CN113881575B - 一株普通青霉及其在减轻苹果连作障碍中的应用 - Google Patents

一株普通青霉及其在减轻苹果连作障碍中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株普通青霉及其在减轻苹果连作障碍中的应用，属于农业微生物技术领域。本发明的普通青霉(Penicillium commune)D12的生物保藏号为：CGMCC NO.11112，该普通青霉(Penicillium commune)对苹果连作障碍的病原菌轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioide)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)有很强的拮抗作用；且该普通青霉(Penicillium commune)的发酵产物营养成分丰富，含有氨基酸、营养元素、酶类及激素类物质，能显著促进作物的生长。且在土壤中对尖孢镰孢菌也有很好的抑制效果，为苹果连作障碍的生物防控提供了理论依据和技术基础。

Description

一株普通青霉及其在减轻苹果连作障碍中的应用
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一株普通青霉及其在减轻苹果连作障碍中的应用。
背景技术
中国老苹果园更新时普遍面临连作障碍问题。有研究认为镰孢属真菌(Fusariumspp.)是引起苹果连作障碍的主要病原菌之一。van Schoor等研究发现，在南非所有连作苹果园土壤中镰孢属、柱孢属以及腐霉属真菌是引起连作障碍的主要原因。徐文凤和刘志研究认为，造成中国环渤海湾地区苹果连作障碍的主要真菌病原是轮枝镰孢菌、层出镰孢菌、腐皮镰孢菌和尖孢镰孢菌。
目前，国内外综合防控苹果连作障碍的措施主要有客土、施用有机物料、轮作、选择抗性砧木、土壤熏蒸等均可有效地减轻苹果连作障碍，而在生产上，客土成本高不易采用。前人研究发现向连作土壤中添加生物炭、有机物料发酵流体、饼肥、甲壳素等有机肥可减轻连作幼树的障碍现象，但这些措施往往存在一些地区取材不便、缺乏水资源等种种因素限制着其在生产中的应用。有研究认为轮作搭配选择抗性砧木等栽培措施可有效地防控苹果连作障碍，缺点是耗时太长，一般轮作时间不能低于三年，生产中也不易推广。土壤化学熏蒸仍是最有效地防控苹果连作障碍的措施，溴甲烷和氯化苦可以有效控制土壤中的真菌，但因其对环境和人身的有害性而逐渐限制使用。而生物防治是利用有益菌抑制土壤中病原菌的数量或干扰病原菌对寄土植物侵染的一种环保型防治方法，对苹果连作障碍进行生物防治是一种前景广阔的技术措施。因此，寻找一种高效、低毒、环保型的生物防治防控措施非常重要。
青霉广泛存在于自然界中，其菌落密毡状或松絮状，大多为灰绿色，分生孢子梗具横膈，顶端不膨大，有扫帚状分枝。青霉属中有在工业上经济价值很高的菌种，例如有些青霉能产生有机酸；青霉中也有许多常见的有害菌，例如白色青霉危害柑橘，扩展青霉危害苹果。普通青霉(Penicillium commune)是青霉属中的一种真菌，目前对于普通青霉(Penicillium commune)的相关研究较少，专利CN105616632A采用普通青霉处理陈皮，可以在短时间内显著提高陈皮中的总黄酮含量以及柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素四种黄酮的含量；专利CN102757903A公开了一株内生菌株普通青霉，使用所述菌株进行发酵，可产生甘草黄酮类成分。但普通青霉(Penicillium commune)在苹果连作障碍中的相关研究却很少见有报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明从甘薯土壤中分离得到一株具有生防功能的普通青霉(Penicillium commune)，该普通青霉(Penicillium commune)对苹果连作障碍的病原菌轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioide)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)有很强的拮抗作用；且该普通青霉(Penicillium commune)的发酵产物营养成分丰富，含有氨基酸、营养元素、酶类及激素类物质，能显著促进作物的生长。