JP6850600B2 - 標準試料および顕微鏡の調整方法 - Google Patents

Description

本発明は、偏光観察法でステージ上に載置された卵子内における紡錘体を観察する顕微鏡に用いられる標準試料および標準試料を用いた顕微鏡の調整方法に関する。

従来、顕微鏡の一用途として、高度生殖医療の分野における顕微授精が知られている。顕微授精は、顕微鏡下で精子と卵子とを授精させる方法であり、例えば精子が納められたマイクロピペットをホールディングピペットで固定された卵子に突き刺して卵子に精子を注入する卵細胞質内精子注入法（Intracytoplasmic Sperm Injection：以下、「ＩＣＳＩ」という）が知られている。このＩＣＳＩでは、ステージ上で標本を操作するため、ステージの上方に大きな作業空間を有する倒立顕微鏡を用いることが一般的である。

また、近年、顕微授精の分野では、卵子の授精率を向上させるため、複数の観察法を適宜切り替えながら顕微鏡を使用する顕微授精の方法が注目されている。たとえば、卵子を立体的に観察可能なレリーフコントラスト観察法（以下、「ＲＣ観察法」という）と、卵子の紡錘体の位置を観察可能な偏光観察法（以下、「ＰＯ観察法」という）を、観察目的に応じて切り替えながら使用する方法が普及しつつある（例えば特許文献１を参照）。

特開２０１４−９２６４１号公報

ところで、上述した従来の顕微鏡では、ユーザがＰＯ観察法で観察した際に、卵子内の紡錘体を確認できないことがある。その主な原因として、卵子の状態に起因するものと、ＰＯ観察法で用いる顕微鏡の光学素子の調整不足に起因するものがある。この原因のうち、ＰＯ観察法で用いる顕微鏡の光学素子の調整状態を確認することができれば、卵子内の紡錘体を確認できない場合、卵子の状態に起因するものと判断することができる。また、卵子内の紡錘体は、時折、標準的な位置とは異なる位置に存在する場合があるので、このような場合には同じ調整状態で複数の卵子を連続して観察することが困難である。このため、ＰＯ観察法で用いる顕微鏡の光学素子の調整状態を顕微鏡観察下で確認することができる技術が望まれていた。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、ＰＯ観察法で卵子内の紡錘体を確認する前に、ＰＯ観察法で用いる光学素子の調整不足を判断することができる標準試料および顕微鏡の調整方法を提供することを目的とする。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明に係る標準試料は、偏光観察法によって試料に処置を行う顕微鏡の調整に用いられる標準試料であって、第１の部位と、前記第１の部位と隣接し、卵子内の紡錘体と同等のリタデーションを有する第２の部位と、を備え、前記第１の部位と第２の部位は、リタデーションが異なることを特徴とする。

また、本発明に係る標準試料は、上記発明において、当該標準試料の外径は、１０ｍｍ以下であることを特徴とする。

また、本発明に係る標準試料は、上記発明において、当該標準試料の外径は、５±２ｍｍ以下であることを特徴とする。

また、本発明に係る標準試料は、上記発明において、前記第２の部位のリタデーションの範囲が２〜５ｎｍであることを特徴とする。

また、本発明に係る標準試料は、上記発明において、前記第１の部位は、生体組織と同等なリタデーションを有する。

また、本発明に係る標準試料は、上記発明において、当該標準試料は、外観が環状の一部または全部であることを特徴とする。

また、本発明に係る標準試料は、上記発明において、前記第１の部位および前記第２の部位は、染色されていることを特徴とする。

また、本発明に係る標準試料は、上記発明において、前記第１の部位および前記第２の部位は、組織固定液によって固定されていることを特徴とする。

また、本発明に係る標準試料は、上記発明において、前記第１の部位および前記第２の部位は、少なくとも精巣由来であることを特徴とする。

また、本発明に係る標準試料は、上記発明において、前記第２の部位は、前記精巣の外周を覆う薄膜領域であることを特徴とする。

また、本発明に係る顕微鏡の調整方法は、偏光観察法で用いられる複数の光学素子を備えた顕微鏡の調整方法であって、上記発明の標準試料に対して、偏光コントラストの反転前後において前記第２の部位の観察像のコントラストの変化を観察できない場合、前記複数の光学素子のいずれか一つ以上を操作することによって前記観察像のコントラストを調整する調整ステップを含むことを特徴とする。

