WO2011148959A1 - 新規環状ペプチド化合物とその製造方法及び感染症治療薬、抗生物質含有画分、その抗生物質及びその抗生物質の製造方法並びに抗生物質産生微生物及びそれが産生した抗生物質 - Google Patents

新規環状ペプチド化合物とその製造方法及び感染症治療薬、抗生物質含有画分、その抗生物質及びその抗生物質の製造方法並びに抗生物質産生微生物及びそれが産生した抗生物質 Download PDF

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antibiotic
microorganism
therapeutic effect
antibacterial activity
cyclic peptide
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関水　和久
洋 浜本
村上　和久
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株式会社ゲノム創薬研究所
国立大学法人東京大学
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to a compound having a novel chemical structure, a method for producing the compound, an infectious disease therapeutic agent containing the compound, and a novel microorganism producing the compound.
  • the present invention also relates to a fraction containing an antibiotic fractionated from a culture produced by a novel microorganism belonging to the genus Rhizobacter, a method for producing the antibiotic, and an antibiotic obtained therefrom, and further from the above fraction
  • the present invention relates to an antibiotic that exhibits antibacterial activity but does not exhibit a therapeutic effect, a method for using the antibiotic that exhibits antibacterial activity and also exhibits a therapeutic effect, and a method for producing them.
  • the present invention relates to a microorganism producing an antibiotic, a method for producing a novel antibiotic by culturing the microorganism, and the novel antibiotic.
  • Antibiotics are indispensable for controlling microorganisms and treating infectious diseases.
  • excessive use of antibiotics gives rise to resistant bacteria, resulting in the emergence of multidrug-resistant bacteria that are resistant to many drugs, which is a major clinical problem.
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • VRE vancomycin-resistant enterococci
  • VRE vancomycin-resistant Staphylococcus aureus
  • Patent Documents 1 to 3 describe microorganisms belonging to the genus Rhizobacter that produce antibiotics that are effective against the above-mentioned multidrug-resistant bacteria, and methods for producing antibiotics using the microorganisms.
  • Patent Documents 1, 2, 5, etc. describe bacteria that produce antibiotics that exhibit antibacterial activity against the multidrug-resistant bacteria and methods for producing antibiotics using the bacteria.
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • VRE vancomycin-resistant enterococci
  • antibiotics effective for both MRSA and VRE include antibacterial activity in vitro against the above-mentioned multidrug-resistant bacteria among the antibiotics reported in Patent Document 3 (hereinafter, unless otherwise specified) Antibacterial activity is described in the sense of “in vitro antibacterial activity.”) Antibiotics are described.
  • Patent Documents 1 and 2 include a novel microorganism belonging to the genus Lysobacter, Patent Document 6 to the genus Flavobacterium, and Patent Document 7 to the genus Streptomyces and its microorganisms. New antibiotics that are produced and manufactured are described.
  • Patent Document 4 skin staphylococcus aureus infection model
  • Patent Documents 2 and 3 describe antibiotics that are effective against VRE as well as MRSA.
  • Patent Document 1 In many cases of conventional reports, only the effectiveness against MRSA is described as in Patent Document 1, and there are almost no antibiotics showing the effectiveness against VRE at present. Therefore, considering the possibility of emergence of resistant bacteria, it is effective not only for MRSA but also for VRE, has a chemical structure different from existing antibiotics such as Patent Document 2 and Patent Document 3, and has an effect on resistant bacteria. There is a need to further increase the choice of antibiotics that can be expected to differ in mechanism from existing therapies.
  • the first object of the present invention is to provide a novel compound having a chemical structure different from that of conventional drugs, and further to provide a novel compound effective against multidrug-resistant bacteria. is there.
  • antibiotics produced by microorganisms and effective for VRE among the antibiotics described in Patent Document 2, antibiotics exhibiting antibacterial activity for both MRSA and VRE are described. However, do they exhibit an in vivo therapeutic effect on an infectious disease (hereinafter, unless otherwise specified, “therapeutic effect” means the therapeutic effect of the infectious disease confirmed in an in vivo evaluation system)? It has not been described until now. This is because the effectiveness of antibiotic treatment in the past is reflected in the magnitude of the therapeutic effect of the antibiotic, as evaluated by the minimum inhibitory concentration (hereinafter abbreviated as “MIC”). It was because it was evaluated. The lack of a method for simply evaluating the “therapeutic effect” in the past is also considered to be the reason why the evaluation by the MIC had to be performed. However, it was confirmed from the examination results of the present inventors that will be described later that “the magnitude of antibacterial activity” evaluated by MIC does not necessarily reflect the “magnitude of therapeutic effect” of those antibiotics. .
  • antibiotic-containing fractions fractions containing antibiotics produced by microorganisms
  • antibiotics obtained from the fractions not only the antibacterial activity exhibited by them, It is important to select the product after evaluating its therapeutic effect. Therefore, it is important to provide an unprecedented highly useful antibiotic-containing fraction and an antibiotic obtained from the fraction. This is a problem to be solved by the invention.
  • the second problem of the present invention is to provide an antibiotic-containing fraction produced by a microorganism having an unprecedented effectiveness, an antibiotic obtained therefrom, and a method for producing the same, and further comprising the antibiotic It is to provide an antibiotic-containing fraction and an antibiotic that are selected by evaluating the fractions and antibiotics including not only antibacterial activity but also their therapeutic effects. Furthermore, it is providing the antibiotic containing fraction and antibiotics which show a therapeutic effect with respect to multidrug resistant bacteria. Moreover, it is providing the microorganism control agent containing the said antibiotic-containing fraction or antibiotics.
  • antibiotics obtained from substances produced by microorganisms are likely to be superior to synthetic products in terms of safety to living organisms, and such antibiotics can reduce the development steps to become pharmaceuticals. It is done.
  • raw materials that are gentler to the living body than in the case of chemical synthesis can be used, and the process and equipment can be performed by simpler and safer processes and equipment because the production conditions are close to normal temperature and pressure. It has the merit that. Therefore, there is a high possibility that the drug development steps can be reduced compared to antibiotics created by chemical synthesis.
  • the present invention has been made in view of the above, and a third object of the present invention is to provide a novel microorganism capable of producing an antibiotic and used in a method for producing an antibiotic. It is to provide a novel microorganism. In particular, it is an object of the present invention to provide a novel microorganism capable of producing a novel antibiotic effective against a multi-drug resistant bacterium that is effective for at least both MRSA and VRE.
  • the present inventor obtained a novel microorganism producing an antibiotic, an antibiotic-containing fraction obtained from the microorganism, and an antibiotic obtained from the microorganism from the culture supernatant of the microorganism.
  • the fractions containing antibiotics and methods for evaluating antibiotics obtained by separating and purifying the fractions were examined.
  • the antibacterial activity of each sample was evaluated by MIC against Staphylococcus aureus, and at the same time, the therapeutic effect was also evaluated. I came up with a way to do it.
  • the antibiotic-containing fraction obtained from the culture supernatant of 45 strains contained microorganisms showing antibacterial activity against both MRSA and VRE multidrug resistant bacteria.
  • the antibiotic-containing fraction fractionated from the culture of the microorganism contains an antibiotic that exhibits a therapeutic effect equivalent to or higher than that of vancomycin in a mouse S. aureus infection model. I found out. And when the antibiotic which showed the said high therapeutic effect was examined in detail including the chemical structure, it confirmed that the antibiotic was a novel antibiotic.
  • the therapeutic effect (ED 50 : 50% effective dose) of the fraction containing the novel antibiotics is concentrated 300 times that of the purified initial fraction, whereas the antibacterial activity (MIC) is 5 times higher. It was confirmed that it was only concentrated.
  • antibiotic-containing fractions with high antibacterial activity but weak therapeutic effects obtained from fractions in the early stages of purification and antibiotics obtained from these fractions are also very useful for microbial control purposes. Minutes.
  • the antibiotic-containing fractions that exhibit antibacterial activity against MRSA and VRE as described above, and microorganisms that produce antibiotics are analyzed by the results of property analysis, analysis of the 16S rRNA base sequence, and the novelty of the product. It was also found to be a novel microorganism belonging to the genus Lysobacter (hereinafter referred to as “RH2180-5”), and the antibiotic-containing fraction of the present invention and the antibiotic obtained therefrom were obtained from the novel microorganism. It became clear that the present invention was completed.
  • the antibiotics that showed high therapeutic effects in the “mouse Staphylococcus aureus infection model” were examined in detail, including their chemical structures, and found that the antibiotics are cyclic peptide compounds having a novel chemical structure. confirmed. It was also confirmed that the culture supernatant contained related cyclic peptide compounds having a similar chemical structure in addition to such substances, and that they also exhibited an antibacterial spectrum similar to such substances.
  • the present invention provides the following.
  • ⁇ 1> The cyclic peptide compound shown by following formula (1), or its pharmaceutically acceptable salt.
  • R 1 represents an optionally substituted acyl group having 7, 8, or 9 carbon atoms
  • R 2 represents a methyl group or a hydrogen atom
  • R 3 represents an ethyl group or Indicates a methyl group.
  • R 1 in the formula (1) is a hydroxyl group.
  • R 1 in the above formula (1) is a 3-hydroxy-5-methyl-hexanoyl group, a 3-hydroxy-6-methyl-heptanoyl group or a 3-hydroxy-7-methyl-octanoyl group Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • R 1 is a 3-hydroxy-5-methyl-hexanoyl group
  • R 2 is a methyl group
  • R 3 is an ethyl group
  • R 1 is a 3-hydroxy-7-methyl-octanoyl group
  • R 2 is a methyl group
  • R 3 is an ethyl group, or a cyclic peptide compound according to ⁇ 1> or a pharmaceutical product thereof A chemically acceptable salt.
  • ⁇ 6> Produces RH2180-5 strain belonging to the genus Lysobacter of NITE BP-870, or a compound similar to that strain, in the patent microorganism deposit center (NPMD) of the National Institute of Technology and Evaluation (NITE)
  • NPMD patent microorganism deposit center
  • NITE National Institute of Technology and Evaluation
  • ⁇ 7> ⁇ 1> or ⁇ 6> having the ability to produce the cyclic peptide compound according to any one of the NITE BPMD (NITE) Patent Microorganism Deposit Center (NPMD) of the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) ⁇ 1> to ⁇ 6>, characterized by culturing a RH2180-5 strain belonging to the genus Lysobacter, or a mutant strain capable of producing a compound similar to the strain and culturing the same.
  • NITE NITE
  • NPMD Patent Microorganism Deposit Center
  • NITE National Institute of Technology and Evaluation
  • An infectious disease therapeutic agent comprising the cyclic peptide compound according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6> or a pharmaceutically acceptable salt thereof together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a microorganism belonging to the genus Lysobacter of accession number NITE BP-870 is cultured, and the cyclic peptide compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6> A fraction containing antibiotics, which is obtained by fractionating the culture.
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • VRE vancomycin-resistant enterococci
  • ⁇ 12> The antibiotic-containing fraction according to any one of ⁇ 9> to ⁇ 11>, wherein the antibiotic-containing fraction is a fraction containing at least an antibiotic having a therapeutic effect on an infection caused by Staphylococcus aureus.
  • ⁇ 13> The antibiotic-containing fraction according to ⁇ 12>, wherein the antibiotic-containing fraction is a fraction containing at least an antibiotic that exhibits a therapeutic effect equivalent to or higher than that of vancomycin against infection caused by Staphylococcus aureus. .
  • ⁇ 14> The antibiotic-containing fraction according to ⁇ 9> or ⁇ 10>, wherein the antibiotic-containing fraction is a fraction containing an antibiotic that exhibits antibacterial activity but does not substantially exhibit a therapeutic effect.
  • ⁇ 15> The antibiotic-containing fraction according to ⁇ 14>, wherein the antibiotic having the antibacterial activity but having substantially no therapeutic effect is used as a microorganism control agent.
  • a microorganism belonging to the genus Lysobacter of accession number NITE BP-870 is cultured, and the cyclic peptide compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>
  • a method for producing an antibiotic comprising separating and purifying an antibiotic having antibacterial activity and / or an antibiotic having a therapeutic effect on an infectious disease from the culture.
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • VRE vancomycin-resistant enterococci
  • ⁇ 18> The method for producing an antibiotic according to ⁇ 16> or ⁇ 17>, wherein the antibiotic has a therapeutic effect on at least an infection caused by Staphylococcus aureus.
  • ⁇ 19> The method for producing an antibiotic according to ⁇ 16>, wherein the antibiotic is an antibiotic that exhibits antibacterial activity but does not substantially exhibit a therapeutic effect.
  • ⁇ 20> A microorganism belonging to the genus Lysobacter of accession number NITE BP-870 is cultured, and the cyclic peptide compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6> And an antibiotic obtained from the culture.
  • ⁇ 21> The antibiotic according to ⁇ 20>, wherein the antibiotic exhibits antibacterial activity at least against both methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and vancomycin-resistant enterococci (VRE).
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • VRE vancomycin-resistant enterococci
  • ⁇ 22> The antibiotic according to ⁇ 20> or ⁇ 21>, wherein the antibiotic has a therapeutic effect on at least an infection caused by Staphylococcus aureus.
  • ⁇ 23> The antibiotic according to ⁇ 22>, wherein the antibiotic exhibits at least a therapeutic effect equivalent to or higher than that of vancomycin against an infection caused by Staphylococcus aureus.
  • a microorganism belonging to the genus Lysobacter of accession number NITE BP-870 is cultured, and the cyclic peptide compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6> Is obtained from the culture, exhibits antibacterial activity at least against both methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and vancomycin-resistant enterococci (VRE), and at least has a therapeutic effect on infection caused by Staphylococcus aureus Antibiotics characterized by showing.
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • VRE vancomycin-resistant enterococci
  • R1 represents an acyl group having one hydroxyl group, 7, 8 or 9 carbon atoms
  • R2 represents a methyl group or a hydrogen atom
  • R3 represents an ethyl group or a methyl group.
  • microorganism control agent characterized by the above-mentioned.
  • ⁇ 27> ⁇ 20> A microorganism control agent comprising the antibiotic according to ⁇ 20>.
  • ⁇ 28> A microorganism having the accession number NITE BP-870 belonging to the genus Lysobacter or a microorganism mutated naturally or artificially thereof, and having the ability to produce a compound represented by the following formula (1) or a salt thereof.
  • R 1 represents an acyl group having one hydroxyl group, 7, 8 or 9 carbon atoms
  • R 2 represents a methyl group or a hydrogen atom
  • R 3 represents an ethyl group or a methyl group. .
  • ⁇ 29> The microorganism according to ⁇ 28>, wherein the antibiotic has antibacterial activity against at least methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and vancomycin-resistant enterococci (VRE).
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • VRE vancomycin-resistant enterococci
  • a compound having a novel chemical structure effective for infectious diseases and the like can be provided. Furthermore, the present invention provides a compound having a novel chemical structure that is effective against many multidrug-resistant bacteria such as MRSA and VRE, or a salt thereof, a production method thereof, and a novel microorganism that produces these compounds. Can do.
  • a fraction containing useful antibiotics produced by new microorganisms and the antibiotics can be provided. Further, some of the antibiotics show antibacterial activity not only on MRSA but also on VRE, and some show high therapeutic effects on Staphylococcus aureus. Therefore, it has the effect that the fraction containing a very useful novel antibiotic and the novel antibiotic can be provided.
  • a novel microorganism capable of producing the above antibiotic having antibacterial activity can be provided.
  • some antibiotics produced by the microorganisms of the present invention have antibacterial activity in MRSA and VRE and have been confirmed to have a high therapeutic effect. Therefore, they are effective against multidrug-resistant bacteria. This has the effect of providing a novel microorganism capable of producing a highly novel antibiotic.
  • FIG. 4 is a diagram showing the analysis results of 1 H-NMR and 13 C-NMR analysis of RH2180-5Peak5 substance.
  • the vertical axis represents the signal intensity
  • the horizontal axis represents the chemical shift value (ppm).
  • the present invention relates to a novel compound characterized by being represented by the following formula (1), having a 37-membered cyclic peptide structure as a basic skeleton, and by the difference in R 1 to R 3 groups, Several compounds have been identified. These were isolated from the peak fractions separated by RP-HPLC, the final purification step described later, from the culture of Isobacter sp. RH2180-5, a novel microorganism strain described later, found by the present inventor.
  • the method for obtaining the “cyclic peptide compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof” of the present invention is not limited to the above-described method, and any method obtained by any method may be used. Well, it is not limited to those produced by microorganisms.
  • each isolated and purified compound is given a peak name to the strain name of the above-mentioned microorganism strain. For example, if it is a compound obtained from peak 1, “RH2180-5 Peak 1 substance” or It is simply expressed as “P1”.
  • R 1 represents an optionally substituted acyl group having 7, 8, or 9 carbon atoms
  • R 2 represents a methyl group or a hydrogen atom
  • R 3 represents an ethyl group or Indicates a methyl group.
  • R 1 in the above formula (1) represents an acyl group having 7, 8 or 9 carbon atoms which may have a substituent.
  • the number of carbon atoms of the acyl group includes the number of carbon atoms of “C ⁇ O” (one).
  • the “acyl group having 7, 8 or 9 carbon atoms” excluding the substituent is represented by “R′—C ( ⁇ O) —”, wherein R ′ has 6, 7 or 7 carbon atoms. 8 represents an alkyl group.
  • R ′ may be linear or branched, but preferably branched.
  • the branched portion is preferably a methyl group, and there is no particular limitation.
  • the end of R ′ opposite to “C ⁇ O” is “CH 3 (CH 3 ) CH—”. It is particularly preferable.
  • R ′ that is, R 1 has a branch
  • the carbon number (7, 8 or 9) of R 1 includes the carbon number of the branched portion.
  • the substituent of R 1 in the above formula (1) in the RH2180-5Peak1 substance to RH2180-5Peak9 substance shown in Table 1 below is a hydroxyl group.
  • R 1 in the above formula (1) is a 3-hydroxy-5-methyl-hexanoyl group, a 3-hydroxy-6-methyl-heptanoyl group or a 3-hydroxy-7-methyl-octanoyl group. It is preferable.
  • R 1 is a 3-hydroxy-5-methyl-hexanoyl group and R 2 is a methyl group.
  • R 3 is preferably an ethyl group, R 1 is a 3-hydroxy-7-methyl-octanoyl group, R 2 is a methyl group, and R 3 is an ethyl group.
  • Table 1 shows the relationship between R 1 , R 2 and R 3 shown in the formula (1) and substances obtained from the respective peaks.
  • the structures of R 1 , R 2 , and R 3 have been determined for the RH2180-5 Peak 5 substance and the RH 2180-5 Peak 9 substance, but the structure of R 1 is completely determined for substances obtained from other peaks. Therefore, the structural formula of R 1 in Table 1 is mainly derived from the analysis of the results of accurate mass spectrometry and the biosynthetic pathway. From the examination results of the antibacterial spectrum of each peak substance to be described later, it is clearly recognized that the difference in R 1 does not particularly affect the antibacterial spectrum. Therefore, at least these side chains may be an acyl group which may have a substituent, and preferably an acyl group having 7 to 9 carbon atoms which may have a substituent.
  • the method for preparing the cyclic peptide compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof is not particularly limited, and may be produced by a microorganism, synthesized, or a combination thereof. May be good.
