WO2010016621A1 - 機能改善したｒｎａポリメラーゼ変異体 - Google Patents

機能改善したｒｎａポリメラーゼ変異体 Download PDF

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WO2010016621A1
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rna polymerase
amino acid
seq
mutant
rna
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PCT/JP2009/064323
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大江正剛
佐藤寛
井出輝彦
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東ソー株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
    • C12Q2521/119—RNA polymerase

Definitions

  • the present invention introduces a mutation into a part of the amino acid sequence of wild-type RNA polymerase to thereby improve the RNA polymerase having an improved function, in particular, the RNA polymerase having improved thermal stability and / or specific activity, and coding for the RNA polymerase. And a method for producing RNA using the RNA polymerase, and a method for producing RNA using the RNA polymerase.
  • the present invention relates to mutant RNA polymerases obtained from bacteriophages, in particular T7 RNA polymerase, which have improved stability and / or specific activity over wild type under high temperature conditions.
  • Bacteriophages that can infect E. coli include T3, T7, ⁇ I, ⁇ II, W31, H, Y, A1, croC21, C22, and C23, of which the RNA polymerase encoded by the T7 phage is T7 RNA polymerase.
  • T7 RNA polymerase first, there is a high selectivity for a promoter sequence.
  • T7 RNA polymerase binds to its own specific promoter sequence, but does not bind to other promoter sequences, even from other bacteriophage promoter sequences. This high selectivity ensures that the RNA polymerase transcription reaction is directed against its own genome and not against the host genome.
  • T7 RNA polymerase has a series of performances such as recognizing a promoter, initiating transcription, extending RNA transcript, and terminating transcription without the need for cofactors. The transcription rate is also 5 times faster than that of E. coli RNA polymerase.
  • the molecular weight is a single chain protein of 98.6 kDa and 883 amino acids, easy mass production of the enzyme is possible.
  • the T7 RNA polymerase having the advantages described above is actively used in various fields.
  • high expression system in Escherichia coli US Pat. No. 4,952,496: Patent Document 1
  • cell-free protein It is used in synthesis systems, base sequence determination methods (Japanese Patent Laid-Open No. 11-18799: Patent Document 2)
  • isothermal nucleic acid amplification methods Japanese Patent Laid-Open No. 11-18799: Patent Document 2
  • Details of the TRC method Japanese Patent Laid-Open No. 2000-14400: Patent Document 3 and Ishiguro T. et al., Analytical Biochemistry, 314, 77-86 (2003): Non-Patent Document 1
  • is one of isothermal nucleic acid amplification methods which is one of isothermal nucleic acid amplification methods.
  • isothermal nucleic acid amplification methods explained in vitro transcription, high expression system in Escherichia coli (US Pat. No. 4,952,496: Patent Document
  • the TRC method is a method of amplifying a target RNA containing a specific RNA sequence by a concerted action of a DNA-dependent RNA polymerase and a reverse transcriptase. That is, double-stranded DNA containing a promoter sequence is synthesized with a primer containing a T7 promoter sequence, reverse transcriptase and ribonuclease H with respect to target RNA, and RNA consisting of a specific RNA sequence is synthesized with T7 RNA polymerase. Thereafter, the generated RNA is used as a template for synthesizing double-stranded DNA containing the promoter sequence, and the above reaction is performed in a chain manner.
  • the nucleic acid amplification method by the TRC method is capable of reacting at a constant temperature, and thus has an advantage of not requiring complicated temperature control.
  • nucleic acid amplification using the TRC method was performed using wild-type T7 RNA polymerase, a decrease in nucleic acid amplification efficiency was observed due to a decrease in T7 RNA polymerase activity under conditions of 46 ° C. or higher. Therefore, nucleic acid amplification by the current TRC method is generally performed under relatively low temperature conditions such as 40 ° C. to 45 ° C.
  • RNA tends to have a complex higher order structure, which has made it difficult to design a primer for highly sensitive detection in the TRC method. Therefore, a T7 RNA polymerase having high thermal stability and / or specific activity has been demanded even at a temperature of 46 ° C. or higher.
  • a system for measuring the activity of T7 RNA polymerase has been established for RNA polymerases having various improved functions by mutation (Ikeda RA et al., Biochemistry, 31, 9073-9080 (1992): Non-patented.
  • Several documents have been prepared so far from Document 2 and Ikeda RA et al., Nucl. Acid. Res., 20, 2517-2524 (1992): Non-patent document 3).
  • Patent Document 4 an enzyme in which a promoter sequence recognized by amino acid substitution is modified (US Pat. No. 5,385,834: Patent Document 4), an enzyme having improved specific activity and thermal stability at high temperature (Japanese Patent Publication No. 2003-525627: Patent Document 5) ), An enzyme whose 3′-deoxyribonucleotide uptake ability is enhanced by amino acid deletion and substitution (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-61683: Patent Document 6).
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a T7 RNA polymerase mutant having improved thermostability and / or specific activity as compared with the wild type and a method for producing the same.
  • amino acid sites with improved thermal stability or specific activity were found by substituting the amino acids of wild-type T7 RNA polymerase by genetic engineering techniques. A mutant with improved sex or specific activity was successfully created. Furthermore, by combining a mutation at an amino acid site with improved thermal stability and a mutation at an amino acid site with improved specific activity, a mutant with improved thermal stability and specific activity was successfully created.
  • a T7 RNA polymerase variant in which at least the amino acid residue corresponding to the 786th glutamine and / or the 179th lysine in the amino acid sequence constituting the wild type T7 RNA polymerase shown in SEQ ID NO: 6 is substituted with another amino acid is provided.
  • the present inventors have found that heat stability and / or heat stability is improved as compared with wild type T7 RNA polymerase. Furthermore, by replacing the amino acid residue at a site different from the above site, that is, the amino acid residue corresponding to the 685th valine with another amino acid, it is thermostable and / or thermostable compared to wild type T7 RNA polymerase. We found that the performance is improved.
  • the present invention includes the following inventions: (1) An amino acid residue corresponding to at least one selected from the group consisting of the 786th glutamine, the 179th lysine and the 685th valine among the amino acid sequences constituting the wild type T7 RNA polymerase shown in SEQ ID NO: 6 Is a T7 RNA polymerase variant characterized in that is substituted with another amino acid and has improved thermal stability and / or specific activity as compared to RNA polymerase of wild type T7-like bacteriophage.
  • the amino acid residue corresponding to at least the 786th glutamine is substituted with a hydrophobic amino acid, and compared with the RNA polymerase of the wild type T7-like bacteriophage
  • a T7 RNA polymerase variant characterized by improved thermostability and / or specific activity.
  • the amino acid residue corresponding to at least the 786th glutamine is substituted with leucine or methionine, and compared with the wild-type T7-like bacteriophage RNA polymerase.
  • a T7 RNA polymerase variant characterized by improved thermostability and / or specific activity.
  • T7 RNA polymerase variant characterized by improved thermostability and / or specific activity compared to the RNA polymerase of.
  • the amino acid residue corresponding to at least the 685th valine is further substituted with a neutral or weakly hydrophobic amino acid, and the wild type T7-like bacterio
  • a T7 RNA polymerase variant characterized by improved thermal stability and / or specific activity (9) Among the amino acid sequences constituting the wild type T7 RNA polymerase shown in SEQ ID NO: 6, at least the amino acid residue corresponding to the 685th valine is substituted with alanine, and compared with the wild type T7 RNA polymerase, the heat stability and / or Alternatively, a T7 RNA polymerase mutant characterized by an increase in specific activity.
  • T7 RNA polymerase variant in which the amino acid residue corresponding to glutamine at position 786 is replaced with leucine or methionine.
  • (12) A gene encoding the T7 RNA polymerase mutant of any one of (1) to (11).
  • (123) A cell capable of producing a T7 RNA polymerase by expressing a gene encoding the T7 RNA polymerase mutant of any one of (1) to (11).
  • (14) A method for producing T7 RNA polymerase by expressing a gene encoding the T7 RNA polymerase mutant of any one of (1) to (11).
  • 15 A method for producing RNA using the T7 RNA polymerase mutant according to any one of (1) to (11).
  • T7 RNA polymerase mutant A method for amplifying RNA using the T7 RNA polymerase mutant according to any one of (1) to (11). Since the mutant T7 RNA polymerase of the present invention has improved thermostability and / or specific activity compared to the wild type T7 RNA polymerase, the transcription reaction and / or transcription reaction in a wider temperature range than the wild type strain. Time can be expected to be shortened.
  • FIG. 1 shows a restriction map of plasmid pTrc99A-T7RNApol in which T7 RNA polymerase has been cloned.
  • FIG. 2 shows a restriction map of the pCDF2 plasmid.
  • FIG. 3 shows a restriction map of plasmid pCDF2-T7RNAP that produces T7 RNA polymerase.
  • FIG. 4 shows a restriction map of plasmid pCDF2-T7RNAPHis that produces T7 RNA polymerase fused with a histidine hexamer at the N-terminus.
  • FIG. 5 shows a restriction map of pSTVGFP having a GFP gene whose expression is induced by the T7 promoter.
  • FIG. 6 shows the results (electrophoresis photograph) comparing the thermal stability of the prepared wild type of T7 RNA polymerase with its mutants K179E, Q786L and double mutant (K179E + Q786L) with heating at 47 ° C.
  • lane 1 is the wild type
  • lane 2 is the K179E mutant
  • lane 3 is the Q786L mutant
  • lane 4 is the result when the (K179E + Q786L) mutant T7 RNA polymerase is used.
  • FIG. 7 shows the results of comparison of the amount of RNA produced at 43 to 50 ° C. for each of the prepared T7 RNA polymerase wild type and its mutants K179E, Q786L and double mutant (K179E + Q786L).
  • FIG. 8 shows the results of comparison of the amount of RNA produced at 43 to 50 ° C. between the prepared wild type of T7 RNA polymerase and its mutants K179E, K179C, and K179N.
  • FIG. 9 shows the results of comparison of the amount of RNA produced at 43 to 50 ° C. between the prepared T7 RNA polymerase wild type and its mutants Q786L, Q786M, Q786F, and Q786Y.
  • FIG. 10 shows the results of comparing the thermal stability of each of wild-type T7 RNA polymerase, mutant T7 RNA polymerase Q786L, Q786M, Q786F, Q786Y, K179E, K179C, and K179N with respect to heating at 47 ° C.
  • FIG. 11 shows the results of comparison of RNA production amounts at 43 to 50 ° C. for wild type T7 RNA polymerase, (K179E + Q786L) double mutant, and (K179E + Q786L + V685A) triple mutant, respectively.
  • FIG. 12 shows the results of comparing the thermal stability of each of wild-type T7 RNA polymerase, (K179E + Q786L) double mutant, and (K179E + Q786L + V685A) triple mutant when heated at 48 ° C.
  • FIG. 13 shows the results of isothermal nucleic acid amplification reaction by TRC method using Salmonella stn RNA as a target and wild type T7 RNA polymerase and (Q786L + V685A) double mutant.
  • FIG. 12 shows the results of comparing the thermal stability of each of wild-type T7 RNA polymerase, (K179E + Q786L) double mutant, and (K179E + Q786L + V685A) triple mutant
  • FIG. 14 shows the results of comparison of RNA production amounts at 43 to 49 ° C. for wild-type T7 RNA polymerase and V685A mutant, respectively.
  • FIG. 15 shows the results of comparing the thermal stability of the wild type T7 RNA polymerase and the V685A mutant with respect to heating at 46 ° C.
  • FIG. 16 shows the results of comparing the RNA production amounts at 43 ° C. to 50 ° C. for each of the wild type T7 RNA polymerase, the V685A mutant, and the (V685A + Q786M) double mutant.
  • the T7 RNA polymerase having improved thermostability and / or specific activity disclosed in the present invention is glutamine at least at position 786 in the amino acid sequence constituting the wild-type T7 RNA polymerase shown in SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid residue corresponding to is substituted with another amino acid, preferably the substituted amino acid is a hydrophobic amino acid (leucine, methionine, phenylalanine, tyrosine), more preferably the substituted amino acid is leucine or Methionine.
  • amino acid residue corresponding to the 786th glutamine refers to a glutamine residue at the 786th, based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the position is shifted by the length of the added or deleted polypeptide (for example, from the sequence shown in SEQ ID NO: 6).
  • the amino acid residue corresponding to the 786th glutamine is glutamine at the 796th).
  • the T7 RNA polymerase with improved thermostability and / or specific activity disclosed in the present invention is a lysine of at least the 179th position in the amino acid sequence constituting the wild-type T7 RNA polymerase shown in SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid residue corresponding to is substituted with another amino acid, preferably the substituted amino acid is glutamic acid, asparagine, or cysteine, and more preferably the substituted amino acid is glutamic acid.
  • the “amino acid residue corresponding to the 179th lysine” refers to the 179th lysine residue based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6,
  • the T7 RNA polymerase with improved thermostability and specific activity disclosed in the present invention corresponds to at least the 786th glutamine in the amino acid sequence constituting the wild-type T7 RNA polymerase shown in SEQ ID NO: 6.
  • amino acid residue corresponding to the 179th lysine are each substituted with another amino acid, and preferably the 786th amino acid residue is any of hydrophobic amino acids (leucine, methionine, phenylalanine, tyrosine).
  • the 179th amino acid residue is substituted with any one of glutamic acid, asparagine, and cysteine, more preferably the 786th amino acid residue is replaced with leucine or methionine, and the 179th amino acid residue is replaced with glutamic acid, asparagine. Cysteine It is obtained by replacing each or Re.
  • the T7 RNA polymerase having improved thermostability and / or specific activity disclosed in the present invention is an amino acid sequence constituting the wild-type T7 RNA polymerase shown in SEQ ID NO: 6 at least at the 685th valine.
  • the corresponding amino acid residue is substituted with another amino acid, and preferably the amino acid is substituted with any of neutral or weakly hydrophobic amino acids (alanine, glycine, serine, threonine, cysteine, asparagine, glutamine). More preferably, the substituted amino acid is alanine.
  • the “amino acid residue corresponding to the 685th valine” refers to the valine residue at the 685th position based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the position is shifted by the length of the added or deleted polypeptide (for example, from the sequence shown in SEQ ID NO: 6).
  • the amino acid residue corresponding to the 685th valine is the 695th lysine).
  • the T7 RNA polymerase with improved thermostability and / or specific activity disclosed in the present invention is the above-mentioned 685th valine among the amino acid sequences constituting the wild-type T7 RNA polymerase shown in SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid residue corresponding to the 179th lysine and / or the 786th glutamine is substituted with another amino acid residue, preferably the 179th lysine.
  • the amino acid residue corresponding to is substituted with glutamic acid and / or the amino acid residue corresponding to the 786th glutamine is replaced with leucine or methionine, respectively.
  • the “amino acid residue corresponding to the 179th lysine and / or the 786th glutamine” refers to the 179th lysine and / or 786 based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. This is the second glutamine residue, and when a polypeptide is added or deleted to the 5 ′ end side of T7 RNA polymerase comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 6, the length of the added or deleted polypeptide is The position is shifted by the minute.
  • the mutant T7 RNA polymerase of the present invention can be prepared by introducing a mutation into the wild type T7 RNA polymerase gene.
  • DNA having mutations can be constructed by appropriately using known techniques such as site-directed mutagenesis, PCR using degenerate oligonucleotides, exposure of cells containing nucleic acids to mutagens or radiation. it can.
  • the wild-type T7 RNA polymerase gene may be obtained by any method that can be obtained by those skilled in the art. For example, an appropriate one prepared from the genome information from T7 phage (DSM No. 4623, ATCC 11303-B7, NCIMB10380, etc.) Can be obtained by PCR using simple primers.
  • the method for obtaining the enzyme of the present invention is not particularly limited, and may be a protein synthesized by chemical synthesis or a recombinant protein produced by a gene recombination technique.
  • the target enzyme can be obtained by incorporating the T7 RNA polymerase gene into a host by an appropriate method.
  • the host to be used various cultured cells such as yeast, animal cell lines, plant cells and insect cells can be used.
  • the T7 RNA polymerase gene E. coli which is the original bacteriophage infection site and is easy to handle is used as the host. It is desirable to use as. Examples of E.
