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位，更に好ましくはマウス脳心筋炎ウイルスの5'非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位が挙げられる。
　本発明において，内部リボソーム結合部位は，野生型の塩基配列を有するものをそのまま使用することができる。また，これら野生型の内部リボソーム結合部位の塩基配列に，１又は２以上の変異（例えば，置換，欠損，又は／及び挿入などをいう。）を加えた変異型の内部リボソーム結合部位も，哺乳動物細胞内（特にＣＨＯ細胞内）で内部リボソーム結合部位として機能するものである限り，何れのものをも使用することができる。また，２以上の内部リボソーム結合部位を融合させたキメラ型の内部リボソーム結合部位も，使用することができる。
　また，本発明においては，内部リボソーム結合部位の制御下に，グルタミン合成酵素をコードする遺伝子（ＧＳ遺伝子）を配置することにより，ＧＳ遺伝子の発現量が制御される。ＧＳ遺伝子の発現量を，内部リボソーム結合部位下で制御することにより，後述するように，組換え体蛋白質を高レベルで発現する哺乳動物細胞を選択することが可能となる。
　なお，本発明において，ＧＳ遺伝子の導入された細胞に限らず，選択マーカーの導入された細胞を選択するための培養を「選択培養」といい，導入された細胞を選択するために使用される培地を「選択培地」という。
　内部リボソーム結合部位下でＧＳ遺伝子の発現量を制御する場合，種々の内部リボソーム結合部位の中から，好適なものが適宜選択して使用される。また，野生型の内部リボソーム結合部位に変異を加えたものも使用することもできる。
　例えば，野生型の内部リボソーム結合部位に翻訳開始点として使用し得る開始コドン（ATG）が複数個存在する場合，これら開始コドンの一部を破壊した内部リボソーム結合部位が使用できる。ここに，「破壊」とは，ある遺伝子配列に変異を加えることにより，当該遺伝子配列が本来有する機能を発揮させないようにすることをいう。例えば，野生型のマウス脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム結合部位の3'末端領域には，３つの開始コドン（ATG）が存在しており，その領域の塩基配列を配列番号１（5'- ATGataatATGgccacaaccATG-3'：開始コドンは，明示のため，大文字で表す。以下同じ。）で示す。この内部リボソーム結合部位の下流に存在するＧＳ遺伝子の発現量を減少させる場合，変異を加えて破壊する開始コドンは，好ましくは5’側から2番目及び3番目の開始コドンであり，より好ましくは2番目の開始コドンである。したがって，このような変異を加えた内部リボソーム結合部位としては，例えば，その3'末端が配列番号２（5'-ATGataatnnngccacaaccnnn-3'：nは任意の塩基，但し3個のnが開始コドンATGを構成する場合を除く。以下同じ。）若しくは配列番号７（5'-ATGataannnngccacaaccnnn-3'）の塩基配列であるもの，又は配列番号３（5'-ATGataatnnngccacaaccATG-3'）若しくは配列番号８（5'-ATGataannnngccacaaccATG-3'）の塩基配列であるものが挙げられる。より具体的には，その3’末端が配列番号４（5'-ATGataagcttgccacaaccATG-3'）の塩基配列である内部リボソーム結合部位であり，変異により5'側から2番目の開始コドンが破壊されたものである。更に詳しくは，野生型のマウス脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム結合部位は，配列番号５の塩基配列を含むものである。また，該塩基配列に変異を加えたものとしては，配列番号６の塩基配列が挙げられる。
　また，野生型及び／又は変異型の内部リボソーム結合部位の下流に配置したＧＳ遺伝子の発現量を，別の方法で更に調節することもできる。例えば，ＧＳ遺伝子を内部リボソーム結合部位の開始コドンに対してアウトオブフレームに組み込むことにより，あるいは内部リボソーム結合部位とＧＳ遺伝子との間に，転写若しくは翻訳を阻害する塩基配列を導入することによって，ＧＳ遺伝子の発現量を減少させることができる。転写を阻害する塩基配列は，特に限定はないが，例えば，ポリメラーゼ付加シグナル（5'-aataaa-3'）等がある。また，翻訳を阻害する塩基配列には，例えばリーディングスルーを誘導するストップコドン等がある。
　本発明において，「グルタミン合成酵素」というときは，グルタミン酸とアンモニアからグルタミンを合成することができるものである限り特に限定はなく，哺乳動物，爬虫類，鳥類，両生類，麟翅目（Lepidoptera）に属するカイコ（Bombyx mori），夜盗蛾（Spodoptera frugiperda），シャクトリムシ（Geometridae）等，双翅目（Diptera）に属するショウジョウバエ（Drosophila）等の昆虫，原核生物，線虫，酵母，放線菌，糸状菌，子嚢菌，坦子菌及び植物由来を含め如何なる生物由来のものでもよいが，好ましくは哺乳動物のものであり，ヒト又はチャイニーズハムスター由来のもの（特に，ＣＨＯ細胞由来のもの）が好適に使用できる。
　また，本発明において，「内因性ＧＳ遺伝子」というときは，発現ベクターが導入される細胞のゲノム上にもともと固有に存在するグルタミン合成酵素遺伝子のことをいい，「外因性ＧＳ遺伝子」というときは，発現ベクターにより細胞に導入されるグルタミン合成酵素遺伝子のことをいう。
　また，「グルタミン合成酵素阻害剤」というときは，上記グルタミン合成酵素の活性を阻害することができるものである限り特に限定はなく，何れのものも用いることができるが，好ましくはメチオニンスルホキシミン（MSX）が挙げられる。
　本発明の発現ベクターを導入した細胞をグルタミン合成酵素阻害剤（ＧＳ阻害剤）の存在下で培養すると，グルタミン合成酵素の発現量の低い細胞はグルタミンが合成できずに死滅するので，グルタミン合成酵素の発現量が相対的に高い細胞が選択的に得られることとなる。ＧＳ阻害剤の濃度を段階的に上昇させることにより，よりグルタミン合成酵素の発現量の高い細胞が得られる。グルタミン合成酵素の発現量の上昇は，主に，染色体上に組み込まれたＧＳ遺伝子が，遺伝子重複によりコピー数を増加させることによる。このとき，グルタミン合成酵素と共に発現ベクターに組み込んでおいた所望の蛋白質をコードする遺伝子も，遺伝子重複によりコピー数を増し，その結果，上記所望の蛋白質を高発現する細胞が得られる。
　しかし，ＣＨＯ細胞は，内因性のＧＳ遺伝子を有するので，グルタミン合成酵素阻害剤により，この内因性ＧＳ遺伝子が重複によりコピー数を増加させる可能性がある。この場合，発現ベクターに組み込まれたＧＳ遺伝子の重複が起こらなくとも，グルタミン合成酵素阻害剤の存在下で細胞が増殖することになり，上記所望の蛋白質を高発現する細胞を得ることができない。この問題は，ＧＳ遺伝子とは別の第２の選択マーカー遺伝子を発現ベクターに更に組み込み，この第２の選択マーカーにより細胞を選択することで，解消できる。
　まず，ＧＳ遺伝子と，ＧＳ遺伝子は異なる第２の選択マーカー遺伝子とを含む発現ベクターを細胞に導入する。次いで発現ベクターが導入された細胞を，ＧＳ遺伝子により選択培養する前に，第２の選択マーカーによって選択培養する。第２の選択マーカーによる選択においては，ＧＳ遺伝子は選択圧を受けないので，内因性ＧＳ遺伝子の影響を受けることなく，発現ベクターに組み込まれた当該第２の選択マーカー，ひいては発現ベクターに組み込まれた上記所望の蛋白質をコードする遺伝子及びＧＳ遺伝子を重複により増加させることができる。その結果，上記所望の蛋白質をある程度の高レベルで発現する細胞を得ることができる。この時点までの過程で，外因性ＧＳ遺伝子のコピー数は重複により増加するが，内因性ＧＳ遺伝子は，重複により増加することはない。
　第２の選択マーカーによる選択の際に用いられる選択培地（第２の選択培地）は，第２の選択マーカーのコードする遺伝子産物の活性を阻害する薬剤，細胞毒性を有し且つ第２の選択マーカーのコードする遺伝子産物によって無毒化又は弱毒化される物質等の，第２の選択マーカーにより細胞を選択するための物質が選択物質として添加されたものであるか，又は第２の選択マーカー導入後の細胞が栄養要求性を示さなくなる物質（即ち，第２の選択マーカー導入前の細胞のみが栄養要求性を示す物質）が選択物質として除去されたものである。第２の選択マーカーがＤＨＦＲの場合，培地に添加される選択物質の例としては，メトトレキセート（MTX）及びアミノプテリンが挙げられる。また，第２の選択マーカーがＤＨＦＲの場合，培地から除去される選択物質は，ヒポキサンチン及びチミジンである。
　第２の選択マーカーによる選択が選択物質を含有させた培地を用いて行われる場合，選択物質の濃度を段階的に上昇させることにより，第２の選択マーカーの発現量を一層高めた細胞を得ることができる。第２の選択マーカーの発現量の上昇は，主に第２の選択マーカーが遺伝子の重複によりコピー数を増加させることによるので，かかる手法により，発現ベクターに組み込まれた他の遺伝子，すなわちＧＳ遺伝子及び上記所望の蛋白質をコードする遺伝子を，重複により更に効率よく増加させることができる。