  • the method for isolating and purifying a novel cyclic peptide compound of the present invention is selected using the therapeutic effect in a silkworm Staphylococcus aureus infection model as an index, but is not particularly limited to that method, and generally a microorganism
  • the methods used as methods for purifying the target compound from the above culture may be combined appropriately.
  • solvent extraction, phase transfer, water precipitation, chromatography using an ODS column or the like, fractionation by RP-HPLC using an ODS column or the like can be used.
  • the solvent for solvent extraction and the solvent for transfer are not particularly limited, but water-soluble solvents such as acetone; hydrophilic solvents such as butanol; mixed solvents thereof; mixed solvents of water and hydrophilic solvents; water and water-soluble A mixed solvent with an organic solvent;
  • a column packed with a carrier modified with an octyl group or a butyl group, a polystyrene polymer carrier, or the like may be used.
  • isolation and purification method is merely an example, and any isolation and purification method may be used as long as the final novel cyclic peptide compound of the present invention can be obtained.
  • the purified RP-HPLC preparation from peak 5, which is the main peak among these nine peaks, is given as an example of structural analysis.
  • the structure analysis method may be performed by appropriately combining existing structure analysis means, but can be efficiently implemented by the following analysis means. That is, molecular weight measurement by accurate mass spectrometry, amino acid analysis after acid hydrolysis treatment (FIG. 2), analysis by 1 H-NMR and 13 C-NMR (FIG. 3), TOF (Time of Flight) MS analysis (FIG. 4 shows peak 5, FIG. 5 shows peaks 1 and 2, FIG. 6 shows peaks 3 and 4, FIG. 7 shows peaks 6 and 7, and FIG. 8 shows peaks 8 and 9). It can be analyzed by UV spectrum (FIG. 1) and infrared absorption spectrum (IR).
  • the substance finally obtained from peak 5 has a novel cyclic peptide skeleton in which R 1 in formula (1) is 3-hydroxy-5-methyl-hexanoyl, R 2 is methyl, and R 3 is ethyl It was found to be a novel compound.
  • This novel compound was named “RH2180-5 Peak 5 substance” (hereinafter sometimes simply referred to as “P5”).
  • the substance obtained from the peak 9 is determined to be a compound in which the number of carbon atoms of R 1 of the RH2180-5Peak5 substance is extended by two, and the “RH2180-5Peak9 substance” (hereinafter, simply “ P9 ”). Further, substances obtained from other peaks were also found to be compounds having the same cyclic peptide structure as a basic skeleton, and similarly named “RH2180-5” with a Peak number n (hereinafter, referred to as “Rh2180-5”). Sometimes simply described as “Pn”.)
  • the manufacturing method using the microorganism of the cyclic peptide compound of this invention may be obtained by chemical synthesis or by culturing a microorganism that produces the compound, and the production method is not particularly limited.
  • RH2180-5 belonging to the genus Lysobacter of NITE BP-870, which has the ability to produce the above-mentioned cyclic peptide compounds, and whose accession number is NITE BP-870 at the Patent Microorganism Depositary Center (NPMD) of the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) It is preferable that a strain or a mutant strain capable of producing a compound similar to the strain is cultured and produced from the culture.
  • the present invention relates to the RH2180-5 strain belonging to the genus Lysobacter having the deposit number NITE BP-870 at the Patent Microorganism Deposit Center (NPMD) of the National Institute of Technology and Evaluation (NITE), or a strain thereof. It is also a cyclic peptide compound represented by the above formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof obtained by culturing a mutant strain having the ability to produce a similar compound and obtaining the same.
  • the present invention cultivates a microorganism belonging to the genus Lysobacter of Accession No. NITE BP-870 having the base sequence of the 16S rRNA region shown in SEQ ID No. 1 of the Sequence Listing, and the culture contains the above circular form.
  • An antibiotic-containing fraction characterized in that it contains a peptide compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof and is obtained by fractionating the culture.
  • RH2180-5 does not remain within the above-mentioned property range.
  • RH2180-5 accession number NITE BP-870
  • it is a microorganism belonging to the genus Lysobacter and has the ability to produce an antibiotic-containing fraction. No. NITE BP-870).
  • the antibiotic-containing fraction of the present invention refers to a product obtained by culturing the above RH2180-5 and subjecting the culture to some fractionation treatment.
  • the “culture” means any of a culture supernatant, cultured cells, cultivated cells, and the like.
  • Fractionation usually includes all treatments performed for the purpose of separation / purification of the target substance, such as extraction, precipitation, membrane separation, transfer dissolution, chromatogram, etc., usually performed on the culture. .
  • antibiotics contained therein exhibit antibacterial activity, and further exhibit therapeutic effects, and can be used for the production of infectious disease therapeutic agents and exhibit antibacterial activity. However, those that do not show a therapeutic effect can be used for the production of a microbial control agent.
  • Antibiotic-containing fractions containing antibiotics that exhibit antibacterial activity but substantially no therapeutic effect are an aspect of the present invention.
  • a microorganism control agent there are no particular restrictions on the method of use as a microorganism control agent, and examples thereof include a method of applying, immersing and moistening on the surface of materials, tools, etc. that require antibacterial properties. More specifically, for example, it is preferably used as an antibacterial component of an adhesive or an antibacterial component in a coating used for various types of adhesive sheets for skin, such as adhesive gauze, bandages, etc. Can be used.
  • an antibiotic that exhibits antibacterial activity but does not substantially exhibit a therapeutic effect is used as a microorganism control agent (used for use as a microorganism control agent and / or a microorganism control agent). It is preferable that it has the performance used as a).
  • antibiotics are difficult to use as a microorganism control agent because it is necessary to pay attention to the emergence of multi-drug resistant bacteria, but antibiotic-containing fractions that do not show therapeutic effects in the present invention and antibiotics obtained therefrom are It can be used as a microbial control agent without such concerns.
  • the antibiotic-containing fraction can be used as a fraction or simply by concentrating the fraction, and the antibiotic can be separated and purified from the fraction.
  • Antibiotics can also be used. Those processes may be selected according to each application.
  • the antibiotic-containing fraction of the present invention can be obtained by culturing RH2180-5 and fractionating the culture.
  • the antibiotic-containing fractions of the present invention and the microorganisms that produce the antibiotics obtained from each fraction include antimicrobial activity by MIC and silkworm described in Patent Document 4 among many microorganisms isolated from Okinawa soil. It is a microorganism selected by evaluating the therapeutic effect by a method using a Staphylococcus aureus infection model.
  • RH2180-5 which is the microorganism of the present invention
  • RH2180-5 strain belonging to the genus Lithobacter
  • NITE Patent Microorganism Depositary Center
  • NPMD Patent Microorganism Depositary Center
  • the microorganism of the present invention is a microorganism having the accession number NITE BP-870 belonging to the genus Lysobacter, or a microorganism that is naturally or artificially mutated and has the ability to produce antibiotics having antibacterial activity. is there.
  • the novel microorganism belonging to the genus Lysobacter was identified from the properties of the strain described later and the sequence of the 16S rRNA region.
  • the present RH2180-5 is a Gram-negative bacilli and has no flagella but gliding properties. Formation of fruiting bodies is not permitted. In addition, it does not show acidity.
  • Physiological properties The physiological and chemical taxonomic properties of this RH2180-5 are as follows: (1) Growth pH (optimum growth pH): 5-9 (6-8) (2) Growth temperature (optimum growth temperature): 10-40 ° C (25-30 ° C) (3) Attitude toward oxygen: aerobic (4) MR test (Methyl red test):- (5) VP test (Voges-Proscauer test): + (6) Pigment production (Pigment): + (7) Oxidase test: + (8) Catalase test: + (9) Urease test:- (10) Phosphatase test: + (11) Casein hydrolysis: + (12) Cellulose hydrolysis:- (13) Gelatin hydrolysis: + (14) Starch hydrolysis:- (15) Deoxyribonuclease test: + (16) Nitrate reduction:- (17) Denitrification:- (18) Hydrogen sulfide production (H 2 S production): ⁇ (19) Indole production:- (20) Citrate utilization: + (21) OF-test: oxidation (2
  • results of molecular biological analysis are as follows. ⁇ 16S rRNA sequence >> (12) Analysis result of 16S rRNA sequence From the colony of RH2180-5, the base sequence of 16S rRNA region was amplified by colony PCR and analyzed by a sequencer. A base sequence corresponding to almost the entire length of 16S rRNA excluding the bases was found. This base sequence is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Since the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is not the full length of 16S rRNA, it was designated as a 16S rRNA “region”.
  • RH2180-5 The above properties of RH2180-5 are compared with those described in the classification and other literature by Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. 3, 1989), and further 16S rRNA analysis. As a result of comprehensive determination in consideration of the results, RH2180-5 was determined to be a microorganism belonging to the genus Lysobacter.
  • RH2180-5 was deposited internationally by the National Institute for Product Evaluation and Technology (NITE) and the Patent Microorganism Depositary Center (NPMD). Accession number: NITE BP-870 (original deposit date: January 25, 2010, international Deposit date (transfer date): May 20, 2011) and is available. Note that RH2180-5 has a possibility that it does not stay within the range of the physiological properties described above, because the bacterial properties are easily mutated as general properties of bacteria. Needless to say, such “mutation” includes both natural and artificial mutations. Even a microorganism mutated from RH2180-5 (Accession No. NITE BP-870) is included in the microorganism of the present invention as long as it has the ability to produce antibiotics.
  • NITE National Institute for Product Evaluation and Technology
  • NPMD Patent Microorganism Depositary Center
  • the cyclic peptide compound represented by the above formula (1) of the present invention includes those produced by microorganisms mutated from RH2180-5 (Accession Number: NITE BP-870). Further, the antibiotic-containing fraction of the present invention and the antibiotic obtained therefrom can be obtained from this culture of RH2180-5.
  • the microorganism of the present invention is a microorganism having the accession number NITE BP-870 belonging to the genus Lysobacter, or a microorganism that is naturally or artificially mutated, and has the ability to produce antibiotics having antibacterial activity. It is a microorganism. Moreover, it is said microorganisms which have a base sequence of 16S rRNA area
  • the microorganism of the present invention is a microorganism having an ability to produce a compound represented by the above formula (1) or a salt thereof.
  • the microorganism of the present invention is the above microorganism, wherein the produced antibiotic has antibacterial activity against at least methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and vancomycin-resistant enterococci (VRE). That is, microorganisms of NITE BP-870 having the ability to produce antibiotics having antibacterial activity at least in MRSA and VRE, and microorganisms mutated from NITE BP-870 are further included in the microorganisms of the present invention. It is. Needless to say, the mutation includes natural mutation and artificial mutation.
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • VRE vancomycin-resistant enterococci
  • RH2180-5 The culture method of RH2180-5 is described below.
  • the RH2180-5 culturing method for producing a novel compound having a novel cyclic peptide structure of the present invention, an antibiotic-containing fraction, and the like can be performed according to a general culturing method performed for a microorganism belonging to the genus Rhizobacter. Good.
  • RH2180-5 is inoculated into a nutrient source-containing medium such as YME medium, SGM medium, CDY medium, or YPGM medium, and cultured under aerobic conditions.
  • Examples of the carbon source in the medium include organic carbon compounds such as D-glucose, D-fructose, sucrose, starch, dextrin, glycerin, molasses, starch syrup, and fats, and the nitrogen source includes meat extract, Organic / inorganic nitrogen compounds such as casein, peptone, yeast extract, dry yeast, germ, soy flour, urea, amino acid, ammonium salt can be used. Further, as the salts, inorganic salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, phosphate, iron salt, copper salt, zinc salt, cobalt salt and the like are appropriately added as necessary.
  • a growth promoting substance such as biotin, vitamin B1, cystine, methyl oleate, lard oil or the like in terms of increasing the production amount of the target product.
  • antifoamers such as a silicone oil and surfactant.
  • the culture is preferably performed under aerobic conditions as described above, and aeration and agitation culture is desirable for the liquid culture method. If it is a small scale, a shaking culture method using a flask may be used.
  • the culture temperature can be 20 ° C. to 40 ° C., but is preferably maintained between 25 ° C. and 35 ° C., more preferably around 30 ° C.
  • the culture pH is preferably 6 to 8, particularly preferably around 7.
  • the culture period is a factor that varies depending on the composition of the medium used, the culture temperature, and the like. In the case of RH2180-5, a sufficient amount is usually obtained in a short period of about 1 to 20 days, preferably about 3 to 7 days. Things can be secured.
  • Recovery of the antibacterial active ingredient from the culture of RH2180-5 may be performed by a method of recovering and purifying the physiologically active substance from a normal microorganism culture.
  • the culture includes culture supernatant, cultured cells, and disrupted cultured cells.
  • a suitable organic solvent such as acetone
  • the extraction supernatant usually separated from the cells by centrifugation or filtration membrane separation is usually used for isolation. What is necessary is just to add a purification process. Further, if necessary, the remaining bacterial cell residue may be subjected to a grinding treatment and then extracted again.
  • the extraction solvent and the separation / purification technique used during the separation / purification of the target substance are selected based on the concentration of antibacterial activity determined by MIC as an index. There is basically no problem with such a method as long as it is simply separation and concentration of antibacterial active ingredients.
  • the separation and purification of antibiotic-containing fractions and antibiotics produced by RH2180-5 of the present invention not only the MIC result but also the therapeutic effect on the silkworm Staphylococcus aureus infection model shown in Patent Document 4 is used as an index. Have made a choice.
  • the primary screening for narrowing down useful strains from a very large number of tens of thousands of strains can be performed by any method as long as it is a method for evaluating antibacterial activity. Specimens with antibacterial activity against S. aureus can be picked up in the culture supernatants of various strains. This is because a strain that does not show any antibacterial activity is not considered.
  • Any method may be used as long as it is a method for evaluating antibacterial activity, but a method of picking up strains having antibacterial activity against Staphylococcus aureus in the culture supernatant of various test strains using MIC as an index Is preferred. Thereafter, when the number of strains is narrowed down to several hundred thousands, evaluation of the therapeutic effect of antibiotic-containing fractions and antibiotics derived from them to measure their ED 50 using silkworms S. aureus infection model Can be considered.
  • various separation and purification operations are further performed, and the therapeutic effect is evaluated with the silkworm Staphylococcus aureus infection model for each operation.
  • the type of separation and purification operations performed by administering the antibiotic-containing fractions at each purification stage and the concentration of therapeutic effect by the technique are also confirmed in the silkworm S. aureus infection model. Then, the types and methods of separation / purification operations that can effectively concentrate the “therapeutic effect” will be selected.
  • Table 2 summarize the antibacterial activity MIC of the sample at each purification stage purified from the culture solution of RH2180-5 and the therapeutic effect ED 50 of the silkworm infection model.
  • the total activity “unit” is defined as the amount of activity necessary for survival with a 50% probability of silkworms infected with S. aureus weighing 1 g.
  • the residue after the acetone extraction is considered to contain a relatively large amount of antibiotics that show antibacterial activity but no therapeutic effect. Can be used as a fraction containing antibiotics.
  • RH2180-5 was effectively found by using a separation / purification method with the therapeutic effect as an index using a silkworm Staphylococcus aureus infection model. This is because when the separation and purification method of the target substance is performed using only the conventional antibacterial activity as an index, antibacterial active ingredients that are not effective in terms of therapeutic effect are concentrated, and the therapeutic effect in vivo. This is because it is inferred from the results in Table 2 that there is a high possibility of overlooking high antibiotics. In this case, the usefulness of RH2180-5 cannot be confirmed, and there is a high possibility that RH2180-5 itself has been overlooked. Therefore, in providing a new microorganism (RH2180-5), it is a very important point in the present invention that selection was performed using the therapeutic effect using a silkworm S. aureus infection model as an index.
  • MIC Evaluation of antibacterial activity by minimum growth inhibitory concentration MIC
  • Antibacterial activity of the antibiotic-containing fractions at each fractionation stage from the culture produced by RH2180-5, and the antibiotics separated and purified therefrom can be evaluated by MIC.
  • MIC is performed according to generally accepted standard methods. For example, it is carried out by a micro liquid dilution method based on CLSI (formerly NCCLS American Clinical Laboratory Standards Committee).
  • each category of S sensitivity, I: intermediate, R: resistance is performed based on the judgment criteria defined by the CLSI.
  • the “antibiotic-containing fraction” of the present invention obtained by culturing RH2180-5 (Accession No. NITE BP-870) and fractionating the culture refers to the culture of RH2180-5, Fractions containing antibiotics that exhibit antibacterial activity and / or therapeutic effects, fractions from which some substances have been separated / extracted from the fractions, and antibiotics in the fractions that have been separated / extracted partially This means any fraction that has been purified to a pure substance and further contains an antibiotic that has been purified to a pure substance.
  • the acetone extract and butanol extract of Table 2 and particularly the butanol extract have the low concentration of antibacterial activity in the subsequent purification step and, conversely, the high concentration of therapeutic effect, as shown in Table 4 to be described later.
  • it think of it as an antibiotic-containing fraction that shows antibacterial activity but no therapeutic effect or a lot of very weak antibiotics compared to the antibiotics contained in the nine peaks (antibiotic-containing fractions) Can do.
  • Such an antibiotic-containing fraction is usually judged to be less useful, but is highly useful for the following reasons, and can be judged as an antibiotic-containing fraction included in the present invention.
  • antibiotics with high antibacterial activity when used as therapeutic agents for infectious diseases, they should be used after careful examination of their necessity in consideration of the emergence of multidrug-resistant bacteria. .
  • an antibiotic when used as an antibacterial agent such as a microbial control agent, it is inevitably abused because of its usage, and it is difficult to limit its use. The antibiotic used is not used for microbial control.
  • the antibacterial activity of the present invention but the antibiotic-containing fraction containing a large amount of antibiotics evaluated as having no therapeutic effect or weak in the silkworm Staphylococcus aureus infection model and other microbial infection models, and the antibacterial activity therefrom Antibiotics that are shown but have no therapeutic effect or are weak can be used for in vitro applications such as microbial control agents. This is because these antibiotic-containing fractions are not used as an infectious disease therapeutic agent, and thus it is not necessary to consider the emergence of multidrug-resistant bacteria.
  • the term “substantially exhibits no therapeutic effect” although it exhibits antibacterial activity means that it does not exhibit a therapeutic effect that can be used as a therapeutic agent.
  • MIC exhibits antibacterial activity and is used in an infectious disease model. What is necessary is just to select and implement the method by which the antibiotic which has a weak therapeutic effect or does not show the therapeutic effect is separated and purified.
  • the infectious disease model using silkworms such as a silkworm Staphylococcus aureus infection model like the antibiotics which show a therapeutic effect, can be used conveniently.
  • the separation and purification of antibiotics that do not exhibit therapeutic effects may be performed only for that purpose, but a method that uses the results of examination of methods for separating and purifying antibiotics that exhibit therapeutic effects is more effective. preferable.
  • the antibiotic-containing fraction is treated with a method of collecting antibiotics that exhibit therapeutic effects, and the residue is subjected to a method of concentrating, separating, and purifying antibiotics that do not exhibit therapeutic effects.
  • Antibiotics that exhibit antibacterial activity but no therapeutic effect can be isolated and purified without further examination.