  • the coli used for transformation include, but are not limited to, JM109 strain and HB101 strain.
  • the gene of the present invention can be used by inserting it into an appropriate vector.
  • the type of the vector used in the present invention is not particularly limited, and may be, for example, a self-replicating vector, or may be incorporated into the host cell genome when introduced into the host cell.
  • the vector used in the present invention is an expression vector.
  • the gene of the present invention is functionally linked to elements necessary for transcription (for example, a promoter and the like).
  • a promoter is a DNA sequence that exhibits transcriptional activity in a host cell, and can be appropriately selected according to the type of host. Examples of promoters that can be used in E.
  • coli include the lac, trp, and tac promoters.
  • E. coli When E. coli is used as a host, a method of transforming by inserting a gene of interest into an appropriate plasmid is convenient.
  • plasmids to be used include plasmids for expression such as pTrc99A (manufactured by GE Healthcare Bioscience) and pCDF-1b (manufactured by Takara Bio).
  • the vector obtained can be used.
  • a T7 RNA polymerase gene to be prepared may be added with a sequence useful for enzyme purification.
  • a signal peptide can be used to make an extracellular secretory enzyme, or a gene can be prepared so that a tag sequence containing histidine hexamer at the end is added as a signal peptide.
  • the type of signal peptide and the method for binding the signal peptide and the present enzyme are not limited to the above methods, and any signal peptide available to those skilled in the art can be used.
  • the produced transformant can be obtained by culturing in an appropriate nutrient medium under conditions that allow expression of the introduced DNA construct. For isolation and purification from the culture of the transformant, isolation and purification methods commonly used for proteins may be used.
  • the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an appropriate aqueous buffer, and then disrupted by lysozyme treatment or an ultrasonic disrupter. A cell-free extract is obtained. Further, the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract is purified by an ordinary protein isolation and purification method.
  • solvent extraction method salting-out method using ammonium sulfate, desalting method, precipitation method using organic solvent
  • anion exchange chromatography method using resin such as diethylaminoethyl (DEAE) Toyopearl (trade name) (manufactured by Tosoh Corporation), butyl Electrophoresis such as hydrophobic chromatography using resins such as Toyopearl and Phenyl Toyopearl (trade name) (manufactured by Tosoh), gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, isoelectric focusing
  • a purified preparation can be obtained by using methods such as methods alone or in combination.
  • a method of purifying by a corresponding method using a signal peptide is also simple, and for example, it can be easily purified by using a histidine hexamer sequence and a nickel column.
  • the T7 RNA polymerase mutant of the present invention can also be obtained by chemical synthesis, for example.
  • the enzyme of the present invention described above can be used in various applications as a conventionally known T7 RNA polymerase. That is, the enzyme of the present invention can be used as an RNA polymerase for synthesizing RNA.
  • RNA polymerase of the present invention can also be used in an isothermal nucleic acid amplification reaction that amplifies a target RNA containing a specific RNA sequence by a concerted action with reverse transcriptase.
  • isothermal nucleic acid amplification reaction examples include TRC method (Patent Document 3 and Non-Patent Document 1), NASBA method, TMA method and the like.
  • the T7 RNA polymerase mutant of the present invention has improved thermostability and / or specific activity compared to wild-type T7 RNA polymerase. Therefore, it can be stored easily compared to the wild type, and can be stored for a long time. Therefore, it is possible to provide a reagent that is easy to use and can be used for a long period of time. Further, since the T7 RNA polymerase mutant of the present invention can be used under higher temperature conditions than the wild type, it is possible to improve the experimental conditions in transcription reactions and isothermal nucleic acid amplification reactions, regardless of whether they are in vitro or in vivo. It can be used in a wider temperature range than the wild type.
  • the nucleic acid amplification reaction can be performed under a relatively low temperature condition of 40 ° C. to 45 ° C. I had to do it.
  • RNA tends to have a complex higher order structure, which has made it difficult to design a primer for highly sensitive detection.
  • the T7 RNA polymerase mutant of the present invention has improved stability and / or specific activity over the wild type at a temperature of 46 ° C. or higher.
  • the nucleic acid amplification reaction by the TRC method can be performed under a temperature condition of 46 ° C. or higher, and a nucleic acid amplification reagent having a detection time shorter than that of the conventional method can be provided. Moreover, since it becomes difficult for RNA to take a complicated higher-order structure under high temperature conditions, it is easy to design a primer for detecting with higher sensitivity. Therefore, a nucleic acid amplification reagent that can be detected with higher sensitivity than before can be provided by performing a nucleic acid amplification reaction by the TRC method at a temperature of 46 ° C. or higher using the T7 RNA polymerase mutant of the present invention.
  • Example 1 Cloning of T7 RNA polymerase gene Cloning of the T7 RNA polymerase gene was performed according to the following method. (1) Using the T7 phage genomic DNA genomic library (manufactured by Sigma) as a template plasmid, the T7 RNA polymerase gene was amplified using the PCR method with the following reagent composition and reaction conditions divided into the first half and the second half.
  • the synthetic DNA primer includes primer FF (SEQ ID NO: 1) and primer FR (SEQ ID NO: 2) for the first half amplification, and primer RF (SEQ ID NO: 3) and primer RR for the second half amplification.
  • coli strain JM109 and LBG / Crb agar medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 0.5% glucose, 1% agar, 50 ⁇ g) / ML carbenicillin (pH 7.4)), and the plasmid retained by the colonies grown after overnight culture at 37 ° C. was designated as pTrc99A-T7F.
  • pTrc99A-T7F plasmid retained by the colonies grown after overnight culture at 37 ° C.
  • the PCR product in the latter half was digested with restriction enzyme HindIII, and reacted with pTrc99A-T7F digested with restriction enzyme HindIII at 4 ° C. for 30 minutes using T4 ligase.
  • the reaction solution of (5) is transformed into E. coli strain JM109, and LBG / Crb agar medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 0.5% glucose, 1% agar, 50 ⁇ g) / ML carbenicillin (pH 7.4)), and the plasmid retained by the colonies grown after overnight culture at 37 ° C. was designated as pTrc99A-T7RNApol.
  • FIG. 1 shows a restriction map of pTrc99A-T7RNApol.
  • the T7 RNA polymerase gene was determined by using the method shown in Example 6 to confirm that no unintended mutation was introduced.
  • T7 RNA polymerase The gene sequence of the obtained T7 RNA polymerase is shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • SEQ ID NO: 5 The gene sequence of the obtained T7 RNA polymerase is shown in SEQ ID NO: 5.
  • Example 2 Production of expression vector A DNA fragment containing the T7 RNA polymerase gene was amplified by the PCR method using the pTrc99A-T7RNApol (FIG. 1) prepared in Example 1 as a template and ligated with the pCDF2 plasmid (FIG. 2). (1) PCR reaction was carried out using pTrc99A-T7RNApol (FIG. 1) as a template plasmid under the following reagent composition and reaction conditions.
  • Reagent composition (Total reaction volume: 100 ⁇ L) 200 pM primer pTrcF (SEQ ID NO: 7) 200 pM primer pTrcR (SEQ ID NO: 8) 100ng template plasmid 0.2 mM dNTPs 0.025 unit / ⁇ L Taq DNA polymerase (TaKaRa Ex Taq (product name), (Takara Bio) Buffer attached to the enzyme (Reaction conditions) Using a thermal cycler (manufactured by Perkin-Elmer), after heating at 94 ° C. for 2 minutes, a temperature cycle of 94 ° C./1 minute, 58 ° C./30 seconds, 72 ° C./2 minutes 40 seconds was repeated 25 times.
  • a thermal cycler manufactured by Perkin-Elmer
  • FIG. 3 shows a restriction enzyme map of pCDF2-T7RNAP.
  • the T7 RNA polymerase gene was determined by using the method shown in Example 6 to confirm that no unintended mutation was introduced.
  • histidine hexamer was introduced by the method shown below.
  • the first PCR reaction was performed using pCDF2-T7RNAP (FIG. 3) as a template plasmid under the following reagent composition and reaction conditions.
  • the synthetic primer used the combination of primer HisF (sequence number 9) and primer pCDFR (sequence number 10), or the combination of primer HisR (sequence number 11) and primer pCDFF (sequence number 12).
  • Reagent composition Total reaction volume: 100 ⁇ L
  • Each 200pM synthetic DNA primer 100ng template plasmid 0.2 mM dNTPs 0.025 unit / ⁇ L DNA polymerase (PrimeStar HS DNA polymerase (trade name), manufactured by Takara Bio Inc.) Buffer attached to the enzyme (Reaction conditions) Using a thermal cycler (manufactured by Perkin-Elmer), after heating at 98 ° C. for 30 seconds, repeating a temperature cycle of 98 ° C. ⁇ 30 seconds, 55 ° C. ⁇ 30 seconds, 72 ° C. ⁇ 3 minutes 30 times, then 7 minutes at 72 ° C. Reacted for 1 minute.
  • FIG. 4 shows a restriction map of pCDF2-T7RNAPHis.
  • Example 3 Preparation of mutation library (part 1) A mutation was introduced into the T7 RNA polymerase gene of the pCDF2-T7RNAPHis plasmid (FIG. 4) prepared in Example 2 by the following procedure.
  • Example 4 Production of screening vector
  • the GFP gene was synthesized based on base sequence information (GenBank Accession Number AF183395).
  • the synthesized GFP gene was designed to have the base sequence of T7 promoter and cloning restriction enzyme SphI (manufactured by Takara Bio).
  • the synthesized GFP gene is digested with restriction enzyme SphI at 37 ° C.
  • the obtained colonies were obtained at 37 ° C. using LBG / Cm liquid medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 0.5% glucose, 30 ⁇ g / mL chloramphenicol). After overnight culture, the plasmid was recovered, and this plasmid was designated as pSTVGFP having a GFP gene whose expression is induced by the T7 promoter.
  • FIG. 5 shows a restriction map of pSTVGFP.
  • the obtained pSTVGFP (FIG. 5) was transformed into E. coli strain JM109 together with the T7 RNA polymerase gene mutant library prepared in Example 3. After culturing this bacterial solution in a 37 ° C.
  • LBG / Crb medium 1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 0.5% glucose, 50 ⁇ g / mL carbenicillin (pH 7.4)
  • a 96 mL deep well plate of 1 mL capacity GFP-positive colonies obtained in Example 4 were inoculated and cultured at 37 ° C. overnight at 600 rpm.
  • the cells were collected by centrifugation at 3000 rpm for 15 minutes at 4 ° C, and the obtained cells were stored frozen at -30 ° C overnight.
  • 100 ⁇ L of lysate in frozen cells composition: 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 0.2% Triton X-100, 0.02% sodium deoxycholate, 0.03% lysozyme) (Manufactured by Taiyo Kagaku), 0.25 unit Benzonase (manufactured by Novagen)), shake at 500 ° C./min for 1 hour at 30 ° C., and centrifuge at 3000 rpm for 30 minutes at 4 ° C. Qing was recovered.
  • the measurement conditions for transcription activity were set at a reaction temperature of 46 ° C., a reaction time of 60 minutes, and an amount of T7 RNA polymerase of 0.5 ⁇ L. Quantification of RNA was performed using Quant-IT RNA assay kit (trade name) (manufactured by Invitrogen). From about 4000 mutant strains, 60 strains that were about twice as high as the wild type specific activity were screened.
  • Example 6 Sequencing method The mutant candidate strain selected in Example 5 was a 37 ° C. LBG / Crb liquid medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 0.5% glucose, 50 ⁇ g / mL carbenicillin (pH 7.4).
  • the plasmid was extracted by a conventional method.
  • the nucleotide sequence of the T7 RNA polymerase gene contained in the extracted plasmid was determined by the following method. (1) Using Big Dye Terminator v3.1 cycle Sequencing Kit (trade name) (Applied Biosystems), sterilize attached buffer 2.0 ⁇ L, premix 4.0 ⁇ L, synthetic DNA primer 3.2 pmol, template plasmid 500 ng Prepare 20 ⁇ L with water, use a thermal cycler (manufactured by Perkin-Elmer), heat at 96 ° C. for 1 minute, and then repeat the temperature cycle of 96 ° C. for 10 seconds, 50 ° C. for 5 seconds, 60 ° C. for 4 minutes for 25 times.
  • a thermal cycler manufactured by Perkin-Elmer
  • the synthetic DNA primers used for the base sequence determination were primer pTrcFs (SEQ ID NO: 15), primer pTrcRs (SEQ ID NO: 16), primer T7F0 (SEQ ID NO: 17), primer T7F1 (SEQ ID NO: 18), primer T7F2 (SEQ ID NO: 19).
  • Primer T7F3 (SEQ ID NO: 20), primer T7F4 (SEQ ID NO: 21), primer T7F5 (SEQ ID NO: 22), primer T7F6 (SEQ ID NO: 23), primer T7R0 (SEQ ID NO: 24), primer T7R1 (SEQ ID NO: 25), primer T7R2 (SEQ ID NO: 26), primer T7R3 (SEQ ID NO: 27), primer T7R4 (SEQ ID NO: 28), primer T7R5 (SEQ ID NO: 29), and primer T7R6 (SEQ ID NO: 30) were selected and used as necessary.
  • the determined base sequence is GENETYX ver. Analysis was performed using 8.0 (trade name) (manufactured by Genetics).
  • nucleotide sequence substitutions were found in 19 strains. Of these, 10 strains contained mutations that caused amino acid changes. One of them is that the 535th adenine is replaced with guanine in the wild-type T7 RNA polymerase base sequence (SEQ ID NO: 5), whereby the AAG codon is replaced with the GAG codon, and the polymerase amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) It was found that the 179th lysine was mutated to glutamic acid.
  • the T7 RNA polymerase having this mutation is a K179E mutant, the gene sequence of which is shown in SEQ ID NO: 31, and the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 32.
  • T7 RNA polymerase having this mutation is designated as a Q786L mutant, the gene sequence of which is shown in SEQ ID NO: 33, and the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 34.
  • Example 7 Preparation and activity measurement of T7 RNA polymerase T7 RNA polymerase was prepared according to the following procedure.
  • Example 5 Transformation obtained in Example 5 into 3 mL of LBG / Crb liquid medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 0.5% glucose, 50 ⁇ g / mL carbenicillin (pH 7.4)) A body glycerol stock was inoculated and cultured overnight at 37 ° C. in an 18 mL test tube.
  • LBG / Crb liquid medium 1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 0.5% glucose, 50 ⁇ g / mL carbenicillin (pH 7.4)
  • the cells were centrifuged at 4000 rpm for 15 minutes at 4 ° C., and the cells were collected. When cell disruption was not performed immediately, the cells were stored at -30 ° C.
  • the collected cells were washed once with 20 mL of 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), resuspended in 20 mL of the same composition buffer, and disrupted.
  • the microbial cell disruption was treated for about 5 minutes at 5 ° C. with an output of about 150 W using an ultrasonic generator (Insonator 201M (trade name), manufactured by Kubota Corporation).
  • Centrifugation was performed at 12,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C.
  • Enzyme purification was performed by the following method by affinity purification using a histidine hexamer tag added to T7 RNA polymerase. (7-1) A slurry of 2 mL of nickel chelate resin (Hisbind (trade name), manufactured by Novagen) was filled in an attached empty column and washed with 3 mL of sterilized water.
  • Nickel was bound to the chelate resin with 5 mL of 50 mM nickel sulfate aqueous solution to the washed nickel chelate resin, and further 3 mL of buffer A (20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 500 mM sodium chloride, Washed with 20 mM imidazole). The above enzyme extract was added thereto, washed with 6 mL of buffer A, and eluted with 1 mL of buffer B (20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 500 mM sodium chloride, 150 mM imidazole). Minutes were collected.
  • buffer A 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 500 mM sodium chloride, Washed with 20 mM imidazole.
  • the collected fraction was subjected to a 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7) containing 5 mM dithiothreitol and 0.1 mM EDTA using a desalting column (PD-10 (trade name), manufactured by GE Healthcare Bioscience). 0.0) and an equal volume of glycerol was added.
  • the concentration of purified T7 RNA polymerase was determined using a protein assay kit (manufactured by Bio-Rad) using bovine serum albumin as a control protein. Moreover, the purity of the enzyme was analyzed by SDS-PAGE at 7.5% concentration, and it was confirmed that the enzyme was almost single.