本発明によれば、ＰＯ観察法で卵子内の紡錘体を確認する前にＰＯ観察法で用いる光学素子の調整不足を判断することができるという効果を奏する。

図１は、本発明の一実施の形態に係る標準試料の組織切片を示す図である。 図２Ａは、偏光コントラストの反転前における図１の領域Ａを拡大した拡大図である。 図２Ｂは、偏光コントラストの反転後における図１の領域Ａを拡大した拡大図である。 図３は、本発明の一実施の形態に係る標準試料の製造方法の概要を示すフローチャートである。 図４Ａは、ブアン液で固定した標準試料ＳＰ１に対する偏光コントラストの反転前の拡大図である。 図４Ｂは、ブアン液で固定した偏光コントラストの反転後の拡大図である。 図５Ａは、一般的な組織固定方法で固定した標準試料ＳＰ１に対する偏光コントラストの反転前の拡大図である。 図５Ｂは、一般的な組織固定方法で固定した標準試料ＳＰ１に対する偏光コントラストの反転後の拡大図である。 図６Ａは、ヘマトキシリン染色を行った標準試料ＳＰ１に対する偏光コントラストの反転前の拡大図である。 図６Ｂは、ヘマトキシリン染色を行った標準試料ＳＰ１に対する偏光コントラストの反転後の拡大図である。 図７Ａは、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った標準試料ＳＰ１に対する偏光コントラストの反転前の拡大図である。 図７Ｂは、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った標準試料ＳＰ１に対する偏光コントラストの反転後の拡大図である。 図８Ａは、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った標準試料ＳＰ１に対する偏光コントラストの反転前の拡大図である。 図８Ｂは、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った標準試料ＳＰ１に対する偏光コントラストの反転後の拡大図である。 図９は、本発明の一実施の形態に係る顕微鏡の構成を示す概念図である。 図１０は、本発明の一実施の形態に係る顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。 図１１は、図９に示す顕微鏡のコンデンサターレットの構成を示す図である。 図１２は、標本を含むシャーレの平面図である。 図１３は、図１２のＡ−Ａ線断面図である。 図１４は、本発明の一実施の形態に係る顕微鏡の操作入力部の構成を模式的に示す図である。 図１５は、図１０に示す顕微鏡の記録部における設定情報記録部が記録する設定情報を示す図である。 図１６は、本発明の一実施の形態に係る顕微鏡が実行するＰＯ観察法における各ユニットの配置を模式的に示す図である。 図１７は、本発明の一実施の形態に係る顕微鏡の調整方法の概要を示すフローチャートである。

以下、本発明の実施の形態に係る標準試料について、図面を参照しながら説明する。なお、以下の説明において、ＩＣＳＩ可能な顕微鏡を例示するが、この実施の形態によって本発明が限定されるものではない。また、以下の説明において、各図は本発明の内容を理解でき得る程度に形状、大きさ、および位置関係を概略的に示してあるに過ぎない。従って、本発明は各図で例示された形状、大きさ、および位置関係のみに限定されるものではない。なお、図面の記載において、同一部分には同一の符号を付している。

〔標準試料〕
図１は、本発明の一実施の形態に係る標準試料の組織切片を示す図である。図２Ａは、偏光コントラストの反転前における図１の領域Ａを拡大した拡大図である。図２Ｂは、偏光コントラストの反転後における図１の領域Ａを拡大した拡大図である。なお、図１においては、観察倍率を２０倍でＰＯ観察を行っている状況下を示す。

図１、図２Ａおよび図２Ｂに示す標準試料ＳＰ１は、第１の部位ＳＰ２と、第１の部位ＳＰ２と隣接し、卵子内の紡錘体と同等のリタデーションを有する第２の部位ＳＰ３と、を備える。第１の部位ＳＰ２は、生体組織と同等なリタデーション（複屈折により光学的に生じる位相差）を有する。ここで、生体組織と同等なリタデーションとは、紡錘体の背景となる卵子の細胞領域を想定しており、２ｎｍ未満、場合によってはゼロ（実質的に位相差がゼロの値の場合）であり得る。また、卵子内の紡錘体と同等のリタデーションとは、リタデーションの範囲が２〜５ｎｍである。即ち、第１の部位ＳＰ２および第２の部位ＳＰ３は、互いのリタデーションが異なる。また、標準試料ＳＰ１は、観察像として観察される外観が環状、好ましくは円または楕円状をなし、その外径ｄは１０ｍｍ以下であればよいが、好ましくは５±２ｍｍ以下である。なお、標準試料ＳＰ１の形状は、環状である必要はなく、例えば標準試料ＳＰ１の一部の環状部分を切り出して使用してもよい。環状の一部分または全体を使用することで、卵子と同様に異なるリタデーションが隣接した状態になるので、顕微操作による調整作業を行い易いという利点がある。また、標準試料ＳＰ１は、マウスの精巣由来である。ここで、精巣由来としては、マウス、豚、牛および馬等の哺乳類動物由来であり、人は除かれる。もちろん、精巣由来として、例えば両生類や魚類であってもよい。さらに、第１の部位ＳＰ２は、精巣中隔であり、第２の部位ＳＰ３は、精巣中隔の外周を覆う薄膜領域（白膜）である。

また、標準試料ＳＰ１は、組織固定液によって固定されている。組織固定液としては、ブアン液（bouin’s Fluid）が好ましい。さらに、第１の部位ＳＰ２および第２の部位ＳＰ３は、染色液によって染色されている。染色液としては、好ましくはヘマトキシリン溶液（Hematoxylin）およびヘマトキシリン・エオシン溶液（Hematoxylin-Eosin）を用いられる。より好ましくは、ヘマトキシリン溶液が用いられる。また、標準試料ＳＰ１は、スライドガラスＳＰ４に載置され、封入剤が注入されてカバーガラス（図示せず）が被されている。

〔標準試料の製造方法〕
次に、標準試料ＳＰ１の製造方法について説明する。図３は、標準試料ＳＰ１の製造方法の概要を示すフローチャートである。なお、以下においては、標準試料ＳＰ１における第１の部位ＳＰ２および第２の部位ＳＰ３の各々のリタデーション等や各試薬による効果の違いを説明するため、既に作製済みの標準試料ＳＰ１に対してＰＯ観察法で観察した場合における標準試料ＳＰ１の偏光コントラストの反転前後における拡大図を補助的に用いて説明する。

図３に示すように、まず、ユーザは、マウスの精巣を取得し（ステップＳ１）、ブアン液で固定して包理する（ステップＳ２）。

図４Ａは、ブアン液で固定した標準試料ＳＰ１に対する偏光コントラストの反転前の拡大図である。図４Ｂは、ブアン液で固定した偏光コントラストの反転後の拡大図である。図５Ａは、一般的な組織固定方法で固定した標準試料ＳＰ１に対する偏光コントラストの反転前の拡大図である。図５Ｂは、一般的な組織固定方法で固定した標準試料ＳＰ１に対する偏光コントラストの反転後の拡大図である。