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一方面，提供一株普通青霉(Penicillium commune)D12，该菌株已于2015年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为：CGMCC NO.11112。
所述普通青霉(Penicillium commune)D12，分离自种植甘薯的土壤，具有如下特征：
菌落质地绒毛状；菌落颜色兰绿色；有黄色渗出液。分生孢子椭圆形；分生孢子链柱状；分生孢子梗壁光滑；帚状枝排列叉开、疏散而叉开，在梗基下再分支，主轴核分支端部呈梗基的轮生物。
上述普通青霉(Penicillium commune)D12的发酵产物也属于本发明的保护范围。
作为优选，所述普通青霉(Penicillium commune)D12的发酵产物由如下方法制备而成：
将普通青霉(Penicillium commune)D12的种子液接种至PD液体培养基中进行发酵培养，培养温度25-29℃，搅拌转速200-220r/min，培养时间4-6天。
更优选的，普通青霉(Penicillium commune)D12的种子液的接种量为PD液体培养基体积的8-12％。
本发明的第二方面，提供上述普通青霉(Penicillium commune)D12或者普通青霉(Penicillium commune)D12的发酵产物在如下(1)-(4)至少一项中的应用：
(1)抑制植物病原菌的生长；
(2)制备用于抑制植物病原菌的产品；
(3)防治由植物病原菌所致病害；
(4)制备用于防治由植物病原菌所致病害的产品。
优选的，所述植物病原菌为轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioide)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰孢菌(Fusarium solani)和层出镰孢菌(Fusariumproliferatum)。
本发明的第三方面，提供上述普通青霉(Penicillium commune)D12或者普通青霉(Penicillium commune)D12的发酵产物在促进植物生长发育中的应用。
优选的，所述植物为苹果。
本发明的第四方面，提供上述普通青霉(Penicillium commune)D12或者普通青霉(Penicillium commune)D12的发酵产物在如下(1)或(2)中的应用：
(1)减轻苹果连作障碍；
(2)制备减轻苹果树连作障碍的生防制剂。
本发明的第五方面，提供一种减轻苹果连作障碍的方法，包括以下步骤：
将普通青霉(Penicillium commune)D12的发酵产物施于苹果连作土壤。
本发明的有益效果：
(1)本发明首次从甘薯种植土壤中经人工分离、筛选得到一株普通青霉(Penicillium commune)D12，该菌株生长速度快，孢子大量繁殖，能够在很短的时间内占据大部分的生存空间，对苹果连作障碍病原镰孢菌(尖孢、轮枝、层出和腐皮)有很强的拮抗作用，对层出镰孢菌的抑制率较高，在PDA培养基上抑制率为85.8％。
(2)普通青霉(Penicillium commune)D12的发酵产物营养成分丰富，含有氨基酸、营养元素、酶类及激素类物质。盆栽试验结果表明普通青霉的发酵产物能显著促进平邑甜茶幼苗生物量的增加，且株高、地径、鲜质量和干质量分别比对照增加了41.98％、15.01％、40.34％和51.53％，且在土壤中对尖孢镰孢菌也有很好的抑制效果，为苹果连作障碍的生物防控提供了理论依据和技术基础。
附图说明
图1为普通青霉D12在不同培养基上的形态特征；图中，A为PDA培养基；B为蔗糖肌酸琼脂培养基；C为查氏酵母琼脂培养基；D为麦芽糖琼脂培养基；E为酵母蔗糖琼脂培养基；(F)、(G)、(H)、(I)、(J)为在OLYMPUS BH-2光学显微镜下放大10×100观察PDA培养基上真菌D12的分生孢子结构，照片使用尼康DS-Ri2相机拍摄。