　次いで，選択マーカーをＧＳ遺伝子に切り替えて細胞の選択を行う。ＧＳ遺伝子を選択マーカーとする選択開始時において，外因性ＧＳ遺伝子のコピー数は内因性ＧＳ遺伝子のそれと比較して増加した状態となっている。従って，この時点で，選択マーカーをＧＳ遺伝子に切り替えて細胞の選択をすることにより，数の上で優勢な外因性ＧＳ遺伝子が，内因性ＧＳ遺伝子と比較して，重複により増幅される可能性が確率的に高くなる。このように，ＧＳ遺伝子とは異なる第２の選択マーカーにより細胞を予め選択することにより，ＧＳ遺伝子による選択時において，内因性ＧＳ遺伝子の重複を抑制し，外因性ＧＳ遺伝子の重複を促進することができる。その結果，上記所望の蛋白質を高発現する細胞を効率よく取得することができる。
　本発明において，第２の選択マーカーは，上記の組換え体蛋白質の発現を制御する遺伝子発現制御部位とは別の遺伝子発現制御部位（第２の遺伝子発現制御部位）を設けて，その下流に組み込んでよい。また，本発明において，第２の選択マーカーは，その上流に第２の内部リボソーム結合部位を設けこれを介して，上記所望の組換え体蛋白質をコードする遺伝子とその下流の内部リボソーム結合部位との間の領域に，又はＧＳ遺伝子の下流の領域に，組み込んでよい。これにより，第２の選択マーカーの発現量を，第２の内部リボソーム結合部位により制御することも可能となる。この場合，第２の内部リボソーム結合部位として，ＧＳ遺伝子の上流の内部リボソーム結合部位と同一の塩基配列のものを使用してもよく，また異なる塩基配列のものを使用してもよい。また，第２の内部リボソーム結合部位は，上記の種々の内部リボソーム結合部位から任意に選択し得る。
　本発明において，第２の選択マーカーは，ＧＳ遺伝子とは別の選択マーカーである限り特に限定はないが，哺乳動物細胞に薬剤耐性を付与する遺伝子（薬剤耐性遺伝子）は，原則として第２の選択マーカーに含まれない。但し，後述する第３の選択マーカー遺伝子を発現ベクターに組み込み，これを用いて哺乳動物細胞の選択を更に行う場合は，第２の選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子を使用し得る。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子は，第２の選択マーカーとして好適に使用できる。
　本発明において，「ジヒドロ葉酸レダクターゼ」（DHFR）というときは，NADPHを電子供与体として，ジヒドロ葉酸をテトラヒドロ葉酸に還元する反応に与る酵素をいい，そのような機能を有する酵素である限り，その起源に限定はなく，哺乳動物，爬虫類，鳥類，両生類，麟翅目（Lepidoptera）に属するカイコ（Bombyx mori），夜盗蛾（Spodoptera frugiperda），シャクトリムシ（Geometridae）等，双翅目（Diptera）に属するショウジョウバエ（Drosophila）等の昆虫，原核生物，線虫，酵母，放線菌，糸状菌，子嚢菌，坦子菌及び植物由来を含め如何なる生物由来のものでもよいが，好ましくは哺乳動物のものであり，ヒト，マウス又はチャイニーズハムスター由来のもの（特に，ＣＨＯ細胞由来のもの）が好適に使用できる。また，上記生物種の野生型酵素の他に，これら野生型酵素に変異が導入された変異型酵素も，酵素活性を有する限り使用することができ，それらも「ジヒドロ葉酸レダクターゼ」に包含される。かかる変異型酵素は，例えば，野生型酵素と比較して，酵素活性が異なるもの，ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤に対する感受性が異なるものがある。好適に使用できるジヒドロ葉酸レダクターゼの例として，マウスの野生型DHFR，マウスの野生型DHFRのN末端から31位のフェニルアラニンがトリプトファンに置換された変異型DHFRがある（Mclvor RS et al., Nucleic Acids Research, 18(23), 7025-32 (1990)）。マウスの野生型DHFRの塩基配列及びアミノ酸配列を，配列番号９及び配列番号１０に，上記変異型DHFRの塩基配列及びアミノ酸配列を，配列番号１１及び配列番号１２に示す。
また，本発明において，「内因性ＤＨＦＲ遺伝子」というときは，発現ベクターが導入される細胞のゲノム上にもともと固有に存在するＤＨＦＲ遺伝子のことをいい，「外因性ＤＨＦＲ遺伝子」というときは，発現ベクターにより細胞に導入されるＤＨＦＲ遺伝子のことをいう。また，本発明において，「ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤」というときは，上記ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の活性を阻害することができるものである限り特に限定はなく，何れのものも用いることができるが，好ましくは葉酸拮抗剤であり，更に好ましくはメトトレキセート（MTX），アミノプテリンが挙げられる。
　本発明において，第２の選択マーカーとしてＤＨＦＲ遺伝子を含む発現ベクターを導入した細胞をジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（ＤＨＦＲ阻害剤）の存在下で培養すると，ＤＨＦＲの発現量の低い細胞はテトラヒドロ葉酸が合成できずに死滅するので，ＤＨＦＲの発現量が相対的に高い細胞が選択的に得られることとなる。ＤＨＦＲ阻害剤の濃度を段階的に上昇させることにより，よりＤＨＦＲの発現量の高い細胞が得られる。ＤＨＦＲの発現量の上昇は，主に，染色体上に組み込まれたＤＨＦＲ遺伝子が，遺伝子の重複によりコピー数を増加させることによる。このとき，発現ベクターに組み込まれた他の遺伝子，すなわちＧＳ遺伝子及び所望の蛋白質をコードする遺伝子も遺伝子重複によりコピー数を増す。その結果，所望の蛋白質をある程度高発現するとともに，外因性ＧＳ遺伝子のコピー数が，内因性ＧＳ遺伝子のそれと比較して増加した細胞が得られる。この時点で，選択マーカーをＧＳ遺伝子に切り替えて細胞の選択をすることにより，数のうえで優勢な外因性ＧＳ遺伝子が，内因性ＧＳ遺伝子と比較して，重複により増幅される可能性が確率的に高くなる。その結果，所望の蛋白質を高発現する細胞を効率よく取得することができる。
　選択培地中に添加されるＤＨＦＲ阻害剤を段階的に上昇させる場合，その最大濃度は，ＤＨＦＲ阻害剤がメトトレキセートの場合，好ましくは0.25～5μMであり，より好ましくは0.5～1.5μMであり，更に好ましくは約1.0μMである。
　本発明においては，発現ベクターに，ＧＳ遺伝子と第２の選択マーカーに加えて，更に第３の選択マーカーを導入してもよい。薬剤耐性遺伝子は，第３の選択マーカー遺伝子として好適に使用できる。本発明において，第３の選択マーカーとして使用できる薬剤耐性遺伝子は，哺乳動物細胞に薬剤耐性を付与することのできる遺伝子である限り特に限定はないが，好ましくは，細胞にピューロマイシン，ハイグロマイシン，ブラストサイジン，ネオマイシン等の薬剤に対する耐性を付与することのできる遺伝子である。ここにおいて，ピューロマイシン，ハイグロマイシン，ブラストサイジン，ネオマイシン等の薬剤は，それぞれ，「薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤」である。これらの薬剤耐性遺伝子として，ピューロマイシン耐性遺伝子，ハイグロマイシン耐性遺伝子，ブラストサイジン耐性遺伝子，ネオマイシン耐性遺伝子が挙げられる。
　本発明において，第３の選択マーカーは，組換え体蛋白質が制御を受ける遺伝子発現制御部位とは別の遺伝子発現制御部位（第３の遺伝子発現制御部位）を設けて，その下流に組み込むことにより，発現量を制御することができる。
　また，本発明において，第３の選択マーカーは，その上流に第２の内部リボソーム結合部位（第２の選択マーカーの上流に第２の内部のリボソーム結合部位を設けてある場合は，第３の内部リボソーム結合部位。以下同じ。）を介して，組換え体蛋白質をコードする遺伝子と内部リボソーム結合部位との間の領域又はＧＳ遺伝子の下流の領域等に，組み込んでよい。これにより，第３の選択マーカーの発現量を，第２の内部リボソーム結合部位により制御することができる。この場合，第２の内部リボソーム結合部位として，ＧＳ遺伝子の上流の内部リボソーム結合部位及び第２の選択マーカーの上流の内部リボソーム結合部位（設けた場合）と同一のものを使用してもよく，また別のものを使用してもよい。また，第３の選択マーカーの上流の第２の内部リボソーム結合部位は，上記の種々の内部リボソーム結合部位から任意に選択し得る。また，この第２の内部リボソーム結合部位に関しても，上述と同様に，適宜変異を加えて最適化させてもよい。
　上記の第２の選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合，ここでいう第３の選択マーカー遺伝子として用いられる薬剤耐性遺伝子は，第２の選択マーカー以外の薬剤耐性遺伝子から選択される。第３の選択マーカーは，第２の選択マーカーと同様に，内因性ＧＳ遺伝子を重複させることなく，ＧＳ遺伝子を増幅させることができる。従って，第２の選択マーカーによる選択に先立って，若しくは当該選択の後に，第３の選択マーカーにより細胞の選択をすることにより，内因性ＧＳ遺伝子を重複させることなく，外因性ＧＳ遺伝子を重複させることができる。その結果，所望の蛋白質を高発現する細胞を更に効率よく取得することができる。
