WO2013137686A1 - 그렘린-1에 대한 항체 - Google Patents

그렘린-1에 대한 항체 Download PDF

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WO2013137686A1
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antibody
gremlin
amino acid
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김현기
정준호
김민수
윤수민
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서울대학교 산학협력단
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    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention relates to antibodies to gremlin-l, and more particularly, to independence on bone morphogenic protein (BMP) or vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR2).
  • BMP bone morphogenic protein
  • VEGFR2 vascular endothelial growth factor receptor-2
  • An antibody against gremlin-1 which has a therapeutic effect against cancer by inhibiting gremlin-1 in a conventional manner.
  • Gremlin-l (20.7 kDa) is an antagonist of bone morphogenetic protein (BMP) and has a structure common to members of the cysteine rich region cysteine knot motif, and the TGF- ⁇ superfamily. It is a protein of 184 amino acids.
  • the protein is evolutionarily conserved and the human gremlin gene is located on chromosome 15ql3-ql5 (Topol LZ et al., (1997) Mol. Cell Biol., 17: 4801-4810; Topol LZ et al., Cytogenet Cell Genet., 89: 79-84).
  • Gremlin-1 has been reported with three isoforms as secretory proteins (Topol LZ et al., J. Biol. Chem., 275: 8785-8793).
  • Subtype 1 is the most common subtype, and subtypes 2 and 3 delete amino acids 39-79 and 10-79, respectively.
  • Gremlin-1 inhibits BMP from binding to receptors on the cell surface by forming heterodimers with BMP-2, BMP-4 and BMP-7 (Stanley E et al., (1998) Mech. Dev , 77: 173-184; Merino R et al., (1999) Development, 126: 5515-5522; Lap in DW et al., (2000) Curr. Opin. Nephrol. Hyper tens., 9: 469-472 ).
  • gremlin-1 plays an important role in regulating BMP not only in the development of lung, limbs, and kidneys, but also in neural crest cell differentiation. (Lu 'et al., (2001) Dev.
  • Gtemlin-1 not only antagonizes soluble ligands, but also interacts with BMP-4 precursor proteins in cells to downregulate BMP-4 mediated signaling activity in embryo lungs (Sun J et al., ( 2006) J. Biol. Chew., 281: 29349-29356.
  • gremlin-1 interacts with the slit protein, one of the secreted axonal guidance proteins, and acts as an inhibitor of chemotaxis (monocytochemistry) (Chen B et al., ( 2004) J. Immunol., 173: 5914-5917). It has recently been reported that gremlin-1 binds to vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR2) and regulates angiogenesis in a BMP-independent manner (Mitola S et al., (2010) Blood, 116: 3677-3680. . .
  • Gremlin-1 is overexpressed in various human tumors, including cervical, endometrial, lung, ovary, kidney, breast, colon, and pancreas cancer, but are (Namkoong H et al, (2006 ) BMC Cancer, ⁇ '74; Sha G et al., (2009) Fertil Steril., 91: 350-358), its role in tumorigenesis has not been studied in detail. While studying the tumor-specific properties of gremlin ⁇ 1, the inventors found that gremlin-1 interacts directly with cancer cells irrespective of BMP or VEGFR2, and based on this, an antibody capable of inhibiting gremlin-1 was identified. To develop.
  • the present invention relates to gremlin-1, which has a therapeutic effect against cancer or immune disease by inhibiting gremlin-1 in a manner independent of bone morphogenic protein (BMP) or vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR2). Provide an antibody.
  • BMP bone morphogenic protein
  • VEGFR2 vascular endothelial growth factor receptor-2
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or immune disease, comprising the antibody and a pharmaceutically acceptable additive. Furthermore, the present invention provides a method of treating cancer or immune disease, comprising administering the antibody or a pharmaceutical composition comprising the same to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a diagnostic kit for cancer or immune disease comprising the antibody.
  • the antibody against gremlin ⁇ 1 according to the present invention inhibits gremlin-1 binding to cancer cells in a manner independent of bone morphogenetic protein (BMP) or vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR2). It can be effectively used for the prevention or treatment of various cancers or immune diseases mediated by.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • VEGFR2 vascular endothelial growth factor receptor-2
  • FIG. 1 shows a reaction of four cancer cells (A549, HeLa, A172 and A431) after a secondary antibody, gremlin-1 alone, and a combination of gremlin-1 and an antibody or control antibody according to the present invention. , The graph measured by flow cytometry.
  • 2A is a graph measured by flow cytometry after reacting Gremlin-1 with HUVEC cells.
  • Figure 2B shows the results of measuring VEGFR2 mRNA and protein expression by RT-PCR after reacting gremlin-1 with HUVEC, A549 and HeLa cells.
  • Figure 2C is the result of measuring the expression of VEGFR2 mRNA and protein by immunoblot analysis after reacting gremlin-1 with HUVEC, A549 and HeLa cells.
  • 3A is a result of measuring the amount of gremlin-1 bound to BMP by enzyme immunoassay by reacting BMP2, BMP4 and BMP7 with gremlin 1 alone, antibodies alone and combinations thereof according to the present invention.
  • 3B is a graph measured by flow cytometry after reacting A549 cells with gremlin-1, and adding 10-fold molar excess of BMP-2, BMP-4 and BMP-7 thereto.
  • 4A is an image of cells photographed after reacting A549 cells with gremlin-1 and staining with crystal violet.
  • Figure 4B is after the reaction of A549 cells with gremlin-1, the expression of E-cadherin (E-cadherin) is measured by immunoblot analysis.
  • FIG. 4C shows the expression of E-cadherin by immunofluorescence staining after reaction of A549 cells with gremlin-1.
  • 4D is a graph measuring the migration of cells after reacting A549 cells with gremlin-1 alone and with a combination of gremlin-1 and an antibody or control antibody according to the invention.
  • 5A is measured by RT-PCR and Western blot for gremlin-1 mRNA and protein expression in gremlin-1-A549 cell line, mock-A549 cell line.
  • 5B shows the expression level of E-cadherin in gremlin-1-A549 cell line, mock-A549 cell line and gremlin 1-A549 cell line treated with antibody and control antibody according to the present invention according to the immunoblot analysis method. It is measured.
  • 5C is a graph measuring the number of cells infiltrated in the co-A549 cell line and the gremlin-1-A549 cell line.
  • 5D is a graph measuring cell migration in gremlin -1-A549 cell line, mock ⁇ A549 cell line, and gremlin -1-A549 cell line treated with antibody and control antibody according to the present invention.
  • 5E is a graph measuring cell growth of the gremlin-1-A549 cell line, the mockmock A549 cell line, and the gremlin-1-A549 cell line treated with the antibody according to the present invention.
  • 5F is a graph measuring tumor volume formed after injection of gremlin-1-A549 cell line and mock-A549 cell line into nude mice.
  • 6A-61 show normal and cancerous tissues (skin, breast, lymph nodes, lungs, liver, esophagus, stomach, colon, rectum, kidney, bladder, prostate, testes, cervix, endometrium and thyroid gland using immunohistochemical staining). Cancer tissue) is reacted with the antibody (13) according to the present invention to compare the expression levels of gremlin ⁇ 1.
  • the present invention will be described in detail.
  • the present invention provides an antibody against gremlin-1.
  • the antibody is characterized by having a therapeutic effect against cancer by inhibiting gremlin-1 in a manner independent of bone morphogenetic protein (BMP) or vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR2).
  • BMP bone morphogenetic protein
  • VEGFR2 vascular endothelial growth factor receptor-2
  • the antibody may be an immune antibody, chimeric antibody, human antibody or humanized antibody, but is not limited thereto.
  • the antibody against gremlin-1 can be selected, for example, by using phage-display technology.
  • Biopanning techniques can be applied to select desired antibodies from phage libraries. Through the phage-display technology as described above, it is possible to obtain antibodies having a large number of effects, and to obtain seven kinds of antibodies having excellent dual effect.
  • the antibody may be an antibody including a light chain constant region, a heavy chain constant region ⁇ light chain variable region, and a heavy chain variable region, wherein the light chain variable region and the heavy chain variable region each have an amino acid sequence as follows:
  • an antibody comprising a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
  • an antibody comprising a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
  • an antibody comprising a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
  • an antibody comprising a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10;
  • an antibody comprising a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 and a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
  • An antibody comprising a light chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and a heavy chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
  • the antibodies of (1) to (7) were named as R-80, R-88, 0-1, 0-13, 0-26, J-1 and 13 (humanized) antibodies, respectively.
  • the light chain variable region and heavy chain variable region of the antibody may be human or rabbit.
  • the light chain variable region and the heavy chain variable region of the antibody are each used alone, or a combination of the two, or combined with the light chain constant region and heavy chain constant region known in the art, respectively . May be used, and fragments thereof may be used.
  • the light chain variable region and the heavy chain variable region may be prepared in the form of a single-chain variable fragment (scFv) according to a known method.
  • the 1st to 22nd amino acids are the framework region (FR1)
  • the 23rd to 33rd amino acids are the complementarity determining region l (CDRl)
  • the 34th to 48th amino acids are the FR2
  • the 49 th to 55 th amino acids are CDR2
  • the 56 th to 87 th amino acids are FR3
  • the 88 th to 100 th amino acids are CDR3
  • the 101 th to 110 th amino acids are FR4.
  • 24th amino acid is FR1, 25-34 amino acid is CDR1, 35-
  • the 48th amino acid is FR2
  • the 49th to 64th amino acids are CDR2
  • the 65th to 95th amino acids are FR3
  • the 96th to 105th amino acids are CDR3
  • the 106th to 116th amino acids are FR4.
  • 1 to The first amino acid is FR1
  • the 23rd to 33rd amino acids are CDR1
  • the 34th to 34th amino acids are FR2
  • the 49th to 55th amino acids are CDR2
  • the 56th to amino acids are FR3
  • the 88 to 100th amino acids are CDR3, 101
  • the 0th amino acid is FR4.
  • the 1 st amino acid is FR1
  • the 25 th 34 th amino acid is CDR1
  • the 35 th amino acid is FR2
  • the 49 th 64 th amino acid is CDR2
  • the 65 th to amino acid is FR3
  • the 96 th to 109 th amino acids are CDR3
  • the 110 th to 0 th amino acids are FR4.
  • the 1 st amino acid is FR1
  • the 23rd 35th amino acid is CU
  • the 36th amino acid is FR2
  • the 51st 57th amino acid is CDR2
  • the 58th amino acid is FR3
  • the 90-100th amino acid is CDR3
  • the 101-100th amino acid is FR4.
  • the 1 st amino acid is FR1
  • the 26 th 35 amino acid is CDR1
  • the 36 th amino acid is FR2
  • the 50 th 66th amino acid is CDR2
  • the 67 th amino acid is FR3
  • the 99 th and 110 th amino acids are CDR3
  • the 111 th and 2nd amino acids are FR4.
  • the 1st to the 3rd amino acids are FR1
  • the 23rd to 35th amino acids are CDR1
  • the 36th to the 31st amino acids are FR2
  • the 51th to 57th amino acids are CDR2
  • 58 To th amino acid is FR3
  • the 90 th to 100 th amino acids are CDR3
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  • 67 to The 98 th amino acid is FR3
  • the 99 th to 110 th amino acids are CDR3
  • the 111 th to 121 th amino acids are FR4.
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  • 51th to 57th amino acid is CDR2
  • the 89th amino acid is FR3
  • the 90-100 amino acids are CDR3
  • the 101-110th amino acids are FR4.
  • 25th amino acid is FR1
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  • 36th to 49th amino acid is FR2
  • 50th to 66th amino acid is CDR2
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  • the 99th to 110th amino acids are CDR3
  • the 111th to 121st amino acids are FR4.
  • 23rd amino acid is FR1
  • 24-34 amino acid is CDR1
  • 35-49 amino acid is FR2
  • 50-56 amino acid is CDR2
  • the 88 th amino acid is FR3
  • the 89 th to 97 th amino acids are CDR3
  • the 98 th to 107 th amino acids are FR4.
  • 30th amino acid is FR1, 31-35th amino acid is CDR1, 36-49th amino acid is FR2, 50-66th amino acid is CDR2, 67-
  • the 98th amino acid is FR3
  • the 99th to 110th amino acids are CDR3
  • the 111th to 121st amino acids are FR4.
  • 23rd amino acid is FR1
  • 24-36 amino acid is CDR1
  • 37-51 amino acid is FR2
  • 52-58 amino acid is CDR2
  • the 90th amino acid is FR3, the 91-1st amino acid is CDR3, and the 102-111th amino acid is FR4.
  • 1st to 25th amino acids are FR1, 26th to 35th amino acids are CDR1, 36th to 49th amino acids are FR2, and 50th to 66th amino acids are CDR2.
  • the 67th to 98th amino acids are FR3, the 99th to 110th amino acids are CDR3, and the 111th to 121st amino acids are FR4.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is SEQ ID NO: 17 can be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 ,
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 is SEQ ID NO: 22 may be encoded by the nucleotide sequence of S
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO. 9 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO.
  • the amino acid sequence of may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28.
  • Gremlin-1 is not only known as a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist, but gremlin-1 binds to vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR2) and regulates angiogenesis. It was expected to be related to cancer through VEGFR2.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • gremlin VII1 is independent of, or not mediated by, BMP or VEGFR2 and directly binds to cancer cells to induce cell migration, invasion, and proliferation.
  • E-cadherin Inhibiting the expression of E-cadherin induces the growth of cancer cells.
  • the gremlin-1 antibody may have a therapeutic effect against cancer by inhibiting gremlin ⁇ 1 independent of BMP or VEGFR2, ie, by inhibiting gremlin-1 binding directly to cancer cells.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising the antibody and a pharmaceutically acceptable additive.
  • the additive may be a carrier, excipient or other additive.
  • the compositions of the present invention can be prepared in pharmaceutical formulations according to conventional methods. In the preparation of the formulation, it is preferred that the antibody is mixed or diluted with the carrier or enclosed in a carrier in the form of a container.
  • the carrier When the carrier is used as a diluent, it may be a solid, semisolid or liquid substance which acts as a carrier, excipient or medium for the antibody.
  • the formulation may be in the form of tablets, pills, powders, sasays, elixirs, suspensions, emulsions, solutions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin accelerators, sterile injectables, sterile powders and the like.
  • suitable carriers, excipients and diluents include lactose, textrose, sucrose, sorbbi, manni, calcium silicate, salrose methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methyl hydride. Oxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the formulation may further comprise a layering agent, an antifoaming agent, a lubricant, a humectant, a perfume, an emulsifier, a preservative, and the like.
  • Compositions of the present invention can be formulated using methods well known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the antibody after administration to a mammal.
  • the antibody composition of the present invention, together with the antibody, interferon, anti-HBV monoclonal antibody, anti-HBV polyclonal antibody, nucleoside Analogs, DNA polymerase inhibitors, siRNA agents or therapeutic vaccines may further be included as antiviral agents.
  • Cancer can be treated by administering an antibody of the invention or a pharmaceutical composition comprising the same to a subject in need thereof, eg, a mammal, including a human.
  • the dosage of the antibody depends on the subject to be treated, the severity of the disease or condition, the rate of administration and the judgment of the prescribing physician.
  • the antibody may be administered via the parenteral route once daily or divided into mammals in an amount of 0.001 to 10 mg / kg body weight, preferably 0.005 to 1 mg / kg body weight. Can be. In some cases, smaller dosages may be more suitable than the above-mentioned ranges, and larger amounts may be used without causing harmful side effects, and higher dosages may be dispensed in several smaller portions throughout the day.