图2为利用ITS rDNA同源性序列和邻接法构建的该菌株的系统发育树。
图3为普通青霉D12在PDA培养基上与尖孢镰孢菌、轮枝镰孢菌、层出镰孢菌、腐皮镰孢菌的对峙试验；
说明：普通青霉D12对尖孢镰孢菌(A)、轮枝镰孢菌(B)、层出镰孢菌(C)和腐皮镰孢菌(D)的菌丝生长均有不同程度的抑制作用，在PDA培养基上菌丝生长抑制率分别为69.8％、73.3％、85.8％、64.3％，拮抗系数达到Ⅱ级或Ⅰ级。
图4为普通青霉D12对连作条件下平邑甜茶幼苗生物量的影响；
说明：普通青霉D12的发酵产物能显著促进平邑甜茶幼苗生物量的增加，且株高、地径、鲜质量和干质量分别比对照增加了41.98％、15.01％、40.34％和51.53％。
图5为普通青霉D12对连作土壤中尖孢镰孢菌基因拷贝数的影响；
说明：普通青霉D12在土壤中对尖孢镰孢菌也有很好的抑制效果，普通青霉D12的发酵产物处理后土壤中尖孢镰孢菌的拷贝数大幅下降，比对照降低了77.27％。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，苹果连作障碍会造成苹果果实产量和品质下降、病虫害加重、树势衰弱甚至死亡，对果农造成严重的经济损失。造成中国环渤海湾地区苹果连作障碍的主要真菌病原是轮枝镰孢菌、层出镰孢菌、腐皮镰孢菌和尖孢镰孢菌。因此，针对引起苹果连作障碍的主要病原菌寻找高效、低毒、环保型的生物防治防控措施非常重要。
本发明从种植甘薯的土壤中分离得到一株普通青霉(Penicillium commune)D12，该普通青霉(Penicillium commune)D12与现有技术中的普通青霉的区别主要在于：
(1)普通青霉(Penicillium commune)D12生长速度快，孢子大量繁殖，能够在很短的时间内占据大部分的生存空间，对引起苹果连作障碍的(轮枝镰孢菌、层出镰孢菌、腐皮镰孢菌和尖孢镰孢菌)4种镰孢菌有很强的拮抗作用。
(2)普通青霉(Penicillium commune)D12的发酵产物营养成分丰富，含有氨基酸、营养元素、酶类及激素类物质。盆栽试验结果表明普通青霉的发酵产物能显著促进平邑甜茶幼苗生物量的增加；并且在土壤中对尖孢镰孢菌也有很好的抑制效果。
因此，本发明的普通青霉(Penicillium commune)D12可以作为生防功能菌用于苹果连坐障碍的防控，由此提出了本发明。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
其中本发明所涉及的培养基及组分如下：
PDA培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌20min，待冷却至45℃左右时，分别加入2.5mL链霉素和1.25ml青霉素，将培养基倒入培养皿凝固。
蔗糖肌酸琼脂培养基：3g肌酸，30g蔗糖，1.6g磷酸钾，0.5g七水硫酸镁，0.5g氯化钾，0.01g硫酸亚铁，0.005g硫酸铜，0.01g硫酸锌，0.05g溴甲酚紫，15g琼脂，1000mL蒸馏水。
查氏培养基：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，酵母粉5g，蔗糖30g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。
麦芽糖琼脂培养基：麦芽糖提取物30g，蛋白胨1g，葡萄糖20g，硫酸铜0.0051g，硫酸锌0.011g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。
酵母蔗糖琼脂培养基：酵母粉20g，蔗糖15g，硫酸镁0.5g，五水硫酸铜0.005g，硫酸锌0.01g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。
PD液体培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌20min，待冷却至45℃左右时，分别加入2.5mL链霉素和1.25ml青霉素。