  • the solvent for solvent extraction and the solvent for transfer are not particularly limited, but water-soluble solvents such as acetone; hydrophilic solvents such as butanol; mixed solvents thereof; mixed solvents of water and hydrophilic solvents; water and water-soluble A mixed solvent with an organic solvent;
  • a column packed with a carrier modified with an octyl group or a butyl group, a polystyrene-based polymer carrier, or the like may be used (see Table 2).
  • the separation / purification method described above is merely an example, and any separation / purification method may be used as long as the method can finally obtain a target antibiotic-containing fraction or antibiotic.
  • the method for analyzing the chemical structure of the antibiotic contained in these peaks is not particularly limited, and any method may be used.
  • RP-HPLC of peak 5 which is the main peak among these nine peaks
  • the structural analysis of the purified sample was performed by the following analysis means.
  • the antibacterial spectrum exhibited by the antibiotic contained in each peak can be examined by the MIC described above.
  • the RH2180-5Peak5 substance exhibited antibacterial activity against Gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus and enterococci.
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • VRE vancomycin-resistant enterococci
  • antibiotics contained in peak 6 and peak 9 also showed an antibacterial spectrum similar to that of RH2180-5 Peak5 substance against MRSA and VRE (see Table 3).
  • the antibiotic having therapeutic effect contained in the antibiotic-containing fraction of the present invention is an antibiotic produced by the microorganism obtained from the culture solution of RH2180-5 (Accession No. NITE BP-870).
  • the antibiotic is characterized by having antibacterial activity against MRSA and VRE.
  • the RH2180-5 Peak 5 substance is low toxic because the mice were not killed at a dose of 50 mg / kg.
  • the antibiotic RH2180-5Peak5 produced in the present invention produced by RH2180-5 exhibits an excellent ED 50 value against Staphylococcus aureus as compared with vancomycin, exhibits a high therapeutic effect, and is clinically very It has been confirmed that not only MRSA, which is a problem, but also VRE has an excellent feature of showing effectiveness.
  • the antibiotic-containing fraction of the present invention produced by RH2180-5 contains at least an antibiotic having a therapeutic effect on infection caused by Staphylococcus aureus, and the antibiotic is used for the above infection. Compared to vancomycin, the therapeutic effect is equivalent or higher.
  • the substance in the other peak (corresponding to the antibiotic in the antibiotic-containing fraction) also shows the same antibacterial spectrum (confirmed by peak 6 and peak 9) and UV spectrum as RH2180-5Peak5 substance. It is considered to be a compound similar to the -5 Peak5 substance. Therefore, it is presumed that the therapeutic effect shows the same tendency as that of the RH2180-5 Peak5 substance.
  • R 1 represents an acyl group having one hydroxyl group, 7, 8 or 9 carbon atoms
  • R 2 represents a methyl group or a hydrogen atom
  • R 3 represents an ethyl group or a methyl group.
  • the present invention is preferably the antibiotics represented by the above formula (1), and the antibiotics represented by the above formula (1) are particularly preferably those shown in Table 1 above.
  • the above RH2180-5 (Accession No. NITE BP-870) is cultured, and the culture contains the above-mentioned cyclic peptide compound or a salt thereof, and antibiotics exhibiting antibacterial activity from the culture and / or infectious diseases
  • the method for separating and purifying antibiotics that exhibit therapeutic effects can be used as a method for producing useful antibiotics.
  • the RH2180-5 (Accession No. NITE BP-870) has the base sequence of the 16S rRNA region represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the method can be used as a method for producing an antibiotic having antibacterial activity against both methicylene-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and vancomycin-resistant enterococci (VRE).
  • MRSA methicylene-resistant Staphylococcus aureus
  • VRE vancomycin-resistant enterococci
  • the present invention can be used as a method for producing an antibiotic in which the antibiotic exhibits antibacterial activity against MRSA and VRE, and at least has a therapeutic effect on infection caused by Staphylococcus aureus.
  • the antibiotic-containing fraction obtained by culturing the microorganism with the deposit number NITE BP-870 and fractionating the culture is useful. Furthermore, a microorganism control agent containing an antibiotic obtained from the culture is useful. A microorganism control agent containing a fraction before being isolated as a substance is also useful.
  • Examples of the method for obtaining the “cyclic peptide compound represented by the above formula (1)” of the present invention from a culture of RH2180-5 include a method for obtaining a physiologically active substance from a normal microorganism culture.
  • the culture is as described above.
  • the cyclic peptide compound represented by the formula (1) of the present invention can be effectively used by using an isolation and purification method selected using not only MIC but also a therapeutic effect using a silkworm Staphylococcus aureus infection model as an index. It can be considered as found.
  • the antibacterial spectrum exhibited by the cyclic peptide compound represented by the formula (1) of the present invention can be examined by the MIC described above.
  • each substance of RH2180-5Peak5, Peak6, and Peak9 shows antibacterial activity against Gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus and enterococci, and also normal bacteria against VRE as well as MRSA
  • the antibacterial activity was exactly the same, and it was confirmed that the substance was effective against many multidrug-resistant bacteria (see Table 3 in Test Example 1 and Table 6 in Test Example 4).
  • each of the above peak substances that is, yellow, which is a drug-sensitive bacterium of the same species as the methicylene-resistant Staphylococcus aureus (MRSA3, MRSA4) and vancomycin-resistant enterococci (VRE) of the cyclic peptide compound represented by the above formula (1).
  • MSSA1 methicylene-resistant Staphylococcus aureus
  • EF1 vancomycin-resistant enterococci
  • novel compound having a novel cyclic peptide structure represented by the formula (1) of the present invention includes at least an antibacterial activity against both methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and vancomycin-resistant enterococci (VRE). Is included.
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • VRE vancomycin-resistant enterococci
  • the novel compound having the novel cyclic peptide structure of the present invention can be produced, for example, from the culture solution of the novel microorganism RH2180-5 (accession number NITE BP-870) of the present invention, and at least a multidrug. It can be confirmed that a novel compound having antibacterial activity against MRSA and VRE, which are resistant bacteria, is contained.
  • the above-described microorganism culture method, purification method, and the like are examples selected for finding the compound of the present invention, and different types of microorganisms may be used depending on the purpose. It is natural to select a manufacturing method.
  • An infectious disease therapeutic agent comprising the cyclic peptide compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof together with a pharmaceutically acceptable carrier has an excellent therapeutic effect on infectious diseases. Play.
  • the compound having a novel cyclic peptide structure or a pharmaceutically acceptable salt thereof represented by the formula (1) of the present invention is not only a silkworm Staphylococcus aureus infection model but also mouse yellow as described later. Some staphylococcal infection models have been confirmed to have a higher therapeutic effect than vancomycin, and can be suitably used as an active ingredient of a therapeutic agent for infectious diseases.
  • the content of the compound of the present invention in the infectious disease therapeutic agent there is no particular limitation on the content of the compound of the present invention in the infectious disease therapeutic agent, and the content may be appropriately selected according to the purpose and administration method.
  • carriers, excipients, and other additives used in formulating ordinary antibiotics are appropriately selected within the range that does not impair the pharmacological effect of the compound of the present invention according to the requirements of the dosage form etc. Can be used.
  • the dosage form of the infectious disease therapeutic agent may be appropriately selected according to the purpose and method of administration, for example, for oral administration of powders, granules, capsules, tablets, liquids, etc .; injections, intravenous agents, suppositories
  • the compound of the present invention can be used for parenteral administration such as an agent, transdermal, nasal, enteral, inhalant and the like.
  • excipients for oral administration known excipients such as lactose, glucose, starch, polyvinylpyrrolidone and the like can be used.
  • an inert solvent such as In addition to purified water, ethanol and the like, pharmaceutically acceptable emulsions, suspensions, solubilizers, sweeteners, pH adjusters, fragrances, preservatives and the like can be used.
  • a sterile aqueous solution such as distilled water for injection or physiological saline can be used.
  • Non-aqueous solutions include vegetable oils such as olive oil; ethanol, polyethylene glycol, butylene glycol, etc. Alcohols etc. can be used. Further, it may contain solubilizing agents such as isotonic agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers and cyclodextrins.
  • the dose of the compound of the present invention formulated as described above may be appropriately determined in consideration of symptoms, age, sex, dosage form, administration method, number of administrations per day, etc. Is 10 mg to 1000 mg per day for adults. However, a higher dose may be required, for example, when used as an intravenous agent by infusion in severely ill patients who are frequently used in the treatment of multidrug-resistant bacteria.
  • Example 1 ⁇ Isolation and purification of RH2180-5 Peak5 substance> (1) Search for microorganisms having antibacterial activity by MIC Soil collected from various places is suspended in physiological saline, the supernatant is applied to GA medium and HV medium, and the bacteria grown after incubation at 30 ° C. are separated, The cells were cultured in a YME medium, an SGM medium, or a CDY medium at 30 ° C. for 5 days. An equal amount of acetone was added, the suspension was centrifuged, and the supernatant was evaporated. After the obtained residue was diluted with physiological saline, the antibacterial activity against Staphylococcus aureus was evaluated by MIC using a micro liquid dilution method. As a result, antimicrobial activity was observed in the culture supernatant of 3487 strains out of 14346 strains.
  • RH2180-5 isolated from soil collected in Okinawa among the above 45 strains, the therapeutically active substance was purified from the culture supernatant. Carried out. RH2180-5 was determined to be a novel microorganism belonging to the genus Lysobacter based on the analysis of 16S rRNA sequence described later, the tendency of the produced substance, and the like.
  • RH2180-5 was inoculated into 1200 mL of YME medium and cultured, and a method for purifying antibiotics having a therapeutic effect from a 50% by mass acetone extract of the culture was examined using the therapeutic effect in a silkworm model as an index.
  • antibiotics showing therapeutic effects were purified by butanol transfer, water precipitation, chromatography using an ODS column, and RP-HPLC (reverse phase HPLC) using an ODS column.
  • the specific activity of the therapeutic effect increased 300 times that of the acetone extract by the above purification process.
  • the increase in antibacterial activity stayed only 5 times. This is because the antibacterial activity of the acetone extract, which is the starting material for purification, also involves substances other than antibiotics that show the therapeutic effect of the final purified product. It is presumed that the antibacterial active substance was removed.
  • Example 2 ⁇ Incubation of RH2180-5 and production of RH2180-5 Peak5 substance> Bacteria were scraped off from the RH2180-5 slant culture with a platinum loop, inoculated into a 500 mL Erlenmeyer flask containing 100 mL of YME medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 3 days to obtain a seed culture solution. Next, 1.0 mL of this seed culture solution was inoculated into 12 500 mL Erlenmeyer flasks containing 100 mL of the previous liquid medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 5 days.
  • the culture broth thus obtained was mixed with an equal amount of acetone, the mixture was sufficiently stirred, centrifuged, and the supernatant was evaporated to remove acetone.
  • the sample was then subjected to butanol transfer.
  • the acetone extract was suspended in 80 mL of water, and after adding an equal amount of butanol and shaking well, the butanol layer was separated by standing, separating funnel, and dried under reduced pressure. Subjected to precipitation.
  • the previous sample was suspended in 80 mL of water, the water was removed after centrifugation, and the precipitate was collected.
  • Antibiotic-containing fractions showing the above therapeutic effects are pooled and dried, and 22 mg of them are dissolved in 50% methanol, and using a Senshu PaK SP-100 ODS column (Senshu Science: diameter 20 mm x length 250 mm), Elution was performed with 75% to 95% methanol + 0.1% TFA.
  • Antibiotic-containing fractions showing therapeutic effects by RP-HPLC under these conditions were fractionated into substances each having 9 peaks consisting of a single substance.
  • the antibiotic-containing fraction showing a therapeutic effect is composed of a group of compounds having nine similar UV absorption patterns (UV apparatus Waters 2996 photodiode array) having the peak 5 as a main component. It was confirmed (see FIG. 1). By the above operation, 5.3 mg of RH2180-5Peak5 substance was obtained. Moreover, each peak substance was obtained from each peak of peak 1, peak 2, peak 3, peak 4, peak 6, peak 7, peak 8, peak 8 and peak 9 by the same method.
  • the absolute configuration R was determined by the modified Mosher method. As a result, it was found that the RH2180-5Peak5 substance is a novel cyclic peptide compound in which each amino acid has the three-dimensional structure shown in FIG.
  • Test example 1 ⁇ Investigation of antibacterial spectrum of cyclic peptide compound of the present invention> The antibacterial spectrum of the above-mentioned RH2180-5 Peak5 substance against various microorganisms including MRSA and VRE was examined. The effect of drug resistance was also examined. For the latter study, Staphylococcus aureus and enterococci are selected. Staphylococcus aureus is resistant to many drugs including staphylococcus aureus that does not exhibit drug resistance (hereinafter abbreviated as “MSSA1”) and methicillin. MRSA2 species (MRSA3, MRSA4; see Table 3 for resistant drugs), enterococci that are not resistant to drugs (hereinafter abbreviated as “EF1”), and resistant to vancomycin. The MIC value of each peak substance was measured by a micro sample dilution method based on CLSI (former NCCLS National Clinical Laboratory Standards Committee) for enterococci (hereinafter abbreviated as “VRE”).
  • CLSI former
  • MIC values were measured for MSSA1 and EF1 and their drug-resistant bacteria (MRSA3, MRSA4 and VRE) for RH2180-5Peak6 substance and RH2180-5Peak9 substance.
  • Table 3 shows measurement results of various microorganisms and MIC subjected to the test.
  • RH2180-5 Peak6 substance and the RH2180-5 Peak9 substance have the same antibacterial activity as the RH2180-5Peak5 substance against multidrug-resistant bacteria and normal bacteria.
  • Test example 2 Comparison of antibacterial activity against multidrug-resistant bacteria and bacteria without drug resistance was conducted on 8 novel cyclic peptide compounds of the present invention with 2 to 9 peaks, excluding 1 substance with a small amount of sample. .
  • Test Example 1 The same staphylococcus aureus and enterococci as in Test Example 1 were selected as test target bacteria, and the MIC values indicated by the peak substances for the same MSSA1 and EF1, MRSA3, MRSA4 and VRE were also determined by CLSI (former NCCLS US clinical laboratory standard). Measured by the micro sample dilution method based on the committee). The results are shown in Table 4.
  • MSSA1 Staphylococcus aureus MRSA3: OX, FL, KM, TC, EM-resistant Staphylococcus aureus MRSA4: OX, FL, KM, CP, CPLX-resistant Staphylococcus aureus EF1: Enterococcus VRE: Vancomycin-resistant enterococci
  • OX Oxacillin
  • FL Fromomoyev
  • KM Kanamycin
  • TC Tetracycline
  • CP Chloramphenicol
  • EM Erythromycin
  • CPLX Ciprofloxacin
  • the antibacterial activity and the therapeutic effect do not necessarily match.
  • the RH2180-5Peak5 substance whose MIC value for MSSA is 6.3 ⁇ g / mL in the case of Table 4 and 5 ⁇ g / mL in the case of Table 3 is the therapeutic effect (ED 50 value) on the mouse S. aureus infection model described later.
  • the MIC values of 5 ⁇ g / mL and 6 ⁇ g / mL are levels that are considered to be MIC values of resistant bacteria in vancomycin
  • one of the reasons why the cyclic peptide compound of the present invention exhibits a sufficient therapeutic effect is as follows: There is a possibility that the compound of the present invention exhibits antibacterial activity with a mechanism of action different from that of existing drugs, which is reflected in the therapeutic effect. When antibacterial activity is shown with an action mechanism different from that of existing drugs, it is predicted that at least the current frequency of isolation of resistant bacteria is low, which is considered to be an advantage of the cyclic peptide compound of the present invention.
  • Test example 3 ⁇ Investigation of therapeutic effect and toxicity of RH2180-5 Peak 5 substance in mouse S. aureus infection model (hereinafter abbreviated as "mouse model")> S. aureus Smith strain was suspended in 7% mucin + 0.2 mM iron (III) ammonium citrate (Ferric ammonium citrate), and 6.2 ⁇ 10 6 mice (20 ⁇ LD50) were grouped into 5 mice (ICR female). 4 weeks old). Each drug was injected subcutaneously 2 hours after administration of the previous strain by the method shown below.
  • RH2180-5Peak5 substance dissolved in PBS was subcutaneously injected into the mouse model at 25 mg / kg, 12.5 mg / kg, and 6.3 mg / kg, and the number of surviving the next day after administration was measured.
  • the therapeutic effect (ED 50 value) was examined (5 per group).
  • vancomycin the ED 50 value for the mouse model used this time was examined.
  • the survival of all mice was confirmed at a dose of 25 mg / kg under the condition that no survival was achieved by PBS administration. The ED 50 value was determined by the probit method.
  • the results obtained are shown in Table 5.
  • the RH2180-5 Peak 5 substance has a therapeutic effect on the mouse model, and its ED 50 value is 0.6 mg / kg, which is clearly lower than the ED 50 value of vancomycin examined at the same time, 1.6 mg / kg. It has been confirmed that it is a highly therapeutic antibiotic.
  • RH2180-5Peak5 substance was subcutaneously administered to mice, and the acute toxicity of RH2180-5Peak5 substance to mice was also examined by observation the next day after administration.
  • the acute toxicity was RH2180-5Peak5 substance because the mice were not killed at all at doses up to 50 mg / kg corresponding to 80 times the ED 50 value, which is the highest concentration studied, and no toxicity was observed. Suggests low toxicity
  • the antibiotic RH2180-5Peak5 substance (P5) of the present invention produced by RH2180-5 exhibits an excellent ED 50 value against Staphylococcus aureus as compared with vancomycin and exhibits a high therapeutic effect.
  • MRSA which has become a very clinical problem from the results of the investigation of antibacterial activity by MIC, it has an excellent feature that it is effective not only for MRSA, but also for VRE, which is expected to become a problem similar to MRSA in the future. It was confirmed that the
  • novel compounds having the novel cyclic peptide structure of the present invention isolated and purified from the culture of RH2180-5 as a basic skeleton (peak 1 substance has not been studied for antibacterial spectrum) Since the MIC value was almost the same for the multidrug-resistant bacteria and the same type of multidrug-resistant strain (Table 4), the novel cyclic peptide structure of the present invention was used as a basic skeleton. It has been confirmed that such a compound can be used as an effective therapeutic agent for infectious diseases, particularly against multidrug-resistant bacteria.
  • Test example 4 ⁇ Investigation of antibacterial spectrum of RH2180-5 Peak5 substance> The antibacterial spectrum of the above-mentioned RH2180-5 Peak5 substance against various microorganisms including MRSA and VRE was examined. When 10% serum was added and when serum was not added, the respective MIC values were measured by a micro sample dilution method based on CLSI (former NCCLS American Clinical Laboratory Standards Committee). Table 6 shows the measurement results.
  • Test Example 5 ⁇ Examination of bactericidal activity of RH2180-5 Peak 5 substance> CA-Mueller Hinton Broth medium was inoculated with 1.8 ⁇ 10 8 S. aureus, the above RH2180-5 Peak5 substance (25 ⁇ g / mL), vancomycin (VM, 5 ⁇ g / mL), gentamicin (GM, 2.5 ⁇ g / mL) ), And the number of viable cells after 15 minutes, 30 minutes, 60 minutes and 120 minutes was determined as CFU (colony forming unit / mL). The results are shown in Table 7.
