WO2020175451A1

WO2020175451A1 - 環状ペプチド系抗菌化合物

Info

Publication number: WO2020175451A1
Application number: PCT/JP2020/007391
Authority: WO
Inventors: 井上　将行; 寛晃伊藤
Original assignee: 国立大学法人東京大学
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2020-02-25
Publication date: 2020-09-03
Also published as: JP2020138908A

Abstract

【解決課題】　優れたメナキノン結合能を示し、優れた抗菌活性を示すペプチド系抗菌化合物及びそのスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】　一般式（Ｉ）で表される化合物。

Description

\¥0 2020/175451 1 卩（：17 2020 /007391 明細書

発明の名称：環状べプチド系抗菌化合物

技術分野

[0001 ] 本発明は、新規のぺプチド系化合物及びそのスクリーニング方法に関する。具体的には、メナキノン等に作用し、抗菌作用を示すペプチド系化合物及び当該ペプチド系化合物を含む薬学的組成物に関する。また、本発明は、細菌膜に存在する物質と相互作用して抗菌活性を示すぺプチド系化合物のスクリーニング方法に関する。

背景技術

[0002] 近年、多様な耐性菌の出現が報告されており、従来の抗生物質とは異なる作用機序並びに、従来よりも低濃度で抗菌活性及び治療効果を示す化合物の創出が求められている。また、新規作用機序を示す化合物として、メナキノン結合性抗生物質の存在が報告されているが、これらの抗生物質は、抗菌活性を示す濃度が十分低いとは言えず、意図しない副作用等を誘発する可能性が高まる。

[0003] 近年、パクテリア膜に存在するメナキノンと相互作用し抗菌活性を示す化合物としてライソシン巳が発見され、この物質は真核生物に対しては無害である（非特許文献 1）。この物質の作用機序は既知の抗生物質の作用機序とは異なり、細菌の呼吸鎖に不可欠な要素であるメナキノンとの選択的相互作用により、細菌膜の機能的完全性を破壊することが知られている。

ライソシン巳はメシチリン耐性ブドウ球菌に対して有効であることが知られているが（非特許文献 2）、より高い抗菌活性を示す化合物の開発は引き続き重要である。

[0004] 一方、メナキノン結合性べプチド化合物を迅速に合成 ·選出する方法は報告されていない。個別の化合物の合成及び特性の調査には長大な時間を要するため、スクリーニングとして要求されるレベルを満たすものではない。先行技術文献 \¥02020/175451 2 卩（：17 2020 /007391 特許文献

[0005] 特許文献 1 :特開 201 4-2 1 7322号公報

非特許文献

[0006] 非特許文献 1 : Hamamoto H, Urai M, Ishii K, Yasukawa J, Paudel A, Murai

M, Kaj i T, Kuranaga T, Hamase K, Katsu T, Su J, Adachi T, Uchida R, Tomoda H, Yamada M, Souma M, Kur i hara H, Inoue M, Sekimi zu. Nat. Chem

. 6^'|〇1. 2015, 11 (2): 127-133.

非特許文献 2 : Murai

1门〇 1

Int. Ec!· 已叩し 2015、 54 (5) : 1556-1560

発明の概要

発明が解決しようとする課題

[0007] 本発明は、優れたメナキノン結合能を示し、優れた抗菌活性を示すぺプチド系抗菌化合物及びそのスクリーニング方法を提供することを目的とする。課題を解決するための手段

[0008] 即ち、本発明は、

[1 ] 以下の一般式 (丨 ) で表される化合物又はその塩。

〇 2020/175451 卩(：170? 2020 /007391

（—般式（丨）において、

基から選択され；

水素原子、炭素数 1〜 3のアルキル基又はヒドロキシ基を表す）

は、同一又は異なっていてもよく、各々独立して、水素原子、炭素数 1〜 3のアルキル基を表し、

各出現において同一又は異なっていてもよく、各々独立して、水素原子又は炭素数 1〜 3 のアルキル基を表し、は、〇〜 2の整数を表す）

〇 2020/175451 4 卩(：170? 2020 /007391

(5)

（式（5）において、

（式（6）において、［¾ は、水素原子、炭素数 1〜 3のアルキル基又はヒドロキシ基を表し、

は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し、

又は

炭素数 1〜 3の直鎖状アルキル基

式（1）〜（6）において、 -は結合部位を表す：

であり：

る置換基から選択され：

(4)

は、水素原子又は炭素数 1〜 3のアルキル基を表す

20/175451 5 卩（：170? 2020 /007391

は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又

（式（7）において、［¾¹³、

同一又は異なっていてもよく、各々独立して、水素原子又は炭素数 1〜 3のアルキル基を表す）又は

（式（8）において

は、水素原子又は炭素数 1〜 3のアルキル基を表し、 8¹⁷は、水素原子、炭素数 1〜 3のアルキル基又はヒドロキシ基を表す）式（1）、（4）、（6）、（7）〜（8）において、 -は結合部位を表す：

ブチル基である。）

（4）で表される基であって、

かつ

、

で表される基であって、

物は除く。〇 2020/175451 6 卩(：170? 2020 /007391

は、以下で表される置換基から選択される、［1］に記載の化合物又はその塩。

（但し、

¹が 3で表される置換基であり、かつ、

³が 0で表される置換基である化合物は除く。）

［3］

の組み合わせが以下の組み合わせから選択される、［1］又は［2］に記載の化合物又はその塩。

（、：（八、 0）、（八、 V）、（＜、 V）、（V、〇）、 V）、（V、 0）、（丫、〇）、（丫、 0）、（丫、 V）（1\1、 0）、（V 、丫）、（V、 3）（1\1、 V）、（1\1、 0）、 ⑴、 0）、 ⑴、丫）、（

〇, V）

ここで、 V、 0、［＜、 3、 1\1、丫、八、〇、 0は、請求項 2で定義した通り 20/175451 7 卩（：170? 2020 /007391

である。

[4] ( I )

が炭素数 1〜 3の直鎖状アルキル基であり、が式 (8) で表される置換基である、 (丨丨 )

が炭素数 1〜 3の直鎖状アルキル基であり、

(1 ) で表される置換基である、又は、 (丨丨丨 )

( 3) で表される置換基であり、

が式 (1 ) で表される置換基である、 [1 ] に記載の化合物又はその塩。

[5] [1 ] 〜 [4] のいずれか 1項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、感染症を治療するための薬学的組成物。

[6] [1 ] 〜 [4] のいずれか 1項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む抗菌剤。

[7] 細菌膜に存在する物質と相互作用して抗菌活性を示すぺプチド系の候補化合物のスクリーニング方法であって、

以下の工程：

( 1 ) 物質八と相互作用して抗菌活性を示すことが知られているぺプチド系化合物の類似化合物のライブラリーを提供すること；

(2) 前記ライブラリー中の類似化合物を物質と接触させて、各々の類似化合物と物質との錯体を形成させること；

(3) (2) で得られた類似化合物と物質との個々の錯体を分配し、溶媒を添加することにより当該錯体から物質を溶離させること；

(4) 各々の錯体から得られた各溶離液を採取して、各々の類似化合物についての物質と錯体を形成した程度を分析すること：

(5) 溶離液を採集した後に残った各々の類似化合物を回収し、各類似化合物の抗菌活性を測定すること；

を含む、前記スクリーニング方法。

[8] 前記化合物八がメナキノンである、 [7] に記載のスクリーニング方法。

[9] (4) の工程において、各々の錯体から得られた溶離液の蛍光を測定することにより、各々の類似化合物についての物質と錯体を形成した程度〇 2020/175451 8 卩（：170? 2020 /007391

を分析する、［7］又は［8］に記載のスクリーニング方法。

［1 0］前記類似化合物が、ビーズ結合型ペプチドである、［7］〜［9］のいずれか 1項に記載のスクリーニング方法。

［1 1］類似化合物のライブラリーが、〇巳〇（3法を用いて調製される、［ 1 0］に記載のスクリーニング方法。

［1 2］物質と相互作用して抗菌活性を示すことが知られているペプチド系化合物が、ライソシン巳である、［7］〜［1 1］のいずれか 1項に記載のスクリーニング方法。

を提供するものである。

発明の効果

［0009］本発明により、優れたメナキノン結合能を示し、優れた抗菌活性を示すぺプチド系抗菌化合物を提供することができる。

更に、本発明により、細菌膜に存在する物質と相互作用して抗菌活性を示すべプチド系化合物を有効にスクリーニングすることができる方法を提供することができる。

図面の簡単な説明

［0010］［図 1］ライソシン巳の構造

［図 2］本発明のスクリーニング方法の基本的なスキームを示す。

［図 33］ライソシン巳を基準化合物として〇巳〇（3法により類似化合物を合成する概略図

［図 31）］ライソシン巳を基準化合物として〇巳〇（3法により類似化合物を合成する概略図

［図 4］ライソシン巳を用いたスクリーニング方法の全体的模式図を示す。

［図 5］ビーズ結合型ライソシン巳の合成スキーム

［図 6］ビーズ結合型ペプチド 3 0、巳 1_ 1、および巳 !_ 2の蛍光強度の測定糸！］: ^

［図 7］ライソシン巳のメナキノン錯体形成アツセイ及び抗菌アツセイの測定結果〇 2020/175451 9 卩（：170? 2020 /007391

［図 8］ライソシン巳に基づく〇巳〇〇ライブラリーの構築のスキーム

［図 9］ビーズ結合型ライソシン巳類似体のメナキノンー複合体形成アッセイによる化合物選定の模式図

［図 10］ビーズからのべプチドの開裂の手順の模式図

［図 1 1］ライソシン巳類似体の抗菌アッセイの評価結果

［図 12］図 1 1の 3のプレートのビーズ結合型べプチドの構造

［図 13］図 1 1の匕のプレートのビーズ結合型べプチドの構造

［図 14］図 1 1の〇のプレートのビーズ結合型ペプチドの構造

［図 15］化合物 1、八 1、八2及び八3の¹ 1^~1 IV! の化学シフトの比較

［図 16］化合物 1、八 1、八 2及び八 3の^{1 3}〇 IV! の化学シフトの比較

［図 17］全合成した 3 5種類のライソシン日類似体の抗菌活性の評価結果

［図 183］ライソシン巳類似体八 1 ~八 1 4、八 1 6 ~八 1 8の構造

［図 181）］ライソシン巳類似体八 1 5、〇2の構造

発明を実施するための形態

［001 1］本明細書において、「アルキル基」は、特に言及しない場合には例えば炭素数 1〜 6個、好ましくは炭素数 1〜 4個、更に好ましくは炭素数 1〜 3個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、

_プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、

_プチル基、 3 6 0 -プチル基、イソプチル基、㊀「 1: -プチル基、シクロプロピルメチル基、 _n -ペンチル基、 n -ヘキシル基などを挙げることができる。

［0012］本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。

［0013］ 1 . 一般式（ I）で表される化合物

本発明の 1つの実施態様は、以下の一般式（丨）で表される化合物である〇 2020/175451 10 卩（：170? 2020 /007391

[0014] —般式（丨）の化合物は、ライソシン巳を基準化合物として、後述する本発明のスクリーニング方法を用いて、見出された化合物である。ライソシン巳は、図 1で示すように 1 2のアミノ酸残基から構成される環状ペプチド化合物であるが、本発明者らは、その個々の残基について、当該化合物の生物学的に重要な構造の変更を最小化し、全体的な合成の効率も考慮して検討したところ、第 3番目の残基である！-— 36 「一 3、第 6番目の残基である!_ — 1_ 6リー 6、第 9番目の残基である 0—◦ 丨 n— 9及び第 1 1番目の残基である！-— 丨 1 6- 1 1 を可変部位と決定し、ミユーテーシヨンすることにより抗菌活性に優れた化合物を得られるのではないかと考えた。そして、第 3番目の残基の置換基、第 6番目に残基の置換基、第 9番目の残基の置換基、及び第 1 1番目の残基の置換基を、夫々、

[¾²、 [¾³、及び ⁴と規定し（図 38参照）、ライソシン巳の類似化合物のライブラリーを構築して、スクリーニングを実施したところ、！_-!_ 6リー6、！_- 1 1 6- 1 1は強力な抗菌活性に不可欠な残基である可能性が高いことを見出した。

[0015] —般式（ I）において、以下の式（1）〜（6）表される置換基、〇 2020/175451 11 卩(：170? 2020 /007391

又は炭素数 1〜 3の直鎖状アルキル基から選択される。

[0016]

[0017]

(2) 式（2）において、

水素原子、炭素数 1〜 3のアルキル基又はヒドロキシ基を表し、好ましくは、水素原子である。

[0018]

(3)

式（3）において、

は、同一又は異なっていてもよく、各々独立して、水素原子又は炭素数 1〜 3のアルキル基を表す。

各出現において同一又は異なっていてもよく、各々独立して、水素原子又は炭素数 1〜

3のアルキル基を表す。

及びは、好ましくは、いずれも水素原子である。

〇〜 2の整数を表し、好ましくは 2である。ここで、が 0の場合は、は存在しない。

[0019]

(4) 〇 2020/175451 12 卩(：170? 2020 /007391

式（4）において、

は、水素原子又は炭素数 1〜 3のアルキル基を表し

、好ましくは、水素原子である。

[0020]

( 5 ) 式（5）において、

式（6）において、 [¾ は、水素原子、炭素数 1〜 3のアルキル基又はヒドロキシ基を表し、好ましくは、水素原子である。

[¾ ^{1 2}は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表す。一価の置換基としては、炭素数 1〜 3のアルキル基、ヒドロキシ基等が挙げられる。

好ましくは、 0である。即ち、好ましい側面においては、ベンゼン環上に置換基は存在しない。

[0022] 炭素数 1〜 3の直鎖状アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基が挙げられるが、好ましくは、メチル基である。

[0023] 式（1）〜（6）において、 -は、式（丨）で表される化合物への結合部位を表す。

[0024] イソプチル基である。

[0025] -般式（丨）において、は、以下の式（1）、（4）、（6）、（7）

、（8）で表される置換基から選択される。 \¥02020/175451 13 卩(：17 2020 /007391

したのと同様である。

式（7）において、 [¾¹³、

同一又は異なっていてもよく、各々独立して、水素原子、炭素数 1〜 3のアルキル基を表す。

及び ¹⁵は、好ましくは、いずれも水素原子である。

[0030]

〇 2020/175451 14 卩（：170? 2020 /007391 式（8）において、

は、水素原子又は炭素数 1〜 3のアルキル基を表し、好ましくは、水素原子である。 [¾ ^{1 7}は、水素原子、炭素数 1〜 3のアルキル基又はヒドロキシ基を表し、好ましくは、水素原子である。

[0031 ] 式（7）〜（8）において、 -は、式（丨）で表される化合物への結合部位を表す。

、、が式（4）で表される基であっ式（8）で表される基であって ^{1 6}及

[0034] 及びの両方が式（4）で表される基、または、式（6）で表される基である場合は、

³の各基は同一であっても異なる基であってもよい

[0035] 本発明の 1つの好ましい態様においては、一般式（丨）において、

は、以下で表される置換基から選択され；

（八）

は、以下で表される置換基から選択される、化合物である。〇 2020/175451 15 卩（：170? 2020 /007391

但し、

¹が 3で表される置換基であり、かつ、

³が 0で表される置換基である化合物は除く。

[0036] （a）本発明の 1つの好ましい側面においては、式（丨）において、

炭素数 1〜 3の直鎖状アルキル基であり、

（8）で表される置換基である化合物である。

（匕）本発明の 1つの好ましい側面においては、式（丨）において、

炭素数 1〜 3の直鎖状アルキル基であり、

（1）で表される置換基である化合物である。

（〇）本発明の 1つの好ましい側面においては、式（丨）において、

式（3）で表される置換基であり、

が式（1）で表される置換基である化合物である。

（¢0 本発明の 1つの好ましい側面においては、式（丨）において、

が式（1）で表される置換基であり、

が式（7）で表される置換基である化合物である。

（ø）本発明の 1つの好ましい側面においては、式（丨）において、

が式（4）で表される置換基であり、

が式（1）で表される置換基である化合物である。

（干）本発明の 1つの好ましい側面においては、式（丨）において、

式（1）で表される置換基であり、

が式（8）で表される置換基である化合物である。

（9）本発明の 1つの好ましい側面においては、式（丨）において、

が式（6）で表される置換基であり、が式（7）で表される置換基である化 20/175451 16 卩（：170? 2020 /007391

合物である。

（）本発明の 1つの好ましい側面においては、式（ I）において、

式（6）で表される置換基であり、

が式（8）で表される置換基である化合物である。

（ I）本発明の 1つの好ましい側面においては、式（丨）において、

式（6）で表される置換基であり、

が式（1）で表される置換基である化合物である。

）本発明の 1つの好ましい側面においては、式（丨）において、

が式（5）で表される置換基であり、

が式（8）で表される置換基である化合物である。

（!＜）本発明の 1つの好ましい側面においては、式（丨）において、

式（1）で表される置換基であり、

が式（6）で表される置換基である化合物である。

式（1）で表される置換基であり、

が式（4）で表される置換基である化合物である。

（〇〇本発明の 1つの好ましい側面においては、式（丨）において、

式（5）で表される置換基であり、

が式（1）で表される置換基である化合物である。

（）本発明の 1つの好ましい側面においては、式（丨）において、

式（5）で表される置換基であり、

が式（7）で表される置換基である化合物である。

式（2）で表される置換基であり、

が式（7）で表される置換基である化合物である。

式（2）で表される置換基であり、が式（6）で表される置換基である化合物である。〇 2020/175451 17 卩（：170? 2020 /007391

（9）本発明の 1つの好ましぃ側面におぃては、式（丨）におぃて、

が式（2）で表される置換基であり、が式（1）で表される置換基である化合物である。

上記の（3）〜（9）の化合物は優れた抗菌活性を示す。

[0037] 本発明のより好ましぃ側面におぃては、式（丨）におぃて、（丨）

が炭素数 1〜 3の直鎖状アルキル基であり、

（8）で表される置換基である、（丨丨）が炭素数 1〜 3の直鎖状アルキル基であり、が式（1）で表される置換基である、又は、（丨丨丨）

が式（3）で表される置換基であり、

（1）で表される置換基である、化合物である。

の組み合わせがい）〜い丨丨）の組み合わせである場合は、より優れた抗菌活性を示す。

[0038] 本発明の更に好ましぃ態様におぃては、

の組み合わせが以下の組み合わせから選択される。

1、）：（八、 0）、（八、 V）、（ V）、（V、〇）、（3、 V）、（V、 0）、（丫、〇）、（丫、 0）、（丫、 V）（1\1、 0）、（V 、丫）、（V、 3）（1\1、 V）、（1\1、 0）、 ⑴、 0）、 ⑴、丫）、（

