WO2011006449A1 - 日本血吸虫的反转座子及其用途 - Google Patents

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WO2011006449A1
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schistosomiasis
inverted
polynucleotide
seq
sequence
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王升跃
夏超明
郑华军
郭俊杰
许静
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Chinese National Human Genome Center at Shanghai
Suzhou University
Original Assignee
Chinese National Human Genome Center at Shanghai
Suzhou University
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6893—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase

Definitions

  • the present invention is in the field of biotechnology and genetics, and more particularly, the present invention relates to schistosomiasis inversion and its use. Background technique
  • Schistosomiasis is a serious threat to human health and causes enormous economic losses in developing countries in Africa, Asia and South America. Schistosoma japonicum is distinct from other schistosomiasis in ecology and biology. It is one of the most serious schistosomiasis diseases with the most serious harm to human health. It has been in China for more than 2,100 years. In the early days of liberation, it was widely popular in 12 provinces, municipalities and autonomous regions in the Yangtze River Basin of China, with an area of 14.8 billion square meters of host snails. In recent years, due to changes in the economic system and the ecological environment of the Yangtze River Basin and the increase of floating population, the area of snail snails has expanded and the source of infection has spread. The schistosomiasis epidemic in China has shown an upward trend, and some areas have rebounded significantly and gradually spread to cities.
  • Direct detection that is, inspection of fecal eggs as one of the main diagnostic methods. Since the eggs excreted from the feces account for only 17% of the total number of eggs laid, most of them occur in advanced patients. Although there are many improvements in the method of testing eggs, it is still cumbersome in the actual operation of epidemic areas. And inconvenience, especially the sensitivity of its diagnosis is poor, and the rate of missed detection for patients with early infection, mild and repeated chemotherapy is higher. Since the 1920s, immunological techniques have been applied to the diagnosis of schistosomiasis, for example, the use of intradermal reactions to diagnose schistosomiasis has achieved good results.
  • Another object of the present invention is to provide a primer pair and a reagent cartridge corresponding to the Schistosoma reversal.
  • Another object of the present invention is to provide the use of the schistosomiasis inversion.
  • an isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence selected from any one of SEQ ID NOS: 1-25 is provided.
  • the polynucleotide has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 10.
  • the use of the polynucleotide is provided as a schistosomiasis detection marker, or the polynucleotide is used as a schistosomiasis detection marker, or a kit for detecting schistosomiasis Or DNA chip.
  • the inverted locus of the present invention can also be used for: determination of the genetic relationship of schistosomiasis; localization of schistosomiasis genes; conservation analysis of various or subspecies of schistosomiasis; evolutionary analysis of schistosomiasis; or identification of species or geographical populations of schistosomiasis .
  • the Schistosoma japonicum is Schistosoma japonicum .
  • a primer pair is provided, the amplification product obtained by amplification of the primer pair having an inverted transposon sequence selected from any one of SEQ ID NOS: 1-25.
  • the primer (pair) is a primer which amplifies the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19 or 10 or a fragment thereof, and more preferably, the primer (pair) is selected from the group consisting of SEQ ID NO: the sequence shown in 26-29 or the sequence shown in SEQ ID NOs: 30-31.
  • a fourth aspect of the invention there is provided the use of said primer pairs for the preparation of a kit for detecting the presence or absence of a polynucleotide corresponding to the inverted cassette of the first aspect of the invention in the genome of the schistosomiasis .
  • a method of determining a genetic relationship between schistosomiasis in two or more samples comprising -
  • the number and/or position of the amplified product is analyzed by electrophoresis, and amplification is performed.
  • the higher the number and/or positional identity of the product the closer the genetic relationship between two or more species of Schistosomiasis; the greater the difference in the number and/or position of entries in the amplified product, indicating two or more species of Schistosoma The farther the genetic relationship is between.
  • test kit comprising the specific primer pair described in the third aspect of the invention.
  • the kit further comprises a material selected from the group consisting of a PCR amplification reagent, an electrophoresis reagent, or a sequence analysis software.
  • a polynucleotide set for genetic analysis comprising the inverted vector represented by any one of SEQ ID NOs: 1-25 sequence.
  • the polynucleotide set comprises the inverted transposon sequence of 25 of SEQ ID NOs: 1-25.
  • a DNA chip having a substrate and a nucleotide sequence immobilized on the substrate as inverted as shown in any one of SEQ ID NOs: 1-25 A stalk or a specific fragment thereof.
  • Figure 1 shows a schematic representation of the SjCHGCS19.P1-P2 target sequence.
  • Figure 2 shows the sensitivity of SjCHGCS19.Pl-P2 target sequence detection.
  • the lanes in the figure are as follows: M: lOObp DNA Ladder molecular weight standard; 1: undiluted adult template DNA; 2 ⁇ 9: 1 : 10 ⁇ 1 : 10 8 diluted worm template DNA; l : 10 7 (21.47fg/ul); 10. Blank control.
  • Figure 3 shows the sensitivity of nested PCR detection of the SjCHGCS 19.P3-P4 target sequence.
  • the lanes in the figure are as follows: M: 100 bp DNA Ladder molecular weight standard; 1 to 8 : 1 : 10 ⁇ 1 : 10 8 diluted worm template DNA. The highest detection sensitivity is 1: 10 7 (21.47fg/ul).
  • Figure 4 shows the detection sensitivity of the constructed TA cloning plasmid DNA.
  • M 100 bp DNA Ladder molecular weight standard
  • 1 to 14 DNA detection results after dilution of the plasmid 1:10 to 1:10 14 .
  • the results showed that the detection sensitivity was 2.02 copies (corresponding to a dilution of 1:10").
  • Figure 5 shows the detection specificity of the SjCHGCS19. P1-P2 target sequence.
  • the lanes in the figure are as follows: M: 100 bp DNA Ladder molecular weight standard; 1: male; 2: liver tissue; 3: liver fluke.
  • the results showed that the amplified band was 303 bp in size and did not cross-react with liver fluke.