　本発明において，発現ベクターに組み込まれる組換え体蛋白質をコードする遺伝子の動物種は，ヒトを含む哺乳動物由来のものを含め，特に限定はない。例えば，該遺伝子としては，本発明のベクターを医療用医薬品の製造に使用するときは，一般的にはヒト由来のものが用いられ，家畜用の医薬品の製造に使用するときは，一般的には治療対象と同種の家畜由来の遺伝子のものとなる。また，該組換え体蛋白質をコードする遺伝子の種類にも特に限定はないが，好ましくは，α－ガラクトシダーゼＡ，イズロン酸2－スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，ガルスルファーゼ，α－L－イズロニダーゼ，酸性α－グルコシダーゼ等のリソソーム酵素，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-PA），血液凝固第VII因子，血液凝固第VIII因子，血液凝固第IX因子等の血液凝固因子，エリスロポエチン，インターフェロン，トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン，顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF），ＤＮａｓｅＩ，甲状腺刺激ホルモン（TSH）又は各種抗体医薬をコードする遺伝子である。抗体医薬としては，マウス抗体，ヒト化マウス抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，ヒト抗体等があり，例えば，ヒト・マウスキメラ抗ヒトCD20抗体であるリツキシマブがある。
　本発明において，抗体を発現させる場合，抗体重鎖又は抗体軽鎖の何れかをコードする遺伝子が，ＧＳ遺伝子の発現を制御する遺伝子発現制御部位により，その発現が制御されるようにベクターに組込まれる一方，もう一方の鎖をコードする遺伝子は，これとは別に当該ベクター中に配置された遺伝子発現制御部位によりその発現が制御されるように組込まれる。このとき用いられる遺伝子発現部位は，抗体重鎖と抗体軽鎖が同等レベル発現するように，同じ種類の遺伝子発現部位を使用することが好ましい。
　また，本発明において，ヘテロダイマーを形成する蛋白質を発現させる場合，ヘテロダイマーを形成する何れかのサブユニットをコードする遺伝子が，ＧＳ遺伝子の発現を制御する遺伝子発現制御部位によりその発現が制御されるように組込まれる一方，もう一方のサブユニットをコードする遺伝子は，これとは別に当該ベクター中に配置された遺伝子発現制御部位によりその発現が制御されるように組込まれる。このとき用いられる遺伝子発現部位は，２種のサブユニットが同等レベル発現するように，同じ種類の遺伝子発現部位を使用することが好ましい。このようなヘテロダイマーを形成する蛋白質としては，卵胞刺激ホルモン，甲状腺刺激ホルモン（TSH）がある。
　本発明において，発現ベクターの哺乳動物細胞への導入は，哺乳動物細胞内において組換え体蛋白質をコードする遺伝子が発現されるようにする目的で行うものであり，この目的が達成できる限り如何なる方法を用いてもよい。発現ベクターは，通常環状のプラスミドであるが，これは，環状のままであっても，又は制限酵素で切断して直鎖状にしてからであっても，細胞に導入することができる。
　本発明において，発現ベクターが導入される哺乳動物細胞は，目的の組換え体蛋白質が発現できるものである限り特に限定はないが，生体から取り出した臓器，筋組織，皮膚組織，結合組織，神経組織，血液，骨髄等から採取された細胞の初代培養細胞，継代培養細胞，及び継代培養しても形質が安定であるように株化された細胞の何れであってもよい。また，細胞は正常細胞，癌化細胞の何れであってもよい。特に好適に使用できる細胞は，チャイニーズハムスターの卵巣に由来するＣＨＯ細胞，ヒトの繊維芽細胞，及びアフリカミドリザルの腎線維芽細胞に由来するＣＯＳ細胞である。
　また，発現ベクターが導入される哺乳動物細胞は，第２の選択マーカーに対応する内因性遺伝子に，変異を有する細胞であってもよい。
　第２の選択マーカーに対応する内因性遺伝子の変異が，当該遺伝子の発現を減少又は欠損させるものであるか，又は内因性遺伝子がコードする蛋白質の機能を低下又は喪失させるものである場合，第２の選択マーカーによる選択時において，選択物質による選択圧が，外因性の第２の選択マーカーに強くかかり，第２の選択マーカーの重複がより促進される。例えば，第２の選択マーカーがＤＨＦＲ遺伝子の場合，内因性ＤＨＦＲ遺伝子の変異が，ジヒドロ葉酸レダクターゼの発現量を減少させ又はジヒドロ葉酸レダクターゼを欠損させるものである場合，ＤＨＦＲ遺伝子による選択時において，ＤＨＦＲ阻害剤による選択圧が専ら外因性ＤＨＦＲ遺伝子にかかり，外因性ＤＨＦＲ遺伝子の重複がより促進される。
　従って，第２の選択マーカーに対応する内因性遺伝子に変異を有する細胞を使用することによって，所望の蛋白質を高発現する細胞を，より効率よく取得することができる。
　発現ベクターが導入された哺乳動物細胞（発現ベクター導入細胞）は，ＧＳ遺伝子による選択に先立ち，細胞を第２の選択マーカーにより選択するための選択培地で培養される。このときの培地は，第２の選択マーカーがＤＨＦＲの場合，ＤＨＦＲ阻害剤を添加した培地である。このとき，アミノプテリン，メトトレキセート（MTX）がＤＨＦＲ阻害剤として好適に用いられる。また，第２の選択マーカーが薬剤耐性遺伝子の場合，その薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤である。
　第２の選択マーカーとしてＤＨＦＲを使用する場合，発現ベクターを導入する哺乳動物細胞として，内因性ＤＨＦＲ遺伝子に，ＤＨＦＲの発現量を減少又は欠損させるものである変異を有するものを使用できる。このような細胞には，例えばDG44株がある。DG44株は，内因性ＤＨＦＲ遺伝子を発現しておらず，従って当該細胞株を用いた場合，選択培養における選択圧が外因性ＤＨＦＲ遺伝子にのみにかかるので，外因性ＤＨＦＲ遺伝子を重複により効率よく増加させることができる。選択培養は，アミノプテリン，メトトレキセート（MTX）等のＤＨＦＲ阻害剤を含有する選択培地で行うことができる。このとき，ＤＨＦＲ阻害剤を段階的に上昇させることにより，よりＤＨＦＲの発現量が高い細胞が得られる。選択培地中に添加されるＤＨＦＲ阻害剤を段階的に上昇させる場合，その最大濃度は，ＤＨＦＲ阻害剤がメトトレキセートの場合，好ましくは0.25～5μMであり，より好ましくは0.5～1.5μMであり，更に好ましくは約1.0μMである。
　また，ＤＨＦＲ遺伝子を欠損する細胞株は，ヒポキサンチン及びチミジンに対する栄養要求性を有するので，細胞を維持し又は増殖させるための培養はこれらを添加した培地で行われる。一方，外因性ＤＨＦＲ遺伝子を導入した細胞は，ヒポキサンチン及びチミジンに対する栄養要求性がないので，これらを培地に添加する必要はない。従って，第２の選択マーカーとしてＤＨＦＲ遺伝子を含む発現ベクターを，内因性ＤＨＦＲ遺伝子の欠損等により内因性ＤＨＦＲ遺伝子に由来するＤＨＦＲ活性を持たないか又はほとんど持たない細胞に導入した場合，選択培地として，ヒポキサンチン及びチミジン不含培地を用いることによっても，外因性ＤＨＦＲ遺伝子が導入された細胞を選択培養できる。また，ヒポキサンチン及びチミジン不含培地にＤＨＦＲ阻害剤を添加した培地を，選択培地として使用することもできる。
　次いで，発現ベクター導入細胞は，ＧＳ遺伝子の導入された細胞を選択するための培地で培養される。このときの培地は，グルタミン合成酵素阻害剤（例えば，MSXなど）を添加したグルタミン不含又は低グルタミン培地中である。
　選択培地中に添加されるＧＳ阻害剤の濃度を段階的に上昇させることにより，ＧＳ遺伝子の発現量がより多い発現ベクター導入細胞を選択することができる。これは，選択培養の過程で，発現ベクター導入細胞のゲノム中に組み込まれたＧＳ遺伝子の数が重複により増加し，ＧＳ遺伝子の発現量が相対的に増加した発現ベクター導入細胞のみが選択的に増殖することなどに起因する。このとき，発現ベクターに組み込んだ組換え体蛋白質をコードする遺伝子のコピー数も増加するので，該遺伝子の発現量も増加する。従って，発現ベクター導入細胞をこのように選択培養することにより，所望の組換え体蛋白質の発現量が相対的に多い発現ベクター導入細胞を選択することができる。本明細書においては，このように選択された発現ベクター導入細胞を，形質転換細胞という。
　本発明において，選択培地中に添加されるＧＳ阻害剤の濃度を段階的に上昇させる場合において，その最大濃度は，ＧＳ阻害剤がメチオニンスルホキシミン（MSX）の場合，好ましくは100～1000μMであり，より好ましくは200～500μMであり，更に好ましくは約300μMである。