〇, V）

ここで、 V、 0、、 3、 1\1、丫、八、〇、〇は、上記で定義した通りである。

優れた抗菌活性を示す。

[0039] また、本発明の更に好ましぃ態様におぃては、

の組み合わせが以下の組み合わせから選択される。

1、）：（八、 0）、（八、 V）、（ V）

より優れた抗菌活性を示す。

[0040] 本発明の化合物を製造する方法に限定はなく、如何なる方法で得られたものでもよぃ。例えば、化学合成によって得られたものであってもよく、微生〇 2020/175451 18 卩（：170? 2020 /007391

物を用いて発現させたものであってもよく、生物体から分離したものであってもよく、それらを組み合わせて得られたものでもよい。本発明の化合物を製造する方法の一例を実施例に示す。

[0041 ] 2 . 蘂学的組成物

本発明のもう 1つの実施態様は、一般式（丨）で表される化合物又はその塩を含む感染症を治療するための薬学的組成物である。

[0042] また、本発明の 1つの実施態様は、哺乳動物、特にヒトにおける感染症の治療方法であって、そのような治療を必要とする哺乳動物に、有効量の一般式（丨）の本発明の化合物又はそれらの薬学的に許容される塩、或いは、一般式（丨）で表される化合物又はその塩を含む薬学的組成物を投与する方法である。

[0043] 感染症の例としては、グラム陽性菌に起因する感染症が挙げられる。本発明の薬学的組成物は、特に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（M R S A）を含む黄色ブドウ球菌（Staphy lococcus aureus）、 Staphy lococcus s i mu Ians 、 btaphy lococcus haemo lyt i cus_% Staphy lococcus pseud i ntermed i us、谷連菌、セレウス菌（Bac i Uus cereus）、枯草菌（Bac i l lus subt i l i s）及びリステリア菌（L i ster i a monocytogenes）等に起因する感染症の治療に好適に使用できる。

[0044] 本発明の薬学的組成物は、一般式（丨）で表される化合物又はその塩に加えて、その他の成分を含有することができる。

[0045] その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬学的に許容され得る担体や賦形剤等が挙げられる。

かかる担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する剤形等に応じて適宜選択することができる。また、前記薬学的組成物中の前記「その他の成分」の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

[0046] 本発明の薬学的組成物の剤形としては、特に制限はなく、例えば、後述す〇 2020/175451 19 卩（：170? 2020 /007391

るような所望の投与方法に応じて適宜選択することができる。

具体的には、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カブセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶剤、懸濁剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散布剤等が挙げられる。

[0047] 前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味 ·矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。

前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等が挙げられる。

前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シエラック、リン酉愛カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。

前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、力ンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられる。

前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等が挙げられる。

前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。前記矯味 ·矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。

[0048] 前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味 ·矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。

前記矯味 ·矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。〇 2020/175451 20 卩（：170? 2020 /007391

前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。

[0049] 前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、 1^~1調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。

前記 1^~1調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、巳〇丁八、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。

[0050] 前記軟膏剤としては、例えば、前記有効成分に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。

[0051 ] 前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シー卜等が挙げられる。

[0052] 本発明の薬学的組成物中の有効成分である、 _般式（丨）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩の、組成物全体に対する含有量は、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができるが、組成物全体を 1 0 0 質量部としたときに、一般式（丨）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩の合計量として、〇. 0 0 1〜 1 0 0質量部の含量で配合すること〇 2020/175451 21 卩（：170? 2020 /007391

が好ましく、より好ましくは 0. 01〜 99質量部、特に好ましくは 0. 1 〜 95質量部、更に好ましくは 1〜 90質量部の含量で配合することができる。

[0053] 本発明の薬学的組成物の投与対象動物としては、特に制限はないが、例えば、ヒト；マウス；ラット；サル；ウマ；ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ等の家畜；ネコ、イヌ等のペット；等が挙げられる。

[0054] また、前記薬学的組成物の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記薬学的組成物の剤形等に応じ、適宜選択することができ、経口投与、腹腔内投与、呼吸器への吸入、血液中への注射、腸内への注入等が挙げられるまた、前記薬学的組成物の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である個体の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への 1 日の投与量は、有効成分の量として、 1 m g〜 30 gが好ましく、 1 0 m g〜 1 O gがより好ましく、 1 00 m g〜 3 gが特に好ましい。

また、前記薬学的組成物の投与時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。

本発明の薬学的組成物は、他の公知の抗感染症剤と併用してもよい。このような公知の抗感染症剤としては、グラム陽性菌に起因する感染症を治療又は予防する公知の抗感染症剤等が挙げられる。

[0055] 本発明のもう 1つの実施態様は、一般式 (丨 ) で表される化合物又はその塩を含む抗菌剤である。

[0056] 本発明の抗菌剤により、グラム陽性菌：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 ( MRSA) を含む黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus) 、 Staphy lococc us simulans、 Staphylococcus haemo lyt i cus_% Staphylococcus pseud i nterme dius、溶連菌、セレウス菌 (Bac i Uus cereus)、枯草菌 (Bacillus subtil is) 及びリステリア菌 (Lister ia monocytogenes)等を殺滅、除去又はこれらの菌〇 2020/175451 22 卩（：170? 2020 /007391

の増殖を抑制することができる。

[0057] 本発明の抗菌剤は、一般式（丨）で表される化合物又はその塩に加えて、その他の成分を含有することができる。「その他の成分」、抗菌剤の剤型については、本発明の薬学的組成物について記載したのと同様のものを使用することができる。

[0058] 本発明の薬学的組成物は、他の公知の抗菌剤を併用することができる。このような公知の抗菌剤としては、様々なものが挙げられるが、例えば/ 3ラクタム系抗菌剤（ペニシリン等）、テトラサイクリン系抗菌剤（ドキシサイクリン等）、マクロライド系抗菌剤（クラリスロマイシン等）、アミノグリコシド系抗菌剤（ゲンタマイシン等）、キノロン系抗菌剤（レポフロキサシン等）、グリコペプチド系抗菌剤（バンコマイシン等）、リポペプチド系抗菌剤（コリスチン等）等が挙げられる。

[0059] 3 . スクリーニング方法

本発明の 1つの実施態様は、細菌膜に存在する物質と相互作用して抗菌活性を示すペプチド系の候補化合物のスクリーニング方法である（以下「本発明のスクリーニング方法」とも言う）。

本発明のスクリーニング方法は、以下の工程を含む。

（ 1）物質八と相互作用して抗菌活性を示すことが知られているぺプチド系化合物の類似化合物のライブラリーを提供すること；

（2）前記ライブラリー中の類似化合物を物質と接触させて、各々の類似化合物と物質との錯体を形成させること；

（3）（2）で得られた類似化合物と物質との個々の錯体を分配し、溶媒を添加することにより当該錯体から物質を溶離させること；

（4）各々の錯体から得られた各溶離液を採取して、各々の類似化合物についての物質と錯体を形成した程度を分析すること：

（5）溶離液を採集した後に残った各々の類似化合物を回収し、各類似化合物の抗菌活性を測定すること。

以下、本発明のスクリーニング方法の各工程について詳細に説明する。〇 2020/175451 23 卩（：170? 2020 /007391

[0060] 本発明のスクリーニング方法において用いることができる細菌膜に存在する物質八としては、メナキノン、デメチルメナキノン、メチルメナキノン、ジメチルメナキノン、メチオナキノン、ユビキノン、ロドキノン、プラストキノン、クロロピウムキノン、ジヒドロメナキノン、テトラヒドロメナキノン、ヘキサヒドロメナキノンが挙げられる。

[0061 ] ( 1 - 1 ) 物質と相互作用して抗菌活性を示すことが知られているべプチド系化合物の類似化合物のライブラリーの構築

本発明のスクリーニング方法は、物質と相互作用して抗菌活性を示すことが知られているべプチド系化合物を部分的にミユーテーシヨンすることにより得られる類似化合物群をスクリーニングすることにより行われる。ここで、ミユーテーシヨンを行うぺプチド系化合物は、直鎖状のぺプチド化合物、環状ペプチド化合物のいずれでもよい。

また、ペプチド系化合物には、各アミノ酸残基がアミド結合で結合したぺプチド化合物に加えて、アミノ酸残基の一部がエステル結合等のアミド結合以外の結合様式により結合した部位を含む化合物も含まれる。

[0062] このような既知のぺプチド系化合物の類似化合物のライブラリーは、公知の複合べプチドの固相全合成法を用いて得ることができる。

本発明のスクリーニング方法においては、類似化合物はビーズ結合型ぺプチド系化合物であることが好ましい。ビーズ結合型べプチド系化合物のライブラリー (化合物群) は、〇巳〇〇 ( 0 11 6—匕 6 3〇1— 0 11 6—〇〇01 〇 u n d ) 法を用いて調製することが好ましい。〇巳〇〇法を用いると、個々のビーズに構造的に特有の類似体をサブマイクログラムの量で担持することができる。また、 1 0 0 0種類以上の類似化合物を同時に調製することができる。

[0063] 〇巳〇〇法は1_ 3〇1 , [< . 3等により開発された方法であり

«. .；

V· (^6111· (^ · 1997, 97, 41 1 ) 、小サイズのペプチドライブラリーを構築する有効な手法ではあるものの、これまで、複雑な天然ペプチドの合成には殆ど適用されなかった。本発明者等は、ライソシン巳の〇 2020/175451 24 卩（：170? 2020 /007391

全固相合成で用いた手法を採用することにより高効率でビーズ結合型べプチド系化合物のライブラリーを構築できるのではないかと考えた。

即ち、本発明者等が行ったライソシン巳の固相全合成においては、図 1 に示す化合物 7を ₃ n 9樹脂に結合させて ₃ n ₉樹脂結合型 7を得て、これを起点として化合物 4〜 6及び化合物 8〜 1 4を用いて段階的なペプチド鎖の伸長を行い、これに続くマクロラクタム化、および保護基の酸による除去によって、総収率 8 . 0 %で達成された。

[0064] 〇巳〇〇法を用いたビーズ結合型べプチド系化合物のライブラリーの調製方法においては、分割混合法（3 丨丨 1： _ 3 11 〇1 _ 111 丨 X法）が好適に用いられる。図 2は、本発明のスクリーニング方法の基本的なスキームを示しているが、その上段部に本発明で用いるビーズ結合型べプチド系化合物の〇巳〇（3ライブラリーを構築する方法が示されている。

[0065] まず、物質八と相互作用して抗菌活性を示すことが知られているペプチド系化合物のぺプチド残基のうち、可変にするぺプチド残基部と変化させないペプチド残基部を選定する。図 2においては、「八」と「巳」が不変（共通）ペプチド残基部であり、「X」と「丫」が可変ペプチド残基である。

図 2の上段に示すように、ビーズを共通のペプチド成分である「八」と結合させ、次に可変残基である「X」の部位にペプチド成分 1〜 3を結合させると 3種類のビーズ結合型ジベプチドが得られる（図 2の上段部の左から 2 番目の図）。こうして得られた 3種類のビーズ結合型ジペプチドの全てに共通のペプチド成分である「巳」を結合し、次に、可変の残基である「丫」の部位にペプチド成分 4〜 6を結合させる。その結果、 9 （= 3 ²）種類のビーズ結合型テトラペプチドが得られる（図 2の上段部の右の図）。この操作を繰り返すことにより、〇巳 0（3ライブラリーとして、所定の可変残基部位に所望のぺプチド成分を導入したビーズ結合型べプチド系化合物のライブラリ —を得ることができる。図 2の下段部は、〇巳〇〇法を用いてビーズ結合型ライソシン類似体が得られる例を模式的に示している。

[0066] 本発明のスクリーニング方法において、〇巳〇〇法を用いてビーズ結合型〇 2020/175451 25 卩（：170? 2020 /007391

ぺプチド系化合物のライブラリーを構築するにあたり、どのアミノ酸残基で構造改変を行うかは、物質と相互作用して抗菌活性を示すことが知られているべプチド系化合物の生物学的に重要な構造への影響を最小化し、全体的な合成の効率も考慮して決定される。一例として、ライソシン巳において検討した結果を以下に示す。

まず、 1

中心と

レンは、生物活性を示す三次元構造に潜在的に影響することから、これらを保持した。次に、（［¾） _ 3—ヒドロキシ _ 5—メチルヘキサンアミド、〇 - A r 9 - 2 / 7、

及び口一丁「一 1 0については、化学変異させると抗菌活性を低下させることから、これらの残基は変更しなかった。更に、！_ _◦ 丨リ _ 8は固体支持体への結合部位として必須であり、また、！_ -丁 II 「一 1 / 1 2を変化させると固相エステル化の収率に影響を与えると推定されたため、これらの残基も変更しなかった。そして、これらの点を考慮して、 I -— 3 6 「一3、 1 -—し㊀リー 6、 0— 0 I 1^— 9及び

1 1 をライブラリーの構築における可変部位と決定した。

［0067］本発明のスクリーニング方法において、〇巳〇〇法を用いてビーズ結合型ぺプチド系化合物のライブラリーを構築するにあたり、可変部位のペプチドの側鎖をどのように変更するかについては、これらの物理化学的性質の観点から多様化するのが望ましい。可変部位のぺプチド側鎖に導入する基として、例えば、疎水性基、酸性基、塩基性基、水酸基又は水酸基含有基、 1級アミド基及び芳香族基からなる群から少なくとも 1以上を選択し、これらの基に属する適切な置換基を採用することができる。

［0068］また、本発明のスクリ—ニング方法で得られるぺプチド系の候補化合物の構造を決定するために IV! 3 /IV! 3分析が用いられるが、 IV! 3 /IV! 3分析により、一つのビーズ上の特有の構造を明確に決定することを可能にするためには、ぺプチド系の候補化合物の配列中の各可変残基は固有の分子量を有さなければならない。従って、可変部位のペプチド側鎖に導入する基の分子量は、通常異なることが好ましい。〇 2020/175451 26 卩（：170? 2020 /007391

[0069] ビーズ結合型べプチド系化合物のライブラリーの調製方法において用いるビーズとしては、ペプチド固相合成で通常用いられる樹脂、例えば、 W a n 9樹脂、 2—クロロトリチル (巳 8 「 I 〇 3 ) 樹脂、

、 I 6 n I 3 0 6 I等が使用できるが、許容される溶媒種の多様性、ビーズサイズの均一性の点から、 I 6 n I 3 0 6 Iが好ましい。

[0070] また、ペプチド系化合物とビーズを連結するリンカーとしては、ペプチド固相合成で通常用いられる種々のリンカーを用いることができるが、酸に安定なリンカーを用いると側鎖を保護基で修飾しなくてもビーズ結合型べプチド系化合物を調製することが可能であることから好ましい。また、光分解性のリンカーを用いると、試薬等を用いなくてもビーズ結合型べプチド系化合物に単に光を照射することで、ビーズからぺプチド系化合物を遊離させることができるため好ましい。

本発明のスクリーニング方法においては、〇-二トロべラトリルリンカー、メチオニンリンカー等を好適に使用することができる。

[0071 ] ( 1 - 2 ) ライブラリー中の類似化合物を物質と接触させて、各々の類似化合物と物質との錯体を形成させる工程

( 1 ) の工程で得られた物質と相互作用して抗菌活性を示すことが知られているぺプチド系化合物の類似化合物群を、物質を接触させる手法としては、例えば、物質八の溶液を類似化合物に噴霧する方法、物質八の溶液に類似化合物群を溶解又は分散させる方法等が挙げられる。

本発明のスクリーニング方法においては、〇巳〇〇法を用いて調製したライブラリー中のビーズ結合型ペプチド系化合物、及び、メナキノン等の物質八をメタノール等のアルコール系溶媒に添加することで、各々のビーズ結合型べプチド系化合物とメシチリン等の物質を接触させることが好ましい。両者を接触させると、ビーズ結合型べプチド系化合物群の個々のビーズ結合型べプチド系化合物とメナキノン等の物質との錯体が形成される。

[0072] ( 1 - 3 ) 工程 ( 2 ) で得られた類似化合物と物質との個々の錯体を分配し、溶媒を添加することにより当該錯体から物質を溶離させる工程〇 2020/175451 27 卩（：170? 2020 /007391

工程 ( 2 ) で得られた類似化合物と物質との個々の錯体、好適には、ビ —ズ結合型べプチド系化合物とメナキノン等の物質との個々の錯体を分配する方法としては、各々の錯体をマイクロプレートに分配することが好ましい。ビーズ結合型べプチド系化合物では 1つのビーズに 1種類のペプチド系化合物が担持されていることから、マイクロプレートの 1つのウェルには 1 種類のビーズ結合型べプチド系化合物を分配することができる。マイクロプレートのウェルの数は、ビーズ結合型べプチド系化合物群中の化合物の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、 9 6—ウェルのマイクロプレー卜等を使用することができる。

[0073] マイクロプレート等に分配した後、前記類似化合物と錯体を形成していない未結合の物質を取り除くため、有機溶媒で洗浄する。この際に使用する有機溶媒としては、例えばメタノール等を用いることができる。