实施例1：菌株的分离纯化
(1)称取10g山东省泰安市某甘薯种植地的土壤样品，加入到盛有90mL灭菌水的三角瓶中，将三角瓶置于摇床上120转/分，振荡30分钟，使土壤颗粒均匀分散于蒸馏水中，得到稀释倍数为10-1的土壤悬浮液。
(2)从中吸取1mL置于装有9mL灭菌水的试管中，为稀释倍数为10-2的悬浮液。
(3)灭菌的PDA培养基冷却至45℃左右时，加入链霉素达到最终浓度为30μg/mL，青霉素50μl倒入培养皿凝固。
(4)每皿加入200μl稀释后10-2的土壤悬浮液，涂布均匀，每个土样重复3皿。
(5)28℃霉菌培养箱培养7天后，体视镜及显微镜下多次观察，挑单孢到PDA培养基上纯化菌种。
(6)纯化过程中采用初次划线+多次纯化，初次划线即在土壤分离培养基上挑单孢，在适宜培养基上划线接种，接种后5-6d观察生长状况，若分离出多个不同的菌落再次挑单孢纯化，如此反复直到得到纯的目的菌落。
通过平板稀释涂布法，从其中发现了一株具有高抑菌活性的真菌，在它的周围其它菌很难生长，从而形成其特定的“势力范围”。对该菌进行平板划线分离纯化，得到一株青霉菌D12(见图1A-E)。
实施例2：菌株的鉴定
对实施例1分离纯化得到的菌株D12进行鉴定，具体如下：
1.菌落特征和菌体形态特征
(1)菌落特征
在PDA培养基上(图1A)，菌落质地绒状，菌落颜色蓝绿色，菌落表面放射状皱纹，老后呈现同心环纹，边缘纯锯齿状，渗出液黄褐色、橘褐色，偶有缺乏者；反面黄褐色、红褐色。在蔗糖肌酸琼脂培养基上(图1B)，出现黄色圈说明D12可以降解肌酸产酸。在查氏培养基上(图1C)，菌落圆形扁平绒毛；边缘菌丝白色；分生孢子表面蓝绿色；菌落表面同心圆环，4-5圆形凹坑。在麦芽糖琼脂培养基上(图1D)：菌落呈颗粒状，质地蓬松，菌丝白色至浅黄色，背黄褐色。在酵母蔗糖琼脂培养基上(图1E)：菌落较厚，中央隆起，不规则的径向褶皱；菌落表面灰白色；中央的分生孢子较少，分生孢子表面灰绿色；少量渗出物。
(2)菌体形态特征
显微镜下观察菌株的菌丝体，分生孢子梗发生于基质，孢梗茎150-500×3.2-4.5μm，壁通常呈现小疣状粗糙，也有平滑者，这两者可能出现在同一分离物中；帚状枝三轮生，双轮生者少，彼此通常紧贴；副枝1-3个，12-32×3.2-3.5μm，壁显著的小疣状粗糙或平滑；梗基每轮3-5个，8-15×2.2-3.2μm，壁平滑；瓶梗每轮5-7个，8-11×2.2-2.6μm，瓶状，梗颈不明显；分生孢子呈现球形、近球形至椭圆形、椭圆形，3.5-4.2×2.5-3.5μm或3.2-4.0μm，壁平滑；分生孢子链呈现叉开的圆柱状或较疏松而不规则(见图1F-J)。
2.ITS rDNA序列及同源性分析
提取青霉菌的基因组DNA，以提取到的DNA为模板，PCR扩增真菌rDNA-ITS全序列。PCR引物为上游引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′(如SEQ ID NO.2所示)，下游引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(如SEQ ID NO.3所示)。
PCR反应体系：12.5μL Taq mix、模板DNA1.0μL、上下游引物各1.0μL、ddH2O 9.5μL。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，循环34次；72℃后延伸10min，4℃保温；利用引物ITS1/ITS4扩增得到的D12菌株ITS rDNA序列长度约为550bp，符合常规的ITS rDNA序列长度，测序序列长度为556bp，其ITS rDNA序列如SEQ IDNO.1所示。
将青霉菌的ITS rDNA测序结果在GenBank数据库中进行Blast比对，从结果中选取11株与测定菌株序列相似性高的菌株进行系统发育分析，用Mega 5.05软件采取Neighbor-joining法构建系统进化树(见图2)。由图2可以看出，所分离青霉菌与青霉属的遗传进化距离最近，与已知菌株普通青霉(Penicillium commune JX156373.1)的ITS rDNA同源性达到99％。