  • the antibiotic-containing fraction obtained by culturing the microorganism with the accession number NITE BP-870 and fractionating the culture, and further the antibiotic obtained from the culture It has been found that the contained microbial control agent is useful.
  • a microbial control agent containing the RH2180-5Peak5 substance is useful, but a microbial control agent containing a fraction other than that of the RH2180-5Peak5 substance and containing a fraction prior to isolation as a substance is also useful. I found out.
  • Test Example 6 ⁇ Examination of lytic activity of RH2180-5 Peak 5 substance>
  • the S. aureus solution was diluted in CA-Mueller Hinton Broth medium, RH2180-5Peak5 substance, vancomycin and daptomycin were added at a concentration 5 times that used in Test Example 1 and cultured at 37 ° C.
  • an absorptiometer manufactured by Shimadzu Corporation
  • the absorbance at 600 nm after addition (OD 600 ) was measured over time. The results are shown in FIG.
  • Example 3 ⁇ Formulation of RH2180-5 Peak5 substance> ⁇ Tablet >> RH2180-5 Peak 5 substance 20.0 mg, lactose 40 mg, starch 20 mg, and low-substituted hydroxypropylcellulose 5 mg are uniformly mixed, and then granulated for tableting by wet granulation using hydroxypropylmethylcellulose 8 mass% aqueous solution as a binder. After adding 0.5 mg to 1 mg of magnesium stearate necessary for imparting lubricity to this, it was tableted using a tableting machine to obtain tablets.
  • RH2180-5 has many similarities in chemical properties with Lysobacter enzyme genes DSM 2043T strain, but the antibacterial spectrum of the bioactive substance produced is different, and the compound that is the main body of the bioactive substance has not been reported so far It is completely different in that it is a “RH2180-5 Peak 5 substance having useful pharmacological action and related compounds” having a basic cyclic peptide structure as a basic skeleton. This is a significant difference from existing strains. Therefore, from the above results, RH2180-5 was determined to be a novel microorganism belonging to the genus Lysobacter.
  • novel cyclic peptide compound of the present invention shows effectiveness against multidrug-resistant bacteria such as MRSA and VRE, which have been a major clinical problem, it can be used as a new therapeutic agent for infectious diseases.
  • novel microbial strain of the present invention can be suitably used for the production of the above-mentioned novel and useful cyclic peptide compounds.
  • the present invention provides a novel antibiotic-containing fraction, an antibiotic contained therein, an antibiotic-containing fraction and a method for producing a novel and useful antibiotic obtained therefrom. Has the above applicability.
  • SEQ ID NO: 1 is a base sequence corresponding to almost the entire length of 16S rRNA of an unknown strain belonging to the genus Lysobacter.

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Abstract

　従来の薬剤とは異なる化学構造を有する新規な化合物を提供すること、及び、新規な化合物を産生する新規な微生物を提供することにあり、更には、多剤耐性菌にも有効な新規な化合物を提供すること。更に、多くの候補化合物から目的の化合物を選別する際に抗菌活性だけでなく、治療効果も含めて評価して選別することで、実用化へのハードルの低いことが期待できる、治療効果の高い新規な化合物を提供することを課題とし、下記式（１）で示される環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩、及び、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０の微生物又はその自然的若しくは人工的に変異した微生物により課題を解決した。 ［式（１）中、Ｒ１は置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。］

Description

新規環状ペプチド化合物とその製造方法及び感染症治療薬、抗生物質含有画分、その抗生物質及びその抗生物質の製造方法並びに抗生物質産生微生物及びそれが産生した抗生物質
　本発明は、新規な化学構造を有する化合物とその製造方法、及びその化合物を含有する感染症治療薬とその化合物を産生する新規微生物に関する。
　また、本発明は、リソバクター属に属する新規な微生物の産生する培養物から分画された抗生物質を含有する画分、その抗生物質の製造方法及びそれから得られる抗生物質に関し、更に、上記画分から得られる、抗菌活性を示すが治療効果を示さない抗生物質と、抗菌活性を示し治療効果も示す抗生物質の使用方法とそれらの製造方法に関する。
　更に、本発明は抗生物質を産生する微生物、その微生物の培養による新規抗生物質の製造方法及びその新規抗生物質に関する。
　抗生物質は、微生物の防除や感染症の治療に必要不可欠なものとなっている。しかしながら、抗生物質の過度の使用はそれに対する耐性菌を生み、その結果多くの薬剤に耐性を有する多剤耐性菌が出現し臨床上大きな問題となっている。特にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下、「ＭＲＳＡ」と略記する）は、臨床現場での出現頻度が高く、社会的な問題に発展している。更に、ＭＲＳＡに対する最終的な治療薬として用いられることの多いバンコマイシンに対して耐性を有する腸球菌（バンコマイシン耐性腸球菌、以下、「ＶＲＥ」と略記する）も、本邦の臨床現場から分離されるようになり、多剤耐性菌に対する新たな治療薬の提供が切望されている。
　特に、ＭＲＳＡに有効なバンコマイシンに対して耐性を示すＶＲＥの出現は、より深刻に受け止められている。なぜならば、腸球菌自体が腸管内に常在している菌であるため潜在的な保菌者を発生させ易く、長期間、患者の体内に存在することによって他の菌に耐性遺伝子が伝播して、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）等を発生させる危険性が高まると予想されるからである。
　また、耐性菌出現の問題とは別に、バンコマイシン等に比べて安全性の点でも優れ、実質的に治療効果の高い抗生物質を求める声も大きく、そのため、ＭＲＳＡやＶＲＥに有効であると共に既存薬に比べて副作用等が少なく安全性も高い新規抗生物質を得るための検討が進められている。
　そのような新たな治療薬として完全化学合成による合成抗生物質であるリネゾリドが知られている。また、各種の微生物の産生する抗生物質の中から、上記の多剤耐性菌に有効性を示す抗生物質を見出すための検討も多数行われている（特許文献１～３）。これらのうち、特許文献１と２には、上記の多剤耐性菌に有効性を示す抗生物質を産生するリソバクター属に属する微生物とその微生物を用いた抗生物質の製造方法が記載されている。
　先の目的の為に、新規な化学構造を有する抗生物質の創出や既存の抗生物質の改良等の合成による探索と共に、これまで報告されていない新規で有用な抗生物質を産生する能力を有する新規微生物の探索も幅広く行われている。微生物の産生する抗生物質は生体内で産生される天然物であるため、化学合成品に比べて生体に対する安全性の高いものが多いと考えられるからである。
　新たな抗生物質を産生する微生物として、既に多くの種類の微生物が報告されており、本発明で用いるキサントモナス科のリソバクター属に属する微生物もそのような微生物として特許文献１、２、５等に報告されている。これらの内、特許文献２と特許文献５には、上記多剤耐性菌に抗菌活性を示す抗生物質を産生する菌とその菌を用いた抗生物質の製造方法が記載されている。
　多剤耐性菌の中でも、臨床上特に問題となっているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下、「ＭＲＳＡ」と略記する）、バンコマイシン耐性腸球菌（以下、「ＶＲＥ」と略記する）に対して抗菌活性を有し、かつ優れた治療効果を示す新たな抗生物質の提供が強く望まれている。しかしながら、これまで報告されている多剤耐性菌に有効な抗生物質はほとんどがＭＲＳＡのみに抗菌活性を示す抗生物質であり、同時にＶＲＥに対しても抗菌活性を示す抗生物質の報告例は少ない。ＭＲＳＡとＶＲＥの両者に有効な抗生物質の例としては、特許文献３に報告されている抗生物質の中に上記両多剤耐性菌にインビトロで抗菌活性を示す（以下、特に付記がない限り、抗菌活性は「インビトロで示される抗菌活性」の意味で記載する。）抗生物質が記載されている。
　また、特許文献１と特許文献２にはリソバクター（ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属、特許文献６にはフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、特許文献７にはストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する新規微生物とその微生物から産生され、製造される新規抗生物質が記載されている。
　一方、本発明者は、抗生物質の探索に有用に用いられる、カイコ（カイコガの幼虫）を実験動物とする「カイコ黄色ブドウ球菌感染モデル」（特許文献４）を構築し、その検討を進めていた。
特許第３３３９２３５号公報 特許第４０５４５７６号公報 特許第４０５７４２６号公報 特開２００７－３２７９６４号公報 特公平６－９９４４４号公報 特開２００３－１１３１９２号公報 特開２００７－１３１５５２号公報
　上記特許文献２と３には、ＭＲＳＡだけでなくＶＲＥに対しても有効性を示す抗生物質が記載されている。しかしながら、従来の報告例の多くは、特許文献１のようにＭＲＳＡに対する有効性だけが記載されており、ＶＲＥに対する有効性を示す抗生物質はほとんど報告されていないのが現状である。そこで耐性菌の出現の可能性を考慮すると、ＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも有効性を示し、特許文献２、特許文献３等の既存の抗生物質とは異なる化学構造を有し、耐性菌に対する作用機序も既存の治療薬と異なることが期待できる抗生物質の選択肢を更に増やす必要がある。
　また、従来の報告例のほとんどは、最小発育阻止濃度（以下、「ＭＩＣ」と略記することがある）で評価したインビトロにおける抗菌活性を中心に抗生物質が選択されており、インビボにおける治療効果を含めた評価によって抗生物質が選択された例はほとんどなく、最後に治療効果の篩が残っているため、実用化へのハードルが高いという問題がある。
　以上より、本発明の最初の課題は、従来の薬剤とは異なる化学構造を有する新規な化合物を提供することにあり、更には、多剤耐性菌にも有効な新規な化合物を提供することにある。
　また、多くの候補化合物から目的の化合物を選別する際に、抗菌活性だけでなく、治療効果も含めて評価して選別することで、既に実用化へのハードルが低くなっている「治療効果の高い新規な化合物」を提供することにある。
　更に、上記したように、多剤耐性菌をターゲットとした抗生物質は多いが、ＶＲＥに対して明確に有効性を示す抗生物質は少なく、実用化されているＶＲＥ用抗生物質としてはオキサゾリジノン系抗生物質であるリネゾリド(ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ)が知られている程度である。しかしながらリネゾリドは完全化学合成によって創出された合成抗生物質であり、生体に対する安全性の問題と既存薬剤に対する耐性菌の出現の可能性を考慮すると、ＶＲＥに有効な多剤耐性菌用の抗生物質の選択肢を更に増やす必要があった。
　一方、微生物の産生する物質からＶＲＥに対して有効性を示す抗生物質を得ることができれば、完全化学合成品に比べて医薬品の開発・製造に必要なハードルを低くできる可能性が高い。なぜならば、少なくとも、製造は培養法によって行うことができるため、特殊な触媒等の薬剤や高温高圧が必要な化学合成法による製造よりも低コストで安全な製造を行うことが可能と考えられるからである。
　そのような微生物の産生する物質でＶＲＥに有効な抗生物質として、上記特許文献２に記載の抗生物質の中に、ＭＲＳＡとＶＲＥの両者に抗菌活性を示す抗生物質が記載されている。しかし、それらは、インビボにおける感染症の治療効果（以下、特に付記しない限り、「治療効果」とは、インビボの評価系で確認された感染症の治療の効果の意味で記載する）を示すかどうかまでは記載されていない。これは、従来、抗生物質の治療における有効性は最小発育阻止濃度（以下、「ＭＩＣ」と略記する）で評価した抗菌活性の大きさがその抗生物質の治療効果の大きさに反映されるとして評価していたからである。従来は「治療効果」を簡便に評価する方法がなかったこともＭＩＣによる評価にたよらざるを得なかった理由と考えられる。しかしながら、後述する本発明者の検討結果からＭＩＣによって評価された「抗菌活性の大きさ」は、必ずしもそれらの抗生物質の「治療効果の大きさ」を反映していないことが確認されたのである。
　つまり、従来報告されている抗生物質については、そのほとんどがＭＩＣによる抗菌活性が評価されて選別され、「抗菌活性」の大きさのみが開示されているのであり、その「治療効果」の大きさについてまで開示されているとはいえないものであった。
　従って、微生物の産生する抗生物質を含有する画分（以下、「抗生物質含有画分」と記載する）や、その画分から得られる抗生物質を提供するにあたって、それらの示す抗菌活性だけでなく、その治療効果も評価した上で選別することが重要であり、従って、そのように選別された従来ない有用性の高い抗生物質含有画分や、その画分から得られる抗生物質を提供することが本発明の解決すべき課題となった。
　そして上記課題を解決することで、抗菌活性を示しかつ治療効果も示す抗生物質含有画分とそこから得られる抗生物質を選別できると共に、抗菌活性は示すが治療効果を示さない抗生物質含有画分や抗生物質を選別することも可能となることに思い当たった。更に、前者が感染症治療剤として有用性が高いことは当然であるが、従来注目されることがなかった後者の抗生物質含有画分等も、微生物防除剤として用いた場合、これらは治療剤として用いられることはないので多剤耐性菌の出現を実質的に考慮する必要がなく、従って微生物防除剤として好適に用いられる性質を有することに思い当たった。
　すなわち、本発明の２番目の課題は、従来ない有効性を有する微生物の産生する抗生物質含有画分、そこから得られる抗生物質とその製造方法を提供することであり、更に、上記抗生物質含有画分や抗生物質が、抗菌活性だけでなくその治療効果の有無も含めて評価されて選別された抗生物質含有画分と抗生物質を提供することである。更に、多剤耐性菌に治療効果を示す抗生物質含有画分と抗生物質を提供することである。また、上記抗生物質含有画分又は抗生物質を含有する微生物防除剤を提供することである。
　一方、微生物の産生する物質から得られる抗生物質は生体に対する安全性に関し合成品より優れている可能性が高いと予想され、そのような抗生物質は医薬品とするための開発ステップを軽減できると考えられる。例えば、製造方法においても化学合成の場合よりも生体に優しい原材料を用いることができ、工程や設備も、製造条件が常温常圧に近いので、より簡便で安全な工程・設備により行うことができるというメリットを有する。そのため、化学合成により創出された抗生物質より医薬品開発ステップを軽減できる可能性が高い。
　しかし、ＭＲＳＡに対して有効性を示すだけでなく、ＶＲＥに対しても抗菌性を示す抗生物質を産生する微生物については、特許文献２のような例はあるものの、実際の治療における治療効果や耐性菌の出現等を考慮すると、更に検討を進める必要があった。つまりＭＲＳＡだけでなくＶＲＥに対しても抗菌活性を有し、実際に治療効果を示す抗生物質を産生するという特徴を有する微生物を新たに見出すと共に、その微生物を用いたＭＲＳＡとＶＲＥの両者に有効性を示す新たな抗生物質とその製造方法の提供が望まれていた。
　また、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ等に対する抗菌活性の有無にかかわらず、広く新規な抗生物質を得るためには、新規な微生物の提供が望まれていた。
　本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、本発明の３番目の課題は、抗生物質を産生することができる新規な微生物を提供することにあり、また、抗生物質の製造方法に用いられる新規な微生物を提供することにある。特に、少なくともＭＲＳＡとＶＲＥの両者に有効性を示す多剤耐性菌に有効な新規な抗生物質を産生することができる新規な微生物を提供することにある。
　本発明者は、上記の事情に鑑み、抗生物質を産生する新規微生物と、その微生物から得られる抗生物質含有画分、そこから得られる抗生物質を得るために、上記微生物の培養上清から得られる抗生物質含有画分や、その画分に分離・精製処理を加えて得られた抗生物質を評価する方法の検討を行った。その結果、微生物や培養上清中の抗生物質を分離・精製する方法の取捨選択に当たり、各試料の抗菌活性については黄色ブドウ球菌に対するＭＩＣで評価し、それと共にそれらの治療効果についても併せて評価するという方法に思い当たった。そして、各試料の治療効果の大きさの評価方法として、上記した特許文献４の、カイコを実験動物として用いたカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを適用し、目的とする微生物株や上記有用性の高い抗生物質含有画分を取得するための検討を行った。
　その結果、国内各地で採取した土壌中から分離した土壌細菌１４３４６株の内その培養上清に黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を認めた菌株が３４８７株あり、それらの菌の培養上清の示す上記カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果を検討したところ、治療効果を示した微生物は４５株に減少した。このことから、ＭＩＣで評価した抗菌活性は、評価された抗生物質の、ＭＩＣ対象菌の惹起した感染症に対する「治療効果」を保証するものではないことが確認された。
　そして、上記４５株の培養上清から得られた抗生物質含有画分の抗菌スペクトルを検討したところ、４５株の中にＭＲＳＡとＶＲＥの両多剤耐性菌に抗菌活性を示す微生物が含まれており、更に、その微生物の培養物から分画された抗生物質含有画分中には、マウス黄色ブドウ球菌感染モデルにおいて、バンコマイシンと比較して同等又はそれより高い治療効果を示す抗生物質が含まれていることを見出した。そして、上記高い治療効果を示した抗生物質について、その化学構造を含めて詳細に検討したところ、その抗生物質は、新規抗生物質であることを確認した。
　また、他の抗生物質含有画分の抗菌スペクトルの検討や、その画分中の抗生物質の検討も行ったところ、他の抗生物質含有画分の抗菌スペクトルも上記新規抗生物質と同様であり、その化学構造も上記新規抗生物質の関連化合物であることが明らかとなり、最終分画段階の上記新規抗生物質以外の他の抗生物質含有画分も有用性の高い画分であることを確認した。
　また、上記新規抗生物質を含む画分の示す治療効果（ＥＤ５０：５０％効果用量）は、精製初期画分の３００倍に濃縮されているのに対し、抗菌活性（ＭＩＣ）は５倍に濃縮されているに過ぎないことが確認された。
　この事実は、後述する分画操作法によって得られた精製初期の抗生物質含有画分中には抗菌活性は比較的高いが治療効果をほとんど示さない抗生物質が高い割合で含まれていることを示している。従って、精製初期の抗生物質含有画分に含まれるこれらの抗生物質は感染症治療剤としては用い難いものと考えられた。
　しかしながら、見方を変えると、抗菌活性は高いが治療効果を示さないということは、そのような抗生物質は感染症の治療剤として用いることは実質的にないので、逆に微生物防除剤等の抗菌剤に適していると評価することができる。なぜならば、治療剤には用いられないので、抗菌剤として用いた場合に懸念される多剤耐性菌の出現を考慮する必要がないからである。また、精製後半の分画からは除かれているので、上記新規抗生物質との化学構造上の類似性もないことが確認されており、感染症治療剤として選別された抗生物質との交差反応による多剤耐性菌の出現も考慮する必要はない。
　つまり、精製初期の分画から得られる、抗菌活性は高いが治療効果が弱い抗生物質含有画分や、そこから得られる抗生物質も、微生物防除を用途とする場合は非常に有用性の高い画分である。
　更に、以上のＭＲＳＡとＶＲＥに抗菌活性を示す抗生物質含有画分や、抗生物質を産生する微生物は、性状分析や１６Ｓ　ｒＲＮＡの塩基配列等の解析結果、その産生物の新規性等からリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規微生物（以下、「ＲＨ２１８０－５」と表記する）であることも判明し、本発明の抗生物質含有画分やそこから得られる抗生物質は新規微生物から得られるものであることが明らかとなり本発明を完成するに至った。
　また、上記「マウス黄色ブドウ球菌感染モデル」において高い治療効果を示した抗生物質についてその化学構造を含めて詳細に検討したところ、その抗生物質は新規な化学構造を有する環状ペプチド化合物であることを確認した。また、培養上清中には、かかる物質以外にも同様の化学構造を有する関連の環状ペプチド化合物が含まれていること、それらも、かかる物質同様の抗菌スペクトルを示すことを確認した。
　すなわち、本発明は、以下を提供するものである。
＜１＞
　下記式（１）で示される環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［式（１）中、Ｒ１は置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。
＜２＞
　上記式（１）中のＲ１の置換基が水酸基である＜１＞に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