  • the present invention provides a method for treating cancer, comprising administering the antibody or the pharmaceutical composition according to the present invention to a subject in need thereof.
  • the antibody according to the present invention is characterized by treating cancer by inhibiting gremlin-1 in a manner independent of bone morphogenic protein (BMP) or vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR2).
  • BMP bone morphogenic protein
  • VEGFR2 vascular endothelial growth factor receptor-2
  • cancers described above include prostate cancer, pancreatic cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, stomach cancer, liver cancer, kidney cancer, ovarian cancer colon cancer, rectal cancer, breast cancer, thyroid cancer, skin cancer, bone cancer, basal cell cancer, squamous cell cancer, nasopharyngeal cancer, Bladder cancer, uterine cancer, skin cancer, esophageal cancer, and head and neck cancer.
  • the antibody of the present invention can be used for the prevention or treatment of immune diseases.
  • gremlin-1 is closely associated with immune diseases (Mezzano S, et al. (2007) Expression of gremlin, a bone morphogenetic ic).
  • the antibodies that inhibit gremlin-1 according to the present invention can be used to prevent or treat immune diseases.
  • immune diseases include rheumatoid arthritis, progressive systemic sclerosis (Scleroderma), systemic lupus erythematosus (apus), atopic dermatitis, alopecia areata, psoriasis ( ⁇ «), pemphigus, Asthma, aphthous stomatitis, chronic thyroiditis, acquired aplastic anemia, primary cirrhosis, ulcerative colitis, Behcet's disease, Crohn's disease, silicon pneumonia, asbestos, IgA kidney disease, streptococcal infection PSGN), Sjogren Syndrome, Gui Han- Barre syndrome, dermatomyositis, polymyositis, multiple sclerosis, autoimmune hemolytic anemia ), Autoimmune encephalomyelitis, myasthenia gravis, Grave's disease, nodular polyarteritis nodosa, ankylosing spinal cord (Ankylosing spondylitis),
  • the present invention provides a kit for diagnosing cancer or immune disease, comprising the antibody according to the present invention.
  • the kit may further include conventional reagents for immunohistochemical staining in addition to the antibody according to the present invention. Additional components that may be included include FITC reagents, antigen retrieval solutions, control antibodies, HRP-linked polymers, DAB solutions (3-3'-diaminobezidine tetrachloride), Mayer hemaroxylin solutions (Mayer '). s hematoxylin solution) and the like, but are not limited to yae.
  • the kit is intended for diagnosis with normal tissues.
  • the antibody and the reaction tissue according to the present invention can be diagnosed as a tissue suffering from or at risk for cancer or immune disease. Specific embodiments of the present invention will be described through the following examples.
  • A549, HeLa, A172, and A431 cells were obtained from Korea Cell Line Bank (Seoul, Korea) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were obtained from Invitrogen (Carlsbad, CA).
  • A549, A172 and A431 cells in RPMI-1640 medium (Welgene, Korea) supplemented with 10% FBS (GIBC0, Grand Island, NY)
  • HeLa cells in MEM medium Welgene
  • HUVEC was cultured in endothelial cell growth medium -2 (EGM-2, Lonza, Walkersvi 1 le, MD).
  • the PCR product was digested with HindUl and 3 ⁇ 4I, and then
  • the gremlin-1 expression vector was prepared by ligating into a vector (Invitrogen). On the other hand, one day before transfection, A549 cells (5.0 ⁇ 10 5 cells) were plated onto plates to reach 70% confluency. The prepared gremlin-1 expression vector was then transfected into A549 cells using the Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. The transfected cells were selected using 1.0 mg / ml of antibiotic G418 (Invitrogen). The selected gremlin-1 expressing cell line was named 'gremlin-1-A549' cell line.
  • HEK293F cells (Invitrogen) were incubated in GIBCO FreeStyle TM 293 expression medium (Invitrogen) at a cell density of 0.1 ⁇ 10 6 to 2.0X10 6 cells / ml, followed by disposable Ellenmeyer tissue culture flasks with vent holes.
  • GIBCO FreeStyle TM 293 expression medium (Invitrogen)
  • To Corning Inc. Transfer was incubated with stirring at 135 rpm on an orbital shaking incubator (37 ° C., 8% CO 2 , Minitron, INFORSHT, Switzerland).
  • fresh medium was added to the cell culture, diluted to a density of ⁇ , ⁇ 6 cells / ml and incubated until a density of 2.0 ⁇ 10 6 cells / ml was reached.
  • the HEK293 cells were then transfected with a vector expressing the gremlin-1 and human IgG-Fc fusion proteins described above using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). The transfected cells were again cultured in an orbital stirred incubator and the culture supernatant was recovered on day 3 of transfection. Since then, Park S et al. , (2010) Clin Chim Acta 411: 1238-1242, purifying the gremlin-1-Fc fusion protein using Protein A affinity gel chromatography.
  • Example 2 Generation of Gremlin-1 Antibody
  • the extracted spleen and bone marrow were homogenized in TRI reagent for 1 minute at 50% output using a homogenizer and incubated for 5 minutes at room temperature.
  • Homogenized samples were centrifuged at 2,500 g at 4 ° C for 10 minutes.
  • the supernatant was transferred to a 50 mL centrifuge tube and 3 rnL of 1-bromo-3-chloro-propane (BCP, Sigma) was added to each supernatant. The mixture was then vortexed for 15 seconds and incubated for 15 minutes at room temperature.
  • the mixture was centrifuged at 17,000 g at 4 ° C. for 15 minutes and the colorless upper aqueous phase was transferred to a fresh 50 mL flow. Then, 15 mL of isopropanol was added and incubated for 10 minutes at room temperature. After centrifugation at 17,500 g for 15 minutes at 4 ° C, the supernatant was carefully removed and washed with 30 mL of 75% ethanol without resuspending the pellet. Pellets were centrifuged for 10 minutes, the supernatant was removed, and the pellets were air-dried in a seal. The pellet was then dissolved in water without RNase and stored at -8 CTC.
  • the first strand cDNA was synthesized using the Superscript TM III system (Invitrogen) for the first strand cDNA synthesis kit with depressed (dT) priming.
  • the isolated total 5 RNA was mixed with 1 U L of 0.5 yg / uL (dT), 1 liL of 10 mM dNTP and diethyl pyrocarbonate (DEPC) -treated water to adjust the final volume to 10 L It was.
  • the mixture was incubated at 65 ° C. for 5 minutes and chilled on ice.
  • ⁇ 2-3> 1st PCR The first strand cDNA obtained from rabbit spleen and bone marrow was subjected to 30 cycles of PCR using the Expand High Fidelity PCR system (Roche Molecular Systems, IN, USA). Ten primer combinations for amplifying rabbit V L (9 ⁇ V k and 1 ⁇ V coding sequences and four combinations for amplification of rabbit V H coding sequences (Table 1) were used together. In each reaction, 60 pmol of 1 L cDNA Each primer of, 10 yL of 10X reaction buffer, 2.5mmdNTP of 8 (Promega, Madison, Wis.), TaqDNA polymerase of 0.5, and water were mixed to adjust the final volume to 100 iiL. :.
  • the primary V L product was randomly linked to the primary V H product by overlap extension PCR (Table 2). At least 10 reactions were performed on the long linker short chain fragments. In each reaction, 100 ng of purified light and heavy chain products were subjected to 60 pm of each primer, 10 j L of 10X reaction mixture, 8 iiL of 2.5 ⁇ dNTP (Pr omega), 0.5 IiL of Taq DNA polymerase, and Mixed with water to adjust final volume 100. PCR was performed under the following conditions: 15 seconds at 94 ° C., 30 seconds at 56 ° C. and 20 cycles of 2 minutes at 72 ° C., followed by a final extension of 10 minutes at 72 ° C.
  • Cloning PCR products and pComb3x vector (The Scripps Research Institute) For Sfi ⁇ restriction enzyme.
  • the purified overlap PCR product of 10 was mixed with 360 units of Sfil (16 units per ⁇ xg DNA, Roche Molecular Systems), 20 L of 10 ⁇ reaction buffer M, and water to adjust the final volume to 200 iiL.
  • the 20 pComb3x vector was mixed with 120 units of 5 units per 5 // Kug DNA, Roche Molecular Systems), 20 iiL of 10X reaction buffer M, and water to adjust the final volume to 200. The mixture was incubated at 50 ° C for 5 hours.
  • the cleaved insert about 700 bp in length, was purified on a 1% agarose gel, and the vector, about 3,400 bp in length, and the fragment having about 1,600 bp in length, contained in the pComb3x vector, was collected on a 0.6% agarose gel. Purified.
  • E. coli ER2738 strains were grown in 50 mL polypropylene tubes containing 15 mL of SB and grown overnight at 37 ° C with stirring at 250 rpm. The next day, 2.5 mL of culture was diluted into a 2 L flask containing 500 mL of SB, 10 mL of 20% (w / v) glucose and 5 mL of 1M MgCl 2 , with 0D at 600 nm of 0.8-0.9. Stir at 250 rpm at 37 ° C until reaching. The cultures were then placed in pre-cooled 500 mL centrifuge bottles and centrifuged at 3,000 g for 20 minutes at 4 ° C.
  • the supernatant was removed and the pellet was resuspended in 30 mL of precooled 10% (v / v) glycerol.
  • the resuspended pellet was centrifuged, washed three times with glycerol and then resuspended in 5 mL of 10% glycerol and stored at -80 ° C.
  • 10 ER2738 suspension prepared in ⁇ 2-7> was inoculated in 10 mL of SB medium and stirred at 250 rpm for 1 hour at 37 ° C.
  • Single helper phage plaques from freshly prepared plates were transferred into culture using a pipette tip.
  • the culture was centrifuged at 2,500 g for 15 minutes and the supernatant was incubated at 70 ° C for 20 minutes in a water bath. After centrifugation at 2500 g for 15 minutes, the supernatant was transferred to a new 50 mL polypropylene tube and stored at 4 ° C.
  • the ligated library sample was transformed into 300 iiL of electrocompetent Escherichia coli and incubated for 1 hour at 37 ° C in 5 mL of SB medium.
  • To the culture was added 100 mL of pre-warmed SB medium and 3 LiL of 100 mg / mL carbenicillin.
  • the library size was determined by smearing 0.1 uL, 1 uL and 10 uL of the culture onto LB medium containing 50 ug / mL carbenicillin.
  • the culture was stirred at 250 rpm for 1 hour.
  • To the culture was added 4.5 mg of 100 mg / mL carbenicillin and stirred for further 1 hour.
  • TBS Tris-buffered saline
  • Biopanning was performed using paramagnetic beads (Dynal Biotech, Lake Success, NY). 3 gremlin-1 was combined with 1 ⁇ 10 7 beads for 20 hours at room temperature. The beads were washed four times with PBS and incubated with blocking buffer solution for 1 hour at room temperature. Beads bound to gremlin-1 were incubated for 2 hours at room temperature with phage displaying scFv obtained from ⁇ 2-9>. The washing step was increased from three times in the first to ten times in the fourth. Combined Phage was eluted with 50 iiL of 0.1M glycine / HC1 (pH2.2) and neutralized with 3 yL of 2M Tris-CKpH 9.1).
  • phage-containing supernatants were used to infect ER2738 and phagemids were rescued using helper phage VCSM13 for amplification overnight.
  • phage was prepared by adding PEG-8000 and NaCl as described above in ⁇ 2-9>.
  • the phage infected culture was plated and put on an LB plate containing 50 yg / mL of carbenicillin. The input and output phage titers were determined.
  • the specificity of the antibody (0-13) according to the present invention was determined using Western blot analysis. To determine the specificity of the antibody (0-13) according to the present invention, the culture supernatant of HEK293F cells transfected with pcDNA3.1 / myc-His-gremlin-1 was separated by SDS-PAGE. The blot was incubated overnight at 4 ° C. with 100 ng / mL of the antibody according to the invention (0-13), followed by HRP-bound anti-human IgG (Fc specific, 1: 1000 dilution; Pierce Chemical Co.) Incubated at room temperature for 1 hour.
  • Blots were visualized using an improved chemiluminescence system (Pierce) according to the manufacturer's instructions. Gels were visualized using Coomassie Brilliant Blue G_250 (Sigma) according to the manufacturer's instructions.
  • the seven antibodies obtained through the above procedure were named R-80, R-88, 0-1, 0-13, 0-26, J-1 and 0-13 (humanized) antibodies, respectively. The sequence was analyzed.
  • the R-80 antibody contained a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the R-88 antibody contained an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • the 0-1 antibody comprises a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
  • the antibody 0-13 contained a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and a 26 antibody light chain having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 Heavy chain variable region having a variable region and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and the J-1 antibody Light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12
  • adherent cells were treated with trypsin and washed with l% (w / v) BSA in phosphate buffered saline (PBS).
  • Suspension cells were harvested by centrifugation at 500 ⁇ g for 2 minutes and washed with l% (w / v) BSA in PBS. All cells were treated with l% (w / v) BSA in PBS with Gremlin® 1 with a His-tag at a final concentration of 100 nM (R & D Systems, Minneapolis, Incubated at 37 ° C for 1 hour. Cells are then washed twice with l% (w / v) BSA in PBS and 30 at 37 ° C.
  • A549 cells were simultaneously treated with 1 ⁇ ⁇ -2, ⁇ -4, or BMP-7 (R & D Systems, Minneapolis, MN) and 100 nM of gremlin -1-Fc and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Cells were probed with FITC-bound IgG-Fc specific type: body (5 ug / ml, Invitrogen). The cells were then analyzed on a FACSCanto II flow cytometer.
  • VEGFR2 mR A and protein expression in A549 cells, HeLa cells, and HUVEC cells were confirmed using RT-PCR and immunoblot analysis.
  • RT-PCR For RT-PCR, follow the manufacturer's instructions using TRizol reagent (Invitrogen) in accordance with A549. Total RNA was isolated from cells HeLa cells, and HUVEC. The cDNA was then synthesized from the RNA using a Superscript® III First-Strand Synthesis System (Invitrogen). RT-PCR was performed in 2720 Thermal Cycler (Appl ied Biosys terns, Foster City, CA) using the following primers. RT-PCR was performed at 35 cycles for 30 seconds at 94 ° C., 30 seconds at 56 ° C., and 1 minute at 72 ° C.
  • HUVEC, A549 cells, and HeLa cells were treated with a cold lye solgar containing a protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, M0) [50 mM Tris-HCl (pH7.4), 150mMNaCl, 2mMEDTA, 1% Triton- X 100, 0.1% SDS, ImMPMSF], followed by Western blot according to the procedure described in [1 61 ⁇ 31., (2008) 13 (101713 (1 ⁇ " (: 11111 :) 27: 18-24).
  • a protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich, St. Louis, M0
  • VEGFR-2 1,000 dilution; Cell Signaling Technology, Danvers, MA
  • ⁇ -actin 1 000 dilution; Applied Biological Materials, Richmond, BC
  • HRP-linked anti-rabbit IgG l: 1,000 dilution; Pierce Chemical Co.
  • FIG. 2C The results of the immunoblot analysis are shown in FIG. 2C. As shown in FIG. 2C, unlike HUVEC cells, A549 and HeLa cells did not express VEGFR2. The results also show that the interaction of gremlin-1 with cancer cells is not mediated by VEGFR2.