　本発明において，ＧＳ遺伝子を選択マーカーによる選択培養をする前に，発現ベクターを導入した細胞を，第２の選択培養による選択培養に加えて，第３の選択マーカーにより選択するための選択培地で選択培養することもできる。この場合，第３の選択マーカーによる選択培養は，第２の選択培養の前後の何れで行ってもよい。第３の選択マーカーは薬剤耐性遺伝子である。従って，選択培地には，薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤が添加される。このとき，選択培地の当該薬剤の濃度を段階的に上昇させることにより，より薬剤耐性遺伝子の発現量が高い細胞が得られる。選択培地中に添加される薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤の濃度を段階的に上昇させる場合において，薬剤がピューロマイシンの場合，その最大濃度は，好ましくは3～30μMであり，より好ましくは5～20μMであり，更に好ましくは約10μMである。また、薬剤がG418の場合、その最大濃度は、好ましくは0.4～1.5mg/mLであり、より好ましくは0.8～1.2 mg/mLであり、更に好ましくは約1 mg/mLである。
　以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
〔pE-neoベクター及びpE-hygrベクターの構築〕
　pEF/myc/nucベクター（インビトロジェン社）を，KpnIとNcoIで消化し，EF-1プロモーター及びその第一イントロンを含む領域を切り出し，これをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理した。別に，pCI-neo（インビトロジェン社）を，BglII及びEcoRIで消化して，CMVのエンハンサー／プロモーター及びイントロンを含む領域を切除した後に，T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに，上記のEF-1αプロモーター及びその第一イントロンを含む領域（平滑末端化処理後のもの）を挿入して，pE-neoベクターを構築した（図１－１及び図１－２）。
　pE-neoベクターを，SfiI及びBstXIで消化し，ネオマイシン耐性遺伝子を含む約１kbpの領域を切除した（図２－１）。pcDNA3.1/Hygro(+)（インビトロジェン社）を鋳型にしてプライマーHyg-Sfi5'（配列番号１３）及びプライマーHyg-BstX3'（配列番号１４）を用いて，ＰＣＲ反応によりハイグロマイシン遺伝子を増幅した（図２－２）。増幅したハイグロマイシン遺伝子を，SfiI及びBstXIで消化し，上記のpE-neoベクターに挿入して，pE-hygrベクターを構築した（図２－３）。
〔pE-IRES-GS-puroの構築〕
　発現ベクターpPGKIH（Miyahara M. et.al., J. Biol. Chem. 275,613-618(2000) ）を制限酵素（XhoI及びBamHI）で消化し，マウス脳心筋炎ウイルス（EMCV）に由来する内部リボソーム結合部位（IRES），ハイグロマイシン耐性遺伝子(Hygr遺伝子)及びマウスホスホグリセリン酸キナーゼ(mPGK)のポリアデニル化領域(mPGKpA)を含む塩基配列IRES-Hygr-mPGKpA（配列番号１５。5'末端から，塩基1～6からなる領域が「XhoIサイト」，塩基120～715及びこれに続く塩基716～718（atg）からなる領域が「マウス脳心筋炎ウイルスの5'非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位を含む塩基配列」，該塩基716～718（atg）を含む塩基716～1741からなる領域が「ハイグロマイシン耐性遺伝子をコードする塩基配列」，塩基1747～2210からなる領域が「マウスホスホグリセリン酸キナーゼ(mPGK)のポリアデニル化領域を含む塩基配列」，及び3'末端の6個の塩基（塩基2211～2216）からなる領域が「BamHIサイト」である。）よりなるDNA断片を切り出した（なお，Hygrr遺伝子に対応するアミノ酸配列は，配列番号１６で示されたものである。）。このDNA断片をpBluescript SK(-) （Stratagene社）のXhoI及びBamHIサイト間に挿入し，これをpBSK（IRES-Hygr-mPGKpA）とした（図３－１）。
　pBSK (IRES-Hygr-mPGKpA)を鋳型とし，プライマーIRES5'（配列番号１７）及びプライマーIRES3'（配列番号１８）を用いて，PCRによりEMCVのIRESの一部を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素（XhoI及びHindIII）で消化し，pBSK
(IRES-Hygr-mPGKpA) のXhoI及びHindIIIサイト間に挿入し，これをpBSK (NotI-IRES-Hygr-mPGKpA) とした（図３－２）。pBSK（NotI-IRES-Hygr-mPGKpA）を制限酵素（NotI及びBamHI）で消化し，pE-hygrベクターのNotI及びBamHIサイト間に挿入し，これをプラスミドpE-IRES-Hygrとした（図３－３）。
発現ベクターpPGKIHを鋳型とし，プライマーmPGKP5'（配列番号１９）及びプライマーmPGKP3'（配列番号２０）を用いて，PCRによりmPGKのプロモーター領域（mPGKp）を含む塩基配列（配列番号２１。5'末端から，塩基4～9が「BglIIサイト」，これに続く塩基10～516からなる領域が「マウスホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーター領域（mPGKp）を含む塩基配列」，これに続く塩基524～529からなる領域が「EcoRIサイト」である。）よりなるDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素（BglII及びEcoRI）で消化し，pCI-neo（Promega社）のBglII及びEcoRIサイト間に挿入し，これをpPGK-neoとした（図３－４）。pE-IRES-Hygrを制限酵素（NotI及びBamHI）で消化してDNA断片（IRES-Hygr）を切り出し，pPGK-neoのNotI及びBamHIサイト間に挿入し，これをpPGK-IRES-Hygrとした（図３－５）。
　CHO-K1細胞からcDNAを調製し，これを鋳型とし，プライマーGS5'（配列番号２２）及びプライマーGS3'（配列番号２３）を用いて，PCRによりGS遺伝子を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素（BalI及びBamHI）で消化し，pPGK-IRES-HygrのBalI及びBamHIサイト間に挿入し，これをpPGK-IRES-GS-ΔpolyAとした（図３－６）。
　pCAGIPuro（Miyahara
M. et.al., J. Biol. Chem. 275,613-618(2000)）を鋳型とし，プライマーpuro5'（配列番号２４）及びプライマーpuro3'（配列番号２５）を用いて，PCRによりピューロマイシン耐性遺伝子（puror遺伝子）を含む塩基配列（配列番号２６。5'末端から，塩基2～7からなる領域が「AflIIサイト」，これに続く塩基8～607からなる領域が「ピューロマイシン耐性遺伝子（puror遺伝子）をコードする塩基配列」，及び，その次の塩基608～619からなる領域が「BstXIサイト」である。）よりなるDNA断片を増幅させた（なお，puror遺伝子に対応するアミノ酸配列は，配列番号２７で示されたものである。）。このDNA断片を制限酵素（AflII及びBstXI）で消化し，発現ベクターpE-neoのAflII及びBstXIサイト間に挿入し，これをpE-puroとした（図３－７）。
　pE-puroを鋳型とし，プライマーSV40polyA5'（配列番号２８）及びプライマーSV40polyA3'（配列番号２９）を用いて，PCRによりSV40後期ポリアデニル化領域を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素（NotI及びHpaI）で消化し，発現ベクターpE-puroのNotI及びHpaIサイト間に挿入し，これをpE-puro（XhoI）とした（図３－８）。pPGK-IRES-GS-ΔpolyAを制限酵素（NotI及びXhoI）で消化し，IRES-GS領域を含むDNA断片を切り出し，これを発現ベクターpE-puro（XhoI）のNotI及びXhoIサイト間に挿入し，これをpE-IRES-GS-puroとした（図３－９）。
〔pE-mIRES-GS-puroの構築〕
　発現ベクターpE-IRES-GS-puroを鋳型とし，プライマーmIRES-GS5'（配列番号３０）及びプライマーmIRES-GS3'（配列番号３１）を用いて，PCRにより，EMCVのIRESからGSにかけての領域を増幅させ，EMCVのIRESの5'側から2番目に位置する開始コドン（ATG）に変異を加えて破壊したDNA断片を増幅させた。発現ベクターpE-IRES-GS-puroを鋳型として，このDNA断片と上記のプライマーIRES5'を用いて，PCRによりIRESからGSにかけての上記領域を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素（NotI及びPstI）で消化し，切り出されたDNA断片を，発現ベクターpE-IRES-GS-puroのNotI及びPstIサイト間に挿入し，これをpE-mIRES-GS-puroとした（図４）。
