CN101535491A - 链霉菌及由其生产的生物活性化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及菌株类型SPRT的分离的微生物(＝DSM 44925T＝NRRLB－24448T)。所述微生物优选地包括GenBank登记号DQ141528(16S－rDNA－序列)的遗传物质。本发明延伸到产生2，5－二苯基噁唑或其变体或衍生物的方法，所述方法包括从菌株类型SPRT的微生物(＝DSM44925T＝NRRL B－24448T)回收2，5－二苯基噁唑或其变体或衍生物。

Description

链霉菌及由其生产的生物活性化合物
发明背景
本发明涉及分离的生物以及从其中回收的化合物。具体而言，本发明涉及′Streptomyces polyantibioticus′菌株SPR和由所述生物产生的作为抗菌化合物的21-57。本发明还涉及21-57作为抗菌剂的应用。
结核病(TB)已经成为南非自然死亡的主要原因，每月使1000人死亡，其中大多数在他们的于经济上最具生产力的年龄死亡。南非是世界上22个负担最重的国家之一，平均发病率是群体中每100000个人中536例TB-是世界上第三高的发病率(全球结核病控制(Global Tuberculosis Control)，WHO报告，2005)。估计所有TB-阳性的病例中有61％可归于也是HIV阳性的患者(2003年是50％；全球结核病控制，WHO报告，2005)，这使问题进一步复杂化。
根据Kim等(2003)，链霉菌科(Streptomycetaceae)包含链霉菌属(Streptomyces)，Kitasatospora和Streptacidiphilus。所有这些属是系统发育上相关的，但是在化学组成和形成系统树上独特的系统发育进化枝上是不同的。所述Kitasatospora属(最初是北里孢菌属(Kitasatosporia))首次由Omura等于1982年提出，并且随后包括在链霉菌属中(Groth等，2003)。其在1997年重建(Zhang等)，并且随后被认为是不同于链霉菌属的属。
链霉菌属由Henrici & Waksman首次描述于1943年。在将属如孢器放线菌属(Actinopycnidium)，孢囊放线菌属(Actinosporangium)，钦氏菌属(Chainia)，鞘孢囊菌属(Elytrosporangium)，小荚孢囊菌属(Microellobosporia)，北里氏菌属(Kitasatoa)和链轮丝菌属(Streptoverticillium)分类和重新分类的时期后(Anderson & Wellington，2001)，链霉菌属现在由519个正式公开的物种组成(Euzeby，2005)。然而链霉菌属在物种水平上的系统仍旧在令人困惑的状态并且认为该属是过度分类的-至今为止具有最多的有效描述的物种(Groth等，1999)。
长期以来已知链霉菌属是抗生素的丰富来源。链霉菌属的成员是好氧，革兰氏阳性的并且具有69-78％的DNA G+C mol％，是关于放线菌最高的报道(Anderson & Wellington，2001)。它们产生分支广泛的基底和气生菌丝体；未产生孢子囊。因年久，气生菌丝体分化成孢子链。孢子链形态和孢子表面纹饰通常被用作区分该属成员的区别性特征。该属表征为具有细胞壁化学型I(Lechevalier & Lechevalier，1970)-在它们的肽聚糖中存在LL-DAP和甘氨酸，并且在全细胞糖水解产物中不存在特征性的糖(Anderson & Wellington，2001；Lechevalier & Lechevalier，1970)。饱和的异脂肪酸和反异脂肪酸，具有9个异戊二烯单位的六氢化或八氢化的甲基萘醌和二磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇和磷脂酰肌醇甘露糖苷的磷脂模式是该属的特征(Locci，1989)。此外，链霉菌具有A3γ肽聚糖类型并且不存在分枝菌酸(Locci，1989)。
大多数抗生素是次生代谢物，具有典型的低分子量(范围从150-5000Da)并且在化学上是多样的。它们可以仅包括碳和氢原子，但是大多数情况下它们包含碳，氢，氧和氮原子，同时一些还包含硫，磷或卤素。此外，几乎存在所有的有机化学官能团(Lancini等，1995)。
长期以来存在关于次生代谢物在细菌中的作用的争论(Bérdy，2005)。在放线菌中，它们典型地在营养生长后并且在当生产者进入休眠或孢子形成阶段时产生(Challis & Hopwood，2003)。存在各种假说来解释抗生素在抗生素生产者中的作用。一些研究者认为这些化合物根据没有任何作用，仅是细菌代谢的简单副产物(Lancini等，1995)。Lenski & Riley(2002)提出放线菌产生抗生素的能力可以解释在土壤中的竞争性效果，这导致一些细菌的增加和另一些细菌的减少，有效驱动土壤细菌的生物多样性。另一个可能的作用是抗生素可以辅助调节某些代谢过程或甚至在抗生素产生生物之间的联系中具有作用(Lancini等，1995)。
在药物公司更集中于研究抗癌剂或用于治疗心血管疾病的化合物的阶段后，在过去数年间关于新抗生素的研究已经得到增加。随着细菌对已知抗生素的抗性的发生的增加和新旧疾病的出现(尤其在结核病的情况中)，对于具有新的作用机制的新的抗生素的需要已经变得非常紧迫(Bérdy，2005；Sandvoss等，2001)。Bérdy(2005)认为微生物(尤其是放线菌)具有产生具有新的作用机制的多种结构上的新分子的巨大能力，其可以直接使用或用作药物设计的模板。他这种观点的基础是天然化合物已经进行了自然的预先筛选并且通过进化已经选择了它们的有效性的事实。
根据Lancini等(1995)，分离，纯化和鉴定新化合物的过程涉及一系列专业人员：微生物学家，发酵技术专家，生物工程人员和化学家，并且涵盖从土壤样品中分离细菌到包含纯化化合物的瓶子的所有的过程。由于已知抗生素的高再分离发生率，必要的是尽可能快地确定化合物是否是新的(Lancini等，1995)。从发酵介质中鉴定抗生素是费力费时的过程(Bérdy，2005；Sandvoss等，2001；Wilson，2000)。用有机溶剂提取粗制样品导致提取了许多天然产物并且因此需要进一步的纯化步骤以获得纯的目的化合物。接着将纯的化合物进行结构阐释以确定所述化合物是否是以前已经分离的(Sandvoss等，2001)。因此，大多数涉及高通量筛选计划的公司使用多重的系统(multiple-hyphenated system)，例如与偶联质谱的核磁共振波谱偶联的高效液相色谱(HPLC-NMR-MS)。将从这种快速筛选技术获得的数据与具有关于已知化合物的信息的数据库进行比较，从而快速确定所述化合物是否是新的(Sandvoss等，2001；Wilson，2000)。然而，这种类型的专门设备是昂贵的并且限于大的研究机构或药物公司。
存在关于用于治疗细菌感染的抗菌剂和用于产生所述试剂的微生物的需要。
发明概述
根据本发明的第一个方面，提供菌株类型SPRT的分离的微生物(＝DSM 44925T＝NRRL B-24448T)。
优选地，所述微生物是放线菌菌株。更优选地，所述微生物来自链霉菌属，所述微生物可以来自链霉菌科，并且最优选地是Streptomycespolyantibioticus。
所述微生物优选地包括GenBank登记号DQ141528(16S-rDNA-序列)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的遗传物质。
根据本发明的第二方面，提供具有GenBank登记号DQ141528(16S-rDNA-序列)的鉴定特征的生物纯培养物。
根据本发明的第三方面，提供放线菌菌株SPRT(＝DSM 44925T＝NRRL B-24448T)。
根据本发明的第四方面，提供生产2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物的方法，所述方法包括从菌株类型SPRT的微生物(＝DSM 44925T＝NRRLB-244487)回收2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物。
根据本发明的第五方面，提供从具有GenBank登记号DQ141528(16S-rDNA-序列)的鉴定特征的微生物回收的2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物。
根据本发明的第六方面，提供将2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物用作抗菌剂的应用，包括用于治疗流感，结核病和/或其它细菌感染的应用。
根据本发明的第七方面，提供用作抗菌剂的组合物，所述组合物包含有效量的2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物。
根据本发明的第八方面，提供2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物，用作抗菌剂。
根据本发明的第九方面，提供2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物，用于制备药物，所述药物用作抗菌剂，包括用于治疗流感，结核病和/或其它细菌感染的应用。