  • Gremlin-1 is a BMP antagonist that specifically binds to BMP-2, BMP-4 and BMP-7 and inhibits their activity.
  • BMP is a multifunctional growth factor known to play an important role in the morphogenesis and homeostasis of many tissues.
  • BMP-2, BMP-4 and BMP-7 are also commonly overexpressed in a variety of cancers, including breast and prostate cancers (Singh A et al., (2010) Cytokine Growth Factor Rev 21: 299-313; Chen D et al. , (2004) Growth Factors 22: 233-241; Bobinac Det al., (2005) Croat Med J 46: 389-396).
  • BMP-4 is It has been reported to reduce the proliferation of BCC cells and the addition of gremlin-1 indirectly reduces the anti-proliferative effect of BMP-4 (Sneddon JB et al., (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103: 14842-14847). .
  • an enzyme immunoassay was performed as follows. Specifically, microtiter plates (Corning Costar Corp., Cambridge, Mass.) Were coated with 100 nM of BMP-2, BMP-4, or BMP-7 (R & D Systems) and l) (w / v) skim milk in PBS. Blocked. Each well was then added with gremlin—1-Fc (10 nM) alone and a combination of gremlin-1-Fc (10 nM) and 500 nM of the antibody (0-13) according to the invention. After washing, plates were incubated with HRP-linked IgG-Fc specific antibodies (1: 5,000 dilution; Pierce Chemical Co.).
  • Example 6 Analysis of the effects of gremlin-1 and its antibodies on the dispersion and migration of cancer cells
  • A549 cells were analyzed by crystal vitreous staining. Specifically, A549 cells were plated in 24-well plates (1.0 ⁇ 10 4 cells / well) and treated with gremlin-1 having a His-tag of 100 nM for 3 days. The medium was removed ' and the cells were washed with PBS and then fixed for 10 minutes with 4% paraformaldehyde in PBS. Cells were stained for 30 minutes with 0.05% crystal violet in distilled water. Li XL et al. , (2009) Cancer Chemother Pharmacol 64: 1097-1104, according to the method disclosed in the staining solution was removed and cells washed three times with PBS. Images were acquired using a Leica DFL290 camera (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) and analyzed using Leica application suite software (Leica Microsystems).
  • FIG. 4A The captured image is shown in FIG. 4A.
  • A549 cells treated with gremlin-1 had a cell morphology similar to fibroblasts, and the cells were dispersed.
  • E-cadherin Downregulation of E-cadherin is associated with epithelial-mesenchymal transition (ETM), and inhibition of E-cadherin and EMT is commonly observed during cancer progression (Perl AK et al., (1998) Nature 392: 190-193).
  • ETM epithelial-mesenchymal transition
  • A549 cells (1.0 ⁇ 10 5 cells / well) were placed on a 60-mm dish. Plated and grown to 50% confluency. The cells were treated with gremlin-1 with 100 nM His-tag for 3 days. The cells were treated with cold lysis buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, l% Triton to X 100, 0.1 SDS, ImMPMSF containing a protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, M0). ], And then Western blot was performed according to the procedure described in Lee MS et al., (2008) Hybridoma (Larchmt) 27: 18-24.
  • E-cadherin 1,000 antibody; Abeam
  • ⁇ -actin 10, 000 antibody; Applied Biological Materials, Richmond, BC
  • HRP-bound anti-rabbit IgG l: l, 000 dilution; Pierce Chemical Co
  • the blot was visualized using the enhanced chemiluminescence system (Pierce) according to the manufacturer's instructions.
  • A549 cells (1.0 ⁇ 10 5 cells / well) were plated on glass coverlets coated with poly L-lysine (100 / ml, Sigma) and grown to 50% confluency.
  • Cells were treated with gremlin-1 with 100 nM His-tag for 3 days, washed with PBS, and then fixed at room temperature for 30 minutes with 4% paraformaldehyde in PBS.
  • Fixed cells were permeabilized with 0.2% Triton X-IOO (PBST) in PBS for 10 minutes at room temperature and then blocked at room temperature with 13 ⁇ 4 gelatin in PBST.
  • PBST Triton X-IOO
  • Immunofluorescence staining was performed using an E-cadherin antibody (Abeam) followed by Alexa 488-bound secondary antibody (Invitrogen). Nuclei were stained with DAPI (1: 1,000 dilution; Invitrogen), and actin filaments were stained with rhodamine-phalloidin (1: 1,000 dilution; Invitrogen). The cover slit was covered on a glass slide using an aqueous mounting medium with an anti-fading agent. Thereafter, images were acquired using an LSM 5 PASCAL laser scanning microscope (Carl Zeiss, Germany) and analyzed using LSM 5 PASCAL software.
  • cell movement analysis was performed as follows. Specifically, cells were plated in 24-well plates at a density of 1.0 10 5 cells per well. The wound was created by scratching with a pipette tip. After washing with medium to remove detached cells, gremlin-1 with 100 nM His-tagol was added to the culture for 24 hours. Immediately and 24 hours later images were analyzed using a Leica DFL290 camera (Leica Microsystems). The distance traveled by the cells through the area formed by the scratch was determined by measuring the wound width at 24 hours and subtracting it from the wound width at the time of initiation. The obtained values were then expressed as% migration, with the migration distance of untreated cells set to 100% as previously described.
  • wounded cells were treated with his-tag of gremlin-1 alone or 10 uM of the antibody (0-13) according to the present invention (or 10 yM control). Antibody) for 24 hours. The distance was determined as described above.
  • FIG. 5A The experimental results are shown in FIG. 5A. As shown in FIG. 5A, the gremlin-1 mRNA and protein were not expressed in the mock-A549 cell line, while the levels increased rapidly in the gremlin-1-A549 cell line.
  • E-cadherin was measured according to the immunoblot analysis method as follows. Specifically, gremlin-1-A549 cells and co-A549 cells (1.0 ⁇ 10 5 cells / well) were plated on 60-mm dishes and grown to 50% confluency. Co-A549 cells were incubated without treatment and gremlin-1-A549 cells were present in the presence of 10 ⁇ of antibody (0-13) or control antibody (Palivizumab, Synagis, Abbott Laborator ies, Abbot t Park, IL) according to the present invention. Incubated for 24 hours. Cells were lysed and analyzed according to the immunoblot assay described in Example 6.
  • Co-A549 cells and gremlin-1-A549 cells (3.0 ⁇ 10 5 cells / well) were suspended in 300 iiL serum-free medium. Complete medium (500 yL) containing 10% FBS was added to the bottom wells of the plate. Cells were incubated for 48 hours. Non-mobile cells were removed and washed with PBS. The membrane was fixed with 4% paraformaldehyde in PBS and stained with Crystal Violet Staining Solution (Chemicon). Images were acquired using a Leica DFL290 camera (Leica Microsystems) and analyzed using Leica application suite software. The migrated cells were counted in four separate fields per well. The obtained values were then expressed as> infiltration with the cell count of co-A549 cells set to 100%. .
  • Co-A549 cells and gremlin-1-A549 cells were plated and wounded. Co-A549 cells were cultured without any treatment, and gremlin-1-A549 cells were incubated for 24 hours in the presence of 10 ⁇ of the antibody (0-13) or control antibody according to the present invention. The distance was then determined as described above.
  • FIG. 5D The measurement results are shown in FIG. 5D.
  • gremlin-1-A549 cells showed increased migration compared to co- ⁇ 549 cells, and this increased migration was significantly inhibited upon addition of the antibody (0-13) according to the present invention. .
  • ⁇ 7-5> Cell Proliferation Assay To determine whether gremlin-1 affects cell growth, cell proliferation assays were performed. The assay was performed in 96-well plates in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FBS using CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Pr omega, Madison, Wis.). Specifically, co-A549 cells and gremlin-1-A549 cells were plated at a density of 1,000 cells per well. After 24 hours, cells were washed twice with serum free medium and incubated in 100 uL of complete medium with or without 3 ⁇ of the antibody according to the invention (0-13). Cell proliferation was determined using a Labsystems Mult iskan Ascent Photometric plate reader (Thermo Labsystems, Franklin, Mass.) On 96 well plates with 492 nm filters. The experiment was repeated three times.
  • FIG. 5E The measurement results are shown in FIG. 5E.
  • gremlin-1-A549 cells showed a higher growth rate compared to co-A549 cells, which increased by the addition of the antibody (0-13) according to the present invention. Suppressed.
  • tumor volume was measured after subcutaneous injection of gremlin-1-A549 cells or co-A549 cells into nude mice as follows.
  • Tumor Volume (Length X Width X Height) / 2 The measurement results are shown in FIG. 5F. Tumor volume in mice injected with gremlin -1-A549 cells increased more rapidly than mice injected with co-A549 cells and showed a tumor size difference of approximately 500 mm 3 at 14 weeks post-injection. These results show that increased expression of gremlin-1 plays an important role in tumorigenesis.
  • Example 8 Diagnosis of Cancer Using Gremlin-1 Antibodies Normal and cancerous tissues (skin, breast, lymph nodes, lungs, liver, esophagus, stomach, colon, rectum, kidney, bladder, prostate, testes) using immunohistochemical staining , Cervix, endometrium and thyroid cancer tissues) were reacted with the antibody (0-13) according to the present invention to compare the expression levels of gremlin-1.
  • FITC reagent to label the antibody with FITC according to the manufacturer's instructions (Pierce FITC antibody labeling kit, 53027). Paraffin removal was performed on a tissue array slide (superbiochip BC8) on which normal and cancerous tissues were fixed according to the manufacturer's instructions. The slides were placed in a glass jar containing antigen retrieval solution (TE pH 9.0) and then heated in a pressure cooker for 30 minutes. The slides were taken out, cooled to 60-65 ° C., washed with distilled water, soaked in cold 95% ethanol for 10 minutes, and then washed with running water for 10 minutes.
  • TE pH 9.0 antigen retrieval solution
  • Thermo Ultra-vision LP detection system (Therao) according to the manufacturer's instructions.
  • the antibody was used at 1:75 and anti-FITC mouse IgG (LS bio) was used at 1: 200.
  • the HRP-bonded polymer (Labvision) was treated for 15 minutes, and then the DAB solution was treated for 1 minute. It was counterstained with Mayer's hematoxylin solution and then observed in 4x, 200x and 400x order under a microscope.
  • IgGkappa antibody was used as a control.
  • the experimental results are shown in FIGS. 6A to 61. As shown in FIG.
  • the antibody according to the present invention is compared with normal tissues such as skin, breast, lymph node, lung, liver, esophagus, stomach, colon, rectum, kidney, bladder, prostate, testes, cervix, endometrium and Strong reaction was seen in thyroid cancer tissue.
  • normal tissues such as skin, breast, lymph node, lung, liver, esophagus, stomach, colon, rectum, kidney, bladder, prostate, testes, cervix, endometrium and Strong reaction was seen in thyroid cancer tissue.
  • gremlin-1 is distributed and overexpressed in various cancer tissues. Therefore, it is expected that cancer or immune disease can be diagnosed using the antibody against gremlin-1 according to the present invention.

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Abstract

본 발명은 골형성 단백질(BMP) 또는 혈관내피성장인자 수용체-2(VEGFR2)에 비의존적인 방식으로 그렘린-1을 억제함으로써 암에 대해 치료 효과를 갖는, 그렘린-1에 대한 항체에 관한 것으로서, 본 발명의 항체는 그렘린-1에 의존하는 세포 이동성(cell migration), 세포 침윤성(Cell invasion) 및 세포 증식(Cell proliferation)을 억제함으로써 암 또는 면역질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

명세서
그렘린 -1에 대한 항체 발명의 분야 본 발명은 그렘린 -l(gremlin-l)에 대한 항체에 관한 것으로서， 보다 상세하게는 골형성 단백질 (BMP) 또는 혈관내피성장인자 수용체 -2(VEGFR2)에 비의존적인 방식으로 그렘린 -1을 억제함으로써 암에 대해 치료 효과를 갖는， 그렘린 -1에 대한 항체에 관한 것이다. 발명의 배경 그렘린 -l(gremlin-l, 20.7 kDa)은 골형성 단백질 (BMP)의 길항제로서， 시스테인 풍부 영역 시스테인 매듭 모티프 (cysteine knot motif), 및 TGF-β 수퍼패밀리의 구성원과 공통된 구조를 갖는 184개의 아미노산으로 구성된 단백질이다. 상기 단백질은 진화적으로 보존되어 있으며 인간 그렘린 유전자 는 염색체 15ql3-ql5 상에 위치한다 (Topol LZ et al . , (1997) Mol. Cell Biol. , 17： 4801-4810； Topol LZ et al. , Cytogenet Cell Genet. , 89： 79-84) . 그렘린 -1은 분비 단백질로서 세가지 아형 (isoform)이 보고되었다 (Topol LZ et al., J. Biol. Chem. , 275： 8785-8793). 아형 1은 가장 흔한 아형이며, 아형 2 및 3은 각각 아미노산 39-79 및 10-79가 결실되어 있다.
그렘린 -1은 BMP-2, BMP-4 및 BMP-7과 이종이량체 (heterodimer)를 형성함으로써 BMP가 세포 표면상의 수용체에 결합하는 것을 억제한다 (Stanley E et al., (1998) Mech. Dev., 77： 173-184； Merino R et al . , (1999) Development, 126： 5515-5522； Lap in DW et al . , (2000) Curr. Opin. Nephrol. Hyper tens. , 9： 469-472). 또한， 그렘린 -1은 폐， 팔다리， 및 신장 발달 과정 뿐만 아니라 신경 능선 세포 (neural crest cell) 분화 과정에서 BMP를 조절하는 중요한 역할을 한다 (Lu醒 et al. , (2001) Dev. Dyn., 222： 667-680； Shi W et al . , (2001) Am. J. Physiol. Lung Cell Mol . Physiol., 280： L1030-1039). 그템린— 1은 가용성 리간드에 대해 길항 효과를 나타낼 뿐만 아니라， 세포 내에서 BMP-4 전구 단백질과 상호작용하여 배아 폐에서 BMP-4 매개 신호전달 활성을 하향조절한다 (Sun J et al., (2006) J. Biol. Chew. , 281： 29349-29356). 또한, 그렘린 -1은 분비된 축색돌기 안내 단백질 (axonal guidance protein)의 하나인 슬릿 단백질 (Slit protein)과 상호작용하며, 단핵구 주화성 (chemotaxis)의 억제제로서 작용한다 (Chen B et al., (2004) J. Immunol. , 173： 5914-5917) . 최근에는 그렘린 -1이 BMP-비의존성 방식으로 혈관내피 성장인자 수용체 -2(VEGFR2)에 결합하여 혈관형성을 조절한다는 것이 보고되었다 (Mitola S et al. , (2010) Blood, 116： 3677-3680) . 그렘린— 1은 자궁 경관， 자궁 내막, 폐， 난소， 신장， 유방， 대장， 및 췌장의 암종을 포함한 다양한 인간 종양에서 과발현되지만 (Namkoong H et al. , (2006) BMC Cancer,^' 74； Sha G et al . , (2009) Fertil Steril. , 91: 350-358), 종양형성에서의 그 역할은 상세하게 연구되지 않았다. 본 발명자들은 그렘린ᅳ1의 종양 관련 특성을 연구하던 중， 그렘린— 1이 BMP나 VEGFR2와 무관하게 암세포와 직접 상호작용을 한다는 사실을 발견하였고， 이를 바탕으로 그렘린 -1을 억제할 수 있는 항체를 개발하는데 이르렀다. 발명의 요약 본 발명은 골형성 단백질 (BMP) 또는 혈관내피성장인자 수용체 -2(VEGFR2)에 비의존적인 방식으로 그렘린 -1을 억제함으로써 암 또는 면역질환에 대해 치료효과를 갖는, 그렘린 -1에 대한 항체를 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 항체 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 암 또는 면역질환의 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 나아가， 본 발명은 상기 항체 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암 또는 면역질환의 치료 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 항체를 포함하는 암 또는 면역질환의 진단용 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 그렘린ᅳ 1에 대한 항체는 그렘린 -1이 골형성 단백질 (BMP) 또는 혈관내피성장인자 수용체 -2(VEGFR2)에 비의존적인 방식으로 암세포에 결합하는 것을 억제하는 바, 그렘린 -1에 의해 매개되는 각종 암또는 면역질환의 예방또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다. 도면의 간단한설명 도 1은 2차 항체, 그렘린 -1 단독， 및 그렘린 -1과 본 발명에 따른 항체 또는 대조군 항체와의 조합을 4종의 암세포 (A549, HeLa, A172 및 A431)와 반응시킨 후， 유세포분석법으로 측정한 그래프이다.