  • Activity measurement was performed by a method of measuring the amount of RNA produced by in vitro transcription reaction.
  • a DNA having a T7 promoter sequence specifically recognized by T7 RNA polymerase is used as the template DNA.
  • an about 1.5 kbp DNA fragment amplified by PCR using a plasmid containing the T7 promoter sequence as a template was used as the template DNA.
  • the length of the DNA downstream of the T7 promoter sequence is 1.0 kbp
  • the RNA to be transcribed is about 1.0 kb.
  • Reaction solution excluding T7 RNA polymerase (40 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 20 mM MgCl 2 5 mM dithiothreitol, 20 ng template DNA, 0.4 U RNase inhibitor, each 0.4 mM NTPs (ATP, CTP, GTP, UTP)) are placed in a 0.2 mL PCR tube, and purified T7 RNA polymerase is brought to 0 ° C. It was added in a cooled state to make a total of 10 ⁇ L.
  • T7 RNA polymerase 40 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 20 mM MgCl 2 5 mM dithiothreitol, 20 ng template DNA, 0.4 U RNase inhibitor, each 0.4 mM NTPs (ATP, CTP, GTP, UTP)
  • RNA quantification kit (trade name) (manufactured by Invitrogen) was subjected to fluorescence staining and analyzed by a method of converting the concentration from a calibration curve prepared with the attached standard RNA.
  • Example 8 Preparation of double mutant Based on the K179E mutant and the Q786L mutant, a double mutant having two mutations, K179E and Q786L, was prepared. (1) Plasmids were prepared from the K179E mutant and the Q786L mutant using the miniprep method. (2) Using the plasmid prepared from the K179E mutant as a template, a PCR reaction was carried out under the following reagent composition and reaction conditions.
  • Reagent composition (Total reaction volume: 100 ⁇ L) 200 pM primer T7R2 (SEQ ID NO: 26) 200 pM primer pTrcFs (SEQ ID NO: 15) 100ng template plasmid 0.2 mM dNTPs 0.025 unit / ⁇ L Taq DNA polymerase (TaKaRa Ex Taq (product name), (Takara Bio) Buffer attached to the enzyme (Reaction conditions) Using a thermal cycler (manufactured by Perkin-Elmer), after heating at 94 ° C. for 2 minutes, a temperature cycle of 94 ° C./1 minute, 58 ° C./30 seconds, 72 ° C./2 minutes 40 seconds was repeated 25 times.
  • a thermal cycler manufactured by Perkin-Elmer
  • the reagent composition, reaction conditions, and purification operation in the PCR reaction were as described in (1) to (2) except that a combination of primer pTrcFs (SEQ ID NO: 15) and primer pTrcRs (SEQ ID NO: 16) was used as a synthetic DNA primer. Same conditions.
  • (6) The purified double mutant gene obtained in (5) was digested with restriction enzymes NcoI and PstI (manufactured by Takara Bio Inc.) and then pCDF2 vector digested with the same enzyme using T4 ligase at 4 ° C. for 30 minutes. Reacted. (7) The reaction solution of (6) was transformed into E.
  • Example 6 From the results of nucleotide sequence analysis of the mutant screened in Example 5 (Example 6), a mutant in which the 179th amino acid having a higher activity than the wild type at a high temperature range was substituted from lysine to glutamic acid ( K179E), a mutant in which the 786th amino acid was substituted from glutamine to leucine (Q786L), and a double mutant in which two mutations were combined (K179E + Q786L) were prepared according to the method described in Example 7. The protein concentration and transcription activity of the purified enzyme were measured according to the method shown in Example 7.
  • RNA produced was analyzed by electrophoresis with 1% agarose. The results are shown in FIG. From FIG. 6, mutants Q786L and (K179E + Q786L) showed a clear RNA band even at 47 ° C. in which almost no activity was observed in the wild type. This indicates that T7 RNA polymerase introduced with at least a Q786L mutation is superior in heat stability to the wild type.
  • Example 10 Activity Evaluation of Mutant T7 RNA Polymerase Part 1 The activity of the mutant T7 RNA polymerase at each reaction temperature was measured as follows.
  • Example 6 From the results of the nucleotide sequence analysis of the mutant screened in Example 5 (Example 6), a mutant in which the 179th amino acid having higher activity than the wild type in the high temperature range was replaced by lysine with glutamic acid (K179E ), A mutant in which the 786th amino acid was substituted from glutamine to leucine (Q786L) and a double mutant in which two mutations were combined (K179E + Q786L) were prepared according to the method described in Example 7. The protein concentration and transcription activity of the purified enzyme were measured according to the method shown in Example 7.
  • T7 RNA polymerase The activity of T7 RNA polymerase was measured by reacting the enzyme amount of T7 RNA polymerase at 10 ⁇ g / mL and the reaction temperature in the range of 43 to 50 ° C. for 10 minutes.
  • the amount of RNA produced was determined using a Quant-IT RNA assay kit (trade name) (Invitrogen). The measured RNA concentration is shown in FIG. Mutant K179E was found to have a higher specific activity than wild type in the range of 42.9 ° C. to 46.8 ° C., indicating that at least the K179E mutation-introduced T7 RNA polymerase had a specific activity higher than that of the wild type. It can be seen that it has improved.
  • the mutant Q786L had a higher specific activity than the wild type in the range of 44.7 ° C. to 47.9 ° C., which seems to be derived from the improved thermal stability from the results of Example 9. .
  • the double mutant (K179E + Q786L) had a higher specific activity than the wild type in the temperature range of 42.9 ° C. to 47.9 ° C. This shows that T7 RNA polymerase introduced with at least mutations of K179E and Q786L has improved thermal stability and specific activity as compared to the wild type.
  • Example 11 Preparation of Mutant T7 RNA Polymerase Gene (Part 1) In the wild type T7 RNA polymerase amino sequence (SEQ ID NO: 6), a gene encoding T7 RNA polymerase in which the 179th lysine was substituted with another amino acid was prepared according to the following procedure. (1) A first PCR reaction was performed using pCDF2-T7RNAPHis (FIG. 4) as a template plasmid under the following reagent composition and reaction conditions.
  • a combination of primer pCDFF (SEQ ID NO: 12) and primer 179MIXR (SEQ ID NO: 39) is used as a synthetic primer for amplifying the 3 ′ end.
  • a combination of primer 179MIXF (SEQ ID NO: 37) and primer pCDFR2 (SEQ ID NO: 38) was used.
  • Reagent composition Total reaction volume: 100 ⁇ L
  • Each 200pM synthetic DNA primer 100ng template plasmid 0.2 mM dNTPs 0.025 unit / ⁇ L DNA polymerase (PrimeStar HS DNA polymerase (trade name), manufactured by Takara Bio Inc.) Buffer attached to the enzyme (Reaction conditions) Using a thermal cycler (manufactured by Perkin-Elmer), after heating at 98 ° C. for 30 seconds, repeating a temperature cycle of 98 ° C./30 seconds, 55 ° C./30 seconds, 72 ° C./1 minute 30 seconds 30 times, then 72 ° C. For 7 minutes.
  • the second PCR product purified in (3) is digested with restriction enzymes NruI and SacI, and then reacted with pCDF2-T7RNAPHis plasmid (FIG. 4) digested with the same enzyme at 4 ° C. for 30 minutes.
  • the DNA solution after the reaction was used as a T7 RNA polymerase gene mutant library.
  • the library prepared in (4) was transformed into E. coli strain JM109, and an LBG / Crb medium (1.0% bactotryptone, 0.5% bacto yeast extract, 0.5% NaCl, Ninety colonies that had grown with 0.5% glucose, 50 ⁇ g / mL carbenicillin (pH 7.4) were selected from each library.
  • Example 12 Preparation of Mutant T7 RNA Polymerase Gene (Part 2) In the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of wild-type T7 RNA polymerase, a gene encoding T7 RNA polymerase in which the 786th glutamine was substituted with another amino acid was prepared according to the following procedure. (1) A first PCR reaction was performed using pCDF2-T7RNAPHis (FIG.
  • telomere sequence As a synthetic DNA primer for amplifying the 5 ′ end side of the T7 polymerase gene, a combination of primer pCDFF4 (SEQ ID NO: 42) and primer 786MIXR (SEQ ID NO: 41), a synthetic primer for amplifying the 3 ′ end side, A combination of primer 786MIXF (SEQ ID NO: 40) and primer pTrcRS (SEQ ID NO: 16) was used.
  • Reagent composition Total reaction volume: 100 ⁇ L
  • Each 200pM synthetic DNA primer 100ng template plasmid 0.2 mM dNTPs 0.025 unit / ⁇ L DNA polymerase (PrimeStar HS DNA polymerase (trade name), manufactured by Takara Bio Inc.) Buffer attached to the enzyme (Reaction conditions) Using a thermal cycler (manufactured by Perkin-Elmer), after heating at 98 ° C. for 30 seconds, repeating a temperature cycle of 98 ° C./30 seconds, 55 ° C./30 seconds, 72 ° C./1 minute 30 seconds 30 times, then 72 ° C. For 7 minutes.
  • the reagent composition and reaction conditions in the PCR reaction were the same as in (1) except for the synthetic DNA primer and template, and the amplified product was extracted and purified after electrophoresis on an agarose gel in the same manner as in (2).
  • the second PCR product purified in (3) is digested with restriction enzymes HindIII and KpnI, and then reacted with pCDF2-T7RNAPHis plasmid (FIG. 4) digested with the same enzyme at 4 ° C. for 30 minutes using T4 ligase.
  • the DNA solution after the reaction was used as a T7 RNA polymerase gene variant (179th) library.
  • the library prepared in (4) was transformed into E.
  • Example 13 Activity Evaluation of Mutant T7 RNA Polymerase Mutant (Part 2) Preparation of T7 RNA polymerase and measurement of transcriptional activity were carried out according to the method of Example 7 from the mutant T7 RNA polymerase gene prepared in Examples 11 and 12. The results are shown in FIG. 8 (T7 RNA polymerase in which the 179th lysine is substituted with another amino acid) and 9 (T7 RNA polymerase in which the 786th glutamine is substituted with another amino acid).
  • the mutant T7 RNA polymerase (Q786M, Q786L, Q786F, Q786Y, K179E, K179C, and K179N) prepared in Example 13 and wild type T7 RNA polymerase were prepared to 100 ⁇ g / mL using a buffer solution having the following composition. Then, 25 ⁇ L was dispensed into a 0.2 mL PCR tube, followed by heat treatment at 47 ° C. for 1, 2, 5, 10, 20, and 30 minutes.
  • Example 15 Creation of mutation library (part 2) Using the (K179E + Q786L) mutant gene sequence (SEQ ID NO: 35) prepared in Example 8 and the plasmid vector pCDF2-T7RNAPHis (K179E + Q786L) containing the histidine hexamer sequence at the 5 ′ end of the sequence, the following procedure was used. Mutation was introduced.
  • the prepared T7 RNA polymerase gene mutant library was transformed into E. coli JM109 strain containing the plasmid pSTVGFP (FIG. 5) prepared in Example 4, and the transformant was cultured in a 37 ° C. SOC medium for 1 hour. Later, LBG / Crb / Cm agar medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 0.5% glucose, 50 ⁇ g / mL carbenicillin, 30 ⁇ g / mL chloramphenicol, 1.5% agar The strain that grows in (1) and emits GFP fluorescence was defined as a mutant candidate strain.
  • Example 16 Screening of high-temperature T7 RNA polymerase (Part 2) Screening of the mutant strain obtained in Example 15 was performed by the same method as in Example 5. As a result of the screening, 34 strains having a specific activity approximately twice as high as that of the (K179E + Q786L) mutant T7 RNA polymerase prepared in Example 8 were obtained from about 4000 mutant strains, which were designated as primary candidate strains.
  • Example 17 Base sequence analysis of selected strains The bacterial strain selected in Example 16 was confirmed by the method described in Example 6 to confirm the base sequence to confirm the mutation site. As a result, it was found that the thymine at the 2054th base sequence was replaced with cytosine, whereby the GTG codon was replaced with the GCG codon, and the valine at the 685th amino acid sequence was mutated to alanine.
  • the T7 RNA polymerase having this mutation is a (K179E + Q786L + V685A) mutant, the gene sequence of which is shown in SEQ ID NO: 43 and the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 44.
  • Example 18 (K179E + Q786L + V685A) Production of mutant T7 RNA polymerase Using the Escherichia coli JM109 strain expressing the triple mutant T7 RNA polymerase having the histidine hexamer sequence obtained in Example 16 (K179E + Q786L + V685A), an enzyme was prepared by the following procedure.
  • Example 16 The strain obtained in Example 16 in 40 mL of LBG / Crb liquid medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 0.5% glucose, 50 ⁇ g / mL carbenicillin (pH 7.4)) Of glycerol stock was inoculated and cultured overnight at 37 ° C. in a 100 mL pleated Erlenmeyer flask. (2) 1.5 L of 2 ⁇ YTG / Crb medium (1.6% bactotryptone, 1% bacto yeast extract, 0.5% NaCl, 0.5% glucose, 50 ⁇ g / mL carbenicillin (pH 7.4)) 30 mL of the preculture solution was inoculated and cultured at 37 ° C.
  • LBG / Crb liquid medium 1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 0.5% glucose, 50 ⁇ g / mL carbenicillin (pH 7.4)
  • the cells were washed with 100 mL of 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), and stored at ⁇ 30 ° C. when not immediately subjected to the next treatment.
  • (5) Half of the collected cells were suspended in 42 mL of 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 mM PMSF and 1 mM EDTA, and the cells were crushed.
  • Cell disruption is performed using an ultrasonic generator (Insonator 201M (trade name), manufactured by Kubota Corporation) at 5 ° C for about 5 minutes and at an output of about 150 W, and at 4 ° C for 10 minutes, 12000 rotations.
  • the soluble fraction was collected by centrifugation at / min.
  • Example 19 Activity Evaluation of Mutant T7 RNA Polymerase (Part 3) The activity of the triple mutant T7 RNA polymerase prepared in Example 18 (K179E + Q786L + V685A) was evaluated by the method for measuring the amount of RNA generated by the in vitro transcription reaction shown in Example 7.
  • the transcription reaction temperature was set in the range of 43 to 50 ° C.
  • the amount of T7 RNA polymerase enzyme was 10 ng / ⁇ L
  • the reaction time was 30 minutes.
  • Example 20 Evaluation of Thermal Stability of Mutant T7 RNA Polymerase (Part 3) T7 RNA polymerase various mutants and wild type thermal stability were measured by the following methods.
  • Example 21 Production of mutant T7 RNA polymerase From the triple mutant T7 polymerase prepared in Example 18 (K179E + Q786L + V685A), a double mutant T7 polymerase was prepared by the following method (Q786L + V685A).
  • the transformant was transformed into LBG / Crb agar medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 0.5% glucose, 1.5% agar, 50 ⁇ g / mL carbenicillin (pH 7.4). ))
  • the above selection was performed to prepare a plasmid of a colony that had grown after overnight culture at 37 ° C.
  • the plasmid prepared in (4) was confirmed to have the desired mutation introduced by the nucleotide sequence determination method shown in Example 6.
  • the plasmid gene sequence is shown in SEQ ID NO: 45, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 46.
  • Example 22 Purification of mutant T7 RNA polymerase
  • the (Q786L + V685A) mutant T7 RNA polymerase was prepared by the following method using the Escherichia coli JM109 strain expressing the double mutant T7 RNA polymerase (Q786L + V685A) prepared in Example 21.
  • Culture was performed according to the procedure shown in Example 18 to obtain 28 g of wet cells.
  • the obtained cells are suspended in 112 mL of 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 mM PMSF and 1 mM EDTA, and then the cells are disrupted by ultrasonic waves and centrifuged to obtain a supernatant. Was recovered.
  • Eluent A 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2) 50 mM NaCl 0.6M ammonium sulfate 1 mM DTT 1 mM EDTA
  • Eluent B Composition of eluent A excluding ammonium sulfate Gradient: 0 min to 60 min: Eluent A 100% 60 minutes to 120 minutes: Linear gradient from 100% to 100% eluent A 120 to 130 minutes: Eluent A0% 130 minutes: Step gradient from eluent A 0% to 100% Detection: 280nm Flow rate: 4mL / min (5-2) 100 mL of a fraction having a high T7 RNA polymerase content was collected by SDS-PAGE and salted out with 39 g of ammonium sulfate.