根据本发明的第十方面，提供将2，5-二苯基或其变体或衍生物用于制备用作抗菌剂的药物的应用，所述应用包括用于治疗流感，结核病和/或其它细菌感染。
根据本发明的第十一方面，提供GenBank登记号DQ141528(16S-rDNA-序列)的分离的多核苷酸。
根据本发明的第十二方面，提供包括GenBank登记号DQ141528(16S-rDNA-序列)的多核苷酸的分离的多核苷酸序列。
微生物已经在两个国际培养物保藏中心，即Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ，德国培养物保藏中心，http://www.dsmz.de)和美国农业部农业研究服务的放线菌培养物保藏中心(http://nrrl.ncaur.usda.gov)保藏。
优选实施方案描述
在说明书中，提及下列附图，其中：
图1是在30℃，在Middlebrook7H9-葡萄糖琼脂上生长90天的菌株SPRT的冰冻扫描电镜图。具有成熟孢子囊的成簇孢囊柄清楚可见，在孢子囊中包含光滑的，杆形的孢子。棒代表1μm。
图2是通过邻接法获得的无根16S-rDNA系统发育树，显示菌株SPRT在其系统发育邻接中的位置并且代表产生孢子囊的属。将球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)JCM 1332T的16S-rDNA序列用作外群(outgroup)。编辑所有的序列到最长的共同区(1409bp)。在括号中给出GenBank序列登记号。在节点的数字代表％自展值。星号表示当使用邻接法，最小进化和最大简约法来构建系统树时保守的进化枝。
图3是菌株SPRT的rRNA操纵子拷贝数。泳道：1 & 3-用SalI消化的基因组DNA；2-用ScaI消化的基因组DNA；4-用EcoRV消化的基因组DNA；5-用SspBI消化的基因组DNA；6-用SnaBI消化的基因组DNA。在0.7％琼脂糖凝胶上分离基因组DNA片段达24小时，将其转移到尼龙膜上并与rDNA探针杂交。泳道1和2表示与16S-rDNA探针杂交的消化的基因组DNA，泳道3-6表示与23S-rDNA探针杂交的消化的基因组DNA。
图4是生物活性化合物，21-57的分离和纯化的示意图。
图5是针对结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37Rv的生物自显影。将卡那霉素用作阳性对照。显示斑点的量。白色区域指示抑制生长的区域；深色区域指示细菌存活的区域。
图6是a)通过X-射线衍射晶体分析法(由开普敦大学，化学系，X-射线衍射晶体分析单位(X-ray Crystallography Unit，Department of Chemistry，University of Cape Town)，Susan Bourne副教授提供的结构)确定的21-57的分子结构和b)具有IUPAC编号的21-57的分子结构，其按照NMR光谱数据的排布(表3)。
图7是涉及噁唑和噻唑生产的生物合成过程的示意图(Roy等，1999)。
图8举例说明包含一个或多个噁唑部分的天然产物的化学结构。
图9是a)由鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)产生的生物合成基因簇和耶尔森菌素的结构；和b)具有最终产物(羟苯基)噻唑啉-半胱氨酸加合物和(羟苯基)噻唑啉羧酸酯的截短的HMWP2的功能(Roy等1999)。
图10显示＂Streptomyces polyantibioticus＂菌株SPRT的基因序列(SEQID NO：1)。
作为产生抗生素的放线菌的筛选程序的部分，从土壤中分离具有不常见形态的放线菌，所述土壤从南非，Kwa-Zulu Natal，Umgeni河的河岸收集。
在28℃温育7天后，菌株SPRT在Middlebrook 7H9琼脂[Difco实验室；补充10mM葡萄糖；无白蛋白-葡萄糖(dextrose)(AD)补充物]上分离。分离后，菌株SPRT维持在Middlebrook 7H9-葡萄糖琼脂上。
通过稀薄琼脂重叠技术确定抗微生物活性。对于该项技术，将分离物重复穿刺接种在Middlebrook 7H9-葡萄糖琼脂，Czapek Solution琼脂(CZ)(Atlas，1993)和酵母提取物-麦芽提取物(ISP 2-Shirling & Gottlieb，1966)琼脂平板中。将板在30℃温育10天(平行设定在37℃)，并用包含测试细菌的6ml Luria稀薄琼脂(Sambrook等，1989)覆盖。针对各种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌：凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)ATCC 7050T，屎肠球菌(Enterococcus faecium)vanA(万古霉素抗性的)，Enterococcusphoeniculicola JLB-1T，微球菌属物种(Micrococcus sp)(临床分离株)，金色分枝杆菌(Mycobacterium aurum)A+和链球菌物种(Streptococcus sp)(临床分离株)测试活性；针对布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braaki)菌株90(临床分离株)，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)菌株67(临床分离株)，大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 25922和产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)菌株K52(临床分离株；对力百汀和头孢呋辛具有抗性)显示弱活性。
在30℃，在摇动器上将菌株SPRT培养在500ml的Hacéne′s培养基(HM；Hacène & Lefebvre，1995)中达10天。通过咖啡滤器(咖啡屋(House ofCoffees)，1X4大小的滤器)过滤培养物。用甲醇提取分离株的菌丝团并且通过生物自显影确定活性。
使用标准方法(Locci，1989)确定菌株SPRT的形态特征。将分离物在30℃在Middlebrook 7H9-葡萄糖琼脂上培养90天，并且在光学显微镜下和通过冰冻扫描电镜观察形态。
如Locci(1989)所述进行标准生理测试。如Shirling & Gottlieb(1966)所述制备ISP培养基。通过将推荐浓度(Locci，1989)的抗生素混合到Bennett′s培养基琼脂平板(Atlas，1993)中确定抗生素抗性。非标准的测试抗生素的浓度如下：卷曲霉素(20μg/ml)，头孢噻肟(100μg/ml)，D-环丝氨酸(50μg/ml)，卡那霉素(10μg/ml)和紫霉素(8μg/ml)。在30℃(除非另外指出)培养推荐的培养期间后来确定生理特征。将用于碳利用测试的所有的碳源用滤器灭菌并且在Locci(1989)和Shirling & Gottlieb(1966)推荐的浓度测试。如Gordon等(1974)所述确定有机酸的利用，自碳水化合物的酸产生和对溶菌酶的抗性。
将标准技术用于确定过氧化氢酶和氧化酶活性。使用标准革兰氏染色技术进行染色。使用标准方法进行酸-快速染色(1％硫酸用在脱色步骤中)和酸-醇快速染色(Ziehl-Neelsen)。
从500ml的菌株SPRT的ISP 2培养物中获得化学分类测试中所用的冷冻干燥细胞，将其在30℃在摇动器上培养5天。
通过Hasegawa等(1983)的方法确定DAP异构体和全细胞糖模式，除了使用冷冻干燥的细胞来替代来自琼脂平板的菌落。
根据Chou等(1998)制备脂肪酸甲酯并通过在Zebron GC柱，ZB-1(0.25mm乘以30m)上的气相色谱分析。柱温固定在210℃并对注射器的温度设定程序以4℃/分钟的速率从150℃到220℃增加。通过与脂肪酸甲酯标准物(FAM标准物：MIX GLC-80；SEPULCO)比较来鉴定峰。如Minnikin等(1975)所述分离并分析分枝菌酸。如Minnikin等(1984)所述分离磷脂。使用HPLC分离方法通过DSMZ鉴定服务(DSMZ IdentificationService)(Braunschweig，德国)分析甲基萘醌。如Komagata & Suzuki(1987)所述，在硅胶60 F254(Merck)板上用双相薄层层析(TLC)分析磷脂。如Komagata & Suzuki(1987)所述确定肽聚糖类型-通过TLC进行分析。使用由Mandel & Marmur(1968)所述的热变性方法，在1.0X标准柠檬酸盐溶液(SSC)中确定碱基组成(G+C mol％)。
