WO2011050547A1

WO2011050547A1 - 连作黄瓜、西瓜枯萎病的生物防治菌株及其微生物有机肥料

Info

Publication number: WO2011050547A1
Application number: PCT/CN2009/075076
Authority: WO
Inventors: 沈其荣; 陈立华; 杨兴明; 徐阳春; 黄启为; 沈标; 冉炜
Original assignee: 南京农业大学; 江苏新天地生物肥料工程中心有限公司
Priority date: 2009-10-29
Filing date: 2009-11-23
Publication date: 2011-05-05
Also published as: EP2514815A4; EP2514815B1; KR101010762B1; CN101696390A; EP2514815A1; AU2009292606A8; AU2009292606A1; US20110214464A1; CN101696390B; AU2009292606B2

Description

连作黄瓜、西瓜枯萎病的生物防治菌株及其微生物有机肥料技术领域

本发明涉及连作黄瓜、西瓜枯萎病的生物防治菌株及其制成的微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术领域，专用于克服和消除连作黄瓜、西瓜枯萎病问题。背景技术

黄瓜和西瓜是我国重要的经济作物，其产量高低和质量的优劣关系着国计民生。黄瓜、西瓜枯萎病是黄瓜和西瓜的主要病害之一，尤其在保护地种植中危害严重。黄瓜的枯萎病于 1943年首次在荷兰报道，在 1949年曾经使美国弗罗里达州黄瓜损失 40%以上，连作的第三个季节植株的感染率达到 70% 以上。目前，在我国高度集约化的黄瓜、西瓜产地，枯萎病发病严重时产量损失 90%左右。黄瓜、西瓜枯萎病是一种土传性真菌病害，该病广泛分布于全世界的热带、亚热带和一些温暧的地区。黄瓜、西瓜枯萎病致病菌镰刀菌 (Fusarium oxysporum) 能通过土壤、流水（灌溉等）、种子等方式传播，对环境有很强的适应能力。镰刀菌侵染化黄瓜，会造成黄瓜出土前或者出土后的猝倒病，顶端的茎蔓萎蔫，植株的茎基部维管束坏死，然后整株枯萎。镰刀菌会导致西瓜苗期的猝倒、皮层的腐化和植株矮化，会导致较老的植株的突然或者逐渐的萎蔫。在高温高湿的条件下，病害发展迅速，发病严重的田块发病率达 100%，造成绝收。

另一方面，水稻、小麦、玉米、油菜等作物秸秆就地焚烧、规模化养殖后的畜禽粪便随地弃置等不仅严重污染了环境，也极大地浪费了能作为有机肥和生物有机肥产品的原料；大量的养分资源（C、 N、 P、 K、 S及微量元素）流失于土壤-植物系统之外，明显地削弱了我国农业可持续发展的能力。如何将从土壤中因收获作物取走的营养元素最大限度地归还到土壤中去，唯一的途径就是将这些固体有机废弃物制成商品有机肥，再施入土壤。如果将这些固体有机废弃物经过高温发酵合成高品位的有机堆肥，再用于功能菌的载体，所制成的微生物有机肥料功能明确，将会有很好的应用前景。发明内容

技术问题本发明的目的在于研制一种能防除黄瓜、西瓜枯萎病的拮抗微生物有机肥料，大田防治效率达到 80%以上，使连作障碍土壤得到生物修复，确保集约化农业的顺利发展。

技术方案

用于防除连作黄瓜、西瓜枯萎病的生物防治菌株，该菌株 SQR-T037属于哈茨木霉 ( Tri choderma harzianum , 2009年 9月 22 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为 CGMCC No.3308 , 主要生物学特性为：在 PDA培养基上最佳的生长温度是 30°C，培养时间为 96个小时的时候，菌落直径可达 90mm，布满整个平皿，在培养基中产生黄色的色素。分生孢子梗呈瓶状，对生，分生孢子椭圆型，长 2.3-3.5 μ ηι, 宽 2.0-3.2 μηι，表面光滑，孢子的颜色开始的时候是黄绿色，然后慢慢的变成深绿色。