  • Figure 6 shows the results of SjCHGCS19.
  • P1-P2 target sequence detection of 50 serum DNA from rabbits infected with Schistosoma japonicum.
  • the lanes in the figure are as follows: M: 100 bp DNA Ladder molecular weight standard; 1: normal rabbit serum; 2: infection for 3 days; 3 to 9: infection for 1 week to 7 weeks; 10 to 18: infection for 9 weeks to 24 weeks (interval 1 week test); 19: positive control.
  • Figure 7 shows the results of the efficacy test of SjCHGCS19.Pl-P2 target sequence for detecting serum DNA of rabbits infected with Schistosoma japonicum.
  • M 100 bp DNA Ladder molecular weight standard
  • 1 Negative control (normal rabbit serum)
  • 2-18 Peripheral serum at 8 weeks after 8 weeks of infection with Schistosoma japonicum cercariae
  • 19-21 20 weeks after praziquantel treatment 20 weeks (25 weeks after infection, 27 weeks) Serum DNA was negative for 3 weeks
  • 22 Positive control (Schistosoma japonicum adult).
  • Figure 8 shows the detection sensitivity of the SjCHGCSlO.P1-P3 target sequence.
  • the lanes in the figure are as follows: M: lOObp DNA Ladder molecular weight standard; 1 undiluted adult template DNA; 2 ⁇ 7: 1:10 ⁇ 1:10 7 diluted worm template DNA; highest detection sensitivity is 1 : 10 6 (214.7fg/ul) 8. Blank control.
  • Figure 9 shows the results of detection of serum DNA of human schistosomiasis by nested PCR based on the SjCHGCS19.P1-P2 target sequence.
  • the lanes in the figure are as follows: 1 ⁇ 22: DNA template of different patients infected with Schistosoma japonicum (the intensity of band reaction is positively correlated with the degree of infection EPG); P: positive control; N: negative control.
  • the inventors have conducted extensive and in-depth research to discover 25 different types of new inverted transposon sequences by studying the genome and transcriptome of Schistosoma japonicum, including 18 LTR inverted transposons SjCHGCS1 ⁇ 5" JCHGCS18) , 4 kinds of Non-LTR inverted nests, SjCHGCS19 ⁇ S JCHGCS22) and 3 kinds of Penelope type inverted nests (5 '- ⁇ 2£ ⁇ 03 ⁇ 4 ⁇ -/1 ⁇ 2?77£? 0 ⁇ .
  • the complete sequence copy number of these 25 new inverted transposons in the Schistosoma japonicum genome ranges from 1 to 130, while the incomplete sequence copy number (only partial sequences of inverted transposons) is from 15 to 6384 unequal.
  • inverted splicing sequence and “inverted splicing” are used interchangeably and each refers to having a nucleotide sequence selected from any one of SEQ ID NOS: 1-25.
  • polynucleotide set is a collection of polynucleotides comprising a polynucleotide set forth in any one of SEQ ID NOS: 1-25.
  • polynucleotides can be selected from said polynucleotides as inverted epitope markers.
  • isolated means that the substance is separated from its original environment (if it is a natural substance, the original environment is the natural environment).
  • the polynucleotides and polypeptides in the natural state in living cells are not isolated and purified, but the same polynucleotide or polypeptide is separated and purified, such as from other substances existing in the natural state. .
  • a pair of specific primers can be designed, and the inverted transposon sequence can be amplified by PCR technology, and the length polymorphism can be obtained by using techniques such as sequencing or electrophoresis analysis.
  • the present invention provides primers (; pairs;) that can be used to amplify said inverted transposons.
  • the primers (pairs;) were designed based on the conserved sequences at the ends of these inverted parents. Primer design methods are well known to those skilled in the art. In general, different primers can be designed for one inverted locus based on their sequence at both ends, and the most suitable primers can be determined by PCR. More specifically, when designing primers, similar Tm temperatures are employed to enable these primers to be used in high throughput amplification and detection. In addition, it is necessary to ensure the uniqueness of the site where the primer is amplified. In general, 18-26 bp oligonucleotide primers have better specificity.
  • the corresponding retrotransposons in the genome of the schistosomiasis (especially Schistosoma japonicum) can be amplified. Furthermore, using the same primer pair and using genomic DNA of Schistosoma japonicum from different sources as a template, a polynucleotide comprising a polymorphic inverted motif structure (e.g., different numbers of inverted repeats or different lengths) can be obtained.
  • a polymorphic inverted motif structure e.g., different numbers of inverted repeats or different lengths
  • the inverted adapters of the present invention and their corresponding primers have a variety of uses including, but not limited to, for: determination of the genetic relationship of schistosomiasis; localization of schistosomal genes; conservation analysis of various or subspecies of schistosomiasis; Evolutionary analysis; or identification of schistosomiasis varieties. Genetic analysis
  • the inverted reps or the corresponding specific primers provided by the present invention can determine the genetic relationship (or kinship) of schistosomiasis by using various techniques known in the art.
  • the gene of trematode for the conservative analysis of various or subspecies of schistosomiasis, the evolution analysis of schistosomiasis, or the identification of schistosomiasis, or the identification of schistosomiasis. Since the PCR amplification of the inverted cassette is specific amplification, its stability and reproducibility are both good.
  • the method for detecting the product after PCR amplification can employ a technique well known to those skilled in the art, and the most convenient and easiest method is to use agarose gel electrophoresis.
  • the difference in amplification products is determined by comparing the number and/or size of the amplified bands.
  • the method is simple in operation and low in cost.
  • Gene scanning can be performed using software known to those skilled in the art, such as GenMapper 4.0 software. Test kit or system
  • the invention also provides a detection kit or system comprising: a primer capable of specifically amplifying an inverted transposon sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 1-25 (Correct;).
  • the kit contains various materials for analyzing the genetic relationship of schistosomiasis, locating the schistosomiasis gene, conserving analysis of various or subspecies of schistosomiasis, evolution analysis of schistosomiasis or identification of schistosomiasis.