＜３＞
　上記式（１）中のＲ１が、３－ヒドロキシ－５－メチル－ヘキサノイル基、３－ヒドロキシ－６－メチル－ヘプタノイル基又は３－ヒドロキシ－７－メチル－オクタノイル基である＜１＞に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
＜４＞
　上記式（１）中のＲ１が３－ヒドロキシ－５－メチル－ヘキサノイル基であり、Ｒ２がメチル基であり、Ｒ３がエチル基である＜１＞に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
＜５＞
　上記式（１）中のＲ１が３－ヒドロキシ－７－メチル－オクタノイル基であり、Ｒ２がメチル基であり、Ｒ３がエチル基である＜１＞に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
＜６＞
　独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属するＲＨ２１８０－５株、又はその株と同様の化合物を産生する能力を有する変異株を培養し、その培養物から得られる＜１＞ないし＜５＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
＜７＞
　＜１＞ないし＜６＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物を産生する能力を有する、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属するＲＨ２１８０－５株、又はその株と同様の化合物を産生する能力を有する変異株を培養し、その培養物から製造することを特徴とする＜１＞ないし＜６＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩の製造方法。
＜８＞
　＜１＞ないし＜６＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩を、製薬学的に許容し得る担体と共に含んでなる感染症治療薬。
＜９＞
　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物には＜１＞ないし＜６＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩が含有され、該培養物を分画することによって得られることを特徴とする抗生物質含有画分。
＜１０＞
　上記抗生物質含有画分が、抗菌活性を示す抗生物質を含む画分である＜９＞に記載の抗生物質含有画分。
＜１１＞
　上記抗生物質含有画分が、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示すものである＜９＞又は＜１０＞に記載の抗生物質含有画分。
＜１２＞
　上記抗生物質含有画分が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示す抗生物質を含む画分である＜９＞ないし＜１１＞の何れかに記載の抗生物質含有画分。
＜１３＞
　上記抗生物質含有画分が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症にバンコマイシンに比較して同等又はそれより高い治療効果を示す抗生物質を含む画分である＜１２＞に記載の抗生物質含有画分。
＜１４＞
　上記抗生物質含有画分が、抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質を含有する画分である＜９＞又は＜１０＞に記載の抗生物質含有画分。
＜１５＞
　上記抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質が、微生物防除剤として用いられるものである＜１４＞に記載の抗生物質含有画分。
＜１６＞
　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物には＜１＞ないし＜６＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩が含有され、該培養物から、抗菌活性を示す抗生物質及び／又は感染症に治療効果を示す抗生物質を、分離・精製することを特徴とする抗生物質の製造方法。
＜１７＞
　上記抗生物質が、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示すものである＜１６＞に記載の抗生物質の製造方法。
＜１８＞
　上記抗生物質が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示すものである＜１６＞又は＜１７＞に記載の抗生物質の製造方法。
＜１９＞
　上記抗生物質が、抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質である＜１６＞に記載の抗生物質の製造方法。
＜２０＞
　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物には＜１＞ないし＜６＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩が含有され、該培養物から得られることを特徴とする抗生物質。
＜２１＞
　上記抗生物質が、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示すものである＜２０＞に記載の抗生物質。
＜２２＞
　上記抗生物質が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示すものである＜２０＞又は＜２１＞に記載の抗生物質。
＜２３＞
　上記抗生物質が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症にバンコマイシンに比較して同等又はそれより高い治療効果を示すものである＜２２＞に記載の抗生物質。
＜２４＞
　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物には＜１＞ないし＜６＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩が含有され、該培養物から得られ、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示し、かつ、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示すことを特徴とする抗生物質。
＜２５＞
　下記式（１）で示される＜２０＞ないし＜２４＞の何れかに記載の抗生物質。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［式（１）中、Ｒ１は水酸基を１つ有する炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。］
＜２６＞
　＜９＞又は＜１０＞に記載の抗生物質含有画分を含有することを特徴とする微生物防除剤。
＜２７＞
　＜２０＞に記載の抗生物質を含有することを特徴とする微生物防除剤。
＜２８＞
　リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０の微生物又はその自然的若しくは人工的に変異した微生物であって、下記式（１）で示される化合物又はその塩を産生する能力を有する微生物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［式（１）中、Ｒ１は水酸基を１つ有する炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。］
＜２９＞
　上記抗生物質が、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有するものである＜２８＞に記載の微生物。
＜３０＞
　配列表の配列番号１で示される１６Ｓ　ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する＜２８＞又は＜２９＞に記載の微生物。
　本発明によれば、感染症等に有効な新規な化学構造を有する化合物を提供することができる。更には、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ等の多くの多剤耐性菌に有効性を示す新規な化学構造を有する化合物又はその塩、及びそれらの製造方法、並びにそれらの化合物を産生する新規な微生物を提供することができる。
　更に、本発明によれば、新たな微生物により産生される有用な抗生物質を含有する画分と、その抗生物質を提供することができる。更に、該抗生物質の中には、ＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも抗菌活性を示すものがあり、また、黄色ブドウ球菌に高い治療効果を示すものがある。従って、極めて有用な新規抗生物質を含有する画分や、その新規抗生物質を提供することができるという効果を有している。
　更に、本発明によれば、抗菌活性を有する上記抗生物質を産生することのできる新規な微生物を提供することができる。特に、本発明の微生物が産生した抗生物質には、ＭＲＳＡやＶＲＥに抗菌活性を有し、治療効果も高いことが確認されているものが存在するので、多剤耐性菌に対して有効性の高い新規な抗生物質を産生することができる新規な微生物を提供することができるという効果を有している。
ＲＨ２１８０－５の培養物から得られた治療効果を示す物質を含有する画分のＯＤＳカラムによる分画結果を示す図である。縦軸は吸収強度、横軸は溶出時間（分）を示す。また別枠で表示した各ピークの欄上の数字は各ピーク物質の分子量を示す。 ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質のアミノ酸組成分析の解析結果を示す図である。 ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質の１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ分析の解析結果を示す図である。縦軸はシグナル強度、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。 ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質のＴＯＦ（Ｔｉｍｅ　ｏｆ　Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳのＭＳ－ＭＳ分析の解析結果を示す図である。 ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ１物質とＰｅａｋ２物質のＴＯＦ（Ｔｉｍｅ　ｏｆ　Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳのＭＳ－ＭＳ分析の解析結果を示す図である。 ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ３物質とＰｅａｋ４物質のＴＯＦ（Ｔｉｍｅ　ｏｆ　Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳのＭＳ－ＭＳ分析の解析結果を示す図である。 ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ６物質とＰｅａｋ７物質のＴＯＦ（Ｔｉｍｅ　ｏｆ　Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳのＭＳ－ＭＳ分析の解析結果を示す図である。 ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ８物質とＰｅａｋ９物質のＴＯＦ（Ｔｉｍｅ　ｏｆ　Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳのＭＳ－ＭＳ分析の解析結果を示す図である。 各解析結果から導き出されたＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質の化学構造を示す図である。 各解析結果から導き出されたＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質のアミノ酸の立体構造も明らかにした化学構造を示す図である。 ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質の溶菌活性を示す図である。
　以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。
＜本発明の環状ペプチド化合物＞
　本発明は、下記式（１）で表されることを特徴とする新規な化合物に係るものであり、３７員環の環状ペプチド構造を基本骨格とし、Ｒ１からＲ３の基の違いにより、複数の化合物が確認されている。これらは、本発明者が見出した、後述する新規微生物株であるイソバクター　エスピーＲＨ２１８０－５の培養物から、後述する最終精製段階であるＲＰ－ＨＰＬＣで分取されたピーク画分中から単離されたが、本発明の「下記式（１）で示される環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩」を得る方法は、上記方法には限定されず、如何なる方法で得られたものでもよく、微生物が産生したものには限定されない。
　なお、それぞれの単離・精製された化合物は、以下、便宜上、上記微生物株の株名にピーク名をつけ、例えば、ピーク１から得られた化合物であれば、「ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ１物質」、又は単に「Ｐ１」と表記することとする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［式（１）中、Ｒ１は置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。
　上記式（１）中のＲ１は、置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示す。上記アシル基の炭素数には「Ｃ＝Ｏ」の炭素数（１個）も含まれる。置換基を除いた「炭素数が７、８又は９のアシル基」は、「Ｒ’－Ｃ（＝Ｏ）－」で表わされ、ここで、Ｒ’は、炭素数が６、７又は８のアルキル基を示す。また、Ｒ’は直鎖であっても分岐を有していてもよいが、分岐を有していることが好ましい。また、分岐された部分はメチル基であることが好ましく、特に限定はないが、Ｒ’の「Ｃ＝Ｏ」とは反対側の末端は、「ＣＨ３（ＣＨ３）ＣＨ－」となっていることが特に好ましい。また、Ｒ’すなわちＲ１が分岐を有する場合には、上記Ｒ１の炭素数（７、８又は９）には、分岐された部分の炭素数も含まれる。また、下記表１に示すＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ１物質～ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ９物質における上記式（１）中のＲ１の置換基は、水酸基である。
　具体的には、上記式（１）中のＲ１は、３－ヒドロキシ－５－メチル－ヘキサノイル基、３－ヒドロキシ－６－メチル－ヘプタノイル基又は３－ヒドロキシ－７－メチル－オクタノイル基であることが好ましい。
　また、上記式（１）で示される「環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩」は、Ｒ１が３－ヒドロキシ－５－メチル－ヘキサノイル基であり、Ｒ２がメチル基であり、Ｒ３がエチル基であるものが好ましく、Ｒ１が３－ヒドロキシ－７－メチル－オクタノイル基であり、Ｒ２がメチル基であり、Ｒ３がエチル基であるものが好ましい。
　式（１）中に示されるＲ１、Ｒ２、Ｒ３と各ピークから得られた物質との関係を、表１に示す。この内、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質とＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ９物質についてはＲ１、Ｒ２、Ｒ３の構造が確定しているが、他のピークから得られた物質についてはＲ１の構造が完全には確定していないので、表１中のＲ１の構造式は主に精密質量分析の結果の解析と生合成経路からによるものである。後述する各ピーク物質の抗菌スペクトルの検討結果から、Ｒ１の違いは抗菌スペクトルに特に影響を与えていないという傾向が明確に認められている。従って、少なくともこれらの側鎖は、置換基を有していてもよいアシル基であればよく、好ましくは置換基を有していてもよい炭素数が７ないし９のアシル基であればよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　表１中、「高分解能質量分析」は、ＨＲ　ＴＯＦ　ＭＳ　ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋
＜本発明の環状ペプチド化合物の調製方法＞
　本発明の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩の調製方法は特に限定されず、微生物が産生したものであってもよいし、合成したものであってもよいし、それらを組み合わせたものでもよい。
＜本発明の環状ペプチド化合物の単離精製方法＞
　本発明の新規な環状ペプチド化合物の単離精製方法は、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果を指標として選択されたものであるが、その方法に特に限定されるものではなく、一般的に微生物の培養物から目的の化合物を精製する方法として用いられている方法を適宜組み合わせて実施すればよい。
　具体的には、溶媒抽出、転溶、水沈殿、ＯＤＳカラム等によるクロマトグラフィー、ＯＤＳカラム等を用いたＲＰ－ＨＰＬＣによる分取等が挙げられる。上記溶媒抽出の溶媒や転溶の溶媒としては特に限定はないが、アセトン等の水溶性溶媒；ブタノール等の親水性溶媒；それらの混合溶媒；水と親水性溶媒との混合溶媒；水と水溶性溶媒との混合溶媒；等が好ましい。また、ＯＤＳカラムの代わりに、オクチル基やブチル基で修飾した担体、ポリスチレン系のポリマー担体等を充填したカラムを用いてもよい。
　なお、上記した単離精製方法は一例に過ぎず、最終的に目的とする本発明の新規な環状ペプチド化合物が得られる方法であれば、如何なる単離精製方法であってもよい。
＜単離精製された本発明の環状ペプチド化合物の構造解析＞
　以上の精製方法を実施した場合、最終的にＲＰ－ＨＰＬＣによって、ＲＨ２１８０－５の培養物から少なくとも９つのピークに分けられる９つの化合物を分取することができる（図１）。これらは、ＲＰ－ＨＰＬＣより前段階の単離精製方法によっては単一の画分中に存在する化合物群であって、また、ＵＶ吸収パターンが類似していることから、互いに類似する化合物群である。
　これらの９つのピークのうちの主要なピークであるピーク５からのＲＰ－ＨＰＬＣ精製標品を構造解析の例として挙げる。その構造解析方法は既存の構造解析手段を適宜組み合わせて行えばよいが、次の解析手段により効率よく実施することができる。すなわち、精密質量分析による分子量測定、酸加水分解処理後のアミノ酸分析（図２）、１Ｈ－ＮＭＲと１３Ｃ－ＮＭＲによる解析（図３）、ＴＯＦ（Ｔｉｍｅ　ｏｆ　Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳ解析（図４はピーク５、図５はピーク１と２、図６はピーク３と４、図７はピーク６と７、図８はピーク８と９の、ＴＯＦ－ＭＳ解析結果。）、その他、ＵＶスペクトル（図１）や、赤外線吸収スペクトル（ＩＲ）で解析することができる。
　以上の構造解析手段を実施した結果、ピーク５から得られた物質は、精密質量分析により、分子量が１６１６．９［ＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＳで、（Ｍ＋Ｈ）＋が、ｍ／ｚ＝１６１７．８７５５］；アミノ酸分析により、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｒｇがそれぞれ２分子、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅがそれぞれ１分子検出された（図２）。そして、最終的にピーク５から得られた物質は、式（１）のＲ１が３－ヒドロキシ－５－メチル－ヘキサノイル、Ｒ２がメチル、Ｒ３がエチルである新規な環状ペプチド骨格を有する新規な化合物であることが判明した。そしてこの新規な化合物を、「ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質」（以下、単に「Ｐ５」と記載することもある。）と命名した。
　また、同様に、ピーク９から得られた物質は、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質のＲ１の炭素数が２つ延長した形の化合物であることが確定し、「ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ９物質」（以下、単に「Ｐ９」と記載することもある。）と命名した。また、他のピークから得られた物質も、同じ環状ペプチド構造を基本骨格として有する化合物であることが判明し、同様に「ＲＨ２１８０－５」にＰｅａｋ番号ｎを付する形で命名した（以下、単に「Ｐｎ」と記載することもある。）。
＜本発明の環状ペプチド化合物ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質の物理化学的性状＞
　以上の本発明の新規な環状ペプチド構造を有する新規な化合物のうち、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質の物理化学的性状は次の通りである。
（１）高分解能質量分析値　ＨＲ　ＴＯＦ　ＭＳ　ｍ／ｚ　（Ｍ＋Ｈ）＋：
　　　１６１７．８７５５
　　　ＴＯＦ（Ｔｉｍｅ　ｏｆ　Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳ解析：図４
（２）１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ：図３
（３）溶媒への溶解性：
　　　水、エタノール、メタノール、アセトニトリルに溶解
　　　クロロホルムに不溶
（４）外観：白色粉末
＜本発明の環状ペプチド化合物の微生物を用いた製造方法＞
　本発明の新規な環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩は、化学合成によっても、それを産生する微生物の培養によって得られるものであってもよく、製造方法は特に限定されないが、上記の環状ペプチド化合物を産生する能力を有する、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属するＲＨ２１８０－５株、又はその株と同様の化合物を産生する能力を有する変異株を培養し、その培養物から製造することが好ましい。
　すなわち、本発明は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属するＲＨ２１８０－５株、又はその株と同様の化合物を産生する能力を有する変異株を培養し、その培養物から得られる前記式（１）で表わされる環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩でもある。
＜本発明の抗生物質含有画分＞
　更に、本発明は、配列表の配列番号１で示される１６Ｓ　ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物には上記の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩が含有され、該培養物を分画することによって得られることを特徴とする抗生物質含有画分である。
　なお、バクテリアの一般的な性状として、その菌株としての性質は変異し易いため、ＲＨ２１８０－５が、上記した性状の範囲内に留まらない可能性も有している。しかしながら、ＲＨ２１８０－５（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０）から変異した微生物であってもリソバクター属に属する微生物であり、抗生物質含有画分を産生する能力を有している限り、ＲＨ２１８０－５（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０）に含まれるものである。
　また、上記変異には自然的な変異と人工的な変異の両方を含むことは言うまでもないことである。
　本発明の抗生物質含有画分は、上記ＲＨ２１８０－５を培養し、その培養物に対して何らかの分画処理を施したものを言う。ここで「培養物」とは、培養上清、培養した菌体、培養した菌体の破砕物等の何れをも意味するものである。また、「分画処理」とは、通常、培養物に対して行われる抽出、沈殿、膜分離、転溶、クロマトグラム等の、目的物質の分離・精製を目的として行われる処理を全て含むものである。
　本発明の抗生物質含有画分の使用については、そこに含まれる抗生物質が、抗菌活性を示し、更に治療効果も示すものは、感染症治療剤の製造に用いることができ、抗菌活性を示すが、治療効果を示さないものは、微生物防除剤の製造に用いることができる。抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質を含有する抗生物質含有画分は、本発明の１つの態様である。
