WO2012150689A1 - 顕微鏡、及び、顕微鏡を用いた顕微授精方法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a microscope and a microinsemination method, and more particularly to a microscope suitable for microinsemination and a microinsemination method using the microscope.
- Microinsemination in the field of advanced reproductive medicine is known as one use of the microscope.
- Microinsemination is a method of fertilizing sperm and ovum under a microscope.
- sperm injection is performed by inserting a micropipette containing sperm into an egg fixed with a holding pipette and directly injecting the sperm into the egg.
- ICSI Intracytoplasmic plasmsperm injection
- relief contrast observation also referred to as modulation contrast observation, hereinafter referred to as RC observation
- a microscope used for RC observation is disclosed in Patent Document 1, for example.
- FIG. 15 is a diagram for explaining a configuration of a microscope according to a conventional technique used for RC observation.
- FIG. 15A shows the overall configuration of a microscope used for RC observation.
- FIG. 15B is a view of the aperture plate included in the condenser lens of the microscope as seen from the optical axis direction.
- FIG. 15C is a diagram of the modulator included in the objective lens of the microscope viewed from the optical axis direction.
- a microscope 100 illustrated in FIG. 15 includes a polarizing plate 101 that rotates around the optical axis, a condenser lens 110, an objective lens 111 that faces the condenser lens 110 with the sample 106 interposed therebetween, and an eyepiece lens 109.
- the condenser lens 110 includes an aperture plate 103 in which an aperture 102 is formed at a position shifted from the optical axis, a polarizing plate 104 that covers a part of the aperture 102, and a lens 105.
- the objective lens 111 and the lens 107 have three regions having different transmittances (a region 108a having a transmittance of 100%, a region 108b having a transmittance of about 25%, and a region 108c having a transmittance of 0%).
- Modulator 108 is disposed at the pupil position of the objective lens 111, and the modulator 108 and the aperture plate 103 have an optically conjugate relationship with each other.
- the modulator 108 may be at a position optically conjugate with the pupil position of the objective lens 111.
- the modulator 108 is disposed within the objective lens 111, but may be disposed at a position optically conjugate with the pupil position of the objective lens outside the objective lens 111.
- RC observation an egg can be observed in three dimensions by the effect of oblique illumination by the opening 102 and the modulation effect by the modulator 108 on the light that has passed through the opening 102. For this reason, RC observation is suitable for ICSI and has been widely used in the field of microinsemination.
- DIC observation is suitable for observing small sperm as compared to an egg because an object can be observed at a higher magnification than RC observation in which a high illumination numerical aperture cannot be obtained. For this reason, it is used when selecting high quality sperm from the shape.
- the PO observation is suitable for observing an ovum spindle having birefringence. For this reason, it is used when checking the position of the spindle in order to prevent the spindle from being damaged accidentally when sperm is injected into the ovum.
- the ovum collected for microinsemination is usually managed in an optimal temperature environment for the ovum by an incubator or the like.
- the egg is removed from the incubator and placed on the microscope. Since the environment on the microscope is not necessarily the optimum environment for the ovum, it is necessary to complete the work performed with the microscope in a short time in order to suppress the stress applied to the ovum. Therefore, there is a need for a microscope configuration that can switch a plurality of observation methods used in microinsemination in a short time with a few operations.
- the present invention aims to provide a technique of a microscope suitable for microinsemination.
- One aspect of the present invention is disposed between a light source, a condenser lens that irradiates a specimen with light from the light source, an objective lens that faces the condenser lens across the specimen, and the light source and the condenser lens.
- a compensator disposed between the first polarizing plate and the second polarizing plate, and depending on the observation method, between the plurality of optical elements disposed inside the capacitor turret
- a microscope is provided in which an optical element arranged on an optical path is switched by rotation of the condenser turret.
- Another aspect of the present invention is a microscope that selectively performs relief contrast observation, differential interference observation, and polarization observation, and includes a light source, a condenser lens that irradiates the sample with light from the light source, and the sample interposed therebetween.
- An objective lens facing the condenser lens a first polarizing plate disposed between the light source and the condenser lens, a condenser turret disposed between the first polarizing plate and the condenser lens, A compensator disposed between the first polarizing plate and the condenser turret, the condenser turret including a DIC prism and an optical element for relief contrast, and depending on the observation method, the condenser turret
- the optical elements arranged on the optical path inside the switch are switched by the rotation of the condenser turret, By changing the retardation of Penseta, it provides a microscope to adjust the contrast of the image of the specimen.
- FIG. 1 is a diagram for explaining a configuration of a microscope according to Example 1.
- FIG. It is a figure for demonstrating the adjustment method of the contrast with the microscope which concerns on the prior art used for RC observation. It is a figure for demonstrating the adjustment method of the contrast with the microscope which concerns on the prior art used for DIC observation. It is a figure for demonstrating the adjustment method of the contrast with the microscope which concerns on the prior art used for PO observation.
- 10 is a diagram for explaining a configuration of a microscope according to Embodiment 2.
- FIG. 10 is a diagram for explaining a configuration of a microscope according to Embodiment 3.
- FIG. 6 is a diagram for explaining a configuration of a microscope according to Embodiment 4.
- FIG. 10 is a diagram for explaining the arrangement of optical elements included in a microscope according to Example 4.
- FIG. 6 is a diagram for explaining a configuration of a condenser turret of a microscope according to Example 4.
- FIG. 10 is a diagram for explaining a configuration of a hand switch unit of a microscope according to Embodiment 4.
- FIG. 10 is a setting table of a microscope according to Example 4.
- 10 is a flowchart illustrating a procedure for storing and restoring contrast settings of a microscope according to a fourth embodiment.
- 12 is a flowchart showing a procedure of microinsemination using a microscope according to Example 4;
- FIG. 10 is a diagram for explaining image processing by a microscope according to a fourth embodiment. It is a figure for demonstrating the structure of the microscope which concerns on the prior art used for RC observation.
- FIG. 1 is a diagram for explaining a configuration of a microscope according to the present embodiment.
- 2, 3, and 4 are diagrams for explaining a contrast adjustment method in a microscope according to the related art used for RC observation, DIC observation, and PO observation, respectively.
- FIGS. 2 to 4 an outline of a conventional microscope configuration and contrast adjustment method used for each of RC observation, DIC observation, and PO observation will be described. To do.
- the microscope 30 As illustrated in FIG. 2, the microscope 30 according to the related art used for RC observation includes a polarizing plate 31, a condenser turret 32, and a condenser lens 33 that are rotatably arranged in order from the light source side on the illumination optical path. And. Further, the microscope 30 includes, in order from the sample 37 side on the observation optical path, the objective lens 38 and three regions having different transmittances (a region 39a having a transmittance of 100%, a region 39b having a transmittance of about 25%, And a modulator 39 having a region 39c) having a transmittance of 0%.
- an aperture plate 34 in which an aperture 35 is formed at a position shifted from the optical axis AX, and a polarizing plate 36 covering a part of the aperture 35 are disposed in the illumination optical path.
- the modulator 39 is disposed at the pupil position of the objective lens 38 and has an optically conjugate relationship with the aperture plate 34 disposed at the pupil position of the condenser lens 33.
- the polarizing plate 36 in the turret is fixed, while the polarizing plate 31 is rotatably arranged. For this reason, the polarization direction of the illumination light (linearly polarized light) that has passed through the polarizing plate 31 can be changed by rotating the polarizing plate 31.
- the polarization direction of the illumination light that has passed through the polarizing plate 31 changes, the amount of illumination light that passes through the polarizing plate 36 also changes.
- the contrast of the image of the specimen 37 is adjusted. That is, in the microscope 30 according to the related art used for RC observation, the operation unit for contrast adjustment is the operation unit of the polarizing plate 31, and the contrast is adjusted by the rotation of the polarizing plate 31.
- a microscope 40 As illustrated in FIG. 3, a microscope 40 according to the related art used for DIC observation includes a polarizing plate 41 functioning as a polarizer in order from the light source side on the illumination optical path, and a condenser turret 42 including a DIC prism 44 inside. And a condenser lens 43.
- the microscope 40 includes an objective lens 46, a DIC prism 47, and a polarizing plate 48 functioning as an analyzer in this order from the sample 45 side on the observation optical path.
- the polarizing plate 41 and the polarizing plate 48 are arranged so that the polarization directions are orthogonal to each other, that is, in crossed Nicols.
- Examples of the DIC prism include a Nomarski prism.
- the microscope 40 visualizes a phase difference caused by two orthogonally polarized lights separated by the DIC prism 44 and synthesized by the DIC prism 47 through slightly different positions of the specimen 45 by interference action. .
- the optical path length difference generated between the DIC prisms can be changed by moving the DIC prism 47 in a plane orthogonal to the optical axis.
- the phase difference between the two polarized lights also changes.
- the contrast of the image of the sample 45 is adjusted. That is, in the microscope 40 according to the related art used for DIC observation, the operation unit for contrast adjustment is the operation unit of the DIC prism 47, and the contrast is adjusted by the movement of the DIC prism 47.
- a microscope 50 As illustrated in FIG. 4, a microscope 50 according to the related art used for PO observation includes a polarizing plate 51, a condenser turret 52, a condenser lens 53, and a polarizing plate 51 functioning as a polarizer in order from the light source side on the illumination optical path. Is included. Further, the microscope 50 includes an objective lens 57, a compensator 58, and a polarizing plate 59 functioning as an analyzer in order from the sample 56 side on the observation optical path. Inside the capacitor turret 52, an aperture plate 54 in which an aperture 55 is formed is disposed. In addition, the polarizing plate 51 and the polarizing plate 59 are arranged so that the polarization directions are orthogonal to each other, that is, in crossed Nicols.
- the microscope 50 visualizes the phase difference between two orthogonally polarized lights caused by the birefringence of the specimen 56 by the interference action.
- the retardation of the compensator 58 is changed to change the phase difference between the two polarized lights.
- the contrast of the image of the sample 56 is adjusted. That is, in the microscope 50 according to the related art used for PO observation, the operation unit for contrast adjustment is the operation unit of the compensator 58, and the contrast is adjusted by changing the retardation of the compensator 58.
- FIG. 4 shows an example in which the aperture plate 54 is disposed in the capacitor turret 52, the aperture plate 54 may not exist if the aperture 55 is formed in the capacitor turret 52.
- the configurations of the microscopes according to the related art used for each of RC observation, DIC observation, and PO observation are different.
- the difference between the configuration of the microscope used for RC observation and the configuration of the microscope used for other observation methods (DIC observation, PO observation) is particularly large. For this reason, when switching the observation method, it is necessary to attach and detach many optical elements (insertion into and removal from the optical path), and it is difficult to switch the observation method in a short time.
- the microscope according to the present embodiment is an inverted microscope that can be selectively performed by appropriately switching between RC observation, DIC observation, and PO observation, and is a microscope that is suitable for microinsemination.
- the microscope 1 includes a light source 2, a polarizing plate 3 (first polarizing plate) functioning as a polarizer, and a plurality of optical elements inside in order from the light source side on the illumination optical path.
- the condenser turret 5 arranged and the condenser lens 6 that irradiates the specimen 13 with the light from the light source 2 are included.
- the microscope 1 is inserted into and removed from the observation optical path with respect to the observation optical path in order from the specimen side, the objective lens 14 facing the condenser lens 6 with the specimen 13 interposed therebetween, the revolver 21 with the objective lens 14 mounted thereon.
- the DIC prism 17 (second DIC prism) and the polarizing plate 18 (second polarizing plate) functioning as an analyzer are included.
- the microscope 1 includes a drive control means 19 that controls the driving of the electric parts of the microscope 1 and a memory 20 that is a storage means for storing settings of the microscope 1 for each observation method.
- the drive control means 19 is electrically connected to the memory 20 and can read the setting information of the microscope stored in the memory 20.
- an aperture plate 7 (first aperture plate) having a polarizing plate 9 in a part of an aperture 8 that is an optical element for RC observation, and a DIC prism 10 (an optical element for DIC observation).
- a first DIC prism) and a compensator 4 which is an optical element for PO observation.
- the optical element arranged on the optical path in the condenser turret 5 is switched by the rotation of the condenser turret 5 according to the observation method.
- the aperture plate 7 having the polarizing plate 9 is disposed on the optical path when performing RC observation
- the DIC prism 10 is disposed when performing DIC observation
- the compensator 4 is disposed when performing PO observation.
- the aperture plate 7 is arranged at the pupil position of the condenser lens 6 on the illumination optical path by the rotation of the condenser turret 5.
- the aperture 8 formed in the aperture plate 7 is formed at a position shifted from the center of the aperture plate 7 in order to realize oblique illumination, and the optical axis AX when the aperture plate 7 is arranged on the illumination optical path. It is arranged at a position deviated from.
- the compensator 4 is an optical element for measuring the phase difference due to the anisotropy of the specimen, that is, the retardation, and has a structure for varying the retardation.
- compensators such as those using liquid crystals and wave plates.
- a berech compensator a cenalmon type compensator, a brace scaler compensator, a quartz wedge compensator, a liquid crystal modulation element, and the like.
- the compensator 4 the liquid crystal modulation element, senalmon-type compensator, brace and the like can be obtained.
- a cola compensator is preferred.
- the retardation of the compensator 4 can be changed by electrically controlling the liquid crystal molecules.
- a Senalmon type compensator is used as the compensator 4
- the retardation of the compensator 4 can be changed by rotating the polarizing plate 3 with respect to the wave plate in the compensator 4.
- a brace scaler compensator is used as the compensator 4
- the retardation of the compensator 4 can be changed by rotating the prism in the compensator 4.
- the compensator 4 is arranged in the illumination optical path, but operates in the same manner as the compensator 58 arranged in the observation optical path.
- the revolver 21 is equipped with an objective lens 16 in addition to the objective lens 14, and these objective lenses are switched and used by the rotation of the revolver 21 according to the observation method.
- the objective lens 14 is an RC observation objective lens having a magnification suitable for observing an egg (for example, 20 times), and has three regions (100% transmittance) having different transmittances at the pupil position of the objective lens 14. And a modulator 15 having a region 15b having a transmittance of about 25% and a region 15c having a transmittance of 0%.
- the modulator 15 has an optically conjugate relationship with the aperture plate 7 disposed at the pupil position of the condenser lens 6.
- the objective lens 14 can be used for PO observation, in which an ovum spindle is the main object of observation, and approximately the same magnification is required.
- the objective lens 16 is an objective lens having a magnification suitable for sperm observation (for example, a high magnification such as 60 times or 100 times), and is used in DIC observation.
- the objective lens 16 is different from the objective lens 14 in that it does not include the modulator 15 in addition to the difference in magnification.
- the DIC prism 10 and the DIC prism 17 are paired to constitute a differential interference optical system.
- the DIC prism 10 is, for example, a Nomarski prism, and is arranged to be detachable with respect to the illumination optical path by the rotation of the condenser turret 5.
- the DIC prism 17 is, for example, a Nomarski prism, and is arranged to be detachable with respect to the observation optical path between the objective lens and the polarizing plate 18.
- the polarizing plate 18 is disposed on the image side of the objective lens 14 (revolver 21), and is fixed in a predetermined direction with respect to the polarizing plate 3 disposed between the light source 2 and the condenser lens 6. Specifically, the polarizing plate 3 and the polarizing plate 18 are arranged so that the polarization directions are orthogonal to each other, that is, in a crossed Nicols state.
- the polarizing plate 18 is an essential component in DIC observation and PO observation, but in the conventional RC observation, there is usually no polarizing plate 18.
- the vibration direction of the polarizing plate 9 in the turret is set to 45 degrees with respect to the vibration direction of the analyzer (polarizing plate 18) and the polarizer (polarizing plate 3)
- the image is obtained even if the polarizing plate 18 is present. Because it only darkens, there is no problem in observation.