〔pE-mIRES-GSの構築〕
　発現ベクターpE-neoを鋳型とし，プライマーSV40polyA5'-2（配列番号３２）及びプライマーSV40polyA3'-2（配列番号３３）を用いて，PCRによりSV40 後期polyA領域を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素（XhoI及びBamHI）で消化し，pE-mIRES-GS-puroのXhoI及びBamHIサイト間に挿入し，これをpE-mIRES-GSとした（図５）。
〔ヒト甲状腺刺激ホルモン（hTSH）発現ベクターの構築〕
〔pE-mIRES-GS-mNeoの構築〕
　pCI-neo(インビトロジェン社)を鋳型とし，プライマーmNeoA5'（配列番号３４）及びプライマーmNeoA3'（配列番号３５）を用いて，PCRによりこのプラスミド全長を増幅させ，セルフライゲーションによりE182D変異型ネオマイシン耐性遺伝子（mNeor遺伝子）を含むプラスミドpCI-mNeoを構築した。pCI-mNeoベクターを鋳型としてプライマーmNeoB5'（配列番号３６）及びプライマーmNeoB3'（配列番号３７）を用いてPCRによりmNeor遺伝子を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素（EagI）で消化し，pUC57-IE1（Gene
Script社）のNotIに挿入し，これをpUC57-IE1-mNeoとした。pCI-neoを鋳型とし，プライマーmNeoC5'（配列番号３８）及びプライマーmNeoC3'（配列番号３９）を用いて，PCRによりネオマイシン耐性遺伝子（neor遺伝子）の3'領域及び合成ポリAシグナルを含む領域を増幅させ，これをメガプライマー(neo-polyA)とした。次に，pUC57-IE1-mNeoを鋳型とし，，プライマーmNeoD5'（配列番号４０）及びメガプライマー(neo-polyA)を用いて，PCRによりmNeor遺伝子及び合成ポリAシグナルを含む領域を増幅させた。得られたDNA断片を制限酵素（AflII及びBamHI）で消化し，pE-mIRES-GS-puroのAflII及びBamHIサイト間に挿入し，これをpE-mIRES-GS-mNeoとした（図６）。
〔pBlue-EF1/mIRES-mNeoの構築〕
　pE-mIRES-GS-mNeoを制限酵素（EcoRI）で消化し，伸長因子１プロモーター（EF-1p），変異型内部リボソーム結合部位（mIRES）及びグルタミン合成酵素（GS）の一部を含むDNA断片を切り出した。このDNA断片をpBluescript
SK(+) （Stratagene社）のEcoRIサイトに挿入し，これをpBlue-EF1/mIRESとした（図７）。
　pE-mIRES-GS-mNeoを制限酵素（PvuI）で消化し，変異型ネオマイシン耐性遺伝子（mNeor遺伝子）を含むDNA断片，及び，SV40 後期polyA領域を含むDNA断片を切り出した。このSV40 後期polyA領域を含むDNA断片を鋳型として，プライマーSVpA-Mega-F（配列番号４１）及びプライマーSVpA-BstXI-R（配列番号４２）を用い，PCRによりSV40 後期polyA領域を含む当該DNA断片を増幅させた。この遺伝子断片と上記mNeor遺伝子を含むDNA断片とをPCRにより繋ぎ合わせて，mNeor遺伝子の下流にSV40 後期polyA領域を含むDNA断片を作製した。このDNA断片を制限酵素（BstXI）で消化し，pBlue-EF1/mIRESのBstXIサイト間に挿入し，これをpBlue-EF1/mIRES-mNeoとした（図７）。
〔pBlue-EF1/SVpAの構築〕
　発現ベクターpE-mIRES-GS-mNeoを鋳型とし，プライマーSVpA-Not-F（配列番号４３）及びプライマーSVpA-BstXI-R（配列番号４４）を用いて，PCRによりSV40 後期polyA領域を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素（NotI及びBstXI）で消化し，pBlue-EF1/mIRESのNotI及びBstXIサイト間に挿入し，これをpBlue-EF1/SVpAとした（図８）。
〔pE-mDHFR31の構築〕
　マウスの野生型DHFRのN末端から31位のフェニルアラニンがトリプトファンに置換されたものである配列番号１１の変異型DHFR（F31W）遺伝子（mDHFR31）を含むDNA（配列番号４５）を合成した。このDNAをpGEM-T easy vector（Promega社）の3'-T overhangs箇所に挿入し，これをpGEM(mDHFR31)とした。pGEM(mDHFR31)を制限酵素（AflII及びBstXI）で消化し，変異型DHFR（F31W）を含むDNA断片を切り出し，このDNA断片をpE-neoのAflII及びBstXIサイト間に挿入し，これをpE-mDHFR31とした（図９）。
〔pCI-neo(hTSHα-WAP3'UTR)及びpCI-neo(hTSHβ-WAP3'UTR)の構築〕
　ヒト甲状腺刺激ホルモンのα鎖（hTSHα）遺伝子を含むDNA（配列番号４６。5'末端から，塩基1～6からなる領域が「MluIサイト」，塩基14～364からなる領域が「hTSHα鎖をコードする塩基配列」，及び，これに続く塩基365～372からなる領域が「NotIサイト」である。），及びヒト甲状腺刺激ホルモンのβ鎖（hTSHβ）遺伝子を含むDNA（配列番号４７。5'末端から，塩基1～6からなる領域が「MluIサイト」，塩基14～433からなる領域が「TSHβ鎖をコードする塩基配列」，及び，これに続く塩基434～441からなる領域が「NotIサイト」である。）を合成し，それぞれpUC57に組み込んで，pUC57-hTSHα，pUC57-hTSHβとした（Shanghai ShineGene Molecular
Biotech社）。また，ウサギ乳清酸性タンパク質（WAP）の3'側非翻訳領域（WAP3'UTR）を含むDNA（配列番号４８）を合成し，pUC57に組み込んで，pUC57-WAP3'UTRとした（Shanghai ShineGene Molecular Biotech社）。
　hTSHα遺伝子を含むpUC57-hTSHαを鋳型とし，プライマーTSHα5'（配列番号４９）及びプライマーTSHα3'（配列番号５０）を用いて，PCRによりTSHα遺伝子を含むDNA断片を増幅させ，得られたDNA断片をメガプライマーTSHαとした。また，hTSHβ遺伝子を含むDNAを鋳型とし，プライマーTSHβ5'（配列番号５１）及びプライマーTSHβ3'（配列番号５２）を用いて，PCRによりTSHβ遺伝子を含むDNA断片を増幅させ，得られたDNA断片をメガプライマーTSHβとした。
　WAP3'UTRを含むpUC57-
WAP3'UTRを鋳型とし，メガプライマーTSHαとプライマーWAP3'（配列番号５３）を用いて，PCRによりTSHα遺伝子とその下流にWAP3'UTRを有するDNA断片を増幅させた（hTSHα-WAP3'UTR）。また，WAP3'UTRを含むpUC57- WAP3'UTRを鋳型とし，メガプライマーTSHβとプライマーWAP3'を用いて，PCRによりTSHβ遺伝子とその下流にWAP3'UTRを有するDNA断片を増幅させた（hTSHβ-WAP3'UTR）。得られた各DNA断片を制限酵素（MluI及びNotI）で消化し，pCI-neoのMluI及びNotIサイト間に挿入し，それぞれpCI-neo（hTSHα-WAP3'UTR）及びpCI-neo（hTSHβ-WAP3'UTR）とした（図１０－１及び図１０－２）。
〔pE-mIRES-GS-mNeo(hTSHβ)の構築〕
　pCI-neo(hTSHβ-WAP3'UTR)を制限酵素（MluI及びNotI）で消化し，hTSHβ遺伝子及びWAP3'UTRを含むDNA断片を切り出した。このDNA断片をpE-mIRES-GS-mNeoのMluI及びNotIサイト間に挿入し，これをpE-mIRES-GS-mNeo(hTSHβ)とした（図１１）。
〔pBlue-EF1/mIRES-mNeo(hTSHα)の構築〕
　pCI-neo(hTSHα-WAP3'UTR)を制限酵素（MluI及びNotI）で消化し，hTSHα遺伝子及びWAP3'UTRを含むDNA断片を切り出した。このDNA断片をpBlue-EF1/mIRES-mNeoのMluI及びNotIサイト間に挿入し，これをpBlue-EF1/mIRES-mNeo(hTSHα)とした（図１２）。
〔pE-mIRES-GS-mNeo-dual(hTSH)の構築〕
　pBlue-EF1/mIRES-mNeo(hTSHα)を制限酵素（ClaI及びBglII）で消化し，伸長因子１プロモーター（EF-1p），hTSHα遺伝子，mIRES及び変異型ネオマイシン耐性遺伝子（mNeor遺伝子）を含むDNA断片を切り出した。このDNA断片をpE-mIRES-GS-mNeo(hTSHβ)のClaI及びBamHIサイト間に挿入し，これをヒト甲状腺刺激ホルモン（hTSH）発現用ベクターのpE-mIRES-GS-mNeo-dual(hTSH)とした（図１３）。
〔pE-mIRES-GS-mNeo-dual+mDHFR31(hTSH)の構築〕