使用通用细菌16S-rDNA引物F1(Cook & Meyers，2003)和引物R6 5′-AAGGAGGTGITCCAICC-3′[从Chun & Goodfellow(1995)的引物p1525r修饰；I＝肌苷]，通过聚合酶链式反应扩增16S-rDNA。PCR条件如Cook& Meyers(2003)所述。纯化扩增的DNA以使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)测序。对于系统发育分析，参考菌株选自BLAST(Altschul等，1997)结果以及选自孢子囊属(sporagniate genera)。对于构建系统树，使用软件包MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis(分子进化遗传分析))版本2.1(Kumar等，2001)和CLUSTALX版本1.81(Thompson等，1997)。使用邻接法(Saitou & Nei，1987)，最少进化和最大简约法(Takahashi & Nei，2000)构建无根系统树，并通过自引重取样(1000次重复)评估。
逐一用限制性内切酶：SalI和ScaI消化基因组DNA以确定16S-rRNA操纵子的多样性，并逐一用SalI，EcoRV，SspBI和SnaBI消化基因组DNA以确定23S-rRNA操纵子多样性。消化的基因组DNA在0.7％琼脂糖凝胶上电泳24小时。通过DNA杂交分析(Sambrook等，1989)确定16S-rRNA基因和23S-rRNA基因的拷贝数。使用洋地黄毒苷-dUTP(罗氏(Roche))标记的DNA探针。使用通用细菌引物F1和R5(Cook & Meyers，2003)从菌株SPRT扩增确定16S-rRNA拷贝数的探针，并使用由Wang & Zhang(2000)所述的引物：正向引物5′-CCGATGAAGGACGTGGGA-3′(位置46到63*)和反向引物5′-ACCAGTGAGCTATTACGC-3′(位置1212到1195*)扩增确定23S-rRNA拷贝数的探针。将扩增，未标记的16S-rDNA和23S-rDNA用作阳性对照。如在罗氏DIG手册(http://www.roche.com)中推荐的进行杂交和观察。
*产二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)ATCC 23877T 23S-rRNA基因编号
从冷冻扫描电镜(图1)，清楚可见在成簇孢囊柄上存在产生的孢子囊。光滑，杏仁形孢子在孢子囊中可见。孢囊柄典型地是11-18μm长，孢子囊具有6-10μm的直径，其中孢子约为2μm长。孢囊柄和孢子囊具有“棒棒糖”外观并且一簇为4-6组(图1)。当将包含成熟孢子囊的平板用水淹没时，在光学显微镜下没有观察到孢子的运动性。
菌株SPRT的化学分类特征与孢子囊属和系统发育相关的非孢子囊属，链霉菌属和Kitasatospora的那些的比较总结在表1中。在菌株SPRT的氨基酸分析中检测LL-DAP和甘氨酸并且全细胞糖水解产物产生半乳糖，葡萄糖和痕量的核糖和甘露糖，与Actinoalloteichus属和Actinomadura属的成员中观察的全细胞糖模式相似。没有检测到分枝菌酸并且菌株SPRT具有A3γ肽聚糖类型[存在LL-DAP和甘氨酸，如通过TLC-Schleifer &Kandler(1972)确定]。确定主要的脂肪酸是异分枝和反异分枝类型(28％i-C16:0；18％ ai-C15:0；15％ C16:0；14％ ai-C17:0；10％ i-C15:0；8％i-C17:0)，与在厄氏菌属(Oerskovia)，小多孢菌属(Micropolyspora)，糖多孢菌属(Saccharopolyspora)，链霉菌属，糖霉菌属(Glycomyces)和Kitasatospora中观察的模式相似。通过2D TLC分析检测磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺，二磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酰肌醇甘露糖苷和两种未知的磷脂。确定主要的甲基萘醌是MK-9(H4)(60％)和MK-9(H6)(40％)以及痕量的MK-9(H2)(<3％)，关于Actinomadura和Spirillospora属观察到的相同的模式。当在1.0X SSC中确定时，G+C mol％是74.4％(±0.2％)(重复)。
Figure A200780031851D00131
关于菌株SPRT获得1459bp 16S-rDNA序列。BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))搜索显示与链霉菌属成员的97％的同源性。代表孢子囊属的链霉菌菌株，Kitasatospora和Streptacidiphilus属的模式物种以及菌株SPRT的系统树(图2)显示菌株SPRT与链霉菌属的成员簇。
从图3清楚可见，菌株SPRT包含16S-rRNA和23S-rRNA基因的7个拷贝。唯一没有给出清楚结果的酶是EcoRV(泳道4)。链霉菌属的大多数成员具有6个拷贝的rRNA操纵子{rrndb；Klappenbach等，2001)，但是委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)具有七个拷贝(Klappenbach等，2000；La Farina等，1996)。γ变形细菌门(Gamma proteobacteria)的一些成员，如大肠杆菌(Escherichia coli)，弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，沙门氏菌物种(Samonella spp)和鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)已知具有rRNA操纵子的七个拷贝(Acinas等，2004)，其中大肠杆菌的一些菌株具有多达36个拷贝(Klappenbach等，2001)。具有七个拷贝的rRNA操纵子的其它细菌菌株，包括Oceanobacillus iheyensisHTE831T，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)NEM316和无乳链球菌2603 V/R(Acinas等，2004)。Klappenbach等(2001)显示在具有相同数量rRNA操纵子的物种中不存在系统发育关联并且拷贝数取决于细菌的天然环境。
在土壤放线菌中检测到四个和更多的拷贝数，这并不令人惊奇，因为Klappenbach等(2000)显示高拷贝数在变动的环境如土壤中具有益处，在所述环境中高拷贝数将确保快速使用新引入的资源的能力。菌株SPRT具有7个拷贝的rRNA操纵子的事实仅反映菌株在其天然环境中与具有低拷贝数的其它菌株竞争的潜在能力，并且绝不反映其在放线菌类中的系统发育位置。
在系统发育上，菌株SPRT明显与链霉菌属相关，与该属有效描述的成员具有97％的同源性值。由于它们的高度的16S-rRNA序列相似性，Kitasatospora属的成员过去被分类为链霉菌属，即使它们明显具有不同的细胞壁化学型(Anderson & Wellington，2001)。在将具有相似化学分类特征的新菌株引入的情况下，很快清楚该组形成独特的系统发育进化枝并且重新形成了Kitasatospora属(Zhang等，1997)。此外，已经观察到在非孢子囊属成员中的孢子囊属的成员的系统发育簇先于在非孢子囊属马杜拉放线菌属(Actinomadura)成员之间的孢子囊属螺孢菌属(Spirillospora)成员(Zhang等，2001)。
菌株SPRT明显与链霉菌属成员不同：在形态上，在产生孢子囊上其与由链孢囊菌属(Streptosporangium)的成员产生的那些相似，在化学上在其全细胞水解产物中包含的特征糖与关于Actinoalloteichus和马杜拉放线菌属的成员观察的糖相似。菌株SPRT的剩下的化学特征与链霉菌属的那些相似，除了甲基萘醌模式。在菌株SPRT中观察到的主要的甲基萘醌是MK-9(H4，H6)，其与大部分链霉菌[MK-9(H6，H8)]不同并且与马杜拉放线菌属相同。在一些链霉菌，包括S.hebeiensis DSM 41837T(Xu等，2004)，S.scabrisporus NRRL B-24202T(Ping等，2004)，S.scopiformis A25T(Li等，2002)，S.sodiiphilus CIP 107975T(Li等，2005)，S.thermocoprophilus B19T(Kim等，2000)和S.yeochonensis NRRL B-24245T(Kim等，2004)中检测到四氢化的MK-9甲基萘醌。然而，S.scabrisporus NRRL B-24202T是唯一具有MK-9(H4)作为其主要的甲基萘醌的一种的链霉菌。
基于所述的多相分类分析，提议菌株SPRT为链霉菌属的成员。Streptomyces polyantibioticus菌株SPRT(＝DSM 44925T＝NRRL B-24448T)被提议为模式菌株。
Streptomyces polyantibioticus sp.nov.的描述
Streptomyces polyantibioticus(po.ly.an.ti.bi.o′ti.cus.N.L.fem.adj.polyantibioticus-称为产生多种抗生素的能力)。