　微生物防除剤としての使用方法は、特に制限はないが、例えば、抗菌性が求められる資材、用具等の表面に塗布、浸漬、湿潤させて用いる方法を挙げることができる。より具体的には、例えば、医療用のガーゼや包帯等に付着させたり浸潤させて用いたり、絆創膏等の各種の皮膚用粘着シートに用いる粘着剤の抗菌成分や塗り薬中の抗菌成分として好適に用いることができる。本発明の抗生物質含有画分は、抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質が微生物防除剤として用いられる（微生物防除剤としての用途に用いられる、及び／又は、微生物防除剤として用いられる性能を有している）ものであることが好ましい。
　通常、抗生物質は、多剤耐性菌の出現に留意する必要から微生物防除剤として用いることは難しいが、本発明における治療効果を示さない抗生物質含有画分とそこから得られる抗生物質は、そのような心配なしに微生物防除剤として用いることができる。微生物防除剤として用いる場合、抗生物質含有画分は、画分のまま用いたり、画分を濃縮するだけでも用いたりすることができ、また、その画分から抗生物質を分離・精製して、その抗生物質を用いることもできる。それらの処理はそれぞれの用途に応じて選択すればよい。
　以上、治療効果の有無を問わず、本発明の抗生物質含有画分は、ＲＨ２１８０－５を培養し、培養物を分画処理することによって得ることができる。
　本発明の抗生物質含有画分と各画分から得られる抗生物質を産生する微生物は、沖縄の土壌中から分離した多くの微生物の中から、ＭＩＣによる抗菌活性と、特許文献４に記載されたカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いた方法で治療効果を評価されて選別された微生物である。
＜本発明の微生物であるＲＨ２１８０－５について＞
　以下、本発明の微生物であるＲＨ２１８０－５について詳述する。リソバクター属に属する「ＲＨ２１８０－５株」と命名した微生物（以下、「ＲＨ２１８０－５」と表記する）を新規に発見した。このＲＨ２１８０－５は、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８、独立行政法人製品評価技術基盤機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ、以下、「ＮＩＴＥ」と略記する）、特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、２０１０年１月２５日に国内寄託され、受託番号「ＮＩＴＥ　Ｐ－８７０」として受託された微生物である。
　「ＲＨ２１８０－５」は、その後、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、原寄託申請書を提出して、国内寄託（原寄託日：２０１０年１月２５日）から、ブダペスト条約に基づく寄託への移管申請を行ない（移管日（国際寄託日）：２０１１年５月２０日）、生存が証明され、ブダペスト条約に基づく寄託（国際寄託）への移管申請が受領された結果、受託番号「ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０」を受けているものである。
　本発明の微生物は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０の微生物又はその自然的若しくは人工的に変異した微生物であって、抗菌活性を有する抗生物質を産生する能力を有する微生物である。リソバクター属に属する新規な微生物であることは、後述する本菌株の性質と１６Ｓ　ｒＲＮＡ領域の配列から同定された。
　形態：本ＲＨ２１８０－５は、グラム陰性の桿菌であり、鞭毛は認められないが滑走性が認められる。子実体の形成は認められない。また抗酸性を示さない。
　培地における生育状況：
（１）肉汁寒天平板上では薄黄色のコロニーを形成する。拡散性の色素は認められない。
（２）肉汁ゼラチン穿刺培養では内部に渡ってゼラチンを液化しながら生育する。
　生理学的性質：本ＲＨ２１８０－５の生理学的、化学分類学的性質は以下の通りである
（１）生育ｐＨ（最適生育ｐＨ）：５～９（６～８）
（２）生育温度（至適生育温度）：１０～４０℃（２５～３０℃）
（３）酸素に対する態度：好気的
（４）ＭＲテスト（Ｍｅｔｈｙｌ　ｒｅｄ　ｔｅｓｔ）：－
（５）ＶＰテスト（Ｖｏｇｅｓ－Ｐｒｏｓｃａｕｅｒ　ｔｅｓｔ）：＋
（６）色素の生成（Ｐｉｇｍｅｎｔ）：＋
（７）オキシダーゼ（Ｏｘｉｄａｓｅ　ｔｅｓｔ）：＋
（８）カタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ　ｔｅｓｔ）：＋
（９）ウレアーゼ（Ｕｒｅａｓｅ　ｔｅｓｔ）：－
（１０）フォスファターゼ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｔｅｓｔ）：＋
（１１）カゼイン加水分解（Ｃａｓｅｉｎ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：＋
（１２）セルロース加水分解（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：－
（１３）ゼラチン加水分解（Ｇｅｌａｔｉｎ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：＋
（１４）でんぷん加水分解（Ｓｔａｒｃｈ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：－
（１５）デオキシリボヌクレアーゼ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｔｅｓｔ）：＋
（１６）硝酸塩還元（Ｎｉｔｒａｔｅ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）：－
（１７）脱窒（Ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）：－
（１８）硫化水素生成（Ｈ２Ｓ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）：－
（１９）インドール生成（Ｉｎｄｏｌｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）：－
（２０）クエン酸塩の利用（Ｃｉｔｒａｔｅ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）：＋
（２１）ＯＦ－ｔｅｓｔ：ｏｘｉｄａｔｉｏｎ
（２２）下記の糖類等からの酸及びガスの生成能
Ｌ－アラビノース（Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ）：－
Ｄ－キシロース（Ｄ－ｘｙｌｏｓｅ）：－
Ｄ－グルコース（Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）：＋
Ｄ－マンノース（Ｄ－ｍａｎｎｏｓｅ）：＋
Ｄ－フラクトース（Ｄ－ｆｒｕｃｔｏｓｅ）：＋
Ｄ－ガラクトース（Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ）：－
Ｄ－マルトース（Ｄ－ｍａｌｔｏｓｅ）：＋
Ｄ－スクロース（Ｄ－ｓｕｃｒｏｓｅ）：＋
Ｄ－ラクトース（Ｄ－ｌａｃｔｏｓｅ）：＋
Ｄ－トレハロース（Ｄ－ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）：＋
Ｄ－ソルビトール（Ｄ－ｓｏｒｂｉｔｏｌ）：－
グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）：－
スターチ（ｓｔａｒｃｈ）：－
　分子生物学的解析結果：分子生物学的な系統分類の指標として用いられている１６Ｓ　ｒＲＮＡに関するＲＨ２１８０－５の解析結果は以下の通りである。
＜＜１６Ｓ　ｒＲＮＡ配列＞＞
（１２）１６Ｓ　ｒＲＮＡ配列の解析結果
　ＲＨ２１８０－５のコロニーから、コロニーＰＣＲにより、１６Ｓ　ｒＲＮＡ領域の塩基配列を増幅し、シーケンサーによる解析を行った結果、５’末端側、３’末端側のいくつかの塩基を除く１６Ｓ　ｒＲＮＡのほぼ全長に当たる塩基配列が見出された。この塩基配列を配列表の配列番号１に示す。配列表の配列番号１の塩基配列は、１６Ｓ　ｒＲＮＡの全長ではないため、１６Ｓ　ｒＲＮＡ「領域」とした。この塩基配列をＮＣＢＩのＢＬＡＳＴで相同性検索を行ったところ、ＲＨ２１８０－５の１６Ｓ　ｒＲＮＡ領域の塩基配列は、リソバクター属であるＬｙｓｏｂａｃｔｅｒ　ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ　ＤＳＮ２０４３Ｔ株の塩基配列と相同率９９％を示した。なお、上記Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ　ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓには、抗生物質産生の報告はないので、ＲＨ２１８０－５とは異なるものである。
　以上のＲＨ２１８０－５の性質をバージース・マニュアル・オブ・システマティックバクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３　１９８９）による分類及びその他の文献の記載内容に照らし合わせ、更に、１６Ｓ　ｒＲＮＡ解析の結果を考慮して総合的に判断した結果、ＲＨ２１８０－５は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物であると判断した。
＜ＲＨ２１８０－５の新規性等＞
　また、ＲＨ２１８０－５の１６Ｓ　ｒＲＮＡ領域の塩基配列に一致する１６Ｓ　ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する微生物が存在しないこと、ＲＨ２１８０－５の産生する化合物が、上記したように、新規な環状ペプチド構造を基本骨格とする新規な化合物であること、また、その化合物がＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも抗菌活性を示し、ＭＲＳＡによる感染症に対しマウスにおいて治療効果が確認されたこと、後述するＲＨ２１８０－５の産生する抗生物質のいくつかが、ＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも抗菌活性を示すという先行例の少ない抗菌スペクトルを有すること、黄色ブドウ球菌による感染症に、バンコマイシンに比較してより高い治療効果を示すこと、これまでに報告されていない有用性の高い新規な抗生物質を産生する等を含め総合的に判断した結果、ＲＨ２１８０－５は、新規な微生物株であると判断した。
　ＲＨ２１８０－５は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）、特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、国際寄託され、受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０（原寄託日：２０１０年１月２５日、国際寄託日（移管日）：２０１１年５月２０日）を受けており、入手可能である。なお、バクテリアの一般的な性状として、その菌株としての性質は変異し易いため、ＲＨ２１８０－５は、先に示した生理学的性状の範囲内に留まらない可能性も有している。また、かかる「変異」には、自然的な変異と人工的な変異の両方を含むことは言うまでもない。ＲＨ２１８０－５（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０）から変異した微生物であっても、抗生物質を産生する能力を有している限り、本発明の微生物に含まれるものである。本発明の前記式（１）で示される環状ペプチド化合物は、ＲＨ２１８０－５（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０）から変異した微生物が産生したものも含まれる。また、本発明の抗生物質含有画分とそこから得られる抗生物質は、このＲＨ２１８０－５の培養物から得ることができる。
　すなわち、本発明の微生物は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０の微生物又はその自然的若しくは人工的に変異した微生物であって、抗菌活性を有する抗生物質を産生する能力を有する微生物である。また、配列表の配列番号１で示される１６Ｓ　ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する上記の微生物である。好ましくは、本発明の微生物は、上記式（１）で示される化合物又はその塩を産生する能力を有する微生物である。
　更に好ましくは、本発明の微生物は、産生される抗生物質が、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有するものである上記の微生物である。すなわち、少なくともＭＲＳＡ及びＶＲＥに抗菌活性を有する抗生物質を産生する能力を有しているＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０の微生物や、ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０から変異した微生物は、更に好ましい本発明の微生物に含まれるものである。また言うまでもなく、その変異には自然的な変異と人工的な変異を含むものである。
＜ＲＨ２１８０－５の培養方法＞
　以下に、ＲＨ２１８０－５の培養方法について記載する。本発明の新規な環状ペプチド構造を有する新規な化合物、抗生物質含有画分等を産生するＲＨ２１８０－５の培養方法は、リソバクター属の微生物に対して行われる一般的な培養方法に準じて行えばよい。具体的には、ＲＨ２１８０－５を、ＹＭＥ培地、ＳＧＭ培地、ＣＤＹ培地、ＹＰＧＭ培地等の栄養源含有培地に接種し、好気的条件下で培養を行う。培地中の炭素源としては、例えば、Ｄ－グルコース、Ｄ－フラクトース、シュクロース、デンプン、デキストリン、グリセリン、糖蜜、水飴、油脂類等の有機炭素化合物が用いられ、窒素源としては、肉エキス、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、胚芽、大豆粉、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩等の有機・無機窒素化合物を用いることができる。また、塩類は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、コバルト塩等の無機塩類を必要に応じて適宜添加する。更に、ビオチン、ビタミンＢ１、シスチン、オレイン酸メチル、ラード油等の生育促進物質を添加することが、目的物の産生量を増加させる点で好ましい。また、シリコン油、界面活性剤等の消泡剤を添加してもよい。
　培養条件は、先に記したように好気的条件下で培養することが好ましく、液体培養法であれば通気攪拌培養が望ましい。小規模であればフラスコによる振とう培養法を用いてもよい。培養温度は２０℃～４０℃で可能であるが、２５℃～３５℃間に保つことが好ましく、３０℃近辺で行うことがより好ましい。培養ｐＨは、６～８が好ましく、７付近で行うことが特に好ましい。培養期間は、用いた培地組成、培養温度等により変動するファクターであるが、ＲＨ２１８０－５の場合、通常は１～２０日間程度、好ましくは３～７日間程度の短期間に充分な量の目的物を確保することができる。
＜抗菌活性成分の精製方法＞
　ＲＨ２１８０－５の培養物からの抗菌活性成分の回収は、通常の微生物培養物から生理活性物質を回収し精製する方法で行えばよい。ここで培養物とは、培養上清、培養菌体、培養菌体破砕物を含むものである。例えば、培養物に抽出処理としてアセトン等の適当な有機溶媒を加えて懸濁した後に、遠心分離やろ過膜分離等を行って菌体と分離した抽出上清に対して、通常用いられる単離精製処理を加えればよい。また必要に応じて残った菌体残渣を摩砕処理等してから再度抽出処理を行ってもよい。
　通常、目的物質の分離・精製時に用いられる抽出溶媒や分離・精製手法は、ＭＩＣで判定された抗菌活性の濃縮度を指標として、その取捨選択が行われる。単なる抗菌活性成分の分離、濃縮であれば基本的にそのような手法でも問題はない。しかしながら、本発明のＲＨ２１８０－５の産生する抗生物質含有画分や抗生物質の分離・精製に当たっては、ＭＩＣの結果だけでなく、特許文献４で示したカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルに対する治療効果を指標とした選択を行っている。その結果、ＭＩＣの結果を見ただけでは濃縮・精製することが困難であったと考えられる「ＲＨ２１８０－５の産生する新規な抗生物質」の濃縮・精製が成し遂げられたのである。そこで、その点に関し次に記載する。
＜カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果を指標とした抗生物質の分離・精製＞
（ＭＩＣによる有用菌株の絞込み）
　本発明においても、数万株の非常に多くの菌株から有用菌株の絞込みを行う一次スクリーニングは、抗菌活性を評価する方法であれば何れの方法でも行うことができるが、例えば、ＭＩＣを指標として各種菌株の培養上清中に黄色ブドウ球菌に対して抗菌活性の認められた検体をピックアップすることができる。まったく抗菌活性を認めない菌株は検討対象とならないからである。抗菌活性を評価する方法であれば何れの方法であってもよいが、ＭＩＣを指標として各種供試菌株の培養上清中に黄色ブドウ球菌に対して抗菌活性の認められた菌株をピックアップする方法が好ましい。その後、菌株数が数千から数百程度に絞り込まれたら、それらから得られる抗生物質含有画分や抗生物質の治療効果の評価はカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いてそのＥＤ５０を測定することで検討することができる。
　カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルに対して治療効果の認められた菌株については、更に各種の分離・精製操作を行い、操作ごとにカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルで治療効果を評価する。また各精製段階の抗生物質含有画分を投与して行った分離・精製操作の種類や手法による治療効果の濃縮度についてもカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルで確認する。そうして「治療効果」を効果的に濃縮できる分離・精製操作の種類や手法を選別していく。
　このような「治療効果を指標にした菌株や分離・精製操作方法の取捨選択」をマウス等の実験動物を用いて行うことは、手法上・コスト上・倫理上の問題から事実上不可能であり、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを利用することによって始めて成し遂げられたものである（実施例１参照）。
　表２の結果は、ＲＨ２１８０－５の培養液から精製される各精製段階の検体の抗菌活性ＭＩＣと、カイコ感染モデルの治療効果ＥＤ５０をまとめたものである。表２中、全活性「ｕｎｉｔ」とは、体重１ｇの黄色ブドウ球菌に感染したカイコの、５０％の確率で生存に必要な活性量と定義される。
　表２に示すように、極めて興味深いことに、行った単離精製操作によって、抗菌活性の濃縮度と、治療効果の濃縮度は、必ずしも一致しないことが明らかとなった。表２の結果は、ＥＤ５０が３００倍に濃縮されているのに対し、ＭＩＣは、この場合に行った単離精製方法では、５倍に濃縮されているに過ぎないことを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表２の結果は、ＥＤ５０がアセトン抽出段階の９０から最終精製段階のＲＰ－ＨＰＬＣの分画ピーク０．３と、３００倍に濃縮されているのに対し、ＭＩＣは、この分離・精製方法では、２５から５と、５倍に濃縮されているに過ぎないことを示している。また、治療活性の回収率は、アセトン抽出物を１００％としたとき、質量％の回収率では僅かに０．１％に過ぎない２つのピークだけで３０％近くに達していることを示している。
　また、アセトン抽出以降の残渣部分は、抗菌活性は示すが治療効果を示さない抗生物質を比較的多く含むと考えられるので、それらを回収し濃縮することで抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質含有画分として用いることができる。
　ＲＨ２１８０－５は、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いた治療効果を指標とした分離・精製方法を用いることによって効果的に見出された。なぜならば、従来から行われている抗菌活性のみを指標として目的物の分離・精製方法を行った場合には、治療効果の点では有効でない抗菌活性成分が濃縮されてしまい、生体内で治療効果の高い抗生物質を見逃してしまう可能性が高いことが表２の結果から推察されるからである。そして、その場合には、ＲＨ２１８０－５の有用性を確認することはできずに、ＲＨ２１８０－５自体を見逃してしまった可能性が高いのである。従って、新規微生物（ＲＨ２１８０－５）を提供するにあたり、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いる治療効果を指標として取捨選択が行われたことが、本発明における非常に重要なポイントである。
（最小発育阻止濃度ＭＩＣによる抗菌活性の評価）
　ＲＨ２１８０－５の産生した培養物からの各分画段階の抗生物質含有画分や、そこから分離・精製した抗生物質の抗菌活性は、ＭＩＣによって評価することができる。ＭＩＣは一般的に認められている標準法に従って実施する。例えば、ＣＬＳＩ（旧ＮＣＣＬＳ米国臨床検査標準委員会）に基づく微量液体希釈法によって実施する。
　また、感受性の判定基準は、菌株毎に異なるので、上記ＣＬＳＩの定める判定基準に基づき、Ｓ：感受性、Ｉ：中間、Ｒ：耐性、の各カテゴリー分けを行う。
（抗生物質含有画分について）
　ここで、ＲＨ２１８０－５（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０）を培養し、その培養物を分画することによって得られる本発明の「抗生物質含有画分」とは、ＲＨ２１８０－５の培養物から、抗菌活性及び／又は治療効果を示す抗生物質を含む画分を分画したもの、その分画から一部の物質を分離・抽出した画分、分離・抽出した画分中の抗生物質を部分的に精製した画分、更に、純物質までに精製した抗生物質を含む画分の何れの画分をも意味するものである。
　また、表２のアセトン抽出物やブタノール抽出物、特にブタノール抽出物は、その後の精製工程の抗菌活性の濃縮度の低さと、逆に治療効果の濃縮度の高さから、後記する表４の９つのピーク（抗生物質含有画分）に含まれる抗生物質に比して、抗菌活性は示すが治療効果を示さないか、非常に弱い抗生物質を多く含む抗生物質含有画分であると考えることができる。このような抗生物質含有画分は、通常は有用性が低いと判断されるが、以下の理由により有用性が高く、本発明に含まれる抗生物質含有画分と判断することができる。
　つまり、抗菌活性が高い抗生物質は感染症の治療剤として用いられる場合には、多剤耐性菌の出現を考慮して使用に際してはその必要性を充分に吟味して使用されるべきものである。一方、抗生物質を微生物防除剤等の抗菌剤として用いた場合には、その使用態様からどうしても乱用されることとなり、その使用に制限をつけることは難しいので、抗菌活性が高くても、治療に用いる抗生物質を微生物防除用に用いることはない。
　しかしながら、本発明の抗菌活性は示すがカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルやその他の微生物感染モデルで治療効果を示さないか弱いと評価された抗生物質を多く含む抗生物質含有画分や、そこから抗菌活性は示すが治療効果を示さないか弱い抗生物質として得られた抗生物質は、微生物防除剤等のインビトロの用途に用いることが可能である。なぜならば、それらの抗生物質含有画分は、感染症治療剤として用いられることはないので、多剤耐性菌の出現を考慮する必要がないからである。本発明において、抗菌活性は示すが「実質的に治療効果を示さない」とは、治療剤として用いることのできる程度の治療効果を示さないという意味である。
　この実質的に治療効果を示さない抗生物質の分離・精製に当たっては、上記治療効果を示す抗生物質と同じ評価方法を用いればよく、具体的には、ＭＩＣで抗菌活性を示し、感染症モデルで治療効果が弱いか、治療効果を示さない抗生物質が分離・精製される方法を選択して実施すればよい。この際の感染症モデルに特に制限はないが、治療効果を示す抗生物質と同様にカイコ黄色ブドウ球菌感染モデル等カイコを用いた感染症モデルを好適に用いることができる。
　また、治療効果を示さない抗生物質の分離・精製は、そのことのみを目的として行ってもよいが、治療効果を示す抗生物質の分離・精製方法の検討を行った結果を利用する方法がより好ましい。つまり、抗生物質含有画分に対して治療効果を示す抗生物質を回収する方法を施し、その残渣に対して治療効果を示さない抗生物質の濃縮・分離・精製操作を行う方法を施すことによって特段の検討なしに抗菌活性を示すが治療効果を示さない抗生物質の分離・精製を行うことができる。