図４Ａおよび図４Ｂに示すように、マウスの精巣は、ブアン液によって固定された場合、精巣管等で構成されている中心部の第１の部位ＳＰ２の組織から第２の部位ＳＰ３が剥離しない。これに対して、図５Ａおよび図５Ｂに示すように、マウスの精巣は、一般的な組織固定方法で用いられるホルマリン液やパラホルムアルデヒド液を用いた場合、第１の部位ＳＰ２から第２の部位ＳＰ３が剥離する。この場合、第２の部位ＳＰ３は、顕微鏡の同視野内において、偏光像が黒く観察される部位と白く観察する部位とが混合する。このため、ユーザは、一般的な組織固定方法で固定されたマウスの精巣を顕微鏡でＰＯ観察法によって観察した後に、卵子内の紡錘体をＰＯ観察法で観察を行う場合、紡錘体が白く観察されるべきなのか、黒く観察されるべきなのかを判断することができない。しかしながら、図４Ａおよび図４Ｂに示すように、ユーザは、標準試料ＳＰ１を用いて顕微鏡でＰＯ観察法によって観察した後に、卵子内の紡錘体の観察を行う場合、コントラストの反転前後で第１の部位ＳＰ２および第２の部位ＳＰ３のコントラストが別々に反転するので、第１の部位ＳＰ２と第２の部位ＳＰ３とを容易に識別することができる。

図３に戻り、ステップＳ２以降の説明を続ける。
ステップＳ２の後、ユーザは、ブアン液で固定し、包理したマウスの精巣を用いて、組織切片を作製する（ステップＳ３）。

続いて、スライドガラスまたはシャーレ等に載置された組織切片に対してヘマトキシリン液を用いてヘマトキシリン染色を行う（ステップＳ４）。

図６Ａは、ヘマトキシリン染色を行った標準試料ＳＰ１に対する偏光コントラストの反転前の拡大図である。図６Ｂは、ヘマトキシリン染色を行った標準試料ＳＰ１に対する偏光コントラストの反転後の拡大図である。図７Ａは、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った標準試料ＳＰ１に対する偏光コントラストの反転前の拡大図である。図７Ｂは、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った標準試料ＳＰ１に対する偏光コントラストの反転後の拡大図である。図８Ａは、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った標準試料ＳＰ１に対する偏光コントラストの反転前の拡大図である。図８Ｂは、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った標準試料ＳＰ１に対する偏光コントラストの反転後の拡大図である。

図６Ａおよび図６Ｂに示すように、組織切片は、ヘマトキシリン液を用いてヘマトキシリン染色を行った場合、第２の部位ＳＰ３（白膜）に対して所望の偏光像を観察することができる。これに対して、図７Ａおよび図７Ｂに示すように、組織切片は、一般的なヘマトキシリン・エオシン液を用いてヘマトキシリン・エオシン染色した場合、第２の部位ＳＰ３に所定の偏光像（白い偏光像）と異なる偏光像（黄色い偏光像）が観察される。この黄色い偏光像は、卵子内の紡錘体で観察される白い観察像（紡錘体）と著しく異なる。マウスの精巣の白膜は、エオシン陽性であり、エオシン染色によって何らかの偏光特性を持つことが考えられるが、図８Ａおよび図８Ｂに示すように、へマトキシリン・エオシン液を用いた場合であっても、第２の部位ＳＰ３（白膜）に対して所望の偏光像を観察することができる場合がある。このため、本発明の一実施の形態では、組織切片に対しては、好ましくはヘマトキシリン・エオシン液またはヘマトキシリン液を用いて染色することが望ましく、より好ましくは、ヘマトキシリン液を用いて染色することが望ましい。

図３に戻り、ステップＳ４以降の説明を続ける。
ステップＳ４の後、ユーザは、ヘマトキシリン染色を行ったスライドガラス上の組織切片に対して、封入剤を注いでカバーガラスを配置する（ステップＳ５）。

その後、ユーザは、ＰＯ観察法が可能な顕微鏡を用いて標準試料ＳＰ１に対してＰＯ観察する（ステップＳ６）。この場合、ユーザは、互いに異なる第１の部位ＳＰ２および第２の部位ＳＰ３のリタデーションを観察することによって、標準試料ＳＰ１が適切に製作できたか否かを目視によって判断する。ステップＳ６の後、標準試料ＳＰ１の作製を終了する。

このような方法によって製作された標準試料ＳＰ１は、ＰＯ観察法で卵子内の紡錘体を確認する前に、ＰＯ観察法によって第２の部位ＳＰ３を観察することで、ＰＯ観察法で用いる光学素子の調整不足を判断することができる。

次に、上述した標準試料ＳＰ１を用いて顕微鏡でＩＣＳＩを行う際の顕微鏡の調整方法について説明する。なお、以下においては、顕微鏡の調整方法の説明に先立って、本発明の一実施の形態に係る顕微鏡の構成を説明後、本発明の一実施の形態に係る顕微鏡の調整方法について説明する。

〔顕微鏡の構成〕
図９は、本発明の一実施の形態に係る顕微鏡の構成を示す概念図である。図１０は、本発明の一実施の形態に係る顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。図９および図１０において、顕微鏡１が載置される平面をＸＹ平面とし、ＸＹ平面と垂直な方向をＺ方向として説明する。