用上述生物防治菌株所生产的防除连作黄瓜、西瓜枯萎病的微生物有机肥料，该肥料中生物防治菌株 SQR-T037菌落形成单位 1 10⁸个以上、全氮质量比含量为 4〜5% ，全氮中质量比 90%以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为 6〜10%、有机质质量比含量为 30〜35%。

所述防除连作黄瓜、西瓜枯萎病的微生物有机肥料的生产方法，包括：

1 )将 SQR-T037接种到 PDA培养液，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：发酵初始 pH范围为 6.5-7.2，培养温度为 25-30°C，溶氧：通气量范围为 30〜100 %， 170转 /分钟，发酵时间为 48小时，发酵后期将菌丝球全部打碎成该菌株的菌落形成单位，发酵液中 SQR-T037菌株的菌落形成单位 1 X 10⁹个 /mL; 所用 PDA培养液配制方法为（以配置 1L培养基为例）：用 200 g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮 30 min，经过滤后滤液中加 20 g 普通蔗糖，定容至 1000 mL， pH值调至 6.5-7.0， 121 °C灭菌 20 min。

2 )将 SQR-T037发酵液按 50 L/吨的量分别接种到腐熟的畜禽粪便堆肥和菜粕微生物酶解混合物中进行固体发酵，发酵温度为 30-50°C，发酵中每天翻堆 1次，发酵 5-7天后结束，使该菌株的菌落形成单位含量达到 l x lO⁸个 /g以上，获得生物防治菌株 SQR-T037的固体菌剂；所用腐熟后的畜禽粪便堆肥为发芽指数 98%以上，有机质含量 35%，有机氮含量为 1.2-2%，含水量 25-30%。

3 )将畜禽粪便堆肥的 SQR-T037固体菌剂按体积比 50-80%与菜粕微生物酶解混合物的 SQR-T037固体菌剂按体积比 20-50%的比例充分混合，后熟 2-3 天，后熟过程中翻堆 2次，最后在温度不超过 50°C的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至 30%以下，包装出厂即为防除连作黄瓜、西瓜枯萎病的微生物有机肥料。

所述微生物有机肥料可专用于防除连作黄瓜、西瓜枯萎病。

有益效果

本发明一种能克服或消除连作黄瓜、西瓜枯萎病的微生物有机肥料及其生产方法，利用畜禽粪便堆肥和菜粕的微生物酶解氨基酸混合物，再与生物防治菌株液混合后制成微生物有机肥料，其产品与目前市场上的产品相比具有如下优点：

1 )该肥料产品中含有抑制黄瓜、西瓜枯萎病病原真菌生长的高效菌株（哈茨木霉），其抑制效果非常显著。试验结果表明，在连作黄瓜、西瓜枯萎病的土壤上施用本产品后，黄瓜、西瓜枯萎病大田生物防治率达 85%以上，连续三年施用本肥料的土壤，枯萎病的生物防治率更高。

2) 该肥料为生物有机肥，含有丰富的有机质（含量 30-35%), 有机氮含量为 3-5%。本产品总磷含量为 2-4%，而且生物有效性特别高，使用本产品后能使作物顺利度过苗期磷素敏感期。相比之下，含磷化肥施入土壤后生物有效性较差。生物有机肥料中含有的丰富营养也为其中的生物防治菌株提供了生长繁殖的条件，使在土壤中存活下来并形成优势群，从而发挥防病作用。

3 ) 由于是生物菌株制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于黄瓜和西瓜的无公害生产，农民可以不用或减少其他防治枯萎病化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于农产品的质量。同时，该微生物肥料还有增产功能，可为农民增加收入。附图说明