结合其菌体形态和菌落特征观察结果，将菌株D12鉴定为普通青霉(Penicilliumcommune)。并对该菌株进行生物保藏，保藏信息如下：
生物材料：D12
分类命名：普通青霉Penicillium commune
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015年7月14日
保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.11112。
实施例3：普通青霉(Penicillium commune)D12的功能鉴定
1.室内对峙试验
试验所用轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioide)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、腐皮镰孢菌(Fusarium solani)和层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)是山东农业大学植保学院于金凤教授于2013年在环渤海湾地区的连作果园土壤及感病苹果植株上分离得到并保存的。公众可从山东农业大学获得以用于重复本试验。
(1)将培养好的普通青霉D12和轮枝、腐皮、尖孢和层出镰孢属真菌，分别用直径0.5cm的打孔器打取成直径为0.5cm的菌饼。
(2)将普通青霉D12与轮枝、腐皮、尖孢和层出四种镰孢属真菌菌饼分别同时接入PDA培养基和玉米粉培养基(培养皿直径9cm)，普通青霉D12分别与尖孢、轮枝、层出和腐皮镰孢菌组成四个试验组进行对峙试验，即1组为普通青霉D12与尖孢镰孢菌；2组为普通青霉D12和轮枝镰孢菌；3组为普通青霉D12和层出镰孢菌；4组为普通青霉D12和腐皮镰孢菌；每个试验组中两菌饼(如D12和尖孢镰孢菌)相距5cm；每个试验组处理重复3次，28℃恒温培养；对照组为四种镰孢属真菌(尖孢、轮枝、层出和腐皮镰孢菌)和普通青霉D12在PDA上的单独培养物，28℃恒温培养；试验组和对照组培养7d后分别测量培养得到的菌落直径，并观察记录普通青霉D12的抑制作用。
(3)一直观察到对照组中真菌菌落覆盖满培养皿，测量并记录处理真菌菌落直径，计算抑菌率。
抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-对峙菌落直径)/对照菌落直径]×100％
培养7d后，采用拮抗指数评价竞争作用强弱。拮抗指数分级标准为(Bell et al.,1982)：
Ⅰ级，青霉菌菌丝占据平皿99％，真菌菌落萎缩；
Ⅱ级，青霉菌菌丝占据平皿大于2/3，真菌菌落边缘萎缩；
Ⅲ级，青霉菌菌丝占据平皿大于1/3，小于2/3，真菌停止生长，菌落边缘凹陷；
Ⅳ级，青霉菌菌丝占据平皿小于1/3，青霉菌停止生长；
Ⅴ级，真菌占据平皿99％。
2.普通青霉D12的拮抗能力
试验组中将普通青霉D12与四种病原镰孢菌同时接入同一培养皿中对峙培养，结果见表1。从结果中可以看出，供试的普通青霉D12对四种镰孢属真菌的生长都有一定的抑制作用，且抑制作用有显著性差异。与尖孢镰孢菌的对峙培养结果表明，普通青霉D12对尖孢镰孢菌也存在一定的抑制作用，在PDA培养基上抑制率达到65％以上。培养7d，普通青霉D12对尖孢镰孢菌的拮抗系数为Ⅱ级，即不能将真菌全部覆盖(表1)。将普通青霉D12和尖孢镰孢菌接入培养皿中后，普通青霉D12与尖孢镰孢菌的菌落交界处未产生抑菌带，普通青霉D12的菌丝在两者接触后继续生长(图3)。
表1：普通青霉D12对四种镰孢菌的抑制率
Figure BDA0003318707810000081
与轮枝镰孢菌的对峙培养结果表明，普通青霉D12对轮枝镰孢菌在PDA培养基上抑制率达到70％以上。培养7d，普通青霉D12对轮枝镰孢菌的拮抗系数为Ⅰ或Ⅱ级(表1)。将普通青霉D12和轮枝镰孢菌接入培养皿中后，普通青霉D12的生长速度快于轮枝镰孢菌，两菌落接触后，在两菌落交界处出现一条透明的抑菌带(图3)。
与层出镰孢菌的对峙培养结果表明，在PDA培养基上普通青霉D12对其抑制率较高，达到了85.8％。普通青霉D12对层出镰孢菌的拮抗系数达到Ⅰ级，即将层出镰孢菌的菌落全部覆盖(表1)。普通青霉D12与层出镰孢菌的菌落交界处未产生抑菌带，普通青霉D12的菌丝在两者接触后继续生长，D12的代谢物消解了大部分的层出镰孢菌的菌丝(图3)。