[0074] 次に、前記類似化合物と物質との錯体から物質を溶離させるために溶媒を添加する。ここで用いる溶媒は、類似化合物と物質との錯体の種類に応じて適宜選択されるが、ビーズ結合型べプチド系化合物とメナキノンの錯体の場合は、長鎖アルカノールを使用することができ、特に -ブタノールを好適に使用することができる。また、この際に、门 _ブタノール等を添加した分散液を 3 0〜 6 0 °〇に加温することが好ましく、 5 0 °〇に加温することが特に好ましい。

上記の工程により、各々の錯体から物質が溶離して、物質の溶離液を得ることができる。

[0075] ( 1 - 4 ) 各々の錯体から得られた各溶離液を採取して、各々の類似化合物についての物質と錯体を形成した程度を分析する工程

( 3 ) の工程で得られた各々の錯体から各溶離液を採取して、各々の類似化合物について物質との錯体を形成した程度を分析する。これにより、各々の類似化合物が物質を取り込むことができる程度、即ち、各々の類似化合物が物質八と相互作用する程度を判定することができる (第 1スクリーニングエ程) 。〇 2020/175451 28 卩（：170? 2020 /007391

各々の類似化合物について物質との錯体を形成した程度を分析する手法としては、物質八の量を定量的又は定性的に検出することができる分析方法を適宜選択することができる。物質がメナキノンの場合は、溶離液の蛍光強度を測定することにより、各々の類似化合物について物質との錯体を形成した程度を分析することができる。更に、メナキノンの溶離液に 3巳1^~1 ₄ 等の還元剤を添加することにより、メナキノンを以下の下段の式に表される還元型メナキノンにすると、蛍光強度の測定感度が向上するため、より定量的な分析が可能になり好ましい。

[0076] 次に、各々の類似化合物が物質を取り込むことができる程度、即ち、各々の類似化合物が物質と相互作用する程度を判定するには、物質と相互作用して抗菌活性を示すことが知られているべプチド系化合物についての分析値を比較することにより、当該既知のぺプチド系化合物よりも物質八と相互作用する程度が高いか否かを判定する。物質がメナキノンの場合は、メナキノンと相互作用することが公知であるペプチド系化合物、例えばライソシン巳を用いた場合の溶離液の蛍光強度と、類似化合物について得られた溶離液の蛍光強度を比較して、類似化合物についての蛍光強度値が前者の蛍光強度より高ければ、当該類似化合物をぺプチド系の候補化合物の 1つとして選定することができる。

このようにしてぺプチド系の候補化合物として選定された化合物の集団（化合物群）を、「ペプチド系の候補化合物群」とも言う。〇 2020/175451 29 卩（：170? 2020 /007391

[0077] （1 - 5）溶離液を採集した後に残った各々の類似化合物を回収し、各類似化合物の抗菌活性を測定する工程

次に、溶離液を採集した後に残った各々の類似化合物を回収し、各類似化合物の抗菌活性を測定する。

ここで、類似化合物がビーズ結合型ペプチド系化合物である場合は、ビーズを除去してペプチド系化合物を得て、その抗菌活性を測定する（図 2の下段の右側を参照）。ビーズ結合型ペプチド系化合物からビーズを除去する手法は、用いるビーズの種類、リンカーの種類等に応じて選択することができるが、リンカーとして光分解性のリンカーを用いると紫外線等の光を照射することによりビーズを除去することができる。

[0078] 本工程においては、（3）の工程の後に回収した全ての類似化合物について抗菌活性を測定してもよいが、（4）の工程で選定された「ペプチド系の候補化合物群」について抗菌活性を測定するのが好ましい。

[0079] 抗菌活性の測定としては、種々の菌に対する耐性を調べることができるが、例えば、グラム陽性菌： IV! 3 3八 1、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（IV! [¾ 3八 4）、

11 3 6 111 0 I

〇リ 3、セレウス菌、枯草菌及びリステリア菌等に対する活性を測定することができる。また、 1\/1 3 3 1 に対する活性は、活性を増強する血清である巳 0 3の存在下（例えば、 1 〇%添加）又は非存在下で評価することができる。

[0080] ぺプチド系の候補化合物群について抗菌活性を測定し、それらの結果を、物質八と相互作用して抗菌活性を示すことが知られているべプチド系化合物の抗菌活性の測定結果と比較することにより、ぺプチド系の候補化合物として選定することができる。

[0081 ] ペプチド系の候補化合物群中の各化合物、又は、抗菌活性を測定した結果選定されたべプチド系の候補化合物の配列は、これら化合物を

シークェンス分析にかけることにより決定することができる。ここで、ぺプチド系の化合物が環状べプチドである場合は、塩基性条件又は酸性条件下で加水分解して直鎖べプチドを得て、これを IV! 3 /IV! 3シークェンス分析に供〇 2020/175451 30 卩（：170? 2020 /007391

する。

[0082] （1 - 6）ライソシン巳を用いたスクリーニング方法

本発明のスクリーニング方法の一例として、メナキノンと相互作用して抗菌活性を示すことが知られているべプチド系化合物としてライソシン巳を用いたスクリーニング方法について説明する。

[0083] ライソシン巳を基準化合物として〇巳〇（3法により類似化合物を合成する概略図を図 3 8及び図 3匕に示す。

図 3の上段左の図は、ビーズ結合型ライソシン巳の構造を示している。ここで、ビーズとして丁 6 n I 3◦ 6 丨を用い、リンカーとして光分解性リン力一である〇二トロべラトリノレリンカーを用いた。

可変部位としては、上記で説明した理由から、！_— 3 6 「一 3、！_— 1_ 6 リー6、 0 -〇 1 门一9及び！- - 1 1 6 - 1 1 を選定した。そして、これら可変部位の各ペプチド残基の側鎖を

、及びと定めた（図 3 3 の上段の左図を参照）。

[0084] 次に、可変部位の、 [¾ ²、

³及び ⁴として導入する基として、疎水性基、酸性基、塩基性基、水酸基含有基、 1級アミド基及び芳香族基を選択した。これらに加えて、アラニンースキャニングの化学バージョンとして、メチル基での置換も採用した。そして、これらの基に属する具体的な置換基を、それぞれの置換基が異なる物理化学的特性を持つように選定した。

上記で選定した置換基のリストを図 3 3の上段の右図に示す。各基の右の括弧内には、各々の置換基を示す記号と、分子量が記載されている。

[0085] 図 3匕は、ライソシン巳ベースの〇巳〇〇ライブラリーを構築するために用いる化合物（アミノ酸成分）のリストを示す。リストの上段の 4〜 1 0の化合物は、本〇巳 0（3法で共通して用いる化合物、つまり、不変ペプチド部位を構成する。

リストの下段の化合物 1 1〜 2 6は、本〇巳〇〇ライブラリーの構築に用いる分割混合法でランダム化させる化合物を示す。これらの化合物が可変部位に導入される。これらの内、化合物 1 1〜 1 4は、ライソシン巳に由来す〇 2020/175451 31 卩（：170? 2020 /007391

る化合物であり、化合物 1 5〜 2 6は人工化合物である。

[0086] 上記の化合物を用いて、分割混合法によりビーズ結合型ライソシン巳系化合物の〇巳 0（3ライブラリーを構築する。ここで、 4種類の可変部位において、夫々 7種類のペプチド基を導入していることから、 7 ⁴ = 2 4 0 1種類の化合物を得ることができる。

このように、本発明のスクリーニング方法では、 1つのビーズに 1種類のぺプチド系化合物が固有的に結合した非常に多くの種類のビーズ結合型ぺプチド系化合物を合成することができるため、有効なスクリーニングを行うことが可能である。

[0087] 図 4に、ライソシン巳を用いたスクリーニング方法の全体的模式図を示す分割混合法により得られるビーズ結合型ライソシン巳系化合物をメタノールに分散し、メナキノンを添加する。これにより、ビーズ結合型ライソシン巳系化合物とメナキノンとの錯体が形成される。そして、この分散液中の各々のビーズ結合型ライソシン巳系化合物を 9 6ウェルのマイクロプレートに分配する。次に、各ウェルにメタノールを加えて、ビーズ結合型ライソシン巳系化合物に結合していないメナキノンを洗浄する。

[0088] 次に、各ウェルに n _ブタノールを 5 0 °〇の条件下で添加して、錯体からメナキノンンを溶離させる。そして、ビーズ結合型ライソシン巳系化合物と溶離液を分離する。

上記の操作で得られた各溶離液を採取して、各々のビーズ結合型ライソシン巳系化合物についてメナキノンとの錯体を形成した程度を分析する。これにより、各々のライソシン巳の類似化合物がメナキノンを取り込むことができる程度、即ち、各々のライソシン巳類似化合物がメナキノンと相互作用する程度を判定する（第 1スクリーニングエ程）。分析手法としては蛍光強度の測定を用いるのが好ましい。また、 3巳 1^~1 ₄を添加することにより、メナキノンを還元型メナキノンに変換すると、蛍光強度の測定感度が向上するため、より定量的な分析が可能になり好ましい（図 4の中段参照）。〇 2020/175451 32 卩（：170? 2020 /007391

そして、各試料の蛍光強度の測定結果をビーズ結合型ライソシン日を用いた場合の蛍光強度と比較して、ライソシン巳よりもメナキノンと相互作用する程度が高いか否かを判定する。ライソシン巳を用いた場合よりも蛍光強度が高ければ、当該ライソシン日類似化合物を候補化合物の 1つとして選定することができる。このようにして、候補化合物を選定してライソシン巳類似化合物の集団（化合物群）を得る。以下この化合物群を「ライソシン巳系候補化合物群」とも言う。

[0089] 上記の工程で、メナキノンが遊離したビーズ結合型ライソシン系化合物を回収する。次に、回収したビーズ結合型ライソシン日系化合物について、ビ —ズを除去してライソシン巳系化合物を得る。ビーズを除去する手法としては、光を照射することによりビーズを除去することができる（図 4の中段参照）。

こうして得られたライソシン日系化合物について抗菌活性を測定するが、全てのライソシン巳類似化合物について抗菌活性を測定してもよいが、上記の第 1のスクリーニングエ程で選定された「ライソシン巳系候補化合物群八」について抗菌活性を測定するのが好ましい。

[0090] 抗菌活性の測定としては、種々の菌に対する耐性を調べることができるが、例えば、グラム陽性菌： IV! 3 3八 1、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（IV! [¾ 3八 4）、

11 3 6 111 0 I

〇リ 3、セレウス菌、枯草菌及びリステリア菌等に対する活性を測定することができる。また、

1 に対する活性は、活性増強血清である巳 0 3の存在下（例えば、 1 0 %添加）又は非存在下で評価することができる。

[0091 ] ライソシン巳系候補化合物群について抗菌活性を測定し、それらの結果を、ライソシン巳の抗菌活性の測定結果と比較することにより、ライソシン巳系の候補化合物として選定することができる。

[0092] ライソシン巳系候補化合物群中の各化合物、又は、抗菌活性を測定した結果選定されたライソシン巳系の候補化合物の配列は、これら化合物を IV! 3 /IV! 3シークエンス分析にかけることにより決定することができる。この際〇 2020/175451 33 卩（：170? 2020 /007391

に、塩基性条件又は酸性条件下で加水分解して直鎖べプチドを得て、これを MS /MSシークエンス分析に供する。

実施例

[0093] 以下に、本発明の実施形態について実施例を用いて詳述するが、本発明はその要旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。

[0094] [参考実施例 1 ]

ビーズ結合ライソシン Eの合成と構诰決定、アッセイの最谪化

本発明のスクリーニング方法を実施するに当たり、 1 ビーズは 1

未満のべプチドしか含まないため、 1つの系の〇 BOCライブラリーを構築する前に小規模の手順を設計する必要がある。そこで、本発明者等は、最初に、本発明の〇 B OC戦略の実現可能性を検証するために、 T e n t a G e 丨ビ —ズを使用してライソシン E （化合物 1）を合成することを目的とした。

[0095] （ 1）合成の一般論

本明細書において、特記しない限り、空気および/または湿気に敏感なすベての反応は、乾燥溶媒中、アルゴン（A r）雰囲気下で行った。 CH₂C I 2、 DMF、および E t ₂〇は、 G l a s s Co n t o u r溶媒分配システム（N i k k o H a n s e n）によって精製した。特記しない限り、他の全ての試薬は供給されたままで使用した。固相ペプチド合成（S P PS）は、密閉反応容器を用いてマイクロ波支援ペプチド合成機 MWS— 1 000 （ EYE LA）にて行い、当該密閉反応容器内の反応温度は、内部温度プローブによってモニターした。

旋光度は、 P- 2200旋光計（J ASC0）で記録した。赤外線（丨 R ）スぺクトルは、 C a F ₂上の薄膜として F T/丨 R-4 1 00分光計（J A SCO）に記録した。 ¹ Hおよび¹³ CN MRスペクトルは、 ECX500 V H NMRでは 500 MH z）分光計、 ECZ 50 O R O H NMRでは 500 MH z）分光計（ J E〇 L）、または C r y〇 P r〇 b e （〗 Hでは 800M H z）を装備した Av a n c e I I I H D 800 MH z O Hでは 80 0MH z、 ¹³CNMRでは 200 MH z）（B r u k e r）で記録した。〇 2020/175451 34 卩（：170? 2020 /007391

化学シフトは、内部標準

^ 52. 50、 ¹³0539. 5）として残留溶媒のピークに関連して 5 （）で表記する。

スペクトルは、 |\/1 1 〇「〇丁〇 1 1

03 I I 〇 11 I 〇 3

）エレクトロスプレーイオン化飛行時間型（巳3 1 _丁〇）質量分析計で記録した。

リ V吸光度は□ V- 1 800 □ V- V I 3分光光度計（ 3 丨 013

1·!）で測定した。高速液体クロマトグラフィー

実験は、 11_ 2089 丨リ 3インテリジェントポンプを備えた 1^~1 !_〇システムまたは 11-2086 ? I リ 3インテリジェントポンプを備えた 1^~1 !_〇システムで行った（」八3〇〇）。超高速液体クロマトグラフィー（II 1^~1 !_〇）実験は、乂一1_〇システム（」八3〇〇）で行った。

[0096] （2）ビーズ結合型ペプチドの合成の一般的手順

化合物 29の調製

3）で洗浄した。 1_ 1 匕「 3丁リ匕 6中のビーズに、 01\/1 （500 1_

）中のヒドロキシエチルフォトリンカー（28. 3当量）、 1\1、 1\1’ ージイソプロピルカルポジイミド（3当量）および 1 —ヒドロキシベンゾトリアゾ —ル（1^~1〇巳 1、 3当量）の溶液を室温で加えた。室温で 2時間撹拌した後、混合物を濾過し、口1\/1 （1. 00 !_ 3）で洗浄して光分解性リンカ —結合樹脂を得た。

!_ 丨匕「 ₃丁リ匕 6中の上記光分解性リンカー結合樹脂に、口 IV! （ 1. 00〇11_）中の〇1〇〇-1_-〇 1 リー〇八 1 I ソ I （7 , 5当量）、 1\1、 1\1’ ージイソプロピルカルボジイミド（5当量）および 4_ （1\1、 1\1_ジメチルアミノ）ピリジン（〇. 5当量）の溶液を室温で添加した。室温で 1 2 時間撹拌した後、反応混合物を濾過し、口1\/1 （1. 00 !_ 3）および〇1^~1₂〇丨 ₂ （1. 00〇!1_ 3）で洗浄して、プレロードビーズを得た。〇 2020/175451 35 卩（：170? 2020 /007391

上記の予め充填されたビーズに、残りのヒドロキシ基をキヤッビングするために室温で八

を加えた。室温で 30分間撹拌した後、反応混合物を濾過し、〇1^~1₂〇丨 ₂ （1. 00 し 3）、

（1. 00〇11_ 3）、および巳 1: ₂〇（1. 00〇11_ 3）で洗浄し、真空乾燥して化合物 29を得た。

[0097] （3）積載率の決定

〇〇保護樹脂をピぺリジン/ 0 IV! （ 1 /4、 1 00 し）で室温にて 30分間処理した。反応混合物を 01\/1 （2. 90 !_）で希釈した。得られた混合物の 301

V吸収を測定した。ピペリジン/ 0 IV! （

1 /4）の溶液から得られた対照吸光度を差し引くことによってバックグラウンド吸光度を相殺した。口ーディング速度（X 01010 I /^）は以下の式によって決定した。ここで、 8は 01〇〇保護樹脂の重量（019）であり、そして 13は 301 01での吸光度である。

X = （ 1 0000X 6） / （7800X 3）

[0098] （4）ビーズ結合型ライソシン巳の合成

ビーズ結合型ライソシン巳の調製は、光開裂可能なリンカー 28と丁 ₆门 I 306 I ビーズ 27のアミンとの結合体ら開始した（スキーム 1 （図 5）

）〇次に、リンカーの第二級アルコールを

I リー〇八 I I V I 7のカルボン酸と縮合させて、化合物 29を 2ステップにわたって 90%の収率で得た（3. 2 |^〇1〇 1 /ビーズ）。このようにして得られたビーズを〇〇系固相ペプチド合成に供した。アミドカップリングは、合成を容易にするためにマイクロ波支援条件下の 40°〇で行った。更に、ペプチドの鎖間凝集および混入ジメチルアミンによる望ましくない 01〇〇除去を回避するために、 1\/1?を溶媒として使用した。

直鎖ドデカペプチドは、 6サイクルのピぺリジン促進脱保護、 1^~1〇八 1 /1^~1八丁11媒介アミド化（4〜 6、 9、 1 1、 1 2）、 0 丨〇/01\/1八？促進エステル化（1 0）、次いで、

脱保護およびアミド化（8 、 1 3、および 1 4）によって、 29より引き延ばされた。次いで、生成物〇 2020/175451 36 卩（：170? 2020 /007391