图 1:生物防治菌株 SQR-T037的抑制黄瓜、西瓜枯萎病病原菌的效果 A SQR-T037抑制黄瓜枯萎病病原菌的效果图

B SQR-T037抑制西瓜枯萎病病原菌的效果图

图 2:温室盆栽试验防治效果

A SQR-T037制成的生物有机肥抑制黄瓜枯萎病效果

CK_{1 :}对照； CK_{2 :}黄瓜连作土壤； T_{1 :} CK₂+有机肥； T₂: CK₂+木霉 SQR-T037 的发酵液； T₃: CK₂+木霉 SQR-T037的混合有机肥； T₄: CK₂+木霉 SQR-T037 发酵的有机肥

B SQR-T037制成的生物有机肥抑制西瓜枯萎病效果

CK_{1 :}对照； CK_{2 :}西瓜连作土壤； T_{1 :} CK₂+有机肥； T₂: CK₂+木霉 SQR-T037 发酵有机肥具体实施方式：

(一）菌株的分离和鉴定

采集已经发生连作障碍并出现严重枯萎病病症的植株和周围土壤，样品低温保存，采用镰刀菌的选择行培养基分离病原菌尖孢镰刀菌黄瓜专化型 ( Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum ) 禾口尖孢镰刀菌西瓜专化型 (Fusarium oxysporum f. sp. niveum) _a然后以分离到的枯菱病病原菌为指不菌，从来自于经过高温堆置的有机堆肥中，采用木霉的选择性培养基分离生物防治菌株。再通过盆栽试验和大田试验最终复筛出高效生物防治菌株 SQR-T037, 鉴定到种，菌种于 PDA培养基 4°C保存和室温保存。生物防治菌株 SQR-T037能够在 72小时完全抑制病原菌的生长（图 1 )。

菌株 SQR-T037属于哈茨木霉 Trichod隱 a harzianum) , 主要生物学特性为：在 PDA培养基上最佳的生长温度是 30°C，培养时间为 96个小时的时候，菌落直径可达 90mm，布满整个平皿，在培养基中产生黄色的色素。分生孢子梗呈瓶状，对生，分生孢子椭圆型，长 2.3-3.5 μ ηι, % 2.0-3.2 μηι, 表面光滑，孢子的颜色开始的时候是黄绿色，然后慢慢的变成深绿色。

(二）菌剂生产

1 )将 SQR-T037接种到 PDA培养液中，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为:初始 pH范围为 6.5-7.0，培养温度 25 °C，溶氧：通气量范围体积比为 30〜100 %， 170转 /分钟，发酵时间为 48小时，发酵后期将菌丝球全部打碎成该菌株的菌落形成单位，发酵液中 SQR-T037菌株的菌落形成单位（菌丝片段） ^ I X IO⁹个 /mL;

所用 PDA培养液配制方法为（以配制 1L培养基为例）：用 200 g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮 30 min，用纱布过滤后，滤液加 20 g普通蔗糖，定容至 1000 ml, pH值调至 6.5-7.0， 121 °C灭菌 20 min。

2 ) 将生物防治菌株 SQR-T037发酵液按 50L/吨的接种量接种到腐熟的猪粪堆肥和菜粕的微生物酶解混合物进行固体发酵，发酵过程中每天翻堆 1次，使固体发酵温度 30-50°C，发酵 5-7天后结束，使生物防治菌株的菌落形成单位含量达到 l x lO⁸个 /g以上，获得生物防治菌株 SQR-T037固体菌剂。所用腐熟后的猪粪堆肥为发芽指数 98%以上，有机质含量 35%，有机氮含量为 1.2-2%, 含水量 25-30%。其中菜粕的微生物酶解混合物制备方法为（公知公用，见发明专利

ZL200610086 126.0 , 一种农用氨基酸的生物制取方法及其肥料产品），将嗜麦芽寡养单胞菌 (Steno trophomonas maltophilia)菌株 37-1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量 55-65%和 pH6.0-7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至 50°C时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在 35-50°C约 5-7 天，固体发酵开始后，堆物的 pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和 pH，使它们分别维持在 55-65%和 6.0-7.0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物 pH调整为 5.0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕的微生物酶解混合物（含氨基酸的混合材料）。