- the analyzer (polarizing plate 18) is always in the optical path, thereby eliminating the trouble of insertion and removal.
- the drive control means 19 is specifically a control means for electrically rotating the polarizing plate 3, the condenser turret 5, and the revolver 21, and is a control means for electrically changing the retardation of the compensator 4.
- the drive control means 19 is also a control means for electrically inserting and removing the DIC prism 17 with respect to the observation optical path. That is, the drive control means 19 also functions as means for moving the DIC prism 17 in a plane orthogonal to the optical axis.
- the operations of the polarizing plate 3, the compensator 4, the condenser turret 5, the revolver 21, and the DIC prism 17 may be controlled by independent control means instead of the drive control means 19. In that case, it is desirable that each control means is electrically connected to the memory 20.
- the RC observation is performed by the switching operation of the optical element arranged on the optical path by the rotation of the condenser turret 5, the switching operation of the objective lens by the rotation of the revolver 21, and the insertion / removal operation of the DIC prism 17.
- PO observation and DIC observation can be arbitrarily switched.
- the objective lens switching operation is not limited to the case of switching the observation method, but is an operation that is appropriately performed according to the observation target. That is, in the microscope 1 according to the present embodiment, RC observation, PO observation, and DIC observation are arbitrarily performed only by performing two operations of rotating the condenser turret 5 and inserting / removing the DIC prism 17 in addition to the conventional operations. You can switch to
- the objective lens 14 having a magnification suitable for observing an egg is arranged in the observation optical path by the rotation of the revolver 21, and the aperture plate 7 is arranged on the illumination optical path by the rotation of the condenser turret 5.
- the DIC prism 17 is removed from the observation optical path and disposed outside the observation optical path.
- the observation method of the microscope 1 can be switched to RC observation.
- the DIC prism 17 may be disposed on the observation optical path.
- the objective lens 16 having a magnification suitable for sperm observation is arranged in the observation optical path by the rotation of the revolver 21, and the DIC prism 10 is arranged in the illumination optical path by the rotation of the condenser turret 5.
- a DIC prism 17 that forms a pair with the DIC prism 10 is inserted into the observation optical path.
- the objective lens 14 having a magnification suitable for observing an egg is arranged in the observation optical path by the rotation of the revolver 21, and the compensator 4 is arranged in the illumination optical path by the rotation of the condenser turret 5. . Further, the DIC prism 17 is removed from the observation optical path and disposed outside the observation optical path. Thereby, the observation method of the microscope 1 can be switched to PO observation.
- the operations may be performed manually, but in the microscope 1 according to the present embodiment, the operations are electrically performed under the control of the drive control means 19.
- the drive control unit 19 reads the setting of the microscope 1 corresponding to the designated observation method from the memory 20, and According to the setting, the rotation of the condenser turret 5, the rotation of the revolver 21, and the insertion / removal of the DIC prism 17 are controlled. Thereby, the observation method is switched electrically.
- the setting of the microscope 1 stored in the memory 20 includes a setting for adjusting the contrast of the image of the specimen 13 for each observation method.
- the setting of the microscope 1 corresponding to the RC observation includes a setting related to the rotation of the polarizing plate 3. Yes.
- the contrast of the image of the specimen 13 is adjusted by the movement of the DIC prism 17, so the setting of the microscope 1 corresponding to the DIC observation is a setting related to the movement of the DIC prism 17 in the plane orthogonal to the optical axis. It is included.
- the contrast of the image of the specimen 13 is adjusted by changing the retardation of the compensator 4. Therefore, the setting of the microscope 1 corresponding to the PO observation includes a setting for changing the retardation of the compensator 4. .
- the drive control means 19 may be connected to a retardation adjustment input means such as a computer.
- a retardation adjustment input means such as a computer.
- the setting relating to the change of the retardation of the compensator 4 is a setting relating to control of liquid crystal molecules if the compensator 4 is a liquid crystal modulation element, and if the compensator 4 is a brace scaler compensator, If the compensator 4 is a Senalmon type compensator, the setting is related to the rotation of the polarizing plate 3 relative to the wave plate in the compensator 4.
- the contrast adjustment by the drive control means 19 may be set so that the best contrast is obtained for each observation method. Moreover, it may be set so as to obtain the same contrast as the state observed immediately before regardless of the observation method.
- the microscope 1 in addition to the rotation of the revolver 21, a plurality of observation methods used in microinsemination are switched in a short time by a slight operation of rotating the condenser turret and inserting / removing the DIC prism. it can. Moreover, since these operations are performed electrically under the control of the drive control means 19, a plurality of observation methods can be switched reliably in a shorter time. Furthermore, since the contrast setting according to the observation method is also electrically performed under the control of the drive control means 19, the setting work by the user for each observation method can be omitted. Therefore, the microscope 1 can shorten the time required to start the work of microinsemination, and is suitable for microinsemination.
- the modulator 15 is not necessary for PO observation, the presence of the modulator 15 does not significantly affect the PO observation. Therefore, as described above, when performing the PO observation, the modulator is the same as in the RC observation.
- An objective lens 14 having 15 can be used.
- the DIC prism 17 is arranged outside the observation optical path in both RC observation and PO observation. Therefore, in the microscope 1 according to the present embodiment, the RC observation and the PO observation can be switched only by the rotation of the condenser turret 5, and the observation method can be switched in a shorter time.
- FIG. 5 is a diagram for explaining the configuration of the microscope according to the present embodiment. First, the configuration of the microscope 22 according to this embodiment illustrated in FIG. 5 will be described. 5 that are the same as those in FIG. 1 are assigned the same reference numerals and descriptions thereof are omitted.
- 5 is an inverted microscope that can be selectively performed by appropriately switching between RC observation, DIC observation, and PO observation, and is a microscope suitable for microinsemination.
- the configuration of the microscope 22 includes a point where the compensator 4 is disposed between the condenser turret 5 and the polarizing plate 3, and an aperture plate 11 in which an opening 12 is formed in the condenser turret 5 instead of the compensator 4.
- the point is different from the configuration of the microscope 1 according to the first embodiment.
- Other configurations of the microscope 22 are the same as those of the microscope 1.
- an aperture plate 7 (first aperture plate) having a polarizing plate 9 in a part of an aperture 8 that is an optical element for RC observation, and a DIC prism 10 (an optical element for DIC observation).
- a first DIC prism and an aperture plate 11 in which an aperture 12 which is an optical element for PO observation is formed.
- the optical element arranged on the optical path in the condenser turret 5 is switched by the rotation of the condenser turret 5 according to the observation method.
- the aperture plate 7 having the polarizing plate 9 when performing RC observation, the DIC prism 10 when performing DIC observation, and the aperture plate 11 having the aperture 12 when performing PO observation. Is disposed on the optical path.
- the opening 12 formed in the opening plate 11 is formed to have a sufficient size that does not block the illumination light. For this reason, when the aperture 12 of the aperture plate 11 is arranged in the illumination optical path by the rotation of the condenser turret 5, illumination with a high numerical aperture is possible. Further, the opening plate 11 may be a part of the capacitor turret 5, and in that case, the opening 12 may be formed in the capacitor turret 5 itself.
- the RC observation, the PO observation, and the DIC observation can be arbitrarily switched by inserting / removing the DIC prism 17.
- the microscope 22 according to the present embodiment is the same as the microscope 1 according to the first embodiment in that these operations are electrically performed under the control of the drive control means 19. Specifically, when the user designates an observation method via an input unit (not shown), the drive control unit 19 reads the setting of the microscope 1 corresponding to the designated observation method from the memory 20, and According to the setting, the rotation of the condenser turret 5, the rotation of the revolver 21, and the insertion / removal of the DIC prism 17 are controlled. Thereby, the observation method is switched electrically. In the microscope 22, the switching operation may be performed manually as in the microscope 1 according to the first embodiment.
- the microscope 22 according to the present embodiment is different from the microscope 1 according to the first embodiment in that the contrast of the image of the specimen 13 can be adjusted by changing the retardation of the compensator 4 regardless of the observation method. .
- a phase difference generated by passing two orthogonally polarized lights separated by the DIC prism 10 and synthesized by the DIC prism 17 through slightly different positions of the specimen 13 is visualized by an interference action.
- the phase difference between the two finally generated polarizations is changed by causing a phase difference in advance before entering the DIC prism 10 by the retardation of the compensator 4. For this reason, the contrast of the image of the specimen 13 can be adjusted by changing the retardation of the compensator 4.
- the contrast of the specimen image is adjusted by changing the retardation of the compensator.
- the compensator 4 of the microscope 22 is arranged in the illumination optical path, but operates in the same manner as the compensator 58 arranged in the observation optical path. For this reason, the contrast of the image of the specimen 13 can be adjusted by changing the retardation of the compensator 4.
- the operation unit for adjusting the contrast is unified to the compensator 4 regardless of the observation method. For this reason, the operation method is also unified, and the microscope 22 has high operability.
- the work of microinsemination needs to be performed very accurately and carefully, and the operability of the microscope is very important in order to perform such work quickly and quickly. Therefore, the microscope 22 that can adjust the contrast with the compensator 4 regardless of the observation method is suitable for microinsemination.
- contrast is used in RC observation, DIC observation, and PO observation.
- the operation sections for adjusting the operation are different, and the operation method is not unified.
- the contrast is adjusted by rotating a polarizer provided on the light source side of the condenser lens.
- DIC observation the contrast is adjusted by moving the DIC prism in a direction perpendicular to the optical axis.
- PO observation the contrast is adjusted by changing the retardation of the compensator provided between the polarizer and the analyzer.
- the microscope 22 As described above, according to the microscope 22 according to the present embodiment, the same effects as those of the microscope 1 according to the first embodiment can be obtained. That is, a plurality of observation methods used in microinsemination can be switched in a short time by a slight operation of rotating the condenser turret 5 and inserting / removing the DIC prism 17 in addition to the rotation of the revolver 21. Moreover, since these operations are performed electrically under the control of the drive control means 19, a plurality of observation methods can be switched reliably in a shorter time. Furthermore, since the contrast setting according to the observation method is also electrically performed under the control of the drive control means 19, the setting work by the user for each observation method can be omitted. Therefore, the microscope 22 can shorten the time required to start the microinsemination work, and is suitable for microinsemination.
- the contrast can be adjusted by the compensator 4 regardless of the observation method. For this reason, it is possible to reduce the burden on the user required for the contrast adjustment work with high operability. Therefore, the microscope 22 can easily adjust the contrast manually.
- the contrast may be adjusted by rotating the polarizing plate 3 in the RC observation.
- contrast may be adjusted by moving the DIC prism 17 in a direction perpendicular to the optical axis.
- the compensator 4 is located between the polarizer (polarizing plate 3) and the condenser turret 5, but may be disposed between the objective lens 14 and the analyzer (polarizing plate 18).
- FIG. 6 is a diagram for explaining the configuration of the microscope according to the present embodiment.
- the configuration of the microscope 23 according to this embodiment illustrated in FIG. 6 will be described. 6 that are the same as those in FIG. 1 or FIG. 5 are given the same reference numerals, and descriptions thereof are omitted.
- the contrast adjustment method for the microscope 23 according to the present embodiment is the same as the contrast adjustment method for the microscope 22 according to the second embodiment illustrated in FIG.
- the microscope 23 illustrated in FIG. 6 is an inverted microscope that can be selectively performed by appropriately switching between RC observation, DIC observation, and PO observation, and is a microscope suitable for microinsemination.
- the configuration of the microscope 23 on the light source side with respect to the specimen 13 of the microscope 23 is the same as that of the microscope 22 according to the second embodiment illustrated in FIG. This is different from the microscope 22 according to Example 2.
- the microscope 23 is the same as the microscope 22 according to the second embodiment in that the drive control means 19 and the memory 20 are included. However, the drive control means 19 is connected to a switching means 27 described later instead of the DIC prism 17. This is different from the microscope 22 according to the second embodiment.
- the microscope 23 has an objective lens 14a facing the condenser lens 6 across the specimen 13 in order from the specimen side on the observation optical path, a revolver 21 with the objective lens 14a and the objective lens 16 mounted thereon, and an imaging lens 24. , A mirror 25, a relay lens 26, a switching unit 27, a polarizing plate 18 (second polarizing plate) functioning as an analyzer, a relay lens 28, and an eyepiece lens 29.
- the objective lens 14a is an objective lens that does not include a modulator and has a magnification suitable for observing an egg (for example, 20 times).
- the objective lens 14a is used for RC observation and PO observation for observing an ovum, and the objective lens 16 is used for DIC observation for observing a sperm.
- the switching means 27 is means for switching and inserting the modulator 15 and the DIC prism 17 (second DIC prism) on the observation optical path according to the observation method.
- the modulator 15 is disposed on the optical path when performing RC observation
- the DIC prism 17 is disposed on the optical path when performing DIC observation
- any optical element is disposed when performing PO observation. It switches so that it may not be arranged on the optical path.
- the modulator 15 disposed on the observation optical path by the switching unit 27 is disposed at a position optically conjugate with the pupil position of the objective lens 14a.
- the imaging lens 24 forms an intermediate image by imaging the light emitted from the objective lens (the objective lens 14a or the objective lens 16).
- the relay lens 26 converts divergent light from the intermediate image position into substantially parallel light. Thereby, substantially parallel light enters the DIC prism 17 and the polarizing plate 18.
- the relay lens 26 relays the pupil of the objective lens 14a to the position where the modulator 15 is arranged when the objective lens 14a is arranged on the optical path. This forms a conjugate relationship between the aperture plate 7 arranged at the pupil position of the condenser lens 6 and the modulator 15 arranged at the pupil conjugate position of the objective lens 14a.
- the RC observation is performed by the switching operation of the optical element arranged on the optical path by the rotation of the condenser turret 5, the switching operation of the objective lens by the rotation of the revolver 21, and the switching operation by the switching means 27.
- PO observation and DIC observation can be switched arbitrarily.
- the operations may be performed manually, but in the microscope 23 according to the present embodiment, the operations are electrically performed under the control of the drive control means 19.
- the drive control unit 19 reads the setting of the microscope 23 corresponding to the designated observation method from the memory 20, and According to the setting, the rotation of the condenser turret 5, the rotation of the revolver 21, and the switching by the switching means 27 are controlled. Thereby, the observation method is switched electrically.
- the same effects as those of the microscope 22 according to the second embodiment can be obtained. That is, a plurality of observation methods used in microinsemination can be switched in a short time by a slight operation of rotating the condenser turret 5 and switching by the switching means 27 in addition to the rotation of the revolver 21. Moreover, since these operations are performed electrically under the control of the drive control means 19, a plurality of observation methods can be switched reliably in a shorter time. In addition, since the contrast setting according to the observation method is also electrically performed under the control of the drive control means 19, the setting work by the user for each observation method can be omitted.
- the microscope 23 can shorten the time required to start the work of microinsemination and is suitable for microinsemination. Further, according to the microscope 23 according to the present embodiment, the contrast can be adjusted by the compensator 4 regardless of the observation method. For this reason, it is possible to reduce the burden on the user required for the contrast adjustment work with high operability.
- the modulator 15 is disposed at the pupil conjugate position, it is not necessary to prepare an objective lens dedicated to RC observation provided with the modulator.
- the compensator 4 is disposed between the polarizing plate 3 and the capacitor turret 5, but the arrangement of the compensator 4 is not limited to between the polarizing plate 3 and the capacitor turret 5. Similar to the microscope 1 according to the first embodiment, the compensator 4 may be disposed inside the condenser turret 5.