普通青霉D12与腐皮镰孢菌的菌落交界处未产生抑菌带，普通青霉D12的菌丝在两者接触后继续生长，直到铺满整个培养皿(图3)。在PDA培养基上，普通青霉D12对腐皮镰孢菌的抑制率达到了64.3％，拮抗系数达到Ⅱ级，普通青霉D12的菌丝在两者接触后继续生长，普通青霉D12的菌丝占领腐皮镰孢菌的生长空间(图3)。
本实施例中对峙试验说明普通青霉D12对尖孢、轮枝、层出和腐皮镰孢菌的菌丝生长均有不同程度的抑制作用，在PDA培养基上菌丝生长抑制率分别为69.8％、73.3％、85.8％、64.3％，拮抗系数达到Ⅱ级或Ⅰ级；说明普通青霉D12对引起苹果连作障碍的腐皮镰孢菌、层出镰孢菌、轮枝镰孢菌和尖孢镰孢菌有很强的拮抗作用，对苹果连作障碍有一定的生防作用。
实施例4：普通青霉(Penicillium commune)D12的发酵产物的制备及相关成分鉴定
1.D12发酵产物的制备
(1)平板活化菌株
挑取D12菌丝于PDA培养基上，于27℃培养5d。
(2)种子液制备
500mL PD液体培养基加入1L的三角瓶，用封口膜或纱布包口，121℃灭菌20min。冷却到室温后挑取平板菌丝于PD液体培养基中旋转摇床上培养24-36h，培养温度(27±2)℃，摇床转速200r/min。
(3)发酵罐培养条件
将PD液体培养基装入发酵罐，121℃灭菌30min，冷却至30℃接种种子液，接种量10％(体积分数)，培养时间5天，培养温度(27±2)℃，搅拌转速600r/min，通风量1.0L/(L·min)，发酵完成后8层纱网过滤得上清液，即D12发酵产物。
此处通风量为1.0L/(L·min)，指的是每分钟内通过每升培养液的空气体积为1L。(L·min)指的是每分钟通过1升体积空气。
2.D12发酵产物成分的鉴定
将D12发酵产物送往科标技术(青岛)研发中心检测，结果如表2-表5所示：
表2：D12发酵产物的氨基酸含量
Figure BDA0003318707810000091
Figure BDA0003318707810000101
由表2可以看出，D12发酵产物中谷氨酸含量最高，为22.08mg/100g；蛋氨酸含量最低，为0.17mg/100g。
表3：D12发酵产物的酶活性
Figure BDA0003318707810000102
表4：D12发酵产物的元素含量
Figure BDA0003318707810000103
Figure BDA0003318707810000111
注：字体加粗部分的计量单位：μg·L-1。
全元素扫描结果显示(表4)，Mg、Si、P、Cu、B和Al元素含量较高，其中Mg元素含量高达125690.14mg·L-1，Si元素含量高达57643.1mg·L-1，P元素含量高达3658.47mg·L-1，Cu元素含量高达2267.0mg·L-1，B元素含量高达1595.8mg·L-1，Al元素含量高达1360.0mg·L-1。
表5：D12发酵产物的激素含量
Figure BDA0003318707810000112
注：①检出限：0.1913μg·g-1。
由表3和表5可以看出，D12代谢产物中SOD的活力最高，高达24.53U/mL，纤维素酶活力较高，为3.38U/mL，是蛋白质酶和脂肪酶活力的3倍；此外，D12代谢产物中吲哚乙酸和赤霉素含量分别为11.67和23.19μg/g。
实施例5：盆栽试验条件下研究普通青霉D12的拮抗作用
1.试验方法：
盆栽试验在山东农业大学园艺科学与工程学院国家苹果工程实验中心以及作物生物学国家重点实验室进行。2016年3月将经过层积、催芽的平邑甜茶种子播种于育苗盘育苗，至幼苗长至第3片真叶时，取长势基本一致的幼苗移栽。每盆定植3株幼苗，缓苗期结束后间掉1株苗。
试验共设置四个处理：连作土壤(CK)，菌肥载体(T1)，真菌D12菌肥(T2)和真菌D12发酵产物(T3)；四个处理所用土壤均是同样的连作土壤，土壤取自山东省泰安市满庄镇29年生的富士苹果园，从距离苹果树干80cm、深10～40cm的区域，多点随机取土，混匀；土壤类型为砂土。T1、T2和T3处理是指在连作土壤中分别添加菌肥载体、真菌D12菌肥和D12发酵产物；菌肥载体、真菌D12菌肥和D12发酵产物的添加量均为连作土壤质量的1％。每个处理20个重复，四个处理采用同一条件进行正常肥水管理。