3 ) 将猪粪堆肥的 SQR-T037固体菌剂按体积比 80%与菜粕微生物酶解混合物的 SQR- T037固体菌剂按体积比 20%充分混合，后熟 2-3天，后熟过程中翻堆 2次，最后在温度不超过 50°C的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至 30%以下，获得防除连作黄瓜、西瓜枯萎病的微生物有机肥。

上述所生产的 SQR-T037经过再次发酵的微生物有机肥（防除连作黄瓜、西瓜枯萎病的微生物有机肥料）中生物防治菌株 SQR-T037的菌落形成单位 1 X 10⁸个 /g以上、全氮质量比含量为 4〜5% ，全氮中质量比 90%以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为 6〜10%、有机质质量比含量为 30〜35%。

(三）温室盆栽试验

1. 连作黄瓜土壤的枯萎病防治

试验土壤为连作土壤，枯萎病发病严重。黄瓜品种采用种植面积较大的黄瓜品种 "津春 4号"。处理如下：

CK_{1 :}对照； CK_{2 :} 黄瓜连作土壤； T_{1 :} CK₂+有机肥； T₂: CK₂+SQR-T037 的发酵液； T_3: CK₂+SQR-T037 与有机肥简单混合微生物有机肥； T_4: CK₂+SQR-T037与有机肥经过再次发酵形成的微生物有机肥

每处理采用 5个重复， 10kg病土 /盆， T₂每盆施 10mlSQR-T037的发酵液， T₃施用 20gSQR-T037混合的微生物有机肥料（ 10mlSQR-T037的发酵液与 20g 有机肥简单混合）， T₄施用 20gSQR-T037发酵的微生物有机肥，搅拌混合均匀，使生物防治菌株在土壤中的浓度达到 10⁵cfu/g干土。黄瓜苗移栽后 5天开始记录发病情况， 40 天后， CK₂发病率达 98.9%，而接种 SQR-T037 发酵液、 SQR-T037混合微生物有机肥或者 SQR-T037再次发酵的微生物有机肥的都能有效降低枯萎病的发病率，其中 T_4: CK₂+SQR-T037与有机肥经过再次发酵形成的微生物有机肥表现出最好的防治效果（表 1，图 2 A) , 发病率为 7.3%。 2. 连作西瓜土壤的枯萎病防治。

试验土壤为连作土壤，枯萎病发病严重。处理如下：

CK_{1 :}对照； CK_{2 :} 西瓜连作土壤； T_{1 :} CK₂+有机肥； T₂: CK₂+ SQR-T037 与有机肥经过再次发酵形成的微生物有机肥；

每处理采用 10个重复，每重复 300g病土 /杯， Tj每杯施用 3g普通有机肥， T₂施用 3gSQR-T037再次发酵的有机肥，搅拌混合均匀， SQR-T037在土壤中的浓度为 10⁵cfu/g干土。西瓜苗移栽后 5天开始记录发病情况， 21天后， CK₂ 发病率达 95.38%，而 T₂: CK₂+ SQR-T037与有机肥经过再次发酵形成的微生物有机肥能有效降低枯萎病的发病率，将其控制在 2.60% (表 2，图 2 B)。

结果表明，生物防治菌株 SQR-T037的施入，不但可以起到防治黄瓜、西瓜枯萎病，大大减少土壤中枯萎病原菌 F. oxysporum) 数量的作用，促进黄瓜、西瓜根际微生物群落的变化，有益细菌群落显著增加，真菌总体数量及病原菌数量显著减少（表 3 )，还能使黄瓜、西瓜的叶绿素含量、根系活力和干物量显著增加（表 1、表 2)。