  • a material selected from the group consisting of a PCR amplification reagent, an electrophoresis reagent, a PCR product purification reagent, or a sequence analysis software may be included. These reagents can all be conventionally used by those skilled in the art.
  • kit may also contain instructions for use to explain the method of use of the kit, and to give suitable conditions for use.
  • the extracted DNA is sequenced to obtain genomic sequence data.
  • the initial data was then obtained from the genomic database, and after further analysis, experimentation, and selection, 25 inverted transposons were finally obtained, the sequences of which are shown in SEQ ID NO: 125.
  • primers were designed using Primer 5.0 software to synthesize 25 pairs of specific primers, respectively. Amplifying the phase with the whole genome DNA of the Schistosoma japonicum sample as a template Amplification products for 25 inverted transposons.
  • the PCR cycling conditions were: 95 °C 5 mm; 94 °C 45 s, 55 °C 45 s, 72 °C 45 s, 30 cycles; 72 °C 10 min.
  • the PCR reaction system was: 25 ng genomic DNA, 2 units of SBS Taq polymerase, bidirectional primers of 10 pm, 1.25 mM MgCl 2 , 1 ⁇ 10 X reaction buffer, 0.5 ⁇ dNTPs (2.5 mM, TaKaRa).
  • the PCR product was purified by a conventional method, followed by genetic analysis, and the genetic analysis method was as follows:
  • the number and/or position of the amplified product is analyzed by electrophoresis.
  • the PC product was separated using an ABI 3730 XL automated sequencer and the exact length of the DNA fragment of the PCR product was determined using an ABI Genescan-500 LIZ (Applied Biosystems) molecular internal standard. Initial data processing was performed using ABI 3730 XL and GenMapper 4.0 software (Applied Biosystems). Result:
  • Penelop sample ⁇ (Penelope-like el ement)
  • the inventors also performed structural analysis on the inverted reciprocators of the LTR, Non-LTR and pene lope types.
  • the remaining 15 LTR inverted reciprocators have long terminal repeats (LTR) at both ends, ranging in length from 190 bp to 1236 bp; all 18 LTRs
  • the inverted transposons have a complete polyprote in coding frame; except for SJCHGC5 and SjCHGC8 ⁇ , the remaining 16 LTR inverted transposons can distinguish between proteases (Proteas e) and reverse transcriptase (in the pol yprote in coding frame).
  • Reverse Transcr i ptase the coding gene of RNaseH and Inte grase; only the coding sequence of protease can be identified in SJdC ⁇ , and the coding sequence of protease can not be identified in SJ ⁇ S.
  • SJCHGCS22 does not have a complete po lyprote in coding frame. A 137 bp inverted repeat was found at both ends.
  • Diagnosis is always at the center of schistosomiasis control activities.
  • pathogen examination that is, the detection of eggs from the feces of people in epidemic areas, is still the only diagnostic route and means of schistosomiasis.
  • pathogen infects the body, its genes are also brought into the human body.
  • the nucleic acid substance exists in the body.
  • the inverted codon S jCHGCS 19 SEQ ID NO: 19 was selected as a representative for further study.
  • the inverted polynucleotide SjCHGCS 19 polynucleotide is suitable as a marker for schistosomiasis detection and is also suitable for the preparation of kits or DNA chips for detecting schistosomiasis.
  • SjCHGCS 19 PI-P2 fragment (303 bp) and its SjCHGCS 19 P3-P4 fragment (607 bp) S 19 PI primer: AAGGCGTTTGACAGCGTAG (SEQ ID NO: 26); S19 P2 primer: ATCATCCGCGAAGTCCAG (SEQ ID NO: 27) S19 P3 Primer: CCAAATCGCAACACTACGC (SEQ ID NO: 28); S19 P Primer: ATCGGATTCTCCTTGTTCAT (SEQ ID NO: 29)
  • S 19 PI primer AAGGCGTTTGACAGCGTAG
  • S19 P2 primer ATCATCCGCGAAGTCCAG
  • S19 P3 Primer CCAAATCGCAACACTACGC (SEQ ID NO: 28)
  • S19 P Primer: ATCGGATTCTCCTTGTTCAT SEQ ID NO: 29
  • the positive rate of positive samples of serum samples of patients was positive.
  • the positive rate of positive samples of serum samples was nested PCR 100 96 96. 0% 20 0 0% Note: 100 patients were from schistosomiasis in Hunan province, all of which were tested by EPG. Positive.
  • the intensity of the amplified band reaction of DNA from different sera of Schistosoma japonicum is positively correlated with the degree of infection EPG.
  • the inverted nester SjCHGCS 10 (SEQ ID NO: 10) was selected as a representative for further study.
  • the sensitivity of the SjCHGCS lO. P1–P3 target sequence detection is shown in Figure 8.
  • the highest detection sensitivity is 1: 10 s (214. 7fg/ul).
  • the primer is SjCHGCSl O.
  • PI GCCAGTGGGCATCTCCTT (SEQ ID NO: 30);
  • SjCHGCS lO. P3 CGGGCTGGCAATCAGTAA (SEQ ID NO: 31).