の 1\1末端の 01〇〇基および（3末端のアリル基を、ピぺリジン、続いて〇1 （ 1^ ₃） ₄およびモルホリンで処理することにより除去して、マクロラクタム前駆体を得た。

次いで、

4 , 6—コリジンを使用してビーズ上環化を行い、 3 7員環マクロラクタムを得た。最後に、マクロラクタムを水性丁八で処理すると、側鎖保護基が脱離してビーズ結合型ライソシン巳（化合物 3 0）が得られた。酸性条件下でのその安定性にもかかわらず、 3 0のリンカ _は1\/| ₆〇1^~1に分散し紫外線（3 6 5 nm）を照射することにより滑らかに開裂し、粗製物 1が得られた。 2 6ステップにわたる化合物 2 9から化合物 1 までの全体の収率は、 1\/1 3および高速液体クロマトグラフィー

）分析によって 5 . 1 %と計算され、この手順の効率が前の全合成（8 . 0 %）に匹敵することを実証した。その結果、合成後の 1 ビーズは、ライソシン巳を〇. 2 5 9含んでいた。

[0099] また、図 6に示す蛍光強度の測定したビーズ結合型べプチド 3 0は以下の手順で合成した。

ビーズ結合べプチド 3 0 :

ビーズ 2 9 （3 7 . 4〇1 9、 8. 3 0 〇1〇 1、負荷率〇. 2 2 2〇1 111〇丨 / 9）を、上記のマイクロ波支援標準 3 3プロトコル、ビーズ上エステル化、ビーズ上マクロラクタム化、および脱保護に供して 3 0を得た（4

〇〇 ₉）

[0100] （5）合成したペプチドの構造決定

〇巳〇〇法においては、 1つのビーズを使用して 1つの構造を確立することが不可欠である。しかしながら、環状ペプチドの配列決定は、複数の位置での開環によって引き起こされるそれらの複雑な断片化パターンのために、一般的に問題がある。そこで、分析を単純化するために、化合物 1の大環状化合物を、 1_ -丁 11 「一 1 と一 1 2との間の単ーエステル結合を利用することによって直鎖状化した。具体的には、化合物 1

中の 1 % !\1 1^~1 ₃で処理して直鎖状セコ酸（化合物 3 1）を生成した。化合物 3 1のマト〇 2020/175451 37 卩（：170? 2020 /007391

リックス支援レーザー脱離/イオン化〇\/1八1_ 0 I）

分光分析は

、化合物 1のアミノ酸配列に一致する高品質フラグメントイオンを与えた。従って、化合物 1の構造は、エンコーディング技術を用いずに一義的に推定された。その高い感度のために、 1\/13/1\/13シーケンス分析は1 ビーズ上の化合物 1 （0. 04 9）の 1 5%しか必要としなかった。

[0101] （6）メナキノン錯体形成アッセイ

次に、ビーズ上に結合したライソシン巳（化合物 30）及びメナキノン（化合物 2）を用いて、ビーズ上複合体形成アッセイの実行可能性を評価した。化合物 2を化合物 30の IV! ₆〇1^~1溶液に添加すると、化合物 3 0の色は黄色から赤色に変化し（図 7の 3）、これは、ライソシン巳の構造と化合物 2との間の選択的芳香族一芳香族相互作用を示している。ビーズが溶液から切り出された後でさえも、赤色が観察された（図 7の匕）。しかしながら、予備実験では、赤色の大きさは捕獲された化合物 2の量に比例しないことが示された。

そこで、本発明者らは、化合物 2を定量するための蛍光べースの方法を開発した。 30のビーズ 1個を IV! 6〇1^~1中の化合物 2と共にインキユベートし、次いでマイクロプレートウエルに分注した。 IV!㊀〇 1^~1により得たビーズからビーズに未結合の化合物 2を洗浄した後、ビーズに結合した化合物 2をさらに強制的かつ疎水性の条件（50^°〇で n -巳リ〇 1^~1）下で溶出して、化合物 2を含有する溶出液を回収した。次に、化合物 2のナフトキノン部分を —巳 1_1〇1~1中の N 3巳 1~1₄で還元して蛍光ヒドロキノン 21~1を生成した（ス

ス %₁₁₁₄ = 43〇 11111）。最後に、化合物 30のビーズ 1個からの 21^~1の蛍光強度を評価してビーズに結合した化合物 2の量を決定した。

この方法はわずかな誤差範囲（1 026±648. リ. ）を有し、それはその高い精度を示した（図 5および図 6）。重要なことに、複合体化アッセイの間、化合物 1の構造は無傷のままであった：ウルトラ 1^~1 !_〇（11 ^ 9 !_〇）および質量分析は、ビーズ上アッセイの前後で化合物 1の量が変化し〇 2020/175451 38 卩（：170? 2020 /007391

ていないことを検証した。

[0102] （7）抗菌アツセイ

最後に、黄色ブドウ球菌に対する抗菌アツセイを小型化して、液相中の化合物 1の活性を評価した。

シークエンシングは単ービーズに由来する化合物 1の 1 5%を消費するため、化合物 1の 0. 2 1 9に対応する 85%をアツセイに適用した。化合物 1の量が微量のため、実験は単一濃度で実施し、増殖培地の容量は 1 ウエルあたり 40 しに縮小した。それでも、化合物 1の IV! I （3値（2〜4 9/ !_）を考慮すると、その抗菌効果を検出するには、化合物 1の約 0. 1 6〜〇. 32 9が必要となる。有益な収率でビーズから誘導された数千のペプチドの活性を並行して推定するためには、活性の検出限界を下げなければならない。そのため、本発明者らは、高感度アツセイを確立するための条件を探索した。

[0103] 化合物 1は黄色ブドウ球菌感染マウス（巳 0₅₀=〇. 5 ₉/1< 9）において強力な治療効果を有するので、本発明者等はインビボ条件を模倣することにより化合物 1のインビトロ活性を改善することを試みた。添加剤のスクリーニングは、ウシの子牛血清（巳〇 3）が化合物 1の抗菌活性を劇的に増強することを明らかにした。具体的には、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（1\/133八 1）に対する化合物 1の IV! I 〇値は、 1 0%巳〇3を増殖培地に添加することによって 64分の 1 （0. 0625 9/ !_）となった。図 7の〇に示されるように、天然の化合物 1 （八/巳）の〇. 04 9および単ービーズ由来の化合物 1 （〇/〇）の 85%の両方の添加は 1\/133八 1の増殖を完全に阻害したが、対照ウエル（日/ ）では増殖が観察された。

[0104] このようにして確立された実験プロトコルは、合成、構造決定、および単 —ビーズ由来の化合物 1のみを使用することによる性能評価を可能にした。したがって、〇巳〇（3戦略全体はこれらのプロトコルに従って設計した（図 5を参照）。

[0105] 第一に、 2401種類のビーズ結合型ペプチドは、分割一混合手法を用いた並行固相合成によって生成する。第二に、ビーズを IV! ₆〇!^~1中で化合物 2 〇 2020/175451 39 卩（：170? 2020 /007391

と混合し、マイクロプレートウエルに分配し、 1\/16〇1^~1および n—巳リ〇1^~1 で順次処理して、化合物 2を含有する溶出液とビーズ結合型べプチドを分離した。第三に、溶出液への 3巳 1^~1₄の添加によって生成される 21^~1の蛍光強度を測定することによって、ペプチドと化合物 2の錯化活性を評価した。第 4に、 1 5%の単ービーズ由来のペプチドを直鎖状化して、その配列を 1\/13 分析によって決定した。第 5に、同じペプチドの 85%を用いてぺプチドの抗微生物活性を評価した。スクリーニングを容易にするために、第三段階の陽性化合物のみを第四および第五段階に使用する。

[0106] [実施例 1 ]

ライソシン巳に甚づ <〇巳〇（3ライブラリーの構築

2401種類のペプチドを含む〇巳〇〇ライブラリーは、第 3残基、第 6 残基、第 9残基及び第 1 1残基の縮合時に分割混合法を適用することによって構築した（スキーム 2 （図 8））。アミド化、エステル化、マクロ環化、および脱保護のための試薬と条件は、スキーム 1で開発したものと同じであるが、ランダム化には 1 2種類のアミノ酸 1 5-26を新たに使用した。ここで、実際には、 3倍のビーズ数（約 75 1 〇ビーズ）を使用することで、合成上の効率を損なうことなくこのライブラリーのカバー率を最大化することを計画した（ペプチドの予想カバー率 = 95%）。このようにして、

75 1 0個のビーズ（7 : 1 ビーズあたり 3. 2 n m〇 I）からなる 7—結合型 29を 3段階でジペプチド 32 （化合物 32）に変換した。

第 6残基での最初のランダム化として、化合物 32のビーズを 7つの反応容器に分割し、それらを天然物と同じ〇〇アミノ酸（1 2）および 6つの〇1〇〇アミノ酸（1 1、 1 5、 1 7、 1 9、 22、 23、および 25）と別々に縮合させ、続いてピぺリジンで処理した。次いで、全てのビーズを再度混合し、化合物 5および化合物 4を用いて縮合を行い、 7つの構造を含むへキサペプチド 33を得た。 7つの成分（化合物 1 1、 1 5、 1 7, 1 9 、 22、 23及び 25）を使用する第 3残基での 2回目のランダム化に続いて、化合物 6、 9及び 1 0の縮合/ 一脱保護を順次行い、ノナペプチド 3 〇 2020/175451 40 卩（：170? 2020 /007391

4 （49構造）を得た。さらに 3個のアミノ酸残基の導入、第 1 1残基および第 9残基でのランダム化および第 1 0残基の縮合により、直鎖ドデカぺプチド 36 （2, 401構造）を合成した。

最後に、ビーズ 36はパラジウムを用いたアリル基の除去、マクロ環化、およびビーズ上での脱保護により 2401種のビーズ結合型環状ペプチドに変換した。

[0107] 以下にライソシン巳に基づく〇巳〇〇ライブラリーを構築した手法の詳細を記載する。

[0108] （ 1）分割混合法による合成の手順

2401種のビーズ結合型べプチドをぺプチド合成機で調製した。基本的操作手順は以下の通りである。

工程 1 :固体支持 1\1„- 〇1〇〇ペプチド（3 〇 1、 3<50）を〇1^~1₂ 〇 I ₂を含む 7つの 5 1_ 1_ 丨匕「 ₃丁リ匕 6に分割し、真空乾燥した。工程 2 :固相支持体 1\1„ _ 〇〇ペプチドをピぺリジン/ IV! （1 /4 、室温、 1 〇分）で脱保護した。

工程 3 : 5〇11_の 1_ 1 匕 V a T u b _&中の樹脂を IV! （2m L_s 30秒 X 5）で洗浄した。

工程 4 :バイアル中のアミノ酸（4. 0当量）を、 1\/1?中の〇一（7 -アザべンゾトリアゾールー 1 —イル）一 1\1、 1\1、 1\1’、 1\!，ーテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフエート（1^~1八丁11、 4. 0当量、〇. 451\/1） /1 -ヒドロキシー7 -アザべンゾトリアゾール（1^~1〇八 1:、 4. 0当量、

〇. 45 IV!）の溶液によって活性化した。活性化アミノ酸の溶液に、 1\/1? 中の丨一「 ₂ 巳 1: （8. 0当量、 2. 01\/〇の溶液を加えた。得られた混合物を反応容器に移した。バイアルを IV! （〇. 0072 1 1_）で洗浄した。溶液を反応容器に移した。

工程 5 :活性化アミノ酸を樹脂上のぺプチドとカップリングさせ（ 40 ^°〇、

1 00 ； 20分）、樹脂を含有する反応容器を IV! で洗浄した（2 !_

、 30秒 X 5）〇〇 2020/175451 41 卩（：170? 2020 /007391

ステップ 6 : 7バッチの樹脂を 1つの 1_ 1 匕「 3丁リ匕 6で〇1^~1₂〇 I ₂と混合した。

[0109] 工程 1〜 6は、残基一 3、一6、一 9及び一 1 1の縮合のために行われた。

工程 2〜 5は、残基一 2、一4、一5、一 7及び一 1 0の縮合のために行われた。

9のカップリングを室温で 40分間行った。

[0110] （2）ビーズ上エステル化

5〇11_の 1_ 丨

ビーズ結合へプタペプチド（ 8 01〇 I

、＜50）に、 1\/1?/〇1^~1₂〇 1 ₂ （1 /9、 500 !_）中の 1\1、 1\1，一ジイソプロピルカルポジイミド（8. 0当量）および 1 0 （8. 0当量）の溶液を加えた。混合物に、 1\1、 1\1—ジメチルー 4—アミノピリジン（1. 0 当量）を加えた。室温で 3時間撹拌した後、反応混合物を

（1.

で洗浄してビーズ結合デプシぺプチドを得、これをさらに精製することなく次の反応に使用した。

[0111] （3）ビーズ上マクロラクタム化および脱保護

!_ I 匕「 3丁リ匕 6中のビーズ結合デプシぺプチド 36または 35に、〇 1^~1₂〇 1 ₂ （500 し）中の（9 9 ^ ₃） ₄ （〇. 25当量）およびモルホリン（24当量）の溶液を加えた。室温で 30分間撹拌した後、反応混合物を〇1^~1₂〇丨 ₂ （1. 00〇!1_ 5）で洗浄してビーズ結合べプチドを得た

（1 /9、 500 し）中のソ巳〇（5. 0当量）および 2, 4, 6 - コリジン（1 0当量）の溶液を加えた。室温で 1 2〜 1 4時間撹拌した後、反応混合物を〇 1^~1₂〇 1 ₂ （1. 00〇11_ 3）、

（1. 00〇11_ 3 ）、および〇 1^~1₂〇 I ₂ （ 1. 00 !_ X 3）で洗浄し、 1時間真空乾燥し、ビーズ結合マクロラクタムを得た。

上記ビーズ結合マクロラクタムに、丁八/1^~1₂〇（1 9/1、 2. 00 1-）を加えた。室温で 1時間撹拌した後、反応混合物を濾過し、〇 2020/175451 42 卩（：170? 2020 /007391

び巳 1₂〇（1. 00〇!1_ 3）で洗浄し、真空下で乾燥させてビーズ結合型ライソシン巳類似体を得た。

[0112] 図 5のスキーム 1 における化合物 1の収率および図 1 7の表の再合成された化合物の収率によると、ペプチドの全体的な収率は 2%_ 1 2% （ビーズあたり約〇. 1 —0. 6 9のペプチド）であると推定された。

[0113] [実施例 2]

ビーズ結合ライソシン巳類似体のメナキノンー複合体形成アッセイ、！\/!3 による構造決定、抗菌アッセイ

（1）ビーズ結合型ライソシン巳類似体の

実施例 1 において合成した 75 1 0のビーズ結合ペプチドを用いて、

-4 （メナキノン（化合物 2）） —複合化アッセイを以下の一般的手順に従つて行¹つた。

[0114] メナキノン錯化アッセイの一般的丰順

のビーズ結合型ライソシン巳類似体に、 IV! 6〇 1^~1中のメナキノンー 4 （化合物 2）の溶液

1. 0〇11_/1 000ビーズ）を加えた。混合物を室温で 1 2時間インキユベートした。 M_e〇H中のビーズの懸濁液（200ビーズ /20〇し）を 2. 0 !_マイクロチユーブに移した。

マイクロピぺットを使用して、マイクロチユーブ内の各ビーズを 96ウエル濾過プレート（27801 1、丁 1"16 「 111〇

3〇 I ø 1^

1: 丨 I¹ 丨〇、 1 ビーズ /ウエル）の各ウエルに化合物 2の溶液（20 !-/ ビーズ）を移した。各ウエルに

（400 し）を加え、ビーズを重力流（ 3）で濾過した。プレート内のビーズを真空下で〇. 5〜 1時間乾燥した。乾燥したビーズを、マイクロピペットを用いて、 Me〇H （20 !_/ウエル）を含む 96ウエル〇[¾プレート（652270、〇 6 1 门 13 丨 0— 0116、 1 ビーズ /ウエル）に移した。溶液を 40 °0の八「気流下で除去して、化合物 2とビーズ結合ペプチドとの複合体を得た。〇 2020/175451 43 卩（：170? 2020 /007391

[0115] プレート中の化合物 2とビーズ結合型ペプチドとの複合体に、室温で n _

B u OH (3〇M L/ウエル) を加えた。懸濁液を 50°Cで 1時間インキユベートした。プレート中に得られた混合物を 3500 X g、室温で 1 0秒間遠心した。各ウエルの上清を黒色ポリスチレン平底 96ウエルプレート (6 55086、 G r e i n e r b i o— o n e) の対応するウエルに移した。溶液を 40 °Cの A r流下で濃縮して溶出物 2を得た。

プレート中の上記溶出物 2に、室温で n _B u〇H (25 L/ウエル) を加えた。プレートを室温で 1 0分間ボルテックスした。得られた溶液に、 n - B u〇 H中の N a B H₄の溶液 ( 1. 0 mM、 25 L/ウエル) を加えた。プレートを室温で 1 0分間ボルテックスした。各ウエルのメナヒドロキノンの虽光 (2 H、 E x. 250 n m/Em. 430 n m) を、 G e m i n i EMマイクロプレートリーダー (Mo l e c u l a r D e v i c e s

) で 3分毎 (0、 3および 6分) に室温で測定した。各ビーズの 3つのデー夕点を平均し、そしてビーズ数に対してプロットした。

上記の手順により 75 1 〇ウエルからの蛍光強度を定量した結果を図 9に示す。

[0116] 図 9のドットプロットに示されるように、蛍光強度は有意に変動しており、ペプチドの可変の MK錯形成活性を示している。ライソシン E構造を有する化合物 30が、 1 026 ±64 a. u. (スキーム 2) の強度を示したため、本発明者らは、＞1 000 a. u. の強度を示す 24 1個のビーズをヒットビーズとして定義した (図 9のチヤートの上部の囲み内) 。こうして、その後の実験のために、ビーズ全体のおよそ上位 3 %が選択された。