菌株SPRT在无机盐-淀粉琼脂(ISP 4)上形成棕色基质菌丝体和绒毛(fluffy)，白色的气生菌丝体，在ISP 2上形成皮革样的深棕色基质菌丝体，但是没有孢子形成。在燕麦琼脂(ISP 3)上形成具有白色气生菌丝体的棕色基质菌丝体。基质菌丝体的颜色不是pH敏感性的。在Middlebrook 7H9-葡萄糖琼脂上观察到良好生长。在甘油-天冬酰胺琼脂(ISP 5)上产生深棕色可分散的色素并且在蛋白胨-酵母提取物-铁琼脂(ISP 6)和酪氨酸琼脂(ISP7)上产生黑色素。
针对凝结芽孢杆菌ATCC 7050T、屎肠球菌vanA(万古霉素抗性的)、Enterococcus phoeniculicola JLB-1T、微球菌属物种(临床分离株)，金色分枝杆菌A+和链球菌物种(临床分离株)显示非常强的抗生作用；针对布氏柠檬酸杆菌菌株90(临床分离株)，阴沟肠杆菌菌株67(临床分离株)，大肠杆菌ATCC 25922和产酸克雷伯氏菌菌株K52(临床分离株；对力百汀和头孢呋辛具有抗性)显示弱活性。使用乙酸乙酯：甲醇(100:15，v/v)作为移动相，在硅胶60 F254(默克(Merck))平板上通过薄层层析法分析来自菌丝团的甲醇提取物。通过生物自显影检测5个抗-金色分枝杆菌A+活性斑点。
在存在0.1％ 2-苯基乙醇(但不是0.3％)，0.0001％结晶紫，7％ NaCl(但不是10％)和0.1％苯酚的情况下菌株SPRT生长，但是在叠氮化钠(0.01％)存在的情况下则不生长。还在存在溶菌酶，卷曲霉素(20μg/ml)，头孢噻肟(100μg/ml)，头孢噻啶(100μg/ml)，D-环丝氨酸(50μg/ml)，青霉素G(10i.u.)和紫霉素(8μg/ml)的情况下观察到细菌的生长，但是在存在庆大霉素(100μg/ml)、卡那霉素(10μg/ml)、林可霉素(100μg/ml)、新霉素(50μg/ml)、竹桃霉素(100μg/ml)、雷帕霉素(50μg/ml)、链霉素(100μg/ml)，妥布霉素(50μg/ml)和万古霉素(50μg/ml)的情况下未观察到细菌的生长。在4℃，30℃和pH4.3观察到生长，在37℃和45℃没有观察到细菌的生长。菌株SPRT利用DL-α-氨基正丁酸，L-精氨酸，L-半胱氨酸，L-组氨酸，L-羟脯氨酸，L-苯丙氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-缬氨酸和硝酸钾作为单一氮源；微弱使用L-甲硫氨酸。其利用D(-)果糖，D(-)乳糖，D(+)纤维二糖，D(+)半乳糖，D(+)葡萄糖，D(+)甘露糖，D(+)蜜二糖，D(+)木糖，内消旋肌醇，棉子糖，水杨苷，醋酸钠(0.1％)，柠檬酸钠(0.1％)和海藻糖作为单一碳源(微弱使用核糖)，但是不利用阿东糖醇，D(-)甘露糖醇，D(+)松三糖，胰岛素，L(+)阿拉伯糖，L(+)鼠李糖，蔗糖和木糖醇。
发生H2S生产并且硝酸盐被还原(弱)。在卵黄琼脂上观察到卵磷脂酶和脂酶活性，但是没有蛋白酶活性。水解果胶，但是不水解马尿酸盐(hippurate)。菌株SPRT降解腺嘌呤，七叶苷，熊果苷，酪蛋白，次黄苷，L-酪氨酸，吐温80，黄嘌呤和DNA，但是不降解尿囊素，纤维素，明胶，鸟嘌呤，淀粉，尿素和木聚糖。未观察到自阿东糖醇，α-甲基-D-糖苷，L(+)阿拉伯糖，D(+)纤维二糖，卫矛醇，内消旋赤藓糖醇(meso-erythritol)，D(+)半乳糖，D(+)葡萄糖，甘油，内消旋肌醇，D(-)乳糖，D(-)甘露糖醇，D(+)甘露糖，D(+)松三糖，D(+)蜜二糖，棉子糖，D(+)山梨糖醇，海藻糖和D(+)木糖的酸生产。菌株SPRT能够利用有机酸，乙酸钠，柠檬酸钠，甲酸钠，葡糖酸钠，乳酸钠，苹果酸钠，琥珀酸钠和酒石酸钠。微弱利用丁酸钠，不利用苯甲酸钠，马来酸钠，粘酸钠，草酸钠，水杨酸钠和山梨酸钠。
DNA的G+C含量是74.4％(±0.2％)(1.0 X SSC)。
模式菌株是菌株SPRT(＝DSM 44925T＝NRRL B-24448T)。
在该研究中，分离抗菌剂，纯化并称其为21-57。确定21-57的活性并且其抗结核活性提示使用规范的结构确定方法包括核磁共振(NMR)波谱，质谱法(MS)，红外线光谱法(IR)和X-射线晶体学来阐释化合物的结构。此外，还确定有助于描述所述化合物的化合物的其它物理化学性质。筛选化学数据库来鉴定所述化合物。
发酵和分离
将′S.polyantibioticus′菌株SPR维持在Middlebrook 7H9-葡萄糖琼脂上。接种后，将平板在28℃培养10天，随后使用。
孢子和菌丝团取自10天龄的琼脂平板并且在9个分别包含5ml无菌蒸馏水的通用容器中制备浑浊的(heavy)混悬液。在1升Erlenmeyer烧瓶中，将混悬液用于接种100ml Hacène′s培养基(HM；每升蒸馏水中5.0g葡萄糖，4.0g酵母提取物粉末，10.0g麦芽提取物和1.0g氯化钠，pH7.0)(Hacène & Lefebvre，1995)的9个接种培养物。在30℃，在摇动器上温育所述烧瓶达48小时。将接种培养物用于接种分别包含500ml的HM的9个5升Erlenmeyer烧瓶。再将烧瓶在摇动器上，在30℃培养另外的192小时(8天)，使总发酵时间达10天。
在图4中概括21-57的分离和纯化(方法来自Oki等，1979)。在通过标准革兰氏染色证实培养物纯度后，合并培养物并通过咖啡滤器(咖啡屋(House of Coffees)，1x4大小的滤器)过滤。通过在室温在磁力搅拌器上过夜搅拌，用甲醇从菌丝团以及用乙酸乙酯从培养物滤液提取抗菌化合物。
在浓缩到100ml(通过在通风橱中蒸发)后，合并甲醇和乙酸乙酯提取物，将pH调节到7.0(用pH条检测，默克(Merck))并将样品用1升甲苯通过在室温在磁力搅拌器上过夜搅拌再提取。将甲苯提取物浓缩到100ml(通过蒸发)并用1升醋酸钠缓冲液(pH3.5)提取(过夜，在室温搅拌)。将甲苯层浓缩到10ml(通过蒸发)并将2ml应用到40cm x 4cm(直径的长度)硅胶G(Merck)柱上。将甲苯用作洗脱剂并且在玻璃试管中收集250个5-ml级分。
将金色分枝杆菌A+用作测试生物，通过生物自显影检测级分的活性。合并活性级分，干燥并且重新溶解在甲醇中。沉淀出白色晶体，在溶液中留下黄色的化合物。去除甲醇并使晶体干燥。将晶体再次溶解在2ml甲苯中并置于另外的40cm x 4cm硅胶G(默克(Merck))柱上用甲苯作为洗脱剂来进一步纯化。再一次，收集5-ml级分(150总共)。如前面确定生物活性。合并级分21-57，其包含110mg的纯化的生物活性化合物，被称为21-57。21-57的产率是每升培养物24.44mg。将试剂级别的有机溶剂用在所有的提取物中。
生物性质
将所有的测试细菌培养在LB(Luria-Bertani)肉汤中，除了牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG(Tokyo)，包皮垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)LR222和结核分枝杆菌H37Rv。将分枝杆菌培养在Middlebrook7H9肉汤中，其补充了0.05％(v/v)的吐温80和十分之一体积的AD补充物(5％ BSA，2％葡萄糖溶液，滤器灭菌)。
用在该研究中的测试细菌是：革兰氏阳性-凝结芽孢杆菌ATCC7050T，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCIB 2602，屎肠球菌VanA(万古霉素抗性)，Enterococcus phoeniculicola JLB-1T，微球菌属物种，金色分枝杆菌A+(快速生长，非病原性)，牛分枝杆菌BCG(Tokyo)(快速生长，非病原性疫苗菌株)，包皮垢分枝杆菌LR222(快速生长，非病原性)，结核分枝杆菌H37Rv(ATCC 27294；缓慢生长，病原性)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923(用于抗微生物测试的质量控制菌株)，和链球菌物种(临床分离株)；革兰氏阴性-乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)C91，布氏柠檬酸杆菌90(临床分离株)，阴沟肠杆菌67(临床分离株)，大肠杆菌ATCC 25922(用于抗生素敏感性测试的菌株)，大肠杆菌ATCC 35218(用于抗生素敏感性测试的菌株)，大肠杆菌CA 84-39(链霉素抗性)，大肠杆菌E4(头孢菌素抗性)，产酸克雷伯氏菌K52(对力百汀和头孢呋辛具有抗性)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)K58(对头孢菌素和力百汀具有抗性)，奇异变形菌(Proteusmirabilis)87(临床分离株)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC 27853(用于抗生素敏感性测试的菌株)。