図９および図１０に示す顕微鏡１は、標本ＳＰが収容されたシャーレ１００を観察する顕微鏡本体部２と、顕微鏡１の各種の操作の入力を受け付ける操作入力部３と、顕微鏡本体部２が撮像した画像データに対応する画像を表示する表示部４と、顕微鏡１を駆動する各種プログラムやパラメータ等を記録する記録部５と、顕微鏡本体部２および表示部４を制御する制御部６と、を備える。顕微鏡本体部２、操作入力部３、表示部４、記録部５および制御部６は、データが送受信可能に有線または無線で接続されている。

まず、顕微鏡本体部２について詳細に説明する。顕微鏡本体部２は、光源１０と、ポラライザ１１と、コンペンセータ１２と、コンデンサターレット１３と、コンデンサレンズ１４と、ステージ１５と、ステージ位置検出部１６と、レボルバ１７と、対物レンズ１８と、レボルバ位置検出部１９と、ＤＩＣプリズム２０と、アナライザ２１と、結像レンズ２２と、光路分割プリズム２３と、撮像部２４と、ミラー２５と、接眼レンズ２６と、駆動部２７と、を備える。

光源１０は、ハロゲンランプ、キセノンランプまたはＬＥＤ（Light Emitting Diode）等によって構成される。光源１０は、照明光を標本ＳＰに向けて出射する。

ポラライザ１１は、光源１０とコンペンセータ１２との光軸ＸＡ上に配置され、光源１０が照射する照明光の１方向の偏光成分のみを透過させる。ポラライザ１１は、光源１０の光路の光軸ＸＡを中心にして回転可能に配置される。ポラライザ１１は、フィルタ等の光学素子の１つである偏光板を用いて構成される。また、ポラライザ１１は、駆動部２７の駆動制御のもと、ステッピングモータまたはＤＣモータ等によって構成されたモータ１１ａによって光軸ＸＡを中心にして回転させられる。

コンペンセータ１２は、標本ＳＰの異方性による位相差（リタデーション）を測定するための光学素子であり、ポラライザ１１を透過した光のリタデーションを調整する。コンペンセータ１２は、対物レンズ１８の光軸を中心として回転可能にコンデンサレンズ１４とポラライザ１１との間の光路上に配置される。コンペンセータ１２は、液晶または波長板を用いて構成される。具体的には、コンペンセータ１２は、ベレークコンペンセータ、セナルモン式コンペンセータ、ブレースケーラコンペンセータ、石英楔コンペンセータおよび液晶変調素子を用いて構成される。コンペンセータ１２としては、卵子の紡錘体を観察するＰＯ観察法を行う際に視野のリタデーションがほぼ均一となることが望ましいため、液晶変調素子、セナルモン式コンペンセータ、ブレースケーラコンペンセータが好ましい。なお、コンペンセータ１２として、液晶変調素子を用いる場合、液晶分子を電気的に制御することによって、リタデーションを変化させることができる。また、コンペンセータ１２として、セナルモン式コンペンセータを用いる場合、コンペンセータ１２内の波長板に対するポラライザ１１の回転によって、コンペンセータ１２のリタデーションを変化させることができる。さらに、コンペンセータ１２として、ブレースケーラコンペンセータを用いる場合、コンペンセータ１２内のプリズムの回転によって、コンペンセータ１２のリタデーションを変化させることができる。さらにまた、コンペンセータ１２は、駆動部２７の駆動制御のもと、ステッピングモータまたはＤＣモータ等によって構成されたモータ１２ａによって光軸ＸＡを中心にして回転させられる。

コンデンサターレット１３は、観察方法や倍率に応じて切り替えて用いられる複数の光学素子を有し、光軸ＸＡ上に回転可能に配置される。コンデンサターレット１３は、観察方法に応じて回転させられることによって、いずれかの光学素子を光軸ＸＡ上に配置する。また、コンデンサターレット１３は、駆動部２７の駆動制御のもと、ステッピングモータまたはＤＣモータ等によって構成されたモータ１３ａによって回転させられる。

図１１は、コンデンサターレット１３の構成を示す図である。図１１に示すように、コンデンサターレット１３は、開口１３０と、ＲＣ観察用開口板１３１と、ＲＣ観察用開口板１３２と、ＤＩＣプリズム１３３と、を有する。

開口１３０は、コンデンサターレット１３とともに開口板（空穴）を構成する。開口１３０は、光源１０からの照明光を遮らない十分な大きさで形成され、開口数の高い照明を実現する。開口１３０は、たとえば、顕微鏡１が明視野観察またはＰＯ観察法を行う際に用いられる。具体的には、開口１３０は、顕微鏡１が明視野観察を行う場合、ユーザが顕微授精の準備のため、４倍または１０倍の対物レンズ１８を用いてシャーレ１００内における場所探しやマニピュレータによって操作されるマイクロピペットの針先の位置決め等を行う際に用いられる。

ＲＣ観察用開口板１３１は、ＲＣ観察に用いられる開口板であり、光軸ＸＡ上に配置された際に光軸ＸＡから偏心した位置に形成された開口１３１ａの一部に偏光板１３１ｂを有する。開口１３１ａは、ＲＣ観察用開口板１３１の中心からずれた位置に形成されることによって偏射照明を実現する。ＲＣ観察用開口板１３１は、たとえば、顕微鏡１が２０倍のＲＣ観察法を行う場合に用いられる。

ＲＣ観察用開口板１３２は、ＲＣ観察に用いられる開口板であり、光軸ＸＡ上に配置された際に光軸ＸＡから偏心した位置に形成された開口１３２ａの一部に偏光板１３２ｂを有する。開口１３２ａは、ＲＣ観察用開口板１３２の中心からずれた位置に形成されることによって偏射照明を実現する。ＲＣ観察用開口板１３２は、たとえば、顕微鏡１が４０倍のＲＣ観察法を行う場合に用いられる。