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Abstract

本发明公开了日本血吸虫反转座子及其应用。具体地，本发明提供了具有选自SEQIDNO:1-25中任一序列所示的核苷酸序列的反转座子。所述反转座子可作为血吸虫病检测标志物。本发明还提供了特异性扩增所述的反转座子序列的引物(对)。

Description

曰本血吸虫反转座子 DNA靶序列在血吸虫病诊断中的应用
技术领域
本发明属于生物技术和遗传学领域， 更具体地， 本发明涉及血吸虫反转座 子及其应用。 背景技术
血吸虫病在非洲、 亚洲和南美洲发展中国家严重危害人类健康并造成巨 大经济损失。 日本血吸虫在生态学和生物学方面明显有别于其它血吸虫， 是对 人体健康危害最为严重、 防治难度最大的血吸虫病之一， 在中国已有 2100 多 年的历史。 解放初期， 广泛流行于我国长江流域的 12个省、 直辖市和自治区， 中间宿主钉螺分布面积 148亿平方米。 近年来， 由于经济体制和长江流域生态 环境的变化和流动人口的增加， 使得钉螺滋生面积扩大， 传染源扩散， 我国的 血吸虫病疫情出现上升趋势， 局部地区明显回升， 并向城市逐步蔓延。
血吸虫疫情的反复引起了国家的高度重视， 国家卫生部已将其列为 4个重 大传染病之一。 2004年 2月国务院成立国家血吸虫病防治工作领导小组， 提出 了 "要抓住源头， 综合治理， 依靠科技进步， 坚决遏制血吸虫病疫情回升势头" 的要求。 2004年 5月召开了全国血吸虫病防治会议中提出， "作好血吸虫病防 治工作关系到人民的身体健康和生命安全，关系到社会经济发展和社会稳定。 " 血吸虫病的诊断长期以来依赖病原体的直接检测， 即检查粪便虫卵作为 主要确诊手段之一。 由于从粪便中排出的虫卵只占产卵总量的 17%， 多数发 生在晚期病人， 虽然在虫卵的检查方法上有了许多的改良， 但在流行疫区的 实际操作中还是较为繁琐和不便，特别是其诊断的敏感性较差， 对早期感染、 轻度和反复化疗后的病人的漏检率较高。 自上世纪 20年代以来， 免疫技术己 应用到血吸虫病的诊断， 例如， 用皮内反应诊断血吸虫病， 取得了较好的效 果。 随后， 经过广泛的研究和不断的改进， 目前己有了几十种免疫学检测方 法， 而且还发展了检测血吸虫循环抗原和循环免疫复合物的新方法， 极大地 推动了血吸虫免疫学检测方法的深入发展。
由于血吸虫感染宿主的免疫调节作用， 导致感染宿主体内的循环抗原、 循环抗原抗体免疫复合物和特异抗体的动态很不一致， 到目前为止， 还缺乏 有效的血吸虫病现症感染诊断手段， 特别是疔效考核的方法。
近年来， 从日本血吸虫全基因组中发掘反转座子的研究越来越引起人们的 重视， 许多学者已经做了大量的研究。 迄今为止， 已知的日本血吸虫反转座子 极为有限。 发明内容
本发明的目的在于提供一类血吸虫反转座子。
本发明的另一目的在于提供对应于所述的血吸虫反转座子的引物对和试 剂盒。
本发明的另一目的在于提供所述的血吸虫反转座子的应用。 在本发明的第一方面， 提供一种分离的多核苷酸， 所述的多核苷酸具有选 自 SEQ ID NO: 1-25中任一所示的核苷酸序列。 在另一优选例中， 所述的多核 苷酸具有 SEQ ID NO: 19或 SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列。
本发明的第二方面， 提供所述的多核苷酸的用途， 其作为血吸虫病检测标 志物， 或者用于所述的多核苷酸作为血吸虫病检测标志物， 或用于制备检测血 吸虫的试剂盒或 DNA芯片。
此外， 本发明的反转座子还可用于： 血吸虫遗传关系的确定； 血吸虫基因 的定位； 血吸虫各种或各亚种间的保守性分析； 血吸虫的进化分析； 或血吸虫 的品种或地域种群鉴定。
在另一优选例中， 所述的血吸虫是日本血吸虫
Figure imgf000003_0001
。 在本发明的第三方面， 提供一种引物对， 所述引物对扩增获得的扩增产物具 有选自 SEQ ID NO: 1-25中任一所示的反转座子序列。
在另一优选例中， 所述的引物 (对)是扩增 SEQ ID NO: 19或 10所示核苷酸序 列或其片段的引物， 更佳地，所示引物 (对)具有选自 SEQ ID NO: 26-29所示的序列 或 SEQ ID NO: 30-31所示的序列。
在本发明的第四方面， 提供所述的引物对的用途， 它们被用于制备检测血 吸虫基因组中是否存在对应于本发明第一方面中所述的反转座子的多核苷酸 的试剂盒。
在本发明的第五方面， 提供一种确定两种或多种样品中血吸虫之间的遗传 关系的方法， 所述方法包括-
(1) 以所述的反转座子序列作为标记；
(2) 用特异性扩增 (1)的反转座子序列的引物， 分别对所述两种或多种样品 中血吸虫的基因组 DNA进行扩增， 从而获得相应的扩增产物；
(3) 比较两种或多种样品中血吸虫的扩增产物的异同， 从而确定两种或多 种样品中血吸虫之间的遗传关系。
在另一优选例中， 通过电泳分析扩增产物的条带数目和 /或位置情况， 扩增 产物的条带数目和 /或位置一致性越高，表示两种或多种血吸虫之间的遗传关系 越近； 扩增产物的条目数目和 /或位置差异越大， 表示两种或多种血吸虫之间的 遗传关系越远。
在本发明的第六方面， 提供一种检测试剂盒， 所述的试剂盒中含有本发明 第三方面中所述的特异性引物对。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有选自下组的材料： PCR扩增试剂， 电泳试剂， 或序列分析软件。
在本发明的第七方面， 提供一种用于遗传分析的多核苷酸集 (set), 所述的 多核苷酸集包括 SEQ ID NO: 1-25中任一序列所示的反转座子序列。
在另一优选例中， 所述的多核苷酸集包括 SEQ ID NO : 1 -25 中 25种所示 的反转座子序列。
在本发明的第八方面， 提供了一种 DNA芯片， 所述 DNA芯片具有基片以及 固定于所述基片上的核苷酸序列如 SEQ ID NO : 1-25中任一所示的反转座子或 其特异性片段。
应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文（如实施 例）中具体描述的各技术特征可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案。 例如， 就某一大范围（如 10-100)的上限可以与另一优选的较小范围（如 20-80) 的下限 20进行组合， 从而构成另一范围（例如 20-100) ,反之亦然。 限于篇幅， 在此不再 累述。