- each observation method there is a sensor that detects which aperture (optical element) is in a predetermined position in the condenser turret.
- a method may be employed in which at least one of a revolver, a DIC slider, or a polarizer (polarizing plate) is operated to switch the observation method so that (DIC observation, RC observation, or PO observation) can be performed.
- the revolver has a sensor that detects which objective lens is in the optical path. It is also effective to switch observation methods in conjunction with each other. That is, when the revolver with a sensor is manually rotated and the objective lens corresponding to the observation method enters the optical path, the condenser turret, the DIC slider, and the polarizer operate to switch the observation method.
- FIG. 7 is a diagram for explaining the configuration of the microscope according to the present embodiment.
- FIG. 8 is a diagram for explaining the arrangement of optical elements included in the microscope according to the present embodiment.
- FIG. 9 is a diagram for explaining the configuration of the condenser turret of the microscope according to the present embodiment.
- the microscope 60 illustrated in FIGS. 7 and 8 is a microscope that can perform RC observation, PO observation, DIC observation, and bright field observation, and has a configuration that allows quick switching between RC observation and PO observation.
- microinsemination an egg cultured in an incubator in an optimal state for fertilization is taken out and fertilized under a microscope.
- the environment temperature, humidity, CO 2 concentration, etc.
- placing an ovum under a microscope for a long period of time will stress the ovum, so switching the observation method quickly, performing the work of microinsemination in a short time and returning it to the incubator will improve the success rate of microinsemination It leads to improvement.
- the microscope 60 according to the present embodiment capable of quickly switching the observation method is an optimal microscope for microinsemination.
- the microscope 60 includes a microscope main body 61 for observing a specimen 95 accommodated in a petri dish arranged on a stage 72, and a hand switch unit to which an instruction such as an observation method change is input.
- a control box 63 that performs operation control and image processing of the microscope 60 is configured by a personal computer and functions as a control unit, and a monitor 64 that displays an image of the specimen 95 acquired by the microscope 60.
- This is a microscope used for microinsemination under a microscope in which a petri dish is placed on a stage 72.
- a petri dish used for microinsemination in general, a plurality of drops of a culture solution are made, and these drops include a drop containing a sperm and a drop containing an ovum. A drop for fertilization may be made separately. The top of the drop is often covered with mineral oil to prevent bacteria from touching the air and drying out.
- the microscope 60 uses a glass bottom dish in which the bottom of the petri dish is not plastic but glass. This is because the plastic petri dish has strong birefringence, so that PO observation and DIC observation are difficult.
- the microscope main body 61 includes a lamp house 65, an illumination column 66, and a capacitor unit 67, as shown in FIG.
- the light from the lamp house 65 illuminates the sample 95 in the petri dish arranged on the stage 72 via the illumination column 66 and the condenser unit 67.
- the portion of the stage 72 where the petri dish is arranged is a heat stage 72a, and the petri dish is heated to 37 degrees by the heat stage 72a.
- the condenser unit 67 includes a polarizer 68, a compensator 69, a condenser turret 70, and a condenser lens 71 arranged in this order from the light source 65 a side.
- the condenser turret 70 as illustrated in FIG. 9, an opening 81 constituting an opening plate together with the condenser turret 70 body, a DIC prism 82, and two types of relief observation opening plates (relief observation opening plate 83). , A relief observation aperture plate 84).
- the polarizer 68 is a first polarizing plate used in combination with an analyzer 76 described later, and is arranged to be rotatable around the optical axis.
- the polarizer 68 is configured to be electrically rotated by the control of the control box 63 according to the observation method.
- the analyzer 76 is connected to the analyzer 76 so as to be in a parallel Nicols state in the bright field observation. Rotates so that it is in a crossed Nicols state.
- the image is rotated at an arbitrary rotation angle for adjusting the contrast.
- the compensator 69 has a structure for changing the retardation, and is configured to change the retardation electrically by the control of the control box 63.
- the contrast in the PO observation can be adjusted by changing the retardation of the compensator 69.
- the compensator 69 is disposed between the condenser turret 70 and the polarizer 68 to form the capacitor unit 67.
- the compensator 69 may be disposed between the polarizer 68 and the analyzer 76. 8 may be disposed between the objective lens 74 and the analyzer 76 shown in FIG.
- the condenser turret 70 includes a plurality of optical elements that are used by switching according to the observation method and magnification.
- the condenser turret 70 is configured to be rotated electrically by the control of the control box 63 according to the observation method, so that one of the optical elements is positioned on the optical axis.
- the aperture 81 constitutes an aperture plate together with the capacitor turret 70, and is used for bright field observation and PO observation. That is, the condenser turret 70 includes an aperture plate for bright field observation or PO observation.
- a 4X or 10X objective lens is used to locate a place in a petri dish or to position a needle tip of a micropipette operated by a manipulator.
- the DIC prism 82 is a first DIC prism used for 60X DIC observation, and constitutes a differential interference optical system together with a second DIC prism arranged on the image side on the objective lens side described later.
- the relief observation aperture plate (relief observation aperture plate 83, relief observation aperture plate 84) is an aperture plate used for RC observation, and a part of the aperture formed at a position eccentric from the optical axis is a polarizing plate. It is covered.
- the relief observation aperture plate 83 and the relief observation aperture plate 84 are aperture plates used in 20X RC observation and 40X RC observation, respectively, and the positions and sizes of the openings are different.
- the capacitor turret 70 is a four-hole turret as shown in FIG. Since the turret generally increases as the number of holes increases, the turret with an excessively large number of holes includes a manipulator (not shown) that three-dimensionally operates a micropipette and a holding pipette used to inject sperm into an egg. It may interfere, and is not preferable.
- the microscope main body 61 includes a revolver 73 to which a plurality of objective lenses 74 are attached, a DIC prism 75, an analyzer 76, an image sensor 77, and a handle for raising and lowering the revolver 73. And a lens barrel 79 to which an eyepiece 80 is attached.
- the objective lens is preferably a 20X or 40X objective lens, and in the case of observing a sperm smaller than an egg, 60X or 100X is desirable. Therefore, it is desirable that the revolver 73 is configured to electrically switch the objective lens under the control of the control box 63.
- the plurality of objective lenses 74 attached to the revolver 73 include a 20X objective lens and a 40X objective lens for RC observation used for observing an egg in RC observation, and a 60X objective lens used for sperm observation in DIC observation. And a 4X objective lens used for bright field observation. Further, a 100 ⁇ objective lens used for sperm observation in DIC observation may be included.
- the 20X objective lens for RC observation is also used for observing eggs during PO observation. Since it is desirable that the PO observation is performed at the same magnification as that in the RC observation, a 40X objective lens for RC observation may be used for observing the egg in the PO observation.
- Each objective lens is an infinitely corrected objective lens.
- the objective lens for RC observation is an objective lens provided with a modulator as described above in the first and second embodiments.
- the objective lens for RC observation is preferably composed of a lens with little distortion. In normal RC observation, the influence of lens distortion is small, but in the microscope 60, since PO observation is performed with an objective lens for RC observation, it is necessary to suppress distortion of the lens. Considering that the retardation of the ovum spindle observed by PO observation is about 5 nm, the objective lens for RC observation should have a retardation of 2 nm or less in order to observe the spindle well with PO. desirable. For the same reason, it is desirable that the condenser lens 71 is also composed of a lens with little distortion, and the retardation of the condenser lens 71 is desirably 2 nm or less.
- the DIC prism 75 is a second DIC prism that is paired with the DIC prism 82 that is the first DIC prism, and can be inserted into and removed from the optical path in the revolver 73, that is, between the objective lens 74 and the analyzer 76.
- the DIC prism 75 is required for DIC observation, but is not required for other observation methods. Therefore, in the case of observations other than DIC observation (RC observation, PO observation, bright field observation), it is removed from the optical path.
- the contrast in the PO observation can be adjusted by moving the DIC prism 75 in the horizontal direction, that is, in the direction orthogonal to the optical axis. For this reason, it is configured to slide by a moving mechanism (not shown).
- the insertion / removal and movement of the DIC prism 75 are electrically performed under the control of the control box 63. Note that the contrast adjustment in DIC observation can also be performed by changing the retardation of the compensator 69.
- the analyzer 76 is a second polarizing plate used in combination with the polarizer 68.
- the analyzer 76 is unnecessary for RC observation, but its presence only slightly darkens the image and does not affect the appearance of the image itself. For this reason, the analyzer 76 is fixed on the optical path.
- the analyzer 76 is desirably disposed on the image side of the objective lens 74, more specifically, between the objective lens 74 and the imaging lens 85 on which the parallel light flux enters. . In the case of being arranged at this position, even if the analyzer 76 is inserted into and removed from the optical path, the image position does not shift. Therefore, the analyzer 76 may be removed from the optical path during RC observation.
- the image sensor 77 detects one of the lights divided by the optical path splitting prism 86 and converts it into an electrical signal.
- the electrical signal is transmitted to the control box 63 and sent to the monitor. Is displayed.
- the monitor image is recorded on a video recording device or the like as necessary.
- the other of the light divided by the optical path dividing prism 86 is incident on the eyepiece 80.
- An optical path splitting prism 86 shown in FIG. 8 is a prism having a joint surface coated with an optical path splitting, and splits the light from the specimen 95 and guides it to the optical path for visual observation and the optical path for imaging. Means. In microinsemination, the work is generally performed visually, but in many cases, video recording of a moving image is performed simultaneously with visual observation, or a still image is acquired. Since the optical path dividing means guides light to both the viewing side and the imaging side, it is not necessary to switch the optical path, and the time can be shortened.
- the light from the light source 65a enters the polarizer 68 via the collector lens 65b, the illumination lens 66a, and the mirror 66b and is polarized.
- the polarized light from the polarizer 68 passes through the optical element in the condenser turret 70 via the compensator 69 and is irradiated onto the specimen 95 by the condenser lens 71.
- Light from the specimen 95 is converted into a parallel light beam by the objective lens 74, passes through the DIC prism 75, the analyzer 76, and the imaging lens 85 and enters the optical path splitting prism 86.
- the image of the specimen 95 is enlarged and projected by the objective lens 74 and the imaging lens 85.
- One of the lights divided by the optical path splitting prism 86 enters the image sensor 77, and the other enters the naked eye via the mirror 87, the relay lens 88, and the eyepiece lens 80. Thereby, visual observation and imaging can be performed simultaneously.
- the optical path splitting prism 86 When the microscope 60 is used for microinsemination, if the total light quantity incident on the optical path splitting prism 86 is L1, and the light quantity guided to the optical path for visual observation is L2, the optical path splitting prism 86 satisfies the following conditions: It is preferable to satisfy the formula.
- the optical path splitting prism 86 is configured to guide light 50:50 to the optical path for visual observation and the optical path for imaging.
- FIG. 10 is a diagram for explaining the configuration of the hand switch unit of the microscope according to the present embodiment.
- FIG. 11 is a setting table of the microscope according to the fourth embodiment.
- the observation method can be switched by operating the hand switch unit 62 shown in FIG. Further, the contrast can be adjusted by the observation method by operating the hand switch unit 62.
- the hand switch unit 62 includes a button group (buttons B1 to B6) corresponding to the observation method, a contrast adjustment button group (buttons B7 and B8), and a revolver driving button group (from the button B9). B13).
- the button B1 of the hand switch unit 62 When switching the observation method of the microscope 60 to bright field observation, the button B1 of the hand switch unit 62 is pressed.
- the control box 63 detects the button press, the polarizer 68 is rotated to bring the polarizer 68 and the analyzer 76 into a parallel Nicols state, the condenser turret 70 and the revolver 73 are rotated, and the aperture 81 and the 4X objective lens are placed on the optical path. insert.
- the parallel Nicol state is not a strict bright field observation because two polarizing plates are used, but there is no problem in finding the location of the sample. Further, when the DIC prism 75 is inserted in the optical path, the DIC prism 75 is removed from the optical path.
- the observation method of the microscope 60 is switched to bright field observation with an observation magnification of 4X.
- the 10X objective lens may be inserted on the optical path. Note that bright field observation is selected when the operation of aligning the needle tip of a micropipette, that is, the positioning operation of the needle tip, is performed as preparation for microinsemination.
- the button B2 of the hand switch unit 62 When the observation method of the microscope 60 is switched to RC observation with an observation magnification of 20X, the button B2 of the hand switch unit 62 is pressed.
- the control box 63 that has detected the pressing of the button reads the setting (specifically, the rotation angle) of the polarizer 68 at the time of the previous RC observation stored in the storage means of the control box 63. Then, the rotation angle of the polarizer 68 is changed according to the read RC observation setting. Further, the condenser turret 70 and the revolver 73 are rotated to insert the RC observation aperture plate 83 and the RC observation 20X objective lens on the optical path. Further, when the DIC prism 75 is inserted in the optical path, the DIC prism 75 is removed from the optical path.
- the observation method of the microscope 60 is switched to RC observation at an observation magnification of 20X. Further, when the observation method of the microscope 60 is switched to RC observation with an observation magnification of 40 ⁇ , the button B3 of the hand switch unit 62 is pressed. The control box 63 that has detected the pressing of the button operates in the same manner as when the button B3 is pressed, except that a 40X objective lens for RC observation is inserted in the optical path instead of the 20X objective lens for RC observation. The observation method of the microscope 60 is switched to RC observation at an observation magnification of 40X. RC observation is selected when observing the appearance of an egg.
- the button B6 or the button B7 may be pressed.
- the control box 63 rotates the polarizer 68, for example, clockwise to change the rotation angle of the polarizer 68
- the control box 63 is, for example, the polarizer 68 counterclockwise. Is rotated to change the rotation angle of the polarizer 68.
- the contrast can be adjusted.
- the button B4 of the hand switch unit 62 When the observation method of the microscope 60 is switched to PO observation with an observation magnification of 20 ⁇ , the button B4 of the hand switch unit 62 is pressed.
- the control box 63 that detects the pressing of the button rotates the polarizer 68 to bring the polarizer 68 and the analyzer 76 into the crossed Nicols state, rotates the condenser turret 70 and the revolver 73, and opens the aperture 81 and the 20 ⁇ objective lens for RC observation. In the light path.
- the observation method of the microscope 60 is switched to PO observation with an observation magnification of 20X.
- the PO observation is selected when observing the spindle in the ovum.
- the button B6 or the button B7 may be pressed.
- the retardation of the compensator 69 is changed so that the control box 63 emphasizes the contrast.
- the retardation of the compensator 69 is changed so that the control box 63 suppresses the contrast. change.
- the contrast adjustment function is effective for observation of the spindle. Note that the retardation of the compensator 69 immediately after switching is preferably set to the retardation of the compensator 69 at the previous PO observation. Thereby, the contrast at the previous observation can be reproduced.
- the objective lens for RC observation is used also in the PO observation, so that it is not necessary to switch the objective lens between the RC observation and the PO observation with the same ovum as the observation target.
- the time required for switching the observation method is shortened, and in addition, there is no confocal shift and image center shift caused by switching of the objective lens before and after switching the observation method. Will improve.
- the button B5 of the hand switch unit 62 is pressed.
- the control box 63 detects the button press, the polarizer 68 is rotated to bring the polarizer 68 and the analyzer 76 into the crossed Nicols state, the condenser turret 70 and the revolver 73 are rotated, and the DIC prism 82 and the 60X objective lens are placed on the optical path. Insert into. Further, when the DIC prism 75 is not inserted into the optical path, the DIC prism 75 is inserted into the optical path. Thereby, the observation method of the microscope 60 is switched to DIC observation with an observation magnification of 60X. Note that DIC observation is selected when sperm is observed. When observing sperm at 100X, a 100X objective lens and a DIC prism for 100XDIC may be inserted in the optical path.