[0117] (2) ライソシン E類似体の構造決定

次に、 24 1個のビーズ結合べプチドの構造を決定した。構造決定は以下の手順に則り行った。

[0118] (a) ビーズ由来ペプチドの分離

(a- 1 ) 開裂反応用ビーズの調製

メナキノン錯化アッセイの後、ビーズを次のように切断反応のために洗浄〇 2020/175451 44 卩（：170? 2020 /007391

した。

マイクロピペットを用いて、 96ウエル〇[¾プレート（1 ビーズ /ウエル）中のビーズを、 Me OH （5〇し/ビーズ）を含む濾過プレート（1 ビーズ /ウエル）に移した。各ウエルに口1\/13〇（400 し）を加え、ビ —ズを重力流（ 3）でろ過した。各ウエルに M_e〇H （400 し）を加え、ビーズを重力流（ 2）で濾過した。プレート中のビーズを真空下で 1 時間乾燥した。乾燥したビーズを、マイクロピペットを用いて、 IV! ₆〇 1^~1 （ 20 !-/ビーズ）を含む 96ウエル〇[¾プレート（1 ビーズ /ウエル）に移した。懸濁液を 40°〇の八「流下で乾燥して乾燥ビーズを得、これを切断反応に使用した。

[0119] （3 _ 2）ビーズからのペプチドの開裂

96ウエル〇[¾プレート（1 ビーズ/ウエル）中の上記洗浄ビーズ結合ペプチドに、

（2〇し/ウエル）を加えた。マイクロプレートに、簡易リランプ（八3 〇巳、 31_ 11 ー6、 6\^/）を用いて、 1 5分毎にランプ位置を 2本ずつずらして室温で合計 1時間 II V光（ス = 365 n を照射した（図 1 0）。得られた溶液を 40°〇の八「流下で濃縮して、粗ライソシン巳類似体（1ペプチド/ウエル）を得た。

[0120] （3-3）抗菌活性アッセイおよび

シーケンス分析のためのぺプチドの分離

96ウエル〇プレートの粗ペプチドに IV! 6〇 1^~1 （ 1 00 !_/ウエル）を加えた。プレートに 8連キャップを装着し、室温で 1分間音波処理した。プレート中の得られた混合物を 3500 ₉、室温で 1 0秒間遠心した。

8連キャップをプレートから注意深く取り除いた。溶液を穏やかにピぺッティングした後（ 3）、 IV! 6〇 1^~1中の粗ペプチドの溶液（85 し/ウエル）を 96ウエル丸底プレート（3367、〇〇「！·！ 1 1^ 9）に移した。丸底プレート中の溶液（85 1-/ウエル）を 40°〇の八「流中で乾燥させて粗ペプチドを得、これを抗菌活性アッセイに使用した。〇[¾プレートに残つた溶液（25 し/ウエル）を 40°〇の八「気流下で乾燥し、粗ペプチドを〇 2020/175451 45 卩（：170? 2020 /007391

得て、これを IV!

3シークエンシング分析に使用した。

[0121] （匕）

シーケンス解析

96ウエル〇プレートの粗ぺプチドに、 1 % 1^~1₃を含む IV! 60 H/H 2〇（1 /9、 20 !-/ウエル）を加えた。混合物を室温で 1 2〜 1 4時間インキユベートした。反応混合物を 40°〇の八「流下で濃縮して、加水分解した直鎖状べプチドを得た。

粗製直鎖状ペプチドを、〇. 1 %丁八（2. 5 1-/ウエル、 4. 〇

9 / m L）を含有する 1\/16〇1\1/1^~1₂〇（7/3）中のシアノー4 -ヒドロキシケイ皮酸の溶液およびクエン酸水素ニアンモニウム溶液に溶解した。 1^~1₂〇中（〇. 0025 !-/ウエル、

得られたぺプチド溶液を丁〇 /丁〇 5800 （八巳 3〇 I 6 X）上で IV! 3 /IV! 3配列決定分析にかけた。

[0122] 24 1個のペプチドのうち、 237個が明確な断片化バターン（図 1 1）を与え、それらの構造を明確に確立することを可能にした（図 1 2〜 1 4の各表を参照）。その結果、それらは 1 66の異なる構造を持つことが分かった。重要なことに、 1 66の化合物のうちの 1つが化合物 1 （ライソシン巳）であることが判明し、何千ものペプチドの混合物から活性分子を選択するための 2—錯形成アッセイの信頼性が実証された。

[0123] （3）ライソシン巳類似体の抗菌アッセイ

最後に、メナキノン錯化アッセイにおいて 1 66個の陽性化合物を用いて溶液中抗菌アッセイを行った。そして、単ービーズ由来のペプチドの残り 8 5%を 1 0%巳〇3添加培地

と別々にインキユベー卜した。抗菌アッセイは以下の手順により行った。

[0124] （₃）抗菌活性測定用ビーズの調製

96ウエル〇[¾プレート（1 ビーズ/ウエル）中のビーズを、マイクロピペットを用いて

（50 ^Ji L）を含むろ過プレート（1 ビーズ /ウエル）に移した。ウエルに口1\/13〇（400 !-/ウエル）を加え、ビーズを重力流（ 3）で濾過した。ウエルに（400 !_/ウエル）を〇 2020/175451 46 卩（：170? 2020 /007391

加え、ビーズを重力流（ 2）で濾過した。プレート中のビーズを真空下で 1時間乾燥した。乾燥したビーズを、マイクロピペットを用いて、 IV! ₆〇 1^~1 （20 !-/ビーズ）を含む 96ウェル〇[¾プレート（1 ビーズ /ウェル）に移した。懸濁液を 40°〇の八「流下で乾燥して乾燥ビーズを得、これを切断反応に使用した。

[0125] b）抗菌活性測定のためのサンプル分離

96ウェル〇プレートの粗ペプチドに IV! 6〇 1^~1 （ 1 00 !_/ウェル）を加えた。プレートに 8連キャップを装着し、そして室温で 1分間音波処理した。プレート中の得られた混合物を 3500 X 9、室温で 1 0秒間遠心した。 8連キャップをプレートから注意深く取り除いた。溶液を穏やかにピペッティングした後（ 3）、 IV! 6〇 1^~1中の粗ペプチドの溶液（85 !-/ ウェル）を 96ウェル丸底プレートに移した。丸底プレート中の溶液を 40 °〇の八「流下で乾燥させて粗ペプチドを得た。プレート中の粗ペプチドに 0 1\/13〇（1 1-/ウェル）を加えた。プレートを抗微生物活性アッセイにかけた。

[0126] （〇）抗菌活性アッセイ

（1 し /ウェル）中のペプチドの溶液に、陽イオン調整ミュラ —ヒントンブロスを含有する 1 0%ウシ血清中の黄色ブドウ球菌丁〇〇 1 3709株の懸濁液 [4〇 !-/ウェル、 2 1 0⁵コロニー形成単位（ 40 !_ /ウェル）を添加した。〇 11）、 2 1 ₉/1_ミュラーヒントンブロス（0 1 干〇〇）、 50〇1₉/1_ 03² + （0 aC ₂ 21^~1₂〇で調整）、および 25〇1₉/1_

（1\/1₉〇丨 ₂ · 61^~1₂〇で調整） ] 。プレートを

37^°〇で1 8時間インキュベートし、ブロスの濁度を調べた。

[0127] その結果、化合物 1 を含む 26の化合物は IV! 33八 1の増殖を完全に抑制した（図 1 2〜図 1 4）。 2つのアッセイで同定された 25個の人エペプチドを八 1 ~八25 （八群）と命名した。

[0128] 本発明のスクリーニング方法の〇巳〇（3戦略を検証し、詳細な生物学的活性を評価するために、八 1〜八 25を大規模に再合成することにした。さら〇 2020/175451 47 卩（：170? 2020 /007391

に、第一のアツセイで陽性でありそして第二のアツセイで陰性であった、巳 1 5および〇 1 ~〇 5の 1 0個のぺプチドを大規模合成のために選択した。具体的には、巳 1 ~巳 5 （グループ巳）は 2 -錯形成アツセイにおける上位 5つの化合物に対応し、〇 1 ~〇5 （グループ〇）は残りの 1 35の化合物から無作為に抽出した。

[0129] [実施例 3]

35種の人工類似体の合成

化合物 1の 35種の人工類似体

巳 1 ~巳 5、および〇 1 〜〇5）は、化合物 1の合成経路に従って数ミリグラム規模で、別々に合成した。原材料は、 24段階で全体的収率の 1. 8〜 1 2%で八 1 ~八 25、巳 1 ~巳 5、および〇 1 ~〇 5を生成するために、

により精製した（表 1および図 32〜34）。一貫した全体的収率（5. 6 ±2. 9%）での 35個の構造的に複雑な類似体の全合成は、全固相合成経路の頑健性および一般性を裏付けた。各化合物の合成手順について以下に記載する。

[0130] ペプチド八 1 ~八25、

及び〇 1 ~〇 5をペプチド合成機で調製した。基本的操作手順は以下の通りである。

工程 1 :固体支持体

（1 /4、室温、 1 〇分）で脱保護した。

1_ 13〇

L \ b V a 7 u b _& （50 〇 1未満の 31用） ] 内の樹脂を IV!

[5〇11_ （50 〇丨以上の 31用）または 2〇11_ （50 〇丨未満の 31用）、 40秒 6] にて洗浄した。

工程 3 :バイアル中のアミノ酸（4. 0当量）を、 1\/1?中の〇一（7 -アザべンゾトリアゾールー 1 —イル）一 1\1、 1\1、 1\1，、 1\1，ーテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフエート（1^~1八丁11、 4. 0当量、〇. 451\/1 ） /1 -ヒドロキシー7 -アザべンゾトリアゾール（1^~1〇八 1:、 4. 0当量、〇. 45 IV!）の溶液によって活性化した。〇 2020/175451 48 卩（：170? 2020 /007391

活性化アミノ酸の溶液に、 1\/1?中の丨一? 「₂ 巳 1: （8. 0当量、 2. 〇1\/〇の溶液を加えた。得られた混合物を反応容器に移した。このバイアルを 31の 3 〇 1用に 1\/1? （0. 0072

で洗浄した。当該溶液を反応容器に移した。

工程 4 :活性化アミノ酸を樹脂上のぺプチドとカップリングさせ（ 40 °〇、

200 ； 20分）、樹脂を含有する反応容器を IV! ［5 1_ （50 〇 I以上の 31用）または

（50 〇丨未満の 31用）、 40秒 X

6］にて洗浄した。

工程 1〜 4を繰り返し、アミノ酸を固体支持体上に縮合させた。

［0131］ペプチド八 1〜八25、巳 1〜巳 5及び〇 1〜〇 5の合成

プレロード樹脂〇 -〇 1 リ（Wa n ₉樹脂）一〇アリル（31

、 3 01〇 1）は、 1\1〇 313 1 〇〇 11601から購入した。反応容器中の樹月旨 31 ［20〇11_の

（50以上の 3）または

\ b V a T u b _& （50未満の 3）］を、〇1^~1₂〇 1 ₂ ［5 1_ （50以上の a）または

（50未満の 3）、 40秒 3］および 1\/1? ［5 1_ （

50以上の 3）または

（50未満の 3）、 40秒 6］で洗浄した。樹脂を 6サイクル（6、乂2、 5、 4、 X I、および 6）のマイクロ波支援 3 3プロトコルに供してペプチド 32を得た。ここで、乂2は化合物 1 1、 1 2、 1 7、 22、 23、および 25のうちの 1つであり、 X 1は化合物 1 1、 1 5、 1 7、 1 9、 22、 23、および 25のうちの 1つである。樹脂結合ペプチド 32をマイクロ波支援 3 3プロトコルで処理した（ 9のカップリングは室温で 40分間行った）。反応混合物を 1\/1?/〇1^~1₂〇 I ₂ ［1 /9、 5〇11_ （50以上の 3）または

（50未満の 3）、 40 秒 6］で洗浄してペプチド 33を得た。

［0132］バイアル中の 1 0 （8. 0当量）に、 1\/1?/〇1^~1₂〇 I ₂ （1 /9）中の

1\1、 1\1’ ージイソプロピルカルボジイミド（8. 0当量、〇. 571\/〇の溶液を加えた。得られた混合物を反応容器［20 !_

50以上の 8）または 5〇11_ 1_ 1 13 「 3丁リ 66 （50未満の 8）］内の〇 2020/175451 49 卩（：170? 2020 /007391 樹脂結合ペプチド 33に移した。バイアルを 1\/1?/〇1^~1₂〇丨 ₂ （1 /9、

〇. 0047 1 1_）で洗浄した。得られた溶液を反応容器に移した。反応混合物を室温で 5分間撹拌し、次いで

（1 /9）中の 4 - （1\1、 1\1 -ジメチルアミノ）ピリジン（1. 0当量、〇. 821\/〇の溶液を加えた。室温で 2時間撹拌した後、得られた混合物を 1\/1?/〇1^~1₂〇 I 2 ［1 /9、 5 !_ （50以上の 3）または

（50未満の 3）、 40秒 6］で洗浄した。このカップリング反応を繰り返した（2度）。反応混合

［0133］樹脂結合ペプチド 34をマイクロ波支援

トコル（乂3は化合物 1 1、 1 4、 1 7、 1 9、 23及び 25のうちの 1つ、乂4は化合物 1 3 、 1 6、 1 8、 20、 2 1、 24、および 26のうちの 1つ）の 3サイクル（乂4、 8、および乂3）にかけた。上記のマイクロ波支援 3 3プロトコルのステップ 1および 2によって、

〇〇基を除去した。反応混合物を〇 1^~1₂〇丨 ₂

（50の以上の 3）または

（50未満の 3）

、 40秒 6］で洗浄してペプチド 35を得た。

以上の 3）または

結合べプチド 35に、〇 1^~1₂〇 1 ₂中の（9 9 ^ ₃） ₄ （〇. 25当量、〇. 01 31\/〇およびモルホリン（24当量、 2. 6 IV!）の溶液を添加した。

室温で 30分間撹拌した後、反応混合物を

［5 1_ （50以上の 3）または

（50未満の 3）、 40秒 6］、 1\/1? ［5〇11_ （5

0以上の 3）または

（50未満の 3）、 40秒 6）および 1\/1?/

〇1^~1₂〇丨 ₂ ［1 /9、 5 1_ （50以上の 3）または 2 1_ （50未満の 3 ）、 40秒 6］で洗浄し、ペプチド 36を得た。

反応容器中の樹脂結合べプチド 36 ［20 1_

0以上の 3）または 5011_ 1_ 1 13 「 3丁リ 66 （50未満の 3）］に、〇 2020/175451 50 卩（：170? 2020 /007391

1\/1 ?/〇 1^~1₂〇 1 ₂ （ 1 /9）および 2, 4, 6 -コリジン（ 1 0当量）中の ? ₇巳〇溶液を加えた。室温で 1 1 時間撹拌した後、反応混合物を

I ₂ （50以上の 3）または

（50未満の 3）、 40秒 X 6］

、 1\/1 ? ［5 1_ （5以上の 3）または

（50未満の 3、 40秒 6

）（50以上の 3）または

（50未満の

真空乾燥して、ペプチド 37を得た。 20〇!