도 2A는 그렘린— 1을 HUVEC 세포와 반웅시킨 후, 유세포분석법으로 측정한 그래프이다.
도 2B는 그렘린 -1을 HUVEC, A549 및 HeLa 세포와 반응시킨 후, VEGFR2 mRNA 및 단백질 발현을 RT-PCR로 측정한 결과이다.
도 2C는 그렘린 -1을 HUVEC, A549 및 HeLa 세포와 반응시킨 후， VEGFR2 mRNA 및 단백질 발현을 면역블롯 분석으로 측정한 결과이다.
도 3A는 BMP2, BMP4 및 BMP7에 그렘린 1 단독， 본 발명에 따른 항체 단독 및 이들의 조합을 반응시켜 BMP에 결합된 그렘린 -1의 양을 효소 면역 분석으로 측정한 결과이다.
도 3B는 A549 세포와 그렘린 -1을 반웅시키고， 여기에 10배 몰 과량의 BMP-2, BMP-4 및 BMP-7을 가한 후, 유세포분석법으로 측정한 그래프이다. 도 4A는 A549 세포를 그렘린 -1과 반응시킨 후， 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 촬영한 세포의 이미지이다.
도 4B는 A549 세포를 그렘린 -1과 반응시킨 후， E-카드헤린 (E-cadherin)의 발현을면역블롯 분석으로 측정한 것이다.
도 4C는 A549 세포를 그렘린 -1과 반웅시킨 후， E-카드헤린 (E-cadherin)의 발현을 면역형광 염색으로 측정한 것이다.
도 4D는 A549 세포를 그렘린 -1 단독， 및 그렘린 -1과 본 발명에 따른 항체 또는 대조군 항체와의 조합과 반웅시킨 후， 세포의 이동을 측정한 그래프이다. 도 5A는 그렘린 -1-A549 세포주， 공 (mock)-A549 세포주에서의 그렘린 -1 mRNA 및 단백질 발현을 RT-PCR 및 웨스턴 블롯에 의해 측정한 것이다.
도 5B는 그렘린 -1-A549 세포주， 공 (mock)-A549 세포주 및 본 발명에 따른 항체 및 대조군 항체를 처리한 그렘린 1-A549 세포주에서의 E-카드헤린의 발현량을 면역블롯 분석 방법에 따라 측정한 것이다.
도 5C는 공 -A549 세포주 및 그렘린 -1-A549 세포주에서 침윤된 세포의 수를 측정한 그래프이다.
도 5D는 그렘린 -1-A549 세포주, 공 (mock)ᅳ A549 세포주 및 본 발명에 따른 항체 및 대조군 항체를 처리한 그렘린 -1-A549 세포주에서의 세포 이동을 측정한 그래프이다.
도 5E는 그렘린 -1-A549 세포주， 공 (mock)ᅳ A549 세포주 및 본 발명에 따른 항체를 처리한 그렘린 -1-A549 세포주의 세포 성장을 측정한 그래프이다.
도 5F는 그렘린 -1-A549 세포주 및 공 (mock)-A549 세포주를 누드 마우스에 주사한 후 형성된 종양 부피를 측정한 그래프이다.
도 6A 내지 61는 면역조직화학 염색법을 이용하여 정상 조직 및 암 조직 (피부, 유방, 림프절， 폐， 간， 식도， 위， 결장， 직장， 신장, 방광, 전립선， 고환， 자궁경， 자궁내막 및 갑상선 암 조직)을 본 발명에 따른 항체 (으 13)와 반응시켜 그렘린ᅳ 1의 발현량을 비교한 결과이다.
Figure imgf000007_0001
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 그렘린 -1에 대한 항체를 제공한다. 상기 항체는 골형성 단백질 (BMP) 또는 혈관내피성장인자 수용체 -2(VEGFR2)에 비의존적인 방식으로 그렘린 -1을 억제함으로써 암에 대해 치료 효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 항체는 면역 항체， 키메라 항체， 인간 항체 또는 인간화 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 그렘린 -1에 대한 항체는 예를 들어 파아지 -디스플레이 기술을 웅용하여 선별할 수 있다. 즉， 필라멘트 (filamentous) 파아지 표피 단백질을 발현하는 유전자에 목적하는 항체를 발현하는 유전자를 융합시키고， 상기 융합된 항체가 박테리오 파아지 입자의 표면에 노출된 항체-파아지 형태의 바이러스 입자를 생성시킨 다음, 바이오패닝 (biopanning) 기법을 응용하여 파아지 라이브러리로부터 원하는 항체를 선별할 수 있다. 상기와 같은 파아지 -디스플레이 기술을 통해 다수의 효과가 우수한 항체들올 확보할 수 있으며， 이중 효과가 매우 뛰어난 7종의 항체를 수득하였다.
상기 항체는 경쇄불변영역, 중쇄불변영역ᅳ 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역을 포함하고， 상기 경쇄가변영역과 중쇄가변영역이 각각 하기의 아미노산서열을 갖는 항체일 수 있다:
(1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역을 포함하는 항체;
(2) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 4의 아미노산서열을 갖는 중쇄가변영역을 포함하는 항체;
(3) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역을 포함하는 항체;
(4) 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역을 포함하는 항체;
(5) 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역을 포함하는 항체;
(6) 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역을 포함하는 항체; 및
(7) 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역을 포함하는 항체.
본 발명에서 상기 (1) 내지 (7)의 항체를 각각 R-80, R-88, 0-1, 0-13， 0-26, J-1 및 으 13(인간화) 항체로 명명하였다.
상기 항체의 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역은 인간 또는 토끼의 것일 수 있다. 상기 항체의 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역은 각각 단독으로 사용되거나, 둘이 조합되어 사용되거나， 본 기술분야에 공지된 경쇄불변영역 및 중쇄불변영역과 각각 조합되어 .사용될 수 있으며， 이들의 단편이 사용될 수도 있다. 또한， 상기 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역은 공지의 방법에 따라 scFv(single-chain variable fragment)의 형태로 제조될 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역의 경우， 1 내지 22번째 아미노산은 프레임워크 영역 (FR1)이고, 23 내지 33번째 아미노산은 상보성 결정영역 l(CDRl)이며, 34 내지 48번째 아미노산은 FR2이고, 49 내지 55번째 아미노산은 CDR2이며， 56 내지 87번째 아미노산은 FR3이고， 88 내지 100번째 아미노산은 CDR3이며， 101 내지 110번째 아미노산은 FR4이다.
또한， 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역의 경우， 1 내지
24번째 아미노산은 FR1이고， 25 내지 34번째 아미노산은 CDR1이며， 35 내지
48번째 아미노산은 FR2이고, 49 내지 64번째 아미노산은 CDR2이며, 65 내지 95번째 아미노산은 FR3이고, 96 내지 105번째 아미노산은 CDR3이며， 106 내지 116번째 아미노산은 FR4이다.
또한， 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역의 경우， 1 내지 번째 아미노산은 FR1이고, 23 내지 33번째 아미노산은 CDR1이며, 34 내지 번째 아미노산은 FR2이고， 49 내지 55번째 아미노산은 CDR2이며， 56 내지 번째 아미노산은 FR3이고， 88 내지 100번째 아미노산은 CDR3이며， 101 내지0번째 아미노산은 FR4이다.
또한, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역의 경우， 1 내지 번째 아미노산은 FR1이고, 25 내지 34번째 아미노산은 CDR1이며， 35 내지 번째 아미노산은 FR2이고， 49 내지 64번째 아미노산은 CDR2이며， 65 내지 번째 아미노산은 FR3이고, 96 내지 109번째 아미노산은 CDR3이며, 110 내지0번째 아미노산은 FR4이다.
또한， 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역의 경우, 1 내지 번째 아미노산은 FR1이고， 23 내지 35번째 아미노산은 C U이며, 36 내지 번째 아미노산은 FR2이고， 51 내지 57번째 아미노산은 CDR2이며, 58 내지 번째 아미노산은 FR3이고， 90 내지 100번째 아미노산은 CDR3이며， 101 내지0번째 아미노산은 FR4이다.
또한， 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역의 경우, 1 내지 번째 아미노산은 FR1이고， 26 내지 35번째 아미노산은 CDR1이며， 36 내지 번째 아미노산은 FR2이고， 50 내지 66번째 아미노산은 CDR2이며, 67 내지 번째 아미노산은 FR3이고, 99 내지 110번째 아미노산은 CDR3이며, 111 내지2번째 아미노산은 FR4이다.
또한， 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역의 경우， 1 내지 번째 아미노산은 FR1이고, 23 내지 35번째 아미노산은 CDR1이몌 36 내지 번째 아미노산은 FR2이고, 51 내지 57번째 아미노산은 CDR2이며, 58 내지 번째 아미노산은 FR3이고， 90 내지 100번째 아미노산은 CDR3이며， 101 내지0번째 아미노산은 FR4이다.
또한, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역의 경우， 1 내지 번째 아미노산은 FR1이고, 26 내지 35번째 아미노산은 CDR1이며， 36 내지 번째 아미노산은 FR2이고， 50 내지 66번째 아미노산은 CDR2이며, 67 내지 98번째 아미노산은 FR3이고， 99 내지 110번째 아미노산은 CDR3이며, 111 내지 121번째 아미노산은 FR4이다.
또한， 서열번호 9의 아미노산 서열올 갖는 경쇄가변영역의 경우, 1 내지
22번째 아미노산은 FR1이고， 23 내지 35번째 아미노산은 CDR1이며， 36 내지 50번째 아미노산은 FR2이고， 51 내지 57번째 아미노산은 CDR2이며， 58 내지
89번째 아미노산은 FR3이고, 90 내지 100번째 아미노산은 CDR3이며， 101 내지 110번째 아미노산은 FR4이다.
또한， 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역의 경우, 1 내지
25번째 아미노산은 FR1이고， 26 내지 35번째 아미노산은 CDR1이며, 36 내지 49번째 아미노산은 FR2이고, 50 내지 66번째 아미노산은 CDR2이며, 67 내지
98번째 아미노산은 FR3이고, 99 내지 110번째 아미노산은 CDR3이며， 111 내지 121번째 아미노산은 FR4이다.
또한， 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역의 경우， 1 내지
23번째 아미노산은 FR1이고， 24 내지 34번째 아미노산은 CDR1이며， 35 내지 49번째 아미노산은 FR2이고, 50 내지 56번째 아미노산은 CDR2이며， 57 내지
88번째 아미노산은 FR3이고, 89 내지 97번째 아미노산은 CDR3이며， 98 내지 107번째 아미노산은 FR4이다.
또한， 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역의 경우， 1 내지
30번째 아미노산은 FR1이고, 31 내지 35번째 아미노산은 CDR1이며, 36 내지 49번째 아미노산은 FR2이고， 50 내지 66번째 아미노산은 CDR2이며, 67 내지
98번째 아미노산은 FR3이고， 99 내지 110번째 아미노산은 CDR3이며， 111 내지 121번째 아미노산은 FR4이다.
또한, 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역의 경우， 1 내지
23번째 아미노산은 FR1이고, 24 내지 36번째 아미노산은 CDR1이며, 37 내지 51번째 아미노산은 FR2이고, 52 내지 58번째 아미노산은 CDR2이며， 59 내지
90번째 아미노산은 FR3이고， 91 내지 1이번째 아미노산은 CDR3이며， 102 내지 111번째 아미노산은 FR4이다. 또한, 서열번호 14의 아미노산 서열올 갖는 중쇄가변영역의 경우， 1 내지 25번째 아미노산은 FR1이고， 26 내지 35번째 아미노산은 CDR1이며， 36 내지 49번째 아미노산은 FR2이고, 50 내지 66번째 아미노산은 CDR2이며， 67 내지 98번째 아미노산은 FR3이고, 99 내지 110번째 아미노산은 CDR3이며， 111 내지 121번째 아미노산은 FR4이다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 서열번호 15의 염기 서열에 의해 코딩될 수 있으며， 서열번호 2의 아미노산 서열은 서열번호 16의 염기 서열에 의해 코딩될 수 있고, 서열번호 3의 아미노산 서열은 서열번호 17의 염기 서열에 의해 코딩될 수 있으며, 서열번호 4의 아미노산 서열은 서열번호 18의 염기 서열에 의해 코딩될 수 있고， 서열번호 5의 아미노산서열은 서열번호 19의 염기 서열에 의해 코딩될 수 있으며， 서열번호 6의 아미노산 서열은 서열번호 20의 염기 서열에 의해 코딩될 수 있고, 서열번호 7의 아미노산 서열은 서열번호 21의 염기 서열에 의해 코딩될 수 있으며， 서열번호 8의 아미노산 서열은 서열번호 22의 염기 서열에 의해 코딩될 수 있고, 서열번호 9의 아미노산 서열은 서열번호 23의 염기 서열에 의해 코딩될 수 있으며， 서열번호 10의 아미노산 서열은 서열번호 24의 염기 서열에 의해 코딩될 수 있고， 서열번호 11의 아미노산 서열은 서열번호 25의 염기 서열에 의해 코딩될 수 있으며， 서열번호 12의 아미노산 서열은 서열번호 26의 염기 서열에 의해 코딩될 수 있고, 서열번호 13의 아미노산 서열은 서열번호 27의 염기 서열에 의해 코딩될 수 있으며， 서열번호 14의 아미노산 서열은 서열번호 28의 염기 서열에 의해 코딩될 수 있다. 종래 그템린 -1이 암 조직에서 발현된다는 것이 알려져 있으나, 그 구체적인 역할은 아직 규명되지 않았다. 그렘린 -1은 골형성 단백질 (BMP) 길항제로서 알려져 있을 뿐만 아니라， 그렘린 -1이 혈관내피 성장인자 수용체 -2(VEGFR2)에 결합하여 혈관형성을 조절하는 것으로 보고되어 있으므로， 그렘린ᅳ1이 BMP나 VEGFR2를 통해 암과 관련되어 있을 것으로 예상되었다. 하지만， 놀람게도 본 발명은 그렘린ᅳ1이 BMP나 VEGFR2에 비의존적으로, 즉 이들에 의해 매개되지 않고， 암세포와 직접 결합하여 세포 이동， 침윤， 및 증식을 유도한다는 것을 발견하였다. 또한, 그렘린ᅳ1은
Eᅳ카드헤린 (E-cadherin)의 발현을 억제함으로써 암세포의 성장을 유도한다.