所有的测试细菌在37℃培养，摇动过夜，除了肠球菌(enterococci)和金色分枝杆菌A+，它们被培养2天。牛分枝杆菌BCG(Tokyo)和包皮垢分枝杆菌LR222在37℃静置温育7天，伴随偶尔的手动摇动；将结核分枝杆菌H37Rv在开普敦大学，感染疾病和分子药物研究所，生物安全水平3实验室(Biosafety Level 3 laboratory，Institute of Infectious Diseases andMolecular Medicine，University of Cape Town)，在培养箱中在37℃静置培养9天，伴随间歇搅拌(涉及结核分枝杆菌H37Rv的所有的测试在该生物安全水平3实验室中进行)。在通过标准革兰氏染色(或结核分枝杆菌H37Rv的Ziehl-Neelsen染色)证实培养物的纯度后，在Beckman DU-64分光光度计上在600nm确定测试细菌培养物的光密度并根据培养物用LB或Middlebrook 7H9肉汤调节到0.5(除了没有被稀释的结核分枝杆菌H37Rv；通过与已知OD的包皮垢分枝杆菌LR222培养物比较OD≈0.6)。
通过生物自显影确定纯化化合物的抗微生物光谱。21-57是高度非极性的，其使在液体中确定最小抑制浓度是困难的，并且标准方法如纸片琼脂扩散方法(Kirby-Bauer方法)不能用于确定21-57的抗菌活性。使用Gilson吸移器将一系列微克量(5-100μg)的抗生素以5μl体积点接在硅胶60 F254(默克(Merck))平板上并使其在通风橱中干燥20分钟。点接相同体积(5μl)的有机溶剂作为阴性对照以确保其不是其中溶解21-57杀死细菌的有机溶剂。
结构和物理性质
用装备数字温度计的Reichart-Jung Thermovar熔点装置确定21-57的熔点。用Perkin-Elmer FT-IR分光光度计记录作为氯仿溶液的红外吸收光谱并且使用MALDI-TOF光谱(由开普敦大学，分子和细胞生物系服务提供)确定质谱，通过高分辨率质谱法-由Witwatersrand大学，化学院(Schoolof Chemistry，University of Witwatersrand)(约翰内斯堡，南非)提供服务证实。在600MHz Bruker NMR分光光度计上记录1H和13C NMR光谱-由Stellenbosch大学化学系(南非)提供服务。以δ值(ppm)给出化学位移，其中四甲基硅烷作为内标。在CDCl3(氘化氯仿)和CD3CN(氘化乙腈)中确定所有的光谱。由开普敦大学化学系提供服务进行微量分析。用BeckmanDU-64分光光度计确定UV/VIS吸收光谱(溶解在甲醇中的21-57)。
通过将10mg的21-57溶解在400μl甲醇中制备用于X-射线晶体学的晶体。将容器用石蜡膜覆盖并且用无菌针在石蜡膜上打孔使溶剂缓慢蒸发。将样品在4℃留置5天。
使用石墨-单色Mo Kα辐射(在113K的0.7107
Figure A200780031851D0020141620QIETU
)在NoniusKappaCCD衍射计上测量单晶体X-射线衍射数据。在每种情形中记录一系列构架，每个Φ或ω宽1°(k≠0)以确保收集的数据完全到θ>27°。将晶胞从前面10个构架做索引并且与衍射计常数一起重新精制(refine)位置数据以得到最终的晶胞参数。整合和标度(scaling)[DENZO，Scalepack(Otwinowski & Minor，2000)]通过组合等价反射和总体积的平均，和标度校正，得到关于Lorentz-极化效应和关于晶体腐蚀和吸光度效应的校正的独特的数据组。使用SHELXS-97解析结构并且使用全矩阵最小平方方法，在程序XSEED的协助下(Barbour，2003)在SHELXL-97中精制(Sheldrick，1997)。
将所有的非氢原子各向异性地塑模，同时给所有的氢原子排布同向性的热参数，所述参数是它们母体原子的1.2倍，并且使用′riding′模型重新精制。使用程序POV-RAY(对于窗口POV-RAYTM，2003)呈递晶体和分子结构的图像。(详情由开普敦大学，化学系，X-射线衍射晶体分析单位的Susan Bourne副教授友情提供)。
对于薄层层析(TLC)，使用硅胶60 F254平板(默克(Merck))。为了分析化合物的纯度，将21-57在TLC平板上用100％甲苯作为移动相进行层析并且用50％硫酸或硫酸铈(IV)铵[将30ml硫酸加入500ml蒸馏水中，加入63.0g的硫酸铈(IV)铵，并将其用蒸馏水稀释到1升]喷雾并在100℃加热以显色。还用碘蒸汽和在254nm的UV照射检测所述化合物。还使用显示糖基团[2ml苯胺(Saarchem)，3.3g邻苯二甲酸(西格玛(Sigma))，溶解在100ml的水饱和的正丁醇中]和伯氨基基团(0.1％在丙酮中的水合茚三酮，w/v)存在的显色剂。
21-57(2，5-二苯基-1，3-噁唑，PPO)：白色结晶固体，m.p.70-72℃(与DOSE相似，第二电子版，2004)；Rf＝0.47(硅胶，100％ CHCl3)；IR(CHCl3)vmax 3071.03，3011.51，1590.58，1483.39，1448.08，1133.10，1026.97cm-1；1HNMR(600MHz，CD3CN)δ 8.18(dd，J＝7.7，1.5Hz，2H)，7.86(dd，J＝8.2，1.3Hz，2H)，7.62-7.53(m，6H)，7.44(t，J＝7.4Hz，1H)；13C NMR(600MHz，CD3CN)δ 161.15，151.25，130.31，128.92，128.80，128.42，128.02，127.46，126.27，124.19，123.44；关于C15H11NO[M+H+]计算HRMS221.08406，实测值221.08178(与Nicolaou等，2004相似)。
21-57的抗菌活性
将针对各种测试细菌的最小抑制量的生物活性化合物，21-57显示在表2中。化合物似乎具有较宽的活性谱，但是没有特异性的活性模式，如在其抑制一些革兰氏阳性和一些革兰氏阴性细菌的生长的能力中观察到的。针对下列细菌-革兰氏阳性-凝结芽孢杆菌ATCC 7050T，Enterococcusphoeniculicola JLB-1T，金黄色葡萄球菌ATCC 25923和链球菌物种(临床分离株)；和革兰氏阴性-乙酸钙不动杆菌C91，布氏柠檬酸杆菌90，阴沟肠杆菌67，大肠杆菌CA84-39(链霉素抗性)，大肠杆菌E4(头孢菌素抗性)，产酸克雷伯氏菌K52(β-内酰胺酶生产菌株)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)K58(对所有的头孢菌素和力百汀具有抗性)，和奇异变形菌(Proteus mirabilis)87没有观察到活性。
所述化合物显示针对三种不同的分枝杆菌的活性，其中牛分枝杆菌BCG(Tokyo)是最敏感的，随后是结核分枝杆菌H37Rv(生物自显影结构显示在图5中)和金色分枝杆菌A+。
结构阐释和物理性质
将21-57的物理-化学性质列在表3中。将所述化合物纯化为白色结晶固体并且在非极性有机溶剂(例如，已烷，甲苯，乙酸乙酯和氯仿)中比在极性溶剂(例如乙醇和甲醇)中更容易溶解，在水中不可溶。为了表征21-57，研究了在TLC板上的与各种喷雾试剂的反应。所述化合物显示与水合茚三酮(测试伯氨基基团存在)或与糖显色剂没有反应。
用碘蒸汽(存在双键)和50％硫酸观察到阳性反应。在暴露于酸化的硫酸铈(IV)铵并加热后，大多数化合物显示黑色。然而，21-57显示白色，指出所述化合物可能已经在氧化状态中。所述化合物还显示当TLC平板用UV射线在254nm照射时，在254nm的吸光度。
表2 当针对各种测试细菌进行测定时，生物活性化合物21-57的最小抑制量(μg)
 
测试细菌 最小抑制量(μg)
革兰氏阳性细菌 凝结芽孢杆菌ATCC 7050 >100
巨大芽孢杆菌NCIB 2602 ≤5
屎肠球菌VanA ≤5
Enterococcus phoeniculicola JLB-1T >100
微球菌物种 ≤5
金色分枝杆菌A+ 50
牛分枝杆菌BCG(东京) ≤5
包皮垢分枝杆菌LR222 >30*
结核分枝杆菌H37Rv 30
金黄色葡萄球菌ATCC25923 >100
链球菌物种 >100
革兰氏阳性细菌 乙酸钙不动杆菌C91 >100
布氏柠檬酸杆菌90 >100
阴沟肠杆菌67 >100
 
大肠杆菌ATCC 25922 ≤5
大肠杆菌ATCC 35218 ≤5
大肠杆菌CA 84-39 >100
大肠杆菌E4 >100
产酸克雷伯氏菌K52 >100
肺炎克雷伯氏菌K58 >100
奇异变形菌87 >100
铜绿假单胞菌ATCC 27853 25
*这是针对该菌株的测试的最高量；
·5μg是针对所有的测试细菌测试的最低量并且≤5显示所述细菌被该量所抑制，但是可以对更低的量敏感
·>100显示测试细菌的生长没有在达到100μg的量被抑制
表3：21-57的物理化学性质
 
性质 结果
外观 白色微晶
气味 稍甜气味
熔点(℃) 70-72
分子式 C15H11NO
分子量(MALDI-TOF) 221.631
分子量(高分辨率MS) 221.08178
计算的分子量 221.08406(C15H11NO)
UV-VIS(λmax；MeOH；nm) 303(ε＝600)216(ε＝4900)
IR(CHCl3)cm-1 3071.03；3011.51；1590.58；1546.02；1483.39；1448.08；1133.10；1058.22；1026.97；953.65；912.38；828.90；779.09                                                
溶解性 在非极性有机溶剂中溶解性最好；在极性有机溶剂中溶解性较差；在水中不可溶                      