　pE-mDHFR31を鋳型として，プライマーdE-BbsI-F（配列番号５４）及びプライマーSynpA-BbsI-R（配列番号５５）を用いてPCRによりSV40初期プロモーター（ＳＶ４０エンハンサー／プロモーター），変異型DHFR（F31W）及び合成ポリアデニレーションシグナル(合成ポリアデニル化領域）を含むDNA断片を増幅させた。得られたDNA断片を制限酵素（BbsI）で消化し，pE-mIRES-GS-mNeo-dual(hTSH)のBsmBIサイト間に挿入し，これをヒト甲状腺刺激ホルモン（hTSH）発現用ベクターのpE-mIRES-GS-mNeo-dual+mDHFR31(hTSH)とした（図１４）。
〔pE-mIRES-GS-mNeo(RTX-H)の構築〕
　リツキシマブ重鎖遺伝子を含むDNA（配列番号５６。5'末端から，塩基1～6からなる領域が「MluIサイト」，塩基18～1430からなる領域が「リツキシマブ重鎖をコードする塩基配列」，及び，これに続く塩基1431～1438からなる領域が「NotIサイト」である。）を合成した。このDNAを制限酵素（MluI及びNotI）で消化し，得られたDNA断片をpE-mIRES-GS-mNeoのMluI及びNotIサイト間に挿入し，これをpE-mIRES-GS-mNeo(RTX-H)とした（図１５）。
〔pBlue-EF1/mIRES-mNeo(RTX-L)の構築〕
　リツキシマブ軽鎖遺伝子を含むDNA（配列番号５７。5'末端から，塩基1～6からなる領域が「MluIサイト」，塩基18～725からなる領域が「リツキシマブ軽鎖をコードする塩基配列」，及び，これに続く塩基726～733からなる領域が「NotIサイト」である。）を合成した。このDNAを制限酵素（MluI及びNotI）で消化し，得られたDNA断片をpBlue-EF1/mIRES-mNeoのMluI及びNotIサイト間に挿入し，これをpBlue-EF1/mIRES-mNeo(RTX-L)とした（図１６）。
〔pE-mIRES-GS-mNeo-dual(RTX)の構築〕
　pBlue-EF1/mIRES-mNeo(RTX-L)を制限酵素（ClaI及びBglII）で消化し，得られたDNA断片をpE-mIRES-GS-mNeo(RTX-H)のClaI及びBamHIサイト間に挿入し，これをリツキシマブ発現用ベクターのpE-mIRES-GS-mNeo-dual(RTX)とした（図１７）。
〔pE-mIRES-GS-dual+mDHFR31(RTX)の構築〕
　配列番号５７のリツキシマブ軽鎖遺伝子を含むDNAを含む合成DNAを，制限酵素（MluI及びNotI）で消化し，得られたDNA断片をpBlue-EF1/SVpAのMluI及びNotIサイト間に挿入し，これをpBlue-EF1/SVpA(RTX-L)とした（図１８－１）。
　pBlue-EF1/SVpA(RTX-L)を，制限酵素（ClaI及びBglII）で消化し，得られたDNA断片をpE-mIRES-GS-mNeo(RTX-H)のClaI及びBamHIサイト間に挿入し，これをpE-mIRES-GS-dual(RTX)とした（図１８－２）。
　pE-mDHFR31を鋳型として，プライマーdE-BbsI-F（配列番号５８）及びプライマーSynpA-BbsI-R（配列番号５９）を用いてPCRによりSV40初期プロモーター（ＳＶ４０エンハンサー／プロモーター，変異型DHFR（F31W）及び合成ポリアデニレーションシグナルを含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素（BbsI）で消化し，pE-mIRES-GS-dual(RTX)のBsmBIサイト間に挿入し，これをリツキシマブ発現用ベクターのpE-mIRES-GS-dual+mDHFR31(RTX)とした（図１８－３）。
〔hTSH発現細胞及びリツキシマブ発現細胞の作成〕
　チャイニーズハムスターの卵巣に由来する細胞のCHO-K1細胞をエレクトロポレーション（Invitrogen社）により，pE-mIRES-GS-mNeo-dual(hTSH)，pE-mIRES-GS-mNeo-dual+mDHFR31(hTSH)，pE-mIRES-GS-mNeo-dual(RTX)及びpE-mIRES-GS-dual+mDHFR31(RTX)でそれぞれ形質転換した。形質転換後の細胞を，選択培地を用いて選択培養を行い，hTSH発現細胞及びRTX発現細胞を得た。
　pE-mIRES-GS-mNeo-dual+mDHFR31(TSH)及びpE-mIRES-GS-dual+mDHFR31(RTX)
で形質転換させた細胞の選択培養においては，まず細胞を，メトトレキセート（WAKO社）を含むCD Opti CHO培地（Invitrogen社）で，培地中に含まれるメトトレキセートの濃度を段階的に上昇させながら培養し，最終的にメトトレキセートを0.5μMで含む培地で培養し，メトトレキセートに耐性を示す細胞を選択的に増殖させた。次いで，培地をメチオニンスルホキシミン（SIGMA社）を含むCD Opti CHO培地（Invitrogen社）に置き換えて，培地中に含まれるメチオニンスルホキシミンの濃度を段階的に上昇させながら培養し，最終的にメチオニンスルホキシミンを300μMの濃度で含む培地で培養し，メチオニンスルホキシミンに耐性を示す細胞を選択的に増殖させた。ここで得られた細胞をバルク細胞とした。
　pE-mIRES-GS-mNeo-dual(TSH)及びpE-mIRES-GS-mNeo-dual(RTX)で形質転換させた細胞の選択培養においては，細胞を，メチオニンスルホキシミン及びG418を含むCD Opti CHO培地（Invitrogen社）で，培地中に含まれるメトトレキセート及びG418の濃度を段階的に上昇させながら培養し，最終的にメチオニンスルホキシミンを300μM，G418を1mg/mLの濃度で含む培地で培養し，これらの薬剤に耐性を示す細胞を選択的に増殖させた。ここで得られた細胞をバルク細胞とした。
　上記の選択培養により得たバルク細胞を1～3個/ウェルとなるように96ウェルプレートに播種し，CD Opti CHO培地（Invitrogen社）でコロニーが形成されるまで，約2週間培養した。培養上清中のhTSH，RTXの濃度を測定し，高発現のクローン細胞を得た。このとき，メチオニンスルホキシミンを300μMの濃度で培地に添加した。このようにして得られた高発現のクローン細胞を，hTSH発現細胞及びRTX発現細胞として，以下の実験に供した。
〔hTSH発現細胞のhTSH発現量の測定〕
　選択培養して得たhTSH発現細胞を2×105
個/mLの細胞密度で300μMのメチオニンスルホキシミンを含有する5mLのCD Opti CHO培地で，37℃，5%
CO2存在下で10日間培養した。培養，3，7及び10日目に培養上清をサンプリングした。
　マウス抗hTSH-betaモノクローナル抗体（Leinco Technologies社）溶液を96ウェルプレートに100μLずつ加え，室温で1時間静置して抗体をプレートに固定させた。液を捨て，プレートをTBS-T液（Tris：0.05M，NaCl：0.138 M，KCl：0.0027M，0.05％Tween20，pH 8.0）で３回洗浄した後，1％BSA／TBS-T液をプレートに200μLずつ加え，室温で1時間静置してプレートをブロッキングした。液を捨て，プレートをTBS-T液で３回洗浄後，サンプリングした培養上清を検体としてプレートに100μLずつ加え，室温で1時間静置した。このとき，必要に応じて，培養上清をTBS-T液で希釈した。また，hTSH（NIBSC社）をTBS-T液で0.244～62.5
ng/mLの濃度に希釈したものを標準溶液として，検体と同様にプレートに加えて静置した。液を捨て，プレートをTBS-T液で３回洗浄後，HRP標識したマウス抗hTSH-alphaモノクロナール抗体（Leinco Technologies社）を２次抗体としてプレートに100μLずつ加え，室温で1時間静置した。プレートをTBS-T液で３回洗浄後，HRP基質（WAKO社）を加え，室温で15分間静置した後，硫酸を加えて反応を停止した。マイクロウエルプレートリーダーで490nmにおける吸光度を測定して，標準溶液の吸光度の測定値から得られた検量線に，検体の測定値を内挿し，検体に含まれるhTSHの濃度を求めた。
〔RTX発現細胞のリツキシマブ発現量の測定〕
　選択培養して得たRTX発現細胞を2×105
個/mLの細胞密度で300μMのメチオニンスルホキシミンを含有する5mLのCD Opti CHO培地で，37℃，5%
CO2存在下で10日間培養した。培養，3，7及び10日目に培養上清をサンプリングした。
　リツキシマブ発現量の測定はHuman IgG ELISA Quantitation Set（Bethyl