상기 세포 이동， 침윤 및 증식 등은 전술한 그렘린 -1에 대한 항체에 의해 억제된다. 따라서, 그렘린 -1 항체는 BMP나 VEGFR2에 비의존적으로 그렘린ᅳ1을 억제함으로써， 즉 그렘린 -1이 암세포에 직접 결합하는 것을 억제함으로써， 암에 대한 치료 효과를 가질 수 있다.
이에 본 발명은 상기 항체 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 첨가제는 담체， 부형제 또는 기타 첨가제일 수 있다. 본 발명의 조성물은 통상적인 방법에 따라 약학 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서， 상기 항체를 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나， 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 담체가 회석제로 사용되는 경우에는 항체에 대한 담체， 부형제 또는 매질 (medium)로 작용하는 고형, 반고형 또는 액상의 물질일 수 있다. 따라서， 제형은 정제, 환제， 분제， 새세이, 엘릭시르, 현탁제， 유제, 용액제， 시럽제， 에어로졸， 연질 또는 경질 젤라틴 갑셀제， 멸균 주사제， 멸균 분제 등의 형태일 수 있다. 적합한 담체， 부형제 및 회석제의 예로는, 락토즈, 텍스트로즈， 수크로즈， 솔비를, 만니를, 칼슘 실리케이트， 샐를로즈 메틸 셀를로즈, 미정질 셀를로즈， 폴리비닐피롤리돈， 물， 메틸하이드록시벤조에이트， 프로필하이드록시벤조에이트， 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 층진제， 항웅집제, 윤활제， 습윤제, 향료， 유화제， 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 항체의 신속， 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 본 발명의 항체 조성물은 상기 항체와 함께 인터페론， 항 -HBV 단일클론 항체, 항 -HBV 폴리클로날 항체， 뉴클레오사이드 유사체， DNA폴리머라제 저해제， siRNA제제 또는 치료백신을 항바이러스제로서 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상， 예를 들어 인간을 포함하는 포유동물에게 투여함으로써 암을 치료할 수 있다. 이때， 상기 항체의 투여량은 처리되는 대상， 질병 또는 상태의 심각도, 투여의 속도 및 처방 의사의 판단에 따른다. 유효성분으로서 상기 항체는 포유동물에 대해 하루 0.001 내지 10 mg/kg (체중)， 바람직하게는 0.005 내지 1 mg/kg (체중)의 양으로 1일 1회 또는 분할하여 비경구적 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부의 경우에 있어서， 상기 언급된 범위보다 적은 투여량이 보다 적합할 수 있고， 해로운 부작용을 일으키지 않으면서도 보다 많은 양의 사용될 수도 있으며， 보다 많은 투여량의 경우는 하루에 걸쳐 수회의 적은 분량으로 분배될 수도 있다. 이에， 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는， 암의 치료 방법을 제공하며. 상기 본 발명에 따른 항체는 골형성 단백질 (BMP) 또는 혈관내피성장인자 수용체 -2(VEGFR2)에 비의존적인 방식으로 그렘린 -1을 억제함으로써 암을 치료하는 것을 특징으로 한다. 전술한 암의 예로는 전립선암, 췌장암， 폐암， 비소세포 폐암， 위암， 간암, 신장암, 난소암 대장암， 직장암， 유방암, 갑상선암， 피부암， 골암， 기저세포암， 편평세포암, 비인두암， 방광암， 자궁암， 피부암, 식도암 및 두경부암을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 한편， 본 발명의 항체는 면역질환의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다. 그렘린 -1이 면역질환과 밀접한 관련이 있음이 여러 문헌을 통해 입증되었다 (Mezzano S, et al . (2007) Expression of gremlin, a bone morphogenet ic protein antagonist , in glomerular crescents of pauci- immune glomerulonephritis. Nephrology, dialysis , transplant at ion: official publication of the European Dialysis and Trans lant Assoc i at ion - European Renal Association 22(7)： 1882-1890) .
따라서， 본 발명에 따른 그렘린 -1을 억제하는 항체는 면역질환을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
상기 면역질환의 예로는 류머티스성 관절염 (rheumatoid arthritis), 전신성 경피증 (Progressive systemic sclerosis, Scleroderma) , 전신 흥반성 낭창 (lupus), 아토피 피부염， 원형탈모증 (alopecia areata), 건선 (乾 «), 천포창, 천식， 아프타구내염， 만성 갑상선염， 후천성 재생불량성 빈혈, 일차성 간경변， 궤양성 대장염， 베체트병 (Behcet' s disease), 크론병， 규소 폐증， 석면 폐증, IgA 신장질환, 연쇄상구균감염후 사구체신염 (PSGN), 쇼그렌 증후군 (Sjogren Syndrome) , 길리안一바레 증早 (Gui Han— Barre syndrome) , 피부근염 (dermatomyositis), 다발성 근염 (polymyositis)， 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 자가면역성 용혈성 빈혈 (Autoimmune hemolytic anemia), 자가면역성 뇌척수염, 중증 근무력증 (Myasthenia gravis), 그레이브병 (Grave' s disease), 결절성 다발성 동맥염 (Polyarteritis nodosa) , 강직성 척주염 (Ankylosing spondylitis), 섬유조직염 (Fibromyalgia syndrome) 및 측두동맥염 (Temporal arteritis)을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 한편, 본 발명은 본 발명에 따른 항체를 포함하는 암 또는 면역질환 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 본 발명에 따른 항체 이외에 면역조직화학 염색법을 위한 통상의 시약 등을 추가로 포함할 수 있다. 추가로 포함될 수 있는 구성요소로는 FITC 시약， 항원 복구액 (antigen retrieval solution), 대조군 항체， HRP-결합된 중합체， DAB 용액 (3-3'-diaminobezidine tetrachloride), 메이어 헤마록실린 용액 (Mayer' s hematoxylin solution) 등을 들 수 있으나ᅤ 이에 제한되지 않는다. 상기 키트는 정상 조직과 진단을 위한 조직에 표지된 본 발명에 따른 항체를 반응시키고， 이를 염색하여 현미경으로 관찰함으로써， 본 발명에 따른 항체와 반웅한 조직을 암 또는 면역질환에 걸린 또는 위험성이 있는 조직으로 진단할 수 있다. 이하의 실시예를 통하여 본 발명의 특정 구체예를 설명한다.
이하에 기재하는 구체예는 예시적인 목적으로 기술된 것일 뿐이몌 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 실시예 1: 그렘린 -1의 발현 및 정제
<!-!> 세포 배양
A549, HeLa, A172, 및 A431 세포는 한국세포주은행 (서울， 대한민국)으로부터 입수하였고， 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)는 인비트로겐 (Carlsbad, CA)으로부터 입수하였다. 한편， A549, A172 및 A431 세포는 10% FBS(GIBC0, Grand Island, NY)가 보층된 RPMI-1640 배지 (Welgene, 대한민국)에서， HeLa 세포는 10% FBS가 보층된 MEM 배지 (Welgene)에서， 그리고 HUVEC는 내피세포 성장 배지 -2(EGM-2, Lonza, Walkersvi 1 le, MD)에서 배양하였다.
<1-2>그렘린ᅳ1 발현 백터의 제조 및 형질감염
문헌 [Namkoong H et al . , (2006) BMC Cancer 6 : 74]의 방법을 참조하여 , 인간 자궁 조직 cDNA 라이브러리로부터 그렘린 cDNA를 증폭시켜 수득하였다. 이후， 하기 PCR 프라이머를 사용한 PCR을 통해 상기 그렘린 cDNA의 5' 및 3' 말단에 Hind 및 ¾?I 제한효소 부위를 도입하였다.
5' -CCC AAG CTT ATG AGC CGC ACA GCC TAC AC-3' (서열번호 29)
5' -CCG CTC GAG ATC C ATC GAT GGA TAT GC-3' (서열번호 30)
상기 PCR 산물을 HindUl 및 ¾I으로 절단한 다음,
Figure imgf000015_0001
백터 (인비트로겐) 내로 라이게이션하여 그렘린 -1 발현 백터를 제조하였다. 한편， 형질감염 1일 전, A549 세포 (5.0X105 세포)를 플레이트에 도말하여 70% 컨플루언시 (confhiency)에 도달하게 하였다. 이후, 상기 제조된 그렘린 -1 발현 백터를 리포펙타민 2000 시약 (인비트로겐)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 A549 세포에 형질감염시켰다. 상기 형질감염된 세포를 1.0 mg/ml의 항생제 G418(인비트로겐)을 사용하여 선별하였다. 상기 선별된 그렘린 -1 발현 세포주를 '그렘린 -1-A549' 세포주로 명명하였다.
전술한 방식대로， 그렘린 -1이 삽입되지 않은 pcDNA3.1/ ^ His 백터 단독으로 A549 세포를 형질감염시켜 '공 (mock)-A549' 세포주를 수득하였다. <1-3>그렘린 -1의 발현 및 정제
그렘린 -1 및 인간 IgG-Fc 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 문헌 [Park S et al., (2010) Clin Chim Acta 411： 1238-1242]에 기재된 방식대로 오버랩핑 PCRCover lapping PCR)을 이용하여 제조하였다. 상기 PCR에 사용된 그렘린 -1 및 IgG-Fc에 대한 링커 프라이머 서열은 하기와 같다:
(1) 그렘린 -1
F: 5' -GGC CCC ACC GGC CCC ATC C ATC GAT-3' (서열번호 31)
R: 5' -GGG GCC GGT GGG GCC TCG GGT GGC GGT GGC-3' (서열번호 32) (2) IgG-Fc
F: 5' -AAG CTT GTG GCC CAG GCG GCC ATG AGC CGC ACA GCC TAC-3' (서열번호 33)
R: 5' -GGA TCC TCA ΓΓΤ TGG CGG GGA CAG GGA GAG-3' (서열번호 34) 상기 PCR 산물을 Hindni 및 BamB으―로 절단하여 pCEP4 발현 백터 (인비트로겐) 내로 클로닝하여， 그렘린 -1-Fc 융합 단백질을 발현하는 백터를 제조하였다.
한편， HEK293F 세포 (인비트로겐)를 GIBCO FreeStyle™ 293 발현 배지 (인비트로겐)에 0.1X106 내지 2.0X106 세포 /ml의 세포 밀도로 배양한 후, 통기구멍 마개가 있는 1회용 엘렌마이어 조직 배양 플라스크 (Corning Inc.)로 옮겨 오비탈 교반 배양기 (orbital shaking incubator; 37°C , 8% C02, Minitron, INFORSHT, Switzerland) 상에서 135 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 형질감염 1일전， 상기 세포 배양물에 신선한 배지를 첨가하여 Ι,ΟΧΙΟ6 세포 /ml의 밀도로 희석하고 2.0X106 세포 /ml의 밀도에 도달할 때까지 배양하였다. 이후, 상기 HEK293 세포를 리포펙타민 2000(인비트로겐)을 이용하여 전술한 그렘린 -1 및 인간 IgG-Fc 융합 단백질을 발현하는 백터로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 다시 오비탈 교반 배양기에서 배양하고， 형질 감염 3일째에 배양 상등액을 회수하였다. 이후， 문헌 [Park S et al. , (2010) Clin Chim Acta 411： 1238-1242]에 기술된 과정에 따라 단백질 A 친화성 겔 크로마토그래피를 이용하여 그렘린 -1-Fc 융합 단백질을 정제하였다. 실시예 2: 그렘린 -1항체의 생성
<2-1> 면역화
5 의 그렘린 -1-Fc를 2 mL의 인산완충식염수 (PBS)와 흔합하여, 37°C에서
30분간 배양하여, 이를 2% 스쿠알렌 중에 독소가 제거된 내독소인 MPL(monophosphory 1 ate lipid A species) 및 마이코박테리아 (mycobacteria)의 세포벽 성분인 TE 및 CWS를 함유하는 유중수 유화액인 보조제 (Sigma, St. Louis, Mo)에 유화시킨 다음, 뉴질랜드 흰 토끼에 주입하였다. 면역화를 3주마다 3회 수행하였다. 면역화된 토끼의 항체 역가 (titer)를 이차 항체로서 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP)-컨쥬케이트된 마우스 항 -토끼 IgG 다클론 항체 (Pierce Chemical Co. , Rockford, IL)를 사용하여 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 결정하였다.
상기 면역화된 토끼의 비장 및 골수로부터 TRI 시약 (Invitrogen)을 이용하여 총 RNA를 수득하였다. 추출된 비장 및 골수를 균질기를 이용하여 50% 아웃풋 (output)에서 1분 동안 TRI 시약 중에서 균질화하고 실온에서 5분간 배양하였다. 균질화된 시료를 4°C에서 10분간 2,500g에서 원심분리하였다. 상등액을 50 mL 원심분리 튜브로 옮기고 각 상등액에 3 rnL의 1-브로모 -3-클로로-프로판 (BCP, Sigma)을 첨가하였다. 이후， 상기 흔합물을 15초간 볼텍싱 (vortexing)하고， 실온에서 15분간 배양하였다. 흔합물을 4°C에서 15분간 17,000g에서 원심분리하고， 무색의 상층 수성상을 새로운 50 mL 류브로 옮겼다. 이후, 15 mL의 이소프로판올을 첨가하여 실온에서 10분간 배양하였다. 4°C에서 15분간 17,500g에서 원삼분리한 후, 상등액을 조심스럽게 제거하고, 펠렛을 재현탁시키지 않고 30 mL의 75% 에탄올로 세척하였다. 펠¾을 10분간 다사 원심분리하고 상등액을 제거한 후， 펠렛을 실은에서 공기건조시켰다. 이후, 펠렛을 RNase가 없는 물에 용해시키고， -8CTC에 보관하였다. 260 nm에서 광학 밀도를 측정하여 RNA농도를 결정하고 (40 ng/uL RNA가 0D260=1을 생성함)， 순도를 0D260/0D280의 비율에 의해 계산하였다 (통상적으로 1.6 내지 1.9의 범위임).
<2-2>총 RNA로부터 제 1가닥 cDNA 합성
을리고 (dT) 프라이밍 (priming)을 갖는 제 1가닥 cDNA 합성 키트에 대한 수퍼스크립트 (Superscript™) III 시스템 (Invitrogen)을 이용하여 제 1가닥 cDNA를 합성하였다. 상기 분리된 5 의 총 RNA를 1 UL의 0.5 yg/uL을리고 (dT), 1 liL의 10 mM dNTP 및 디에틸 피로카보네이트 (DEPC)-처리된 물과 흔합하여 최종 부피를 10 L로 조정하였다. 상기 흔합물을 65°C에서 5분간 배양하고 얼음에서 넁각시켰다. 상기 RNA시료에 2 tiL의 10x 반응 완층액， 4 uL의 25 mM MgCl2, 2 UL의 100 mM디티오트레이를 (DTT), 1 의 RNase OUT(Ribonuc lease Inhibitor) 및 1 uL의 Superscript III 역전사효소를 첨가하고 50°C에서 50분간 배양하였다. 85°C에서 5분간 배양한 후， 얼음에서 넁각시켜 반응을 종료하였다. 이후, 1 L의 RNase H를 첨가하고 37°C에서 20분간 배양하였다. 상기 제 1가닥 cDNA를 -20°C에서 보관하였다.