施入生物防治菌株后，黄瓜和西瓜的系统抗病性相关酶的酶活显著提高 (表 4)。

(四）田间试验

2008年在江苏省宜兴市黄瓜枯萎病发病的大田施用 SQR-T037有机肥。大田试验处理： 1、施用有机肥； 2、施用 SQR-T037与有机肥经过再次发酵形成的微生物有机肥。将枯萎病发病严重的一块田以随机的方式划分成 8 个小区，每个处理随机选取四个小区。黄瓜品种为 "津春 4号"，肥料都采用穴施，生物有机肥施入量为 30kg/亩。

定期到田间采集数据，统计发病率和微生物区系，最后采收后计算其不同处理间生物量的差异。施入 SQR-T037与有机肥经过再次发酵形成的微生物有机肥可以显著地减少枯萎病害的发生，降低发病率 33.1%，黄瓜产量增加 1.3倍 (表 5)。

2007年在河南通许西瓜枯萎病发病严重的大田施用微生物有机肥。

大田试验处理： 1、施用有机肥； 2、施用 SQR-T037与有机肥经过再次发酵形成的微生物有机肥。选择枯萎病发病严重的田块，将田块以随机的方式划分成 8个小区，每个处理随机选取四个小区。西瓜品种为 8424，肥料都采用穴施，生物有机肥施入量按 30kg/亩田。

定期到田间采集数据，统计发病率、病情指数和微生物区系，最后采收后计算其不同处理间生物量的差异。施入 SQR-T037发酵的生物有机肥可以显著地减少枯萎病害的发生，与当地习惯施肥相比（非嫁接苗），发病率减少 20-40%，防治率达 95%以上，西瓜亩产增加 1200斤以上 (表 5)。

本发明专利从微生物区系这一关键问题着手，研制出一种能显著消除连作黄瓜、西瓜枯萎病发生的微生物有机肥料产品，防治率达 85%以上（大田试验）。本肥料产品的作用机制在于本肥料产品提供的功能菌及其有效碳和有效氮源给连作障碍土壤有益微生物区系的培育提供了很好的条件，使之迅速恢复和建立外源有益功能菌微生物的生态及其食物链；另一方面，本肥料产品中含有较高含量的有机氮和有机磷，这些营养物质对连作障碍土壤中作物的生长十分有利，大大提高了黄瓜、西瓜等作物的立苗率和抗逆能力。

表 1 不同盆栽处理黄瓜叶片叶绿素含量、根系活力和植株的干重

表 2 不同盆栽处理西瓜叶片叶绿素含量、根系活力和植株的干重

注：枯萎病发病率统计按照国际通行规则： 0，植株健康； 1，植株 <10% 部分萎蔫； 2，植株 11-20%萎蔫； 3，植株 21-50%萎蔫； 4，植株 50-100%萎蔫； 5，植株死亡。计算公式：总植株数量 X 最高等级黄瓜根际土壤微生物数量 (cfu/g 土）处理