1_の 1_ 丨匕 r a T u b㊀中の樹脂結合べプチド 37について、樹脂結合ぺプ

（ 1 9/ 1、 2. 0 !_）を加えた。室温で 1 時間撹拌した後、反応混合物を濾過し、そして丁八/1^~1₂〇（ 1 9/ 1、 1 0 !_、 40^X 6）で洗浄した。合わせた濾液を 2時間撹拌した。得られた混合物を濃縮して粗ぺプチドを得た。粗ペプチドに巳 1₂〇（ 1 〇〇 !_）を加えた。得られた混合物を室温で 1分間超音波処理し、そして有機層を除去した。同じ手順を繰り返した（2度）。残渣を真空乾燥して粗ペプチドを得た。

粗ペプチドを、〇. 05 %丁八を含有し、〇. 05%丁八/1^~1₂〇を含有する

に溶解した［25/7 5、 8. 0 !_ （50以上の 3の各バッチに対して）または 5. O m L （50未満の 3に対して）］。溶液を I

6 「 36 3 I I 111 （3 1 8—巳［840〇19 （50以上のの各バッチについて）または

（50未満の 3について）］に充填した。力ラムは、〇. 05%丁八［25/7 5、 8. O m L （50以上の 3の各バッチに対して）または 5. O m L （50未満の 3に対して）］を含有し、 0 . 05%丁 /1^~1₂〇を含有する

で洗浄し、不純物を除去した。粗ペプチドは、〇 05%丁八［60/40、 1 6〇11_ （50以上の 3の各バッチについて）または 1 0〇11_ （50未満の 3について）］を含有し、 0 . 05%丁 /1^~1₂〇を含有する

で溶出し、そして凍結乾燥した。残渣を逆相 1^~1 1_（3により精製して、化合物 1 （ライソシン巳）類似体を得た。〇 2020/175451 51 卩（：170? 2020 /007391

[0135] （合成実施例 1）

ペプチド八 1の合成

リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、充填速度： 0 . 45 〇 1 /₉）を、 X I として化合物 25、乂2として化合物 1 2、乂3として化合物 1 3、および X 4として化合物 1 4を用いて上記の一般的手順に供した。

粗製八 1 を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 20X2500101 、溶離液： IV! 6〇 1^~1 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05%丁八、直線勾配 /巳= 50分間かけて 60/40から 85/1 5、流速： 5. 0mL /分、検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 20X2500101、溶離液八： 1\/16〇 + 0. 05%丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%丁八、直線勾配八/巳 = 30分間かけて 37. 5/62. 5から 45/55、次いで 1 0分かけて 45/55、流速： 5. 0 !_/分、検出： II V 280 n〇〇により精製し、八 1 （I ^ 29. 6〜 3 1. 4分、 1 8. 7〇1₉、 1 0. 9 〇 1、 25工程で 1 0 %） : 白色の固体； [«] 0 = + 22. 2° （〇 =〇. 800、 1\/16〇1^~1）

得た。

[0136] （合成実施例 2）

ぺプチド八 2の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇 1 /₉）を、 X I として化合物 25、乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 1 6、および X 4として化合物 1 4を使用して、上記の一般手順に供した。〇 2020/175451 52 卩（：170? 2020 /007391

粗製八 2を第 1逆相 1^~1 1_〇（カラム：不活性〇 8-3 20X25001 、溶離液： IV! 6〇 1^~1 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05% 丁、直線勾配 /巳= 50分間かけて 60/40から 85/1 5、流速 : 5. 0rr\L /分、検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 !_〇（力ラム：不活性〇 8-3 20X2500101、溶離液八： 1\/16〇 + 0. 05

%丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%丁八、直線勾配八/巳 = 30分間かけて 37. 5/62. 5から 45/55、次いで 1 0分かけて 45/55 、流速 = 5. 0 !_/分、検出： II V 280 n ）により精製し、八 2 （ 1 ^ = 35. 7〜 37. 1分、 1 2. 4〇1₉、 7. 37 〇 1、 25工程で 6 . 9%） : 白色の固体； [«] ₀ ²³二 +26. 2° （〇 = 0. 427、 1\/16〇 1^~1） ;

（フイルム） V I 1 39、 1 203、 1 454、 1 540、 1 6 27、 1 678、 2338、 2360、 2959、 3276、 3625、 3

〇₁₈ [1\/1+1^~1] ⁺ 1 572. 8897の計算値 1^~1 IV! 3 （巳 3 I）、実測値 1 572. 8927を得た。

[0137] （合成実施例 3）

ぺプチド八 3の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇丨 /₉）を、 X I として化合物 1 9、乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 1 6、および X 4として化合物 1 4を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製八 3を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 20X25001 、溶離液： IV! 6〇 1^~1 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05% 丁、直線勾配 /巳= 50分間かけて 60/40から 85/1 5、流速 : 5. Orr\L /分、検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 !_〇（力ラム：不活性〇 8-3 20X2500101、溶離液八： 1\/16〇 + 0. 05

%丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇 + 0. 05%丁八、八/巳 = 50分間かけ〇 2020/175451 53 卩（：170? 2020 /007391

て 37. 5/62. 5、流速 = 5. 0 !_/分、検出： II V 280 n〇〇により精製し、八3 （1^=27. 6〜 29. 9分、 1 3. 8019、 7. 43 〇1〇 1、 25工程で 6. 9%） : 白色の固体； [«] ⁴ = + 25. 0°

= 0. 447、 1\/16〇1^~1） ;

（フイルム） V I 1 4 1、 1 200、 1 4

65、 1 5 1 5、 1 629、 1 677、 1 740、 2305、 3274、 3

〇₁₈ [1\/1+1^~1] ⁺ 1 629. 9475計算値 1^~1 IV! 3 （巳 3 I）、実測値 1

629. 9477を得た。

[0138] （合成実施例 4）

ぺプチド八 4の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 746 〇 1 /₉）を、 X I として化合物 1 5、乂2として化合物 1 2、乂3として化合物 20、および X 4として化合物 1 4を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製八 4を、第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 03-4 1 0X25

0〇1〇1、溶離液： 1\/16〇 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 0 5%丁八、直線勾配八/巳= 25分間かけて 35/65から 50/50次いで 5分かけて 50 / 50まで、流速： 3. OmL /分、検出： II V 280 门〇〇および第 2逆相 1^~1 1_〇（カラム：

003-4 1 0 X 2500101、溶出液八： 1\/16〇1^~1 + 0. 05%丁八、溶離液巳： 1^~1₂ 0 + 0. 05%丁八、直線勾配八/巳= 40分間かけて 70/30から 9 0/1 0、流速： 2. 0 !_/分、検出： UV220 n m）により精製し、八4 （1 ^ 1 4. 1 - 1 6. 0分、 1. 22m g_^ 〇. 705 〇 1、 2 5工程で 4. 1 %） : 白色の固体；〇₇₇1^~1₁₂₃!^₂₀〇₁₈

+ 1 6 1 5

. 93 1 9の計算値 !! [¾ IV! 3 （巳 3 I）、実測値 1 6 1 5. 9277を得た

[0139] （合成実施例 5）〇 2020/175451 54 卩（：170? 2020 /007391

ペプチド八 5の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇丨 /₉）を、 X I として化合物 1 1、乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 1 6、および X 4として化合物 1 4を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製八 5を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、溶離液： IV! 60 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05% 丁八、直線勾配八/巳 = 50分間かけて 25/75から 50/50まで、流速 = 3. 0 !_/分、検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 P LC （カラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： IV! 6〇 1^~1 + 0. 0

5%7 F A_s 溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%7 F A_s 直線勾配八/巳 = 60分間かけて 45/55から 75/25、流速 = 3. 0 !_/分、検出： II V 2 80门〇〇により精製し、八5 （1^=55. 5〜 56. 8分、〇. 684 9、〇. 402 〇丨、 25工程で 1. 8%） : 白色の固体；〇 ₇₅1^~1 _{] ] 8} ₁₉〇₁₉ [1\/1+1^~1] + 1 588. 8846の計算値 1^~1 IV! 3 （巳 3 I）、実測値 1 588. 8895を得た。

[0140] （合成実施例 6）

ぺプチド八 6の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇丨 /₉）を、 X I として化合物 1 5を、乂2として化合物 1 2、乂3として化合物 1 3、および X 4として化合物 1 4を用いて上記の一般的手順に供した。

粗製八 6を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、溶離液： IV! 60 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05% 丁、直線勾配 /巳= 50分間かけて 25/75から 50/50、流速 : 3. 0 !_/分、検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 P LC （カラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： 1\/16〇1^~1 + 0. 05% 丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%7 F A_s 直線勾配八/巳 = 60分間か〇 2020/175451 55 卩（：170? 2020 /007391

けて 45/55から 75/25、流速 = 3. 0 !_/分、検出： II V 280 门〇〇により精製し、八6 （1 ^54. 3〜 55. 8分、 3. 7 1 ₉、 2 . 1 3 〇丨、 25工程で 9. 8%） : 白色の固体；〇₇₇1^~1₁₂₁1\1₂₀〇₁₉ [1\/1+1^~1] + 1 629. 9 1 1 1の計算値 1^~1 IV! 3 （巳 3 I）、実測値 1 62 9. 9 1 1 1 を得た。

[0141] （合成実施例 7）

ぺプチド八 7の合成

リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇丨 /₉）を、 X I として化合物 23、乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 20、および乂4として化合物 1 4を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製八 7を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、溶離液： IV! 60 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05% 丁、直線勾配 /巳= 50分間かけて 25/75から 50/50、流速 : 3. 0 !_/分、検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 P LC （カラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： 1\/16〇1^~1 + 0. 05% 丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%7 F A_s 直線勾配八/巳 = 60分間かけて 45/55から 75/25、流速 = 3. 0 !_/分、検出： II V 280 门〇〇により精製し、八 7 （1^=5 1. 〇〜 52. 8分、 3. 53 ₉、 1 . 85 〇丨、 25工程で 8. 8%） : 白色の固体；〇₈₁1^~1₁₂₃1\1₂₀〇₁₉ [1\/1+1^~1] + 1 679. 9268の計算値 1^~1 IV! 3 （巳 3 I）、実測値 1 67 9. 9276を得た。

[0142] （合成実施例 8）

ぺプチド八 8の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇丨 /₉）を、 X I として化合物 23、乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 1 3、および X 4として化合物 1 4を使用して上記の一般手川頁に供した。〇 2020/175451 56 卩（：170? 2020 /007391

粗製八 8を第一逆相 l·\ P LC （カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、溶離液： IV! 60 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05% 丁、直線勾配 /巳= 48分間かけて 25/75から 49/5 1、流速 : 3. 0 !_/分、検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 P LC （カラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： 1\/16〇1^~1 + 0. 05% 丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05%丁八、 60分かけて直線勾配八/巳 = 60分間かけて 45/55から 75/25、流速： 3. 0 1_/分、検出 : 11 280门〇〇により精製し、八8 （1^=55. 7〜 57. 1分、 2. 27〇19、 1. 26 111〇 1、 25工程で 5. 6 %） : 白色の固体；〇 ₈〗 1^~1 _! ₂₁1\1₂₀0₂₀

+ 1 693. 906 1の計算値

（巳 3 I）、実測値 1 693. 9086を得た。

[0143] （合成実施例 9）

ぺプチド八 9の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 746 〇 1 /₉）を、 X I として化合物 23、乂2として化合物 1 2、乂3として化合物 1 6、および X 4として化合物 1 4を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製八9を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性 003-4 4. 6X25

0〇1〇1、溶離液： 1\/16〇 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 0 5%丁八、直線勾配八/巳= 20分間かけて 35/65から 50/50、次いで 1 5分間かけて 50/50、流速： 1. 0 !_/分、検出： II V 28

0门〇〇および第 2逆相 1^~1 1_〇（カラム：

003-4 1 0 X 2500101、溶出液八： 1\/16〇1^~1 + 0. 05%丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%7 F A_s 直線勾配八/巳= 40分間かけて 70/30から 90/1 0、流速： 2. 0 !_/分、検出： □ V220 n〇!）により精製し、八9 （t _R= 1 7. 4〜 2〇. 1分、 1. 25 019、〇. 703 〇 1

、 25工程で 3. 8%） : 白色の固体；〇₈₁1^~1₁₂₂1\1₁₉〇₁₉ [1\/1+1^~1] + 1 6 64. 9 1 59の計算値 !! [¾ IV! 3 （巳 3 I）、実測値 1 664. 9207を〇 2020/175451 57 卩（：170? 2020 /007391

得た。

[0144] （合成実施例 1 0）

ペプチド八 1 0の合成

リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（3 1、負荷率：〇. 746 〇 1 /₉）を、 X I として化合物 22、乂 2として化合物 1 2、乂3として化合物 1 3、および乂4として化合物 1 4を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製八 1 0を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性 003-4 4. 6 X 2 溶離液： 1\/16〇 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇 + 0.

05%丁八、直線勾配八/巳= 20分間かけて 35/65から 50/50 、次いで 1 5分かけて 50/50まで、流速 = 1 . 0 !_/分、検出： II V

280门〇〇および第 2逆相 1^~1 1_〇（カラム：

003 -4 1 0 X 250〇1〇1、溶出液八： 1\/16〇 1^~1 + 0. 05%丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%7 F A_s 直線勾配八/巳 = 40分間かけて 70/30 から 90/ 1 0、流速： 2. 0〇! !_/分、

により精製し、八 1 0 （t _R= 1 5. 6〜 1 8. 3分、 1 . 1 8〇1₉、〇. 67 1 〇1 〇 1、 25工程で 3. 7%） : 白色の固体；〇₇₆1^~1 _{] 18}1\1₂₁〇 ₂〇

+

1 644. 885 7の計算値 1^~1 IV! 3 （巳 3 丨）、実測値 1 644. 887 1 を得た。

[0145] （合成実施例 1 1 ）

ぺプチド八 1 1 の合成

〇1〇〇 - 1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（3 1、負荷率：〇. 45 〇丨 /₉）を、 X I として化合物 1 5、乂 2として化合物 1 2、 X 3として化合物 24、および乂4として化合物 1 4を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製八 1 1 を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0 X 250 〇1〇1、溶離液： 1\/16〇 1^~1 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05 %丁八、直線勾配八/巳 = 50分間かけて 55/45から 80/20、流〇 2020/175451 58 卩（：170? 2020 /007391

速： 3. 0 !_/分、検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 1_〇（力ラム：不活性〇 8-3 1 0X25001〇1、溶離液八： 1\/16〇1^~1/1\/16〇

（2/1） +0. 05%丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%丁八、直線勾配八/巳 = 50分間かけて 40/60〜 75/25、流速： 3. OmLX 分、検出： 11 280门〇〇により精製し、八 1 1 （1 ^27. 3〜 28.

0分、 3. 35019、 1. 88 111〇 1、 25工程で 8. 3 %） : 白色の固体；〇₈₁1^~1₁₂₂1\1₁₉〇₁₉

+ 1 664. 9 1 59の計算値

（巳 3 I）、実測値 1 664. 9 1 45を得た。

[0146] （合成実施例 1 2）

ペプチド八 1 2の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 746 〇 1 /₉）を、 X I として化合物 1 5、乂2として化合物 1 2、乂3として化合物 2 1および X 4として化合物 1 4を用いて上記の一般手順に供した。

粗製八 1 2を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 03-4 1 0X25

0〇1〇1、溶離液： 1\/16〇 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 0 5%丁八、直線勾配八/巳= 25分間かけて 35/65から 50/50、次いで 30分かけて 50/50、流速： 3. 0〇!!_/分、検出： □ V 280 门〇〇および第 2逆相 1^~1 1_〇（カラム：

003-4 1 0 X 2500101、溶離液： 1\/16〇1^~1 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂ 0 + 0. 05%丁八、直線勾配八/巳= 30分間かけて 70/30から 8 5/1 5、流速： 2. 0 !_/分、検出： UV220 n m）により精製し、八 1 2 （1 ^ 1 7. 4〜 1 8. 9分、〇. 944〇1₉、〇. 554 〇 1 、 25工程で 3. 4%） : 白色の固体；〇₇₅1^~1_{1 18}1\1₁₉〇₁₉ [1^+（·!] + 1 5 88. 8846の計算値

（巳 3 丨）、実測値 1 588. 8873を得た。

[0147] （合成実施例 1 3）

ペプチド八 1 3の合成〇 2020/175451 59 卩（：170? 2020 /007391

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇 1 /₉）を、 X I として化合物 22、乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 1 6および X 4として化合物 1 4を用いて上記の一般的手順に供した。

粗製八 1 3を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X250 〇1〇1、溶離液： 1\/16〇1^~1 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05 %丁八、直線勾配八/巳 = 50分間かけて 55/45から 80/20、流速： 3. 0 !_/分、検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 1_〇（力ラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： 1\/16〇 + 0. 05 %丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%丁八、直線勾配八/巳 = 40分間かけて 30/70から 50/50、流速： 3. 0 1_/分、検出： □ V 28 0门〇〇により精製し、八 1 3 （1^=32. 9〜 33. 9分、 2. 55 9、 1. 47 〇1〇 1、 25工程で 6. 1 %） : 白色の固体；

₀〇₁₉ [1\/1+1^~1] + 1 6 1 5. 8955の計算値

（巳 3 I）、実測値 1 6 1 5. 8967を得た。

[0148] （合成実施例 1 4）

ペプチド八 1 4の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 746 〇 1 /₉）を、 X I として化合物 22、乂2として化合物 1 2、乂3として化合物 20、および X 4として化合物 1 4を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製八 1 4を第 1逆相 1^~1 !_〇カラム（不活性〇 03-4 1 0X250

〇1〇1、溶離液： 1\/16〇 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05 %丁八、直線勾配八/巳 = 25分間かけて 35/65から 50/50、次いで 30分かけて 50/50、流速 = 3. 0 !_/分、検出： II V 280 n

003-4 1

、溶離液巳： 1^~1₂〇 + 0. 05%丁八、直線勾配八/巳= 1 8分間かけて 70/30から 79 〇 2020/175451 60 卩（：170? 2020 /007391

/2 1、流速： 2. 0 !_/分、検出： UV220 n m）により精製し、八 1 4 （1：［^= 1 3· 2〜 1 4. 9分、 0 939〇19、〇. 538 111〇 1、

25工程で 3. 6%） : 白色の固体；〇₇₆!^~1₁₂〇 ₂₁〇₁₉

+ 1 63

〇. 9064の計算値

（巳 3 I）、実測値 1 63〇. 9 1 1 2を得た。

［0149］（合成実施例 1 5）

ペプチド八 1 5の合成

リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 746 〇 1 /₉）を、 X I として化合物 25、乂2として化合物 1 2、乂3として化合物 24、および X 4として化合物 23を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製八 1 5を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 03-4 1 0X25 0〇1〇1、溶離液： 1\/16〇 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 0 5%丁八、直線勾配八/巳= 20分間かけて 35/65から 50/50、次いで 1 0分かけて 50 / 50まで、流速： 3. OmL /分、検出： II V 2 80门〇〇および第 2逆相 1^~1 1_〇（カラム：

003- 4

溶出液八）： 1\/16〇1^~1 + 0. 05%丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%7 F A_s 直線勾配八/巳 = 30分間かけて 70/30 から 85/1 5、流速： 2. 0〇!!_/分、検出：

により精製し、八 1 5 （1 ^ 1 1. 〇〜 1 2. 8分、 1. 54〇1₉、〇. 855 〇1 〇 1、 25工程で 5. 8%） : 白色の固体；〇₈₂1^~1_{1 16}1\1₁₉〇 ₂〇

+

1 686. 8639の計算値 1^~1 IV! 3 （巳 3 I）、実測値 1 686. 866 2を得た。

［0150］（合成実施例 1 6）

ペプチド八 1 6の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 746 〇 1 /₉）を、 X I として化合物 1 7、乂2として化合物 1 2、乂3として化合物 20、および X 4として化合物 1 4を使用して、上記の一〇 2020/175451 61 卩（：170? 2020 /007391

般手順に供した。

粗製八 1 6を第 1逆相 1^~1 1_〇（カラム：不活性〇 03-4 1 0X25 0〇1〇1、溶離液： 1\/16〇 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 0 5%丁八、直線勾配八/巳= 25分間かけて 35/65から 50/50、次いで 5分かけて 50 / 50まで、流速： 3. 0mL /分、検出： II V 28 0门〇〇および第 2逆相 1^~1 1_〇（カラム：

003-4 1 0 X 2500101、溶出液八： 1\/16〇1^~1 + 0. 05%丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05%7 F A_s 直線勾配八/巳= 30分間かけて 70/30から 85/1 5、流速： 2. 0 !_/分、検出： □ V220 n〇!）により精製し、八 1 6 （1： _[^= 1 3· 2〜 1 5. 5分、 1. 58〇19、〇. 905 111〇 1 、 25工程で 5. 9%） : 白色の固体；〇₇₆1^~1_{1 19}1\1₂₀〇₂〇

+ 1 6

3 1. 8904の計算値

（巳 3 丨）、実測値 1 63 1. 8889を得た。

[0151] （合成実施例 1 7）

ペプチド八 1 7の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇丨 /₉）を、 X I として化合物 1 7、乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 24、および乂4として化合物 1 4を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製八 1 7を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X250 〇1〇1、溶離液： 1\/16〇1^~1 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05 %丁八、直線勾配八/巳 = 50分間かけて 55/45から 80/20、流速： 3. 0 !_/分、検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 1_〇（力ラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： 1\/16〇 + 0. 05

%丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%丁八、直線勾配八/巳 = 50分間かけて 30/70から 55/45、流速： 3. 0 1_/分、検出： □ V 28 0门〇〇により精製し、八 1 7 （1 ^34. 1〜 35. 2分、 3.