  • Eluent A 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.6) 50 mM NaCl 1 mM dithiothreitol 1 mM EDTA
  • Eluent B Composition gradient with NaCl concentration changed to 0.8M in eluent A: 0 minutes to 20 minutes: Eluent A 100% 20 to 80 minutes: linear gradient from 100% to 0% eluent A 80 minutes to 90 minutes: Eluent A0% 90 minutes: Step gradient from eluent A 0% to 100% Detection: 280nm Flow rate: 4mL / min (5-5) 5 mL of a fraction containing a large amount of T7 RNA polymerase was collected by SDS-PAGE analysis and salted out with 1.95 g of ammonium sulfate.
  • Example 23 Nucleic acid amplification reaction with mutant T7 RNA polymerase
  • the nucleic acid amplification by the TRC method using the double mutant T7 RNA polymerase (Q786L + M685A) prepared in Example 22 was measured by using the Salmonella toxin gene (stn RNA) as a target RNA by the following method.
  • stn RNA Salmonella toxin gene
  • wild type T7 RNA polymerase was used as a control.
  • StnRNA positive standard (concentration: 10) attached to Salmonella stn mRNA detection reagent (TRCRtest stn-m (trade name), manufactured by Tosoh Corporation) 6 10 copies with RNA dilution (10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.5 U / ⁇ L RNase Inhibitor, 5 mM dithiothreitol) 4 Dilute to copy / 5 ⁇ L. Only the diluted RNA was used for the control test group (negative). (2) 20 ⁇ L of the reaction solution having the following composition was dispensed into a 0.5 mL PCR tube, and 5 ⁇ L of the RNA sample was added thereto.
  • TRCRtest stn-m (trade name), manufactured by Tosoh Corporation) 6 10 copies with RNA dilution (10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.5 U / ⁇ L RNase Inhibitor
  • composition of reaction solution (Concentration or amount at final reaction solution volume 30 ⁇ L) 60 mM Tris-HCl buffer (pH 8.6) 17 mM MgCl 2 100 mM KCl 6U RNase Inhibitor 1 mM dithiothreitol 0.25 mM each for dATP, dCTP, dGTP, DTTP 3.6 mM ITP Each 3.0 mM ATP, CTP, GTP, UTP 0.12 ⁇ M cleavage oligonucleotide (SEQ ID NO: 47, 3 ′ terminal hydroxyl group is aminated) 1.0 ⁇ M first primer (SEQ ID NO: 48) 1.0 ⁇ M second primer (SEQ ID NO: 49) A nucleic acid probe labeled with 7.5 nM intercalating fluorescent dye (SEQ ID NO: 50, the intercalating fluorescent dye is labeled between the 12th “A” on the 5 ′ end side and the 13th “A”, and 3 'The terminal
  • composition of enzyme solution (Concentration or amount in 30 ⁇ L of final reaction solution) 2% sorbitol 3.6 ⁇ g bovine serum albumin 4U AMV reverse transcriptase (Life Science) 46U T7 RNA polymerase Distilled water for volume adjustment (4) Using a fluorometer with a temperature control function capable of direct measurement, the PCR tube was kept warm at each temperature, and the reaction solution was measured over time at an excitation wavelength of 470 nm and a fluorescence wavelength of 510 nm.
  • the time-dependent change in the fluorescence intensity ratio of the reaction solution (the value obtained by dividing the fluorescence intensity value at a predetermined time by the background fluorescence intensity value) was shown in FIG.
  • wild type T7 RNA polymerase was used, no amplification of stn RNA was observed at a reaction temperature of 49 ° C, whereas (Q786L + V685A) double mutant showed amplification of stn RNA even at a reaction temperature of 51 ° C. It was. This indicates that the (Q786L + V685A) double mutant is superior in thermal stability and / or specific activity in a high temperature range from 49 ° C. to 51 ° C., compared to the wild type T7 RNA polymerase.
  • Example 24 Measurement of minimum detection concentration of nucleic acid amplification reaction by T7 RNA polymerase mutant
  • the minimum detection concentration of the double mutant T7 RNA polymerase prepared in Example 22 (Q786L + V685A) with respect to stn mRNA standard RNA was confirmed.
  • the measurement method was the same as in Example except that the reaction temperature was changed to 50 ° C. (double mutant) or 43 ° C. (wild type), and the target RNA concentration was changed to 10, 50, 100, 300, 500, 1000 copies / 5 ⁇ L. 23 in the same manner.
  • Table 3 shows the detection rates of (Q786L + V685A) double mutant T7 RNA polymerase and wild type T7 RNA polymerase at each initial RNA copy number.
  • the detection rate of stn RNA when using the double mutant (Q786L + V685A) is higher than the detection rate of wild-type 43 ° C, and compared with the minimum RNA concentration showing a detection rate of 80% or more, the wild-type 1000 copies For the / 5 ⁇ L, the (Q786L + V685A) double mutant was 200 copies / 5 ⁇ L.
  • the (Q786L + V685A) mutant is about 5 times more sensitive than wild type.
  • Example 4 a T7 RNA polymerase mutant (V685A mutant) in which the valine at amino acid sequence 685 was mutated to alanine was prepared by the following procedure.
  • a PCR reaction was performed using pCDF2-T7RNAPHis (FIG. 4) as a template plasmid under the following reagent composition and reaction conditions.
  • the synthetic primer used was a combination of primer V685AF (SEQ ID NO: 51) and primer pTrcRs (SEQ ID NO: 16), or a combination of pCDFF4 (SEQ ID NO: 42) and primer V685AR (SEQ ID NO: 53).
  • Reagent composition total reaction volume: 50 ⁇ L
  • reaction solution was separated by 1% agarose electrophoresis, then ethidium bromide staining was performed, and the target product band was cut out from the stained gel and purified.
  • PCR reaction was further carried out to produce a V685A mutant gene.
  • the reagent composition, reaction conditions, and purification operation in the PCR reaction are as described in (1) to (2) except that a combination of primer pCDFF4 (SEQ ID NO: 42) and primer pTrcRs (SEQ ID NO: 16) was used as a synthetic DNA primer. Same conditions.
  • Example 26 Purification and activity evaluation of V685A mutant T7 RNA polymerase Using the Escherichia coli JM109 strain expressing the V685A mutant T7 RNA polymerase prepared in Example 25, V685A mutant T7 RNA polymerase was prepared and evaluated for activity by the method shown in Example 7.
  • the transcription reaction temperature was set in the range of 43 to 49 ° C.
  • the amount of T7 RNA polymerase enzyme was 20 ng / ⁇ L
  • the reaction time was 30 minutes.
  • Example 27 Evaluation of Thermal Stability of V685A Mutant T7 RNA Polymerase Using the V685A mutant T7 RNA polymerase prepared in Example 26, the thermal stability of the V685A mutant T7 RNA polymerase was evaluated by the method shown in Example 20. The heat treatment temperature was set to 46 ° C., and the treatment time was 1 minute, 2 minutes and 5 minutes.
  • FIG. Table 4 shows the results of determining the half-lives of V685A mutant T7 RNA polymerase and wild type from the slope of the graph of FIG. Table 4 shows that the V685A mutant has a longer half-life than the wild type and is excellent in thermal stability at 46 ° C.
  • Example 28 (V685A + Q786M) Production of mutant T7 RNA polymerase Using the pCDF-T7RNAPHis plasmid inserted with the V685A mutant T7 RNA polymerase gene (FIG.
  • Example 25 the glutamine at the 786th amino acid sequence was further mutated to methionine (V685A + Q786M) by the following method.
  • Mutant T7 RNA polymerase was prepared.
  • (1) PCR reaction was carried out using the V685A mutant pCDF2-T7RNAPHis as a template plasmid under the following reagent composition and reaction conditions.
  • the synthetic primer used was a combination of primer Q786MF (SEQ ID NO: 56) and primer pTrcRs (SEQ ID NO: 16), or a combination of pCDFF4 (SEQ ID NO: 42) and primer Q786MR (SEQ ID NO: 57).
  • Reagent composition total reaction volume: 50 ⁇ L
  • reaction solution was separated by 1% agarose electrophoresis, then ethidium bromide staining was performed, and the target product band was cut out from the stained gel and purified.
  • PCR reaction was further carried out to produce a (V685A + Q786M) mutant gene.
  • the reagent composition, reaction conditions, and purification operation in the PCR reaction are as described in (1) to (2) except that a combination of primer pCDFF4 (SEQ ID NO: 42) and primer pTrcRs (SEQ ID NO: 16) was used as a synthetic DNA primer. Same conditions.
  • Example 29 (V685A + Q786M) Purification and activity evaluation of mutant T7 RNA polymerase The (V685A + Q786M) mutant T7 RNA polymerase was prepared and evaluated for activity by the method shown in Example 7 using the E. coli JM109 strain expressing the (V685A + Q786M) mutant T7 RNA polymerase prepared in Example 28.
  • the transcription reaction temperature was set in the range of 43 to 50 ° C.
  • the amount of T7 RNA polymerase enzyme was 20 ng / ⁇ L
  • the reaction time was 30 minutes.
  • wild type T7 RNA polymerase was used as a control.
  • the amount of RNA produced at each temperature is shown in FIG. FIG. 16 shows that (V685A + Q786M) mutant T7 RNA polymerase has a higher amount of RNA production at a reaction temperature of 45 ° C. or higher than wild type, and its specific activity at high temperature is improved.

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Abstract

　配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち少なくとも、７８６ 番目のグルタミン、１７９番目のリジン及び６８５番目のバリンからなる群から選ばれる少なくとも１ つに相当するアミノ酸残基が、他のアミノ酸に置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポ リメラーゼと比較して、熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とするＴ７ＲＮＡポリ メラーゼ変異体。

Description

機能改善したＲＮＡポリメラーゼ変異体
　本発明は野生型ＲＮＡポリメラーゼのアミノ配列の一部に変異を導入することで、改善された機能を持つＲＮＡポリメラーゼ、特に熱安定性及び／または比活性が向上したＲＮＡポリメラーゼ、当該ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子、当該ＲＮＡポリメラーゼの生産方法、及び当該ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡの製造方法に関する。
　本発明は、高温条件下で野生型よりも安定性及び／または比活性が向上した、バクテリオファージから得られる変異型ＲＮＡポリメラーゼ、特にＴ７ＲＮＡポリメラーゼに関する。大腸菌に感染し得るバクテリオファージとして、Ｔ３、Ｔ７、φＩ、φＩＩ、Ｗ３１、Ｈ、Ｙ、Ａ１、ｃｒｏＣ２１、Ｃ２２、及びＣ２３があるが、そのうちＴ７ファージによってコードされるＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼである。
　Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの特徴として、まず、プロモーター配列に対する高い選択性がある。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、自身の特異なプロモーター配列には結合するが、それ以外のプロモーター配列とは他のバクテリオファージのプロモーター配列であっても結合しない。この高い選択性により、ＲＮＡポリメラーゼの転写反応が、宿主のゲノムに対してではなく、自身のゲノムに対して確実に向けられる。
　次に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは他のポリメラーゼと違い、補助因子を必要とせずに、プロモーターを認識し、転写を開始、ＲＮＡ転写物を伸長させ、転写を終結させるといった一連の性能を有しており、転写速度も大腸菌のＲＮＡポリメラーゼと比較して５倍速くＲＮＡを伸長させることができる。
　さらに、分子量が９８．６ｋＤａ、８８３アミノ酸の単鎖タンパク質であることから、酵素の安易な大量製造が可能である。
　以上に述べた有利な点を持つＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、各種分野で積極的に用いられており、例えば、インヴィトロ転写や大腸菌における高発現系（米国特許第４９５２４９６号公報：特許文献１）、無細胞タンパク合成系、塩基配列決定法（特開平１１−１８７９９号公報：特許文献２）、等温核酸増幅法の中で利用されている。等温核酸増幅法の１つであるＴＲＣ法（特開２０００−１４４００号公報：特許文献３及びＩｓｈｉｇｕｒｏ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３）：非特許文献１）について詳細に説明する。
　ＴＲＣ法はＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと逆転写酵素との協奏的作用によって特定のＲＮＡ配列を含む標的ＲＮＡを増幅する方法である。即ち、標的となるＲＮＡに対しＴ７プロモーター配列を含むプライマーと逆転写酵素及びリボヌクレアーゼＨによりプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより特定ＲＮＡ配列から成るＲＮＡを合成する。以降生成したＲＮＡを前記プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型とし、上記の反応を連鎖的に行なうものである。ＴＲＣ法による核酸増幅法はＰＣＲ法で増幅する場合と異なり、一定の温度で反応することが可能であるため、複雑な温度コントロールを必要としない長所がある。しかしながら、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用してＴＲＣ法を用いた核酸増幅を行なうと、４６℃以上の条件ではＴ７ＲＮＡポリメラーゼの活性低下により核酸増幅効率の低下が見られた。そのため、現状ＴＲＣ法での核酸増幅は一般に４０℃から４５℃といった比較的低温条件下で行なわれている。低温条件下ではＲＮＡが複雑な高次構造をとりやすく、そのことがＴＲＣ法における高感度に検出するプライマーの設計を困難にしてきた。そのため、４６℃以上の条件においても、熱安定性及び／または比活性の高いＴ７ＲＮＡポリメラーゼが求められてきた。
　変異により各種の改善された機能を持つＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの活性を測定する系が確立されている（Ｉｋｅｄａ　Ｒ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，９０７３−９０８０（１９９２）：非特許文献２及びＩｋｅｄａ　Ｒ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２０，２５１７−２５２４（１９９２）：非特許文献３）ことから、これまでいくつか作製されている。例えばアミノ酸置換により認識するプロモーター配列を改変した酵素（米国特許第５３８５８３４号公報：特許文献４）、高温での比活性及び熱安定性を高めた酵素（特表２００３−５２５６２７号公報：特許文献５）、アミノ酸の欠失と置換により３’−デオキシリボヌクレオチドの取り込み能を増強した酵素などである（特開２００３−６１６８３号公報：特許文献６）。
　本発明が解決する課題は、野生型と比較して熱安定性及び／または比活性が向上したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体とその製造方法を提供するものである。