- the button B6 or the button B7 may be pressed.
- the control box 63 moves the DIC prism 75 in the direction orthogonal to the optical axis, and when the button B7 is pressed, the control box 63 sets the DIC prism 75 to the direction of the button B6 orthogonal to the optical axis. Move it in the opposite direction. Thereby, the contrast can be adjusted.
- the position of the DIC prism 75 immediately after the switching is preferably set to the position at the previous DIC observation. Thereby, the contrast at the previous observation can be reproduced.
- the contrast adjustment in DIC observation may be performed by changing the retardation of the compensator 69 instead of moving the DIC prism 75.
- FIG. 12 is a flowchart showing a procedure for saving and restoring the contrast setting of the microscope according to the present embodiment.
- storage and restoration of contrast settings for each observation method will be described with reference to FIG.
- the control box 63 switches the observation method of the microscope 60 to the selected observation method A, and starts observation by the observation method A (step S1). .
- the user operates the contrast adjustment button group (buttons B7 and B8) of the hand switch unit 62, whereby the contrast setting of the observation method A is changed.
- Step S2 when the control box 63 detects a switching instruction from the hand switch unit 62 to the observation method B (step S2), the control box 63 sets the contrast setting of the observation method A, which is the current observation method, in the control box 63.
- Step S3 the observation method of the microscope 60 is switched to the observation method B (step S4), and observation by the observation method B is started (step S5).
- the user operates the contrast adjustment button group (buttons B7 and B8) of the hand switch unit 62, whereby the contrast setting of the observation method B is changed.
- control box 63 detects a switching instruction from the hand switch unit 62 to the observation method A (step S6), the control box 63 stores the contrast setting of the observation method B in the storage means in the control box 63. (Step S7), the previous contrast setting of the observation method A stored in Step S3 is read from the storage means (Step S8), and the observation method of the microscope 60 is switched to the observation method A (Step S9). Then, the contrast setting read in step S8 is restored (step S10), and observation by the observation method A is started (step S11).
- the microscope 60 operates to store the contrast setting immediately before switching the observation method and restore the previous contrast setting in the observation method immediately after switching the observation method. Thereby, since favorable contrast setting is reproduced for each observation method, it is possible to omit the adjustment of the contrast immediately after switching of the observation method, and the work efficiency can be improved.
- the control box 63 is the first control means for electrically rotating the condenser turret 70, and the second control means for electrically changing the retardation of the compensator 69. Further, by functioning as third control means for electrically rotating the polarizer 68, the observation method can be switched simply by operating the hand switch unit 62, and contrast adjustment according to the observation method is also performed at the same time. For this reason, according to the microscope 60 according to the present embodiment, it is possible to quickly switch the observation method without error, and it is possible to realize rapid microinsemination.
- the microscope 60 includes the electric capacitor unit (condenser unit 67), the electric revolver (revolver 73), and the electric DIC prism (DIC prism 75), and the observation method is switched automatically by the hand switch unit 62.
- the capacitor unit 67 the polarizer 68, the compensator 69, and the capacitor turret 70
- the revolver 73, and the DIC prism 75 may be manually switched or adjusted.
- the revolver driving button group (buttons B9 to B13) shown in FIG. 10 may be operated to electrically control only the switching of the objective lens.
- FIG. 13 is a flowchart showing a part of the procedure of microinsemination using the microscope according to the present embodiment.
- FIG. 14 is a diagram for explaining the image processing by the microscope according to the present embodiment. In FIG. 13, only the portion related to the operation on the egg in the procedure of microinsemination is shown.
- the morphology of the ovum is observed by RC observation at an observation magnification of 20X (step S21).
- the contrast setting stored for each observation method in the storage unit 91 in the control box 63 is automatically read, and the rotation angle of the polarizer 68 is adjusted. Thereby, an image with adjusted contrast can be observed.
- a structure called the first polar body 93 is observed by RC observation.
- the ovum 92 is arranged so that the first polar body 93 is located above or below in the field of view (image) of the microscope.
- the reason for this is as follows.
- the needle micropipette
- the sperm is injected. If the spindle 94 is damaged by the needle at this time, fertilization fails. Therefore, in consideration of the fact that the spindle 94 is often near the first polar body 93, in step S11, the first polar body 93 is moved up or down in order to shift the spindle 94 from the central portion where the needle is stuck. Place it so that it is located in
- the polarizer 68 and the analyzer 76 are set in a crossed Nicol state, and the spindle 94 in the ovum is observed by PO observation with an observation magnification of 20X (step S22).
- the spindle 94 has a retardation of about 5 nm.
- the spindle 94 can be visually observed by adjusting the contrast with the compensator 69.
- there is an apparatus for observing the spindle by performing image processing on a polarization image acquired by PO observation but the conventional apparatus cannot perform confirmation while performing microinsemination.
- the microscope 60 can determine whether or not the ovum 92 has matured to a state suitable for fertilization. If the presence of the spindle 94 cannot be confirmed, it can be determined that the ovum 92 has not matured to a state suitable for fertilization. Further, in order not to damage the spindle 94 with the needle, the position of the spindle 94 can be confirmed.
- the manipulator is operated with the holding pipette to rotate the egg 92 and move it to a position that does not affect microinsemination. In many cases, the position of the spindle is near the first polar body. However, there is a case where the spindle is located away from the first polar body, so this confirmation work is required.
- microinsemination is performed by RC observation at an observation magnification of 20X (step S23). That is, the micropipette into which the sperm is injected by operating the manipulator is inserted into the ovum 92 and the sperm is introduced into the ovum 92.
- the contrast setting stored in the storage unit 91 for each observation method is automatically read out and the rotation angle of the polarizer 68 is adjusted, so that the contrast is adjusted under the RC observation. Microinsemination can be performed with.
- the presence and position of the spindle 94 are confirmed in advance using RC observation and PO observation, so that the ovum 92 is not damaged by the RC observation without damaging the spindle 94. It is possible to introduce sperm. Accordingly, since it is possible to avoid a situation in which the spindle 94 is scratched with a needle, microinsemination can be achieved with a high probability.
- the presence and position of the spindle 94 can be sufficiently visually confirmed, but the shape thereof may not be sufficiently visually confirmed.
- the shape of the spindle 94 is likely to be related to the abnormality of the ovum, and confirmation of the shape of the spindle is highly likely to help improve the fertilization rate.
- the image processing unit 90 may perform image processing for further enhancing the contrast on the polarization observation image of the egg output from the driver 89 that has received the electrical signal from the image sensor 77.