TLC(Rf；100％ CHCl3) 0.47
所述化合物的熔点是70-72℃并且该化合物的UV/VIS光谱显示在303nm和216nm的强吸光度。甲醇中所确定的摩尔消光系数显示在表3中。IR光谱指示下列情形的存在：C＝C-H(>3000cm-1)，缀合于环状-C＝N和C＝C键伸展(bond stretches)(1400-1600cm-1)，C-O(1000-1200cm-1)和芳香C-H弯曲(700-900cm-1)。
通过微量分析和高分辨率MS和MALDI-TOF MS结果确定21-57的分子式，C15H11NO。通过X-射线晶体学数据阐释21-57的结构并且通过1HNMR，13C NMR，DEPT实验，和2D NMR光谱(1H-1H COSY，HMQC和HSQC)证实。
将21-57的晶体结构显示在图6中。通过X-射线结晶数据的证实结构进行NCBI Pubmed化合物数据库的搜索，并且将21-57鉴定为已知结构2，5-二苯基噁唑。
1H和13C光谱和DEPT实验证实在21-57中存在15个碳原子和11个质子，其中所有的碳是芳香的，并且4个是在δ 161.15(C5)，151.25(C2)，128.02(C11)和127.46(C21)的季碳。1H NMR和13C NMR光谱的排布显示在表4中。NMR数据对应于Nicolaou等(2004)关于2，5-二苯基噁唑获得的数据。
表4：抗菌剂21-57的NMR光谱数据和排布(所有的数据在CD3CN中在600MHz收集)
 
位置 原子 13C，δ 原子 1H，δ(信号*，J，以Hz为单元)
1 O-1 - -
2 C-2 161.15
3 N-3 - -
4 C-4 123.44 H-4 7.62(m)
5 C-5 151.25
11 C-1’ 128.02
12 C-2’ 126.27 H-2’ 8.18(dd.7.7)
13 C-3’ 128.80 H-3’ 7.59(m)
14 C-4’ 130.31 H-4’ 7.59(m)
15 C-5’ 128.80 H-5’ 7.59(m)
16 C-6’ 126.27 H-6’ 8.18(dd.7.7)
21 C-1” 127.46
22 C-2” 124.19 H-2” 7.74(dd.8.2)
23 C-3” 128.92 H-3” 7.56(m)
24 C-4” 128.42 H-4” 7.35(t，7.4)
 
25 C-5” 128.92 H-5” 7.56(m)
26 C-6” 124.19 H-6” 7.74(dd，8.2)
关于信号的缩写：dd＝双峰的双峰；t＝三峰；和m＝多峰
化合物21-57从发酵肉汤和′S.polyantibioticus′菌株SPR的菌丝团中分离。化合物的结构阐释容许将21-57鉴定为2，5-二苯基噁唑(PPO)。充分了解PPO作为闪烁流体的主要成分或作为发光团的性质(lonescu等，2005；Semenova等，2004；Hariharan等，1997；Agnew等，1995)。其广泛应用于激光染料并且作为“用于生物医疗测定的标记和探针”(Semenova等，2004)。从未报道过该化合物从天然来源即细菌的产生。其通过工业合成产生。
关于如在图6中所显示的21-57的晶体结构进行碳和质子NMR信号的完全排布。最初，所有的NMR光谱在CDCl3中确定，但是1H信号中的一些以这样的方式重叠使排布难以进行。当在CD3CN中确定NMR光谱时，某些质子信号以这样的方式位移从而容许进行进一步的分析。为了描述目的，将噁唑环左侧的苯环称为环B，而将右侧的苯环称为环A。NMR数据与Nicolaou等(2004)的数据对应良好，尽管没有充分报道信号的详细排布。
在噁唑环中，存在两个季碳。在位置C2的碳最受邻近的氧和氮的去屏蔽效应的影响并且因此具有所有的碳的最远的化学位移低磁场。因此在δ 161.15共振的碳被指定到C-2。另一个季碳在位置C-5。预期该碳具有第二高的化学位移低磁场，这是因为在噁唑环中的氧的去屏蔽效应。因此，将具有化学位移δ 151.25的碳指定到该位置。
通过1H-1H COSY分析，在δ 7.62(m)的质子没有与在21-57中的其它质子的任一个偶联。该质子与在δ 123.44的碳键合，如通过HSQC数据所确定的。从HMQC数据确定该碳与任何其它的质子不具有远程的关联，但是在δ 7.62的质子与C-2(δ 161.15)和C-5(δ 151.25)这两个在噁唑环中的季碳具有远程关联，由此证实该碳和质子指定到位置4的排布。在其它的两个季碳中，在δ 128.02的碳是与在δ 127.46的碳相比更进一步的低磁场，显示其也受在噁唑环上的氧和氮的去屏蔽效应的影响并且可以指定为在环A的位置C-1’的碳。因此，在δ 127.46的碳可以被指定为在环B中的碳，所述环B与噁唑环(C-1＂)键合。
在δ 8.18(dd)共振的两个质子位移了所有质子的最远的低磁场，说明它们的化学位移受到噁唑环中氧和氮的吸电子效应的影响。此外，尽管在信号中具有一些精细结构，其实质上是关于一个大和一个小偶联的双峰的双峰，提示邻位和间位偶联。因此，通过关于小的远程对位偶联的证据，将信号指定到H-2′和H-6′。通过HSQC数据，使在δ 126.27的两个碳直接与质子H-2′和H-6′关联，并且因此将该信号指定到C-2′和C-6′。1H-1H COSY数据还显示H-2′和H-6′与以δ 7.59为中心的复合信号偶联并且关于三个质子整合。因此，将该三个质子多峰指定到环A其余的三个质子H-3′，H-4′和H-5′。通过HSQC光谱观察到在δ 7.59的多峰与在δ 128.80的两个碳和在δ 130.31的一个其它的碳关联。由于C-3′和C-5′在相同的环境中，这些被指定到前者，而C-4′被指定到后者。
如上提及，在δ 127.46的碳被指定到环B中的C-1＂。通过所述HMQC光谱，该碳与四个质子具有远程关联，两个具有δ7.86(dd)的化学位移，其它的两个具有δ 7.56(m)的化学位移。如上关于在δ 8.18的信号所陈述的，在δ 7.86的信号可以被指定到环B中的H-2＂和H-6＂。从HSQC光谱可见，该信号与在δ 124.19的碳信号关联，其因此被指定为在环B中的C-2＂和C-6＂。在δ 7.56的两个质子与具有化学位移δ 128.92的两个碳结合(如从HSQC光谱所见)。将这些碳指定到C-3＂和C-5＂。其余的在C-4＂的碳在δ 128.42共振，这根据HSQC光谱与在δ 7.35作为三峰共振的质子结合。此外，HMQC光谱证实H-4＂和C-2＂，C-3＂，C-5＂和C-6＂的远程关联，证实其在环B中的存在和排布。
甚至即使两个苯环在结构上是相同的，它们在其化学和磁性环境中显著不同。环A被噁唑环的氧和氮的吸电子效应所影响，而环B是相对富含电子的，导致观察到独特的化学位移。此外，H-4似乎不与环B中的任一质子远程偶联的事实显示尽管分子似乎在晶体形式上是平面的，在C-5-C-1＂键的周围可能存在溶液中的一定程度的旋转，这可能是因为释放一些由H-4和H-2＂在平面构象中的相互作用导致的一些空间张力。
为了理解菌株SPR怎样能够合成21-57，必须考虑化合物的成分以及它们在自然中是怎样合成的。21-57的核心包含噁唑部分。噁唑是5元芳香杂环，其包含氧和氮(Yeh，2004)。噁唑由基于肽的天然产物的酶促翻译后修饰产生。通常涉及非核糖体肽合成酶(Walsh，2004；Keating等，2000)。如可以在图7中观察到的，丝氨酸或苏氨酸的环化脱水作用产生二氢杂芳香的噁唑啉。噁唑啉的双电子氧化又产生噁唑作为核心结构。在噁唑啉中的碳-氮键的还原产生噁唑烷酮环(Yeh，2004；Roy等，1999；Milne等，1998)。所有这三种氧化状态可以见于天然产物中。如果起始的构件是半胱氨酸，相应的过程将产生噻唑啉，噻唑和噻唑烷酮(Roy等，1999；Milne等，1998)。噁唑/噻唑产生的过程需要5±1ATP/GTP分子/产生的噁唑/噻唑(Milne等，1998)。
起初认为天然存在的噁唑是稀少的直到19世纪80年代越来越多的研究证实其在自然中的普遍存在(Yeh，2004)。Noltemeyer等(1982)提示在链霉菌中筛选次生代谢物通常是片面的并且目的分子，如噁唑衍生物通常因为它们通常缺乏生物活性而没有被纯化，产生噁唑在自然中是稀少的这种概念。
在表5和图8中，列出和显示了大多数已知包含噁唑的天然生物活性化合物。为什么这么多研究者对噁唑和噻唑感兴趣的主要原因是它们与广泛种类的细胞内细菌靶标，尤其是蛋白质，RNA和DNA相互作用的能力(Walsh，2004；Milne等，1998)。从表5中的包含噁唑的天然生物活性化合物的多样的生物性质来看，这些能力是明显的。
令人感兴趣注意的是，这样化合物的许多已经从海洋海绵，海鞘或seaplume分离的事实。Bérdy(2005)警告许多从海洋无脊椎动物中分离的化合物通常可归于它们的微生物共生生物，尤其是如果考虑到所述共生生物典型地构成海洋生物生物量的40到60％。此外，要留心的预兆是从实际海洋生物中分离的相对低量，例如diazonamide A通常是化学合成的焦点，因为其是这样缺乏并且不容易从其已知来源中分离(Bérdy，2005；Yeh，2004)。
