JPH10327871A - 多分子発現カセット及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイ
ルス（ＩＢＤＶ）の５’非翻訳領域のインターナル・リ
ボソーム・エントリーサイト（ＩＲＥＳ）を利用するこ
とにより、単一のプロモーターで複数の外来遺伝子を鶏
又は鶏由来細胞に発現させるための多分子発現ベクター
を提供する。 【構成】 マレック病ウイルス１型（ＭＤＶ１）のｇＢ
遺伝子プロモーターの下流にニューカッスル病ウイルス
のＦタンパク質（ＮＤＶ−Ｆ）を結合し、更にその下流
にＩＲＥＳ活性を有する配列を含むＩＢＤＶ遺伝子を連
結したＤＮＡ断片を含有するプラスミド及びウイルスベ
クター、該ウイルスベクターによって得られる組換え体
ウイルス、前記ベクター又は組換え体ウイルスを主成分
とするワクチン及び該ワクチンによる家禽の免疫方法、
並びに前記ベクター又は組換え体ウイルスを用いたペプ
チドの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】 本発明は、動物細胞又は動
物体内において２つ以上の外来遺伝子を発現させること
ができる新規な多分子発現カセット又は多分子発現ベク
ターに関する。本発明はまた、該多分子発現カセット、
または該多分子発現ベクターから得られる組換え体ウイ
ルスを用いた動物用多価ワクチンに関する。

【０００２】

【従来技術】近年、養鶏規模の拡大に伴って飼育管理の
省力化が進められており、その一環として、ワクチン接
種に対する省力化が強く要望されている。これに応え
て、数種のワクチンを混合することにより接種回数を減
らすことを狙った混合ワクチンが既に開発され、野外で
広く用いられている。しかしながらこの方法では、ウイ
ルス種によっては異なる培養、精製を行う必要があり、
煩雑な操作を強いられる場合がある。また、既存の混合
ワクチンは基本的には不活化ワクチンであり、より自然
感染に近い免疫を賦与する生ワクチンに関しては、ウイ
ルス間の干渉や効果の持続等の問題により、省力的なワ
クチンは実現されていない。このような点を解決する一
つの手段として、ウイルスベクターによる多価ワクチン
の研究が盛んに行われている。

【０００３】養鶏分野における多価生ワクチンを目的と
するウイルスベクターに関しては、鶏痘ウイルスや七面
鳥ヘルペスウイルスの応用研究が進んでいる。これらに
対して本発明者らは、より効果的なベクターを開発すべ
く、鶏のヘルペスウイルスの一種であるマレック病ウイ
ルス１型（ＭＤＶ１）のベクター化について検討を行
い、その成果について数多くの報告を行ってきた。例え
ば、外来遺伝子を安定に保持し、かつマレック病（Ｍ
Ｄ）に対するワクチン効果に大きなダメージを与えない
外来遺伝子挿入可能部位として、ＵＳ１０遺伝子を同定
している｛特願平４−２０５９３３（特開平６−２２７
５７）フォース・インターナショナルシンポジウム・オ
ンマレックスディジーズ（4th International Symposiu
m on Marek'sDisease（１９９２）、アムステルダム；V
accine 1994 Vol.12 953-957｝。このＵＳ１０遺伝子に
ニューカッスル病ウイルスＦ蛋白（以下、ＮＤＶ−Ｆと
も称する）遺伝子を挿入した組換え体ウイルスは、ＳＰ
Ｆ鶏において十分なワクチン効果を示し、その効果は少
なくとも接種後２４週にわたって持続する（フォース・
インターナショナルシンポジウム・オンマレックスディ
ジーズ、１９９２、アムステルダム）。

【０００４】本発明者らは、更に実用的なウイルスベク
ターワクチンとすべく、遺伝子発現プロモーターに着目
し、ＭＤＶ１の糖蛋白Ｂ（ｇＢ）遺伝子プロモーターを
ＮＤＶ−Ｆ遺伝子の発現に応用した。その結果、移行抗
体を保有する動物（ニワトリ）でのワクチン効果は極め
て高く、市販雛に免疫した場合でもＭＤ及びニューカッ
スル病（ＮＤ）の両者に対し安定して９０％以上の防御
効果を付与した。また、その効果は１年以上にわたって
持続することを確認した（特願平７−１６０１０６
号）。このような研究成果を踏まえ、さらなる効果的か
つ省力的なワクチンを開発するためには、ＮＤに加えて
他疾病の感染防御抗原遺伝子をも組み込んだ組換え体ウ
イルスの構築が必要となる。

【０００５】一方、多価の発現系という観点では、ある
種のｍＲＮＡ上のリボソーム結合部位に存在するインタ
ーナル・リボソーム・エントリーサイト（ＩＲＥＳと称
する）を利用した発現系が試みられている。コザックら
は、遺伝子の転写翻訳機構について研究する中で、鋳型
のＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼにより転写されたｍＲ
ＮＡは、その５’末端にキャップ構造を有しており、こ
のキャップ構造を通してリボソーム複合体と会合し、ペ
プチドに翻訳されることを明らかにしている（Kozak,
M. J.Cell Biol., 108,229-241,1989）。殆どの蛋白質
は、このようなキャップ依存的な翻訳機構によって合成
される。

【０００６】これに対し、近年、一部のウイルスでは、
その複製の際に合成されるウイルス蛋白質は、キャップ
非依存的な翻訳機構によるとする例が報告された。すな
わち、ある種のウイルスＲＮＡには、その５’末端側に
ＩＲＥＳと呼ばれる特殊な高次構造を有する領域が存在
し、リボソーム複合体はこの特殊構造を認識してＲＮＡ
に結合し、キャップ非依存的に蛋白質の翻訳を開始する
ことが明らかにされた。ＩＲＥＳは、これまでに脳心筋
炎ウイルス（Jang, S. K. J. Virology, 62, 2636-264
3, 1988）、ポリオウイルス（Pelletier, J. Nature, 3
34, 320-325, 1988）、Ｃ型肝炎ウイルス（Tsukiyama-K
ohara, K.J. Virology, 66, 1476-1483,1992）などのＲ
ＮＡをゲノムとするウイルス及び免疫グロブリン重鎖結
合蛋白質（Macejak, D. G. Nature, 353, 90-94, 199
1）などのいくつかの真核生物の細胞内ｍＲＮＡに存在
することが報告されており、この発現システムをレトロ
ウイルスベクター（細胞工学、第１５巻３号、ｐ３８６
−３８７、１９９６）やアデノ随伴ウイルスベクター
（第４３回日本ウイルス学会抄録、ｐ１２９、１９９
５）に応用する試みも始まっている。