本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是显而 易见的。 附图说明
图 1显示了 SjCHGCS19.Pl-P2靶序列的示意图。
图 2显示了 SjCHGCS19.Pl-P2靶序列检测敏感性。 图中各泳道如下： M: lOObp DNA Ladder分子量标准品； 1:未稀释的成虫模板 DNA; 2〜9： 分别为 1 : 10〜1 : 108稀释后的虫体模板 DNA; 最高检测灵敏度为 l : 107(21.47fg/ul); 10. 空白对照。
图 3显示了 SjCHGCS 19.P3-P4靶序列巢式 PCR检测敏感性。 图中各泳道如 下： M: 100bp DNA Ladder分子量标准品； 1〜8：分别为 1 : 10〜1 : 108稀释后的虫体 模板 DNA。 最高检测灵敏度为 1： 107(21.47fg/ul)。
图 4显示了构建 TA克隆质粒 DNA检测敏感性。 图中各泳道如下： M: 100bp DNA Ladder分子量标准品； 1〜 14：为质粒经 1： 10〜 1： 1014稀释后的 DNA检测结 果。 结果表明， 检测灵敏度为 2.02个拷贝 （对应于 1: 10"的稀释度） 。 图 5显示了 SjCHGCS19. P1-P2靶序列检测特异性。图中各泳道如下： M:100bp DNA Ladder分子量标准品； 1: 雄虫； 2: 肝组织； 3: 肝吸虫。 结果表明， 扩 增条带的大小为 303bp， 并且与肝吸虫无交叉反应。
图 6显示了 SjCHGCS19. P1-P2靶序列检测 50条尾蚴日本血吸虫感染兔血清 DNA的结果。 图中各泳道如下： M:100bp DNA Ladder分子量标准品； 1:正常兔 血清； 2:感染 3天； 3〜9：感染 1周〜 7周； 10〜18：感染 9周〜 24周 （间隔 1周检 测）； 19:阳性对照。
图 7显示了 SjCHGCS19.Pl-P2靶序列检测日本血吸虫感染兔血清 DNA的疔效 考核结果。 图中各泳道如下： M:100bp DNA Ladder分子量标准品； 1:阴性对照 (正常兔的血清） ； 2— 18: 依次为感染日本血吸虫尾蚴后 8周一 24周的外周血 清； 19-21:为吡喹酮治疗后第 18周一 20周 （感染后 25周一 27周） 血清 DNA连续 3 周转阴； 22:阳性对照（日本血吸虫成虫）。
图 8显示了 SjCHGCSlO. P1— P3靶序列的检测敏感性。 图中各泳道如下： M: lOObp DNA Ladder分子量标准品；1未稀释的成虫模板 DNA; 2〜 7: 分别为 1:10〜 1:107稀释后的虫体模板 DNA; 最高检测灵敏度为 1:106(214.7fg/ul) 8.空白对 照。
图 9显示了基于 SjCHGCS19. P1-P2靶序列通过巢式 PCR法检测日本血吸虫病 人血清 DNA结果。 图中各泳道如下： 1〜22：感染日本血吸虫不同病人血清的 DNA 模板（条带反应强度与感染度 EPG成正相关）； P:阳性对照； N:阴性对照。 具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究， 通过对日本血吸虫基因组和转录组的研 究， 发现了 25种不同类型新的反转座子序列， 其中包括 18种 LTR反转座子 SjCHGCSl〜 5" JCHGCS18)， 4种 Non-LTR反转座子、SjCHGCS19〜 S JCHGCS22)和 3 种 Penelope型的反转座子（5 '- ^/2£^0¾^〜 -/½?77£? 0^ 。 研究表明， 这 25 种新的反转座子在日本血吸虫基因组中的完整序列拷贝数从 1 个到 130 个不 等，而不完整序列拷贝数（只有反转座子的部分序列）则从 15个到 6384个不等。 如此众多的拷贝数， 使得这 25 种新的反转座子占据整个日本血吸虫基因组的 17%。 同时发现其中 21种反转座子都具有表达活性。 提示这些活动性反转座子 (mobile elements)可能在血吸虫进化， 致病性和寄生性方面起着重要的作用。 在此基础上完成了本发明。 如本文所用， 术语 "含有"或 "包括"包括了 "包含" 、 "主要由 ......构 成" 、 "基本上由 ......构成" 、 和 "由 构成" 。
如本文所用， 所述的 "反转座子序列" 和 "反转座子" 可互换使用， 均 是指具有选自 SEQ ID NO: 1-25中任一所示的核苷酸序列。
如本文所用，所述的 "多核苷酸集 "是一种多核苷酸的集合，其中含有 SEQ ID NO: 1-25中任一序列所示的多核苷酸。在用于遗传分析时， 可以从所述的多 核苷酸选出一条或多条所述的多核苷酸， 作为反转座子标记物。
如本文所用， "分离的"是指物质从其原始环境中分离出来 (如果是天然的 物质， 原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多 肽是没有分离纯化的， 但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其 他物质中分开， 则为分离纯化的。 引物
根据本发明反转座子两端的序列， 可设计一对特异引物， 通过 PCR技术将 反转座子序列扩增出来， 利用测序或电泳分析等技术就可获得其长度多态性。
因此，本发明提供了可用于扩增所述的反转座子的引物 (；对;)。所述的引物 (对；) 根据这些反转座子两端的保守序列进行设计。 引物的设计方法为本领域技术人 员所熟知的方法。 通常， 可以针对一个反转座子， 根据其两端序列设计不同种 引物， 通过 PCR试验确定最合适的引物。 更特别的， 在设计引物时， 采用相近 的 Tm温度， 以便使这些引物能够在高通量的扩增和检测中使用。 此外， 确保 引物扩增的位点的唯一性是必要的。 一般而言， 18-26 bp的寡核苷酸引物具有 较好的特异性。
采用所述的引物， 可扩增出血吸虫 (特别是日本血吸虫)基因组中相应的反 转座子。 并且， 采用相同的引物对， 以不同来源的血吸虫的基因组 DNA为模 板，可获得包含多态性反转座子结构 (如反转座子重复次数不同、或长度不同等） 的多核苷酸。 应用