某些合成的抗生素还包含噁唑官能团。一些属于公知的抗生素种类，β-内酰胺，例如异噁唑青霉素噁西林。其包含噁唑官能团的侧链提供结合青霉素酶的空间位阻。这些青霉素具有比甲氧西林更强的体外活性，但是由于它们在血清中的短的半衰期，它们在体内的活性与甲氧西林的活性是相似的(Lancini等，1995)。
两种氨磺酰药物，磺胺甲噁唑和磺胺曲沙唑是磺胺的衍生物，其中磺胺的一个氢分别被甲基噁唑和二甲基噁唑取代(Prescott等，1996)。
噁唑啉和噁唑烷酮也在抗菌中出现。苯基噁唑啉具有通过抑制脂质A产生抑制某些革兰氏阴性细菌生长的能力，所述脂质A是在大多数革兰氏阴性细菌的外膜中发现的分子(Jackman等，2000)。噁唑烷酮首先在19世纪80年代鉴定(Tanitame等，2004)。这种新的抗菌类别是合成的并且在蛋白质合成的早期阶段发挥作用-一种新的作用机制。它们典型地靶向革兰氏阳性细菌，包括结核分枝杆菌的敏感的和抗性菌株，甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌，万古霉素抗性的屎肠球菌和青霉素抗性的肺炎链球菌的菌株(Sood等，2005；Sbardella等，2004)。最为熟知的噁唑烷酮是利萘唑胺和依哌唑胺。
表5：具有噁唑官能团的天然化合物，它们的起源和它们的生物功能
 
化合物 分离起源 生物性质 参考文献
2-乙基-5-(3-吲哚基)噁唑 放线菌：肉桂链霉菌(Streptomycescinnamomeus)Tü89(非模式菌) 无抗细菌或抗真菌活性；与pimprinethine相关 Noltemeyer等(1982)
Bengazole A 海洋海绵：Jaspis sp.  抗真菌(可能形成可渗透离子的孔的作用模式)   Yeh(2004)
BistratamidesCeratospongamideCyclodideminamideDendroamide多拉司他汀ELeucamide ALissodinamidesNostocyclamideTrunkamide       蓝细菌，海洋海绵和海鞘 细胞毒性，抗细菌抗病毒并且一些作用为抗肿瘤药剂 Yeh(2004)
Calyculins 海洋海绵：Discodermia calyx 细胞毒性；抑制蛋白质磷酸酶1和2A          Yeh(2004)Roy等(1999)
Diazonamide A 海洋海鞘(海鞘)： 抗癌 Roy等(1999)Lindquist和Fenical
 
Diazona chinensis (1991)
Disorazole C1 滑行细菌：纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)   细胞毒性和中度抗真菌 Yeh(2004)
Hennoxazole A 海洋海绵：多丝海绵属物种(Polyfibrospongiasp.)             针对I型单纯疱疹病毒具有抗病毒活性；末梢止痛活性；抗真菌；细胞毒性和驱虫性             Roy等(1999)Ichiba等(1991)
Homopseudopteroxazole                 Sea plume：Pseudopterogorgiaelisabethae        抗结核 Rodriguez &Rodriguez(2003)
Leucascandrolide A 海洋海绵：Leucascandracaveolata     细胞毒性和强抗真菌 Yeh(2004)
Madumycin，维吉霉素和灰绿菌素(组A链阳性菌素抗生素) 放线菌：黄色马杜拉放线菌(Actinomaduraflava)(madumycin)弗吉尼亚链霉菌(Streptomycesvirginiae)(维吉霉素)灰绿链霉菌(Streptomycesgriseoviridis)&灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)(灰绿菌素)       当与组B链阳性菌素抗生素一起给药时，具有强协同作用。市售为Synercid(Aventis)，用于治疗由万古霉素抗性的革兰氏阳性细菌导致的感染 Yeh(2004)
小菌素B17 革兰氏阴性细菌大肠杆菌       抗细菌-DNA旋转酶抑制剂 Roy等(1999)Milne等(1998)
Muscoride A 淡水蓝细菌属：灰色念珠蓝细菌(Nostoc muscorum) 弱抗菌活性 Yeh(2004)
Mycalolide A，ulapualide A，kabiramides，halichondramides和jaspiramides      海洋海绵 抗白血病，抗真菌，鱼毒素性的；并抑制肌动球蛋白Mg2+-ATPase            Yeh(2004)
Oxazoiomycin 放线菌：白色链霉菌JA3453(不是模式菌) 抑制根癌形成；毒害植物的；针对根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)具有抗细菌活性，但是针对其它细菌 Kanzaki等(1998)
 
几乎没有抗细菌活性
Phorboxazoles 海洋海绵：雏海绵属物种(Phorbas sp.) 抗真菌和抗肿瘤(在细胞周期的S相的细胞捕获)  Yeh(2004)
Pimprinethine 放线菌：橄榄网状链轮丝菌(Streptoverticilliumolivoreticuli)(再次分类为橄榄网状链霉菌) Noltemeyer等(1982)
Pimprinine 放线菌：′Streptomycespimprina′(未正式公开)                 抗癫痫 Noltemeyer等(1982)
原始霉素IIA 放线菌：′Streptomycespristinaespiralis′(未正式公开)       与madumycin和维吉霉素相同 Canu & Leclercq(2001)Roy等(1999)      
硫肽抗生素：Promothiocin AThioxamycin硫霉素 放线菌：链霉菌属物种，SF2741链霉菌属物种.DP94绿色产色链霉菌硫霉素变种(Streptomycesviridochromogenesvar，sulfomycini nov.var.)MCRL-1368      抗细菌-与23S rRNA和核糖体蛋白L11的复合物结合 Yeh(2004)Roy等(1999)Yun等(1994)Egawa等(1969)
Telomestatin 放线菌：环圈链霉菌(Streptomycesanulatus)3533-SV4(不是模式菌) 抗癌(端粒末端转移酶抑制剂) Shin-ya等(2001)
Thiangazole 滑行细菌足囊菌属物种(Polyangium sp) 细胞毒性；抗-HIV-1 Roy等(1999)Yeh(2004)  
图8包含在表5中提及的化合物的一些化学结构。对于在图8中的化学结构的参考与在表5中指出的参考相同的。
根据Lancini等(1995)，存在许多确定新抗生素的生物合成途径的步骤，即：1鉴定涉及的初级代谢产物；2分离并且鉴定在所述过程中产生的任何中间体；3鉴定能够催化这些反应的任何酶；和4鉴定生物合成基因簇，包括涉及的基因的序列和组成。理想地，按照所列出的这些步骤，但是关于遗传和重组DNA技术，步骤4通常在获得生物化学证据前首先完成(Lancini等，1995)。
Roy等(1999)讨论yersiniabactin，一种由鼠疫耶尔森氏菌产生的铁载体的生物合成。合成典型地通过非核糖体的肽合成酶机制实现。生物合成基因簇由两个催化亚基，高分子量蛋白质2和1(HMWP2和HMWP1)组成。HMWP2包括具有芳基载体蛋白(ArCP)的起始亚基，通过salicoyl-AMP连接酶(YbtE)的催化作用，其被水杨酸酯(salicylate)酰化。亚基的剩余部分由C’结构域和A结构域组成，其激活半胱氨酸为Cys-AMP。紧接下游的是PCP结构域，如可以在图9a中观察到的。如果YbtE，HMWP2，ATP，半胱氨酸和水杨酸酯在一起温育，时间依赖性催化过程导致形成(羟苯基)噻唑啉-半胱氨酸加合物和(羟苯基)噻唑啉羧酸酯(图9b)。理论上，如果A结构域具有以与半胱氨酸类似的方式激活L-苯基丝氨酸的能力，获得的终产物中的一种将是具有连接的另外的苯基(来自L-苯基丝氨酸)的(羟苯基)噁唑啉羧酸酯。噁唑啉的另外的去羧化作用，去羟基化作用和两个电子的氧化作用导致形成2，5-二苯基噁唑。对于菌株SPR合成2，5-二苯基噁唑，其必须具有HMWP2的截短形式或与HMWP2相似，利用半胱氨酸的能力将由L-苯基丝氨酸取代并且另外的酶促过程将必须发生(去羧化作用，去羟基化作用和氧化反应)。
噁唑是否在其所存在的较大分子，例如普那霉素的作用模式中具有任何作用是不确定的。根据Lancini等(1995)，存在三种研究新抗生素的作用模式的方式：1.在完整的细胞中；2.在部分纯化的无细胞系统中；和3.在一种或多种纯化的酶系统中。然而，存在两种基本的规则，其可以用于预测作用模式：1.如果所述新的抗生素具有与已知抗生素相似的结构，可以预期它们具有相同的作用模式；和2.如果新的抗生素与细菌代谢的中间体具有相似的结构，可以预期抗生素可以作用为该中间体的拮抗剂起作用。因此，可能的是21-57可以通过DNA的插入抑制细菌生长，尤其是当考虑到分子具有成为平面的能力，与吖啶橙相似(使其作为DNA嵌入试剂作用的三个稠合的杂环)，但是这仍旧只是推测，有待实验证实。