【０００７】一般に、ウイルスゲノムに挿入可能な遺伝
子サイズは、およそ当該ウイルスゲノムの数％とされて
おり、挿入できる遺伝子断片のサイズに限りがある（組
織培養 １４（４） １０７−１１１、１９８８）。し
たがって、従来の多価生ワクチンを目的とした発現系で
は、プロモーターの下流に外来遺伝子を結合した遺伝子
断片を１セットとし、これをウイルスベクター等に挿入
したものを発現ベクターとするため、挿入する外来遺伝
子を増やせば、それだけプロモーターの数も増えること
になり、挿入できる外来遺伝子の数は制限される。これ
に対し、ＩＲＥＳを用いる多価生ワクチン発現系は、上
記の問題点を解決する有用な方法と考えられる。しかし
ながら、ＩＲＥＳは、ウイルス感染において対象組織あ
るいは対象宿主への特異性を担っている可能性が示唆さ
れており（細胞工学、第１５巻８号、ｐ１１０６−１１
１３、１９９６）、種を超えて該ＩＲＥＳを使用すれば
発現効率が低下することが予測される。より効果的な多
価発現系を構築するには、その対象動物に感染性を有す
るウイルス等に由来するＩＲＥＳを用いることが必要と
考えられる。例えば、鶏のワクチンを対象とした場合に
は、鶏細胞で機能するＩＲＥＳを使用する必要がある
が、鶏を始めとする鳥類細胞において効果的にＩＲＥＳ
活性を示す核酸配列は未だに報告されていない。

【０００８】そこで、本発明者等は、従来から養鶏産業
では重要な病気の一つとして位置づけられいる鶏伝染性
ファブリキウス嚢病に着目し、本発明を実施した。本感
染症の感染因子である鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイ
ルス（以下、ＩＢＤＶと称する）は、ニワトリの免疫器
官の１つであるファブリキウス嚢（以下、Ｆ嚢とも称
す）を冒し、重篤な液性免疫不全を起こす（Cheville,
Amer J. Pathol. 51, 527-551, 1967）ウイルスで、ビ
ルナ科、ビルナ属に属し、２本鎖のＲＮＡゲノムを有す
る正二十面体の非エンベロープウイルス（Kibenge, F.
S. B. J. Gen. Virol. 69, 1575-1775, 1988）である。
ＩＢＤＶゲノムの塩基配列は、マント等（Mundt E., Vi
rology, 209, 10-18 1995）及びハドソン等（Hudson P.
J. et al.,Nucleic Acid Research 14, 12,5001-5012,
1986）により報告され、その５’末端非翻訳領域にはパ
ンハンドルと呼ばれる二次構造を取りうる配列が存在
し、ウイルスＲＮＡ複製に関与する可能性が指摘されて
おり、またリボソーム結合配列の存在が指摘されている
（Munt E., Virology, 209, p10-18, 1996）。しかしな
がら同論文において、そのＩＲＥＳ活性は明らかにされ
ていない。

【発明が解決しようとする課題】

【０００９】上述したように、従来の鶏感染症に対する
多価ワクチン発現系では、挿入できる外来遺伝子数の制
限、又は発現効率の点で問題があった。本発明の目的
は、ＩＢＤＶの５’非翻訳領域のＩＲＥＳを利用するこ
とにより、単一のプロモーターで複数の外来遺伝子を鶏
又は鶏由来細胞に発現させるための多分子発現カセット
又は多分子発現ベクターを提供することにある。

【００１０】また、本発明の他の目的は、上記の多分子
発現カセット又は多分子発現ベクターを含有する動物用
多価ワクチン及び該ワクチンで家禽類を免役する方法を
提供することにある。

【００１１】本発明の更に他の目的は、上記の多分子発
現カセット、多分子発現ベクター又は該多分子発現ベク
ターよって得られる組換え体ウイルスを用いたペプチド
の製造方法を提供することにある

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ＩＢＤＶの
５’末端領域にＩＲＥＳ（ＩＲＥＳとしての活性を含む
ＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡ断片をｉｒｅｓと称する）
が存在することを明らかにし、更に、ＭＤＶ１のｇＢプ
ロモーターの下流にＮＤＶ−Ｆ遺伝子、及びｉｒｅｓを
有するＩＢＤＶｃＤＮＡを連結したＤＮＡ断片を組み込
んだ組換えＭＤＶ１を作出したところ、同ウイルス感染
細胞中に、ＮＤＶ−Ｆ蛋白質及びＩＢＤＶ蛋白質の両蛋
白質が発現していることを確認し、本発明を完成するに
至った。

【００１３】従って、本発明は、ＭＤＶ１のｇＢプロモ
ーターの下流にＮＤＶ−Ｆ遺伝子及びｉｒｅｓを有する
ＩＢＤＶｃＤＮＡを連結したＤＮＡ断片並びに該ＤＮＡ
断片を含むプラスミド及びウイルスベクターを包含す
る。

【００１４】また、本発明は、上記ＤＮＡ断片、プラス
ミド、ウイルスベクター又は該ウイルスベクターによっ
て得られる組換え体ウイルスを主成分とするワクチンを
包含する。

【００１５】また、本発明は、上記、ＤＮＡ断片、プラ
スミド、ウイルスベクター又は該ウイルスベクターによ
って得られる組換え体ウイルスを用いたペプチドの製造
方法を包含する。以下に、本発明について更に詳述す
る。

【００１６】本発明のベクター、ワクチン及び方法は、
プロモーター−（外来遺伝子）ｍ−（ｉｒｅｓ−外来遺
伝子）ｎなる式で表されるＤＮＡ断片からなる多分子発
現カセット及び該発現カセットが組み込まれた多分子発
現ベクターにより特徴づけられる。ここで、外来遺伝子
は任意の遺伝子、ｉｒｅｓはＩＢＤＶゲノムの５’非翻
訳領域の塩基配列に相補的なＤＮＡ断片であり、ｍは０
又は１、ｎは１以上の整数値で、これらは連結したＤＮ
Ａ断片の数を表す。上記多分子発現カセット及び多分子
発現ベクターは培養細胞もしくは動物体内で複数の外来
遺伝子を発現し得る。

【００１７】本発明を構成する上記の遺伝子断片の作製
及びベクターの構築は、サンブルック等が述べている、
ＲＮＡの抽出、逆転写反応とポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）によるｃＤＮＡの合成と増幅及び遺伝子のクロー
ニング等の一般的な組換え技術により達成される（J.Sa
mbrook, et al., Molecular Cloning. A laboratoryman
ual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989）。また、
遺伝子断片のクローニング及び発現には、市販のベクタ
ーを使用できる。

【００１８】まず、ＩＢＤＶの５’非翻訳領域にＩＲＥ
Ｓが存在するかを調べた。ＩＢＤＶは、通常のウイルス
増殖方法に準じて調製される。具体的には、ＩＢＤＶ雛
用生ワクチンとして使用されているＫ株を鶏胚繊維芽細
胞（以下、ＣＥＦと称す）に接種後、この細胞を一般の
動物細胞を培養するための合成培地中、３７℃で培養
し、充分な細胞変性を呈した時点で培養上清を採取し、
遠心分離等の方法によりウイルスを精製、回収する。ま
た、野外分離株の場合は、接種後４日目のＦ嚢を培地で
２０％乳剤としたものを出発材料として、同様な手法で
ウイルスを精製回収した。