- the image in which the shape of the spindle 94 is enhanced by enhancing the contrast may be displayed on the monitor 64 so that it can be confirmed during microinsemination, or is stored in the storage unit 91 formed of a hard disk or an optical disk and later displayed. It may be used for research. Thereby, it becomes possible to confirm the spindle abnormality, and it is highly possible to help improve the fertilization rate.
- the microscope 60 is shown as a microscope that can switch between bright field observation, RC observation, PO observation, and DIC observation, but the microscope 60 may be configured so that only RC observation and PO observation can be switched. Good.
- the DIC prism 82 in the condenser turret 70 and the DIC prism 75 disposed on the objective lens side can be omitted, the configuration of the microscope can be simplified.
- modulator 15a, 15b, 15c, 39a, 39b, 39c, 108a, 108b 108c ... area, 19 ... drive control means, 20 ... memory, 21, 73 ... revolver, 24, 85 ... imaging lens, 25, 66b, 87 ... mirror, 26, 28 ... Relay lens, 27 ... Turret, 29, 80, 109 ... Eyepiece, 61 ... Microscope body, 62 ... Hand switch, 63 ... Control box, 64 ... Monitor, 65 ... Lamp house, 65b ... Collector lens, 66 ... Illumination column, 66a ... Illumination lens, 67 ... Condenser unit, 68 ... Polarizer, 72 ... Stage, 72a ... Heat stage, 76 ...
- Analyzer 77 ... Image sensor, 78 ... Handle, 79 ... Lens barrel, 83, 84 ... Opening plate for RC observation, 86 ... Optical path Split Rhythm, 88 ... Relay lens, 89 ... Driver, 90 ... Image processing unit, 91 ... Storage unit, 92 ... Egg, 93 ... First polar body, 94 ... Spindle Body, 103 ... slit aperture plate, 105, 107 ... lens, AX ... optical axis
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Abstract
顕微鏡1は、光源2と、光源2からの光を標本13に照射するコンデンサレンズ6と、標本13を挟んでコンデンサレンズ6と対向する対物レンズ14と、光源2とコンデンサレンズ6の間に配置された偏光板3と、偏光板3とコンデンサレンズ6の間に配置され、内部に複数の光学素子を配置したコンデンサターレット5と、対物レンズ14よりも像側に配置された偏光板18と、偏光板3と偏光板18の間に配置されたコンペンセータ4と、を含む。顕微鏡1では、観察法に応じて、コンデンサターレット5の内部に配置された複数の光学素子の間で光路上に配置される光学素子がコンデンサターレット5の回転により切り替わる。
Description
本発明は、顕微鏡、及び、顕微授精方法に関し、特に、顕微授精に好適な顕微鏡、及び、それを用いた顕微授精方法に関する。
顕微鏡の一用途として、高度生殖医療の分野における顕微授精が知られている。顕微授精は、顕微鏡下で精子と卵子を受精させる方法であり、一般に、精子が納められたマイクロピペットをホールティングピペットで固定された卵子に突き刺して卵子に精子を直接注入する卵細胞質内精子注入法(ICSI:Intracytoplasmic sperm injection)により行われる。本観察法では、ステージ上で標本を操作するため、ステージの上方に大きな作業空間を有する倒立顕微鏡を用いることが一般である。
従来から、顕微授精の分野では、レリーフコントラスト観察(変調コントラスト観察とも呼ばれる。以降、RC観察と記す。)が用いられている。RC観察に用いられる顕微鏡は、例えば、特許文献1で開示されている。
図15は、RC観察に用いられる従来技術に係る顕微鏡の構成を説明するための図である。図15(a)は、RC観察に用いられる顕微鏡の全体構成を示している。図15(b)は、顕微鏡のコンデンサレンズに含まれる開口板を光軸方向から見た図である。図15(c)は、顕微鏡の対物レンズに含まれるモジュレータを光軸方向から見た図である。
図15に例示される顕微鏡100は、光軸周りに回転する偏光板101と、コンデンサレンズ110と、標本106を挟んでコンデンサレンズ110と対向する対物レンズ111と、接眼レンズ109と、を含んでいる。コンデンサレンズ110は、光軸からずれた位置に開口102が形成された開口板103と、開口102の一部を覆う偏光板104と、レンズ105と、を含んでいる。対物レンズ111は、レンズ107と、透過率の異なる3つの領域(100%の透過率を有する領域108a、25%程度の透過率を有する領域108b、0%の透過率を有する領域108c)を有するモジュレータ108と、を含んでいる。モジュレータ108は、対物レンズ111の瞳位置に配置されていて、モジュレータ108と開口板103は互いに光学的に共役な関係を有している。なお、モジュレータ108は、対物レンズ111の瞳位置と光学的に共役な位置にあればよい。図15では、モジュレータ108は、対物レンズ111の内に配置されているが、対物レンズ111外の対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置されてもよい。
RC観察によれば 開口102による偏斜照明の効果と開口102を通過した光に対するモジュレータ108による変調効果とにより、卵子を立体的に観察することができる。このため、RC観察は、ICSIに好適であり、顕微授精の分野で従来から広く用いられている。
近年、顕微授精の分野では、受精率を向上させるために、複数の観察法を適宜切り替えながら顕微鏡を使用する顕微授精の方法が注目されている。具体的には、上述したRC観察と、微分干渉観察(以降、DIC観察と記す。)や偏光観察(以降、PO観察と記す。)といった他の観察法とを併用する方法が普及しつつある。
DIC観察は、高い照明の開口数が得られないRC観察に比べて高倍率で対象物を観察することができるため、卵子に比べて小さな精子の観察に好適である。このため、形状から良質な精子を選別する場合に用いられる。また、PO観察は、複屈折性をもつ卵子の紡錘体の観察に好適である。このため、卵子に精子を注入する際に紡錘体を誤って傷つけてしまうことを防止するために、紡錘体の位置を確認する場合に用いられる。
ところで、顕微授精のために採取された卵子は、通常、インキュベータなどにより卵子に最適な温度環境下で管理されている。しかしながら、精子を注入する作業が行われる際には、卵子はインキュベータから取り出されて顕微鏡上に配置されることになる。顕微鏡上の環境は、卵子にとって必ずしも最適な環境ではないため、卵子に掛かるストレスを抑制するためには、顕微鏡で行われる作業を短時間で済ませる必要がある。このため、顕微授精で用いられる複数の観察法を、わずかな作業により短時間で切り替え得る顕微鏡の構成が必要とされている。
以上のような実情を踏まえて、本発明では、顕微授精に好適な顕微鏡の技術を提供することを目的とする。
本発明の一態様は、光源と、前記光源からの光を標本に照射するコンデンサレンズと、前記標本を挟んで前記コンデンサレンズと対向する対物レンズと、前記光源と前記コンデンサレンズの間に配置された第1の偏光板と、前記第1の偏光板と前記コンデンサレンズの間に配置され、内部に複数の光学素子を配置したコンデンサターレットと、前記対物レンズよりも像側に配置された第2の偏光板と、前記第1の偏光板と前記第2の偏光板の間に配置されたコンペンセータと、を含み、観察法に応じて、前記コンデンサターレットの内部に配置された前記複数の光学素子の間で、光路上に配置される光学素子が、前記コンデンサターレットの回転により切り替わる顕微鏡を提供する。
本発明の別の態様は、レリーフコントラスト観察と微分干渉観察と偏光観察を選択的に行う顕微鏡であって、光源と、前記光源からの光を標本に照射するコンデンサレンズと、前記標本を挟んで前記コンデンサレンズと対向する対物レンズと、前記光源と前記コンデンサレンズの間に配置された第1の偏光板と、前記第1の偏光板と前記コンデンサレンズの間に配置されたコンデンサターレットと、前記第1の偏光板と前記コンデンサターレットの間に配置されたコンペンセータと、を含み、前記コンデンサターレットは、DICプリズムと、レリーフコントラスト用の光学素子と、を含み、観察法に応じて、前記コンデンサターレットの内部で光路上に配置される光学素子が、前記コンデンサターレットの回転により切り替わり、前記コンペンセータのリターデーションを変更することにより、前記標本の画像のコントラストを調整する顕微鏡を提供する。
本発明によれば、顕微授精に好適な顕微鏡の技術を提供することができる。
図1は、本実施例に係る顕微鏡の構成を説明するための図である。図2、図3、及び、図4は、それぞれ、RC観察、DIC観察、PO観察に用いられる従来技術に係る顕微鏡でのコントラストの調整方法を説明するための図である。
まず、本実施例に係る顕微鏡について説明する前に、図2から図4を参照しながら、RC観察、DIC観察、PO観察の各々に用いられる従来技術に係る顕微鏡の構成とコントラスト調整方法について概説する。
図2に例示されるように、RC観察に用いられる従来技術に係る顕微鏡30は、照明光路上に光源側から順に、回転可能に配置された偏光板31と、コンデンサターレット32と、コンデンサレンズ33と、を含んでいる。また、顕微鏡30は、観察光路上に標本37側から順に、対物レンズ38と、透過率の異なる3つの領域(100%の透過率を有する領域39a、25%程度の透過率を有する領域39b、0%の透過率を有する領域39c)を有するモジュレータ39と、を含んでいる。コンデンサターレット32内には、光軸AXからずれた位置に開口35が形成された開口板34と、開口35の一部を覆う偏光板36とが照明光路中に配置されている。また、モジュレータ39は、対物レンズ38の瞳位置に配置されていて、コンデンサレンズ33の瞳位置に配置された開口板34と光学的な共役な関係を有している。
顕微鏡30では、ターレット内の偏光板36が固定されているのに対して、偏光板31は回転可能に配置されている。このため、偏光板31を回転させることで、偏光板31を通過した照明光(直線偏光)の偏光方向を変化させることができる。偏光板31を通過した照明光の偏光方向が変化すると偏光板36を通過する照明光の光量も変化することになるため、その結果として、標本37の画像のコントラストが調整される。即ち、RC観察に用いられる従来技術に係る顕微鏡30では、コントラスト調整のための操作部は偏光板31の操作部であり、偏光板31の回転によりコントラストが調整される。
図3に例示されるように、DIC観察に用いられる従来技術に係る顕微鏡40は、照明光路上に光源側から順に、ポラライザとして機能する偏光板41と、内部にDICプリズム44を含むコンデンサターレット42と、コンデンサレンズ43と、を含んでいる。また、顕微鏡40は、観察光路上に標本45側から順に、対物レンズ46と、DICプリズム47と、アナライザとして機能する偏光板48と、を含んでいる。偏光板41と偏光板48は、互いに偏光方向が直交するように、即ち、クロスニコルとなるように配置されている。DICプリズムとしては、例えば、ノマルスキープリズムなどがある。
顕微鏡40は、DICプリズム44により分離されてDICプリズム47により合成される互いに直交する2つの偏光が標本45のわずかに異なる位置を通過することで生じる位相差を、干渉作用により可視化するものである。顕微鏡40では、DICプリズム47を光軸と直交する平面内で移動させることで、DICプリズム間で生じる光路長差を変化させることができる。DICプリズム47の移動により2つの偏光間の光路長差が変化すると2つの偏光間の位相差も変化することになるため、その結果として、標本45の画像のコントラストが調整される。即ち、DIC観察に用いられる従来技術に係る顕微鏡40では、コントラスト調整のための操作部はDICプリズム47の操作部であり、DICプリズム47の移動によりコントラストが調整される。
なお、DIC観察では、図3では図示しない、回転偏光板と1/4波長板を組合せたセナルモン式のコンペンセータを用いて、リターデーションを変化させてコントラストを変える方法も知られている。
図4に例示されるように、PO観察に用いられる従来技術に係る顕微鏡50は、照明光路上に光源側から順に、ポラライザとして機能する偏光板51と、コンデンサターレット52と、コンデンサレンズ53と、を含んでいる。また、顕微鏡50は、観察光路上に標本56側から順に、対物レンズ57と、コンペンセータ58と、アナライザとして機能する偏光板59と、を含んでいる。コンデンサターレット52内部には、開口55が形成された開口板54が配置されている。また、偏光板51と偏光板59は、互いに偏光方向が直交するように、即ち、クロスニコルとなるように配置されている。
顕微鏡50は、標本56の複屈折性により生じる直交する2つの偏光間の位相差を、干渉作用により可視化するものである。顕微鏡50では、コンペンセータ58のリターデーションを変化させることで、2つの偏光間の位相差が変化するため、その結果として、標本56の画像のコントラストが調整される。即ち、PO観察に用いられる従来技術に係る顕微鏡50では、コントラスト調整のための操作部はコンペンセータ58の操作部であり、コンペンセータ58のリターデーションの変更によりコントラストが調整される。
なお、図4では、コンデンサターレット52内に開口板54を配置した例を示したが、コンデンサターレット52内に開口55が形成されていれば、開口板54が存在していなくても良い。
図2から図4で例示されるように、RC観察、DIC観察、PO観察の各々に用いられる従来技術に係る顕微鏡の構成はそれぞれ異なっている。RC観察に用いられる顕微鏡の構成と他の観察法(DIC観察、PO観察)に用いられる顕微鏡の構成との相違は、特に大きい。このため、観察法を切り替える場合には、多くの光学素子の着脱(光路中への挿脱)が必要であり、観察法を短時間で切り替えることは困難である。
次に、本実施例に係る顕微鏡の構成とコントラスト調整方法について説明する。
本実施例に係る顕微鏡は、RC観察、DIC観察、PO観察を適宜切り替えて、選択的に行うことができる倒立顕微鏡であり、顕微授精に好適な顕微鏡である。
図1に例示されるように、顕微鏡1は、照明光路上に、光源側から順に、光源2と、ポラライザとして機能する偏光板3(第1の偏光板)と、内部に複数の光学素子を配置したコンデンサターレット5と、光源2からの光を標本13に照射するコンデンサレンズ6と、を含んでいる。また、顕微鏡1は、観察光路上に、標本側から順に、標本13を挟んでコンデンサレンズ6と対向する対物レンズ14と、対物レンズ14が装着されたレボルバ21と、観察光路に対して挿脱可能に配置されたDICプリズム17(第2のDICプリズム)と、アナライザとして機能する偏光板18(第2の偏光板)と、を含んでいる。
さらに、顕微鏡1は、顕微鏡1の電動部位の駆動を制御する駆動制御手段19と、観察法毎の顕微鏡1の設定を記憶する記憶手段であるメモリ20と、を含んでいる。駆動制御手段19は、メモリ20に電気的に接続されていて、メモリ20に記憶されている顕微鏡の設定情報を読み出すことができる。
コンデンサターレット5内部には、RC観察用の光学素子である開口8の一部に偏光板9を有する開口板7(第1の開口板)と、DIC観察用の光学素子であるDICプリズム10(第1のDICプリズム)と、PO観察用の光学素子であるコンペンセータ4と、が含まれている。コンデンサターレット5内で光路上に配置される光学素子は、観察法に応じて、コンデンサターレット5の回転により切り替わる。具体的には、RC観察を行う場合には偏光板9を有する開口板7が、DIC観察を行う場合にはDICプリズム10が、PO観察を行う場合にはコンペンセータ4が、光路上に配置される。
開口板7は、コンデンサターレット5の回転により照明光路上のコンデンサレンズ6の瞳位置に配置される。開口板7に形成される開口8は、偏斜照明を実現するため、開口板7の中心からずれた位置に形成されていて、開口板7が照明光路上に配置されたときに光軸AXからずれた位置に配置される。
コンペンセータ4は、標本の異方性による位相差、すなわち、リターデーションを測定するための光学素子であり、リターデーションを可変する構造を有している。コンペンセータには、液晶や波長板を用いたものなどさまざまなものがある。具体的には、ベレークコンペンセータ、セナルモン式コンペンセータ、ブレースケーラコンペンセータ、石英楔コンペンセータ、液晶変調素子などがある。卵子の紡錘体を観察するPO観察においては、視野のリターデーションがほぼ均一となることが望ましいため、コンペンセータ4としては、視野のリターデーションがほぼ均一となり得る、液晶変調素子、セナルモン式コンペンセータ、ブレースケーラコンペンセータが望ましい。
なお、コンペンセータ4として液晶変調素子を用いる場合には、液晶分子を電気的に制御することでコンペンセータ4のリターデーションを変化させることができる。また、コンペンセータ4としてセナルモン式コンペンセータを用いる場合には、コンペンセータ4内の波長板に対する偏光板3の回転によりコンペンセータ4のリターデーションを変化させることができる。また、コンペンセータ4としてブレースケーラコンペンセータを用いる場合には、コンペンセータ4内のプリズムの回転によりコンペンセータ4のリターデーションを変化させることができる。