　次いで、抗生物質含有画分からの抗生物質の分離・精製方法について、治療効果を示す抗生物質の分離・精製方法を例として記載する。
（抗生物質の分離・精製方法）
　カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果を指標として選択される分離・精製方法に特に限定はないが、培養物の溶媒抽出、転溶、水沈殿、ＯＤＳカラム等によるクロマトグラフィー、ＯＤＳカラム等を用いたＲＰ－ＨＰＬＣによる分取等を挙げることができる。上記溶媒抽出の溶媒や転溶の溶媒としては特に限定はないが、アセトン等の水溶性溶媒；ブタノール等の親水性溶媒；それらの混合溶媒；水と親水性溶媒との混合溶媒；水と水溶性溶媒との混合溶媒；等が好ましい。また、ＯＤＳカラムの代わりに、オクチル基やブチル基で修飾した担体、ポリスチレン系のポリマー担体等を充填したカラムを用いてもよい（表２参照）。
　なお、上記した分離・精製方法は一例に過ぎず、最終的に目的とする抗生物質含有画分や抗生物質が得られる方法であれば、如何なる分離・精製方法であってもよい。
（分離精製された抗生物質の構造解析）
　以上のＲＰ－ＨＰＬＣによって、ＲＨ２１８０－５の培養物から９つのピーク（抗生物質含有画分に相当）に分けられる化合物を分取することができた（図１）。これらはＵＶ吸収パターンが類似していることから互いに類似する化合物であり、ＲＰ－ＨＰＬＣより前段階の分離・精製方法によっては単一の成分となっている。
　これらのピーク中に含まれる抗生物質の化学構造の解析方法に特に限定はなく、任意の方法を用いればよいが、例えば、これらの９つのピークのうち主要なピークであるピーク５のＲＰ－ＨＰＬＣ精製標品の構造解析は次の解析手段により行われた。
　すなわち、精密質量分析による分子量測定、酸加水分解処理後のアミノ酸分析（図２）、１Ｈ－ＮＭＲ解析や１３Ｃ－ＮＭＲ解析（図３）、ＴＯＦ（Ｔｉｍｅ　ｏｆ　Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳ解析（図４）等を実施した結果、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｒｇがそれぞれ２分子、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅがそれぞれ１分子検出され（図４）、図９に示す新規骨格構造を有する新規抗生物質（以下、「ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質」と表記する）であることが判明した。
（抗菌スペクトル）
　上記各ピークに含まれる抗生物質の示す抗菌スペクトルは、上記したＭＩＣによって検討することができる。それによって、例えば、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質は、試験例１の表３に示すように、黄色ブドウ球菌、腸球菌等のグラム陽性細菌に対して抗菌活性を示した。更に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）だけでなくバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対しても抗菌活性を有し、多剤耐性細菌にも有効であることを確認することができた（表３参照）。
　また、ピーク６とピーク９に含まれる抗生物質も、ＭＲＳＡとＶＲＥに対しＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質と同様の抗菌スペクトルを示した（表３参照）。
　更に、ピーク１を除く、ピーク２、ピーク３、ピーク４、ピーク７、ピーク８に含まれる抗生物質の、多剤耐性菌と薬剤耐性を示さない菌に対する抗菌活性について検討したところ、上記ピークに含まれる抗生物質も、ピーク５、ピーク６、ピーク９と同様に多剤耐性菌と薬剤耐性を示さない菌に対して同様の抗菌活性を示し、多剤耐性の影響を受けていないことが確認された（試験例２の表４参照）。
　以上から、本発明の抗生物質含有画分に含有される治療効果を有する抗生物質は、ＲＨ２１８０－５（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０）の培養液から得られる、該微生物の産生した抗生物質であって、ＭＲＳＡ及びＶＲＥに対して抗菌活性を有することを特徴とする抗生物質であることが確認できる。
＜マウス黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果＞
　ＲＨ２１８０－５の産生する抗生物質は、各精製工程においてカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおいてその治療効果を有することが確認されている。前記特許文献４において、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルに治療効果を示す物質は、マウス感染モデルに対しても治療効果を示すことが確認されている。そこで、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質に対しても同様の確認を行ったところ、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質はマウス感染モデルにおいても治療効果を示し、そのＥＤ５０値は０．６ｍｇ／ｋｇとなりバンコマイシンの１．６ｍｇ／ｋｇよりも明確に低く治療効果の高いことが確認された。（試験例３の表５参照）
　また、マウスに対する急性毒性試験の結果は、５０ｍｇ／ｋｇの投与量ではマウスは殺傷されなかったことから、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質は低毒性である。
　以上の結果から、ＲＨ２１８０－５の産生する本発明における抗生物質ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質は、黄色ブドウ球菌に対してバンコマイシンに比べて優れたＥＤ５０値を示し、高い治療効果を示すと共に、臨床上非常に問題となっているＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも有効性を示すという優れた特徴を有していることが確認できた。
　すなわち、ＲＨ２１８０－５の産生する本発明の抗生物質含有画分は、少なくとも黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示す抗生物質を含んでおり、また、その抗生物質は、上記感染症に対し、バンコマイシンに比較して同等又はそれより高い治療効果を示すものである。
　また、他のピーク中の物質（抗生物質含有画分中の抗生物質に相当）も、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質と同様の抗菌スペクトル（ピーク６とピーク９で確認）とＵＶスペクトルを示すことから、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質と類似する化合物と考えられる。また、そのため治療効果もＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質と同様の傾向を示すものと推察される。
　ピーク５からのＲＰ－ＨＰＬＣ精製標品と同様に、その他のピークも、精密質量分析による分子量測定、酸加水分解処理後のアミノ酸分析、１Ｈ－ＮＭＲと１３Ｃ－ＮＭＲによる解析、ＴＯＦ型ＭＳ解析、ＵＶスペクトル、赤外線吸収スペクトル（ＩＲ）で構造解析した結果、下記式（１）と表１で示される化合物であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 ［式（１）中、Ｒ１は水酸基を１つ有する炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。］
　本発明は、上記式（１）で示される前記の抗生物質であることが好ましく、上記式（１）で示される抗生物質としては、上記表１で示されるものが特に好ましい。
　上記ＲＨ２１８０－５（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０）を培養し、その培養物には上記の環状ペプチド化合物又はその塩が含有され、該培養物から抗菌活性を示す抗生物質、及び／又は、感染症に治療効果を示す抗生物質を分離・精製する方法は有用な抗生物質を製造する方法として用いることができる。該ＲＨ２１８０－５（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０）は、配列表の配列番号１で示される１６Ｓ　ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する。
　また、その方法は、抗生物質が、メチシレン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示す抗生物質の製造方法として用いることができる。
　更に、本発明は、抗生物質がＭＲＳＡとＶＲＥに抗菌活性を示し、更に、少なくとも黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示す抗生物質の製造方法として用いることができる。
　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０の微生物を培養し、その培養物を分画することによって得られた抗生物質含有画分は有用である。更には、その培養物から得られた抗生物質を含有する微生物防除剤は有用である。また、物質として単離する前の画分を含有する微生物防除剤も同様に有用である。
＜ＲＨ２１８０－５の培養物からの本発明の環状ペプチド化合物の調製方法＞
　ＲＨ２１８０－５の培養物から、本発明の「前記式（１）で示される環状ペプチド化合物」を得る方法としては、通常の微生物培養物から生理活性物質を得る方法が挙げられる。ここで培養物とは、上記した通りである。
　また、本発明の「前記式（１）で示される環状ペプチド化合物」の調製にあたり、通常実施されるＭＩＣによる抗菌活性の確認だけでなく、特許文献４に記載のカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いた治療効果（ＥＤ５０）を指標として単離精製方法の取捨選択を行っている（表２参照）。
　つまり、本発明の前記式（１）で示される環状ペプチド化合物は、ＭＩＣだけでなくカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いた治療効果を指標として選択された単離精製方法を用いることによって効果的に見出されたものと考えることができる。
＜抗菌スペクトル＞
　本発明の前記式（１）で示される環状ペプチド化合物の示す抗菌スペクトルは、先に記載したＭＩＣによって検討することができる。それによって、例えば、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５、Ｐｅａｋ６、Ｐｅａｋ９の各物質は、黄色ブドウ球菌、腸球菌等のグラム陽性細菌に対して抗菌活性を示し、更に、ＭＲＳＡだけでなくＶＲＥに対しても通常の細菌とまったく同じ抗菌活性を示し、多くの多剤耐性菌に有効な物質であることを確認することができた（試験例１の表３、試験例４の表６参照）。
　先の各ピーク物質、すなわち、前記式（１）で示される環状ペプチド化合物の、メチシレン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ３、ＭＲＳＡ４）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）と同じ菌種の薬剤感受性菌である黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ１）と腸球菌（ＥＦ１）に対するＭＩＣによる抗菌スペクトルを検討した結果（ピーク１物質は未実施）、ＭＳＳＡ１とＭＲＳＡ３及びＭＲＳＡ４、ＥＦ１とＶＲＥ間で各ピーク物質はほぼ同様のＭＩＣ値を示し、本発明の一群の化合物が、バンコマイシン耐性を含む薬剤耐性の影響を受けていないことを確認することができた（試験例２の表４参照）。
　本発明の前記式（１）で示される新規な環状ペプチド構造を有する新規な化合物には、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示す化合物が含まれる。
　以上から、本発明の新規な環状ペプチド構造を有する新規な化合物は、例えば、本発明の新規な微生物ＲＨ２１８０－５（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０）の培養液から製造することができ、少なくとも多剤耐性菌のＭＲＳＡ及びＶＲＥに対して抗菌活性を有する新規な化合物を含んでいることが確認できる。なお、先に挙げた微生物の培養方法、精製方法等は、本発明の化合物を見出すために選択された一例であって、効率よく大量に製造する必要がある場合等、目的に応じて別種の製造方法を選択することは当然行われることである。
＜感染症治療薬＞
　前記式（１）で表わされる環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩を、製薬学的に許容し得る担体と共に含んでなる感染症治療薬は、感染症に対して優れた治療効果を奏する。特に、本発明の前記式（１）で表わされる、新規な環状ペプチド構造を有する化合物又はその製薬学的に許容される塩は、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルだけでなく、後述するようにマウス黄色ブドウ球菌感染モデルでも、バンコマイシンに比して高い治療効果が確認されたものがあり、感染症治療薬の有効成分として好適に用いることができる。
　上記の感染症治療薬中の、本発明化合物の含有量には特に制限はなく、目的や投与方法に応じて含有量を適宜選択して用いればよい。また、通常の抗生物質を製剤化する際に用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤を、適宜、剤形等の要求に応じて本発明の化合物の薬理効果を損なわない範囲内で選択して用いればよい。
　前記の感染症治療薬の剤形は、投与の目的や方法に応じて適宜選択すればよく、例えば、粉末、顆粒、カプセル、錠剤、液剤等の経口投与用；注射剤、経静脈剤、坐剤、経皮、経鼻、経腸、吸入剤等の非経口投与用の何れにも本発明の化合物は用いることができる。経口投与のための賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、デンプン、ポリビニルピロリドン等、公知の賦形剤を用いることができ、液剤とする場合は、本発明の化合物に、不活性な溶媒、例えば、精製水、エタノール等と共に、薬学的に許容される乳剤、懸濁剤、可溶化剤、甘味剤、ｐＨ調整剤、芳香剤、防腐剤等を含有させて用いることができる。
　注射剤として用いる場合は、注射用の蒸留水や生理食塩水のような無菌の水性液剤を用いることができ、非水性の液剤としては、オリーブ油等の植物油；エタノール、ポリエチレングリコール、ブチレングリコール等のアルコール類等を用いることができる。更に、等張化剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、シクロデキストリン等の溶解補助剤を含んでいてもよい。
　以上のように製剤化した本発明の化合物の投与量は、症状、年齢、性別、剤形、投与方法、１日の投与回数等を考慮して適宜決定すればよいが、一般的な投与量は、成人１日当たり１０ｍｇ～１０００ｍｇである。しかしながら、多剤耐性菌に対する治療で多用される重症化患者に点滴によって経静脈剤として用いられる場合等には更に多い投与量を必要とする場合もあり得る。
　以下、実施例、試験例及び検討例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等の具体的範囲に限定されるものではない。
実施例１
＜ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質の単離精製＞
（１）抗菌活性を有する微生物のＭＩＣによる探索
　各地から採取した土壌を生理食塩水に懸濁し、その上清をＧＡ培地及びＨＶ培地に塗布し、３０℃でインキュベート後に生育した菌を分離し、ＹＭＥ培地又はＳＧＭ培地、ＣＤＹ培地にて３０℃で５日間培養した。アセトンを等量加え、懸濁後に遠心分離しその上清をエバポレーションした。得られた残存物を生理食塩水で希釈後に黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を微量液体希釈法によるＭＩＣにて評価した。その結果、１４３４６株中、３４８７株の培養上清に抗菌活性が認められた。
（２）カイコ黄色ブドウ球菌感染モデル（以下、「カイコモデル」と略記する。）を用いた治療活性物質を産生する微生物株の検討
　先の抗菌活性が認められた３４８７株の検体を、特許文献４に記載のカイコモデルに供してその治療効果を検討したところ、４５株の培養上清に治療効果が認められた。
（３）カイコモデルを用いた治療効果を指標とした治療活性物質の精製
　上記４５株中、沖縄で採取された土壌から分離されたＲＨ２１８０－５について、培養上清からの治療活性物質の精製を実施した。ＲＨ２１８０－５は、後述する１６Ｓ　ｒＲＮＡ配列の解析、産生物質の傾向等から、新規リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物と判定された。
　ＲＨ２１８０－５を、ＹＭＥ培地１２００ｍＬに接種して培養し、培養物の５０質量％アセトン抽出物からカイコモデルにおける治療効果を指標に治療効果を示す抗生物質の精製方法を検討した。その結果、ブタノール転溶、水沈殿、ＯＤＳカラムによるクロマトグラフィー、更にＯＤＳカラムを用いたＲＰ－ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣ）により、治療効果を示す抗生物質が精製された。
　表２に示したように、以上の精製工程により、治療効果（ＥＤ５０値）の比活性は、アセトン抽出物の３００倍に上昇した。一方、抗菌活性（ＭＩＣ）の上昇は５倍に留まった。これは、精製の出発材料であるアセトン抽出物の示す抗菌活性には最終精製物の治療効果を示す抗生物質以外の物質も関与し、今回選択された精製工程により、治療効果を示す抗生物質以外の抗菌活性物質を除去できているためと推定される。
　また、上記ＲＰ－ＨＰＬＣにおいて、ＵＶ吸収パターンの類似した９つの化合物が検出されていることから、ＲＨ２１８０－５は少なくとも９つの関連化合物を産生していることが確認された（図１のＨＰＬＣのＵＶ吸収パターン参照）。
実施例２
＜ＲＨ２１８０－５の培養とＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質の製造＞
　ＲＨ２１８０－５の斜面培養から白金耳で菌を掻き取り、１００ｍＬのＹＭＥ培地を入れた５００ｍＬ容の三角フラスコに接種し、３０℃で３日間振とう培養を行い種培養液とした。次いで、この種培養液１．０ｍＬを、先の液体培地１００ｍＬを入れた５００ｍＬ容の三角フラスコ１２本に接種し、３０℃で５日間振とう培養を行った。
　このようにして得た培養液にアセトンを等量混合し、この混合液を充分に攪拌した後に遠心分離を行い、遠心上清をエバポレーションしてアセトンを除去した。次いで、この試料をブタノール転溶に供した。ブタノール転溶はアセトン抽出物を８０ｍＬの水に懸濁し、等量のブタノールを添加して充分に振とうした後、静置、分液ロートにてブタノール層を分取し、減圧乾固後水沈殿に供した。水沈殿は先の試料を８０ｍＬの水に懸濁し、遠心後に水を取り除き、沈殿物を分取した。
　ブタノール抽出物残渣７５ｍｇのサンプルを６０％メタノールに溶解し、Ｗａｔｅｒｓ、Ｓｅｐ－ｐａＫ（Ｗａｔｅｒｓ社：登録商標）Ｃ１８、２５ｍＬを用いて、０．１％ＴＦＡを含む６０％～１００％メタノールで、１０％ごとに２０ｍＬの液で溶出させた。その結果、７０％～８０％メタノール画分で治療効果を示す抗生物質含有画分が溶出された。
　先の治療効果を示す抗生物質含有画分をプールして乾固させ、内２２ｍｇを５０％メタノールに溶解し、Ｓｅｎｓｈｕ　ＰａＫ　ＳＰ－１００　ＯＤＳカラム（センシュー科学：直径２０ｍｍＸ長さ２５０ｍｍ）を用いて、７５％～９５％メタノール＋０．１％ＴＦＡにて溶出させた。この条件のＲＰ－ＨＰＬＣにより治療効果を示す抗生物質含有画分は、それぞれ単一物質からなる９つのピークを示す物質に分画された。
　以上のＲＰ－ＨＰＬＣにおいて、治療効果を示す抗生物質含有画分は、ピーク５を主要成分とする９つの類似したＵＶ吸収パターン（ＵＶ装置Ｗａｔｅｒｓ２９９６　ｐｈｏｔｏ　ｄｉｏｄｅ　ａｒｒａｙ）を有する化合物群からなっていることが確認された（図１参照）。
　以上の操作により、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質を５．３ｍｇ得た。また、同様の方法で、ピーク１、ピーク２、ピーク３、ピーク４、ピーク６、ピーク７、ピーク８、ピーク９の各ピークからそれぞれのピーク物質を得た。
検討例１
＜ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質の構造解析＞
　ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質を、ブルカー・ダルトニクス社（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ）ＢｉｏＴＯＦ－Ｑ質量分析器による精密質量分析に供した結果、分子量は１６１６．９［ＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＳで、（Ｍ＋Ｈ）＋が、ｍ／ｚ＝１６１７．８７５５］であることが分かった。
　また、６Ｎ塩酸下、１０５℃で一晩加水分解処理をした後に、日立アミノ酸分析機によりアミノ酸分析を行ったところ、各々２分子のＴｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇと、各々１分子のＳｅｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅが検出された（図２）。
　更に、日本電子ＥＣＡ－５００ＮＭＲによる１Ｈ、１３Ｃ－ＮＭＲ解析（図３）、ＴＯＦ－ＭＳ解析（図４）の結果、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質は、式（１）のＲ１が３－ヒドロキシ－５－メチル－ヘキサノイル、Ｒ２がメチル、Ｒ３がエチルである環状ペプチド化合物であり、図９に示す新規骨格を有する化合物であることが明らかとなった。
　更に、酸加水分解を行ったＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質について、キラルカラムによるＤ，Ｌ体の決定を行ったところ、Ｉｌｅ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，２個のＴｈｒはＬ体で、Ｎ－ＭｅＰｈｅ，２個のＡｒｇ，ＴｒｐはＤ体であることが明らかになった。
　ＧｌｎとＧｌｕについては、酸加水分解の結果では両方ともＧｌｕとなり、Ｄ，Ｌ体が１：１で検出されたため、グルタミンおよびグルタミン酸を含むペプチドに対して、ビス（１，１―トリフルオロアセトキシ）ヨードベンゼンを反応させることにより、グルタミンをジアミノ酪酸に変換し、加水分解後、反応しなかったグルタミン酸について、キラルカラムによる絶対配置の決定を行ったところ、ＧｌｎがＤ体、ＧｌｕがＬ体であることが明らかになった。（この分解法によるペプチドのＤ，Ｌ体の決定法は本願において初めて行われた新規の方法である。）
　脂肪酸鎖の水酸基については、改良モッシャー法により絶対配置Ｒを決定した。
　その結果、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質は、各アミノ酸が図１０に示す立体構造を有する新規な環状ペプチド化合物であることが分かった。
検討例２
＜ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ９物質の構造解析＞
　構造解析に供する試料としてＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ９物質を用いる以外は検討例１と同様の構造解析手段により構造解析を行った（図８参照）。その結果、式（１）のＲ１が３－ヒドロキシ－７－メチル－オクタノイルである以外は、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質と同じ化学構造を有する環状ペプチド化合物であることが確認された。
　また、他のピーク物質についても同様の解析を行い、表１に示すＲ１、Ｒ２、Ｒ３を有すること以外は全て、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ９物質と同じ環状ペプチド骨格を有する化合物であることが確認された（図５、６、７、８参照）。
試験例１
＜本発明の環状ペプチド化合物の抗菌スペクトル検討＞