本发明的反转座子及其相应的引物具有多种用途，其中包括但不限于用于： 血吸虫遗传关系的确定； 血吸虫基因的定位； 血吸虫各种或各亚种间的保守性 分析； 血吸虫的进化分析； 或血吸虫的品种鉴定。 遗传分析方法
在得知了本发明提供的各反转座子或其对应的特异性引物后， 本领域人员 可采用多种本领域已知的技术来确定血吸虫的遗传关系 (或亲缘关系）， 定位血 吸虫的基因，对血吸虫各种或各亚种间进行保守性分析，进行血吸虫进化分析， 或进行血吸虫的品种鉴定， 或血吸虫地域种群鉴定。 由于反转座子的 PCR扩增 是特异性扩增， 其稳定性和重现性都较好。
检测 PCR扩增后的产物的方法可以采用本领域人员熟知的技术，最常用最 简便的方法是采用琼脂糖凝胶电泳技术。通过比较扩增条带的数目和 /或大小来 确定扩增产物的差异。 该方法操作简单， 成本低廉。
另一种更为精细的方法是通过测序仪的基因扫描， 从而可很好地分辨出 PCR产物大小上 1-2碱基的差异。基因扫描可采用本领域人员巳知的一些软件， 例如 GenMapper 4.0 软件。 检测试剂盒或系统
本发明还提供了一种检测试剂盒或系统， 所述的试剂盒或系统中含有： 可 特异性扩增选自 SEQ ID NO: 1-25中任一所示的反转座子序列的引物 (对；)。
此外，所述的试剂盒中还含有各种分析血吸虫遗传关系、定位血吸虫基因、 血吸虫各种或各亚种间保守性分析、 血吸虫进化分析或血吸虫品种鉴定所需的 其它材料。 例如可以包含选自下组的材料： PCR扩增试剂， 电泳试剂， PCR产 物纯化试剂， 或序列分析软件。 这些试剂均可以是本领域人员常规使用的。
此外， 所述的试剂盒中还可含有的使用说明书， 以说明所述试剂盒的使用 方法， 给出较合适的使用条件。 本发明的优点和效果：
1. 开发出一类血吸虫特异的反转座子，所述的反转座子有助于阐明日本血 吸虫种群之间的遗传差异。
2. 针对各反转座子的特异性引物 (对；)， 所述引物扩增效果良好， 扩增产物 唯一。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方 法， 通常按照常规条件如 Sambrook等人， 分子克隆： 实验室指南 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建 议的条件。 除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。 实施例 1 反转座子的获得以及引物设计
1. 日本血吸虫成虫样本 DNA的抽提 采用 DNA的酚抽提和乙醇沉淀法：
1) 取单条虫置入 200 μΐ提取缓冲液洗涤虫体 3次， 2 000 g 离心 2 min 分离 洗液；
2)吸干洗涤液， 加入 20 μ1 抽提缓冲液， 用 RNAase-free 的灭菌小碾磨棒， 碾磨虫体至匀浆；
3)加入提取缓冲液至终体积 50 μΐ ;
4)加入 0.5 μΐ RNAase(10 ug/μΐ), 5μ1 SDS(10%)， 0.5 μΐ 蛋白质消化酶， 用 枪反复混匀；
5)在复式水浴恒温振荡器中 110转 /分 56 °C 消化 l h;
6)加入等体积 50 μΐ苯酚： 氯仿：异丙醇为 25 : 24： 1的混合液， 混匀， 10 000 g,离心 5 min;
7) 取上清， 加入 50 μΐ氯仿： 异丙醇为 24 : 1的混合液， 混匀， 10000 g,离 心 5 min;
8) 取上清， 加入 80 μΐ无水乙醇， 混匀， -30 °C过夜；
9)加入 1 ml 70 %乙醇， 10000 g， 离心 15 min;
10) 取下层溶液加入 10 μ1 ( Η20， 待用。
或采用蛋白酶 Κ消化法-
1) 用 200 μ1 ϋΝΤ 缓冲液 洗涤虫体 3次， 2 000 g,离心 2 min分离洗涤液；
2) 吸干洗涤液， 加入 20 l GNT 缓冲液， 用一根 RNAase-free 的灭菌小碾 磨棒， 碾磨虫体至匀浆；
3) 加入 40 1 GNT 缓冲液， 旋转 10 s;
14) 加入 Ι μΐ蛋白酶消化酶， 用移液器反复混匀，在复式水浴恒温振荡器中 1 10转 /分于 56 °C消化 l h;
5) 10000 g,离心 5 min， 室温放置， 转移上清至一只干净 1.5 ml EP管中； 6) 加入 50 μΙ ΝΙϋ缓冲液， 振荡 30 s， 置室温 3 min;
7) 旋转混合 30 s， 95 。C 15 min灭活蛋白酶消化酶；
8) 10000 g , 离心 5 min, 取上清至一干净 1.5 ml EP管中， 待用。
2. 反转座子的获得
对提取的 DNA进行测序， 获得基因组序列数据。 然后从基因组数据库获 取初始数据， 经过进一步分析、 实验和选择， 最后获得 25 个反转座子， 它们 的序列依次如 SEQ ID NO: 1 25所示。
基于 SEQ ID NO: 1— 25所示的序列， 采用 Primer 5.0软件设计引物， 分别 合成 25对特异性引物。 以日本血吸虫样本的全基因组 DNA为模板， 扩增出相 应的对于 25种反转座子的扩增产物。
PCR循环条件为： 95 °C 5 mm; 94 °C 45 s， 55 °C 45 s， 72 °C 45 s， 30个 循环； 72 °C 10 min。PCR反应体系为： 25 ng基因组DNA， 2个单位的 SBS Taq 聚合酶，双向引物各 10 pm, 1.25 mM MgCl2， 1 μΐ 10 X反应缓冲液， 0.5 μΐ dNTPs (2.5 mM， TaKaRa)。
用常规方法对 PCR产物进行纯化， 然后进行遗传学特征分析， 遗传分析方 法如下：
(1) .对 PCR产物进行电泳鉴定
通过电泳分析扩增产物的条带数目和 /或位置情况，扩增产物的条带数目和 /或位置一致性越高， 表示两种血吸虫之间的遗传关系越近； 扩增产物的条目数 目和 /或位置差异越大， 表示两种血吸虫之间的遗传关系越远。
(2) . 样本的基因扫描
PC 产物用 ABI 3730 XL 自动测序仪分离， 以 ABI Genescan-500 LIZ (Applied Biosystems) 分子内标测定 PCR 产物的 DNA片段的确切长度。 并用 ABI 3730 XL和 GenMapper 4.0 软件 (Applied Biosystems)进行初始数据处理。 结果：