　上記課題を解決するために検討した結果、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸を遺伝子工学的手法によって置換することで、熱安定性または比活性が向上するアミノ酸部位を見出し、野生株と比較して熱安定性または比活性が向上した変異体の作成に成功した。さらに、熱安定性が向上したアミノ酸部位の変異と、比活性が向上したアミノ酸部位の変異を組み合わせることで、熱安定性及び比活性が向上した変異体の作成に成功した。
　詳しくは、配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち少なくとも、７８６番目のグルタミン及び／または１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体が、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較し熱安定性及び／または熱安定性が向上していることを見出した。
　さらに、上記部位とは異なる部位のアミノ酸残基、すなわち、６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換することで、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較し熱安定性及び／または熱安定性が向上していることを見出した。
　また、上記各アミノ酸残基をそれぞれ組み合わせることで、さらに熱安定性及び／または熱安定性が向上したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体を得ることができた。
　即ち本発明は、以下の発明を包含する：
（１）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち少なくとも、７８６番目のグルタミン、１７９番目のリジン及び６８５番目のバリンからなる群から選ばれる少なくとも１つに相当するアミノ酸残基が、他のアミノ酸に置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して、熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（２）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基が疎水性アミノ酸に置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（３）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはメチオニンに置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（４）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、さらに、少なくとも１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸、アスパラギン、システインのいずれかに置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して、熱安定性及び比活性が向上していることを特徴とする、（２）又は（３）に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（５）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸、アスパラギン、システインのいずれかに置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（６）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、さらに、少なくとも６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基が中性または弱疎水性アミノ酸に置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して、熱安定性及び比活性が向上していることを特徴とする、（２）から（５）のいずれかのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（７）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、さらに、少なくとも６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して、熱安定性及び比活性が向上していることを特徴とする、（６）のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（８）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基が中性または弱疎水性アミノ酸に置換され、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較して熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とする、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（９）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換され、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較して熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とする、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（１０）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換され、さらに、１７９番目のリジン及び／または７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（１１）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換され、さらに、１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸に置換、及び／または７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはメチオニンに置換されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（１２）（１）から（１１）のいずれかのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子。
（１３）（１）から（１１）のいずれかのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子を発現してＴ７ＲＮＡポリメラーゼを生産することのできる細胞。
（１４）（１）から（１１）のいずれかのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子を発現させることによるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの生産方法。
（１５）（１）から（１１）のいずれかのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体を用いてＲＮＡを製造する方法。
（１６）（１）から（１１）のいずれかのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体を用いてＲＮＡを増幅する方法。
　本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比べて熱安定性及び／または比活性が向上しているため、野生株と比較し、より広い温度範囲での転写反応及び／または転写反応時間の短縮が期待できる。
　図１は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをクローニングしたプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌの制限酵素地図を示す。
　図２は、ｐＣＤＦ２プラスミドの制限酵素地図を示す。
　図３は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを生産するプラスミドｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰの制限酵素地図を示す。
　図４は、Ｎ末端にヒスチジンヘキサマーを融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼを生産するプラスミドｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓの制限酵素地図を示す。
　図５は、Ｔ７プロモーターによって発現が誘導されるＧＦＰ遺伝子を持つｐＳＴＶＧＦＰの制限酵素地図を示す。
　図６は、作製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼの野生型とその変異体Ｋ１７９Ｅ、Ｑ７８６Ｌ及び二重変異体（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）それぞれの４７℃での加熱に対する熱安定性を比較した結果（電気泳動写真）を示す。なお、図中のレーン１は野生型の、レーン２はＫ１７９Ｅ変異体の、レーン３はＱ７８６Ｌ変異体の、レーン４は（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）変異体のＴ７ＲＮＡポリメラーゼをそれぞれ用いたときの結果である。
　図７は、作製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼの野生型とその変異体Ｋ１７９Ｅ、Ｑ７８６Ｌ及び二重変異体（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）それぞれの４３から５０℃でのＲＮＡ生産量を比較した結果を示す。
　図８は、作製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼの野生型とその変異体Ｋ１７９Ｅ、Ｋ１７９Ｃ及びＫ１７９Ｎそれぞれの４３から５０℃でのＲＮＡ生産量を比較した結果を示す。
　図９は、作製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼの野生型とその変異体Ｑ７８６Ｌ、Ｑ７８６Ｍ、Ｑ７８６Ｆ及びＱ７８６Ｙそれぞれの４３から５０℃でのＲＮＡ生産量を比較した結果を示す。
　図１０は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、変異体Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＱ７８６Ｌ、Ｑ７８６Ｍ、Ｑ７８６Ｆ、Ｑ７８６Ｙ、Ｋ１７９Ｅ、Ｋ１７９Ｃ及びＫ１７９Ｎそれぞれの４７℃での加熱に対する熱安定性を比較した結果を示す。
　図１１は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）二重変異体、及び（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）三重変異体、それぞれの４３から５０℃でのＲＮＡ生産量を比較した結果を示す。
　図１２は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）二重変異体、及び（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）三重変異体、それぞれの４８℃での加熱に対する熱安定性を比較した結果を示す。
　図１３は、サルモネラｓｔｎ　ＲＮＡを標的に、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及び（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）二重変異体を用いて、ＴＲＣ法による等温核酸増幅反応を行なった結果を示す。
　図１４は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、及びＶ６８５Ａ変異体、それぞれの４３から４９℃でのＲＮＡ生産量を比較した結果を示す。
　図１５は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、及びＶ６８５Ａ変異体、それぞれの４６℃での加熱に対する熱安定性を比較した結果を示す。
　図１６は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｖ６８５Ａ変異体、及び（Ｖ６８５Ａ＋Ｑ７８６Ｍ）二重変異体、それぞれの４３℃から５０℃でのＲＮＡ生産量を比較した結果を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　第一の観点において、本発明で開示する、熱安定性及び／または比活性が向上したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号６に示す野生型のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したものであり、好ましくは置換したアミノ酸が疎水性アミノ酸（ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン）のいずれかであり、さらに好ましくは置換したアミノ酸がロイシンまたはメチオニンである。なお、本明細書において「７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基」とは、配列番号６に示すアミノ酸配列を基準としたとき、７８６番目にあるグルタミン残基のことをいい、配列番号６に示す配列からなるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの５’末端側にポリペプチドが付加または削除された場合は、前記付加または削除されたポリペプチドの長さの分だけ位置がずれる（例えば、配列番号６に示す配列からなるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの５’末端側にアミノ酸１０残基からなるポリペプチドが付加されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼの場合、「７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基」は７９６番目にあるグルタミンとなる）。
　第二の観点において、本発明で開示する、熱安定性及び／または比活性が向上したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号６に示す野生型のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したものであり、好ましくは置換したアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン、システインのいずれかであり、さらに好ましくは置換したアミノ酸がグルタミン酸である。なお、本明細書において「１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基」とは、配列番号６に示すアミノ酸配列を基準としたとき、１７９番目にあるリジン残基のことをいい、配列番号６に示す配列からなるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの５’末端側にポリペプチドが付加または削除された場合は、前記付加または削除されたポリペプチドの長さの分だけ位置がずれる。
　第三の観点において、本発明で開示する、熱安定性及び比活性が向上したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号６に示す野生型のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基及び１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基をそれぞれ他のアミノ酸に置換したものであり、好ましくは７８６番目のアミノ酸残基を疎水性アミノ酸（ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン）のいずれかに、１７９番目のアミノ酸残基をグルタミン酸、アスパラギン、システインのいずれかにそれぞれ置換したものであり、さらに好ましくは７８６番目のアミノ酸残基をロイシンまたはメチオニンに１７９番目のアミノ酸残基をグルタミン酸、アスパラギン、システインのいずれかにそれぞれ置換したものである。
　第四の観点において、本発明で開示する、熱安定性及び／または比活性が向上したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたものであり、好ましくは当該アミノ酸が中性または弱疎水性アミノ酸（アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン）のいずれかに置換され、さらに好ましくは置換したアミノ酸がアラニンである。なお、本明細書において「６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基」とは、配列番号６に示すアミノ酸配列を基準としたとき、６８５番目にあるバリン残基のことをいい、配列番号６に示す配列からなるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの５’末端側にポリペプチドが付加または削除された場合は、前記付加または削除されたポリペプチドの長さの分だけ位置がずれる（例えば、配列番号６に示す配列からなるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの５’末端側にアミノ酸１０残基からなるポリペプチドが付加されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼの場合、「６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基」は６９５番目にあるリジンとなる）。
　第五の観点において、本発明で開示する、熱安定性及び／または比活性が向上したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、前述の６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基の置換に加え、さらに、１７９番目のリジン及び／または７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたものであり、好ましくは１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸に、及び／または７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはメチオニンにそれぞれ置換されたものである。なお、本明細書において「１７９番目のリジン及び／または７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基」とは、配列番号６に示すアミノ酸配列を基準としたとき、１７９番目にあるリジン及び／または７８６番目にあるグルタミン残基のことをいい、配列番号６に示す配列からなるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの５’末端側にポリペプチドが付加または削除された場合は、前記付加または削除されたポリペプチドの長さの分だけ位置がずれる。
　本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子へ変異を導入することで作製することができる。所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤または放射線への露出といった公知の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮＡを構築することができる。
　野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の入手は、当業者のなし得る方法であればいかなる方法でもよいが、例えばＴ７ファージ（ＤＳＭ　Ｎｏ．４６２３，ＡＴＣＣ　１１３０３−Ｂ７，ＮＣＩＭＢ１０３８０など）から、そのゲノム情報から作製した適当なプライマーを用いてＰＣＲによって取得することができる。
　本発明の酵素の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換え蛋白質でもよい。遺伝子組み換え技術を利用して取得する場合、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を適当な方法で宿主に組み込むことで目的の酵素を得ることができる。
　使用される宿主には酵母、動物細胞株、植物細胞、昆虫細胞など各種培養細胞が使用できるが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の場合、もともとのバクテリオファージの感染先であり、かつ取り扱いの簡便な大腸菌を宿主として用いることが望ましい。形質転換に用いる大腸菌はＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株が例示できるがそれらに限定されない。
　本発明の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立複製型ベクターでもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれるものであってもよい。好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結される。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。大腸菌で使用できるプロモーターには　ｌａｃ、ｔｒｐもしくはｔａｃプロモーターなどが挙げられ、宿主に大腸菌を利用する場合には適当なプラスミドに目的の遺伝子を組み込み、形質転換する方法が簡便である。使用するプラスミドはｐＴｒｃ９９Ａ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、ｐＣＤＦ−１ｂ（タカラバイオ製）といった発現用プラスミドが例示できるがそれらに限定されず、一般的な大腸菌用ベクターであれば当業者が入手し得るベクターを使用すればよい。また、作製するＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は酵素の精製のために有用な配列を付加してもよい。例えばシグナルペプチドを利用し細胞外分泌型酵素としたり、シグナルペプチドとして末端にヒスチジンヘキサマーを含んだタグ配列が付加されるように遺伝子を作製することができる。もっとも、シグナルペプチドの種類やシグナルペプチドと本酵素の結合方法は上記方法に限定されることはなく、当業者が利用可能な任意のシグナルペプチドを利用することが出来る。
　作製した形質転換体は、導入されたＤＮＡ構築物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養することで、本発明の酵素を取得することができる。形質転換体の培養物からの単離精製には、通常のタンパク質で用いられる単離、精製法を用いればよい。例えば、本発明の酵素が細胞内に発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し適当な水系緩衝液に懸濁後、リゾチーム処理や超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。さらに無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清を通常のタンパク質の単離精製法で精製する。即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）トヨパール（商品名）（東ソー製）といったレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルトヨパール及びフェニルトヨパール（商品名）（東ソー製）といったレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動といった電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。また、シグナルペプチドを利用し対応する方法で精製する方法も簡便であり、例えばヒスチジンヘキサマー配列とニッケルカラムを用いることで容易に精製することができる。
　本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体は上記方法のほかにも、例えば化学的に合成して得ることもできる。
　上記で説明した本発明の酵素は、従来知られているＴ７ＲＮＡポリメラーゼとして、各用途で使用することができる。即ち、本発明の酵素は、ＲＮＡポリメラーゼとして、ＲＮＡを合成するために使用することができる。具体的には、基質としてリボヌクレオチド（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）を使用し、特定の配列を有する二本鎖ＤＮＡを鋳型に、一本鎖ＲＮＡ合成を行なうことができる。
　さらに本発明のＲＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素との協奏的作用によって特定のＲＮＡ配列を含む標的ＲＮＡを増幅する等温核酸増幅反応にも使用することができる。等温核酸増幅反応としてはＴＲＣ法（特許文献３及び非特許文献１）、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法などが挙げられる。
　本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比べて熱安定性及び／または比活性が向上している。そのため、野生型と比較して保存が容易であり、また長期間の保存も可能である。よって、使い勝手がよく、長期に渡って使用可能な試薬を提供することができる。