病原菌木霉菌细菌放线菌真菌

5.9X10² 3.3 X10³ 6.2 X10⁶ 3.5 X10⁴ 8.1 X10³

CK₂ 6.1 X10⁴ 8.8 X10³ 6.6 X10⁶ 5.2X10⁴ 6.2 X10⁴

Tl 7.9 X10⁴ 3.9X10³ 7.7 X10⁶ 6.6 X10⁴ 8.9 X10⁴

T2 8.3 X10³ 5.5 X10⁵ 7.1 X10⁶ 5.8X10⁴ 6.1 X10⁵

T3 3.2 X10³ 6.0 X10⁵ 8.3 X10⁶ 5.9X10⁴ 6.9 X10⁵

T4 9.5 X10² 1.1X10⁶ 8.9 X10⁶ 6.1 X10⁴ 1.9X10⁶ 西瓜根际土壤微生物数量 (cfu/g 土）

处理

病原菌木霉菌细菌放线菌真菌

CKj 8.1 X10² 5.5 X10³ 5.1 X10⁶ 2.3 X10⁴ 3.7 X10³

CK₂ 2.9 X10⁴ 5.9X10³ 6.1 X10⁶ 5.1 X10⁴ 3.7 X10⁴

Tl 3.1 X10⁴ 8.0 X10³ 7.9 X10⁶ 6.8 X10⁴ 6.1 X10⁴

T2 6.2 X10³ 5.7X10⁵ 9.2 X10⁶ 9.9 X10⁴ 6.0 X10⁵ 表 4 不同处理间根部抗病性相关酶的活力的变化

表 5 大田试验效果

下面的说明与本申请说明书中此处提到的

保藏的微生物或其他生物材料相关：

-1 页码 2

-2 行号： 7

-3 保藏事项

-3-1 保藏单位名称 CGMCC 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 -3-2 保藏单位地址中国微生物菌种保藏委员会，中国北京市 2714信箱，邮政编码：100080， Be i j i ng (GN)。

-3-3 保藏日期 2009年 9月 22日（22. 09. 2009)

-3-4 保藏号 CGMCC 3308

-5 本说明是对下列指定国

所有指定国由受理局填写

-4 本表格与国际申请一起收到：

(是或否）

-4-1 受权官员由国际局填写 -5 国际局收到本表格日期： -5-1 受权官员

Claims

权利要求书

1、一种连作黄瓜、西瓜枯萎病的生物防治菌株,该菌株 SQR-T037属于哈茨木霉 ( rich oderma harzianum ) , 2009年 9月 22 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为 CGMCC No.3308，主要生物学特性为：在 PDA培养基上最佳的生长温度是 30°C，培养时间为 96个小时的时候，菌落直径可达 90mm，布满整个平皿，在培养基中产生黄色的色素；分生孢子梗呈瓶状，对生，分生孢子椭圆型，长 2.3-3.5 μ ηι，宽 2.0-3.2 μηι, 表面光滑，孢子的颜色开始的时候是黄绿色，然后慢慢的变成深绿色。

2、用权利要求 1所述生物防治菌株所生产的微生物有机肥料。

3、根据权利要求 2所述的微生物有机肥料，其特征在于：该肥料中分别含有 1 X 10⁸个 /g以上的生物防治菌株 SQR-T037的菌落形成单位、全氮质量比含量为 4〜5% ，全氮中质量比 90%以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为 6〜10%、有机质质量比含量为 30〜35%。

4、权利要求 2或 3所述微生物有机肥料的生产方法，包括：

1 )将权利要求 1所述的菌株 SQR-T037接种到 PDA培养液，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始 pH范围为 6.5-7.2，培养温度 25-30°C，溶氧：通气量体积比范围为 30〜100 %， 170转 /分钟，发酵时间为 48小时，发酵后期将菌丝球全部打碎成该菌株的菌落形成单位，发酵液中该菌株的菌落形成单位 1 X 10⁹个 /mL;

2 ) 将 SQR-T037发酵液按 50L/吨的接种量分别接种到腐熟的畜禽粪便堆肥、菜粕微生物酶解混合物中进行固体发酵，发酵温度为 30-50°C，发酵过程中每天翻堆 1次，发酵 5-7天后结束，获得生物防治菌株 SQR-T037的固体菌剂，其中该菌株的菌落形成单位含量达到 l x lO⁸个 /g以上；

5、根据权利要求 4 所述微生物有机肥料的生产方法，其中步骤（1 ) 所用 PDA培养液配制方法为，以配制 1L培养基为例：

用 200 g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮 30 min，经过滤后滤液中加 20 g普通蔗糖，定容至 1000 ml， pH值调至 7.2-7.4， 121°C灭菌 20 min。

6、根据权利要求 4或 5所述微生物有机肥料的生产方法，其中步骤（2) 所用腐熟后的畜禽粪便堆肥为发芽指数 98%以上，有机质质量比含量 35%，有机氮质量比含量为 1.2-2%，含水量质量比 25-30%。

7、权利要求 2或 3所述微生物有机肥料的应用。