其中，菌肥载体具体为牛粪和玉米秸秆的混合物(牛粪：秸秆＝1：3，重量比)，由中国德州创迪微生物资源有限公司提供。
真菌D12菌肥由如下方法制备而成：
将麸皮粉和水按重量比1：1并搅拌均匀，将混合物分别装入铁盘(26cm*19cm*3.5cm)中，每个铁盘100g混合物，用4层纱布覆盖铁盘，并用橡皮筋固定住纱布。将分装处理好的铁盘放入灭菌锅灭菌(115℃，25min)。灭菌结束后，将铁盘放入超净工作台(提前灭菌30min)，待铁盘冷却后，将活化好的D12菌株用灭菌的量筒加入铁盘中(每个铁盘100ml，需要把活化的菌液检测下活菌数，平板培养的方法检测，100ml菌液摇匀称一下重量，取1g菌液涂板培养3天数一下菌数)，并且搅拌均匀。将加完菌株的铁盘盖好纱布后放入恒温箱中(25℃)。每隔1天观察菌种生长状况，在超净工作台中充分搅拌一次，使普通青霉D12更好地生长。待生长7天后将普通青霉D12连同培养基一块移出铁盘，并在40度烘箱晾干。过20目的筛子，把麸皮粉筛除，即得普通青霉D12孢子粉。
然后将普通青霉D12孢子粉与灭菌的菌肥载体(牛粪：秸秆＝1：3，重量比)按重量比1：10混合均匀，使菌粉与载体的混合物充分潮湿(45％的湿度最好)，以手握不留水印为宜；搅拌均匀后放在遮阳处盖上塑料布静置24小时，温度保持在35-38℃最佳，发酵15天，即制备得到真菌D12菌肥。每克菌肥含3.57×109孢子；剂型：粉末状。
真菌D12发酵产物按实施例4的方法制备得到。
试验在四月中旬移栽，在八月中旬进行取样。试验持续时间为四个月，试验结束后考察不同处理对平邑甜茶幼苗生物量的影响，以及对尖孢镰孢菌的抑制效果。
2.试验结果：
(1)不同处理对平邑甜茶幼苗生物量的影响：
由图4可以看出，与连作土对照(CK)相比，不同处理均促进了平邑甜茶幼苗生物量的增加，以D12发酵产物(T3)的促进效果最显著，且株高、地径、鲜重和干重分别比对照增加了41.98％、15.01％、40.34％和51.53％，而D12菌肥处理(T2)与载体处理(T1)的株高、干重没有显著性差异。
(2)连作土壤中普通青霉D12对尖孢镰孢菌的抑制效果：
取0.5g过筛的新鲜土壤，按
Figure BDA0003318707810000121
土壤DNA提取试剂盒操作步骤提取DNA，采用CFX96TMThermal Cycler(Bio-Rad)对土壤中尖孢镰孢菌的基因拷贝数进行实时荧光定量分析，验证普通青霉D12在土壤中对尖孢镰孢菌抑制效果，特异性引物及反应步骤参考李家家的方法(李家家,相立,潘凤兵,陈学森,沈向,尹承苗,毛志泉.平邑甜茶幼苗与葱混作对苹果连作土壤环境的影响[J].园艺学报,2016,43(10):1853-1862.)。
从图5可以看出，与连作土对照(CK)相比，不同处理均使尖孢镰孢菌的基因拷贝数显著降低，且以D12发酵产物处理(T3)降低最显著，比对照降低了77.27％。D12发酵产物处理后土壤中尖孢镰孢菌的拷贝数大幅下降，说明D12发酵产物施入土壤后真菌D12大量繁殖，占据了大部分营养空间使尖孢镰孢菌的生长繁殖受到抑制，说明真菌D12在土壤中对尖孢镰孢菌也有很好的抑制效果。
综上，普通青霉(Penicillium commune)D12对苹果连作障碍病原镰孢菌(尖孢、轮枝、层出和腐皮)有很强的拮抗作用；普通青霉(Penicillium commune)D12的发酵产物营养成分丰富，含有氨基酸、营养元素、酶类及激素类物质。盆栽试验结果表明：普通青霉(Penicillium commune)D12以发酵产物的形式进行应用的效果最好，能显著促进平邑甜茶幼苗生物量的增加，且在土壤中对尖孢镰孢菌也有很好的抑制效果。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学，山东惠美农牧发展有限公司
<120> 一株普通青霉及其在减轻苹果连作障碍中的应用
<130> 2021
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 556