<2-3> 1차 PCR 토끼의 비장 및 골수로부터 얻은 제 1가닥 cDNA에 대하여 Expand High Fidelity PCR 시스템 (Roche Molecular Systems, IN, USA)을 이용한 30 사이클의 PCR올 수행하였다. 토끼 VL(9xVk 및 1XV 코딩 서열 증폭을 위한 10개의 프라이머 조합 및 토끼 VH 코딩 서열 (표 1)의 증폭을 위한 4개의 조합을 함께 사용하였다. 각 반응에서, 1 L의 cDNA를 60 pmol의 각 프라이머， 10 yL의 10X 반웅 완충액， 8 의 2.5mmdNTP(Promega, Madison, WI), 0.5 의 TaqDNA 중합효소， 및 물과 흔합하여 최종 부피를 100 iiL로 조정하였다. 하기 조건에서 PCR을 수행하였다: 94°C에서 15초， 56°C에서 30초 및 72°C에서 90초의 30사이클 후, 72°C에서 10분간 최종 연장. 약 350 bp의 길이를 갖는 단편을 1.5%아가로스 겔에 로딩하여 전기영동한 후， QIAEX II 겔 추출 키트 (QIAGEN, Valencia, CA)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR산물을 0D 260 nm에서 판독하여 정량하였다 (1 0D단위 = 50 ug/mL).
<2-4> 2차 PCR
2차 PCR에서, 1차 VL 산물을 오버랩 연장 PCR에 의해 1차 VH 산물과 무작위로 연결시켰다 (표 2). 긴 링커 단쇄 단편에 대하여 적어도 10회의 반응을 수행하였다. 각 반응에서 , 100 ng의 정제된 경쇄 산물 및 중쇄 산물을 60 pm이의 각 프라이머， 10 j L의 10X 반웅 완층액, 8 iiL의 2.5 ιτιΜ dNTP (Pr omega ) , 0.5 IiL의 Taq DNA 중합효소， 및 물과 흔합하여 최종 부피 100 로 조정하였다. 하기 조건 하에서 PCR을 수행하였다: 94°C에서 15초， 56°C에서 30초 및 72°C에서 2분의 20사이클 후， 72°C에서 10분간 최종 연장. 약 700 bp크기의 단편을 1.5% 아가로스 겔에 로딩하여 전기영동한 후， QIAEX II 겔 추출 키트 (QIAGEN, Valencia, CA)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 0D 260 nm에서 판독하여 정량하였다 (10D단위 = 50 ug/mL).
<2-5>정제된 오버랩 연장산물 및 백터 DNA의 제한효소 처리
PCR 산물 및 pComb3x 백터 (The Scripps Research Institute)를 클로닝을 위해 Sfi\ 제한 효소로 처리하였다. 10 의 정제된 오버랩 PCR 산물을 360 유닛의 Sfil{\xg DNA당 16유닛， Roche Molecular Systems), 20 L의 10 x 반웅 완충액 M, 및 물과 흔합하여 최종 부피를 200 iiL로 조정하였다. 20 의 pComb3x 백터를 120 유닛의 5//K ug DNA 당 6 유닛 , Roche Molecular Systems), 20 iiL의 10X 반응 완충액 M, 및 물과 흔합하여 최종 부피를 200 로 조정하였다. 상기 흔합물을 50°C에서 5시간 동안 배양하였다. 약 700 bp 길이를 갖는 절단된 삽입물을 1% 아가로스 겔에서 정제하고, 약 3,400 bp의 길이를 갖는 백터 DNA 및 pComb3x 백터내에 함유되어 있는 약 1,600 bp의 길이를 갖는 단편을 0.6%아가로스 겔에서 정제하였다.
<2-6> 처리된 오버랩 PCR산물과 백터 DNA의 라이게이션 (ligation) 고효율 라이게이션 및 형질전환을 위한 백터 및 삽입물의 적합성을 평가하기 위해, 소규모 라이게이션을 수행하였다. 백터 DNA의 처리물만을 함유하는 라이게이션 반응올 5% 미만의 라이브러리 사이즈인 백그라운드 라이게이션에 대해 평가하였다. 라이게이션을 위해， 140 ng의 처리되고 정제된 백터 DNA 및 70 ng의 5//Ί-처리되고 정제된 PCR산물 또는 stuffer DNA, 4 IiL의 5X 라이게이즈 완층액， 1 L의 T4 라이게이즈 (Invitrogen), 및 물을 흔합하여 총 부피를 20 iiL로 조정하였다. 상기 라이게이션 흔합물을 실온에서 4시간 동안 배양하였다. 상기 라이게이션된 산물 1 uL를 0.2 cm 큐벳 및 유전자 진동기 (Gene pulser; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하여 2.5 kV, 25 및 200 Ω에서 전기천공법에 의해 50 의 ER2738 일렉트로컴피턴트 세포 (NEB) 내로 형질전환시켰다. 상기 세포를 3 mL의 SB 배지에 재현탁시키고， 225-250 rpm으로 교반하면서 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 형질전환체 총 수를 LB+카베니실린 플레이트 상에 1 uL, 10 l 및 100 uL를 도말하여 결정하였다. 이상적으로는， 최종 라이브러리 크기는 백터 DNA 에 대하여 적어도 108 집락 형성 단위 (cfu)가 되어야 하며， > 백그라운드 라이게이션 미만이어야 한다. <2-7> 일렉트로컴피턴트 대장균의 제조
대장균 ER2738 균주를 15 mL의 SB가 담긴 50 mL의 폴리프로필렌 튜브에서 배양하고 250 rpm으로 교반하면서 37°C에서 밤새 성장시켰다. 다음날, 2.5 mL의 배양물을 500 mL의 SB, 10 mL의 20%(w/v) 글루코스 및 5 mL의 1M MgCl2가 담긴 2 L 플라스크 내로 희석시키고, 600 nm에서의 0D가 0.8-0.9에 도달할 때까지 37°C에서 250 rpm으로 교반하였다. 이후， 배양물을 미리냉각한 500 mL 원심분리 병에 넣고, 4°C에서 20분간 3,000g에서 원심분리하였다. 상등액을 제거하고, 펠렛을 미리냉각한 30 mL의 10%(v/v) 글리세를에 재현탁시켰다. 재현탁된 펠렛을 원심분리하고， 글리세를로 3회 세척한 후 5 mL의 10% 글리세롤에 재현탁하여 -80°C에서 보관하였다.
<2-8> 헬퍼 파아지의 제조
<2-7>에서 제조된 10 의 ER2738 현탁액을 10 mL의 SB 배지에 접종하고 37°C에서 1시간 동안 250 rpm으로 교반하였다. 새롭게 제조된 플레이트로부터 얻은 단일 헬퍼 파아지 플라크를 피펫 팁을 이용하여 배양물 내로 옮겼다. 상기 감염된 10 mL 배양물을 카나마이신이 함유된 미리가열한 (37°C) SB 배지 500 mL가 담긴 2 L 엘렌마이어 플라스크로 옮겨 최종 농도를 70 yg/mL로 조정한 후, 37°C에서 밤새 250 rpm으로 교반하였다. 다음날, 배양물을 2,500g에서 15분간 원심분리하고， 상등액을 수조에서 70°C에서 20분간 배양하였다. 2,500g에서 15분간 원심분리한 후, 상등액을 새로운 50 mL 폴리프로필렌 튜브로 옮겨 4°C에서 보관하였다.
<2-9> 라이브러리 라이게이션 및 형질전환
1.4 Ug의 5//I-절단 pComb3x, 700 ng의 <2-5>에서 얻은 5/71-절단 PCR 산물， 40 의 5χ 라이게이즈 완충액， 10 iiL의 T4 DNA 라이게이즈， 및 물 (최종 부피를 200 uL로 맞춤)을 이용하여 라이브러리 라이게이션을 수행하였다. 상기 라이게이션 흔합물을 실온에서 밤새 배양한 후， -80°C에서 밤새 에탄을로 침전시켰다. 마이크로원심분리기에서 최고 속도로 4°C에서 15분간 원심분리한 후， 상등액을 제거하고, 펠렛을 1 mL의 70%(v/v) 에탄을로 세척하고 건조시켰다. 펠렛을 15 의 물에 용해시켰다. 상기 라이게이션된 라이브러리 샘폴을 300 iiL의 일렉트로컴피턴트 대장균 내로 형질전환시키고， 5 mL의 SB 배지에서 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 배양물에 100 mL의 미리가온시킨 SB 배지 및 3 LiL의 100 mg/mL 카베니실린을 첨가하였다. 50 ug/mL의 카베니실린을 함유하는 LB 배지에 상기 배양물 0.1 uL, 1 uL 및 10 uL를 도말하여 라이브러리 크기를 결정하였다. 배양물을 250 rpm으로 1시간 동안 교반하였다. 상기 배양물에 4.5 의 100 mg/mL 카베니실린을 첨가하여 1 시간 더 교반하였다. 상기 배양물에 2mL의 VCSM13 헬퍼 파아지， 183 mL의 미리가온된 SB 및 92.5 uL의 100 mg/mL 카베니실린을 첨가하여 300 rpm 및 37°C에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 배양물에 280 의 50 mg/mL의 카나마이신을 첨가하고 상기 배양물을 300 rpm 및 37°C에서 밤새 교반하였다. 다음날， 배양물을 3,000g에서 4°C에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 500 mL 원심분리병으로 옮기고， 이후 8 g의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-8000 및 6 g의 NaCl을 첨가하였다. 얼음에서 30분간 보관한 후， 상등액을 15,000g 및 4°C에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 버리고， 파아지 펠렛을 1% BSA를 함유하는 트리스 -완충 식염수 (TBS)에 재현탁시켰다.
<2-10>고정화된 항원 상에서의 라이브러리 패닝
파라마그네틱 비드 (Dynal Biotech, Lake Success , NY)를 이용하여 바이오패닝을 수행하였다. 3 의 그렘린— 1을 실온에서 20시간 동안 1X107 비드와 결합시켰다. 상기 비드를 PBS로 4회 세척하고 블로킹 완층액과 함께 실온에서 1시간동안 배양하였다. 그렘린 -1과 결합한 비드를 <2-9>에서 수득한 scFv를 디스플레이하는 파아지와 함께 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 상기 세척 단계를 1차에서는 3회에서 이후 4차에서는 10회로 증가시켰다. 결합된 파아지를 50 iiL의 0.1M글리신 /HC1 (pH2.2)를 이용하여 용출시키고, 3 yL의 2M Tris-CKpH 9.1)에 의해 중화시켰다. 이러한 파아지 -함유 상등액을 사용하여 ER2738을 감염시키고， 파아지미드를 밤새 증폭을 위해 헬퍼 파아지 VCSM13를 이용하여 레스큐 (rescue)하였다. 다음날， <2-9>에서 전술한 바와 같이 PEG-8000 및 NaCl을 첨가하여 파아지를 제조하였다. 또한ᅳ 상기 파아지로 감염된 배양물을 50 yg/mL의 카베니실린을 함유하는 LB 플레이트 상에 도말하여 투입. (input) 및 생산 (output) 파아지 역가를 결정하였다.
<2-11>파아지 ELISA에 의한 클론의 선별
추가 분석을 위해 선택된 개별 클론으로부터 scFv 결합을 확인하기 위하여， 정제된 재조합 그렘린— 1에 대하여 scFv를 디스플레이하는 파아지를 이용하여 EUSA를 수행하였다. 그템린 -1으로 코팅된 마이크로타이터 플레이트를 PBS 중의 3% BSA를 이용하여 37°C에서 1시간동안 블로킹하였다. 이후， 파아지 상등액을 PBS 중의 6¾ BSA와 동일하게 흔합하고 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 0.05% PBST로 세척한 후， 플레이트를 HRP-결합된 항ᅳ M13 항체 (1:5000 회석 , Pierce Chemical Co.)와 함께 배양하였다. 색상 반응을 위해, 2,2' -아지노 -비스 (3-에틸벤조티아졸린 -6—설폰산， ABTS) 기질 용액 (Amresco, Solon, 0H)를 사용하였다.
scFv 단편을 전장 IgG로 전환시키고 과발현시켰다. 본 발명에 따른 항체 (0-13)의 특이성을 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 결정하였다. 본 발명에 따른 항체 (0-13)의 특이성을 결정하기 위해, pcDNA3.1/myc-His-그렘린 -1으로 형질감염된 HEK293F 세포의 배양 상등액을 SDS-PAGE로 분리하였다. 블롯을 100 ng/mL의 본 발명에 따른 항체 (0-13)과 4°C에서 밤새 배양한 후， HRP—결합된 항 -인간 IgG(Fc 특이적， 1:1000 회석; Pierce Chemical Co.)과 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 블롯을 제조사의 지침에 따라 향상된 화학발광 시스템 (Pierce)을 이용하여 시각화하였다. 겔을 제조사의 지침에 따라 쿠마시 브릴리언트 블루 G_250(Sigma)를 이용하여 시각화하였다. 상기 과정을 통해 수득한 7종의 항체를 각각 R-80, R-88, 0-1， 0-13, 0-26, J-1 및 0-13(인간화) 항체로 명명하였고, 아미노산 및 염기서열을 분석하였다. 서열 분석 결과, 상기 R-80 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 증쇄가변영역을 포함하고 있었고， R-88 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역을 포함하고 있었으며， 0-1 항체는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역을 포함하고 있었고, 0-13 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역을 포함하고 있었으며， 으 26 항체는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역을 포함하고 있었고， J-1 항체는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는. 중쇄가변영역을 포함하고 있었으며, 0-13(인간화) 항체는 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역을 포함하고 있었다.
예비 실험을 통해， 상기 항체 증 가장 효과가 우수한 으 13 항체를 이후 실험에 사용하였다. 실시예 3: 그렘린 -1의 암세포와의 상호작용 분석 그렘린 -1이 암세포와 직접 상호작용하는지 살펴보기 위해， 그렘린 -1을 4종의 암세포 (A549, HeLa, A172 및 A431)와 함께 배양한 후， 유세포분석법으로 분석하였다.
구체적으로, 부착세포를 트립신으로 처리하고 인산 완충 식염수 (PBS) 중의 l%(w/v) BSA로 세척하였다. 현탁 세포를 500Xg에서 2분간 원심분리하여 회수하고 PBS 중의 l%(w/v) BSA로 세척하였다. 모든 세포를 PBS 중의 l%(w/v) BSA로 100 nM의 최종 농도의 His-tag을 갖는 그렘린ᅳ 1(R&D Systems, Minneapolis, 丽)과 함께 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 그리고 나서 세포를 PBS 중의 l%(w/v) BSA로 2회 세척하고, 5 iig/ml의 최종 농도의 FITO결합된 His 항체 (Abeam, Cambridge, UK)와 함께 어두운 곳에서 37°C에서 30분간 배양하였다. 이후， 세포를 PBS 중의 l¾(w/v) BSA로 2회 세척하고， FACSCanto II 유세포분석기 (BD Biosciences, San Jose, CA) 상에서 분석하기 전에 500 의 PBS에 재현탁시켰다.
한편， 그렘린 -1 항체 (0-13)의 중화 효능을 분석하기 위해, 세포를 His-tag을 갖는 그템린 -1 100 nM 및 PBS 중의 O/v) BSA 중의 10 μΜ의 본 발명에 따른 항체 (0-13)과 함께 37°C에서 1시간 동안 배양한 다음， FITC-결합된 His 항체 (Abeam)로 탐침시켰다.