【００１９】回収したＩＢＤＶからのＲＮＡの抽出は、
市販のＲＮＡ抽出キット、例えば、Ｃａｒｔｒｉｍｏｘ
−１４ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＲＩＫ
２．１１：ＷＡ００３（宝酒造株式会社）を用いて容易
に行うことができる。次いで、ＩＢＤＶの目的とする領
域のｃＤＮＡ断片の合成と増幅が、合成プライマー及び
ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ：ＲＲ０１２Ａ
（宝酒造株式会社）を用いて行われる。具体的には、配
列番号：１及び２に記載のプライマーの組合せでＩＢＤ
Ｖの５’非翻訳領域の全長とＶＰ２遺伝子を含む約１．
５ｋｂのｃＤＮＡ断片、配列番号：２及び３に記載のプ
ライマーの組合せでＩＢＤＶの５’非翻訳領域の一部と
ＶＰ２遺伝子を含むｃＤＮＡ断片、配列番号：１及び４
に記載のプライマーの組合せで非翻訳領域の全長とＶＰ
２／４／３遺伝子を含む約３．２ｋｂのｃＤＮＡ断片を
それぞれ得ることができる。

【００２０】このようにして得られたｃＤＮＡ断片に終
止コドンが存在しない場合には、その３’側に、終止コ
ドンが付加される。具体的には、まず、ＤＮＡブランテ
ィングキット（宝酒造株式会社；ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉ
ｎｇ Ｋｉｔ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝
酒造株式会社）を用いて、ＰＣＲにより得たｃＤＮＡ断
片の末端を平滑化し、リン酸基を付加し、ＤＮＡライゲ
ーションキットバージョン２（宝酒造株式会社；ＤＮＡ
Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２）を用いて、
適当なベクター、例えば、ｐＵＣ１１９（宝酒造株式会
社）のマルチクローニングサイトＳｍａＩにクローニン
グする。次に、該断片が挿入されたｐＵＣ１１９をＸｈ
ｏＩで切断し、上記と同様の方法で、その末端を平滑化
した後、ＤＮＡライゲーションキットバージョン２を用
いてリンカーＥｃｏＲＩストップコドン（ニッポンジー
ン；Ｌｉｎｋｅｒ ＥｃｏＲＩ Ｓｔｏｐ Ｃｏｄｏ
ｎ）を挿入する方法が取られる。

【００２１】ＩＢＤＶの５’非翻訳領域におけるＩＲＥ
Ｓの存在は、単一プロモーターの下流に、第１シストロ
ンとして、終止コドンを持つＮＤＶ−Ｆ遺伝子を挿入
し、その下流に第２シストロンとして、ＩＢＤＶの５’
非翻訳領域の全長とＶＰ２遺伝子を含む約１．５ｋｂの
ｃＤＮＡ断片を挿入したジシストロン性の発現カセット
を組み込んだベクターを構築し、これを適当な動物細
胞、例えば、ＣＯＳ細胞に導入し、ＶＰ２を検出するこ
とにより達成される。すなわち、第１シストロンのＮＤ
Ｖ−Ｆはキャップ構造に依存した翻訳が行われるが、第
２シストロンのＶＰ２については、キャップ構造が形成
されないため、ＩＲＥＳが存在しない限り蛋白質への翻
訳は行われない。したがって、第２シストロンのＶＰ２
の発現を確認することにより、ＩＢＤＶの５’非翻訳領
域に、ＩＲＥＳの存在が支持される。本発明において以
下に開示するように、第２シストロンとしてＩＢＤＶの
５’非翻訳領域の全長（１〜１３０ｂｐ）を有するＶＰ
２遺伝子（ｃＤＮＡ断片）を挿入したところ、ＶＰ２遺
伝子の発現が確認され、ＩＲＥＳ活性の存在が同定され
た。この時、５’非翻訳領域の１〜６４ｂｐを欠如した
非翻訳領域を有するＶＰ２遺伝子を挿入した発現実験で
はＶＰ２の発現が認められなかった。すなわち、配列番
号：９に示した配列上ではリボソーム結合部位、ＣＵＣ
ＣＵＣ（Munt E.,Virology, 209,p10-18, 1996）が存在
するにもかかわらず、ＩＲＥＳ活性の発現にはＩＢＤＶ
の５’非翻訳領域の前半部分の配列が必須であった。

【００２２】プロモーターは、動物細胞内でプロモータ
ー活性を示すものであればどのようなものでもよく、ウ
イルス由来のＳＶ４０初期、ＳＶ４０後期もしくはｇＢ
プロモーター又は動物細胞由来のβアクチンプロモータ
ーなどから選択するすることができる。好ましくは、ニ
ワトリに感染するウイルス由来のプロモーターが使用さ
れる。ＭＤＶをベクターとする組換え体ウイルスの場合
には、ＭＤＶ１由来の糖蛋白質遺伝子プロモーター、好
ましくは、ＭＤＶ１由来のｇＢプロモーターが使用され
る。

【００２３】プロモーター又はＩＲＥＳの下流に組み込
まれる外来遺伝子としては、ウイルス性疾病、細菌性疾
病、寄生虫病等各種鶏感染症のワクチン抗原となりうる
蛋白質をコードする種々の遺伝子又は抗原決定部分を保
持するその遺伝子断片等が挙げられる。例えば鶏を対象
とした多価ワクチンの調製においては、その組み込む外
来遺伝子として、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）
抗原をコードする遺伝子（例えばＮＤＶ−Ｆ蛋白又はＨ
Ｎ蛋白をコードする遺伝子）、鶏伝染性咽頭気管炎ウイ
ルスの糖蛋白をコードする遺伝子、ＩＢＤＶのウイルス
構造蛋白をコードする遺伝子、鶏伝染性気管支炎ウイル
スのスパイク蛋白をコードする遺伝子、鶏貧血ウイルス
のカプシド蛋白、特にＶＰ１及びＶＰ２をコードする遺
伝子、鶏レオウイルスのカプシド蛋白、七面鳥鼻気管炎
ウイルス（ＴＲＴＶ）膜蛋白並びに鶏伝染性コリーザの
原因菌であるヘモフィラス・パラガリナルム（Heamophi
lus paragallinarum）のＨＡ蛋白をはじめとする防御抗
原をコードする遺伝子、キャンピロバクター、サルモネ
ラ、大腸菌及びマイコプラズマの防御抗原遺伝子等が挙
げられる。更に、鶏コクシジウム症の因子であるアイメ
リア・マキシマ、アイメリア・テネラ、アイメリア・ブ
ルネッティー、アイメリア・アセルブリーナ、及びロイ
コチトゾーン症の因子であるロイコチトゾーン・カウレ
リイー等の原虫の防御抗原遺伝子が挙げられる。また、
ウイルス性疾病を予防する抗原としては、インフルエン
ザでは各蛋白（ＮＰ）が血清型を超えて予防効果を示す
重要な抗原であることが示されていることから、他のウ
イルスにおいても核蛋白遺伝子が重要な防御抗原遺伝子
である可能性が考えられる。さらには、サイトカインや
ホルモン等の生理活性物質をコードする遺伝子も含まれ
る。