根据菌株SPR产生抗菌剂的巨大能力来分离和纯化21-57。PPO的抗菌能力以前没有进行测试，这可能是因为其荧光能力被考虑为其最重要的性质。根据PPO的物质安全数据表(Material Safety Data Sheet(MSDS))，所述化合物显示低水平的毒性，当以腹膜内给药时，具有750mg/kg小鼠的LD50。这有利地与下列已知抗生素的LD50值比较：红霉素LD50＝660mg/kg；四环素，LD50＝200-300mg/kg；和雷帕霉素LD50＝340mg/kg(所有的都关于在小鼠的腹膜内应用确定)(Lancini等，1995)。对于其它药物上重要的抗生素的LD50值是：氯霉素LD50＝1320mg/kg；青霉素G LD50＝3490mg/kg；链霉素LD50＝1400mg/kg和林可霉素LD50＝1000mg/kg(Lancini等，1995)。
PPO被考虑的一个方面是其在人中通过芳基烃羟化酶(HH)代谢的事实。酶AHH与癌症形成相关-酶的诱导导致多环芳香烃代谢为致癌性反应性代谢物(Ahokas等，1987；Mutch等，1985)。由于其荧光能力，PPO被体内测试为AHH的底物并且其代谢导致产生另外的荧光化合物。其可以因此用于研究作用机制和AHH的诱导性。Mutch等(1985)还确定PPO在小鼠中是通过单加氧酶细胞色素P-450氧化代谢，在人肝微粒体中通过一些细胞色素P-450同工酶氧化代谢。PPO明显被识别为潜在的毒性剂并且因此被单加氧酶所靶向。这可以排除PPO作为抗结核药剂的应用。
作为结论，21-57或2，5-二苯基噁唑可以潜在地用作抗结核药剂：其具有低细胞毒性，其在体外针对结核分枝杆菌H37Rv具有活性，并且可以从许多化学供应者大量获得。还将所述化合物用作其它包含噁唑的化合物的化学合成的起始点，其可以以产生其它抗结核药物的目标进行开发。PPO针对结核分枝杆菌的体内活性需要如Sood等(2005)推荐确定并且在考虑该化合物作为潜在的抗结核药物的任何进一步的发展之前，需要考虑/测试人体内中通过AHH的降解的可能性。
在本文包括下列参考文献作为参考。
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权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.菌株类型SPRT的分离的微生物(＝DSM 44925T＝NRRLB-24448T)。
2.根据权利要求1的微生物，其是放线菌菌株。
3.根据权利要求1和2任一项的微生物，其来自链霉菌属(Streptomyces)。
4.根据权利要求3的微生物，其来自链霉菌科(Streptomycetaceae)。
5.根据权利要求4的微生物，其中所述微生物是Streptomycespolyantibioticus。
6.根据权利要求5的微生物，其包括GenBank登记号DQ141528(16S-rDNA-序列)的遗传物质(SEQ ID NO：4)。
7.生物纯培养物，其具有GenBank登记号DQ141528(16S-rDNA-序列)的鉴定特征。
8.放线菌菌株SPRT(＝DSM44925T＝NRRL B-24448T)。
9.生产2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物的方法，所述方法包括从菌株类型SPRT的微生物(＝DSM 44925T＝NRRL B-24448T)回收2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物。
10.2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物，其是从具有GenBank登记号DQ141528(16S-rDNA-序列)的鉴定特征的菌株类型SPRT的分离的微生物(＝DSM 44925T＝NRRL B-24448T)回收。
11.2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物作为抗菌剂的应用，包括用于治疗流感，结核和/或其它细菌感染的应用，所述2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物从菌株类型SPRT的分离的微生物(＝DSM 44925T＝NRRL B-24448T)回收。
12.用作抗菌剂的组合物，所述组合物包含有效量的2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物，所述2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物从菌株类型SPRT的分离的微生物(＝DSM 44925T＝NRRL B-24448T)回收。
13.2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物，用作抗菌剂，所述2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物从菌株类型SPRT的分离的微生物(＝DSM 44925T＝NRRL B-24448T)回收。
14.从菌株类型SPRT的分离的微生物(＝DSM 44925T＝NRRLB-24448T)回收的2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物，用于制备用作抗菌剂的药物，包括用于治疗流感，结核和/或其它细菌感染的应用。
15.2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物用于制备用作抗菌剂的药物的应用，包括用于治疗流感，结核和/或其它细菌感染的应用，所述2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物从菌株类型SPRT的分离的微生物(＝DSM 44925T＝NRRL B-24448T)回收。
16.GenBank登记号DQ141528(16S-rDNA-序列)的分离的多核苷酸。
17.分离的多核苷酸序列，其包括GenBank登记号DQ141528(16S-rDNA-序列)的多核苷酸。
18.根据本发明的分离的微生物，基本如前文所述或举例。
19.根据本发明的分离的多核苷酸序列，基本如前文所述或举例。

Claims (19)

1.菌株类型SPRT的分离的微生物(＝DSM 44925T＝NRRL B-24448T)。
2.根据权利要求1的微生物，其是放线菌菌株。
3.根据权利要求1和2任一项的微生物，其来自链霉菌属(Streptomyces)。
4.根据权利要求3的微生物，其来自链霉菌科(Streptomycetaceae)。
5.根据权利要求4的微生物，其中所述微生物是Streptomycespolyantibioticus。
6.根据权利要求5的微生物，其包括GenBank登记号DQ141528(16S-rDNA-序列)的遗传物质(SEQ ID NO：1)。
7.生物纯培养物，其具有GenBank登记号DQ141528(16S-rDNA-序列)的鉴定特征。
8.放线菌菌株SPRT(＝DSM44925T＝NRRLB-24448T)。
9.生产2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物的方法，所述方法包括从菌株类型SPRT的微生物(＝DSM44925T＝NRRLB-24448T)回收2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物。
10.2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物，其从具有GenBank登记号DQ141528(16S-rDNA-序列)的鉴定特征的微生物回收。
11.2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物作为抗菌剂的应用，包括用于治疗流感，结核和/或其它细菌感染的应用。
12.用作抗菌剂的组合物，所述组合物包含有效量的2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物。
13.2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物，用作抗菌剂。
14.2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物，用于制备用作抗菌剂的药物，包括用于治疗流感，结核和/或其它细菌感染。
15.2，5-二苯基噁唑或其变体或衍生物用于制备用作抗菌剂的药物的应用，包括用于治疗流感，结核和/或其它细菌感染的应用。
16.GenBank登记号DQ141528(16S-rDNA-序列)的分离的多核苷酸。
17.分离的多核苷酸序列，其包括GenBank登记号DQ141528(16S-rDNA-序列)的多核苷酸。
18.根据本发明的分离的微生物，基本如前文所述或举例。
19.根据本发明的分离的多核苷酸序列，基本如前文所述或举例。
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