A549 세포를 1 μΜ의 ΒΜΡ-2, ΒΜΡ-4, 또는 BMP-7 (R&D Systems, Minneapolis, MN) 및 100 nM의 그렘린 -1-Fc로 동시에 처리하고， 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 세포를 FITC-결합된 IgG-Fc 특이적 형:체 (5 ug/ml , 인비트로겐)로 탐침시켰다. 그리고 나서, 세포를 FACSCanto II 유세포분석기 상에서 분석하였다.
상기 실험결과를 도 1에 나타내었다. 상기 도에서 보는 바와 같이, 그렘린 -1은 암세포주와 직접 상호작용하였으며, 이는 그렘린 -1 항체에 의해 억제되었다. 실시예 4: 그렘린 -1과 암세포와의 상호작용에 대한 VEGFR2의 영향 그렘린 -1과 세포주의 상호작용이 그렘린 -1의 유일하게 알려진 세포 표면 수용체인 VEGFR2에 의해 매개되는지 여부를 평가하였다. <4-1>유세포분석법
그렘린 -1이 HUVEC와 결합하는지 여부를 실시예 3과 동일한 과정에 따라 유세포분석법에 의해 분석하였다. 상기 결과를 도 2A에 나타내었다. 상기 도에서 보는 바와 같이， 그렘린 -1은 HUVEC과 결합하지 않았다. HUVEC가 VEGFR2를 발현하므로, 그렘린 -1이 HUVEC와 결합하지 않는다는 것은 그렘린 -1이 VEGFR2와 무관하게 암세포에 결합한다는 것을 시사한다. <4-2> RT-PCR
A549 세포， HeLa 세포， 및 HUVEC 세포에서의 VEGFR2 mR A 및 단백질 발현을 RT-PCR 및 면역블롯 분석을 이용하여 확인하였다.
구체적으로， RT-PCR을 위해, TRizol 시약 (인비트로겐)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 A549. 세포 HeLa 세포， 및 HUVEC로부터 총 RNA를 분리하였다. 이후， 상기 RNA로부터 수퍼스크립트 (Superscript®) III 제 1-가닥 (First-Strand) 합성 시스템 (Invitrogen)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 하기 프라이머를 이용하여 2720 Thermal Cycler(Appl ied Biosys terns, Foster City, CA)에서 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR은 94°C에서 30초， 56°C에서 30초， 및 72°C에서 1분간 35사이클로 수행하였다.
(1) VEGFR-2
F: 5 ' -TGATCGGAAATGACACTGGA-3 ' (서열번호 35)
R: 5'- TGCTTCACAGAAGACCATGC-3 ' (서열번호 36)
(2) 그렘린 -1
F: 5 ' -AACAGTCGCACCATCATCAA-3 ' (서열번호 37)
R: 5'-MTTTCTTGGGCTTGCAGM-3' (서열번호 38)
(3) GAPDH
F: 5 ' -AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3 ' (서열번호 39)
R: 5 ' -AGGGGTCATTGATGGCAACA-3 ' (서열번호 40)
상기 RT-PCR 결과를 도 2B에 나타내었다. 도 2B에서 보는 바와 같이， HUVEC 세포에서는 VEGFR2이 존재하지만, A549 및 HeLa 세포에서는 VEGFR2가 검출되지 않았다. 실시예 3에서 그렘린 -1이 암세포와 상호작용하였음에도 불구하고 VEGFR2 mRNA가 검출되지 않았다는 사실은 그렘린 -1과 암세포와의 상호작용이 VEGFR2에 의해 매개되지 않는다는 것을 보여준다. <4-3>면역블롯 분석
HUVEC, A549 세포, 및 HeLa 세포를 프로테아제 억제제 칵테일 (Sigma-Aldrich, St. Louis, M0)을 함유하는 차가운 용해 완층액 [50 mM Tris-HCl (pH7.4), 150mMNaCl, 2mMEDTA, 1% Triton-X 100， 0.1% SDS, ImMPMSF]에 용해시킨 후， 문헌[1 61 ^ 31.， (2008) 13 (101713(1^"(:11111:) 27: 18-24]에 기재된 과정에 따라 웨스턴 블롯을 수행하였다. 이때, 일차 항체로서 VEGFR-2 (1:1,000 희석; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), 및 β-액틴 (1:1으 000 회석; Applied Biological Materials, Richmond, BC) 항체를 사용하였고, 이차 항체로서 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase, HRP)-결합된 항-마우스 IgG(l: 1,000 희석 ; Pierce Chemical Co. , Rockford, IL) 또는 HRP-결합된 항 -토끼 IgG(l: 1,000 희석 ; Pierce Chemical Co.)를 사용하였다. 블롯을 증강된 화학발광 시스템 (Pierce)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 시각화하였다.
상기 면역블롯 분석 실험결과를 도 2C에 나타내었다. 도 2C에서 보는 바와 같이 , HUVEC 세포와 달리 A549 및 HeLa 세포는 VEGFR2를 발현하지 않았다. 상기 결과 역시 그렘린 -1과 암세포와의 상호작용이 VEGFR2에 의해 매개되지 않는다는 것올 보여준다. ᅳ 실시예 5: 그렘린 -1과 암세포와의 상호작용에 대한 BMP의 영향 그렘린 -1은 BMP-2, BMP-4 및 BMP-7에 특이적으로 결합하여 이들의 활성을 억제하는 BMP 길항제이다. BMP는 많은 조직의 형태형성 및 항상성에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 다기능성 성장 인자이다. 또한 BMP-2, BMP-4 및 BMP-7은 유방암 및 전립선암을 포함한 다양한 암에서 흔히 과발현된다 (Singh A et al .， (2010) Cytokine Growth Factor Rev 21: 299-313； Chen D et al . , (2004) Growth Factors 22： 233-241； Bobinac Det al. , (2005) Croat Med J 46： 389-396) . BMP— 4는 BCC 세포의 증식을 감소시키며 그렘린 -1의 첨가는 BMP-4의 항 -증식 효과를 간접적으로 감소시킨다는 것이 보고되었다 (Sneddon JB et al .， (2006) Proc Natl Acad Sci U S A 103： 14842-14847). 이에， BMP가 그렘린 -1과 암세포와의 상호작용에 영향을 미치는지 살펴보았다.
<5-1> 효소 면역 분석
우선， 그렘린— 1이 BMP와 결합하는지 여부를 살펴보기 위하여， 하기와 같이 효소 면역분석을 수행하였다. 구체적으로, 마이크로타이터 플레이트 (Corning Costar Corp. , Cambridge, MA)를 100 nM의 BMP— 2， BMP-4, 또는 BMP-7(R&D Systems)로 코팅하고 PBS 중의 l )(w/v) 탈지유로 블로킹하였다. 이후， 각 웰에 그렘린— 1-Fc(10 nM) 단독 및 그렘린 -1-Fc(10 nM)와 500 nM의 본 발명에 따른 항체 (0-13)의 조합올 첨가하였다. 세척 후, 플레이트를 HRP-결합된 IgG-Fc 특이적 항체 (1:5,000 회석; Pierce Chemical Co.)와 함께 배양하였다. 그리고 나서， 문헌 [Chung J et al. , (2004) FASEB J 18： 361-363]에 따라， 2，2'-아지노 -비스 (3-에틸벤조티아졸린 -6-설폰산 (ABTS) 기질 용액 (Amresco, Solon, 0H)을 사용하여 발색 반웅 (coloring react ion)시키고， 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 상기 결과를 도 3A에 나타내었다. 도 3A에서 보는 바와 같이, 그렘린 -1은 BMP-7을 제외한 BMP-2 및 BMP-4와 상호작용하는 것으로 나타났으며， 본 발명에 따른 항체 (0-13)는 그렘린 1과 BMP-2 또는 BMP-4와의 상호작용에 아무런 영향을 미치지 않았다.
<5-2>유세포 분석
A549 세포와 그렘린 -1을 반응시키고, 여기에 10배 몰 과량의 BMP-2, BMP-4 및 BMP-7을 가한 후， 실시예 3과 동일한 방식으로 유세포분석을 수행하였다. 상기 결과를 도 3B에 나타내었다. 도 3B에서 보는 바와 같이， BMP의 존재는 그렘린 -1의 A549 세포와의 상호작용에 영향을 미치지 않았다. 이들 결과는 그렘린 1에 A549 세포와 BMP의 상호작용을 매개하는 2개의 별개의 모티프가 존재함을 암시한다 . 실시예 6: 그렘린 -1 및 이의 항체가 암세포의 분산 및 이동에 미치는 효과 분석
<6-1> 세포 분산 분석
그렘린 -1 처리시 암세포의 형태를 살펴보기 위하여， A549 세포를 크리스탈 바이을렛 염색법으로 분석하였다. 구체적으로， A549 세포를 24-웰 플레이트 (1.0X104 세포 /웰)에 도말하고, 100 nM의 His-tag을 갖는 그렘린 -1으로 3일간 처리하였다. 배지를 '제거하고 세포를 PBS로 세척한 다음, PBS 중의 4% 파라포름알데하이드로 10분간 고정시켰다. 세포를 증류수 중의 0.05% 크리스탈 바이올렛으로 30분간 염색하였다. 문헌 [Li XL et al. , (2009) Cancer Chemother Pharmacol 64： 1097-1104]에 개시된 방법에 따라， 염색 용액을 제거하고 세포를 PBS로 3회 세척하였다. Leica DFL290 카메라 (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)를 이용하여 이미지를 얻고， 이를 Leica application suite 소프트웨어 (Leica Microsystems)를 이용하여 분석하였다.
상기 촬영된 이미지를 도 4A에 나타내었다. 도 4A에서 보는 바와 같이, 그렘린 -1으로 처리된 A549 세포는 세포 형태가 섬유아세포와 비슷하였으며， 세포가 분산된 것으로 나타났다.
<6-2> E-카드헤린 발현 변화 분석
E-카드헤린 (E-cadherin)의 하향조절은 상피 중간엽 세포이행 (epithelial-mesenchymal transition, EMT)과 관련이 있으며， 암 진행시 E-카드헤린 및 EMT의 억제가 공통적으로 관찰된다 (Perl AK et al . , (1998) Nature 392： 190-193) . 이에 , 면역블롯 분석 및 면역형광염색을 통해 그렘린 _1 처리에 따른 E-카드헤린의 발현 변화를 살펴보았다.
면역블롯 분석의 경우， A549 세포 (1.0X105세포 /웰)를 60-隱 디쉬 상에 도말하고 50% 컨플루언시까지 성장시켰다. 상기 세포를 100 nM의 His-tag를 갖는 그렘린 -1으로 3일간 처리하였다. 상기 세포를 프로테아제 억제제 칵테일 (Sigma-Aldrich, St. Louis, M0)을 함유하는 차가운 용해 완충액 [50 mM Tris-HCl (pH7.4), 150mMNaCl, 2mMEDTA, l%Triton~X 100, 0.1 SDS, ImMPMSF]에 용해시킨 후， 문헌 [Lee MS etal., (2008) Hybridoma (Larchmt) 27: 18-24]에 기재된 과정에 따라 웨스턴 블롯을 수행하였다. 이때， 일차 항체로서 E-카드해린 (1:1,000 회석 ; Abeam) 및 β—액틴 (1:10, 000 회석 ; Appl ied Biological Materials, Richmond, BC) 항체를 사용하였고， 이차 항체로서 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase, HRP)—결합된 항-마우스 IgG(l:l,000 희석 ; Pierce Chemical Co. , Rockford, ID 또는 HRP-결합된 항 -토끼 IgG(l:l,000 회석 ; Pierce Chemical Co.)를 사용하였다. 상기 블롯을 증강된 화학발광 시스템 (Pierce)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 시각화하였다.
상기 결과를 도 4B에 나타내었다. 도 4B에서 보는 바와 같이， 그렘린 -1으로 처리된 A549 세포에서 E-카드헤린 (E-cadherin)의 발현이 현저히 감소하였다.
또한, 면역형광염색의 경우， A549 세포 (1.0X105 세포 /웰)를 폴리 L-라이신 (100 /ml, 시그마)으로 코팅된 유리 커버슬릿 상에 도말하고 50% 컨플루언시까지 성장시켰다. 세포를 100 nM의 His-tag을 갖는 그렘린 -1으로 3일간 처리하고， PBS로 세척한 다음， PBS 중의 4% 파라포름알데하이드로 상온에서 30분간 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS 중의 0.2% 트리톤 X-IOO(PBST)로 상온에서 10분간 투과시킨 다음， PBST 중의 1¾ 젤라틴으로 상온에서 블로킹하였다. E-카드헤린 항체 (Abeam) 이후에 알렉사 (Alexa) 488-결합된 이차 항체 (인비트로겐)를 이용하여 면역형광 염색을 수행하였다. 핵은 DAPI(1:1,000 희석; Invitrogen)로 염색하였고， 액틴 팔라멘트는 로다민—팔로이딘 (rhodamine-phalloidin; 1：1,000 희석; Invitrogen)을 이용하여 염색하였다. 커버 슬릿을 색바램-방지제 (anti-fading agent)를 갖는 수용성 마운팅 배지 (aqueous mounting medium)올 이용하여 유리 슬라이드 상에 을렸다. 이후, LSM 5 PASCAL 레이저 스캐닝 현미경 (Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 영상을 얻고 이를 LSM 5 PASCAL 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
상기 결과를 도 4C에 나타내었다. 도 4C：에서 보는 바와 같이, 그렘린—1으로 처리된 A549 세포에서 E-카드헤린 (E-cadherin)의 발현이 현저히 감소하였다.
<6-3>세포 이동 분석
세포의 이동 여부를 확인하기 위해， 하기와 같이 세포이동분석을 수행하였다. 구체적으로， 세포를 웰당 1.0 105 세포의 밀도로 24-웰 플레이트에 도말하였다. 피펫 팁으로 스크래칭하여 상처를 생성하였다. 탈착된 세포를 제거하기 위해 배지로 세척한 후， 상기 배양물에 100 nM의 His-tag올 갖는 그렘린 -1을 24시간 동안 첨가하였다. 곧바로 그리고 24시간 후 Leica DFL290 카메라 (Leica Microsystems)를 이용하여 이미지를 분석하였다. 스크래치에 의해 형성된 면적을 통해 세포가 이동한 거리를 24시간째에 상처 폭을 측정하고 개시 시점의 상처 폭으로부터 이를 뺌으로써 결정하였다. 그리고 나서 상기 얻어진 값을 종래 기술된 대로 처리되지 않은 세포의 이동 거리를 100%로 설정하여， % 이동으로써 표현하였다.
본 발명에 따른 항체 (0-13)의 중화효능을 결정하기 위해， 상처난 세포를 His-tag을 갖는 그렘린 -1 단독 또는 10 uM의 본 발명에 따른 항체 (0-13) (또는 10 yM 대조군 항체)와 함께 24시간 동안 배양하였다. 전술한 대로 거리를 결정하였다.
동일한 프로토콜을 이용하여, 공 -형질감염된 A549 세포 및 그렘린ᅳ 1 형질감염된 A549 세포를 도말하고 상처를 내었다. 공 -A549 세포는 아무런 처리 없이 배양한 반면， 그렘린 -1-A549 세포는 10 μΜ의 본 발명에 따른 항체 (0-13) 또는 대조군 항체의 존재하에 24시간 동안 배양하였다. 전술한 대로 거리를 결정하였다. 결과는 3번의 독립적인 실험의 대표값이다.
상기 측정 결과를 도 4D에 나타내었다. 도 4D에서 보는 바와 같이， 그램린 -1으로 처리한 경우 A549 세포의 이동이 현저하게 증가하였으며， 이는 중화 항체의 첨가시 완전히 사라졌다.