【００２４】このようにして得られる発現カセットをウ
イルスベクターに組み込むことによって、多価ウイルス
ワクチンを作製することができる。ウイルスベクターに
ジシストロン性の発現カセットを組み込む場合には、更
に、該発現カセットを親ウイルスゲノムに相同組換えに
よって挿入することによりベクターが構築される。ウイ
ルスベクターとしては、対象動物に対し、病原性を示さ
ないかあるいは病原性の弱いウイルスが利用され、これ
らのウイルスゲノム上のウイルス複製に影響しない部位
に、上記の発現カセットが挿入される。例えば、ニワト
リ感染症に対しては、ＭＤＶ１のＵＳ１０遺伝子の間に
上記の発現カセットを挿入したプラスミドが構築され
る。このプラスミドと親ウイルスであるＭＤＶ１ゲノム
間で相同組換えを行うことにより、発現カセットが挿入
された組換え体ウイルスを得ることができる（特願平７
−１６０１０６号）。

【００２５】動物細胞に前記ベクターを導入する際に
は、燐酸カルシウム共沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン
法、リポフェクチン法、エレクトロポレーション法など
一般的な遺伝導入方法が利用できる。具体的には、ＣＥ
Ｆ細胞にＭＤＶ１を感染させ、これに前記ベクターをエ
レクトロポレーション法で導入し、生じたウイルスプラ
ークに生産された外来遺伝子蛋白質を検出することによ
り、目的の組換え体ウイルスを作出することができる。
外来遺伝子の発現は、通常使用される、蛍光抗体法、Ｅ
ＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ウエスタンブロット法等によっ
て確認される。上記方法に使用される抗体は、外来遺伝
子がコードする蛋白質を認識する抗体であればどのよう
なものでも良い。

【００２６】このようにして得られる組換え体ウイルス
は、親ウイルス抗原とともに外来遺伝子がコードする蛋
白質を発現するため、多価ワクチンの材料とすることが
できる。また、組換え体ウイルス又は該組換え体ウイル
スが感染した細胞から得られるペプチドは、親ウイルス
又は外来遺伝子がコードする蛋白質を構成成分の一つと
するウイルスの検出並びに該ウイルスが産生する抗体の
検出系に利用することができ、診断薬を構築するための
材料となる。

【００２７】

【発明の効果】本発明によると、多価ワクチンの材料と
なる複数の外来遺伝を発現する多分子発現カセット、多
分子発現ベクター及び該ベクターによって得られる組換
え体ウイルス、並びに、前記ベクター又は組換え体ウイ
ルスによって構成されるワクチン及び外来遺伝子に由来
するペプチドが提供される。

【００２８】例えば、本発明を応用した組換え体ウイル
スによれば、ワクチンの中で最も効果的な生ワクチンの
形態をとりながら、一回の接種でより多く感染症に対す
るワクチネーションが可能な多価ワクチンが提供され、
従来から養鶏分野において要請されている省力化を達成
することが可能となる。また、今後の実用化が期待され
るＤＮＡワクチンにおいても、従来技術では複数のプラ
スミドを混合せざるを得ないようなケースにおいても、
本技術を用いることで同一プラスミド上に複数の防御抗
原遺伝子をのせることが可能となり、製造コストの低減
が可能となる。以下、実施例に従い、本発明を更に詳細
に説明する。

【００２９】組換え技術において汎用される制限酵素消
化、フェノール／クロロホルム処理及びエタノール沈殿
によるＤＮＡ断片の回収、ＤＮＡ断片の末端のリン酸
化、脱リン酸化（以下ＢＡＰ処理とも称す）、大腸菌の
形質転換法、大腸菌からのプラスミドの調製法、アガロ
ース電気泳動法（本実施例においては、ＤＮＡ断片のサ
イズに応じて０．６〜１．２％アガロースを使用した）
並びに電気溶出法は常法に従った。制限酵素は宝酒造株
式会社又はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社よ
り購入した。ＤＮＡ断片の末端の平滑化及びＤＮＡ断片
の連結は、ＤＮＡブランティングキット（宝酒造株式会
社：DNA Blunting kit）及びＤＮＡライゲーションキッ
トバージョン２（宝酒造株式会社）をそれぞれ用い、添
付のプロトコールに従って行った。

【００３０】

【実施例】実施例１：ＩＢＤＶｃＤＮＡ断片の作製 （１）ウイルス株 ＩＢＤＶとして、極めて高い致死率を示す超強毒株のＫ
ａ３６１株（Takase K. et al., J. Vet. Med. Sci. 55
(1), 137-139, 1993）及びヒナ用生ワクチンとして使用
されている弱毒株のＫ株（山田ら, 畜産の研究, 41, 49
4-500, 1987）を用いた。

【００３１】（２）ＩＢＤＶ粒子の調製 ＩＢＤＶ−Ｋ株をＣＥＦに接種後、該ＣＥＦを牛胎児血
清（以下、ＦＢＳと称す）を３％に含むイーグルＭＥＭ
（日水株式会社：以下、Ｅ．ＭＥＭと称す）培地中、３
７℃で培養し、細胞変性効果を強く呈した時点で培養上
清を採取した。培養上清中に含まれる細胞断片等を微量
高速遠心幾（トミーＭＲＸ−１５０）により１５Ｋｒｐ
ｍ、５分間の遠心分離により除いた後、４０％シュクロ
ース液をクッションとする２２Ｋｒｐｍ、２時間の超遠
心（株式会社日立製作所、ＲＰＳ４０Ｔ）を行い、ＩＢ
ＤＶ粒子を沈渣として得た。超強毒株については、４週
齢鶏にＫａ３６１株を経口投与後４日目にＦ嚢を摘出
し、Ｅ．ＭＥＭを４倍容加えた後破砕し２０％乳剤とし
た。このものを上記と同様に１５Ｋｒｐｍで５分間粗遠
心後、その上清を超遠心にかけウイルス粒子を沈渣とし
て回収した。

【００３２】（３）ＩＢＤＶ ＲＮＡの調製 ＩＢＤＶ粒子中のＲＮＡは、Ｃａｔｒｉｍｏｘ−１４
ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＲＩＫ２．１１
（宝酒造株式会社、ＷＡ００３）を用い、添付のプロト
コールに従って調製した。