ＤＩＣプリズム１３３は、コンデンサターレット１３の回転により光軸ＸＡ上に配置される。ＤＩＣプリズム１３３は、後述する対物レンズ１８側の像側に配置されたＤＩＣプリズム２０と対を成し、微分干渉光学系を構成する。ＤＩＣプリズム１３３は、ノマルスキープリズム等を用いて構成される。ＤＩＣプリズム１３３は、たとえば、顕微鏡１が６０倍のＤＩＣ観察法を行う際に用いられる。

このように構成されたコンデンサターレット１３は、観察法に応じて、コンデンサターレット１３がモータ１３ａによって回転させられることによって、光軸ＸＡ上に配置される光学素子が切り替えられる。具体的には、コンデンサターレット１３は、ＲＣ観察を行う場合、ＲＣ観察用開口板１３１またはＲＣ観察用開口板１３２が光軸ＸＡ上に配置され、ＤＩＣ観察法を行う場合、ＤＩＣプリズム１３３が光軸ＸＡ上に配置され、明視野観察法またはＰＯ観察法を行う場合、開口１３０が光軸ＸＡ上に配置される。

コンデンサレンズ１４は、光軸ＸＡ上に配置され、光源１０から出射された照明光を集光し、シャーレ１００内の標本ＳＰを含む領域に対して均一に照射する。なお、コンデンサレンズ１４は、光源１０から出射された照明光の光量を調整可能な視野絞りと、視野絞りの径を変化させる視野絞り操作部とを設けてもよい。

ステージ１５は、ＸＹＺ方向に移動自在に構成されている。ステージ１５は、駆動部２７によってＸＹ平面内およびＺ方向に移動する。ステージ１５は、標本Ｓが配置されたシャーレ１００が載置される。ステージ１５は、制御部６の制御のもと、ステージ位置検出部１６によってＸＹ平面における所定の原点位置が検出され、この原点位置を基点として駆動部２７の駆動量が制限されることによって、標本ＳＰ上の所望の観察箇所（観察領域）に移動する。また、ステージ１５は、制御部６の制御のもと、ステージ位置検出部１６によってＺ方向における位置が検出され、この位置を基準として駆動部２７の駆動量が制限されることによって、標本ＳＰに対するコンデンサレンズ１４および対物レンズ１８のピントが合う位置（合焦位置）に移動する。また、ステージ１５は、駆動部２７の駆動制御のもと、ステッピングモータまたはＤＣモータ等によって構成されたモータ１５ａによってＸＹ平面内およびＺ方向に移動させられる。なお、ステージ１５には、シャーレ１００を一定温度に保持する加温部を設けてもよい。また、ステージ１５は、電動である必要はなく、手動で移動可能であってもよい。

ここで、標本Ｓが配置されたシャーレ１００について詳細に説明する。図１２は、標本Ｓを含むシャーレ１００の平面図である。図１３は、図１２のＡ−Ａ線断面図である。図１２および図１３に示すように、顕微授精で用いられるシャーレ１００は、卵子に精子を授精させるＩＣＳＩ用ドロップＲ１（培養液）および精子を選別する精子選別用ドロップＲ２（培養液）が形成され、各ドロップが空気に触れて細菌に感染することと乾燥とを防止するミネラルオイルＷａによって覆われている。なお、シャーレ１００上におけるドロップの数は、適宜変更することができる。

ステージ位置検出部１６は、エンコーダや光フォトインタラプタ等を用いて構成され、ステージ１５のＸＹ平面およびＺ方向におけるステージ１５のステージ位置を検出し、この検出結果を制御部６に出力する。なお、ステージ位置検出部１６は、制御部６から入力される駆動信号に応じて駆動する駆動部２７のパルス数に基づいて、ステージ１５のステージ位置を検出し、この検出結果を制御部６に出力してもよい。

レボルバ１７は、複数の対物レンズ１８が装着される。レボルバ１７は、光軸ＸＡに対して回転自在に設けられ、対物レンズ１８を標本ＳＰの下方に配置する。レボルバ１７は、スイングレボルバ等を用いて構成される。レボルバ１７は、駆動部２７の駆動制御のもと、ステッピングモータまたはＤＣモータ等によって構成されたモータ１７ａによって回転させられる。また、レボルバ１７は、光軸ＸＡ方向に沿って移動可能に設けられ、駆動部２７によってＺ方向の上下方向へ移動する。なお、レボルバ１７に対して、試料側を光軸ＸＡ方向に移動させる焦準機構を別途設けてもよい。

対物レンズ１８は、標本Ｓを挟んでコンデンサレンズ１４と対向する光軸ＸＡ上の位置に配置される。対物レンズ１８は、対物レンズ１８１と、対物レンズ１８２と、対物レンズ１８３と、を有する。対物レンズ１８１は、卵子の観察に適した倍率、たとえば１０倍または２０倍等の低倍率を有する対物レンズであり、ＲＣ観察法に用いられる。対物レンズ１８１は、対物レンズ１８１の瞳位置に、透過率の異なる３つの領域を有するモジュレータ１８１１を有する。モジュレータ１８１１は、１００％の透過率を有する領域１８１１ａと、２５％程度の透過率を有する領域１８１１ｂと、０％の透過率を有する領域１８１１ｃと、を有する。モジュレータ１８１１は、コンデンサレンズ１４の瞳位置に配置されたＲＣ観察用開口板１３１およびＲＣ観察用開口板１３２と光学的に共役な関係を有する。また、対物レンズ１８１は、卵子の紡錘体を主な観察対象とし、ほぼ同程度の倍率が要求されるＰＯ観察法にも適用される。対物レンズ１８２は、精子の観察に適した倍率、たとえば６０倍または１００倍等の高倍率を有する対物レンズであり、ＤＩＣ観察法に用いられる。対物レンズ１８３は、マイクロピペットの針先の観察に適した倍率、たとえば、４倍の低倍率を有する対物レンズであり、明視野観察に用いられる。