<212> DNA
<213> 菌株D12
<400> 1
gggctacgtg ctgaggcttt gggtccacct cccacccgtg tttattttac cttgttgctt 60
cggcgggccc gcctttactg gccgccgggg ggcttcacgc ccccgggccc gcgcccgccg 120
aagacaccct cgaactctgt ctgaagattg aagtctgagt gaaaatataa attatttaaa 180
actttcaaca acggatctct tggttccggc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgatac 240
gtaatgtgaa ttgcaaattc agtgaatcat cgagtctttg aacgcacatt gcgccccctg 300
gtattccggg gggcatgcct gtccgagcgt cattgctgcc ctcaagcccg gcttgtgtgt 360
tgggccccgt cctccgattc cgggggacgg gcccgaaagg cagcggcggc accgcgtccg 420
gtcctcgagc gtatggggct ttgtcacccg ctccgtaggc ccggccggcg cttgccgatc 480
aacccaaatt tttatccagg ttgacctcgg atcaggtagg gatacccgct gaacttaagc 540
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (6)

1.一株普通青霉（Penicillium commune）D12，其生物保藏号为：CGMCC NO.11112。
2.权利要求1所述的普通青霉D12的发酵产物。
3.根据权利要求2所述的普通青霉D12的发酵产物，其特征在于，所述发酵产物由如下方法制备而成：
将普通青霉D12的种子液接种至PD液体培养基中进行发酵培养，培养温度25-29 ℃，搅拌转速200-220 r/min，培养时间4-6天。
4.权利要求1所述的普通青霉D12在如下（1）-（4）至少一项中的应用：
（1）抑制植物病原菌的生长；
（2）制备用于抑制植物病原菌的产品；
（3）防治由植物病原菌所致病害；
（4）制备用于防治由植物病原菌所致病害的产品；
所述植物病原菌为轮枝镰孢菌（Fusarium verticillioide)、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum)、腐皮镰孢菌（Fusarium solani)和层出镰孢菌（Fusarium proliferatum）。
5.权利要求2或3所述的普通青霉D12的发酵产物在促进植物生长发育中的应用；所述植物为平邑甜茶幼苗。
6.权利要求1所述的普通青霉D12在如下（1）或（2）中的应用：
（1）减轻苹果连作障碍；
（2）制备减轻苹果树连作障碍的生防制剂；
所述苹果连作障碍是由轮枝镰孢菌（Fusarium verticillioide)、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum)、腐皮镰孢菌（Fusarium solani)和层出镰孢菌（Fusarium proliferatum）引起的。
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GR1006119B (el) * 2007-09-11 2008-10-24 Ο μυκητας fusarium solani στελεχος fs-k και η χρηση του στον βιολογικο ελεγχο φυτοπαθογονων οργανισμων και στη βελτιωση της αναπτυξης και της παραγωγικοτητας φυτων
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