　また、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、野生型よりも高温条件下で使用可能であることから、転写反応や等温核酸増幅反応における実験条件を改善することが可能で、インヴィトロ、インヴィヴォを問わず、野生型よりも広い温度範囲で使用可能である。
　特にＴＲＣ法を用いた等温核酸増幅反応において、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用した場合は前記酵素が４６℃以上で活性低下を生じるため、４０℃から４５℃といった比較的低温条件下で核酸増幅反応を行なう必要があった。また、前記温度条件下では、ＲＮＡが複雑な高次構造をとりやすく、そのことが高感度に検出するプライマーの設計を困難にしてきた。一方、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体は４６℃以上の温度条件下において、野生型より安定性及び／または比活性が向上している。そのため、ＴＲＣ法による核酸増幅反応を４６℃以上の温度条件下で実施することが可能となり、従来より検出時間が短縮した核酸増幅試薬を提供することができる。また高温条件下では、ＲＮＡが複雑な高次構造をとりにくくなるため、より高感度に検出するプライマーの設計も容易になる。そのため、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体を用いて、ＴＲＣ法による核酸増幅反応を４６℃以上の温度条件下で行なうことで、従来より高感度に検出する核酸増幅試薬も提供することができる。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
　実施例１　Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング
　Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニングは以下の方法に従い実施した。
（１）Ｔ７ファージゲノミックＤＮＡゲノミックライブラリー（シグマ製）を鋳型プラスミドとして、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を、以下の試薬組成及び反応条件にて、前半部分と後半部分に分けてＰＣＲ法を用い増幅した。なお、試薬組成のうち合成ＤＮＡプライマーは、前半部分の増幅にはプライマーＦＦ（配列番号１）及びプライマーＦＲ（配列番号２）を、後半部分の増幅にはプライマーＲＦ（配列番号３）及びプライマーＲＲ（配列番号４）を、それぞれ用いた。
　（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
　　　各２００ｐＭ　合成ＤＮＡプライマー
　　　１００ｎｇ　鋳型プラスミド
　　　０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ
　　　０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ　ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
　　　（ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（商品名）、
　　　タカラバイオ製）
　　　酵素に付属するバッファー
　（反応条件）
　　　サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９４℃で２分加熱後、９４℃・１分、５８℃・３０秒、７２℃・１分の温度サイクルを２５回繰り返した。
（２）ＰＣＲ反応後の液を１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで、ＰＣＲ産物を精製した。
（３）精製したＰＣＲ産物のうち、前半部分のＰＣＲ産物を制限酵素ＢｓｐＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ製）で消化し、制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ製）及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）にＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（４）（３）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％　ポリペプトン、０．５％　酵母エキス、１％　ＮａＣｌ、０．５％　グルコース、１％　寒天、５０μｇ／ｍＬ　カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーの保持するプラスミドをｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７Ｆとした。
（５）常法に従いｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７Ｆを調製後、後半部分のＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＦにＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（６）（５）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％　ポリペプトン、０．５％　酵母エキス、１％　ＮａＣｌ、０．５％　グルコース、１％　寒天、５０μｇ／ｍＬ　カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーの保持するプラスミドをｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌとした。図１にｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌの制限酵素地図を示す。なお、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子については実施例６に示す方法を用いて塩基配列を決定することにより、意図しない変異が導入されていないことを確認した。得られたＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子配列を配列番号５に、アミノ酸配列を配列番号６に示す。
　実施例２　発現ベクターの作製
　実施例１で作製したｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ（図１）を鋳型にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含んだＤＮＡ断片をＰＣＲ法にて増幅し、ｐＣＤＦ２プラスミド（図２）と連結した。
（１）ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ（図１）を鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成及び反応条件にて、ＰＣＲ反応を行なった。
　（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
　　　２００ｐＭ　プライマーｐＴｒｃＦ（配列番号７）
　　　２００ｐＭ　プライマーｐＴｒｃＲ（配列番号８）
　　　１００ｎｇ　鋳型プラスミド
　　　０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ
　　　０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ　ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
　　　（ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（商品名）、
　　　タカラバイオ製）
　　　酵素に付属するバッファー
　（反応条件）
　　　サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９４℃で２分加熱後、９４℃・１分、５８℃・３０秒、７２℃・２分４０秒の温度サイクルを２５回繰り返した。
（２）１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで、ＰＣＲ産物を精製した。
（３）精製したＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ（タカラバイオ製）及びＢｌｎＩ（タカラバイオ製）で消化し、制限酵素ＰｓｔＩ（タカラバイオ製）及びＢｌｎＩで消化したｐＣＤＦ２プラスミド（図２）にＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（４）（３）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％　ポリペプトン、０．５％　酵母エキス、１％　ＮａＣｌ、０．５％　グルコース、１％　寒天、５０μｇ／ｍＬ　カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーの保持するプラスミドをｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰとした。図３にｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰの制限酵素地図を示す。なお、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子については実施例６に示す方法を用いて塩基配列を決定することにより、意図しない変異が導入されていないことを確認した。
（５）ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰ（図３）を基に以下に示す方法でヒスチジンヘキサマーの導入を行なった。
（５−１）ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰ（図３）を鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成及び反応条件にて、１回目のＰＣＲ反応を行なった。なお、合成プライマーはプライマーＨｉｓＦ（配列番号９）とプライマーｐＣＤＦＲ（配列番号１０）の組み合わせ、またはプライマーＨｉｓＲ（配列番号１１）とプライマーｐＣＤＦＦ（配列番号１２）の組み合わせを用いた。
　（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
　　　各２００ｐＭ　合成ＤＮＡプライマー
　　　１００ｎｇ　鋳型プラスミド
　　　０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ
　　　０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）、タカラバイオ製）
　　　酵素に付属するバッファー
　（反応条件）
　　　サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９８℃で３０秒加熱後、９８℃・３０秒、５５℃・３０秒、７２℃・３分の温度サイクルを３０回繰り返した後、７２℃で７分間反応した。
（５−２）反応液を１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで、ＰＣＲ産物を精製した。
（５−３）得られた２種類のＰＣＲ産物を鋳型に、合成ＤＮＡプライマーとしてプライマーｐＣＤＦＲ（配列番号１０）とプライマーｐＣＤＦＦ（配列番号１２）の組み合わせを用いて２回目のＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応における試薬組成、及び反応条件は合成ＤＮＡプライマーと鋳型以外は（５−１）と同じ条件で行ない、増幅した産物を（５−２）と同様にアガロースゲルにて電気泳動後、抽出、精製した。
（５−４）ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰプラスミド（図３）と、（５−３）で精製した２回目のＰＣＲ産物に０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ　ＤＮＡポリメラーゼ及び酵素に付属するバッファーを加え、総反応液量を１００μＬとした。この反応液をサーマルサイクラーを用いて９５℃で３０秒加熱後、９５℃・３０秒、５５℃・１分、６８℃・８分の温度サイクルを１８回繰り返した後、６８℃で７分間反応させることで、ＰＣＲ反応を行なった。
（５−５）ＰＣＲ反応終了後、制限酵素ＤｐｎＩを１０ｕｎｉｔｓ加え、３７℃で１時間消化し、常法に従い大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。
（５−６）形質転換した溶液はＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％　ポリペプトン、０．５％　酵母エキス、１％　ＮａＣｌ、０．５％　グルコース、１％　寒天、５０μｇ／ｍＬ　カルベニシリン（ｐＨ７．４））に塗布し、３７℃で一晩保温した。生成したコロニーから常法によりプラスミドを抽出し、ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓプラスミドとした。図４にｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓの制限酵素地図を示す。さらに実施例６に示す方法を用いて塩基配列を決定することにより、意図しない変異が導入されていないこと、及びヒスチジンヘキサマーが導入されていることを確認した。また培養した菌体から酵素を抽出し、ニッケルキレート樹脂によるアフィニティ精製が可能であることを確認した。得られたヒスチジンヘキサマーを融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子配列を配列番号１３にアミノ酸配列を配列番号１４に示す。
　実施例３　変異ライブラリーの作製（その１）
　実施例２で作製したｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓプラスミド（図４）のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子に以下の手順で変異を導入した。
（１）ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓ（図４）を鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成及び反応条件にて、エラープローンＰＣＲ反応を行なった。
　（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
　　　０．１から０．３ｍＭ（必要に応じて）　ＭｎＣｌ２
　　　２００ｐＭ　プライマーｐＴｒｃＦｓ（配列番号１５）
　　　２００ｐＭ　プライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号１６）
　　　１００ｎｇ　鋳型プラスミド
　　　０．２ｍＭ　ｄＡＴＰ
　　　０．２ｍＭ　ｄＧＴＰ
　　　１ｍＭ　ｄＣＴＰ
　　　１ｍＭ　ｄＴＴＰ
　　　２ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　　　０．０１ｕｎｉｔ／μＬ　ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＧｏＴａｑ（商品名）、Ｐｒｏｍｅｇａ製）
　　　酵素に付属するＭｇフリーのバッファー
　（反応条件）
　　　サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９４℃で２分加熱後、９４℃・３０秒、５５℃・１分、７２℃・８分の温度サイクルを２５回繰り返した。
（２）ＰＣＲ産物を、１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで精製した。
（３）精製されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩで消化後、同酵素で消化したｐＣＤＦ２プラスミド（図２）にＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させ、反応後のＤＮＡ溶液をＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子変異体ライブラリーとした。
（４）作製したライブラリーの一部を定法に従い大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換しプラスミドを精製し、実施例６に示す方法で塩基配列を決定することでエラープローンＰＣＲの効果を確かめた。
　実施例４　スクリーニングベクターの作製
　実施例３で作製した変異ライブラリーの活性を評価するためにＧＦＰを用いた活性確認用ベクターの作製を行なった。
（１）ＧＦＰ遺伝子は塩基配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ　ＡＦ１８３３９５）に基づき、ｄｓＤＮＡを合成した。合成したＧＦＰ遺伝子には、Ｔ７プロモーターとクローニング用の制限酵素ＳｐｈＩ（タカラバイオ製）の塩基配列を持つように設計した。
（２）合成したＧＦＰ遺伝子は制限酵素ＳｐｈＩで３７℃で３時間消化し、１．０％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで精製した。これを同様に消化、精製したｐＳＴＶ２８ベクター（タカラバイオ製）とＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（３）（２）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｍ寒天培地（１％　ポリペプトン、０．５％　酵母エキス、１％　ＮａＣｌ、０．５％　グルコース、１％　寒天、３０μｇ／ｍＬ　クロラムフェニコール）上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーを取得した。
（４）取得したコロニーは、ＬＢＧ／Ｃｍ液体培地（１％　ポリペプトン、０．５％　酵母エキス、１％　ＮａＣｌ、０．５％　グルコース、３０μｇ／ｍＬ　クロラムフェニコール）を用いて、３７℃で一晩培養後、プラスミドを回収し、このプラスミドをＴ７プロモーターによって発現が誘導されるＧＦＰ遺伝子を持つｐＳＴＶＧＦＰとした。図５にｐＳＴＶＧＦＰの制限酵素地図を示す。
（５）取得したｐＳＴＶＧＦＰ（図５）を、実施例３で作製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子変異体ライブラリーと共に大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換を行なった。この菌液を３７℃のＳＯＣ培地で１．５時間培養後、ＦＡＣＡｒｉａセルソーター（日本ＢＤ製）で蛍光が観察される株を１クローンずつ分取し３７℃の２×ＹＴＧ／Ｃｒｂ培地（１．６％　バクトトリプトン、１％　バクト酵母エキス、０．５％　ＮａＣｌ、０．５％　グルコース、５０μｇ／ｍＬ　カルベニシリン（ｐＨ７．４））で増殖してきた株を、それぞれ変異体候補株とした。
　実施例５　高温型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのスクリーニング
　変異株のスクリーニングは効率的に変異体が評価できるよう９６ウェルタイタープレートを用いて行なった。
（１）１ｍＬ容量の９６ウェルディープウェルプレートに２００μＬのＬＢＧ／Ｃｒｂ培地（１％　ポリペプトン、０．５％　酵母エキス、１％　ＮａＣｌ、０．５％　グルコース、５０μｇ／ｍＬ　カルベニシリン（ｐＨ７．４））を加え、実施例４で得たＧＦＰ陽性のコロニーを植菌し、３７℃にて一晩６００回転／分で培養した。
（２）２ｍＬ容量の９６ディープウェルプレートに１．０ｍＬの２×ＹＴＧ／Ｃｒｂ培地（１．６％　バクトトリプトン、１％　バクト酵母エキス、０．５％　ＮａＣｌ、０．５％　グルコース、５０μｇ／ｍＬ　カルベニシリン（ｐＨ７．４））を加え、（１）での一晩培養液を１０μＬ植菌し、３７℃にて７５０回転／分で培養を開始した。
（３）（２）での培養約４時間後、５０ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）溶液１０μＬを添加し、温度を３０℃に下げて更に３時間振とう培養した。培養終了後、４℃にて３０００回転／分で１５分間遠心分離して菌体を回収し、得られた菌体は−３０℃にて一晩凍結保存した。
（４）凍結させた菌体に溶菌液１００μＬ（組成：２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．２％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、０．０２％　デオキシコール酸ナトリウム、０．０３％　リゾチーム（太陽化学製）、０．２５ｕｎｉｔのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（ノバジェン製））を加え、３０℃にて５００回転／分で１時間振とうし、４℃にて３０００回転／分で３０分間遠心分離し、上清を回収した。
（５）（４）で得られた上清の全量をニッケルキレート樹脂（ヒスバインド（商品名）、ノバジェン製）を充填した９６ウェルフィルタープレートにアプライし、緩衝液Ａ（２０ｍＭのイミダゾール及び５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））２００μＬで４回洗浄後、５０μＬの緩衝液Ｂ（１５０ｍＭのイミダゾール及び５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で溶出させた。
（６）溶出画分は実施例７の手順と同様にタンパク質濃度及び転写活性を測定し、タンパク量あたりの転写産物量である比活性を求めた。転写活性の測定条件は反応温度４６℃、反応時間６０分、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ量０．５μＬに設定し、ＲＮＡの定量はＱｕａｎｔ−ＩＴ　ＲＮＡアッセイキット（商品名）（インビトロジェン製）を用いた。約４０００の変異株から野生型の比活性よりも約２倍高い菌株６０種類をスクリーニングした。
　実施例６　シークエンス方法
　実施例５で選択した変異体候補株は、３７℃のＬＢＧ／Ｃｒｂ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％　酵母エキス、１％　ＮａＣｌ、０．５％　グルコース、５０μｇ／ｍＬ　カルベニシリン（ｐＨ７．４））で一晩培養後、定法によりプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドに含まれるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列決定は以下の方法で行なった。
（１）Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、添付のバッファー２．０μＬ、プレミックス４．０μＬ、合成ＤＮＡプライマー３．２ｐｍｏｌ、鋳型プラスミド５００ｎｇを滅菌水にて２０μＬに調製し、サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９６℃で１分加熱後、９６℃・１０秒、５０℃・５秒、６０℃・４分の温度サイクルを２５回繰り返した。
（２）（１）で調製した塩基配列決定用サンプルをＣｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラム（商品名）（ＡＢＩ製）を用いて、以下に示す方法で精製した。
（２−１）Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラムに滅菌水を８００μＬ加え、ボルテックスにより乾燥したゲルを十分に水和させた。
（２−２）カラムに気泡がないことを確認後、室温にて２時間以上放置した。
（２−３）上のキャップ、下のストッパーを順に外しカラム内の滅菌水をゲル表面まで自然落下させた後、７３０×ｇで２分間遠心分離を行なった。
（２−４）（２−１）から（２−３）により作製したスピンカラムの中央に塩基配列決定用サンプルをアプライし、７３０×ｇで２分間遠心分離によりサンプルをチューブに回収した。
（２−５）回収したサンプルについて減圧乾燥を行なった後、ホルムアミドに溶解した。
（３）（２）で調製した塩基配列決定用サンプルを９５℃で２分間処理し、氷上で急冷後、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３１０−ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）で解析することで、塩基配列を決定した。塩基配列決定に使用した合成ＤＮＡプライマーは、プライマーｐＴｒｃＦｓ（配列番号１５）、プライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号１６）、プライマーＴ７Ｆ０（配列番号１７）、プライマーＴ７Ｆ１（配列番号１８）、プライマーＴ７Ｆ２（配列番号１９）、プライマーＴ７Ｆ３（配列番号２０）、プライマーＴ７Ｆ４（配列番号２１）、プライマーＴ７Ｆ５（配列番号２２）、プライマーＴ７Ｆ６（配列番号２３）、プライマーＴ７Ｒ０（配列番号２４）、プライマーＴ７Ｒ１（配列番号２５）、プライマーＴ７Ｒ２（配列番号２６）、プライマーＴ７Ｒ３（配列番号２７）、プライマーＴ７Ｒ４（配列番号２８）、プライマーＴ７Ｒ５（配列番号２９）、プライマーＴ７Ｒ６（配列番号３０）を必要に応じて選択し使用した。
（４）決定した塩基配列はＧＥＮＥＴＹＸ　ｖｅｒ．８．０（商品名）（ゼネティクス製）を使用して解析を行なった。