また、コンペンセータ4は、図4に例示される従来技術に係る顕微鏡50のコンペンセータ58と異なり、照明光路中に配置されているが、観察光路中に配置されるコンペンセータ58と同様に作用する。
レボルバ21には、対物レンズ14に加えて、対物レンズ16が装着されていて、これらの対物レンズは、観察法に応じて、レボルバ21の回転により切り替えて使用される。
対物レンズ14は、卵子の観察に適した倍率(例えば、20倍)を有するRC観察用の対物レンズであり、対物レンズ14の瞳位置に、透過率の異なる3つの領域(100%の透過率を有する領域15a、25%程度の透過率を有する領域15b、0%の透過率を有する領域15c)を有するモジュレータ15を備えている。モジュレータ15は、コンデンサレンズ6の瞳位置に配置された開口板7と光学的に共役な関係を有している。対物レンズ14は、卵子の紡錘体を主な観察対象とし、ほぼ同程度の倍率が要求されるPO観察でも使用することができる。
一方、対物レンズ16は、精子の観察に適した倍率(例えば、60倍または100倍などの高倍率)を有する対物レンズであり、DIC観察で用いられる。対物レンズ16は、倍率が異なる点に加えて、モジュレータ15を備えてない点が、対物レンズ14と異なっている。
DICプリズム10とDICプリズム17は、対を成していて、微分干渉光学系を構成している。DICプリズム10は、例えば、ノマルスキープリズムであり、コンデンサターレット5の回転により照明光路に対して挿脱可能に配置されている。DICプリズム17は、例えば、ノマルスキープリズムであり、対物レンズと偏光板18の間の観察光路に対して挿脱可能に配置されている。
偏光板18は、対物レンズ14(レボルバ21)の像側に配置されていて、光源2とコンデンサレンズ6の間に配置された偏光板3に対して所定の方向に固定されている。具体的には、偏光板3と偏光板18は、互いに偏光方向が直交するように、即ち、クロスニコルとなるように配置されている。
なお、偏光板18はDIC観察とPO観察においてはなくてはならない構成要素であるが、従来のRC観察では偏光板18はないのが通常である。しかし、ターレット内の偏光板9の振動方向をアナライザ(偏光板18)、ポラライザ(偏光板3)の振動方向に対して45度方向に設定しておけば、偏光板18があっても単に像が暗くなるだけであるので、観察に支障はない。本実施例においては、アナライザ(偏光板18)は常に光路に入っていることにして、その挿脱の手間を省いている。
駆動制御手段19は、具体的には、偏光板3、コンデンサターレット5、及び、レボルバ21を電動で回転させる制御手段であり、コンペンセータ4のリターデーションを電動で変更する制御手段である。また、駆動制御手段19は、DICプリズム17を観察光路に対して電動で挿脱する制御手段でもある。即ち、駆動制御手段19は、DICプリズム17を光軸と直交する平面内で移動させる手段としても機能する。なお、偏光板3、コンペンセータ4、コンデンサターレット5、レボルバ21、及び、DICプリズム17の動作は、駆動制御手段19の代わりに、それぞれ独立した制御手段により、制御されてもよい。その場合、各制御手段は、それぞれメモリ20に電気的に接続されていることが望ましい。
本実施例に係る顕微鏡1では、コンデンサターレット5の回転による光路上に配置する光学素子の切り替え作業と、レボルバ21の回転による対物レンズの切り替え作業と、DICプリズム17の挿脱作業によって、RC観察とPO観察とDIC観察を任意に切り替えることができる。
なお、対物レンズの切り替え作業は、観察法を切り替える場合に限らず、観察対象に応じて適宜行われる作業である。即ち、本実施例に係る顕微鏡1では、従来の作業に加えて、コンデンサターレット5の回転とDICプリズム17の挿脱の2つの作業を行うことのみより、RC観察とPO観察とDIC観察を任意に切り替えることができる。
観察法をRC観察に切り替えるときには、レボルバ21の回転により卵子の観察に適した倍率を有する対物レンズ14が観察光路中に配置され、コンデンサターレット5の回転により照明光路上に開口板7が配置される。さらに、DICプリズム17が観察光路上から取り除かれて、観察光路外に配置される。これにより、顕微鏡1の観察法をRC観察に切り替えることができる。なお、DICプリズム17は、RC観察の場合、観察光路上に配置されていてもよい。
観察法をDIC観察に切り替えるときには、レボルバ21の回転により精子の観察に適した倍率を有する対物レンズ16が観察光路中に配置され、コンデンサターレット5の回転により照明光路中にDICプリズム10が配置される。さらに、DICプリズム10と対を成すDICプリズム17が観察光路中に挿入される。これにより、顕微鏡1の観察法をDIC観察に切り替えることができる。
観察法をPO観察に切り替えるときには、レボルバ21の回転により卵子の観察に適した倍率を有する対物レンズ14が観察光路中に配置され、コンデンサターレット5の回転により照明光路中にコンペンセータ4が配置される。さらに、DICプリズム17が観察光路上から取り除かれて、観察光路外に配置される。これにより、顕微鏡1の観察法をPO観察に切り替えることができる。
これらの作業は、手動で行われても良いが、本実施例に係る顕微鏡1では、駆動制御手段19の制御のもとで電動で行われる。具体的には、不図示の入力手段を介して利用者が観察法を指定することで、駆動制御手段19がメモリ20から、指定された観察法に対応する顕微鏡1の設定を読出して、その設定に従って、コンデンサターレット5の回転、レボルバ21の回転、DICプリズム17の挿脱を制御する。これにより、観察法が電動で切り替わる。
さらに、メモリ20に記憶された顕微鏡1の設定には、観察法毎の標本13の画像のコントラストを調整するための設定も含まれている。具体的には、RC観察では、標本13の画像のコントラストは偏光板3の回転により調整されるため、RC観察に対応する顕微鏡1の設定には、偏光板3の回転に関する設定が含まれている。DIC観察では、標本13の画像のコントラストはDICプリズム17の移動により調整されるため、DIC観察に対応する顕微鏡1の設定には、光軸と直交する平面内でのDICプリズム17の移動に関する設定が含まれている。PO観察では、標本13の画像のコントラストはコンペンセータ4のリターデーションの変更により調整されるため、PO観察に対応する顕微鏡1の設定には、コンペンセータ4のリターデーションの変更に関する設定が含まれている。
図示はしていないが、駆動制御手段19にはコンピュータなどのリターデーション調整入力手段を接続してもよい。リターデーション調整入力手段からの入力により、RC観察、DIC観察、PO観察のそれぞれにおいて、ユーザの好みのコントラストの値になるように調整することができる。
コンペンセータ4のリターデーションの変更に関する設定は、より具体的には、コンペンセータ4が液晶変調素子であれば、液晶分子の制御に関する設定であり、コンペンセータ4がブレースケーラコンペンセータであれば、コンペンセータ4内のプリズムの回転に関する設定であり、コンペンセータ4がセナルモン式コンペンセータであれば、コンペンセータ4内の波長板に対する偏光板3の回転に関する設定である。
このような設定により、観察法の切り替えと同時に観察画像のコントラストが良好に調整される。なお、駆動制御手段19によるコントラストの調整は、観察法毎に最も良好なコントラストが得られるように設定されてもよい。また、観察法によらず、直前に観察した状態と同じコントラストが得られるように設定されてもよい。
本実施例に係る顕微鏡1によれば、顕微授精で用いられる複数の観察法を、レボルバ21の回転に加えて、コンデンサターレットの回転とDICプリズムの挿脱というわずかな作業により短時間で切り替えることできる。また、これらの作業が駆動制御手段19の制御のもとで電動で行われるため、複数の観察法をより短時間で確実に切り替えることができる。さらに、観察法に応じたコントラストの設定も駆動制御手段19の制御のもとで電動で行われるため、観察法毎に行われる利用者による設定作業を省略することができる。従って、顕微鏡1は、顕微授精の作業を開始するまでに要する時間を短縮することが可能であり、顕微授精に好適である。
なお、モジュレータ15はPO観察に不要であるが、モジュレータ15の存在はPO観察に大きな影響を及ぼさないため、上述したように、PO観察を行う場合にもRC観察を行う場合と同様に、モジュレータ15を有する対物レンズ14を利用することができる。また、顕微鏡1では、RC観察とPO観察のいずれにおいても、DICプリズム17は観察光路外に配置されている。従って、本実施例に係る顕微鏡1では、コンデンサターレット5の回転のみでRC観察とPO観察を切り替えることが可能であり、さらに短時間で観察法を切り替えることができる。
図5は、本実施例に係る顕微鏡の構成を説明するための図である。まず、図5に例示される本実施例に係る顕微鏡22の構成について説明する。なお、図5の構成要素のうち図1と同一の構成要素には同一の符号を付して説明を省略する。
図5に例示される顕微鏡22は、RC観察、DIC観察、PO観察を適宜切り替えて、選択的に行うことができる倒立顕微鏡であり、顕微授精に好適な顕微鏡である。
顕微鏡22の構成は、コンペンセータ4がコンデンサターレット5と偏光板3の間に配置されている点と、コンデンサターレット5内にコンペンセータ4の代わりに開口12が形成された開口板11が含まれている点が、実施例1に係る顕微鏡1の構成と異なっている。顕微鏡22のその他の構成は、顕微鏡1と同様である。
コンデンサターレット5内部には、RC観察用の光学素子である開口8の一部に偏光板9を有する開口板7(第1の開口板)と、DIC観察用の光学素子であるDICプリズム10(第1のDICプリズム)と、PO観察用の光学素子である開口12が形成された開口板11と、が含まれている。コンデンサターレット5内で光路上に配置される光学素子は、観察法に応じて、コンデンサターレット5の回転により切り替わる。具体的には、RC観察を行う場合には偏光板9を有する開口板7が、DIC観察を行う場合にはDICプリズム10が、PO観察を行う場合には開口12が形成された開口板11が、光路上に配置される。
開口板11に形成される開口12は、照明光を遮らない十分な大きさを有するように形成されている。このため、開口板11の開口12は、コンデンサターレット5の回転により照明光路中に配置されたときに、開口数の高い照明を可能とする。また、開口板11はコンデンサターレット5の一部であってもよく、その場合には、開口12は、コンデンサターレット5自体に形成されてもよい。
本実施例に係る顕微鏡22では、実施例1に係る顕微鏡1と同様に、コンデンサターレット5の回転による光路上に配置する光学素子の切り替え作業と、レボルバ21の回転による対物レンズの切り替え作業と、DICプリズム17の挿脱作業によって、RC観察とPO観察とDIC観察を任意に切り替えることができる。
本実施例に係る顕微鏡22は、これらの作業が駆動制御手段19の制御のもとで電動で行われる点も、実施例1に係る顕微鏡1と同様である。具体的には、不図示の入力手段を介して利用者が観察法を指定することで、駆動制御手段19がメモリ20から、指定された観察法に対応する顕微鏡1の設定を読出して、その設定に従って、コンデンサターレット5の回転、レボルバ21の回転、DICプリズム17の挿脱を制御する。これにより、観察法が電動で切り替わる。なお、顕微鏡22では、実施例1に係る顕微鏡1と同様に、切り替え作業は手動で行われても良い。
次に、本実施例に係る顕微鏡22におけるコントラスト調整方法について説明する。本実施例に係る顕微鏡22は、観察法によらずコンペンセータ4のリターデーションを変更することにより標本13の画像のコントラストを調整することができる点が、実施例1に係る顕微鏡1と異なっている。
RC観察では、コンペンセータ4のリターデーションにより、偏光板3を通過した直線偏光が楕円偏光に変化する。その楕円の状態は、コンペンセータ4のリターデーションの大きさに応じて変化する。このため、コンペンセータ4のリターデーションの変更により、偏光板3に対して一定の方向に固定された偏光板9を通過する照明光の光量が変化することになり、その結果として、標本13の画像のコントラストを調整することができる。
DIC観察は、DICプリズム10により分離されてDICプリズム17により合成される互いに直交する2つの偏光が標本13のわずかに異なる位置を通過することで生じる位相差を干渉作用により可視化ものである。DIC観察では、コンペンセータ4のリターデーションにより、DICプリズム10へ入射する前に予め位相差を生じさせることで、最終的に生じる2つの偏光間の位相差も変化することになる。このため、コンペンセータ4のリターデーションの変更により、標本13の画像のコントラストを調整することができる。
PO観察では、従来からコンペンセータのリターデーションを変更することで、標本の画像のコントラストが調整されている。顕微鏡22のコンペンセータ4は、図4に例示される従来技術に係る顕微鏡50のコンペンセータ58と異なり、照明光路中に配置されているが、観察光路中に配置されるコンペンセータ58と同様に作用する。このため、コンペンセータ4のリターデーションの変更により、標本13の画像のコントラストを調整することができる。
このように、本実施例に係る顕微鏡22では、コントラストを調整するための操作部は、観察法によらずコンペンセータ4に統一されている。このため、操作方法も統一されていて、顕微鏡22は高い操作性を有する。顕微授精の作業は、極めて正確に且つ丁寧に行われる必要があり、そのような作業を短時間で素早く行うためには、顕微鏡の操作性は非常に重要である。従って、観察法によらずコンペンセータ4によりコントラストを調整することができる顕微鏡22は、顕微授精に好適である。
これに対して、図2から図4で例示される従来技術に係る顕微鏡や図1に例示される実施例1に係る顕微鏡1を使用する場合、RC観察、DIC観察、及びPO観察では、コントラストを調整するための操作部がそれぞれ異なっており、その操作方法も統一されていない。具体的には、RC観察では、コンデンサレンズの光源側に設けられたポラライザを回転させることによりコントラストが調整される。DIC観察では、DICプリズムを光軸と垂直な方向に移動させることによりコントラストが調整される。また、PO観察では、ポラライザとアナライザの間に設けられたコンペンセータのリターデーションを変更することにより、コントラストが調整される。
以上、本実施例に係る顕微鏡22によれば、実施例1に係る顕微鏡1と同様の効果を得ることができる。つまり、顕微授精で用いられる複数の観察法を、レボルバ21の回転に加えて、コンデンサターレット5の回転とDICプリズム17の挿脱というわずかな作業により短時間で切り替えることできる。また、これらの作業が駆動制御手段19の制御のもとで電動で行われるため、複数の観察法をより短時間で確実に切り替えることができる。さらに、観察法に応じたコントラストの設定も駆動制御手段19の制御のもとで電動で行われるため、観察法毎に行われる利用者による設定作業を省略することができる。従って、顕微鏡22は、顕微授精の作業を開始するまでに要する時間を短縮することが可能であり、顕微授精に好適である。
また、本実施例に係る顕微鏡22によれば、観察法によらずコンペンセータ4によりコントラストを調整することができる。このため、高い操作性によりコントラストの調整作業に要する利用者の負担を軽減することができる。従って、顕微鏡22は、手動でのコントラストの調整を容易に行うことができる。
なお、顕微鏡22でも、実施例1に係る顕微鏡1と同様に、RC観察において、偏光板3の回転によりコントラストを調整してもよい。また、DIC観察において、DICプリズム17の光軸と垂直な方向への移動によりコントラストを調整してもよい。
また、本実施例ではコンペンセータ4は、ポラライザ(偏光板3)とコンデンサターレット5の間にあるが対物レンズ14とアナライザ(偏光板18)の間に配置されてもよい。
図6は、本実施例に係る顕微鏡の構成を説明するための図である。以下、図6に例示される本実施例に係る顕微鏡23の構成について説明する。なお、図6の構成要素のうち図1又は図5と同一の構成要素には同一の符号を付して説明を省略する。また、本実施例に係る顕微鏡23のコントラスト調整方法は、図5に例示される実施例2に係る顕微鏡22のコントラスト調整方法と同様である。
図6に例示される顕微鏡23は、RC観察、DIC観察、PO観察を適宜切り替えて、選択的に行うことができる倒立顕微鏡であり、顕微授精に好適な顕微鏡である。
顕微鏡23は、顕微鏡23の標本13に対して光源側の構成は図5に例示される実施例2に係る顕微鏡22と同様であるが、顕微鏡23の標本13に対して像側の構成が実施例2に係る顕微鏡22と異なっている。また、顕微鏡23は、駆動制御手段19及びメモリ20を含む点は実施例2に係る顕微鏡22と同様であるが、駆動制御手段19がDICプリズム17の代わりに後述する切り替え手段27に接続されている点が実施例2に係る顕微鏡22と異なっている。
顕微鏡23は、観察光路上に、標本側から順に、標本13を挟んでコンデンサレンズ6と対向する対物レンズ14aと、対物レンズ14aと対物レンズ16が装着されたレボルバ21と、結像レンズ24と、ミラー25と、リレーレンズ26と、切り替え手段27と、アナライザとして機能する偏光板18(第2の偏光板)と、リレーレンズ28と、接眼レンズ29と、を含んでいる。
対物レンズ14aは、モジュレータを備えない、卵子の観察に適した倍率(例えば、20倍)を有する対物レンズである。対物レンズ14aは、卵子を観察するRC観察及びPO観察で用いられ、対物レンズ16は、精子を観察するDIC観察で用いられる。
切り替え手段27は、観察方法に応じて、観察光路上に、モジュレータ15とDICプリズム17(第2のDICプリズム)とを切り替えて挿入する手段である。具体的には、RC観察を行う場合にはモジュレータ15が光路上に配置され、DIC観察を行う場合にはDICプリズム17が光路上に配置され、PO観察を行う場合にはいずれの光学素子も光路上に配置されないように、切り替わる。切り替え手段27により観察光路上に配置されたモジュレータ15は、対物レンズ14aの瞳位置と光学的に共役な位置に配置される。
結像レンズ24は、対物レンズ(対物レンズ14aまたは対物レンズ16)から射出された光を結像して、中間像を形成する。リレーレンズ26は、中間像位置からの発散光を略平行光に変換する。これにより、DICプリズム17や偏光板18に略平行な光が入射する。また、リレーレンズ26は、対物レンズ14aが光路上に配置されている場合には、対物レンズ14aの瞳をモジュレータ15が配置される位置にリレーする。これにより、コンデンサレンズ6の瞳位置に配置された開口板7と対物レンズ14aの瞳共役位置に配置されたモジュレータ15との共役関係を形成する。