【００３３】（４）ＩＢＤＶ ＲＮＡに相補的なｃＤＮ
Ａ断片の増幅 ＩＢＤＶ ＲＮＡに相補的な４種のｃＤＮＡ断片をＲＴ
−ＰＣＲにより増幅した（図１）。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｔ
ａＫａＲａ ＲＮＡ ＬＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）
（宝酒造株式会社、ＲＲ０１２Ａ）及びプライマーとし
て配列表の配列番号：１〜４の塩基配列を有する合成Ｄ
ＮＡ（宝酒造株式会社）を用い、添付のプロトコールに
従って実施した。ＰＣＲは以下の条件、すなわち、９４
℃２分の反応の後、９４℃１分、６０℃１分、７２℃２
分の反応を３５サイクル行い、引き続き、７２℃１０分
の反応条件で行った。反応終了後、フェノール・クロロ
ホルム処理、引き続きエタノール沈殿で増幅産物を回収
した。プライマーの塩基配列は、既報の塩基配列（Mund
t E., Virology, 209, 10-18 1995及びHudson P.J.et a
l., Nucleic Acid Research 14, 12,5001-5012, 1986)
から求めた。 ａ）５’非翻訳領域の全長とＶＰ２コード領域を含むｃ
ＤＮＡの増幅 ＩＢＤＶのＫ株及びＫａ３６１株由来のＲＮＡを鋳型に
し、配列番号：１及び２のプライマーを用いて、５’非
翻訳領域の全長とＶＰ２コード領域 のｃＤＮＡを増幅
した。ＩＢＤＶのＫ株及びＫａ３６１株由来のｃＤＮＡ
をそれぞれｉＫ１．５及びｉＫａ１．５と命名した。 ｂ）５’非翻訳領域の後半部とＶＰ２コード領域を含む
ｃＤＮＡの増幅 ＩＢＤＶのＫ株のＲＮＡを鋳型とし、配列番号：３及び
２のプライマーを用いて５’非翻訳領域の一部を含むＶ
Ｐ２領域のｃＤＮＡを増幅した。得られたｃＤＮＡをＫ
１．５と命名した。 ｃ）５’非翻訳領域の全長を含むＶＰ２／４／３領域ｃ
ＤＮＡの増幅 ＩＢＤＶのＫ株のＲＮＡを鋳型とし、配列番号：１及び
４を用いて５’非翻訳領域の全長を含むＶＰ２／４／３
領域のｃＤＮＡ増幅した。得られたｃＤＮＡをｉＫＧと
命名した。

【００３４】（５）ｐＵＣ１１９へのクローニング 上記の各ＩＢＤＶｃＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１１
９（宝酒造株式会社）のマルチクローニングサイトＳｍ
ａＩ部位にクローニングした（図１）。まず、ＩＢＤＶ
ｃＤＮＡ断片の末端を平滑化し、その５’末端にＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（宝酒造株式会社）でリン酸基
を付加した。このｃＤＮＡ断片を、予めＳｍａＩで消化
し、アルカリフォスファターゼ（宝酒造株式会社）で
５’末端を脱リン酸化したｐＵＣ１１９に、ＤＮＡライ
ゲーションキットバージョン２を用いて挿入し、このプ
ラスミドで大腸菌を形質転換した。常法により、形質転
換体から目的のプラスミドを保持する菌体をクローニン
グし、該プラスミドを回収した。ｉＫＧ断片が挿入され
たプラスミドはｐｉＫＧと名付けた（図１）。また、ｉ
Ｋａ１．５、ｉＫ１．５及びＫ１．５の各ｃＤＮＡ断片
が挿入されたプラスミドについては、これらをＸｈｏＩ
消化し、末端平滑処理した後、その部位にリンカーＥｃ
ｏＲＩ終止コドン（ニッポンジーン：Linker EcoRI Sto
p Codon）を挿入した。終止コドンが挿入されたプラス
ミドを含む形質転換体から該プラスミドを回収し、それ
ぞれｐｉＫａ１．５Ｓ、ｐｉＫ１．５Ｓ、ｐＫ１．５Ｓ
と名付けた（図２）。これらのうち、ｐｉＫ１．５Ｓに
含まれる５’非翻訳領域の塩基配列の決定を宝酒造株式
会社遺伝子解析センターに依頼した。オートシークエン
サーを用いて決定された塩基配列のうち、ＩＲＥＳ活性
にとって重要な領域、すなわち、５’非翻訳領域の前半
部分を配列表の配列番号：９に示す。

【００３５】実施例２：単一プロモーターにより２種の
タンパク質を発現するプラスミドの構築 （１）挿入断片ｉＫａ１．５Ｓ、ｉＫ１．５Ｓ及びＫ
１．５Ｓの作製 ｐｉＫａ１．５Ｓ、ｐｉＫ１．５Ｓ、ｐＫ１．５Ｓを制
限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、末端平滑処理
することによりｉＫａ１．５、ｉＫ１．５及びＫ１．５
の各ｃＤＮＡ断片に終止コドンが付加した断片、ｉＫａ
１．５Ｓ、ｉＫ１．５Ｓ及びＫ１．５Ｓを得た（図
３）。

【００３６】（２）発現プラスミドｐＳ（ＦｉＫａ１．
５Ｓ）の構築 ＳＶ４０後期プロモーターの下流にＮＤＶ−Ｆ遺伝子及
びｉＫａ１．５Ｓを連結した発現プラスミドｐＳ（Ｆｉ
Ｋａ１．５Ｓ）を構築した。まず、ＮＤＶ−Ｆ遺伝子を
含むプラスミドＸＬIII１０Ｈ（Sato et al. Ｖirus Re
search 7, p241-255,1987）を制限酵素ＸｈｏＩで消化
し、アガロース電気泳動、クロロホルム処理及びエタノ
ール沈殿により、ＮＤＶ−Ｆ遺伝子を含むＤＮＡ断片を
回収した。該ＮＤＶ−Ｆ遺伝子断片をｐＵＣ１１９のＳ
ａｌＩサイトにクローニングした。更にこのプラスミド
をＢｓｍＩとＢｂｅＩで部分消化し、上記手順によりＮ
ＤＶ−Ｆ遺伝子を回収し、平滑末端処理後、ｐＵＣ１１
８（宝酒造株式会社）のＳｍａＩサイトにクローニング
し、ｐＦを構築した（図４）。本プラスミドをＫｐｎＩ
とＸｂａＩで消化後、上記手順によってＮＤＶ−Ｆ遺伝
子を含む断片を回収し、平滑末端処理後、発現ベクター
ｐＳＶＬ（ファルマシア社）のＳｍａＩサイトに挿入し
てｐＳＦを得た（図５）。次いで、これをＳａｃＩ消
化、末端平滑処理及び脱リン酸化した後、ｉＫａ１．５
Ｓ断片を挿入し、ＮＤＶ−Ｆ遺伝子の下流にｉＫａ１．
５Ｓが結合したプラスミドｐＳ（ＦｉＫａ１．５Ｓ）を
回収した（図６）。