　解析の結果、１９株に塩基配列の置換が見出された。そのうち、１０株にはアミノ酸の変化をもたらす変異が含まれていた。そのうちの１つは、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ塩基配列（配列番号５）のうち、５３５番目のアデニンがグアニンに置換されることでＡＡＧコドンがＧＡＧコドンに置換され、当該ポリメラーゼアミノ酸配列（配列番号６）の１７９番目のリジンがグルタミン酸に変異していることがわかった。この変異を有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼをＫ１７９Ｅ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号３１に、アミノ酸配列を配列番号３２に示す。さらに、残りの９株は野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ塩基配列（配列番号５）のうち、２３５７番目のアデニンがチミンに置換されることでＣＡＡコドンがＣＴＡコドンに置換され、当該ポリメラーゼアミノ酸配列（配列番号６）の７８６番目のグルタミンがロイシンに変異していることがわかった。この変異を有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼをＱ７８６Ｌ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号３３に、アミノ酸配列を配列番号３４にそれぞれ示す。
　実施例７　Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの調製と活性測定
　Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの調製は以下に示す手順で行なった。
（１）ＬＢＧ／Ｃｒｂ液体培地（１％　ポリペプトン、０．５％　酵母エキス、１％　ＮａＣｌ、０．５％　グルコース、５０μｇ／ｍＬ　カルベニシリン（ｐＨ７．４））３ｍＬに実施例５で得た形質転換体のグリセロールストックを植菌し、１８ｍＬ試験管にて３７℃で一晩振とう培養した。
（２）２×ＹＴＧ／Ｃｒｂ培地（１．６％　バクトトリプトン、１％　バクト酵母エキス、０．５％　ＮａＣｌ、０．５％　グルコース、５０μｇ／ｍＬ　カルベニシリン（ｐＨ７．４））１００ｍＬに（１）の前培養液１．０ｍＬを植菌し、５００ｍＬ容量のひだ付き三角フラスコにて、３７℃、１５０回転／分（タイテック製、ロータリー式）で培養した。
（３）（２）の培養約３から４時間後（Ｏ．Ｄ．６００ｎｍの値としておよそ１．０程度）に５００ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）１００μＬを添加し、温度を３０℃に下げて更に３時間振とう培養した。
（４）培養終了後、４℃にて４０００回転／分で１５分間遠心分離し、菌体を回収した。直ちに菌体破砕を行わない場合は−３０℃に保存した。
（５）回収した菌体は２０ｍＬの２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）により１回洗浄し、同じ組成の緩衝液２０ｍＬに再懸濁し、菌体破砕した。菌体破砕は超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、５℃にて約１５０Ｗの出力で約５分間処理した。
（６）得られた菌体破砕液を４℃にて１２０００回転／分で１０分間遠心分離し、回収した上清を酵素抽出液として、塩化ナトリウム及びイミダゾールをそれぞれ５００ｍＭ，２０ｍＭになるように添加し、ニッケルキレート樹脂によるアフィニティ精製に供した。
（７）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに付加させたヒスチジンヘキサマータグを利用したアフィニティ精製により、以下の方法で酵素精製を行なった。
（７−１）２ｍＬのニッケルキレート樹脂（ヒスバインド（商品名）、ノバジェン製）のスラリーを付属の空カラムに充填し、３ｍＬの滅菌水で洗浄した。
（７−２）洗浄したニッケルキレート樹脂に５ｍＬの５０ｍＭの硫酸ニッケル水溶液でキレート樹脂にニッケルを結合させ、更に３ｍＬの緩衝液Ａ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ　塩化ナトリウム、２０ｍＭ　イミダゾール）で洗浄した。そこに上記の酵素抽出液を加え、６ｍＬの緩衝液Ａで洗浄後、１ｍＬの緩衝液Ｂ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ　塩化ナトリウム、１５０ｍＭ　イミダゾール）で溶出し、活性画分を回収した。
（７−３）回収した画分を脱塩カラム（ＰＤ−１０（商品名）、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）により、５ｍＭ　ジチオスレイトール及び０．１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に置換し、等量のグリセロールを加えた。精製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは牛血清アルブミンをコントロールタンパク質としたプロテインアッセイキット（バイオラッド製）により濃度を求めた。また７．５％濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより酵素の純度を分析し、ほぼ単一であることを確認した。
（８）活性測定を、インヴィトロ転写反応にて生成したＲＮＡ量を測定する方法で行なった。なお、鋳型ＤＮＡはＴ７ＲＮＡポリメラーゼが特異的に認識するＴ７プロモーター配列を有するＤＮＡを用いるが、ここではＴ７プロモーター配列を含むプラスミドを鋳型にＰＣＲで増幅した約１．５ｋｂｐＤＮＡ断片を用いた。また、Ｔ７プロモーター配列の下流のＤＮＡの長さは１．０ｋｂｐであり、転写されるＲＮＡは約１．０ｋｂになる。
（８−１）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを除いた反応液（４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５ｍＭ　ジチオスレイトール、２０ｎｇ　鋳型ＤＮＡ、０．４Ｕ　ＲＮａｓｅ阻害剤、各０．４ｍＭ　ＮＴＰｓ（ＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ，ＵＴＰ））を０．２ｍＬのＰＣＲチューブにいれ、精製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼを０℃に冷却した状態で加え、合計１０μＬとした。
（８−２）予め反応温度に保温しておいたヒートブロック（マスターサイクラーｅｐグラジエント（商品名）、エッペンドルフ製）に先ほど調製したＰＣＲチューブをセットし、転写反応を行なった。反応停止は８０℃で２分間加熱することで行なった。
（８−３）生成したＲＮＡ量は１％アガロースゲルにて電気泳動した後、エチジウムブロマイドにて染色する方法、及び市販のＲＮＡ定量キットのＱｕａｎｔ−ＩＴ　ＲＮＡアッセイキット（商品名）（インビトロジェン製）を用いて蛍光染色し、添付の標準ＲＮＡで作製した検量線より濃度換算する方法にて分析した。
　実施例８　（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）二重変異体の作製
　Ｋ１７９Ｅ変異体とＱ７８６Ｌ変異体を基に、Ｋ１７９ＥとＱ７８６Ｌの二つの変異を持った二重変異体を作製した。
（１）Ｋ１７９Ｅ変異体とＱ７８６Ｌ変異体、それぞれからミニプレップ法を用いてプラスミドを調製した。
（２）Ｋ１７９Ｅ変異体から調製したプラスミドを鋳型として、以下の試薬組成及び反応条件にて、ＰＣＲ反応を行なった。
　（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
　　　２００ｐＭ　プライマーＴ７Ｒ２（配列番号２６）
　　　２００ｐＭ　プライマーｐＴｒｃＦｓ（配列番号１５）
　　　１００ｎｇ　鋳型プラスミド
　　　０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ
　　　０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ　ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
　　　（ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（商品名）、
　　　タカラバイオ製）
　　　酵素に付属するバッファー
　（反応条件）
　　　サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９４℃で２分加熱後、９４℃・１分、５８℃・３０秒、７２℃・２分４０秒の温度サイクルを２５回繰り返した。
（３）反応液を１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで精製した。
（４）Ｑ７８６Ｌ変異体から調製したプラスミドを鋳型に、合成プライマーとしてプライマーＴ７Ｆ２（配列番号１９）とプライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号１６）の組み合わせを使用した他は（１）から（２）と同じ条件で、ＰＣＲ反応と精製を行なった。
（５）（３）及び（４）で得られた、２種類の精製ＰＣＲ産物を鋳型として、さらにＰＣＲ反応を行ない、二重変異体遺伝子を作製した。なお、ＰＣＲ反応における試薬組成、反応条件、及び精製操作は、合成ＤＮＡプライマーとしてプライマーｐＴｒｃＦｓ（配列番号１５）とプライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号１６）の組み合わせを使用した他は（１）から（２）と同じ条件である。
（６）（５）で得られた、精製二重変異体遺伝子は制限酵素ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩ（タカラバイオ製）で消化後、同酵素で消化したｐＣＤＦ２ベクターにＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（７）（６）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％　ポリペプトン、０．５％　酵母エキス、１％　ＮａＣｌ、０．５％　グルコース、１％　寒天、５０μｇ／ｍＬ　カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーを二重変異体とした。さらに二重変異体は実施例６に示す塩基配列決定法により変異の導入を確認し、（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）変異体とした。その遺伝子配列を配列番号３５に、アミノ酸配列を配列番号３６に示す。
　実施例９　変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの熱安定性評価（その１）
　変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの熱安定性を以下のように測定した。
（１）実施例５でスクリーニングした変異体の塩基配列解析の結果（実施例６）から、高温域で野生型よりも活性が高かった、１７９番目のアミノ酸をリジンからグルタミン酸に置換した変異体（Ｋ１７９Ｅ）、７８６番目のアミノ酸をグルタミンからロイシンに置換した変異体（Ｑ７８６Ｌ）及び２つの変異を合わせた二重変異体（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）を、実施例７に記載した方法に従い精製酵素を調製した。なお、精製した酵素のタンパク濃度及び転写活性は実施例７に示した方法に準じ測定した。
（２）実施例７で調製した各種Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを希釈液（４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ　塩化マグネシウム、５ｍＭ　ジチオスレイトール、７０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１ｍｇ／ｍＬ　牛血清アルブミン）を用いて５０μｇ／ｍＬに調製した。
（３）０．２ｍＬのＰＣＲチューブに２５μＬ分注し、４７℃にて５分間、１０分間、２０分間、それぞれ加熱させた。
（４）加熱処理後遠心分離に上清を回収後、４３℃にて３０分間転写反応を行ない、残存活性を求めた。
（５）生成したＲＮＡ量は１％アガロースによる電気泳動にて分析した。
　結果を図６に示した。図６から変異体Ｑ７８６Ｌ及び（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）は野生型ではほとんど活性が無くなる４７℃でも、明瞭なＲＮＡのバンドが認められた。このことから、少なくともＱ７８６Ｌの変異を導入したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、野生型よりも熱安定性が優れていることがわかる。
　実施例１０　変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの活性評価（その１）
　変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの各反応温度における活性を以下のように測定した。
（１）実施例５でスクリーニングした変異体の塩基配列解析の結果（実施例６）から、高温域で野生型よりも活性が高かった１７９番目のアミノ酸をリジンからグルタミン酸に置換した変異体（Ｋ１７９Ｅ）、７８６番目のアミノ酸をグルタミンからロイシンに置換した変異体（Ｑ７８６Ｌ）及び２つの変異を合わせた二重変異体（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）を、実施例７に記載した方法に従い精製酵素を調製した。なお、精製した酵素のタンパク濃度及び転写活性は実施例７に示した方法に準じ測定した。
（２）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの活性を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの酵素量を１０μｇ／ｍＬ、反応温度を４３から５０℃の範囲で１０分間反応させて測定した。
（３）生成したＲＮＡ量をＱｕａｎｔ−ＩＴ　ＲＮＡアッセイキット（商品名）（インビトロジェン製）を用いて求めた。
　測定したＲＮＡ濃度を図７に示した。変異体Ｋ１７９Ｅは４２．９℃から４６．８℃の範囲で野生型よりも比活性が高いことがわかり、このことから、少なくともＫ１７９Ｅの変異を導入したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、野生型よりも比活性が向上していることがわかる。次に、変異体Ｑ７８６Ｌは４４．７℃から４７．９℃の範囲で野生型よりも比活性が高かったが、これは実施例９の結果より熱安定性が向上したことに由来すると思われる。また、二重変異体（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）では４２．９℃から４７．９℃の温度域で野生型よりも比活性が高かった。このことから、少なくともＫ１７９Ｅ及びＱ７８６Ｌの変異を導入したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、野生型よりも熱安定性及び比活性が向上していることがわかる。
　実施例１１　変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の調製（その１）
　野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ配列（配列番号６）のうち、１７９番目のリジンを他のアミノ酸に置換したＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の調製を、以下に示す手順で行なった。
（１）ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓ（図４）を鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成及び反応条件にて、１回目のＰＣＲ反応を行なった。なおＴ７ポリメラーゼ遺伝子の５’末端側を増幅するための合成ＤＮＡプライマーとして、プライマーｐＣＤＦＦ（配列番号１２）とプライマー１７９ＭＩＸＲ（配列番号３９）の組み合わせを、３’末端側を増幅するための合成プライマーとして、プライマー１７９ＭＩＸＦ（配列番号３７）とプライマーｐＣＤＦＲ２（配列番号３８）の組み合わせをそれぞれ用いた。
　（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
　　　各２００ｐＭ　合成ＤＮＡプライマー
　　　１００ｎｇ　鋳型プラスミド
　　　０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ
　　　０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）、タカラバイオ製）
　　　酵素に付属するバッファー
　（反応条件）
　　　サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９８℃で３０秒加熱後、９８℃・３０秒、５５℃・３０秒、７２℃・１分３０秒の温度サイクルを３０回繰り返した後、７２℃で７分間反応した。
（２）（１）で調製したＰＣＲ産物を、１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで、ＰＣＲ産物を精製した。
（３）得られた２種類（５’末端側及び３’末端側）のＰＣＲ産物を鋳型に、プライマーｐＣＤＦＦ（配列番号１２）とプライマーｐＣＤＦＲ２（配列番号３８）を合成ＤＮＡプライマーとして用いて、２回目のＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応における試薬組成、及び反応条件は合成ＤＮＡプライマーと鋳型以外は（１）と同じ条件で行ない、増幅した産物を（２）と同様にアガロースゲルにて電気泳動後、抽出、精製した。
（４）（３）で精製した２回目のＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｒｕＩ及びＳａｃＩで消化後、同酵素で消化したｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓプラスミド（図４）にＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させ、反応後のＤＮＡ溶液をＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子変異体ライブラリーとした。
（５）（４）で作製したライブラリーを大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、３７℃のＬＢＧ／Ｃｒｂ培地（１．０％　バクトトリプトン、０．５％　バクト酵母エキス、０．５％　ＮａＣｌ、０．５％　グルコース、５０μｇ／ｍＬ　カルベニシリン（ｐＨ７．４））で増殖してきたコロニーを９０個、各ライブラリーから選抜した。
（６）選抜した菌株は常法によりプラスミドを抽出後、ｐＣＤＦＦ（配列番号１２）を塩基配列決定用合成ＤＮＡプライマーとして使用した他は、実施例６の手順と同様に塩基配列決定を行なうことで、塩基配列の変異を確認した。
　実施例１２　変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の調製（その２）
　野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ配列（配列番号６）のうち、７８６番目のグルタミンを他のアミノ酸に置換したＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の調製を、以下に示す手順で行なった。
（１）ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓ（図４）を鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成及び反応条件にて、１回目のＰＣＲ反応を行なった。なおＴ７ポリメラーゼ遺伝子の５’末端側を増幅するための合成ＤＮＡプライマーとして、プライマーｐＣＤＦＦ４（配列番号４２）とプライマー７８６ＭＩＸＲ（配列番号４１）の組み合わせ、３’末端側を増幅するための合成プライマーとして、プライマー７８６ＭＩＸＦ（配列番号４０）とプライマーｐＴｒｃＲＳ（配列番号１６）の組み合わせをそれぞれ用いた。
　（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
　　　各２００ｐＭ　合成ＤＮＡプライマー
　　　１００ｎｇ　鋳型プラスミド
　　　０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ
　　　０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）、タカラバイオ製）
　　　酵素に付属するバッファー
　（反応条件）
　　　サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９８℃で３０秒加熱後、９８℃・３０秒、５５℃・３０秒、７２℃・１分３０秒の温度サイクルを３０回繰り返した後、７２℃で７分間反応した。
（２）（１）で調製したＰＣＲ産物を、１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで、ＰＣＲ産物を精製した。
（３）得られた２種類（５’末端側及び３’末端側）のＰＣＲ産物を鋳型に、プライマーｐＣＤＦＦ４（配列番号４２）とプライマーｐＴｒｃＲＳ（配列番号１６）を合成ＤＮＡプライマーとして用いて、２回目のＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応における試薬組成、及び反応条件は合成ＤＮＡプライマーと鋳型以外は（１）と同じ条件で行ない、増幅した産物を（２）と同様にアガロースゲルにて電気泳動後、抽出、精製した。
（４）（３）で精製した２回目のＰＣＲ産物を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩで消化後、同酵素で消化したｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓプラスミド（図４）にＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させ、反応後のＤＮＡ溶液をＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子変異体（１７９番目）ライブラリーとした。
（５）（４）で作製したライブラリーを大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、３７℃のＬＢＧ／Ｃｒｂ培地（１．０％　バクトトリプトン、０．５％　バクト酵母エキス、０．５％　ＮａＣｌ、０．５％　グルコース、５０μｇ／ｍＬ　カルベニシリン（ｐＨ７．４））で増殖してきたコロニーを９０個、各ライブラリーから選抜した。
（６）選抜した菌株は常法によりプラスミドを抽出し、ｐＣＤＦＦ４（配列番号４２）を塩基配列決定用合成ＤＮＡプライマーとして使用した他は、実施例６の手順と同様に塩基配列決定を行なうことで、塩基配列の変異を確認した。
　実施例１３　変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体の活性評価（その２）
　実施例１１及び１２で作製した変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子から、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの調製及び転写活性の測定を実施例７の方法に従い実施した。結果を図８（１７９番目のリジンを他のアミノ酸に置換したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）及び９（７８６番目のグルタミンを他のアミノ酸に置換したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）に示す。
　１７９番目のリジンを他のアミノ酸に置換した場合、スクリーニングで得られたグルタミン酸置換（Ｋ１７９Ｅ）の他にも、システイン置換（Ｋ１７９Ｃ）、アスパラギン置換（Ｋ１７９Ｎ）した変異体が野生型より耐熱性及び／または比活性が向上しており、特にグルタミン酸に置換した（Ｋ１７９Ｅ）変異体が、野生型に対する耐熱性及び比活性の向上が大きかった（図８）。
　一方、７８６番目のグルタミンを他のアミノ酸に置換した場合、スクリーニングで得られたロイシン置換（Ｑ７８６Ｌ）の他にも、メチオニン置換（Ｑ７８６Ｍ）、フェニルアラニン置換（Ｑ７８６Ｆ）、チロシン置換（Ｑ７８６Ｙ）した変異体が野生型より耐熱性及び／または比活性が向上しており、特にメチオニンに置換した（Ｑ７８６Ｍ）変異体が、野生型に対する耐熱性及び比活性の向上が大きかった（図９）。
　実施例１４　変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの熱安定性評価（その２）
　実施例１３で調製した変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの熱安定性を以下に示す方法で測定した。
（１）実施例１３で調製した変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｑ７８６Ｍ、Ｑ７８６Ｌ、Ｑ７８６Ｆ、Ｑ７８６Ｙ、Ｋ１７９Ｅ、Ｋ１７９Ｃ、及びＫ１７９Ｎ）及び野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを以下に示す組成の緩衝液を用いて１００μｇ／ｍＬに調製し、０．２ｍＬのＰＣＲチューブに２５μＬ分注後、４７℃にて１分、２分、５分、１０分、２０分、３０分間加熱処理した。
　（緩衝液組成）
　　　４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
　　　２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　　　５ｍＭ　ジチオスレイトール
　　　７０ｍＭ　ＫＣｌ
　　　０．０１ｍｇ／ｍＬ　牛血清アルブミン
（２）加熱処理後の液を用いて、４３℃・３０分間の転写反応により活性を測定し、各処理時間の活性を加熱前の活性で割った値を残存活性とした。