本実施例に係る顕微鏡23では、コンデンサターレット5の回転による光路上に配置する光学素子の切り替え作業と、レボルバ21の回転による対物レンズの切り替え作業と、切り替え手段27による切り替え作業によって、RC観察とPO観察とDIC観察を任意に切り替えることができる。
これらの作業は、手動で行われても良いが、本実施例に係る顕微鏡23では、駆動制御手段19の制御のもとで電動で行われる。具体的には、不図示の入力手段を介して利用者が観察法を指定することで、駆動制御手段19がメモリ20から、指定された観察法に対応する顕微鏡23の設定を読出して、その設定に従って、コンデンサターレット5の回転、レボルバ21の回転、切換手段27による切り替えを制御する。これにより、観察法が電動で切り替わる。
以上、本実施例に係る顕微鏡23によれば、実施例2に係る顕微鏡22と同様の効果を得ることができる。つまり、顕微授精で用いられる複数の観察法を、レボルバ21の回転に加えて、コンデンサターレット5の回転と切換手段27による切り替えというわずかな作業により短時間で切り替えることできる。また、これらの作業が駆動制御手段19の制御のもとで電動で行われるため、複数の観察法をより短時間で確実に切り替えることができる。また、観察法に応じたコントラストの設定も駆動制御手段19の制御のもとで電動で行われるため、観察法毎に行われる利用者による設定作業を省略することができる。従って、顕微鏡23は、顕微授精の作業を開始するまでに要する時間を短縮することが可能であり、顕微授精に好適である。また、本実施例に係る顕微鏡23によれば、観察法によらずコンペンセータ4によりコントラストを調整することができる。このため、高い操作性によりコントラストの調整作業に要する利用者の負担を軽減することができる。
さらに、本実施例に係る顕微鏡23では、モジュレータ15は瞳共役位置に配置されるため、モジュレータを備えたRC観察専用の対物レンズを用意する必要がない。
なお、図5では、コンペンセータ4は、偏光板3とコンデンサターレット5の間に配置されているが、コンペンセータ4の配置は、偏光板3とコンデンサターレット5の間に限られない。実施例1に係る顕微鏡1と同様に、コンデンサターレット5内部にコンペンセータ4が配置されてもよい。
なお、各観察方法の切替えについては、コンデンサターレット内の所定の位置にどの開口(光学素子)が入っているかを検出するセンサーがついており、そのセンサーによる検出に連動して観察方法を切り替える方法も有効である。すなわち、手動により変更されたコンデンサターレット位置(所定の位置)がDICプリズムの位置か、レリーフコントラスト用の光学素子の位置か、コンペンセータまたは開口板の位置かを検出し、その検出結果に応じた観察(DIC観察、RC観察、または、PO観察)ができるようレボルバ、DICスライダ、または、ポラライザ(偏光板)の少なくとも一つを動作させて観察方法を切り替える方式としてもよい。上記は手動でコンデンサターレットを回転させた場合にレボルバとDICスライダとポラライザを連動させる例だが、同様にレボルバにどの対物レンズが光路に入っているかを検出するセンサーがついており、そのセンサーによる検出に連動して観察方法を切り替える方法も有効である。すなわち、手動でセンサー付のレボルバを回転させて、観察方法に応じた対物レンズが光路に入ると、コンデンサターレットとDICスライダとポラライザが動作して観察方法を切り替えるものである。
図7は、本実施例に係る顕微鏡の構成を説明するための図である。図8は、本実施例に係る顕微鏡に含まれる光学素子の配置を説明するための図である。図9は、本実施例に係る顕微鏡のコンデンサターレットの構成を説明するための図である。
図7及び図8に例示される顕微鏡60は、RC観察、PO観察、DIC観察、明視野観察が可能な顕微鏡であり、RC観察とPO観察の素早い切替が可能な構成を有している。顕微授精では、インキュベータで受精に最適な状態に培養した卵子を取り出して顕微鏡下で受精を行うが、顕微鏡下は卵子にとって最適な環境(温度、湿度、CO2濃度など)とはいえない。従って、長時間顕微鏡下に卵子を置くことは、卵子にストレスを与えることになるため、観察方法を素早く切替えて短時間で顕微授精の作業を行ってインキュベータに戻すことが顕微授精の成功率の向上につながる。このため、観察方法を素早い切替えが可能な本実施例に係る顕微鏡60は、顕微授精に最適な顕微鏡である。
顕微鏡60は、図7に示されるように、ステージ72に配置されたシャーレ中に収容された標本95を観察するための顕微鏡本体61と、観察方法の変更などの指示が入力されるハンドスイッチ部62と、顕微鏡60の動作制御や画像処理を行う、例えばパーソナルコンピュータなどで構成され制御部として機能するコントロールボックス63と、顕微鏡60で取得した標本95の画像を表示するモニタ64とを備えていて、シャーレをステージ72の上に置いた顕微鏡下での顕微授精に使用される顕微鏡である。
顕微授精に用いられるシャーレ中には、一般に、培養液のドロップが複数作られ、これらのドロップには、精子が入ったドロップと卵子が入ったドロップが含まれる。別途受精用のドロップを作る場合もある。ドロップの上には、空気に触れて細菌に感染することと乾燥とを防ぐために、ミネラルオイルで覆われることが多い。なお、顕微鏡60では、シャーレの底面がプラスティックでなく、ガラスとなっているガラスボトムディッシュが用いられる。これは、プラスチックシャーレは強い複屈折性を有しているため、PO観察及びDIC観察が困難となるからである。
顕微鏡本体61は、図7に示されるように、ランプハウス65と、照明支柱66と、コンデンサユニット67を備えている。顕微鏡本体61では、ランプハウス65からの光が照明支柱66、コンデンサユニット67を介して、ステージ72に配置されたシャーレ中の標本95を照明する。なお、ステージ72のシャーレが配置される部分はヒートステージ72aになっていて、シャーレはヒートステージ72aにより37度に暖められる。
コンデンサユニット67は、図8に示されるように、光源65a側から順に配置された、ポラライザ68、コンペンセータ69、コンデンサターレット70、コンデンサレンズ71から構成されている。コンデンサターレット70内には、図9に例示されるように、コンデンサターレット70本体とともに開口板を構成する開口81と、DICプリズム82と、2種類のレリーフ観察用開口板(レリーフ観察用開口板83、レリーフ観察用開口板84)と、が配置されている。
ポラライザ68は、後述するアナライザ76との組み合わせで用いられる第1の偏光板であり、光軸周りに回転可能に配置されている。ポラライザ68は、観察方法に応じてコントロールボックス63の制御により電動で回転するように構成されていて、明視野観察ではアナライザ76と平行ニコル状態となるように、PO観察及びDIC観察ではアナライザ76とクロスニコル状態となるように回転する。また、RC観察では、コントラストの調整のために任意の回転角度に回転する。
コンペンセータ69は、リターデーションを可変する構造を有していて、コントロールボックス63の制御により電動でリターデーションを変更するように構成されている。コンペンセータ69のリターデーションの変更により、PO観察におけるコントラストを調整することができる。なお、顕微鏡60では、コンペンセータ69はコンデンサターレット70とポラライザ68の間に配置されてコンデンサユニット67を構成しているが、コンペンセータ69は、ポラライザ68とアナライザ76の間に配置されればよく、例えば、図8に示される対物レンズ74とアナライザ76との間に配置されてもよい。
コンデンサターレット70の内部には、図9に示されるように、観察方法や倍率に応じて切替えて使用される複数の光学素子が含まれている。コンデンサターレット70は、観察方法に応じてコントロールボックス63の制御により電動で回転して、いずれかの光学素子が光軸上に位置するように構成されている。
開口81は、コンデンサターレット70とともに開口板を構成していて、明視野観察やPO観察の際に用いられる。即ち、コンデンサターレット70は、明視野観察用またはPO観察用の開口板を含んでいる。明視野観察では、顕微授精の準備のために、4Xや10Xの対物レンズを用いて、シャーレの中の場所探しやマニピュレータによって操作されるマイクロピペットの針先の位置決めなどが行われる。
DICプリズム82は、60XのDIC観察に用いられる第1のDICプリズムであり、後述する対物レンズ側の像側に配置された第2のDICプリズムとともに微分干渉光学系を構成する。
レリーフ観察用開口板(レリーフ観察用開口板83、レリーフ観察用開口板84)は、RC観察に用いられる開口板であり、光軸から偏心した位置に形成された開口の一部が偏光板で覆われたものである。レリーフ観察用開口板83、レリーフ観察用開口板84は、それぞれ、20XのRC観察、40XのRC観察で用いられる開口板であり、開口の位置やサイズが異なっている。
なお、コンデンサターレット70は、図9に示されるように、4穴ターレットである。穴数が多くなるほど一般にターレットは大きくなることから、過度に穴数の多いターレットは、卵子に精子をインジェクションするために用いられるマイクロピペットとホールティングピペットとを3次元的に操作する図示しないマニピュレータと干渉する場合があり、好ましくない。
顕微鏡本体61は、さらに、図7に示されるように、複数の対物レンズ74が装着されたレボルバ73と、DICプリズム75と、アナライザ76と、撮像素子77と、レボルバ73を昇降するためのハンドル部78と、接眼レンズ80が取付けられた鏡筒79と、を備えている。
顕微授精を行う場合には、卵子と精子を観察する必要があるが、卵子の観察と精子の観察では観察に用いられる対物レンズの倍率が異なる。具体的には、卵子の観察の場合には対物レンズは20Xまたは40Xの対物レンズが望ましく、卵子よりも小さい精子を観察する場合には60Xまたは100Xが望ましい。従って、レボルバ73は、コントロールボックス63の制御により電動で対物レンズを切替えるように構成されることが望ましい。
レボルバ73に装着された複数の対物レンズ74には、RC観察での卵子の観察に用いられるRC観察用の20X対物レンズ及び40X対物レンズと、DIC観察での精子の観察に用いられる60X対物レンズと、明視野観察に用いられる4X対物レンズが含まれている。さらに、DIC観察での精子の観察に用いられる100X対物レンズなどが含まれてもよい。RC観察用の20X対物レンズはPO観察での卵子の観察にも用いられる。PO観察はRC観察での倍率と同じ倍率で行われることが望ましいため、さらにRC観察用の40X対物レンズをPO観察での卵子の観察に用いてもよい。なお、いずれの対物レンズも無限遠補正型の対物レンズである。
RC観察用の対物レンズは、実施例1や実施例2で上述したようなモジュレータを備えた対物レンズである。RC観察用の対物レンズは、歪みが少ないレンズで構成されていることが望ましい。通常のRC観察ではレンズの歪みの影響は小さいが、顕微鏡60ではRC観察用の対物レンズでPO観察が行われるためレンズの歪みを抑える必要がある。PO観察で観察する卵子の紡錘体のリターデーションが5nm程度であることを考慮すると、紡錘体を良好にPO観察するためには、RC観察用の対物レンズのリターデーションが2nm以下であることが望ましい。なお、同様の理由からコンデンサレンズ71も歪みが少ないレンズで構成されていることが望ましく、コンデンサレンズ71のリターデーションが2nm以下であることが望ましい。
DICプリズム75は、第1のDICプリズムであるDICプリズム82と対をなす第2のDICプリズムであり、レボルバ73内、即ち、対物レンズ74とアナライザ76の間で光路に対して挿脱可能に配置されている。DICプリズム75は、DIC観察で必要とされるが他の観察方法では不要である。従って、DIC観察以外の観察(RC観察、PO観察、明視野観察)の際には、光路から取り除かれる。また、DICプリズム75を水平方向、つまり、光軸と直交する方向へ移動させることで、PO観察におけるコントラストの調整が可能である。このため、図示しない移動機構によりスライドするように構成されている。DICプリズム75の挿脱及び移動は、コントロールボックス63の制御により電動で行われる。なお、DIC観察におけるコントラストの調整は、コンペンセータ69のリターデーションを変更することによっても行うことができる。
アナライザ76は、ポラライザ68との組み合わせで用いられる第2の偏光板である。アナライザ76はRC観察では不要であるが、その存在は像をわずかに暗くするだけであり像の見え方自体には影響しない。このため、アナライザ76は光路上に固定されている。なお、アナライザ76は、図8に示されるように、対物レンズ74よりも像側、より具体的には、平行光束が入射する対物レンズ74と結像レンズ85との間に配置することが望ましい。この位置に配置されている場合、アナライザ76を光路から挿脱しても像位置がずれることがないため、RC観察の際にアナライザ76を光路外に取り除いてもよい。
撮像素子77は、図8に示されるように、光路分割プリズム86に分割された光の一方を検出して電気信号に変換するものであり、その電気信号はコントロールボックス63に送信され、モニタに表示される。モニタ像は必要によりビデオ記録装置等に記録される。一方、接眼レンズ80には、光路分割プリズム86に分割された光の他方が入射する。
図8に示す光路分割プリズム86は、接合面に光路分割のためのコーティングが施されたプリズムであり、標本95からの光を分割して目視観察用の光路と撮像用の光路に導く光路分割手段である。顕微授精では目視で作業を行うのが一般的であるが、目視観察と同時に動画のビデオ記録を行ったり、静止画像を取得することが多い。光路分割手段が目視側と撮像側の両方に光を導くことにより、光路を切り替える必要がなく、時間を短縮することが可能となる。
以上のように構成された顕微鏡60では、図8に示されるように、光源65aからの光は、コレクタレンズ65b、照明レンズ66a、ミラー66bを経由して、ポラライザ68に入射し偏光する。ポラライザ68からの偏光は、コンペンセータ69を経由して、コンデンサターレット70内の光学素子を透過し、コンデンサレンズ71により標本95に照射される。標本95からの光は、対物レンズ74で平行光束に変換されて、DICプリズム75、アナライザ76、及び結像レンズ85を通過して光路分割プリズム86に入射する。この際、標本95の像は、対物レンズ74と結像レンズ85により拡大して投影される。光路分割プリズム86により分割された光の一方は撮像素子77に入射し、他方はミラー87、リレーレンズ88、接眼レンズ80を経由して肉眼に入射する。これにより、目視観察と撮像を同時に行うことができる。
なお、顕微鏡60が顕微授精に使用される場合には、光路分割プリズム86に入射する全光量をL1とし、目視観察用の光路に導かれる光量をL2とすると、光路分割プリズム86は以下の条件式を満たすことが好ましい。
20<L2/L1<60
上記の条件式の下限を下回ると、目視観察用の光路に導かれる光量が不足して顕微授精の効率が低下してしまう。特に、アナライザ76が光路上に固定された顕微鏡60では、アナライザ76の存在によりRC観察における光量が低下していることを考慮すべきである。一方、条件式の上限を超えると、目視観察用の光路には十分な量の光が導かれるが、撮像用の光路に導かれる光量が不足し、その結果、ノイズが多くなる。顕微授精では目視観察で顕微授精の作業をしながら作業全体や卵子の状態を撮像素子を用いて撮像する場合が多々あるが、上記条件式を満たすことで、作業性を確保しながら目視観察と撮像を同時に行うことが可能となる。顕微鏡60では、光路分割プリズム86は、目視観察用の光路と撮像用の光路に50:50で光を導くように構成されている。
上記の条件式の下限を下回ると、目視観察用の光路に導かれる光量が不足して顕微授精の効率が低下してしまう。特に、アナライザ76が光路上に固定された顕微鏡60では、アナライザ76の存在によりRC観察における光量が低下していることを考慮すべきである。一方、条件式の上限を超えると、目視観察用の光路には十分な量の光が導かれるが、撮像用の光路に導かれる光量が不足し、その結果、ノイズが多くなる。顕微授精では目視観察で顕微授精の作業をしながら作業全体や卵子の状態を撮像素子を用いて撮像する場合が多々あるが、上記条件式を満たすことで、作業性を確保しながら目視観察と撮像を同時に行うことが可能となる。顕微鏡60では、光路分割プリズム86は、目視観察用の光路と撮像用の光路に50:50で光を導くように構成されている。
次に、図10及び図11を参照しながら、観察方法の切替について説明する。図10は、本実施例に係る顕微鏡のハンドスイッチ部の構成を説明するための図である。図11は、実施例4に係る顕微鏡の設定表である。
顕微鏡60では、図10に示されるハンドスイッチ部62を操作することで観察方法を切替えることができる。また、観察方法でのコントラストの調整もハンドスイッチ部62を操作することで行うことができる。
図10に示されるように、ハンドスイッチ部62は、観察方法に対応したボタン群(ボタンB1からB6)と、コントラスト調整ボタン群(ボタンB7、B8)と、レボルバ駆動用ボタン群(ボタンB9からB13)と、を備えている。
顕微鏡60の観察方法を明視野観察に切替える場合には、ハンドスイッチ部62のボタンB1を押下する。ボタンの押下を検出したコントロールボックス63は、ポラライザ68を回転させて、ポラライザ68とアナライザ76を平行ニコル状態にし、コンデンサターレット70及びレボルバ73を回転させて、開口81と4X対物レンズを光路上に挿入する。平行ニコル状態は偏光板を2枚用いるため厳密な明視野観察ではないが、試料の場所探しにおいては問題がない。さらに、DICプリズム75が光路中に挿入されている場合には、DICプリズム75を光路外に取り除く。これにより、顕微鏡60の観察方法が観察倍率4Xの明視野観察に切替わる。レボルバ73に10X対物レンズが装着されている場合には、10X対物レンズが光路上に挿入されてもよい。なお、明視野観察は、顕微授精の準備として、マイクロピペットの針先を合せる作業、即ち、針先の位置決め作業などを行う場合に選択される。
顕微鏡60の観察方法を観察倍率が20XのRC観察に切替える場合には、ハンドスイッチ部62のボタンB2を押下する。ボタンの押下を検出したコントロールボックス63は、コントロールボックス63の記憶手段に記憶されている前回のRC観察時のポラライザ68の設定(具体的には、回転角度)を読み出す。そして、読み出したRC観察の設定に従って、ポラライザ68の回転角度を変更する。さらに、コンデンサターレット70及びレボルバ73を回転させて、RC観察用開口板83とRC観察用の20X対物レンズを光路上に挿入する。さらに、DICプリズム75が光路中に挿入されている場合には、DICプリズム75を光路外に取り除く。これにより、顕微鏡60の観察方法が観察倍率20XのRC観察に切替わる。また、顕微鏡60の観察方法を観察倍率が40XのRC観察に切替える場合には、ハンドスイッチ部62のボタンB3を押下する。ボタンの押下を検出したコントロールボックス63は、RC観察用の20X対物レンズの代わりにRC観察用の40X対物レンズを光路上に挿入する点を除き、ボタンB3が押下された場合と同様に動作し、顕微鏡60の観察方法が観察倍率40XのRC観察に切替わる。なお、RC観察は、卵子の外観を観察する場合に選択される。