【００３７】（３）発現プラスミドｐＣＡＧ（ＦｉＫ
１．５Ｓ）、ｐＣＡＧ（ＦＫ１．５Ｓ）の構築 ニワトリβアクチンプロモーターの下流に、ＮＤＶ−Ｆ
遺伝子及びｉＫａ１．５Ｓを連結した発現プラスミドｐ
ＣＡＧ（ＦｉＫ１．５Ｓ）並びにＮＤＶ−Ｆ遺伝子及び
Ｋ１．５Ｓを連結した発現プラスミドｐＣＡＧ（ＦＫ
１．５Ｓ）を構築した（図７、８）。まず、実施例２−
（２）で得たｐＦをＸｂａＩで消化し、末端を平滑化し
た後、ｉＫ１．５Ｓ又はＫ１．５Ｓ断片を挿入した。こ
れらをＫｐｎＩ、ＳａｌＩ及びＦｓｐＩ（ＦｓｐＩによ
る消化は、目的のＤＮＡ断片とベクターとのサイズの差
を生じさせるために用いた）で消化して、ＮＤＶ−Ｆ及
びｉＫ１．５Ｓを含む断片ＦｉＫ１．５Ｓ並びにＮＤＶ
−Ｆ及びＫ１．５Ｓを含む断片ＦＫ１．５Ｓを得た（図
７）。次に、βアクチンプロモーターを有する発現ベク
ターｐＣＡＧｎ−ｍｃｓ−ｐｏｌｙＡ（特開平８−２７
１３６９）をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、末端平滑化した
後、上記の各断片を挿入した。このようにして得られた
ＦｉＫ１．５Ｓを含むプラスミドをｐＣＡＧ（ＦｉＫ
１．５Ｓ）、ＦＫ１．５Ｓを含むプラスミドをｐＣＡＧ
（ＦＫ１．５Ｓ）と名付けた（図８）。

【００３８】（４）ｐＳ（ＦｉＫａ１．５Ｓ）、ｐＣＡ
Ｇ（ＦｉＫ１．５Ｓ）及びｐＣＡＧ（ＦＫ１．５Ｓ）の
発現 カバーグラス３枚（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ，Ｎｏ．１，１
８ｘ１８）の入った直径５ｃｍシャーレに約１００万個
のＣＯＳ細胞を播き、ＦＢＳを１０％含むダルベッコ変
法イーグルＭＥＭ培地（以下１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭと
も称す）中で３７℃４時間培養した。次いで無血清のＤ
ＭＥＭで２回洗浄後、無血清ＤＭＥＭを２ｍｌを添加し
た。該ＣＯＳ細胞に、ｐＳ（ＦｉＫａ１．５Ｓ）、ｐＣ
ＡＧ（ＦｉＫ１．５Ｓ）又はｐＣＡＧ（ＦＫ１．５Ｓ）
の１μｇを含む無血清ＤＭＥＭ１００μｌとＬｉｐｏｆ
ｅｃｔＡＭＩＮＥ Ｒａｅｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ ＢＲ
Ｌ社）１０μｌを含む無血清ＤＭＥＭ１００μｌとを混
和して１５分間室温に放置したものを添加し、３７℃１
６時間培養した。次いで、培地を１０％ＦＢＳ−ＤＭＥ
Ｍに交換してさらに３７℃で４８時間培養した。カバー
グラスを取り出し、20分間室温でアセトン固定し、間接
蛍光抗体法に供した。ＮＤＶ−Ｆ遺伝子の発現確認に
は、一次抗体としてＮＤＶのＦ蛋白に対するモノクロー
ナル抗体＃３１３（Y.Umino et al. J.gen.virol. 71,p
1199,1990）を、二次抗体としてＦＩＴＣ標識抗マウス
ＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社）を用いた。また、ＩＢＤＶ遺
伝子の発現確認には、一次抗体としてＩＢＤＶ免疫ＳＰ
Ｆニワトリ血清を、二次抗体としてＦＩＴＣ標識抗ニワ
トリＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いた。すな
わち、上記アセトン固定した細胞とＦＢＳを５％含むＰ
ＢＳ緩衝液で１００倍希釈した各一次抗体とを４℃で一
晩反応させ、ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。次いで、ＦＢＳ
を５％含むＰＢＳ緩衝液で０．０５ｍｇ／ｍｌに希釈し
た二次抗体を３７℃で２時間反応させ、ＰＢＳ緩衝液で
洗浄した後、蛍光顕微鏡下で細胞を観察した。その結
果、ｐＳ（ＦｉＫａ１．５Ｓ）又はｐＣＡＧ（ＦｉＫ
１．５Ｓ）を導入したＣＯＳ細胞は、ＮＤＶ−Ｆ遺伝子
及びＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子の両方を発現していたのに
対し、ｐＣＡＧ（ＦＫ１．５Ｓ）を導入したＣＯＳ細胞
では、ＶＰ２は発現されていなかった。これは、ＩＢＤ
Ｖの５’非翻訳領域にＩＲＥＳとしての機能が存在する
ことを示唆する。

【００３９】実施例３：組換え体ウイルスの作出 （１）ＦｉＫＧ断片の作製 まず、実施例１−（５）で作製したｐｉＫＧを制限酵素
ＫｐｎＩ、Ｓｓｅ８３８７１及びＦｓｐＩで消化し、上
記手順によりｉＫＧを含む断片を回収後、末端平滑化し
た。次に、実施例２−（３）で得たｐＦをＸｂａＩで消
化し、脱リン酸化した後、上記のｉＫＧを挿入した。得
られたプラスミドをＫｐｎＩ及びＳｓｅ８３８７１で消
化し、末端を平滑化することにより、ＮＤＶ−Ｆ遺伝子
とＩＢＤＶのｉＫＧｃＤＮＡ断片が結合したＦｉＫＧ断
片を作製した（図９）。