Laboratories社）を用いて行った。ヤギ抗hIgG抗体（Bethyl Laboratories社）溶液を96ウェルプレートに100μLずつ加え，室温で1時間静置して抗体をプレートに固定させた。液を捨て，プレートをTBS-T液で３回洗浄した後，1％BSA／TBS-T液をプレートに200μLずつ加え，室温で1時間静置してプレートをブロッキングした。液を捨て，プレートをTBS-T液で３回洗浄後，サンプリングした培養上清を検体としてプレートに100μLずつ加え，室温で1時間静置した。このとき，必要に応じて，培養上清をTBS-T液で希釈した。また，リツキシマブ（中外製薬社）をTBS-T液で3.9～500 ng/mLの濃度に希釈したものを標準溶液として，検体と同様にプレートに加えて静置した。液を捨て，プレートをTBS-T液で３回洗浄後，HRP標識したヤギ抗hIgG抗体（Bethyl Laboratories社）を２次抗体としてプレートに100μLずつ加え，室温で1時間静置した。プレートをTBS-T液で３回洗浄後，HRP基質（WAKO社）を加え，室温で15分間静置した後，硫酸を加えて反応を停止した。マイクロウエルプレートリーダーで490
nmにおける吸光度を測定して，標準溶液の吸光度の測定値から得られた検量線に，検体の測定値を内挿し，検体に含まれるリツキシマブの濃度を求めた。
〔結果（hTSH発現細胞のhTSH発現量）〕
　ヒト甲状腺刺激ホルモン（hTSH）発現用ベクターのpE-mIRES-GS-mNeo-dual(hTSH)で形質転換させたCHO細胞では，培養開始後10日目の培地中のhTSHの濃度は，バルク細胞では22.0μg/mL，クローン細胞では29.2μg/mLであった。一方，第２の選択マーカーとしてDHFR遺伝子を組み込んだhTSH発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-mNeo-dual+mDHFR31(hTSH)で形質転換させたCHO細胞では，培養開始後10日目の培地中のhTSHの濃度は，バルク細胞では35.3μg/mL，クローン細胞では85.2μg/mLであった（表１）。
　すなわち，伸長因子１プロモーター（EF-1p），hTSH遺伝子，変異型内部リボソーム結合部位（mIRES），及び第１の選択マーカーとしてGS遺伝子をこの順で含むhTSH発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-mNeo-dual(hTSH)と比較して，更に第２の選択マーカーとしてDHFR遺伝子を組み込んだhTSH発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-mNeo-dual+mDHFR31(hTSH)で形質転換させたCHO細胞では，hTSHの発現量が，バルク細胞間で約1.6倍に，クローン細胞間で約2.9倍と，飛躍的に増加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
〔結果（RTX発現細胞のリツキシマブ発現量）〕
　RTX発現用ベクターのpE-mIRES-GS-mNeo-dual(RTX)で形質転換させたCHO細胞では，培養開始後10日目の培地中のリツキシマブの濃度は，バルク細胞では188.6μg/mL，クローン細胞では318.9μg/mLであった。一方，第２の選択マーカーとしてDHFR遺伝子を組み込んだRTX発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-dual+mDHFR31(RTX)で形質転換させたCHO細胞では，培養開始後10日目の培地中のリツキシマブの濃度は，バルク細胞では174.1μg/mL，クローン細胞では401.5μg/mLであった（表２）。
　すなわち，伸長因子１プロモーター（EF-1p），リツキシマブ遺伝子，変異型内部リボソーム結合部位（mIRES），及び第１の選択マーカーとしてGS遺伝子をこの順で含むRTX発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-mNeo-dual(RTX)と比較して，更に第２の選択マーカーとしてDHFR遺伝子を組み込んだRTX発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-dual+mDHFR31(RTX)で形質転換させた細胞では，RTXの発現量が，バルク細胞間ではほとんど同レベルであるものの，クローン細胞間では約1.26倍に増加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
〔結果（まとめ）〕
　これらの結果は，遺伝子発現制御部位の下流に，外来遺伝子，変異型内部リボソーム結合部位，及び第１の選択マーカーとしてグルタミン合成酵素をこの順で組み込み，更に，第2の選択マーカーとしてジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を組み込んだ発現ベクターが，外来遺伝子を高レベルで発現させることができる発現ベクターとして機能することを示すものである。
　本発明は，哺乳動物細胞を用いて組換え体蛋白質を高レベルで発現させることができるため，組換え体蛋白質を含む製品，例えば，組換え体蛋白質を含有する医薬品の製造コストの低減に利用することができる。
１　　LacZプロモーター
２　　mPGKプロモーター
３　　配列番号１に示す塩基配列を含む野生型マウス脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム結合部位（EMCV-IRES）
３a 　配列番号４に示す塩基配列を含む変異型マウス脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム結合部位（EMCV-mIRES）
４　　mPGKのポリアデニル化領域(mPGKpA)
５　　EF-1p及び第一イントロンを含む塩基配列
６　　SV40後期ポリポリアデニル化領域
７　　SV40初期プロモーター（ＳＶ４０エンハンサー／プロモーター）を含む領域
８　　合成ポリポリアデニル化領域
９　　サイトメガロウイルスプロモーターを含む領域
１０　グルタミン合成酵素遺伝子
配列番号２：Modified murine
encephalomyocarditis virus; n is a, c, g, or t
配列番号３：Modified murine
encephalomyocarditis virus; n is a, c, g, or t
配列番号４：Modified murine
encephalomyocarditis virus
配列番号６：Modified murine
encephalomyocarditis virus
配列番号７：Modified murine encephalomyocarditis
virus; n is a, c, g, or t
配列番号８：Modified murine
encephalomyocarditis virus; n is a, c, g, or t
配列番号１１：Modified Mus musculus DHFR
配列番号１２：Synthetic Construct
配列番号１３：Primer Hyg-Sfi5', synthetic
sequence
配列番号１４：Primer Hyg-BstX3', synthetic sequence
配列番号１５：IRES-Hygr-mPGKpA, synthetic
sequence
配列番号１６：Synthetic Construct
配列番号１７：Primer IRES5', synthetic
sequence
配列番号１８：Primer IRES3', synthetic
sequence
配列番号１９：Primer mPGKP5', synthetic
sequence
配列番号２０：Primer mPGKP3', synthetic
sequence
配列番号２１：mPGKp, synthetic sequence
配列番号２２：Primer GS5', synthetic
sequence
配列番号２３：Primer GS3', synthetic
sequence
配列番号２４：Primer puro5', synthetic
sequence
配列番号２５：Primer puro3', synthetic
sequence
配列番号２６：Synthetic sequence containing
puromycin resistance gene
配列番号２７：Synthetic Construct
配列番号２８：Primer SV40polyA5', synthetic
sequence
配列番号２９：Primer SV40polyA3', synthetic
sequence
配列番号３０：Primer mIRES-GS5', synthetic
sequence
配列番号３１：Primer mIRES-GS3', synthetic
sequence
配列番号３２：Primer SV40polyA5'-2,
synthetic sequence
配列番号３３：Primer SV40polyA3'-2,
synthetic sequence
配列番号３４：Primer mNeoA5', synthetic
sequence
配列番号３５：Primer mNeoA3', synthetic
sequence
配列番号３６：Primer mNeoB5', synthetic
sequence
配列番号３７：Primer mNeoB3', synthetic
sequence
配列番号３８：Primer mNeoC5', synthetic
sequence
配列番号３９：Primer mNeoC3', synthetic
sequence
配列番号４０：Primer mNeoD5', synthetic