RC観察でコントラストを調整する場合には、ボタンB6またはボタンB7を押下すればよい。ボタンB6が押下されると、コントロールボックス63が例えば時計回りにポラライザ68を回転させてポラライザ68の回転角度を変更し、ボタンB7が押下されると、コントロールボックス63が例えば反時計回りにポラライザ68を回転させてポラライザ68の回転角度を変更する。これにより、コントラストを調整することができる。
顕微鏡60の観察方法を観察倍率が20XのPO観察に切替える場合には、ハンドスイッチ部62のボタンB4を押下する。ボタンの押下を検出したコントロールボックス63は、ポラライザ68を回転させて、ポラライザ68とアナライザ76をクロスニコル状態にし、コンデンサターレット70及びレボルバ73を回転させて、開口81とRC観察用の20X対物レンズを光路上に挿入する。さらに、DICプリズム75が光路中に挿入されている場合には、標本95の微弱な複屈折を可視化することができないため、DICプリズム75を光路外に取り除く。これにより、顕微鏡60の観察方法が観察倍率20XのPO観察に切替わる。なお、PO観察は、卵子内の紡錘体を観察する場合に選択される。
PO観察でコントラストを調整する場合にも、ボタンB6またはボタンB7を押下すればよい。ボタンB6が押下されると、コントロールボックス63がコントラストを強調するようにコンペンセータ69のリターデーションを変更し、ボタンB7が押下されると、コントロールボックス63がコントラストを抑えるようにコンペンセータ69のリターデーションを変更する。これにより、コントラストを調整することができる。紡錘体のリターデーションは卵子の成熟度によって変化するため、コントラスト調整機能は紡錘体の観察に効果的である。なお、切替直後のコンペンセータ69のリターデーションは、前回のPO観察時のコンペンセータ69のリターデーションに設定されることが望ましい。これにより、前回観察時のコントラストを再現することができる。
顕微鏡60では、PO観察においてもRC観察用の対物レンズを用いることで、同じ卵子を観察対象とするRC観察とPO観察とで対物レンズの切替が不要となる。これにより、観察方法の切替に要する時間が短縮されることに加えて、観察方法の切替前後で対物レンズの切替に起因する同焦ずれと像心ずれが生じないため、顕微授精の作業の効率が向上する。
顕微鏡60の観察方法をDIC観察に切替える場合には、ハンドスイッチ部62のボタンB5を押下する。ボタンの押下を検出したコントロールボックス63は、ポラライザ68を回転させて、ポラライザ68とアナライザ76をクロスニコル状態にし、コンデンサターレット70及びレボルバ73を回転させて、DICプリズム82と60X対物レンズを光路上に挿入する。さらに、DICプリズム75が光路中に挿入されていない場合には、DICプリズム75を光路中に挿入する。これにより、顕微鏡60の観察方法が観察倍率60XのDIC観察に切替わる。なお、DIC観察は、精子を観察する場合に選択される。100Xで精子を観察する場合には、100X対物レンズと100XDIC用のDICプリズムを光路中に挿入してもよい。
DIC観察でコントラストを調整する場合にも、ボタンB6またはボタンB7を押下すればよい。ボタンB6が押下されると、コントロールボックス63がDICプリズム75を光軸と直交する方向に移動させ、ボタンB7が押下されると、コントロールボックス63がDICプリズム75を光軸と直交するボタンB6の場合とは反対の方向に移動させる。これにより、コントラストを調整することができる。なお、切替直後のDICプリズム75の位置は、前回のDIC観察時の位置に設定されることが望ましい。これにより、前回観察時のコントラストを再現することができる。また、DIC観察におけるコントラストの調整は、DICプリズム75の移動の代わりにコンペンセータ69のリターデーションの変更により行われてもよい。
図12は、本実施例に係る顕微鏡のコントラスト設定の保存と復元の手順を示すフローチャートである。以下、図12を参照しながら、観察方法毎のコントラスト設定の保存と復元について説明する。
まず、コントロールボックス63は、ハンドスイッチ部62からの観察方法Aの選択を検出すると、顕微鏡60の観察方法を選択された観察方法Aに切替えて、観察方法Aによる観察を開始する(ステップS1)。観察方法Aによる観察中に、利用者がハンドスイッチ部62のコントラスト調整ボタン群(ボタンB7、B8)を操作することで、観察方法Aのコントラスト設定が変更される。
次に、コントロールボックス63がハンドスイッチ部62から観察方法Bへの切替指示を検出する(ステップS2)と、コントロールボックス63は、現在の観察方法である観察方法Aのコントラスト設定をコントロールボックス63内の記憶手段に記憶してから(ステップS3)、顕微鏡60の観察方法を観察方法Bに切替えて(ステップS4)、観察方法Bによる観察を開始する(ステップS5)。観察方法Bによる観察中に、利用者がハンドスイッチ部62のコントラスト調整ボタン群(ボタンB7、B8)を操作することで、観察方法Bのコントラスト設定が変更される。
さらに、コントロールボックス63がハンドスイッチ部62から観察方法Aへの切替指示を検出する(ステップS6)と、コントロールボックス63は、観察方法Bのコントラスト設定をコントロールボックス63内の記憶手段に記憶してから(ステップS7)、ステップS3で記憶した観察方法Aの前回のコントラスト設定を記憶手段から読み出して(ステップS8)、顕微鏡60の観察方法を観察方法Aに切替える(ステップS9)。そして、ステップS8で読み出したコントラスト設定を復元して(ステップS10)、観察方法Aによる観察を開始する(ステップS11)。
このように、顕微鏡60は、観察方法を切替える直前にコントラストの設定を保存し、観察方法を切替えた直後にその観察方法での前回のコントラストの設定を復元するように動作する。これにより、観察方法毎に良好なコントラスト設定が再現されるため、観察方法の切替直後のコントラストの調整を省略することが可能であり、作業効率を向上させることができる。
以上で説明したように、本実施例に係る顕微鏡60では、コントロールボックス63がコンデンサターレット70を電動で回転させる第1の制御手段として、コンペンセータ69のリターデーションを電動で変更する第2の制御手段として、さらに、ポラライザ68を電動で回転させる第3の制御手段として機能することで、ハンドスイッチ部62を操作するだけで観察方法が切替わり、観察方法に応じたコントラストの調整も同時に行われる。このため、本実施例に係る顕微鏡60によれば、誤りのない素早い観察方法の切替が可能であり、迅速な顕微授精を実現することができる。これに対して、観察方法の切替における光学素子の切替、対物レンズの切替、観察方法毎のコントラスト調整が手動で行われる従来の顕微鏡では、観察方法の切替の際に設定を誤ることも多々有り、切替や調整に時間が掛かるため、迅速な顕微授精は困難である。
なお、以上では、顕微鏡60が電動コンデンサユニット(コンデンサユニット67)、電動レボルバ(レボルバ73)、電動DICプリズム(DICプリズム75)を備え、ハンドスイッチ部62により観察方法が全自動で切替わる例を示したが、少なくとも一部が電動で切り替ればよく、コンデンサユニット67(ポラライザ68、コンペンセータ69、コンデンサターレット70)、レボルバ73、DICプリズム75は、手動で切替や調整が行われてもよい。また、例えば、図10に示されるレボルバ駆動用ボタン群(ボタンB9からB13)を操作して、対物レンズの切替だけを別に電動で制御してもよい。
次に、図13及び図14を参照しながら、本実施例に係る顕微鏡60を用いた顕微授精の手順について説明する。図13は、本実施例に係る顕微鏡による顕微授精の手順の一部を示すフローチャートである。図14は、本実施例に係る顕微鏡による画像処理について説明するための図である。なお、図13では、顕微授精の手順のうち卵子に対する操作に関連する部分のみが示されている。
まず、観察倍率20XのRC観察で卵子の形態を観察する(ステップS21)。この際、コントロールボックス63内の記憶部91に観察方法毎に記憶されたコントラスト設定が自動的に読み出されてポラライザ68の回転角度が調整される。これにより、コントラストが調整された画像を観察することができる。卵子92が成熟して受精に適した状態になると、図14に示されるように、RC観察により第一極体93という構造が観察される。ステップS11では、顕微鏡の視野(画像)の内において第一極体93が上または下に位置するように卵子92を配置する。
この理由は以下のとおりである。顕微授精では針(マイクロピペット)を視野(画像)右側から卵子92に突き刺して精子をインジェクションするが、このときに紡錘体94を針で傷つけると受精が失敗してしまう。このため、紡錘体94が第一極体93の近くにある場合が多いことを踏まえ、ステップS11では、紡錘体94を針が刺さる中心部分からずらすために、第一極体93を上または下に位置するように配置する。
次に、ポラライザ68とアナライザ76をクロスニコル状態に設定して、観察倍率20XのPO観察で卵子内の紡錘体94を観察する(ステップS22)。紡錘体94は5nm程度のリターデーションを持っているが、顕微鏡60では、コンペンセータ69によりコントラストを調整することで、目視で紡錘体94を観察することが可能である。これに対して、従来は、PO観察により取得された偏光画像に画像処理を施すことで紡錘体を観察する装置はあるが、従来の装置では顕微授精を目視で行いながらの確認はできない。
PO観察により紡錘体94の有無を確認することで、顕微鏡60では、卵子92が受精に適した状態にまで成熟しているか否かを判断することができる。紡錘体94の存在を確認できなければ、卵子92が受精に適した状態にまでは成熟してないと判断することができる。また、針で紡錘体94を傷つけないようにするために、紡錘体94の位置の確認することができる。紡錘体94が顕微授精に適当でない位置にある場合には、マニピュレータでホールティングピペットを操作して卵子92を回転させて、顕微授精に影響のない位置に移動させる。紡錘体の位置は第一極体の近くにある場合が多いが、第一極体と離れた位置にある場合もあるため、この確認作業が必要となる。
最後に、観察倍率20XのRC観察で顕微授精を行う(ステップS23)。つまり、マニピレータを操作して精子を注入したマイクロピペットを卵子92に突き刺して精子を卵子92の中に導入する。この際、ステップS11と同様に、記憶部91に観察方法毎に記憶されたコントラスト設定が自動的に読み出されてポラライザ68の回転角度が調整されることで、コントラストが調整されたRC観察下で顕微授精を行うことができる。
顕微鏡60によれば、図13に示されるように、RC観察とPO観察を用いて紡錘体94の存在と位置を事前に確認することで、RC観察で紡錘体94を傷つけることなく卵子92に精子を導入することが可能である。従って、紡錘体94を針で傷をつけてしまう事態を回避することができるため、顕微授精を高い確率で成功させることができる。
なお、上述したように顕微鏡60では、紡錘体94の存在と位置について十分に目視で確認することができるが、その形状については十分に目視で確認できない場合がある。紡錘体94の形状は卵子の異常と関係している可能性が高く、紡錘体の形状の確認は受精率の向上に役立つ可能性が高い。このため、撮像素子77からの電気信号を受信したドライバ89が出力する卵子の偏光観察画像に対して、画像処理部90がさらにコントラストを強調する画像処理を施してもよい。コントラストを強調して紡錘体94の形状が強調された画像は、顕微授精中に確認できるようにモニタ64に表示されてもよく、また、ハードディスクや光ディスクからなる記憶部91に記憶されて後の研究等で使用してもよい。これにより、紡錘体異常を確認することが可能となり、受精率の向上に役立つ可能性が高い。
また、顕微鏡60は、明視野観察、RC観察、PO観察、DIC観察を切替えることができる顕微鏡として示されているが、顕微鏡60は、RC観察とPO観察のみが切替えられるように構成されてもよい。この場合、コンデンサターレット70内のDICプリズム82と、対物レンズ側に配置されたDICプリズム75とを省略することができるため、顕微鏡の構成を簡素化することができる。
1、22、23、30、40、50、60、100・・・顕微鏡、2、65a・・・光源、3、9、18、31、36、41、48、51、59、101、104・・・偏光板、4、58、69・・・コンペンセータ、5、32、42、52、70・・・コンデンサターレット、6、33、43、53、71、110・・・コンデンサレンズ、7、11、34、54・・・開口板、8、12、35、55、81、102・・・開口、10、17、44、47、75、82・・・DICプリズム、13、37、45、56、95、106・・・標本、14、14a、16、38、46、57、74、111・・・対物レンズ、15、39、108・・・モジュレータ、15a、15b、15c、39a、39b、39c、108a、108b、108c・・・領域、19・・・駆動制御手段、20・・・メモリ、21、73・・・レボルバ、24、85・・・結像レンズ、25、66b、87・・・ミラー、26、28・・・リレーレンズ、27・・・ターレット、29、80、109・・・接眼レンズ、61・・・顕微鏡本体、62・・・ハンドスイッチ部、63・・・コントロールボックス、64・・・モニタ、65・・・ランプハウス、65b・・・コレクタレンズ、66・・・照明支柱、66a・・・照明レンズ、67・・・コンデンサユニット、68・・・ポラライザ、72・・・ステージ、72a・・・ヒートステージ、76・・・アナライザ、77・・・撮像素子、78・・・ハンドル部、79・・・鏡筒、83、84・・・RC観察用開口板、86・・・光路分割プリズム、88・・・リレーレンズ、89・・・ドライバ、90・・・画像処理部、91・・・記憶部、92・・・卵子、93・・・第一極体、94・・・紡錘体、103・・・スリット開口板、105、107・・・レンズ、AX・・・光軸
Claims (13)
- 光源と、
前記光源からの光を標本に照射するコンデンサレンズと、
前記標本を挟んで前記コンデンサレンズと対向する対物レンズと、
前記光源と前記コンデンサレンズの間に配置された第1の偏光板と、
前記第1の偏光板と前記コンデンサレンズの間に配置され、内部に複数の光学素子を配置したコンデンサターレットと、
前記対物レンズよりも像側に配置された第2の偏光板と、
前記第1の偏光板と前記第2の偏光板の間に配置されたコンペンセータと、を含み、
観察法に応じて、前記コンデンサターレットの内部に配置された前記複数の光学素子の間で、光路上に配置される光学素子が、前記コンデンサターレットの回転により切り替わる
ことを特徴とする顕微鏡。 - 請求項1に記載の顕微鏡において、
前記コンデンサターレットの内部に配置された前記複数の光学素子は、
レリーフコントラスト観察用の光学素子と、
偏光観察用の開口板と、を含む
ことを特徴とする顕微鏡。 - 請求項1に記載の顕微鏡において、
前記コンペンセータは、前記コンデンサターレットと前記第1の偏光板の間に配置される
ことを特徴とする顕微鏡。 - 請求項1に記載の顕微鏡において、
前記対物レンズと前記コンデンサレンズの各々が有する歪みが2nm以下である
ことを特徴とする顕微鏡。 - 請求項1に記載の顕微鏡において、
前記コンデンサターレットの内部に配置された前記複数の光学素子は、
レリーフコントラスト観察用の光学素子と、
微分干渉観察用の第1のDICプリズムと、
偏光観察用の開口板と、を含み、
前記顕微鏡は、さらに、前記対物レンズと前記第2の偏光板の間に挿脱可能に配置された第2のDICプリズムを含む
ことを特徴とする顕微鏡。 - 請求項1に記載の顕微鏡において、さらに、
前記コンデンサターレットを電動で回転させる第1の制御手段と、
前記コンペンセータのリターデーションを電動で変更する第2の制御手段と、
前記第1の偏光板を電動で回転させる第3の制御手段と、を含む
ことを特徴とする顕微鏡。 - 請求項6に記載の顕微鏡において、さらに、
観察法毎の設定が記憶された記憶手段を含み、
観察法が指定されたときに、前記第3の制御手段は、前記記憶手段に記憶されている指定された観察法の設定に従って、前記第1の偏光板の回転角度を変更する
ことを特徴とする顕微鏡。 - 請求項7に記載の顕微鏡において、さらに、
前記標本からの光を分割して目視観察用の光路と撮像用の光路に導く光路分割手段を含む
ことを特徴とする顕微鏡。 - 請求項8に記載の顕微鏡において、さらに、
前記標本である卵子の偏光観察像を取得し、前記偏光観察像にコントラスト強調処理を行い、処理後の画像を記憶する装置を含む
を満たすことを特徴とする顕微鏡。 - 請求項1に記載の顕微鏡を用いた顕微授精方法であって、
前記第1の偏光板の回転角度を調整して、コントラストが調整されたレリーフコントラスト観察で卵子の形態を観察するステップと、
前記第1の偏光板と前記第2の偏光板をクロスニコル状態に設定して、偏光観察で卵子の紡錘体を観察するステップと、
前記第1の偏光板の回転角度を調整して、コントラストが調整されたレリーフコントラスト観察で顕微授精を行うステップと、を含む
ことを特徴とする顕微授精方法。 - 請求項10に記載の顕微授精方法において、
前記対物レンズを切替えることなく、前記レリーフコントラスト観察と前記偏光観察が行われる
ことを特徴とする顕微授精方法。 - 請求項10に記載の顕微授精方法において、
前記コンデンサターレットの内部に配置された前記複数の光学素子は、
レリーフコントラスト観察用の光学素子と、
偏光観察用の開口板と、を含み、
前記第1の偏光板の回転角度が電動で変更される
ことを特徴とする顕微授精方法。 - レリーフコントラスト観察と微分干渉観察と偏光観察を選択的に行う顕微鏡であって、
光源と、
前記光源からの光を標本に照射するコンデンサレンズと、
前記標本を挟んで前記コンデンサレンズと対向する対物レンズと、
前記光源と前記コンデンサレンズの間に配置された第1の偏光板と、
前記第1の偏光板と前記コンデンサレンズの間に配置されたコンデンサターレットと、
前記第1の偏光板と前記コンデンサターレットの間に配置されたコンペンセータと、を含み、
前記コンデンサターレットは、DICプリズムと、レリーフコントラスト用の光学素子と、を含み、
観察法に応じて、前記コンデンサターレットの内部で光路上に配置される光学素子が、前記コンデンサターレットの回転により、切り替わり、
前記コンペンセータのリターデーションを変更することにより、前記標本の画像のコントラストを調整する
ことを特徴とする顕微鏡。
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