レボルバ位置検出部１９は、レボルバ１７のＺ方向における位置を検出し、この検出結果を制御部６へ出力する。レボルバ位置検出部１９は、エンコーダや光フォトインタラプタ等を用いて構成される。なお、レボルバ位置検出部１９は、制御部６から入力される駆動信号に応じて駆動する駆動部２７のパルス数に基づいて、レボルバ１７のＺ方向における位置を検出し、この検出結果を制御部６に出力してもよい。

ＤＩＣプリズム２０は、ＤＩＣプリズム１３３と対を成し、微分干渉光学系を構成する。ＤＩＣプリズム２０は、ノマルスキープリズム等を用いて構成される。ＤＩＣプリズム２０は、対物レンズ１８とアナライザ２１との間の光軸ＸＡ上に対して挿脱可能に配置される。また、ＤＩＣプリズム２０は、駆動部２７の駆動制御のもと、ステッピングモータまたはＤＣモータ等によって構成されたモータ２０ａによって光軸ＸＡ上に配置される。

アナライザ２１は、対物レンズ１８の後段の観察側の光軸ＸＡ上に配置され、ポラライザ１１との相対的な位置関係に応じて標本ＳＰを透過した光の１方向の偏光成分のみを透過させる。具体的には、ポラライザ１１およびアナライザ２１は、互いに偏光方向が直交するクロスニコルの状態になるように配置される。また、アナライザ２１は、コンデンサターレット１３のＲＣ観察用開口板１３１の偏光板１３１ｂの振動方向に対して４５度方向になるように配置される。これにより、顕微鏡１は、観察に支障なくＲＣ観察法を行うことができる。なお、アナライザ２１は、光軸ＸＡ上に進退可能に配置されてもよい。

結像レンズ２２は、対物レンズ１８から出射された光を集光して観察像を結像する。結像レンズ２２は、一または複数のレンズを用いて構成される。

光路分割プリズム２３は、結像レンズ２２で結像された観察像の光を撮像部２４とミラー２５に分割する。光路分割プリズム２３は、接合面に光を分割するためのコーティングが施されたプリズムを用いて構成される。

撮像部２４は、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）またはＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）等の撮像素子を用いて構成され、結像レンズ２２および光路分割プリズム２３を経て入射された標本ＳＰの観察像を撮像して画像データを生成し、この画像データを制御部６へ出力する。

ミラー２５は、結像レンズ２２から出射された観察像を接眼レンズ２６へ向けて反射する。なお、ミラー２５と接眼レンズ２６との光路上に、複数のリレーレンズを設けてもよい。

接眼レンズ２６は、結像レンズ２２、光路分割プリズム２３およびミラー２５を介して入射された観察像を拡大する。接眼レンズ２６は、一または複数のレンズを用いて構成される。

駆動部２７は、駆動ドライバを用いて構成され、制御部６の制御のもと、顕微鏡本体部２の各光学素子を移動または回転させる。具体的には、駆動部２７は、制御部６の制御のもと、モータ１１ａ、モータ１２ａ、モータ１３ａ、モータ１５ａ、モータ１７ａ、モータ２０ａそれぞれを駆動することによって、ポラライザ１１、コンペンセータ１２、コンデンサターレット１３、ステージ１５、レボルバ１７、ＤＩＣプリズム２０およびアナライザ２１を所定の位置に回転または移動させる。

操作入力部３は、顕微鏡１の各種の操作の入力を受け付ける。操作入力部３は、キーボード、マウス、ジョイスティック、タッチパネルおよび各種ボタン等を用いて構成され、各種スイッチの操作入力に応じた操作信号を制御部６に出力する。

図１４は、操作入力部３の構成を示す図である。図１４に示すように、操作入力部３は、各観察法を指示する指示信号の入力を受け付けるボタンＢ１〜Ｂ５、コントラストを調整する指示信号の入力を受け付けるボタンＢ６，Ｂ７、対物レンズ１８の倍率を指示する指示信号の入力を受け付けるボタンＢ８〜Ｂ１３、ステージ１５の位置を登録する指示信号の入力を受け付けるボタンＢ１４、ステージ１５のＸＹ平面の移動を指示する指示信号の入力を受け付けるボタンＢ１５、およびステージ１５のＺ方向の移動を指示する指示信号の入力を受け付けるボタンＢ１６を有する。

表示部４は、液晶または有機ＥＬ（Electro Luminescence）等からなる表示パネルを用いて構成される。表示部４は、制御部６を介して撮像部２４から入力される画像データに対応する画像を表示する。

記録部５は、顕微鏡１に実行させる各種プログラム、プログラムの実行中に使用される各種データを記録する。記録部５は、フラッシュメモリおよびＲＡＭ（Random Access Memory）等の半導体メモリを用いて構成される。また、記録部５は、観察毎に光軸ＸＡ上における各光学素子それぞれの配置情報が含まれる。