【００４０】（２）ｐＡ４Ｐ（ＦｉＫ１．５Ｓ）及びｐ
Ａ４Ｐ（ＦｉＫＧ）プラスミドの構築 ＭＤＶ１のｇＢプロモーター（特願平７−１６０１０
６、ＷＯ９６／３８５６５）の下流に、ＮＤＶ−Ｆ及び
ｉＫ１．５Ｓ又はＮＤＶ−Ｆ及びｉＫＧを連結し、更に
該ＤＮＡ断片をＭＤＶゲノムの遺伝子断片間に挿入した
プラスミドｐＡ４Ｐ（ＦｉＫ１．５Ｓ）及びｐＡ４Ｐ
（ＦｉＫＧ）を構築した。まず、ＭＤＶ１のｇＢプロモ
ーターの下流にＮＤＶ−Ｆを結合させた断片ＰＦを作製
した（図１０）。実施例２−（２）で構築したｐＳＦを
ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩにより部分消化して３５
０ｂｐの塩基配列部分を除去し、配列表の配列番号：５
及び６に記載の塩基配列から構成されるリンカー、すな
わち、ＥｃｏＲＩ、ＦｓｐＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限
酵素認識配列を含むＤＮＡ断片（ＥＦＨ）を挿入した。
得られたプラスミドを更にＢｓａＢＩ及びＳａｌＩで消
化して４５０ｂｐ塩基配列部分を除去し、配列表の配列
番号：７及び８に記載の塩基配列から構成され、Ｂｓａ
ＢＩ、ＮｒｕＩ、ＳｎａＢＩ、ＦｓｐＩ及びＳａｌＩ制
限酵素認識配列を持つリンカー（ＢＮＳＦ）を挿入し
た。さらに、該プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏ
Ｉで消化してＳＶ４０後期プロモーターを除いた後、末
端平滑化及び脱リン酸化を行い,ここにＭＤＶ１のｇＢ
プロモーター断片を挿入した。このようにして得られた
プラスミドをＦｓｐＩで消化し、アガロース電気泳動に
より、ｇＢプロモーターとＮＤＶ−Ｆが結合した約２．
５Ｋｂの断片ＰＦを得た。

【００４１】次に、ＭＤＶ１ゲノムをＨｉｎｄＩＩＩ消
化して得られるＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂ断片を、さらにＥｃ
ｏＲＩで消化することによって得られる２．８Ｋｂｐの
ＤＮＡ断片Ａ４（図１１）をｐＵＣ１１９のＥｃｏＲＩ
部位に挿入したしたプラスミド（ｐＡ４）をＢａｌＩで
消化した後、脱リン酸化した。これに上記のＰＦ断片を
挿入した（図１１）。得られたプラスミド（ｐＡ４Ｐ
Ｆ）をＸｂａＩ及びＳｎａＢＩで消化して、ＮＤＶ−Ｆ
及びＳＶ４０ ｐｏｌｙＡシグナルを除いた後、末端平
滑化及び脱リン酸化を行った。ここに、実施例２−
（３）で作製したＦｉＫ１．５Ｓ又は実施例３−（１）
で作製したＦｉＫＧを挿入した。このようにして得られ
たプラスミドをｐＡ４Ｐ（ＦｉＫ１．５Ｓ）及びｐＡ４
Ｐ（ＦｉＫＧ）とそれぞれ名付けた（図１２）。

【００４２】（３）組換え体ウイルスｒＭＤＶ１−ＵＳ
１０Ｐ（ＦｉＫ１．５Ｓ）及びｒＭＤＶ１−ＵＳ１０Ｐ
（ＦｉＫＧ）の作出 特願平７−１６０１０６及び特願平４−２０５９３３号
に記載の方法に従い、ＭＤＶ１のＵＳ１０遺伝子内にｇ
Ｂプロモーター、ＮＤＶ−Ｆ及びｉＫ１．５Ｓ断片を挿
入した組換え体ウイルスｒＭＤＶ１−ＵＳ１０Ｐ（Ｆｉ
Ｋ１．５Ｓ）並びにｇＢプロモーター、ＮＤＶ−Ｆ及び
ｉＫＧ断片を挿入した組換え体ウイルスｒＭＤＶ１−Ｕ
Ｓ１０Ｐ（ＦｉＫＧ）を作出した。すなわち、ｐＡ４Ｐ
（ＦｉＫ１．５Ｓ）及びｐＡ４Ｐ（ＦｉＫＧ）をそれぞ
れＰｍａｃＩで消化して直鎖状とした後、これをエレク
トロポレーション法によりＭＤＶ１感染ＣＥＦに導入
し、ＦＢＳを１〜５％添加したＥ．ＭＥＭ培地中、３７
℃で数日間培養した。ＰＢＳで洗浄した後、ＦＢＳを５
％含むＥ．ＭＥＭ培地で１００００倍希釈したモノクロ
ーナル抗体＃３１３とを室温で３０分間反応させた。洗
浄した後、ＦＢＳを５％含むＥ．ＭＥＭ培地で３００倍
に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（バイオラッド
社）を、室温で３０分間反応させ、ジアミノベンチジン
（ＤＡＢ、同仁化学）で発色し、ＮＤＶ−Ｆ蛋白を発現
している組換え体ウイルスをクローニングした。得られ
た組換え体ウイルスがＩＢＤＶ蛋白も発現していること
を蛍光抗体法により確認した。すなわち、カバーグラス
３枚の入った直径５ｃｍシャーレに、組換え体ウイルス
１０，０００ＰＦＵを含むＣＥＦ細胞３００万個を播
き、３７℃、４８時間培養し、実施例２−（４）に記載
の方法に従い、ＩＢＤＶ蛋白を検出した。また、このよ
うにして得た組換え体ウイルスｒＭＤＶ１−ＵＳ１０Ｐ
（ＦｉＫ１．５Ｓ）及びｒＭＤＶ１−ＵＳ１０Ｐ（Ｆｉ
ＫＧ）は 、ＭＤＶ１免疫ＳＰＦニワトリ血清とも特異
的に反応した。

【００４３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GGATACGATC GGTCTGACCC CG 22

【００４４】

【配列表】

配列番号：２ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CTCTTAACAC GCAGTCGAGG TTGT 24

【００４５】

【配列表】

配列番号：３ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ATGGAACTCC TCCTTCTACA ACGC 24

【００４６】

【配列表】

配列番号：４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TGTTGTAAGG CCGAATTGGT GTCC 24

【００４７】

【配列表】

配列番号：５ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 AATTCTGCGC AA 12

【００４８】

【配列表】

配列番号：６ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GACGCGTTTC GA 12

【００４９】

【配列表】

配列番号：７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TGATCTCGCG ATACGTATGC GCA 23

【００５０】

【配列表】

配列番号：８ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ACTAGAGCGC TATGCATACG CGT 23

【００５１】

【配列表】

配列番号：９ 配列の長さ：６４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GGATACGATC GGTCTGACCC CGGGGGAGTC ACCCGGGGAC AGGCCGTCAA GGCCTTGTTC 60 CTGG 64

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＵＣ１１９にＩＢＤＶ ｃＤＮＡ
及びその断片を挿入したプラスミド（ｐｉＫａ１．５、
ｐｉＫ１．５、ｐＫ１．５又はｐｉＫＧ）を構築する手
順を示す図。

【図２】ｐｉＫａ１．５、ｐｉＫ１．５及びｐＫ１．５
に終止コドンリンカーを挿入したプラスミド（ｐｉＫａ
１．５Ｓ、ｐｉＫ１．５Ｓ及びｐＫ１．５Ｓ）を構築す
る手順を示す図。

【図３】図２に記載のプラスミドから終止コドンリンカ
ーが付加されたＩＢＤＶ ｃＤＮＡ断片（ｉＫａ１．５
Ｓ、ｉＫ１．５Ｓ及びＫ１．５Ｓ）を調製する手順を示
す図。