　先のＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質の、ＭＲＳＡ、ＶＲＥを含む各種の微生物に対する抗菌スペクトルの検討を行った。また、薬剤耐性の影響についても検討した。後者の検討には黄色ブドウ球菌と腸球菌を選択し、黄色ブドウ球菌については、薬剤耐性を示さない黄色ブドウ球菌（以下、「ＭＳＳＡ１」と略記する。）と、メチシリンを含む多くの薬剤に耐性を示すＭＲＳＡ２種（ＭＲＳＡ３、ＭＲＳＡ４；耐性薬剤については表３を参照）について、また、腸球菌については、薬剤耐性を示さない腸球菌（以下、「ＥＦ１」と略記する。）と、バンコマイシンに耐性を示す腸球菌（以下、「ＶＲＥ」と略記する。）について、各ピーク物質の示すＭＩＣ値をＣＬＳＩ（旧ＮＣＣＬＳ米国臨床検査標準委員会）に基づく微量検体希釈法によって測定した。
　また、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ６物質とＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ９物質についても、ＭＳＳＡ１とＥＦ１、及びその薬剤耐性菌（ＭＲＳＡ３、ＭＲＳＡ４とＶＲＥ）についてＭＩＣ値を測定した。試験に供した各種の微生物とＭＩＣの測定結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表３の結果から、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質は、黄色ブドウ球菌、腸球菌に抗菌活性を示すことからグラム陽性の球菌に抗菌活性を示すことが確認された。また、多剤耐性菌のＭＲＳＡ２種とＶＲＥに対しても、通常の菌（ＭＳＳＡ１とＥＦ１）と同じＭＩＣ値を示し、バンコマイシン耐性を含む多剤耐性の影響を受けないことが確認された。このＭＩＣの値は、従来報告のある抗生物質と比べて低い値でもなく、また、特に高い抗菌活性を示したものではないが、治療効果については、後述する検討により、バンコマイシンと比べた場合、バンコマイシン以上の治療効果を有することが確認された。
　また、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ６物質とＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ９物質も、多剤耐性菌と通常の菌に対してＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質と同じ抗菌活性を有することが確認された。
試験例２
＜各ピーク物質の多剤耐性菌と薬剤耐性を有さない菌に対する抗菌活性の比較検討＞
　試料量の少ないピーク１物質を除くピーク２物質からピーク９物質の８つの本発明の新規な環状ペプチド化合物について、多剤耐性菌と薬剤耐性を有さない菌に対する抗菌活性の比較検討を行った。
　試験対象菌には、試験例１と同じ黄色ブドウ球菌と腸球菌を選択し、微生物も同じＭＳＳＡ１とＥＦ１、ＭＲＳＡ３とＭＲＳＡ４及びＶＲＥについて各ピーク物質の示すＭＩＣ値をＣＬＳＩ（旧ＮＣＣＬＳ米国臨床検査標準委員会）に基づく微量検体希釈法によって測定した。その結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
 　　　　　ＭＩＣ（μｇ／ｍＬ）
　ＭＳＳＡ１：黄色ブドウ球菌
　ＭＲＳＡ３：ＯＸ，ＦＬ，ＫＭ，ＴＣ，ＥＭ耐性黄色ブドウ球菌
　ＭＲＳＡ４：ＯＸ，ＦＬ，ＫＭ，ＣＰ，ＣＰＬＸ耐性黄色ブドウ球菌
　ＥＦ１　　：腸球菌
　ＶＲＥ　　：バンコマイシン耐性腸球菌
　ＯＸ：オキサシリン、ＦＬ：フロモキエフ、ＫＭ：カナマイシン、
　ＴＣ：テトラサイクリン、ＣＰ：クロラムフェニコール、ＥＭ：エリスロマイシン
　ＣＰＬＸ：シプロフロキサシン
　その結果、各ピーク物質の示すＭＩＣ値自体は従来報告されている抗菌剤に比べると大きい値となっているものの、通常の菌とその多剤耐性菌（ＭＳＳＡ１とＭＲＳＡ３，ＭＲＳＡ４との間、ＥＦ１とＶＲＥ間）の比較においては、ＭＩＣ値はほとんど同等の値を示し、各ピーク物質の抗菌活性は多剤耐性の影響を受けていないことが確認された。
　なお、本発明の環状ペプチド化合物の場合、抗菌活性と治療効果は必ずしも一致していないことが確認されている。例えば、ＭＳＳＡに対するＭＩＣ値が表４の場合で６．３μｇ／ｍＬ、表３の場合で５μｇ／ｍＬを示したＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質は、後述するマウス黄色ブドウ球菌感染モデルに対する治療効果（ＥＤ５０値）の検討結果ではバンコマイシンの１／３程度のＥＤ５０値を示しており、高い治療効果を示すことが確認されている。
　ＭＩＣ値５μｇ／ｍＬや６μｇ／ｍＬは、バンコマイシンでは耐性菌の示すＭＩＣ値とされている水準であるにもかかわらず、本発明の環状ペプチド化合物が充分な治療効果を示す理由の一つとして、本発明化合物が既存薬とは異なった作用機序で抗菌活性を示し、それが治療効果に反映している可能性が考えられる。既存薬と異なった作用機序で抗菌活性を示している場合は、少なくとも現時点での耐性菌の分離頻度が低いことが予測され、本発明の環状ペプチド化合物の有利な点と考えられる。
試験例３
＜ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質のマウス黄色ブドウ球菌感染モデル（以下、「マウスモデル」と略記する。）における治療効果と毒性の検討＞
　７％ムチン＋０．２ｍＭクエン酸鉄（III）アンモニウム（Ｆｅｒｒｉｃ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ）に、黄色ブドウ球菌Ｓｍｉｔｈ株を懸濁し、６．２×１０６個（２０×ＬＤ５０）を一群５匹のマウス（ＩＣＲ雌４週齢）の腹腔に投与した。各薬剤は、以下に示す方法で先の菌株投与２時間後に皮下注射した。
　上記マウスモデルに対して、ＰＢＳに溶解したＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質を２５ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、６．３ｍｇ／ｋｇとなるよう皮下注射し、投与後翌日の生存数を測定することでその治療効果（ＥＤ５０値）を検討した（１群５匹）。同様にしてバンコマイシンについても、今回用いたマウスモデルに対するＥＤ５０値を検討した。ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質の場合、ＰＢＳ投与で生存なしとなる条件で、２５ｍｇ／ｋｇの投与量でマウス全匹の生存が確認された。また、ＥＤ５０値はプロビット法により求めた。
　得られた結果を表５に示す。ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質はマウスモデルに対して治療効果を示し、そのＥＤ５０値は０．６ｍｇ／ｋｇとなり、同時に検討したバンコマイシンのＥＤ５０値１．６ｍｇ／ｋｇより明確に低く、黄色ブドウ球菌に対して治療効果の高い抗生物質となっていることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　また、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質をマウスに皮下投与し、投与後翌日の観察によりマウスに対するＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質の急性毒性についても検討した。急性毒性は、検討した中で最も高い濃度であるＥＤ５０値の８０倍量に相当する５０ｍｇ／ｋｇまでの投与量ではマウスはまったく殺傷されず、毒性を認めなかったことから、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質は低毒性であることが示唆された
　以上の結果から、ＲＨ２１８０－５の産生する本発明の抗生物質ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質（Ｐ５）は、黄色ブドウ球菌に対して、バンコマイシンに比べて優れたＥＤ５０値を示し、高い治療効果を示すと共に、ＭＩＣによる抗菌活性の検討結果から臨床上非常に問題となっているＭＲＳＡだけでなく、今後ＭＲＳＡと同様に問題化されることが予想されるＶＲＥに対しても有効性を示すという優れた特徴を有していることが確認できた。
　また、ＲＨ２１８０－５の培養物から単離精製された本発明の新規な環状ペプチド構造を基本骨格として有する新規な化合物９種中８種（ピーク１物質は抗菌スペクトルの検討未実施）は、共に多剤耐性菌とその同種の多剤耐性の性質を獲得していない菌株に対してほぼ同じＭＩＣ値を示した（表４）ことから、本発明の新規な環状ペプチド構造を基本骨格として有する新規な化合物は、特に多剤耐性菌に対して有効な感染症治療薬として用いられ得ることが確認できた。
試験例４
＜ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質の抗菌スペクトルの検討＞
　先のＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質の、ＭＲＳＡ、ＶＲＥを含む各種の微生物に対する抗菌スペクトルの検討を行った。１０％血清を添加した場合と血清を添加しなかった場合それぞれのＭＩＣ値をＣＬＳＩ（旧ＮＣＣＬＳ米国臨床検査標準委員会）に基づく微量検体希釈法によって測定した。測定結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表６の結果より、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質は、グラム陽性菌に対し有効であり、血清の添加によって活性が上昇することが確認できた。
試験例５
＜ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質の殺菌活性の検討＞
　ＣＡ－Ｍｕｅｌｌｅｒ　Ｈｉｎｔｏｎ　Ｂｒｏｔｈ培地に１．８ｘ１０８個の黄色ブドウ球菌を摂取し、先のＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質（２５μｇ／ｍＬ）、バンコマイシン（ＶＭ、５μｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（ＧＭ、２．５μｇ／ｍＬ）を添加し、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後の生存細胞数をＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ／ｍＬ）として求めた。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　表７の結果より、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質を添加すると、バンコマイシン、ゲンタマイシンを添加した場合と比較して直ちに黄色ブドウ球菌が減少することが確認できた。
　また、この結果等より、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０の微生物を培養し、その培養物を分画することによって得られた抗生物質含有画分、更には、その培養物から得られた抗生物質を含有する微生物防除剤は、有用であることが分かった。ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質を含有する微生物防除剤は有用であるが、それ以外のピークの物質を含有しても、また、物質として単離する前の画分を含有する微生物防除剤も同様に有用であることが分かった。
試験例６
＜ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質の溶菌活性の検討＞
　ＣＡ－Ｍｕｅｌｌｅｒ　Ｈｉｎｔｏｎ　Ｂｒｏｔｈ培地に黄色ブドウ球菌液を希釈し、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質、バンコマイシン、ダプトマイシンを試験例１で用いたときの５倍の濃度で添加し、３７℃で培養した。吸光度計（島津製作所社製）を用いて、添加後の６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を経時的に測定した。結果を図１１に示す。
　図１１の結果より、ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質が、バンコマイシン、ダプトマイシンと比較して吸光度（ＯＤ６００）の減少が大きかったことから、溶菌活性を示すことが確認できた。
実施例３
＜ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質の製剤化＞
＜＜錠剤＞＞
　ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質２０．０ｍｇ、ラクトース４０ｍｇ、デンプン２０ｍｇ、及び、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース５ｍｇを均一に混合した後、ヒドロキシプロピルメチルセルロース８質量％水溶液を結合剤として湿式造粒法で打錠用顆粒を製造した、これに滑沢性を与えるのに必要なステアリン酸マグネシウムを０．５ｍｇから１ｍｇ加えてから打錠機を用いて打錠し、錠剤とした。
＜＜液剤＞＞
　ＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質１０．０ｍｇを、２質量％２－ヒドロキシプロピル－β－サイクロデキストリン水溶液１０ｍＬに溶解し、注射用液剤とした。
検討例３
＜１６Ｓ　ｒＲＮＡ解析＞
　ＲＨ２１８０－５の１６Ｓ　ｒＲＮＡの塩基をコロニーＰＣＲ法によって増幅し、増幅できたＲＮＡ断片についてシーケンサーによって解析した。その結果、５’末端側、３’末端側のいくつかの塩基を除く配列番号１に示すほぼ１６Ｓ　ｒＲＮＡ領域全長に相当する塩基配列を決定した。この塩基配列を元に、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴを用いて既存のリソバクター属に属する菌株との相同性検索を行った。その結果ＲＨ２１８０－５は、既存のＬｙｓｏｂａｃｔｅｒ　ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ　ＤＳＭ　２０４３Ｔ株と９９％の相同性を示したことから、ＲＨ２１８０－５はリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物であると考えられた。
＜ＲＨ２１８０－５の新規性について＞
　ＲＨ２１８０－５は、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ　ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ　ＤＳＭ　２０４３Ｔ株と化学的性質について相似する点が多いが、産生する生理活性物質の抗菌スペクトルが異なること、生理活性物質の本体である化合物がこれまで報告されていない新規な環状ペプチド構造を基本骨格とする「有用な薬理作用を有するＲＨ２１８０－５Ｐｅａｋ５物質とその関連化合物」である点で全く異なっている。この点は、既存の菌株との大きな相違点である。よって、以上の結果から、ＲＨ２１８０－５は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規な微生物であると判定した。
　本発明の新規な環状ペプチド化合物は、臨床上大きな問題となっているＭＲＳＡやＶＲＥ等の多剤耐性菌に対して有効性を示すことから、新たな感染症治療薬として利用可能である。また、本発明の新規微生物株は、先の新規で有用な環状ペプチド化合物の製造に好適に利用することができる。
　更に、本発明は、新規な抗生物質含有画分とそこに含有される抗生物質、その抗生物質含有画分とそこから得られる新規で有用な抗生物質の製造方法を提供することができるという産業上の利用可能性を有している。
　本願は、２０１０年５月２５日に出願した日本の特許出願である特願２０１０－１１９１３８、特願２０１０－１１９１３９及び特願２０１０－１１９１４０に基づくものであり、それらの出願の全ての内容はここに引用し、本願発明の明細書の開示として取り込まれるものである。
　ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０
　配列番号１は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する未知の菌株の、１６Ｓ　ｒＲＮＡのほぼ全長にあたる塩基配列である。

Claims (30)

  1. 　下記式（１）で示される環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（１）中、Ｒ１は置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。］
  2. 　上記式（１）中のＲ１の置換基が水酸基である請求項１に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
  3. 　上記式（１）中のＲ１が、３－ヒドロキシ－５－メチル－ヘキサノイル基、３－ヒドロキシ－６－メチル－ヘプタノイル基又は３－ヒドロキシ－７－メチル－オクタノイル基である請求項１に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
  4. 　上記式（１）中のＲ１が３－ヒドロキシ－５－メチル－ヘキサノイル基であり、Ｒ２がメチル基であり、Ｒ３がエチル基である請求項１に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
  5. 　上記式（１）中のＲ１が３－ヒドロキシ－７－メチル－オクタノイル基であり、Ｒ２がメチル基であり、Ｒ３がエチル基である請求項１に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
  6. 　独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属するＲＨ２１８０－５株、又はその株と同様の化合物を産生する能力を有する変異株を培養し、その培養物から得られる請求項１ないし請求項５の何れかの請求項に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
  7. 　請求項１ないし請求項６の何れかの請求項に記載の環状ペプチド化合物を産生する能力を有する、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属するＲＨ２１８０－５株、又はその株と同様の化合物を産生する能力を有する変異株を培養し、その培養物から製造することを特徴とする請求項１ないし請求項６の何れかの請求項に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩の製造方法。
  8. 　請求項１ないし請求項６の何れかの請求項に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩を、製薬学的に許容し得る担体と共に含んでなる感染症治療薬。
  9. 　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物には請求項１ないし請求項６の何れかの請求項に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩が含有され、該培養物を分画することによって得られることを特徴とする抗生物質含有画分。
  10. 　上記抗生物質含有画分が、抗菌活性を示す抗生物質を含む画分である請求項９に記載の抗生物質含有画分。
  11. 　上記抗生物質含有画分が、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示すものである請求項９又は請求項１０に記載の抗生物質含有画分。
  12. 　上記抗生物質含有画分が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示す抗生物質を含む画分である請求項９ないし請求項１１の何れかの請求項に記載の抗生物質含有画分。
  13. 　上記抗生物質含有画分が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症にバンコマイシンに比較して同等又はそれより高い治療効果を示す抗生物質を含む画分である請求項１２に記載の抗生物質含有画分。
  14. 　上記抗生物質含有画分が、抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質を含有する画分である請求項９又は請求項１０に記載の抗生物質含有画分。
  15. 　上記抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質が、微生物防除剤として用いられるものである請求項１４に記載の抗生物質含有画分。
  16. 　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物には請求項１ないし請求項６の何れかの請求項に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩が含有され、該培養物から、抗菌活性を示す抗生物質及び／又は感染症に治療効果を示す抗生物質を、分離・精製することを特徴とする抗生物質の製造方法。
  17. 　上記抗生物質が、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示すものである請求項１６に記載の抗生物質の製造方法。
  18. 　上記抗生物質が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示すものである請求項１６又は請求項１７に記載の抗生物質の製造方法。
  19. 　上記抗生物質が、抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質である請求項１６に記載の抗生物質の製造方法。
  20. 　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物には請求項１ないし請求項６の何れかの請求項に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩が含有され、該培養物から得られることを特徴とする抗生物質。
  21. 　上記抗生物質が、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示すものである請求項２０に記載の抗生物質。
  22. 　上記抗生物質が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示すものである請求項２０又は請求項２１に記載の抗生物質。
  23. 　上記抗生物質が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症にバンコマイシンに比較して同等又はそれより高い治療効果を示すものである請求項２２に記載の抗生物質。
  24. 　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物には請求項１ないし請求項６の何れかの請求項に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩が含有され、該培養物から得られ、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示し、かつ、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示すことを特徴とする抗生物質。
  25. 　下記式（１）で示される請求項２０ないし請求項２４の何れかの請求項に記載の抗生物質。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式（１）中、Ｒ１は水酸基を１つ有する炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。］
  26. 　請求項９又は請求項１０に記載の抗生物質含有画分を含有することを特徴とする微生物防除剤。
  27. 　請求項２０に記載の抗生物質を含有することを特徴とする微生物防除剤。
  28. 　リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８７０の微生物又はその自然的若しくは人工的に変異した微生物であって、下記式（１）で示される化合物又はその塩を産生する能力を有する微生物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式（１）中、Ｒ１は水酸基を１つ有する炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。］
  29. 　上記抗生物質が、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有するものである請求項２８に記載の微生物。
  30. 　配列表の配列番号１で示される１６Ｓ　ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する請求項２８又は請求項２９に記載の微生物。
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