図１５は、設定情報記録部５１が記録する設定情報を示す図である。図１５に示すように、設定情報Ｔ１には、各観察法に応じた各光学素子の位置情報が記録されている。具体的には、図１５に示すように、明視野観察法を行う場合、ポラライザ１１がアナライザ２１に対してパラニコル状態になるように配置され、コンペンセータ１２が光軸ＸＡ上に、コンデンサターレット１３の空穴（開口１３０）が光軸ＸＡ上に配置され、対物レンズ１８が４倍、ＤＩＣプリズム２０が光軸ＸＡ外に配置され、アナライザ２１が光軸ＸＡ上に配置される。

制御部６は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）等を用いて構成され、顕微鏡１を構成する各部の動作を統括的に制御する。制御部６は、操作入力部３から入力される操作信号に応じて、顕微鏡１を構成する各ユニットを駆動する。具体的には、制御部６は、操作入力部３から明視野観察を指示する指示信号が入力された場合、設定情報記録部５１が記録する設定情報を参照し、観察法に応じて、ポラライザ１１、コンペンセータ１２、コンデンサターレット１３、ステージ１５、レボルバ１７、ＤＩＣプリズム２０およびアナライザ２１をそれぞれ駆動させて光軸ＸＡ上に配置して指示信号の観察法に変更する。たとえば、制御部６は、操作入力部３から入力される指示信号に応じてＤＩＣ観察が指示された場合、駆動部２７を駆動することによって、レボルバ１７を回転させて対物レンズ１８２を光軸ＸＡ上に配置し、コンデンサターレット１３を回転させて光軸ＸＡ上にＤＩＣプリズム１３３、ＤＩＣプリズム２０を配置させる。また、制御部６は、顕微鏡１がＰＯ観察法を行う際に、リタデーションが０になる位置を基準に含む範囲で駆動部２７にコンペンセータ１２を駆動させることによって、リタデーションを増減させる。具体的には、制御部６は、リタデーションが０になる位置をまたぐ角度の範囲内で駆動部２７にコンペンセータ１２を繰り返し回転させる。

このように構成された顕微鏡１は、制御部６の制御のもと、ポラライザ１１、コンペンセータ１２、コンデンサターレット１３、レボルバ１７、ＤＩＣプリズム２０およびアナライザ２１それぞれの光軸ＸＡ上における配置位置を切り替えることで、明視野観察法、ＲＣ観察法、ＤＩＣ観察法を行うことができる。たとえば、制御部６は、顕微鏡１が観察法をＲＣ観察で行う場合、レボルバ１７を回転させることによって、対物レンズ１８１を光軸ＸＡ上に配置させるとともに、コンデンサターレット１３を回転させることによって、光軸ＸＡ上にＲＣ観察用開口板１３１を配置させる。さらに、制御部６は、ＤＩＣプリズム２０を光軸ＸＡ外に配置させる。これにより、顕微鏡１の観察法をＲＣ観察法に切り替えることができる。なお、ＤＩＣプリズム２０は、ＲＣ観察法の場合、光軸ＸＡ上に配置されていてもよい。

また、制御部６は、顕微鏡１が観察法をＤＩＣ観察法で行う場合、レボルバ１７を回転させることによって、対物レンズ１８２を光軸ＸＡ上に配置させるとともに、コンデンサターレット１３を回転させることによって、光軸ＸＡ上にＤＩＣプリズム１３３を配置させる。さらに、制御部６は、駆動部２７を駆動することによって、ＤＩＣプリズム２０を光軸ＸＡ上に配置させるとともに、光軸ＸＡを中心にポラライザ１１を回転させることによって、ポラライザ１１とアナライザ２１とをクロスニコルの状態にする。これにより、顕微鏡１の観察法をＤＩＣ観察法に切り替えることができる。

また、制御部６は、顕微鏡１が観察法をＰＯ観察法で行う場合、レボルバ１７を回転させることによって、対物レンズ１８１を光軸ＸＡ上に配置させるとともに、コンデンサターレット１３を回転させることによって、光軸ＸＡ上に開口１３０（空穴）を配置させる。さらに、制御部６は、光軸ＸＡを回転軸としてポラライザ１１を回転させることによって、ポラライザ１１とアナライザ２１とをクロスニコルの状態にする（図１６を参照）。これにより、制御部６は、顕微鏡１の観察法をＰＯ観察法（２０倍）に切り替えることができる。また、コンペンセータ１２は、ＰＯ観察法の場合、標本ＳＰを通過する光軸ＸＡを中心に任意の角度で回転させられる。

〔顕微鏡の調整方法〕
次に、上述した標準試料ＳＰ１を用いて顕微鏡１のＰＯ観察法を行う際の調整方法について説明する。図１７は、本発明の一実施の形態に係る標準試料ＳＰ１を用いて顕微鏡１のＰＯ観察法を行う際の調整方法の概要を示すフローチャートである。

図１７に示すように、まず、ユーザは、操作入力部３のボタンＢ４を押下することによって、顕微鏡１にＰＯ観察のための素子を設定する（ステップＳ１０１）。具体的には、制御部６は、操作入力部３から入力される指示信号に応じて、顕微鏡１を構成する各素子をＰＯ観察が可能な状態に設定する（上述した図１６を参照）。