【図４】プラスミドｐＵＣ１１８にプラスミドＸＬIII
１０Ｈ中のＮＤＶ−Ｆ遺伝子を挿入したプラスミドｐＦ
を構築する手順を示す図。

【図５】ＳＶ４０プロモーターの下流に、ＮＤＶ−Ｆ遺
伝子を挿入したプラスミドｐＳＦを構築する手順を示す
図。

【図６】ｐＳＦのＮＤＶ−Ｆ遺伝子の下流に、ｉＫａ
１．５Ｓを挿入したプラスミドｐＳ（ＦｉＫａ１．５
Ｓ）を構築する手順を示す図。

【図７】ｐＦのＮＤＶ−Ｆ遺伝子の下流に、ｉＫ１．５
Ｓ又はＫ１．５Ｓを挿入したプラスミドを構築し、該プ
ラスミドからＮＤＶ−Ｆ遺伝子とｉＫ１．５Ｓが連結し
たＦｉＫ１．５Ｓ断片又はＮＤＶ−Ｆ遺伝子とＫ１．５
Ｓ断片が連結したＦＫ１．５Ｓ断片を調製する手順を示
す図。

【図８】ニワトリβアクチンプロモーターの下流に、Ｆ
ｉＫ１．５Ｓを挿入したプラスミドｐＣＡＧ（ＦｉＫ
１．５Ｓ）又はＦＫ１．５Ｓを挿入したプラスミドｐＣ
ＡＧ（ＦＫ１．５Ｓ）を構築する手順を示す図。

【図９】ｐＦのＮＤＶ−Ｆ遺伝子の下流に、ｐｉＫＧの
ｉＫＧ断片を挿入したプラスミドｐＦｉＫＧを構築し、
該プラスミドからＮＤＶ−Ｆ遺伝子とｉＫＧ断片が連結
したＦｉＫＧ断片を調製する手順を示す図。

【図１０】ｐＳＦのＳＶ４０後期プロモーターを除去
し、そこにＭＤＶ１由来のｇＢプロモーターを挿入した
プラスミドを構築し、該プラスミドからｇＢプロモータ
ーとＮＤＶ−Ｆ遺伝子が連結したＰＦ断片を調製する手
順を示す図。

【図１１】ＭＤＶ１のＵＳ１０領域を含むＡ４断片がク
ローニングされたプラスミドｐＡ４に、ＰＦ断片を挿入
したプラスミドｐＡ４ＰＦを構築する手順を示す図。

【図１２】ｐＡ４ＰＦのＮＤＶ−Ｆ遺伝子を除去し、そ
こにＦｉＫ１．５Ｓを挿入したプラスミドｐＡ４Ｐ（Ｆ
ｉＫ１．５Ｓ）及びＦｉＫＧを挿入したプラスミドｐＡ
４Ｐ（ＦｉＫＧ）を構築する手順を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:92）

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 複数の外来遺伝子を発現させる多分子発
   現カセットであって、プロモーター−（外来遺伝子）ｍ
   −（ｉｒｅｓ−外来遺伝子）ｎなる式で表されるＤＮＡ
   断片、ここで、外来遺伝子は任意の遺伝子、ｉｒｅｓは
   鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶと称す
   る）に由来するインターナル・リボソーム・エントリー
   サイトを形成するＲＮＡに相補的なＤＮＡ断片であり、
   ｍは０又は１、ｎは１以上の整数値を表す、からなるこ
   とを特徴とする多分子発現カセット。
2. 【請求項２】 前記ＲＮＡがＩＢＤＶゲノムの５’非翻
   訳領域からなることを特徴とする請求項１に記載の多分
   子発現カセット。
3. 【請求項３】 前記５’非翻訳領域がＩＢＤＶ分節Ａで
   あることを特徴とする請求項２に記載の多分子発現カセ
   ット。
4. 【請求項４】 前記５’非翻訳領域が配列表の配列番
   号：９に記載の塩基配列、又は該塩基配列に対し、１も
   しくは数個の塩基が置換、欠失あるいは付加された塩基
   配列を有し、該配列から転写されたＲＮＡがインターナ
   ル・リボソーム・エントリーサイトを形成することを特
   徴とする請求項２又は３に記載の多分子発現カセット。
5. 【請求項５】 前記プロモーターが動物細胞由来である
   ことを特徴とする請求項１に記載の多分子発現カセッ
   ト。
6. 【請求項６】 前記動物細胞由来のプロモーターが鶏の
   βアクチンプロモーターであることを特徴とする請求項
   ５に記載の多分子発現カセット。
7. 【請求項７】 前記プロモーターがウイルス由来である
   ことを特徴とする請求項１に記載の多分子発現カセッ
   ト。
8. 【請求項８】 前記ウイルス由来のプロモーターがマレ
   ック病１型ウイルス糖蛋白質Ｂ（ｇＢ）遺伝子のプロモ
   ーターであることを特徴とする請求項７に記載の多分子
   発現カセット。
9. 【請求項９】 請求項１ないし８のいずれかに記載の多
   分子発現カセットが組み込まれたことを特徴とする多分
   子発現ベクター。
10. 【請求項１０】 前記多分子発現ベクターがプラスミド
    であることを特徴とする請求項９に記載の多分子発現ベ
    クター。
11. 【請求項１１】 前記多分子発現ベクターがウイルスゲ
    ノムであることを特徴とする請求項９に記載の多分子発
    現ベクター。
12. 【請求項１２】 前記ウイルスゲノムがマレック病ウイ
    ルス由来であることを特徴とする請求項１１に記載の多
    分子発現ベクター。
13. 【請求項１３】 請求項１１又は１２に記載の多分子発
    現ベクターをウイルスゲノムとする組換え体ウイルス。
14. 【請求項１４】 前記組換え体ウイルスが鳥類又は鳥類
    細胞に感染性を有することを特徴とする請求項１３に記
    載の組換え体ウイルス。
15. 【請求項１５】 前記鳥類がニワトリであることを特徴
    とする請求項１４に記載の組換え体ウイルス。
16. 【請求項１６】 請求項１ないし８のいずれかに記載の
    多分子発現カセット、請求項９ないし１２のいずれかに
    記載の多分子発現ベクター、請求項１３ないし１５のい
    ずれかに記載の組換え体ウイルスを含有することを特徴
    とする動物用ワクチン。
17. 【請求項１７】 請求項１ないし８のいずれかに記載の
    多分子発現カセット、請求項９ないし１２のいずれかに
    記載の多分子発現ベクター、請求項１３ないし１５のい
    ずれかに記載の組換え体ウイルスを用いることを特徴と
    するペプチドの製造方法。
18. 【請求項１８】 請求項１７に記載の方法により得られ
    るペプチド。
19. 【請求項１９】 請求項１６のワクチン又は１８に記載
    のペプチドを用いることを特徴とする家禽類の免疫方
    法。