sequence
配列番号４１：Primer SVpA-Mega-F, synthetic
sequence
配列番号４２：Primer SVpA-BstXI-R, synthetic
sequence
配列番号４３：Primer SVpA-Not-F, synthetic
sequence
配列番号４４：Primer SVpA-BstXI-R, synthetic
sequence
配列番号４５：Synthetic sequence containing
Modified DHFR(F31W)
配列番号４６：Synthetic sequence containing
human TSH alpha
配列番号４７：Synthetic sequence containing
human TSH beta
配列番号４８：Synthetic sequence containing
WAP3'UTR
配列番号４９：Primer TSHalpha5', synthetic
sequence
配列番号５０：Primer TSHalpha3', synthetic
sequence
配列番号５１：Primer TSHbeta5', synthetic
sequence
配列番号５２：Primer TSHbeta3', synthetic
sequence
配列番号５３：Primer WAP3', synthetic
sequence
配列番号５４：Primer dE-BbsI-F, synthetic
sequence
配列番号５５：Primer SynpA-BbsI-R, synthetic
sequence
配列番号５６：Rituximab heavy chain,
synthetic sequence
配列番号５７：Rituximab light chain,
synthetic sequence
配列番号５８：Primer dE-BbsI-F, synthetic
sequence
配列番号５９：Primer SynpA-BbsI-R, synthetic
sequence

Claims (26)

  1. 　蛋白質を発現させるための発現ベクターであって，遺伝子発現制御部位（Ａ），並びに，その下流に該蛋白質をコードする遺伝子，更に下流に内部リボソーム結合部位，及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み，且つ，該遺伝子発現制御部位（Ａ）の又は該遺伝子発現制御部位（Ａ）とは別の遺伝子発現制御部位（Ｂ）の下流にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を更に含んでなる，発現ベクター。
  2. 　該遺伝子発現制御部位（Ａ）及び／又は該遺伝子発現制御部位（Ｂ）が，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，伸長因子１プロモーターからなる群から選択されるものである，請求項１の発現ベクター。
  3. 　該内部リボソーム結合部位が，ピコルナウイルス科のウイルス，口蹄疫ウイルス，Ａ型肝炎ウイルス，Ｃ型肝炎ウイルス，コロナウイルス，ウシ腸内ウイルス，サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス，コクサッキーＢ型ウイルス，ヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質遺伝子，ショウジョウバエアンテナペディア遺伝子，ショウジョウバエウルトラビトラックス遺伝子からなる群から選択されるウイルス又は遺伝子の5'非翻訳領域に由来するものである，請求項１又は２の発現ベクター。
  4. 　該内部リボソーム結合部位が，ピコルナウイルス科のウイルスの5'非翻訳領域に由来するものである，請求項１又は２の発現ベクター，
  5. 　該内部リボソーム結合部位が，マウス脳心筋炎ウイルスの5'非翻訳領域に由来するものである，請求項１又は２の発現ベクター。
  6. 　該内部リボソーム結合部位が，野生型の内部リボソーム結合部位の塩基配列に，１又は２以上の変異を加えたものである，請求項１ないし５の何れかの発現ベクター，
  7. 　該野生型の内部リボソーム結合部位の塩基配列が複数の開始コドンを含み，該変異により，それら複数の開始コドンのうち一部が破壊されたものである，請求項６の発現ベクター。
  8. 　該内部リボソーム結合部位が，配列番号１の塩基配列を含むものである，請求項５の発現ベクター。
  9. 　該内部リボソーム結合部位が，配列番号２の塩基配列を含むものである，請求項５の発現ベクター。
  10. 　該内部リボソーム結合部位が，配列番号３の塩基配列を含むものである，請求項５の発現ベクター。
  11. 　該内部リボソーム結合部位が，配列番号４の塩基配列を含むものである，請求項５の発現ベクター。
  12. 　該内部リボソーム結合部位が，配列番号５の塩基配列を含むものである，請求項５の発現ベクター。
  13. 　該内部リボソーム結合部位が，配列番号６の塩基配列を含むものである，請求項５の発現ベクター。
  14. 　該蛋白質をコードする該遺伝子と該内部リボソーム結合部位との間の領域又はグルタミン合成酵素をコードする該遺伝子の下流の領域において，該内部リボソーム結合部位とは別の内部リボソーム結合部位及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる，請求項１ないし１３の何れかの発現ベクター。
  15. 　該遺伝子発現制御部位（Ａ）及び遺伝子発現制御部位（Ｂ）とは別に，更なる遺伝子発現制御部位（Ｃ）及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる，請求項１ないし１３の何れかの発現ベクター。
  16. 　該薬剤耐性遺伝子が，ピューロマイシン又はネオマイシン耐性遺伝子である，請求項１４又は１５の発現ベクター。
  17. 　該蛋白質をコードする該遺伝子が，ヒト由来の遺伝子である請求項１ないし１６の何れかの発現ベクター。
  18. 　ヒト由来の該遺伝子が，リソソーム酵素，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-PA），血液凝固因子，エリスロポエチン，インターフェロン，トロンボモジュリン，甲状腺刺激ホルモン（TSH），卵胞刺激ホルモン，顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF），及び抗体をコードする遺伝子からなる群から選択されるものである，請求項１７の発現ベクター。
  19. 　ヒト由来の該遺伝子が，リソソーム酵素をコードする遺伝子である，請求項１７の発現ベクター。
  20. 　該リソソーム酵素が，α-ガラクトシダーゼＡ，イズロン酸2-スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，ガルスルファーゼ，α-L-イズロニダーゼ，及び酸性α-グルコシダーゼからなる群から選択されるものである，請求項１９の発現ベクター。
  21. 　ヒト由来の該遺伝子が，エリスロポエチンをコードする遺伝子である請求項１７の発現ベクター。
  22. 　請求項１ないし２１の何れかの発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞。
  23. 　該哺乳動物細胞が，内因性のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を欠損したものである，請求項２２の細胞。
  24. 　該哺乳動物細胞が，ＣＨＯ細胞である，請求項２２又は２３の細胞。
  25. 　（ａ）請求項１ないし２１の何れかの発現ベクターを，哺乳動物細胞に導入するステップ，
    　（ｂ）該発現ベクターが導入された哺乳動物細胞を，ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤の存在下で選択培養するステップ，及び
    　（ｃ）該選択培養により選択された細胞を，グルタミン合成酵素阻害剤の存在下で更に選択培養するステップ
    を含む，該蛋白質をコードする遺伝子を発現する形質転換細胞の製造方法。
  26. 　（ａ）請求項１４ないし１６の何れかの発現ベクターを，哺乳動物細胞に導入するステップ，
    　（ｂ）該発現ベクターが導入された哺乳動物細胞を，ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤の存在下で選択培養するステップ，及び
    　（ｃ）該選択培養により選択された細胞を，グルタミン合成酵素阻害剤の存在下で更に選択培養するステップ
    を含む，該蛋白質をコードする遺伝子を発現する形質転換細胞の製造方法であって，該ステップ（ａ）と該ステップ（ｂ）の間，又は該ステップ（ｂ）と該ステップ（ｃ）の間に，該発現ベクターが導入された哺乳動物細胞を，該薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤の存在下で選択培養するステップを更に含む，製造方法。
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