、 1. 86 〇丨、 25工程で 9. 3%） : 白色の固体；〇 2020/175451 62 卩（：170? 2020 /007391

〇₂₁ [1\/1+1^~1] + 1 680. 8744の計算値

（巳 3 I）、実測値 1 680. 8766を得た。

[0152] （合成実施例 1 8）

ペプチド八 1 8の合成

リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 746 〇 1 /₉）を、 X I として化合物 1 7、乂2として化合物 1 2、乂3として化合物 1 6、および X 4として化合物 1 4を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製八 1 8を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性 003-4 4. 6X2 溶離液： 1\/16〇 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇 + 0.

05%丁八、直線勾配八/巳= 20分間かけて 35/65から 50/50 、次いで 1 5分かけて 50/50まで、流速 = 1. 0 !_/分、検出： II V

280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 P LC （カラム：不活性 003 -4 1 0 X

溶離液： 1\/16〇1^~1 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇 + 0 . 05%丁八、直線勾配八/巳= 35分間かけて 70/30から 87. 5 /1 2. 5、流速： 2. 0 !_/分、検出： II 220 n ）により精製し

、八 1 8 （t _R=23. 2〜 25. 3分、〇. 82 1 〇1₉、〇. 474 〇 I、 25工程で 2. 6%） : 白色の固体；〇₇₆1^~1_{1 18}1\1₁₉〇₂〇

+ 1

6 1 6. 8795の計算値 1^~1 IV! 3 （巳 3 I）、実測値 1 6 1 6. 881 1 を得た。

[0153] （合成実施例 1 9）

ペプチド八 1 9の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇丨 /₉）を、 X I として化合物 1 7、乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 2 1、および X 4として化合物 1 4を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製八 1 9を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X250 〇1〇1、溶離液： 1\/16〇 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05 〇 2020/175451 63 卩（：170? 2020 /007391

%丁八、直線勾配八/巳 = 50分間かけて 30/70から 55/45、流速： 3. 0 !_/分、検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 1_〇（力ラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： 1\/16〇1^~1 + 0. 05 %丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%丁八、直線勾配八/巳 = 35分間かけて 60/40から 80/20、流速： 3. 0 1_/分、検出： □ V 28 0门〇〇により精製し、八 1 9 （1^=20. 3〜 2 1. 6分、 2. 04 ₉ 、 1. 27 〇丨、 25工程で 5. 1 %） : 白色の固体；〇₇₄1^~1 _{] 14}1\1₁₉ 〇₂₁ [1\/1+1^~1] ⁺ 1 604. 843 1の計算値

（巳 3 I）、実測値 1 604. 8409を得た。

[0154] （合成実施例 20）

ぺプチド八 20の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇丨 /₉）を、 X I として化合物 1 1 を、乂2として化合物 25、乂3として化合物 2 1、および X 4として化合物 1 4を用いて上記の一般手川頁に供した。

粗製八 20を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X250

〇1〇1、溶離液： 1\/16〇 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05 %丁八、直線勾配八/巳 = 50分間かけて 30/70から 55/45、流速： 3. 0 !_/分、検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 1_〇（力ラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： 1\/16〇1^~1 + 0. 05 %丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%丁八、直線勾配八/巳 = 25分間かけて 60/40から 74. 3/25. 7、流速： 3. 0 1_/分、検出： 11 280门〇〇により精製し、八20 （1 ^ 1 4. 〇〜 1 6. 2分、 1.

26〇19、〇. 767 111〇 1、 25工程で 3. 2 %） : 白色の固体；〇 ₇〇 1^~1₁₀₈1\1₁₉〇₂₀

+ 1 534. 801 3の計算値

（巳 3 I

）、実測値 1 534. 7999を得た。

[0155] （合成実施例 2 1）

ぺプチド八 2 1の合成〇 2020/175451 64 卩（：170? 2020 /007391

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇丨 /₉）を、 X I として化合物 1 5を、乂2として化合物 23、乂3として化合物 20、および X 4として化合物 1 4を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製八 2 1 を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X250 〇1〇1、溶離液： 1\/16〇 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05 %丁八、直線勾配八/巳 = 50分間かけて 25/75から 50/50、流速： 3. 0 !_/分、検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 1_〇（力ラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： 1\/16〇1^~1 + 0. 05

%丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%丁八、直線勾配八/巳 = 50分間かけて 45/55から 75/25、流速 = 3. 0 !_/分、検出： II V 28 〇门〇〇により精製し、八2 1 （1^=35. 9〜 37. 7分、 3. 86 ₉ 、 2. 04 〇丨、 25工程で 1 0%） : 白色の固体；〇₈₀1^~1₁₂₁1\1₂₀〇₁ ₉ [1\/1+1^~1] + 1 665. 9 1 1 1の計算値 1^~1 IV! 3 （巳 3 I）、実測値 1 6 65. 907 1 を得た。

[0156] （合成実施例 22）

ぺプチド八 22の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 746 〇 1 /₉）を、 X I として化合物 1 7、乂2として化合物 1 2、乂3として化合物 1 6、および X 4として化合物 23を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製八 22を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 03-4 1 0X25

0〇1〇1、溶離液： 1\/16〇 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 0 5%7 F A_s 八/巳 = 5分間かけて 35/65、次いで直線勾配八/巳 = 2 5分間かけて 35/65から 60/40、流速： 3. 0 1_/分、検出： II 280门〇〇、第 2逆相 1^~1 1_〇（カラム：不活性 003-4 1 0 X

溶離液： 1\/16〇1^~1 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇 + 0 . 05%丁八、直線勾配八/巳= 25分間かけて 65/35から 70/3 〇 2020/175451 65 卩（：170? 2020 /007391

〇、次いで 5分かけて 70/30、流速： 3. 0 1_/分、検出：フォトダイオードアレイ検出器 1 99〜 65 1 n〇〇、および第 3逆相 1^~1 !_〇（力ラム：不活性〇 03-4 1 0X2500101、溶離液八： IV! 6〇 1^~1 + 0. 0

5%7 F A_s 溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%7 F A_s 直線勾配八/巳 = 35分間かけて 70/30から 87. 5/1 2. 5、流速： 2. 0 !_/分、検出 : II V 220门〇〇により精製し、八 22 （1 ^ 1 7. 8〜 1 9. 4分、 0 . 969〇19、〇. 544 111〇 1、 25工程で 3. 2 %） : 白色の固体；〇₇₉1^~1_{1 16}1\1₁₉〇₂₁

+ 1 666. 8588の計算値1^~1 [¾1\/13 （巳 3 I）、実測値 1 666. 8624を得た。

[0157] （合成実施例 23）

ぺプチド八 23の合成

リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45〇1〇1〇 1 /₉）を、 X I として化合物 23、 X 2として化合物 25、 X 3として化合物 1 8、および乂4として化合物 1 1 を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製八 23を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X250

〇1〇1、溶離液： 1\/16〇 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05 %丁八、直線勾配八/巳= 50分間かけて 30/70から 37. 5/62 . 5、流速： 3. 0 !_/分、検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 1_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101）、溶離液八： IV! 6〇 1^~1

+ 0. 05%丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%丁八、直線勾配八/巳 = 50分間かけて 45/55から 70/30、流速： 3. 0 1_/分、検出 : II V 280门〇〇により精製し、八 23 （1 ^29. 7〜 3 1. 5分、 2 . 33〇19、 1. 44 111〇 1、 25工程で 6. 4 %） : 白色の固体；〇 ₇₄ 1^~1₁₀₆1\1₁₉〇₂₂ [1\/1+1^~1] + 1 6 1 2· 7754の計算値1^~| [¾1\/13 （巳3 I）

、実測値 1 6 1 2. 7746を得た。

[0158] （合成実施例 24）

ぺプチド八 24の合成〇 2020/175451 66 卩（：170? 2020 /007391

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇 1 /₉）を、 X I として化合物 25、乂2として化合物 22、 X 3として化合物 1 6、および X 4として化合物 1 9を用いて上記の一般手順に供した。

粗製八 24を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X250

〇1〇1、溶離液： 1\/16〇1^~1 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05 %丁八、直線勾配八/巳= 56分間かけて 24/76から 73/27、流速： 3. 0 !_/分、検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 1_〇（力ラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： 1\/16〇 + 0. 05

%丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%丁八、直線勾配八/巳 = 40分間かけて 20/80から 35/65、流速： 3. 0 1_/分、検出： □ V 28 O n m）により精製し、八24 （1 ^24. 2〜 26. 0分、 3. 1 7 ₉ 、 1. 74 111〇丨、 25工程で 8. 4%） : 白色の固体；〇 ₇₃ ^ _{1 15} N ₂₁ 〇_{1 g} [M+2 H] ²+794. 9334の計算値

（巳 3 I）、実測値 794. 9346を得た。

[0159] （合成実施例 25）

ぺプチド八 25の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇 1 /₉）を、 X I として化合物 25、乂2として化合物 1 7、 X 3として化合物 1 8、および X 4として化合物 1 4を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製八 25を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X250 〇1〇1、溶離液： 1\/16〇 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05 %丁八、直線勾配八/巳 = 50分間かけて 25/75から 50/50、流速： 3. 0 !_/分、検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 1_〇（力ラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： 1\/16〇1^~1 + 0. 05

%丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%丁八、直線勾配八/巳 = 50分間かけて 45/55から 70/30、流速 = 3. 0 !_/分、検出： II V 28 〇 2020/175451 67 卩（：170? 2020 /007391

〇门〇〇により精製し、八25 （1^=38. 2〜 39. 8分、 3.

、 2. 00 〇丨、 25工程で 9. 1 %） : 白色の固体；〇₇₂1^~1₁〇₈1\1₁₉ 〇 ₂₂ [1\/1+1^~1] + 1 59〇. 79 1 1の計算値

（巳 3 I）、実測値 1 590. 7903を得た。

[0160] （合成実施例 26）

ペプチド巳 1の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇 1 /₉）を、 X I として化合物 1 5を、乂2として化合物 25、乂3として化合物 2 1、および X 4として化合物 1 4を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製巳 1 を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、溶離液： IV! 60 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05% 丁、直線勾配 /巳= 50分間かけて 30/70から 55/45、流速 : 3. 0 !_/分、検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 P LC （カラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： 1\/16〇1^~1 + 0. 05% 丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%7 F A_s 直線勾配八/巳 = 50分間かけて 45/55から 70/30、流速： 3. 0 1_/分、検出： 11 28

〇门〇〇により精製し、巳 1 （1^ = 40. 〇〜 42. 6分、 2. 24 ₉、 1. 35 〇丨、 25工程で 6. 1 %） : 白色の固体；〇₇₂1^~1_{1 13}1\1 〇】 9 [1\/1+21^~1] ²+773. 9225の計算値

（巳 3 I）、実測値 77 3. 9234を得た。

[0161] （合成実施例 27）

ぺプチド巳 2の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇丨 /₉）を、 X I として化合物 1 7、乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 1 6、および X 4として化合物 25を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製巳 2を第 1逆相 !! !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 〇 2020/175451 68 卩（：170? 2020 /007391

、溶離液： IV! 6〇 1^~1 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05% 丁、直線勾配 /巳= 60分かけて 40/60から 70/30、流速： 3.

検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 P LC （カラム :不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： 1\/16〇 + 0. 05%7 八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%7 F A_s 直線勾配八/巳 = 50分間かけて 25/75から 50/50、流速： 3. 0rr\L /分、検出： II V 280 门〇〇により精製し、巳 2 （1^=25. 4〜 26. 5分、 3. 35 ₉、 2 . 1 3 〇 1、 25工程で 9. 9%） : 白色の固体；〇₇₃1^~1 _{] 12}1\1₁₉0₂₀ [1\/1+1^~1] + 1 574. 8326の計算値 1^~1 IV! 3 （巳 3 I）、実測値 1 57 4. 8357を得た。

[0162] （合成実施例 28）

ペプチド巳 3の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇丨 /₉）を、 X I として化合物 1 7、乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 20、および X 4として化合物 23を使用して、上記の一般手順に供した。

粗巳 3を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101

、溶離液： IV! 6〇 1^~1 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05%丁八、直線勾配 /巳= 60分間かけて 40/60から 70/30、流速： 3.

検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 P LC （カラム :不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： 1\/16〇 + 0. 05%7 八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%7 F A_s 直線勾配八/巳 = 50分かけて 25/75から 50/50、流速： 3. OmL /分、

）により精製し、巳 5 （1^=30. 8〜 32. 2分、 4. 34 ₉、 2. 4 2 〇 I、 25工程で 1 1 %） : 白色の固体；〇₇₉1^~1_{1 17}1^₂₀〇₂₁ [IV! + 1^~1] + 1 681. 8697の計算値

（巳 3 I）、実測値 1 681. 8 727を得た。

[0163] （合成実施例 29）〇 2020/175451 69 卩（：170? 2020 /007391

ぺプチド巳 4の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇丨 /₉）を、 X I として化合物 23、乂2として化合物 1 1、 X 3として化合物 26、および X 4として化合物 1 9を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製巳 4を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、溶離液： IV! 60 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05% 丁、直線勾配 /巳= 40分間かけて 25/75から 35/65、流速 : 3. 0 !_/分、検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 P LC （カラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： 1\/16〇1^~1 + 0. 05% 丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%7 F A_s 直線勾配八/巳 = 50分間かけて 45/55から 62. 5/57. 5、流速： 3. 0 1_/分、検出： II V 280门〇〇により精製し、巳4 （1 ^ 1 8. 4〜 1 9. 8分、 0. 74 3〇19、〇. 401 〇丨、 25工程で 2. 0 %） : 白色の固体；〇 ₇₆1^~1 _! ₁₄1\1₂₀0₂₀ [IV! +21^~1] ² + 81 3. 4254の計算値

（巳 3 I）、実測値 81 3. 4276を得た。

[0164] （合成実施例 30）

ぺプチド巳 5の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇丨 /₉）を、 X I として化合物 1 7、乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 24、および X 4として化合物 1 7を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製巳 5を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、溶離液： IV! 60 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05% 丁、直線勾配 /巳= 38分かけて 25/75から 44/56、流速： 3.

検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 P LC （カラム

:不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： 1\/16〇1^~1 + 0. 05%7 八、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05%丁八、直線勾配八/巳 = 40分間かけ〇 2020/175451 70 卩（：170? 2020 /007391

て 50/50から 70/30、流速： 3. 0mL /分、検出： II V 280门

81 75を得た。

[0165] （合成実施例 3 1）

ペプチド〇 1の合成

リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇丨 /₉）を、 X I として化合物 1 5、乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 24、および X 4として化合物 1 1 を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製〇 1 を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、溶離液： IV! 60 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05% 丁、直線勾配 /巳= 50分かけて 25/75から 50/50、流速： 3.

検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 P LC （カラム

:不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： 1\/16〇1^~1 + 0. 05%7 八、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05%丁八、直線勾配八/巳 = 50分かけて 45/55から 70/30、流速： 3. OmL /分、

）により精製し、〇 1 （1^=38. 2〜 39. 6分、 3. 44 ₉、 1. 9 6 〇丨、 25工程で 8. 8%） : 白色の固体；〇₇₈1^~1 _{] 16}1\1₁₉〇₂₀ [IV! + 1^~1] + 1 638. 8639の計算値

（巳 3 I）、実測値 1 638.

8627を得た。

[0166] （合成実施例 32）

ぺプチド〇 2の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45〇1〇1〇 1 /₉）を、 X I として化合物 25、 X 2として化合物 25、 X 3として化合物 24、および X 4として化合物 23を使用して、上記の一般手順に供した。〇 2020/175451 71 卩（：170? 2020 /007391

粗製〇 2を第 1逆相 1^~1 1_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、溶離液： IV! 60 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05% 丁、直線勾配 /巳= 50分間かけて 30/70から 55/45、流速 : 3. 0 !_/分、検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 P LC （カラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： 1\/16〇1^~1 + 0. 05% 丁八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%7 F A_s 直線勾配八/巳 = 35分間かけて 60/40から 80/20、流速： 3. 0 1_/分、検出： □ V 280 门〇〇により精製し、〇2 （t _R=7. 69〜 9. 1 9分、 1. 48 ₉、 0 . 843 〇丨、 25工程で 4. 0%） : 白色の固体；〇 ₇₉1^~1 _{] ]}〇 1\1 _{] 9}〇 ₂ ₀ [1\/1+1^~1] + 1 644. 81 69の計算値 1^~1 IV! 3 （巳 3 I）、実測値 1 6 44. 81 39を得た。

[0167] （合成実施例 33）

ぺプチド〇 3の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇丨 /₉）を、 X I として化合物 1 1、乂2として化合物 25、 X 3として化合物 24、および X 4として化合物 25を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製〇 3を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、溶離液： IV! 60 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05% 丁、直線勾配 /巳= 50分かけて 30/70から 55/45、流速： 3.