25种不同类型新的反转座子序列 (如表 1所示；)， 其中包括 18种 LTR反转座子 (SJCHGCS 1〜SJCHGCS 18)， 4种 Non-LTR反转座子 CSjCHGCS 19〜SjCHGCS22) 和 3种 Penelope型的反转座子（Sj-penelope l〜Sj-penelope3)。 研究表明， 这 25种 新的反转座子在日本血吸虫基因组中的完整序列拷贝数从 1个到 130个不等， 而 不完整序列拷贝数 (只有反转座子的部分序列；)则从 15个到 6384个不等。 如此众 多的拷贝数， 使得这 25种新的反转座子占据整个日本血吸虫基因组的 17%。 同 时发现其中 21种反转座子都具有表达活性。 提示这些活动性反转座子 (mobile dements)可能在血吸虫进化， 致病性和寄生性方面起着重要的作用。
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表 1 25个日本血吸虫反转座子
完整拷贝的 不完整拷贝 反转座子名称 长度 (bp) LTR Pol Pro RT RNH Int
数 的数曰 NO:
LTR 反转座子
SJCHGCS1 5249 332 1360-4437 1360-1615 1876-2937 2695-3025 3265-3802 130 1650 1
SjCHGCS2 4945 361 430-4482 1480-1741 1939-2503 2758-3163 3442-3958 32 930 2
SjCHGCS3 4451 292 320-4201 1100-1349 1607-2168 2420-2735 3053-3590 17 646 3
SjCHGCS4 4710 312 325-4407 1153-1555 1741-2311 2563-2932 3214-3763 6 208 4
SjCHGCS5 2148 304 338-1870 1286-1574 19 762
SJCHGCS6 4839 353 379_4476 1327-1720 1891-2461 2713-3070 3394-3913 11 826 6
SJCHGCS7 4000 409 13-2870 513-666 816-1323 1539-1908 2145-2643 6 600 7
SjCHGCSH 4865 932-3817 1091-1655 1895-2255 2678-3281 2 662 8
SjCHGCS 4779 308 316-4467 1213-1609 1795-2365 2617-2986 3268-3814 4 294 9
SjCHGCSlO 5025 868-4065 988-1342 1513-2080 2335-2680 2914-3457 29 758 10
SjCHGCSH 6488 559 861-4898 1788-2139 2310-2874 3126-3480 3711-4251 5 542 11
SjCHGCSH 4965 415 438-4541 1401-1797 1965-2535 2787-3144 3474-3993 12 605 12
SjCHGCSi3 5099 527 573-4478 1623-1887 2091-2655 2910-3315 3597-4113 9 628 13
SjCHGCS14 5211 399-4922 1383-1647 2295-2859 3129-3519 3801-4317 3 381 14
S CHGCS15 4711 190 329-4378 1385-1649 1886-2450 2705-3110 3389-3905 5 479 15
SjCHGCS16 7232 1236 806-5830 2006-2438 2828-3647 3812-4277 4721-5309 1 515 16
SjCHGCSH 6960 995 940-5982 2140-2554 3241-3811 4057-4423 4855-5461 3 508 17
SjCHGCSIS 5985 400 386-5626 1694-2108 2786-3356 3596-3965 4412-5018 7 532 18
Non-LTR反转座子
SJCHGCS19 3145 108-3131 82 2384 19
S CHGCS20 3578 610-3366 16 1530 20
S CHGCS21 4275 266-4039 1 15 21
SjCHGCSH 3768 不完整 1 386 22
Penelop 样兀 ^(Penelope-like el ement)
Sj-penelope I "50 756-3215 2 700 2
Sj-penelope2 2734 137 405-2051 10 643 24
Sj-penelope3 2512 230-1732 528 25
本发明人对 LTR, Non-LTR和 pene lope型的反转座子也进行了结构分析。 在 18种 LTR反转座子中， 除 SjCHGCS8, SjCHGCSW W SjCHGCSim 剩余 15 种 LTR反转座子都在两端具有长末端重复序列（LTR)， 长度从 190bp到 1236bp 不等；所有的 18种 LTR反转座子都具有完整的 polyprote in编码框；除 SJCHGC5 和 SjCHGC8 ^ , 剩余 16种 LTR反转座子在 pol yprote in编码框中， 都能区分 出蛋白酶（Proteas e)， 反转录酶（Reverse Transcr i ptase)， RNA酶 H (RNaseH) 和整合酶（Inte grase)的编码基因； SJdC ^中只能鉴定出蛋白酶的编码序列， SJ^ ^S中则是无法鉴定出蛋白酶的编码序列。 4种 Non-LTR和 3种 pene lope 型的反转座子中， 只有 SJCHGCS22 没有完整的 po lyprote in 编码框，而
Figure imgf000011_0001
的两端则发现有一段长 137bp的反向重复序列。