続いて、ユーザは、ステージ１５上に標準試料ＳＰ１を載置し、標準試料ＳＰ１のＰＯ観察を行う（ステップＳ１０２）。

その後、ユーザは、標準試料ＳＰ１に対して目的の偏光像が観察できたか否かを判断する（ステップＳ１０３）。具体的には、標準試料ＳＰ１に対して第２の部位ＳＰ３（白膜）の偏光像のコントラストの変化を観察できたか否かを判断する。標準試料ＳＰ１に対して目的の偏光像を観察できた場合（ステップＳ１０３：Ｙｅｓ）、ユーザは、顕微鏡１の調整方法を終了し、卵子の紡錘体を観察しながら、ＩＣＳＩを行う。この場合において、ユーザは、卵子内の標準的な紡錘体の位置（卵子の第１極体の近傍）のみならず細胞全体を顕微鏡観察して、卵子の紡錘体を観察できないとき、顕微鏡１が調整済みであるため、卵子の状態が良くないと判断し、精子を注入することなく、別の卵子を用いて精子を注入する。一方、観察している卵子が形状等からＭ１期と判断された場合には、インキュベータ内でさらに培養を行った後に紡錘体の観察を再度行うのが望ましい。これに対して、標準試料ＳＰ１に対して目的の偏光像を観察できない場合（ステップＳ１０３：Ｎｏ）、ユーザは、上述したステップＳ１０１へ戻る。この場合、ユーザは、ＰＯ観察法に用いる各素子、例えばポラライザ１１やアナライザ２１に対して微調整を行い、再度、標準試料ＳＰ１の観察を行って、標準試料ＳＰ１に対して目的の偏光像を観察できるまで、顕微鏡１を構成する各素子の調整を行う。

このように卵子の紡錘体を観察する前に、紡錘体と同等のリターデーションを有する標準試料ＳＰ１を用いて顕微鏡観察しながら顕微鏡１を構成する各素子の調整を行うので、顕微鏡１の調整不足であるのか、卵子の状態が悪いのか、を判断することができる。

以上説明した本発明の一実施の形態によれば、標準試料ＳＰ１を用い、顕微鏡観察下で顕微鏡１を構成する各素子の調整を行うので、ＰＯ観察法で卵子内の紡錘体を確認する前に、ＰＯ観察法で用いる光学素子の調整不足を判断することができる。この結果、紡錘体体が卵子内の標準の位置に存在しない場合であっても、紡錘体の位置を顕微鏡下で探査することができるようになる。また、卵子内の紡錘体を確認できない場合、卵子の状態に起因することを判断することができる。

なお、本発明の一実施の形態では、標準試料ＳＰ１を用いて顕微鏡１の各素子の調整を行った後に、卵子の観察や処置を行っていたが、例えば顕微鏡１の同視野内に標準試料ＳＰ１および卵子を配置し、その視野内で顕微鏡１の各素子の調整を行いながら、卵子の観察や処置を行ってもよい。また、標準試料ＳＰ１を用いた各素子の調整および／または卵子内の紡錘体の確認については、顕微鏡下での観察状態を、接眼レンズ２６を介して直接観察してもよいし、表示部４に表示された画像により観察してもよい。これら各素子の調整および／または紡錘体の確認については、画像認識処理により自動的に判定結果を表示部４に出力するようにしてもよい。

また、本発明の一実施の形態では、標準試料ＳＰ１として、外観が円または楕円状である状態とは、殆どの天然の生物由来の試料がそうであるように、曲率の正負の符号が逆転しない程度に歪んだ形状を有しているような円または楕円状の形状であってもよい。また、標準試料ＳＰ１として生物由来の材料を用いて人工的に製造したり、幹細胞を用いた再生技術によって同一の生物材料を人為的に再生された非天然の試料であってもよい。

１ 顕微鏡
２ 顕微鏡本体部
３ 操作入力部
４ 表示部
５ 記録部
６ 制御部
１０ 光源
１１ ポラライザ
１２ コンペンセータ
１３ コンデンサターレット
１４ コンデンサレンズ
１５ ステージ
１６ ステージ位置検出部
１７ レボルバ
１８ 対物レンズ
１９ レボルバ位置検出部
２０ ＤＩＣプリズム
２１ アナライザ
２２ 結像レンズ
２３ 光路分割プリズム
２４ 撮像部
２５ ミラー
２６ 接眼レンズ
２７ 駆動部
５１ 設定情報記録部
１００ シャーレ
ＳＰ 標本
ＳＰ１ 標準試料
ＳＰ２ 第１の部位
ＳＰ３ 第２の部位

Claims (9)

1. 偏光観察法によって試料に処置を行う顕微鏡の調整に用いられる標準試料であって、
   第１の部位と、
   前記第１の部位と隣接し、卵子内の紡錘体と同等のリタデーションを有する第２の部位と、
   を備え、
   前記第１の部位と第２の部位は、リタデーションが異なり、
   前記第２の部位のリタデーションの範囲が２〜５ｎｍであり、
   前記第１の部位は、生体組織と同等なリタデーションを有することを特徴とする標準試料。
2. 当該標準試料の外径は、１０ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の標準試料。
3. 当該標準試料の外径は、５±２ｍｍ以下であることを特徴とする請求項２に記載の標準試料。
4. 当該標準試料は、外観が環状の一部または全部であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一つに記載の標準試料。
5. 前記第１の部位および前記第２の部位は、染色されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載の標準試料。
6. 前記第１の部位および前記第２の部位は、組織固定液によって固定されていることを特徴とする請求項５に記載の標準試料。
7. 前記第１の部位および前記第２の部位は、少なくとも精巣由来であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一つに記載の標準試料。
8. 前記第２の部位は、前記精巣の外周を覆う薄膜領域であることを特徴とする請求項７に記載の標準試料。
9. 偏光観察法で用いられる複数の光学素子を備えた顕微鏡の調整方法であって、
   請求項１〜８のいずれか一つに記載の標準試料に対して、偏光コントラストの反転前後において前記第２の部位の観察像のコントラストの変化を観察できない場合、前記複数の光学素子のいずれか一つ以上を操作することによって前記観察像のコントラストを調整する調整ステップを含むことを特徴とする顕微鏡の調整方法。

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