検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 P LC （カラム :不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： 1\/16〇1^~1 + 0. 05%7 八、溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%7 F A_s 直線勾配八/巳 = 30分かけて 60/40から 73. 3/26. 7、流速： 3. 0 1_/分、検出： 11 2 80门〇〇により精製し、〇3 （1^=7. 5 1〜 8. 82分、〇. 870 9、〇. 5 1 7 〇1〇 1、 25工程で 2. 5 %） : 白色の固体；〇 ₇₃1^~1 _{! 07} _{! 9}〇₂₀ [1\/1+21^~1] ²+784. 8964の計算値

（巳 3 I）、実測値 784. 8957を得た。〇 2020/175451 72 卩（：170? 2020 /007391

[0168] （合成実施例 34）

ぺプチド〇 4の合成

リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇丨 /₉）を、 X I として化合物 1 7、乂2として化合物 23、 X 3として化合物 1 3、および X 4として化合物 1 4を使用して上記の一般手川頁に供した。

粗製〇 4を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、溶離液： IV! 60 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05% 丁八、直線勾配八/巳= 45分かけて 25/75〜 47. 5/52. 5、流速 = 3. 0 !_/分、検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 P LC （カラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： IV! 6〇 1^~1 + 0. 0

5%7 F A_s 溶離液巳： 1^~1₂〇+〇. 05%7 F A_s 直線勾配八/巳 = 50分かけて 45/55〜 70/30、流速： 3. 0 1_/分、検出： 11 28

〇门〇〇により精製し、 04 （1^ = 40. 4〜 4 1. 9分、 1. 62 ₉、

0. 955 〇1〇 1、 25工程で 4 1 %） : 白色の固体；〇₇₉1^~1_{1 15}1\1₂〇〇 ₂₂ [1\/1+1^~1] + 1 695. 8489の計算値

（巳 3 I）、実測値 1 695. 8484を得た。

[0169] （合成実施例 35）

ペプチド〇 5の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ（Wa n g樹脂）一〇アリル（31、負荷率：〇. 45 〇丨 /₉）を、 X I として化合物 1 7、乂2として化合物 23、 X 3として化合物 24、および X 4として化合物 25を使用して、上記の一般手順に供した。

粗製〇 5を第 1逆相 1^~1 !_〇（カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、溶離液： IV! 60 + 0. 05%丁、溶離液巳： 1^~1₂〇+ 0. 05% 丁、直線勾配 /巳= 50分かけて 25/75から 50/50、流速： 3.

検出： II V 280 n〇〇および第 2逆相 1^~1 P LC （カラム :不活性〇 8-3 1 0X2500101、溶離液八： 1\/16〇 !! + 0. 05%7 〇 2020/175451 73 卩（：170? 2020 /007391

FA、溶離液 B : H₂〇 +〇. 05%T FA、直線勾配 A/ B = 50分かけて 45/55から 70/30、流速： 3. 0 m L /分、検出： U V 280 n m ）により精製し、 C5 （t _R=32. 2〜 34. 6分、 1. 54m g、 0. 9 1 3 M m〇 u 25工程で 4. 3%） : 白色の固体； C₈₀H_{1 10}N_{i g}〇₂₂ [ M+ H] + 1 688. 8067の計算値 H RMS （ES I）、実測値 1 688 . 8095を得た。

[0170] [実施例 4]

35種の人工類似体の杭微生物スぺクトルと MK_ 4依存的膜破壊活忡

全合成した 35種類のライソシン E類似体の抗菌活性を評価し、ライソシン E （化合物 1）の抗菌活性と比較した（図 1 7）。 M 丨 Cアツセイは、 C l i n i c a l a n d L a b o r a t o r y S t a n d a r d s I n s t i t u t eのプロトコルに従って行った。ぺプチドの抗微生物活性は微量希釈法を用いて測定した。

[0171] M l C値は、 6株のグラム陽性細菌： M S S A 1、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA4）、スタフイロコツカスへモリテイカス、セレウス菌、枯草菌、およびリステリアモノサイトゲネスに対する 2倍段階希釈手順によって決定された。さらに、 MSS A 1 に対するペプチドの効果は BCS、つまり活性増強血清の有無にかかわらず評価した。各 A群、 B群、または C 群の化合物は、 1 0%BCSの存在下での MSS A 1 に対する活性の降順で記載した。化合物が BCS存在下での MSS A 1 に対して同じ M 丨 C値を示したとき、 BCS非存在下での MSS A 1の値をそれらの順序付けに使用した。活性の強さは、カラーグラデーションヒートマツプ形式で表示した。

[0172] 最も重要なことには、 MS S A 1 に対する A 1〜 A 1 1の 1 1個の新規類似体の M 丨 C値は、増殖培地に 1 0 % B C Sを添加すると 0. 01 5 M 9 / mL~0. 0625 g /m Lであることが分かった。従って、化合物 1 （ 0. 0625 M g/m L）の活性に比べ、より効力がある、または同じ効力がある。これらのうち、 3つの人エペプチド A 1、 A 2、および A 3は、天然の化合物 1 よりも 4倍高い抗菌活性を示した。化合物 1 （ 0. 25 M 9 / 〇 2020/175451 74 卩（：170? 2020 /007391 1_）と同様に、八 1 ~八3も巳3〇添加

（それぞれ 0. 25、〇. 25、および〇. 1 25 9/ 1_）に対して高い活性を示し、 1\/^3 八感染症の治療におけるそれらの潜在的な有用性を示唆している。さらに、

7つの化合物八 1 2~八 1 8は化合物 1 よりやや弱かったが、それでも強い抗菌効果を保持していた。

—方、八群の残りの 7つのペプチド八 1 9~八 25は、 IV! 丨〇値が 4. 0 9/ 1_よりも高いため、偽陽性化合物として分類される。単一点抗菌ァッセイ（図 5）の結果によると、巳群（巳 1 ~巳 5）および（3群（<31 ~〇 5）の化合物はいずれも低い IV! 丨 <3値を持っていなかった。その結果、八群の 26個のぺプチドの 69%ならびに巳群および〇群の 1 0個のぺプチドの 0%が活性であった。このように、本発明のスクリーニング方法により複数の活性類似体を発見することができ、本発明の方法の妥当性が確認された。

[0173] 次に、巳〇 3を使用せずに、 6つのグラム陽性菌に対する八群〜〇群の 3

6化合物の抗菌活性を評価した。天然の化合物 1および 1 8個の類似体八 1 〜八 1 8は1\/1[¾3八 1 を含む全ての株に対して活性であったが、八 1 9〜八 25、巳 1 ~巳 5、および〇 1 ~〇 5は細菌に対して弱いまたは無視できるほどの影響しか及ぼさなかった。興味深いことに、巳〇3は、 1\/133八 1 に対する八 1

1 4の活性を 1 6〜 533倍増強したが、添加剤は八 1 5〜八 1 8の活性を 2〜 4倍しか増大させなかった。血清の増強効果の構造依存性は、この現象に対する分子物質の存在を示した。

八 1

1 8の株選択性は類似していることが分かった：これらは 3. へモリチカスおよび巳. セレウスに対してより活性があり、！-. モノサイトゲネスに対しては活性が低い。八 1 5と八 1 7は他のペプチドとわずかに異なっていたが、！-. モノサイトゲネス（1\/1 丨〇= 64 9/ !_）、巳. セレウスと枯草菌（IV! 丨 0= 1 6 9/ !_）には各々弱い影響しかなかった。これらの結果は、化合物 1の構造変化が株選択性を減弱させるのに有効であることを実証した。

[0174] 合成されたライソシン巳類似体がライソシン巳と同様の作用機序を有する〇 2020/175451 75 卩（：170? 2020 /007391

ことを確認するために、細菌細胞膜のモデルとしてリポソームを用いることによって 36の合成ペプチ

（化合物 2）依存的膜破壊活性を推定した。卵黄ホスファチジルコリン（〇） /卵黄ホスファチジルグリセロ _ル（〇）（50 : 50の比）を含む大きな単層小胞（1_ 11 3）を調製して、細菌膜の負に帯電した表面を模倣した。〇/ 〇からなる 1_ II Vに

（2）の 1. 25モル％、または II〇一 1 0 （ユビキノン（化合物 3））の 1. 25モル％で添加して、化合物 3に対する化合物 2への選択性を評価した。 PCXPGX2_S PCXPGX3_S および〇/ 〇を含む 3つの！- II V 3の中に、カルボキシフルオレセイン（〇）を蛍光指示薬としてカプセル化した。 3種類の !_ II Vに対するべプチドの膜破壊活性は、様々な濃度の蛍光変化（％）を測定することによって最大半減応答（巳〇; 〇）値として定量した。

[0175] 90/90/2_% 90/90/3. および〇/ 〇 1_ 11 についての化合物 1の巳（3₅。値は、それぞれ 1 9. 5 nM、 92. 0 n M_% および 55 9 _n IV!であると決定され（図 1 6）、化合物 1 による化合物 2依存的な膜破壊が確認された。化合物 1の、化合物 2に対する選択性指数は、 4. 7 （= 92. 0/1 9. 5）であると計算された。注目すべきことに、 35の類似体のうち 27 （八 1 ~八22、巳 1、巳 2、および〇 1 ~〇3）が、 9〇/ 90/2 !_ II Vについて検出可能な巳（3₅。値および 2. 9を超える選択性指数を有していた。

これらのデータは、リポソーム膜の化合物 2依存的破壊が抗菌活性にとって十分な条件ではないことを示した。高い割合の膜破壊性類似体は、 2—錯化アツセイにおける八群〜〇群のすべてのぺプチドの強力な活性を反映していたと考えられる（図 8）。重要なことに、八 1 ~八 1 1の 1 1個の最も強力な抗菌化合物は、 90/90/2 1_ 11 （巳〇₅。= 1 〇. 7〜 38. 8 门 IV!）に対して化合物 1 （1 9. 5 n IV!）に匹敵する膜破壊活性を示した。したがって、化合物 1 と 1〜 1 1は同じ化合物 2依存的な作用機序を有することが示唆される。また、八 7 （1 9. 7）、八 1 4 （＞1 9. 7）、〇 2020/175451 76 卩（：170? 2020 /007391

および八 1 6 （2 0 . 6）の選択性指数が八 1 （4 . 7）のそれよりも高いことは注目に値し、キノン選択性は化合物 1の構造変化によって減衰できることを示唆している。

[0176] 以上の結果から、抗菌および 2選択的膜破壊活性の構造的要件に関する貴重な情報を集めることができた（図 1 8 3）。最も注目すべきことに、化合物 1および 1 1個すベての強力な類似体 1 ~ 1 1は残基一 6でロイシン（!_）を、そして残基一 1 1でイソロイシン（丨）を共有する。八 1 5以外の活性の低い八 1 2 ~八 1 8でさえ、同じ 2つの残基を持っている。したがって、これらの残基は強力な抗菌機能に不可欠である可能性が最も高い。

!_および丨は疎水性があり、嵩高いため、 2つの側鎖は細菌膜または化合物 2の疎水性脂質尾部と相互作用し、および/または生物活性立体配座を形成するであろう。保存された残基一 6および一 1 1 とは対照的に、残基一 3 および一 9は有意に変化しており、これらの部分構造の活性に対する相対的な無関係を示している。

化合物 1の残基一 3および一 9、八 1 ~八 1 4、および八 1 6 ~八 1 8は、それぞれ 7および 5アミノ酸残基に対応する。それらの中で、最も高い抗菌活性を有する八 1 ~八 3は、残基一 3にアラニン（八）またはリジン（）および残基一 9にパリン（V）またはグルタミン（〇）を有する。一方、最も高い化合物 2—選択性を有する八 7、八 1 4および八 1 6の全てにおいて、残基一 9にオルニチン（〇）を含み、このことはこれら部分構造の特異的効果を意味する。注目すべきことに、化合物 1および最も強力な八 1は、残基一 3におけるヒドロキシ基の存在または非存在においてのみ異なる。

[0177] 類似体八 1 5は、残基一 3、 _ 9、および一 1 1 において、化合物 1 と異なる（図 1 8匕）。すなわち、八 1 5では、化合物 1のセリン（3）、グルタミン（〇）、およびイソロイシン（丨）が、それぞれアラニン（八）および 2つのチロシン（丫）に置き換えられている。抗微生物類似体の中の八 1 5のこの独特の突然変異パターンは、添加に対する非感受性と異なる細菌株選択性、といった異なる生物学的行動の原因となる。巳 0 3添加と異〇 2020/175451 77 卩（：170? 2020 /007391

なる細菌株選択性に対する非感受性。興味深いことに、 1 5の残基一 6のロイシン（!_）をアラニン（八）に変えると、非抗菌性 0 2が得られ、これもまた、残基一 6の側鎖の活性に対する意義を裏付けるものである。全体として、本戦略は、化合物 1の機能を増強および調節するための極めて重要な構造因子を抽出するのに有効であることが証明された。

Claims

〇 2020/175451 78 卩（：170? 2020 /007391 請求の範囲

[請求項 1 ] 以下の一般式（丨）で表される化合物又はその塩。

（—般式（丨）において、

基から選択され；

水素原子、炭素数 1〜 3のアルキル基又はヒドロキシ基を表す） 79 卩(：170? 2020 /007391

（

同一又は異なっていてもよく、各々独立して、水素原子、炭素数 1〜 3のアルキル基を表し、

は、各出現において同一又は異なっていてもよく、各々独立して、水素原子又は炭素数 1〜 3のアルキル基を表し、 nは、〇〜 2の整数を表す）

（

水素原子又は炭素数 1〜 3のアルキル基を表す）

（

（式（6）において、［¾ は、水素原子、炭素数 1〜 3のアルキル 80 卩（：170? 2020 /007391

基又はヒドロキシ基を表し、［¾ ^{1 2}は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し、 01は〇〜 4の整数である）

又は

炭素数 1〜 3の直鎖状アルキル基

式（1）〜（6）において、 -は結合部位を表す：

であり：

る置換基から選択され：

水素原子又は炭素数 1〜 3のアルキル

（式（6）において、［¾ は、水素原子、炭素数 1〜 3のアルキル基又はヒドロキシ基を表し、［¾ ^{1 2}は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し、

は〇〜 4の整数である）〇 2020/175451 81 卩(：170? 2020 /007391

（式（7）において、［¾¹³、［¾¹⁴及び［¾¹⁵は、同一又は異なっていてもよく、各々独立して、水素原子又は炭素数 1〜 3のアルキル基を表す）

又は

（式（8）において

水素原子又は炭素数 1〜 3のアルキル基を表し、［¾¹⁷は、水素原子、炭素数 1〜 3のアルキル基又はヒドロキシ基を表す）

式（1）、（4）、（6）、（7）〜（8）において、 -は結合部位を表す：

チル基である。）

4）で表される基であって、

（8）で表される基であって、［¾¹⁶及び［¾¹⁷が水素原子である化合物は除く。

［請求項 2］

は、以下で表される置換基から選択され； \¥0 2020/175451 82 卩(：17 2020 /007391

は、以下で表される置換基から選択される、請求項 1 に記載の化合物又はその塩。

（但し、

で表される置換基であり、かつ、

る置換基である化合物は除く。）

［請求項 3］

ら選択される、請求項 1又は 2に記載の化合物又はその塩。

（、：（八、 0）、（八、 V）、（＜、 V）、（V、〇）

、 V）、（V、 0）、（丫、 0）、（丫、 0）、（丫、 V）（

|\|、 0）、（V、丫）、（V、 3）（1\1、 V）、（1\1、 0）、 ⑴、

〇）、 ⑴、丫）、 ⑴、 V）

ここで、 V、 0、［＜、 3、 1\1、丫、八、〇、 0は、請求項 2で定義した通りである。

［請求項 4］（ I） 8 ¹が炭素数 1〜 3の直鎖状アルキル基であり、（〇 2020/175451 83 卩（：170? 2020 /007391

8) で表される置換基である、 (丨丨 )

が炭素数 1〜 3の直鎖状アルキル基であり、が式 (1 ) で表される置換基である、又は、

( \ \ \ ) が式 (3) で表される置換基であり、

(1 ) で表される置換基である、請求項 1 に記載の化合物又はその塩。

[請求項 5] 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、感染症を治療するための薬学的組成物。

[請求項 6] 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む抗菌剤。

[請求項 7] 細菌膜に存在する物質と相互作用して抗菌活性を示すペプチド系の候補化合物のスクリーニング方法であって、

以下の工程：

(1 ) 物質と相互作用して抗菌活性を示すことが知られているぺプチド系化合物の類似化合物のライブラリーを提供すること；

(3) ( 2 ) で得られた類似化合物と物質との個々の錯体を分配し、溶媒を添加することにより当該錯体から物質を溶離させること；

を含む、前記スクリーニング方法。

[請求項 8] 前記化合物がメナキノンである、請求項 7に記載のスクリーニング方法。

[請求項 9] (4) の工程において、各々の錯体から得られた溶離液の蛍光を測定することにより、各々の類似化合物についての物質と錯体を形成した程度を分析する、請求項 7又は 8に記載のスクリーニング方法。

[請求項 10] 前記類似化合物が、ビーズ結合型ペプチドである、請求項 7〜 9の〇 2020/175451 84 卩（：170? 2020 /007391

いずれか 1項に記載のスクリーニング方法。

[請求項 1 1 ] 類似化合物のライブラリーが、〇巳 0 ⁽3法を用いて調製される、請求項 1 〇に記載のスクリーニング方法。

[請求項 12] 物質と相互作用して抗菌活性を示すことが知られているペプチド系化合物が、ライソシン巳である、請求項 7〜 1 1のいずれか 1項に記載のスクリーニング方法。