상기 결과들은 그렘린 -1이 암세포의 분산 및 이동을 유도하며， 이를 그렘린 -1 항체를 사용하여 억제시킬 수 있음을 보여준다. 실시예 7: 그렘린 -1으로 형질감염된 A6549 세포의 특성 규명
<7-1> 그렘린 1 mRNA 및 단백질 발현량 측정
실시예 <1-2〉에서 제조된 '그렘린 -1-A549' 세포주 및
'공 0nock)-A549' 세포주에 대하여， 그렘린 -1 전사체 및 단백질의 수치 변화를 전술한 RT-PCR 및 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다.
상기. 실험 결과를 도 5A에 나타내었다. 도 5A에서 보는 바와 같이， 공 (mock)-A549 세포주에서는 그렘린 -1 mRNA 및 단백질이 발현되지 않은 반면， 그렘린 -1-A549 세포주에서는 그 수치가 급격히 증가하였다.
<7-2> E-카드헤린 발현량 측정
또한, 하기와 같이 면역블롯 분석 방법에 따라 E-카드헤린의 발현량을 측정하였다. 구체적으로, 그렘린 -1-A549 세포 및 공 -A549 세포 (1.0 x 105 세포 /웰)를 60-mm 디쉬 상에 도말하여 50% 컨플루언시까지 성장시켰다. 공 -A549 세포를 처리없이 배양하고， 그렘린 -1-A549 세포를 10 μΜ의 본 발명에 따른 항체 (0-13) 또는 대조군 항체 (Palivizumab, Synagis, Abbott Laborator ies , Abbot t Park, IL)의 존재 하에 24시간동안 배양하였다. 세포를 용해시키고， 실시예 6에 기재된 면역블롯 분석방법에 따라 분석하였다.
상기 결과를 도 5B에 나타내었다. 도 5B에서 보는 바와 같이， E-카드헤린 발현은 공 -A549 세포와 비교하여 그렘린 -1-A549 세포에서 감소하였으며， 중화 항체를 첨가한 경우 약간 증가하였다. <7-3>세포 침윤 분석
ECM 코팅된 안쪽 챔버 (Chemicon, Temecula, CA)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 세포 침윤 분석을 수행하였다. 공 -A549 세포 및 그렘린 -1-A549 세포 (3.0X105 세포 /웰)를 300 iiL의 무혈청 배지에 현탁시켰다. 플레이트의 바닥 웰에 10% FBS를 함유하는 완전 배지 (500 yL)를 첨가하였다. 세포를 48 시간 동안 배양하였다. 비 -이동 세포를 없애고， PBS로 세척하였다. 막을 PBS 중의 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고 크리스탈 바이올렛 염색 용액 (Chemicon)으로 염색하였다. Leica DFL290 카메라 (Leica Microsystems)를 이용하여 이미지를 얻고 이를 Leica application suite 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 이동된 세포를 웰당 4개의 별도의 필드에서 계수하였다. 그리고 나서， 얻어진 값을 공 -A549 세포의 세포수를 100%로 설정하여 > 침윤으로써 표현하였다. .
상기 결과를 도 5C에 나타내었다. 도 5C에서 보는 바와 같이， 공— A549 세포와 비교하여 그렘린 -1-A549가 훨씬 많이 이동하였다.
<7-4>세포 이동 분석
실시예 6에 기재된 방법대로， 세포 이동 분석을 수행하였다. 공 -A549 세포 및 그렘린 -1-A549 세포를 도말하고 상처를 내었다. 공 -A549 세포는 아무런 처리 없이 배양하고， 그렘린 -1-A549 세포는 10 μΜ의 본 발명에 따른 항체 (0-13) 또는 대조군 항체의 존재 하에 24시간 동안 배양하였다. 이후， 전술한 대로 거리를 결정하였다.
상기 측정 결과를 도 5D에 나타내었다. 상기 도 5D에서 보는 바와 같이， 그렘린 -1-A549 세포는 공 -Α549 세포와 비교하여 증가된 이동을 나타내었고， 이러한 증가된 이동은 본 발명에 따른 항체 (0-13)의 첨가시 현저히 억제되었다.
<7-5> 세포 증식 분석 그렘린 -1이 세포 성장에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해, 세포 증식 분석을 수행하였다. 상기 분석은 CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Pr omega, Madison, WI)를 이용하여 10% FBS가 첨가된 RPMI-1640 배지에서 96-웰 플레이트에서 수행하였다. 구체적으로, 공 -A549 세포 및 그렘린 -1-A549 세포를 웰 당 1,000 세포의 밀도로 도말하였다. 24시간 후， 세포를 무혈청 배지로 2회 세척하고 3 μΜ의 본 발명에 따른 항체 (0-13)가 함유되거나 함유되지 않은 완전 배지 100 uL에서 배양하였다. 세포 증식을 492 nm필터를 갖는 96 웰 플레이트에 대해 Labsystems Mult iskan Ascent Photometric plate reader (Thermo Labsystems, Franklin, MA)를 이용하여 결정하였다. 실험은 3회 반복하였다.
상기 측정 결과를 도 5E에 나타내었다. 상기 도 5E에서 보는 바와 같이， 그렘린 -1-A549 세포는 공 -A549 세포와 비교하여 더 높은 성장 속도를 나타내었으며， 상기 증가된 성장 속도는 본 발명에 따른 항체 (0-13)의 첨가에 의해 억제되었다.
<7-6>종양 성장 분석
종양형성에 대한 그렘린 -1의 효과를 평가하기 위해， 하기와 같이 그렘린 -1-A549 세포 또는 공 -A549 세포를 누드 마우스 내로 피하로 주사한 후， 종양 부피를 측정하였다.
모든 동물 실험은 실험동물 자원 서울대 협회 및 사용 위원회 (Permit number： SNU-11-0207)의 승인을 받았다. 그렘린 -1-A549 세포 및 공 -A549 세포 (1.0X106 세포 /마우스)를 4 내지 6주령의 암컷 무흉선 누드 마우스 (각 처리군 당 7마리)의 오른쪽 옆구리에 피하내로 주사하였다. 종양 형성 및 크기를 종양의 길이 및 폭을 캘리퍼스로 측정하여 매주 평가한 후， 하기 식을 이용하여 종양 부피를 계산하였다 (Tomayko丽 et al .， (1989) Cancer Chemother Pharmacol 24： 148-154)：
종양 부피 = (길이 X폭 X높이 ) /2 상기 측정 결과를 도 5F에 나타내었다. 그렘린 -1-A549 세포를 주사한 마우스에서의 종양 부피는 공 -A549 세포를 주사한 마우스보다 더 급격하게 증가되었으며， 주사 후 14주에 대략 500 mm3의 종양 크기 차이를 나타내었다. 이 결과는 그렘린 -1의 발현 증가가 종양형성에 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다. 실시예 8: 그렘린 -1항체를 이용한 암 진단 면역조직화학 염색법을 이용하여 정상 조직 및 암 조직 (피부, 유방, 림프절， 폐， 간, 식도， 위, 결장， 직장， 신장, 방광, 전립선， 고환, 자궁경, 자궁내막 및 갑상선 암 조직)을 본 발명에 따른 항체 (0-13)와 반웅시켜 그렘린 -1의 발현량올 비교하였다.
구체적으로, 본 발명에 따른 항체 (0-13) (2 mg/ml) 0.5 ml을 FITC 시약과 흔합하여 제조사의 지침에 따라 항체를 FITC로 라벨링하였다 (Pierce FITC antibody labeling kit, 53027). 정상 조직 및 암 조직을 고정시킨 조직 배열 슬라이드 (Tissue array slide; superbiochip BC8)에 대해 제조사의 지침에 따라 파라핀 제거 작업을 수행하였다. 상기 슬라이드를 항원 복구액 (antigen retrieval solution; TE pH 9.0)이 담겨있는 유리병 (glass jar)에 넣은 후, 압력 쿠커 (pressure cooker)에서 30분 동안 가열하였다. 슬라이드를 꺼내 60~65°C로 식히고 증류수로 세척하고， 차가운 95% 에탄올에 10분간 담궈둔 다음， 흐르는 물로 10분간 세척하였다. 이후， 제조사의 지침에 따라 Thermo Ultra-vision LP detection system(Therao)을 이용하여 조직 슬라이드에 상기 FITC로 라벨링된 항체를 반웅시켰다. 상기 항체는 1:75로 사용하였고， 항 -FITC 마우스 IgG(LS bio)는 1:200으로 사용하였다. 이후， HRP-결합된 중합체 (Labvision)를 15분간 처리한 후， DAB 용액을 1분간 처리하였다. 메이어 헤마록실린 용액 (Mayer' s hematoxylin solution)으로 반대염색한 다음， 현미경으로 4x, 200x, 400x순서로 관찰하였다. 상기 실험에서 IgGkappa항체를 대조군으로 사용하였다. 상기 실험결과를 도 6A 내지 61에 나타내었다. 상기 도 6에서 보는 바와 같이， 본 발명에 따른 항체는 정상 조직과 비교하여 피부, 유방， 림프절， 폐， 간, 식도， 위， 결장， 직장， 신장， 방광， 전립선, 고환， 자궁경， 자궁내막 및 갑상선 암 조직에서 강한 반웅성을 나타내었다. 이는 다양한 암 조직에서 그렘린 -1이 분포하고 있으며 과발현됨을 보여준다. 따라서, 본 발명에 따른 그렘린 -1에 대한 항체를 이용하여 암 또는 면역질환을 진단할 수 있을 것으로 예상된다.

Claims

허청구범위: 청구항 1. 그렘린 -1에 대한 항체 . 청구항 2. 제 1항에 있어서， 골형성 단백질 (BMP) 또는 혈관내피성장인자 수용체 -2(VEGFR2)에 비의존적인 방식으로 그렘린 -1을 억제함으로써 암에 대해 치료 효과를 갖는， 그렘린 -1에 대한 항체. 청구항 3. 제 1항에 있어서， 상기 항체가 면역 항체， 키메라 항체， 인간 항체 및 인간화 항체로 아루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는， 그렘린 -1에 대한 항체 . 청구항 4. 제 1항에 있어서, 상기 항체가 경쇄불변영역， 중쇄불변영역， 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역을 포함하고, 상기 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역이 각각 하기의 아미노산 서열올 갖는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 그렘린 -1에 대한 항체 :
(1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역;
(2) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 4의 아미노산 서열올 갖는 중쇄가변영역;
(3) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역;
(4) 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역;
(5) 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역;
(6) 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역; 및
(7) 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역. 청구항 5. 제 4항에 있어서, 상기 항체의 경쇄불변영역 및 중쇄불변영역이 인간 또는 토끼의 것인 것을 특징으로 하는， 그렘린 -1에 대한 항체 . 청구항 6. 제 1항에 있어서， 상기 항체가 그렘린 -1이 암세포에 직접 결합하는 것을 억제하는 것을 특징으로 하는， 그렘린 -1에 대한 항체. 청구항 7. 게 1항에 있어서, 상기 항체가 그렘린 -1에 의존하는 세포 이동성 (cell migration), 세포 침윤성 (Cell invasion) 및 세포 증식 (Cell prol i ferat ion)을 억제하는 것을 특징으로 하는 항체. 청구항 8. 계 1항에 있어서, 상기 항체가 그렘린— 1에 의존하는 E-카드헤린 (E-cadherin)의 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 항체. 청구항 9. 제 1항의 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. 청구항 10. 계 9항에 있어서， 상기 암이 전립선암, 췌장암， 폐암， 비소세포 폐암， 위암, 간암， 신장암， 난소암, 대장암, 직장암， 유방암, 갑상선암, 피부암， 골암， 기저세포암， 편평세포암， 비인두암， 방광암， 자궁암， 피부암， 식도암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는， 약학적 조성물. 청구항 11. 제 9항에 있어서, 상기 면역질환이 류머티스성 관절염 (rheumatoid arthritis) , 전신성 경피증 (Progressive systemic sclerosis Scleroderma) , 전신 홍반성 낭창 (lupus), 아토피 피부염， 원형탈모증 (alopecia areata), 건선 (乾薪), 천포창， 천식， 아프타구내염， 만성 갑상선염, 후천성 재생불량성 빈혈， 일차성 간경변， 궤양성 대장염， 베체트병 (Behcet' s disease), 크론병， 규소 폐증, 석면 폐증， IgA 신장질환, 연쇄상구균감염후 사구체신염 (PSGN 쇼그렌 증후군 (Sjogren Syndrome) , 길리안-바레 증早군 (Gui 1 ian-Barre syndrome) , 피부근염 (dermatomyositis), 다발성 근염 (polymyosit is) , 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 자가면역성 용혈성 빈혈 (Autoimmune hemolytic anemia), 자가면역성 뇌척수염， 중증 근무력증 (Myasthenia gravis), 그레이브병 (Grave' s disease), 결절성 다발성 동맥염 (Polyarteritis nodosa) , 강직성 척추염 (Ankylosing spondylitis) , 섬유조직염 (Fibromyalgia syndrome) 및 측두동맥염 (Temporal arteritis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는， 약학적 조성물. 청구항 12. 제 1항의 항체 또는 제 9항의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는， 암 또는 면역질환의 치료 방법. ■ 청구항 13. 제 12항에 있어서， 상기 항체가 골형성 단백질 (BMP) 또는 혈관내피성장인자 수용체 _2(VEGFR2)에 비의존적인 방식으로 그렘린 -1을 억제함으로써 암을 치료하는 것을 특징으로 하는, 암 또는 면역질환의 치료 방법. 청구항 14. 제 12항에 있어서， 상기 암이 전립선암, 췌장암, 폐암， 비소세포 폐암， 위암 간암， 신장암， 난소암， 대장암， 직장암, 유방암， 갑상선암, 피부암, 골암， 기저세포암， 편평세포암， 비인두암， 방광암， 자궁암， 피부암， 식도암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는， 암 또는 면역질환의 치료 방법 청구항 15. 제 12항에 있어서, 상기 면역질환이 류머티스성 관절염 (rheumatoid arthritis) , 전신성 경피증 (Progressive systemic sclerosis , Scleroderma) , 전신 홍반성 낭창 (lupus), 아토피 피부염, 원형탈모증 (alopecia areata), 건선 (乾擦)， 천포창， 천식， 아프타구내염, 만성 갑상선염， 후천성 재생블량성 빈혈， 일차성 간경변， 궤양성 대장염， 베체트병 (Behcet' s disease), 크론병， 규소 폐중， 석면 폐증， IgA 신장질환， 연쇄상구균감염후 사구체신염 (PSGN), 쇼그렌 증후군 (Sjogren Syndrome), 길리안 -바레 증후군 (Gui lian-Barre syndrome), 피부근염 (demiatomyositis), 다발성 근염 (polymyosit is)， 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 자가면역성 용혈성 빈혈 (Autoimmune hemolytic anemia), 자가면역성 뇌척수염, 중증 근무력증 (Myasthenia gravis), 그레이브병 (Grave' s disease), 결절성 다발성 동맥염 (Polyarteritis nodosa), 강직성 척추염 (Ankylosing spondylitis), 섬유'조직염 (Fibromyalgia syndrome) 및 측두동맥염 (Temporal arteritis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것올 특징으로 하는， 암 또는 면역질환의 치료 방법. 청구항 16. 제 1항의 항체를 포함하는 암 또는 면역질환 진단용 키트.
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