基于对这 25 种新的日本血吸虫反转座子序列的精确分析， 本发明人认为 这些新发现的反转座子序列可作为潜在的血吸虫病检测标志物， 并且可从中寻 找与日本血吸虫的致病性和免疫逃避等相关的靶点， 可利用这些反转座子作为 基因治疗的载体， 帮助研究抗血吸虫病的疫苗以及药物。 实施例 2
基于反转座子 SjCHGCS 19的检测方法和应用
诊断在血吸虫病防治活动中始终处于中心位置。 迄今为止， 病原学检查， 即从流行区人的粪便中查见虫卵， 仍是血吸虫病惟一的确定诊断途径和手段。 某种病原体感染机体时， 把它们的基因也带入人体， 理论上讲， 只要病原体存 在， 机体内就会有其核酸物质存在。 针对表 1中所列出的日本血吸虫基因组中 的 25 个反转座子， 在本实施例中选用反转座子 S jCHGCS 19 (SEQ ID NO : 19) 作为代表进行深入研究。
结果表明， 反转座子 SjCHGCS 19多核苷酸适合作为血吸虫病检测标志物， 也适合用于制备检测血吸虫的试剂盒或 DNA芯片。
例如， 将 SjCHGCS 19 P I— P2片段 ( 303bp ) 及其 SjCHGCS 19 P3— P4片段 ( 607bp ) (S 19 P I 引物： AAGGCGTTTGACAGCGTAG (SEQ ID NO : 26)； S19 P2 引 物： ATCATCCGCGAAGTCCAG (SEQ ID NO : 27)； S19 P3引物： CCAAATCGCAACACTACGC (SEQ ID NO : 28)； S19 P 引物： ATCGGATTCTCCTTGTTCAT (SEQ ID NO : 29) ) 作为靶序列（图 1)， 应用巢式 PCR法检测日本血吸虫特异性 DNA显示出极高的 敏感性和特异性， 其中敏感性可提高至 2拷贝（图 2、 图 3和图 4)，并且与肝吸 虫无交叉反应（图 5)。
进一步对感染日本血吸虫动物模型血清 DNA检测结果表明， 从感染 50条 尾蚴日本血吸虫后 3天的家兔血清中即可扩增出分子量为 303bp的日本血吸虫 特异性 DNA片段（图 6)。 此外， 还检测了感染 1500条， 500条， 200条， 100 条和 30条尾蚴日本血吸虫感染的兔的血清 DNA， 均获得了与图 6—致的结果。 因此， 本发明方法非常适用于早期检测。
此外， 对经吡喹酮治疗后的血清样本检测结果显示， 本发明的反转座子具 有较好的疗效考核价值， 血清中日本血吸虫 DNA于治疗后 17周转阴而其特异性 抗体仍维持在高水平（图 7)。
此外， 应用 SjCHGCS 19. Pl— P2靶序列对日本血吸虫病慢性病人的血清进行 DNA检测， 结果如表 1和图 9所示。
表 1 巢式 PCR法对日本血吸虫病病人血清 DNA检测结果
方法 病人血清样本 阳性数 阳性检出率正常人血清样本阳性数阳性检出率 巢式 PCR 100 96 96. 0% 20 0 0% 注： 100例病人血清来自湖南省血吸虫病疫区， 均为 EPG检测阳性。 令人特别感兴趣的是， 如图 9所示， 感染日本血吸虫不同病人血清的 DNA 的扩增条带反应强度与感染度 EPG成正相关。 实施例 3
基于反转座子 SjCHGCS 10的检测方法和应用
与实施例 2类似， 在本实施例中选用反转座子 SjCHGCS 10(SEQ ID NO: 10) 作为代表进行深入研究。
日本血吸虫反转座子 SjCHGCS lO. P1— P3靶序列检测敏感性结果如图 8所 示， 其最高检测灵敏度为 l : 10s (214. 7fg/ul)。 其中引物为 SjCHGCSl O. PI : GCCAGTGGGCATCTCCTT (SEQ ID NO : 30)； SjCHGCS lO. P3： CGGGCTGGCAATCAGTAA (SEQ ID NO : 31)。
此外， 应用 SjCHGCSl O. PI— P3 靶序列对日本血吸虫病慢性病人的血清进 行 DNA检测。 与实施例 2的检测结果类似， 阳性检出率也高达 92%以上，并且 DNA 的扩增条带反应强度也与感染度 EPG成正相关。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

权 利 要 求
1. 一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸具有选自 SEQ ID NO: 19、 1-18和 20-25中任一所示的核苷酸序列。
2. 权利要求 1所述的多核苷酸的用途， 其特征在于， 所述的多核苷酸作为血 吸虫病检测标志物， 或用于制备检测血吸虫的试剂盒或 DNA芯片。
3. 一种引物对， 其特征在于， 所述引物对扩增获得的扩增产物具有选自 SEQ ID NO: 1-25中任一所示的反转座子序列。
4. 如权利要求 3所述的引物对的用途， 其特征在于， 用于制备检测血吸虫 基因组中是否存在对应于权利要求 1所述的反转座子的多核苷酸的试剂盒。
5. 一种确定两种或多种样品中血吸虫之间的遗传关系的方法， 其特征在 于， 所述方法包括以下步骤-
(1) 以权利要求 1所述的反转座子序列作为标记；
(2) 用特异性扩增 (1)的反转座子序列的引物， 分别对所述两种或多种样品 中血吸虫的基因组 DNA进行扩增， 从而获得相应的扩增产物； 和
(3) 比较两种或多种样品中血吸虫的扩增产物的异同， 从而确定两种或多 种样品中血吸虫之间的遗传关系。
6. 一种检测试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂盒中含有权利要求 3所述的 引物对。
7. 如权利要求 6所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂盒中还含有 选自下组的材料： PCR扩增试剂， 电泳试剂， 或序列分析软件。
8. 一种用于遗传分析的多核苷酸集， 其特征在于， 所述的多核苷酸集包括 SEQ ID NO: 1-25中任一序列所示的反转座子序列。
9. 如权利要求 8所述的多核苷酸集， 其特征在于， 所述的多核苷酸集包括 SEQ ID NO: 1-25中 25种所示的反转座子序列。
10. 一种 DNA芯片， 其特征在于， 所述 DNA芯片具有基片以及固定于所述 基片上的核苷酸序列如 SEQ ID NO : 1-25 中任一所示的反转座子或其特异性片 段。
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