　残存活性のグラフを図１０に示す。また、図１０のグラフの傾きから各種変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及び野生型の半減期を求めた結果を表１に示す。表１より各種変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは野生株よりも半減期が長く、４８℃における熱安定性に優れていることがわかる。また特に、Ｑ７８６Ｌ及びＱ７８６Ｍ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの熱安定性が高いことがわかる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　実施例１５　変異ライブラリーの作製（その２）
　実施例８で作製した（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）変異体遺伝子配列（配列番号３５）、及び前記配列の５’末端側にヒスチジンヘキサマー配列を含むプラスミドベクターｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓ（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）を用いて、以下の手順で変異を導入した。
（１）ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓ（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）を鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成及び反応条件にて、エラープローンＰＣＲ反応を行なった。
　（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
　　　０．１から０．３ｍＭ（必要に応じて）　ＭｎＣｌ２
　　　２００ｐＭ　プライマーｐＴｒｃＦｓ（配列番号１５）
　　　２００ｐＭ　プライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号１６）
　　　１００ｎｇ　鋳型プラスミド
　　　０．２ｍＭ　ｄＡＴＰ
　　　０．２ｍＭ　ｄＧＴＰ
　　　１ｍＭ　ｄＣＴＰ
　　　１ｍＭ　ｄＴＴＰ
　　　２ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　　　０．０１ｕｎｉｔ／μＬ　ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＧｏＴａｑ（商品名）、Ｐｒｏｍｅｇａ製）
　　　酵素に付属するＭｇフリーのバッファー
　（反応条件）
　　　サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９４℃で２分加熱後、９４℃・３０秒、５５℃・１分、７２℃・８分の温度サイクルを２５回繰り返した。
（２）ＰＣＲ産物を、１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色により行い、ゲルから切り出して精製した。
（３）精製されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩで消化後、同酵素で消化したｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓプラスミド（図４）にＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させ、反応後のＤＮＡ溶液をＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子変異体ライブラリーとした。
（４）作製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子変異体ライブラリーを、実施例４で作製したプラスミドｐＳＴＶＧＦＰ（図５）を含む大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、前記形質転換液を３７℃のＳＯＣ培地で１時間培養後、ＬＢＧ／Ｃｒｂ／Ｃｍ寒天体培地（１％ポリペプトン、０．５％　酵母エキス、１％　ＮａＣｌ、０．５％　グルコース、５０μｇ／ｍＬ　カルベニシリン、３０μｇ／ｍＬ　クロラムフェニコール、１．５％　寒天）で増殖し、かつＧＦＰ蛍光を発する株を変異体候補株とした。なお作製したライブラリーは、その一部を用いて定法に従い大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換しプラスミドを精製し、実施例６に示す方法で塩基配列を決定することでエラープローンＰＣＲの効果を確かめた。
　実施例１６　高温型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのスクリーニング（その２）
　実施例１５で得られた変異株のスクリーニングは実施例５と同じ方法でスクリーニングを行なった。スクリーニングの結果、約４０００の変異株から、実施例８で作製した（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼより比活性が約２倍高い菌株が３４株得られ、これを一次候補株とした。更に前記一次候補株を実施例５と同じ方法で再スクリーニングを行ない、最終的に（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼより比活性が２倍以上高い菌株１株を選定した。
　実施例１７　選定株の塩基配列解析
　実施例１６で選定した菌株を実施例６に記載の方法で、塩基配列の確認を行ない変異部位を確認した。その結果、塩基配列２０５４番目のチミンがシトシンに置換されることでＧＴＧコドンがＧＣＧコドンに置換されアミノ酸配列６８５番目のバリンがアラニンに変異していることがわかった。この変異を有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼを（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）変異体とし、その遺伝子配列を配列番号４３にアミノ酸配列を配列番号４４に示す。
　実施例１８　（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの作製
　実施例１６で得られたヒスチジンヘキサマー配列を有する（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）三重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌ＪＭ１０９株を用い、以下の手順で酵素を調製した。
（１）ＬＢＧ／Ｃｒｂ液体培地（１％　ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％　ＮａＣｌ、０．５％　グルコース、５０μｇ／ｍＬ　カルベニシリン（ｐＨ７．４））４０ｍＬに実施例１６で得られた菌株のグリセロールストックを植菌し、１００ｍＬ容量のひだ付き三角フラスコにて３７℃で一晩振とう培養した。
（２）１．５Ｌの２×ＹＴＧ／Ｃｒｂ培地（１．６％　バクトトリプトン、１％　バクト酵母エキス、０．５％　ＮａＣｌ、０．５％　グルコース、５０μｇ／ｍＬ　カルベニシリン（ｐＨ７．４））に前培養液３０ｍＬを植菌し、３Ｌ容量の発酵槽にて、３７℃にて培養した。
（３）（２）の培養約３時間後（Ｏ．Ｄ．６００ｎｍの値としておよそ２．０）に５００ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）１．５ｍＬを添加し、温度を３０℃に下げてさらに３時間培養した。培養中酸素濃度は１．６ｐｐｍ以上、ｐＨは６．８から７．２の範囲に調整した。
（４）培養終了後、４℃にて１５分間、７０００回転／分で遠心分離し、湿菌体２１ｇを得た。菌体は１００ｍＬの２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、直ちに次の処理をしない場合は−３０℃に保存した。
（５）回収した菌体の半分を０．１ｍＭ　ＰＭＳＦ及び１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）４２ｍＬに懸濁し、菌体破砕した。菌体破砕は超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、５℃にて約５分間、約１５０Ｗの出力で処理し、４℃にて１０分間、１２０００回転／分の遠心分離にて可溶性画分を回収した。
（６）回収した画分４５ｍＬに５．１ｍＬの２Ｍ　硫酸アンモニウム、及び０．９５ｍＬの１０％ポリエチレンイミンをそれぞれ添加し、０℃で約１時間保冷した後、４℃にて１０分間、１２０００回転／分の遠心分離にて上清を回収した。
（７）回収した上清の一部を用いて、実施例７に示した方法に準じ、ヒスチジンヘキサマータグを利用したアフィニティクロマトグラフにより精製した。
　精製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼのタンパク濃度は２８０ｎｍの吸光度より求めた。また５から２０％濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより酵素タンパク純度を分析し、ほぼ単一のタンパクであることを確認した。
　実施例１９　変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの活性評価（その３）
　実施例１８で作製した（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）三重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの活性評価を実施例７に示したインヴィトロ転写反応によって生成したＲＮＡ量を測定する方法で行なった。なお、転写反応温度は４３から５０℃の範囲に設定し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの酵素量を１０ｎｇ／μＬ、反応時間は３０分間とした。また、対照として実施例８で作製した（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）二重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、及び野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた。
　各温度において生成したＲＮＡ量を図１１に示した。図１１から（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）三重変異体は元の変異体である（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）二重変異体よりも反応温度４６℃以上で比活性が高いことがわかる。
　実施例２０　変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの熱安定性評価（その３）
　Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ各種変異体及び野生型の熱安定性は以下の方法で測定した。
（１）実施例１８で作製した（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）三重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、実施例８で作製した（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）二重変異体型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、及び野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを以下に示す組成の緩衝液を用いて１００μｇ／ｍＬに調製し、０．２ｍＬのＰＣＲチューブに２５μＬ分注後、４８℃にて１分、２分、５分、１０分、２０分間加熱処理した。
　（緩衝液組成）
　　　４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
　　　２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　　　５ｍＭ　ジチオスレイトール
　　　７０ｍＭ　ＫＣｌ
　　　０．０１ｍｇ／ｍＬ　牛血清アルブミン
（２）加熱処理後の液を用いて、４３℃にて３０分間の転写反応により活性を測定し、各処理時間の活性を加熱前の活性で割った値を残存活性とした。
　残存活性のグラフを図１２に示す。また、図１２のグラフの傾きから各種変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及び野生型の半減期を求めた結果を表２に示す。表２より（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）三重変異体は（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）二重変異体や野生株よりも半減期が長く、４８℃における熱安定性に優れていることがわかる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　実施例２１　（Ｑ７８６Ｌ＋Ｍ６８５Ａ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの作製
　実施例１８で作製した（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）三重変異型Ｔ７ポリメラーゼより、以下の方法で（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）二重変異型Ｔ７ポリメラーゼを作製した。
（１）（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）三重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を挿入したｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓ（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）プラスミド、及び野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を挿入したプラスミドｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰ（図３）をミニプレップ法で調製した。
（２）両プラスミド２００ｎｇを常法により制限酵素ＫｐｎＩ及びＳａｃＩで消化し、アガロースゲル電気泳動後、野生型の４．５ｋｂｐのフラグメント及び（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）変異体の１．４ｋｂｐのフラグメントをゲル抽出法により精製した。
（３）精製した野生型フラグメント４０ｎｇと（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）変異体のフラグメント８０ｎｇをＴ４リガーゼを用いて１６℃で３０分間反応し、常法により大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。
（４）前記形質転換体を、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％　ポリペプトン、０．５％　酵母エキス、１％　ＮａＣｌ、０．５％グルコース、１．５％　寒天、５０μｇ／ｍＬ　カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選別を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーのプラスミドを調製した。
　（４）で調製したプラスミドは実施例６に示す塩基配列決定法により目的とする変異の導入を確認した。当該プラスミド遺伝子配列を配列番号４５、アミノ酸配列を配列番号４６に示す。
　実施例２２　（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの精製
　実施例２１で作製した（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）二重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌ＪＭ１０９株を用い、以下の方法で（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを調製した。
（１）実施例１８に示した手順に準じ培養を行ない、湿菌体２８ｇを得た。
（２）得られた菌体を０．１ｍＭ　ＰＭＳＦ及び１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１１２ｍＬに懸濁後、超音波にて菌体を破砕し、遠心分離により上清を回収した。
（３）得られた酵素抽出液１３５ｍＬに対し１７．５ｍＬの２Ｍ　硫酸アンモニウム及び３．５ｍＬの１０％　ポリエチレンイミンを添加し、０℃で約１時間保冷後、遠心分離により上清を回収した。
（４）回収した上清１３０ｍＬに５１ｇの硫酸アンモニウムを加え、０℃で１時間保冷後、遠心分離にて回収した沈殿を以下の組成の緩衝液３０ｍＬに溶解させた。
　（緩衝液組成）
　　　２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）
　　　１ｍＭ　ジチオスレイトール
　　　０．１ｍＭ　ＰＭＳＦ
　　　１ｍＭ　ＥＤＴＡ
（５）（４）で調製した沈殿溶解液を以下の方法で高速液体クロマトグラフィーにて精製した。
（５−１）疎水カラム（ＴＳＫｇｅｌ　Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ（商品名）、東ソー製）により以下の条件で精製した。
　（精製条件）
　　　溶離液Ａ：
　　　　２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）
　　　　５０ｍＭ　ＮａＣｌ
　　　　０．６Ｍ　硫酸アンモニウム
　　　　１ｍＭ　ＤＴＴ
　　　　１ｍＭ　ＥＤＴＡ
　　　溶離液Ｂ：
　　　　溶離液Ａのうち硫酸アンモニウムを除いた組成
　　　グラジエント：
　　　　０分から６０分：溶離液Ａ１００％
　　　　６０分から１２０分：溶離液Ａ１００％から０％へのリニアグラジエント
　　　　１２０分から１３０分：溶離液Ａ０％
　　　　１３０分：溶離液Ａ０％から１００％へのステップグラジエント
　　　検出：２８０ｎｍ
　　　流速：４ｍＬ／分
（５−２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＴ７ＲＮＡポリメラーゼの含有量が多い画分１００ｍＬを回収し、３９ｇの硫酸アンモニウムで塩析した。
（５−３）遠心分離で回収した塩析物を以下に示す組成の緩衝液５ｍＬに溶解させた。
　（緩衝液組成）
　　　２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）
　　　１ｍＭ　ジチオスレイトール
　　　０．１ｍＭ　ＰＭＳＦ
　　　１ｍＭ　ＥＤＴＡ
（５−４）分画分子量１２０００の透析膜を用いて同組成の緩衝液に一晩４℃で透析し、イオン交換カラム（ＴＳＫｇｅｌ　ＤＥＡＥ−５ＰＷ（商品名）、東ソー製）により以下の条件で精製した。
　（精製条件）
　　　溶離液Ａ：
　　　　２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）
　　　　５０ｍＭ　ＮａＣｌ
　　　　１ｍＭ　ジチオスレイトール
　　　　１ｍＭ　ＥＤＴＡ
　　　溶離液Ｂ：
　　　　溶離液ＡのうちＮａＣｌ濃度を０．８Ｍに変更した組成グラジエント：
　　　　０分から２０分：溶離液Ａ１００％
　　　　２０分から８０分：溶離液Ａ１００％から０％へのリニアグラジエント
　　　　８０分から９０分：溶離液Ａ０％
　　　　９０分：溶離液Ａ０％から１００％へのステップグラジエント
　　　検出：２８０ｎｍ
　　　流速：４ｍＬ／分
（５−５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析でＴ７ＲＮＡポリメラーゼの含有量が多い画分５ｍＬを回収し、１．９５ｇの硫酸アンモニウムで塩析した。
（５−６）ゲルろ過精製に用いる緩衝液１ｍＬに溶解させ、ゲルろ過カラム（ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ（商品名）、東ソー製）で以下の条件で精製した。
　（精製条件）
　　　溶離液：
　　　　４０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）
　　　　２００ｍＭ　ＮａＣｌ
　　　　２ｍＭ　ジチオスレイトール
　　　　０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ
　　　検出：２８０ｎｍ
　　　流速：５ｍＬ／分
（５−７）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析からＴ７ＲＮＡポリメラーゼの含有量が多い画分４ｍＬを回収した。
（５−８）回収画分を１．５６ｇの硫酸アンモニウムで塩析したのち、脱塩カラム（ＰＤ−１０（商品名）、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いてゲルろ過カラム精製と同じ組成の緩衝液で置換し、等量のグリセロールを加えて２．５ｍＬとした。
　精製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ二重変異体のタンパク濃度を２８０ｎｍの吸光度より求めたところ１．９ｍｇ／ｍＬだった。また５から２０％濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥで酵素タンパクを分析し、ほぼ単一なバンドであることを確認した。
　実施例２３　変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応
　実施例２２で調製した（Ｑ７８６Ｌ＋Ｍ６８５Ａ）二重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたＴＲＣ法による核酸増幅を、以下の方法でサルモネラ毒素遺伝子（ｓｔｎ　ＲＮＡ）を標的ＲＮＡとし、測定した。なお、対照として野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた。
（１）サルモネラｓｔｎ　ｍＲＮＡ検出試薬（ＴＲＣＲｔｅｓｔ　ｓｔｎ−ｍ（商品名）、東ソー製）に添付のｓｔｎ　ＲＮＡ陽性標準（濃度：１０６コピー／５μＬ）をＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μＬ　ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、５ｍＭ　ジチオスレイトール）にて、１０４コピー／５μＬとなるよう希釈した。コントロール試験区（陰性）にはＲＮＡ希釈液のみを用いた。
（２）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容のＰＣＲ用チューブに分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
　（反応液の組成）（最終反応液量３０μＬにおける濃度または量）
　　　６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
　　　１７ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　　　１００ｍＭ　ＫＣｌ
　　　６Ｕ　ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
　　　１ｍＭ　ジチオスレイトール
　　　各０．２５ｍＭ　ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、
　　　ｄＴＴＰ
　　　３．６ｍＭ　ＩＴＰ
　　　各３．０ｍＭ　ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
　　　０．１２μＭ　切断用オリゴヌクレオチド（配列番号４７、３’末端の水酸基はアミノ化）
　　　１．０μＭ　第一のプライマー（配列番号４８）
　　　１．０μＭ　第二のプライマー（配列番号４９）
　　　７．５ｎＭ　インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（配列番号５０、５’末端側１２番目の「Ａ」と１３番目の「Ａ」の間にインターカレーター性蛍光色素が標識され、かつ３’末端側の水酸基はグリコール基で修飾）
　　　１％　ＤＭＳＯ
　　　容量調整用蒸留水
（３）（２）の反応液を変異体は４９℃、５０℃、５１℃の各温度で、野生型は４３℃、４９℃の各温度で、５分間保温後、あらかじめ各温度で２分間保温した以下に示す組成の酵素液５μＬを添加した。
　（酵素液の組成）（最終反応液量３０μＬにおける濃度または量）
　　　２％　ソルビトール
　　　３．６μｇ　牛血清アルブミン
　　　４Ｕ　ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス製）
　　　４６Ｕ　Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
　　　容量調整用蒸留水
（４）直接測定可能な温度調節機能付き蛍光光度計を用い、各温度でＰＣＲチューブを保温し、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
　酵素添加時の時間を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度値で割った値）の経時変化を図１３に示した。野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用したときは、反応温度４９℃の時点でｓｔｎ　ＲＮＡの増幅が見られなかったのに対し、（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）二重変異体は反応温度５１℃においてもｓｔｎ　ＲＮＡの増幅がみられた。このことから、（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）二重変異体は野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較し、４９℃から５１℃といった高温領域での熱安定性及び／または比活性に優れていることがわかる。
　実施例２４　Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体による核酸増幅反応の最低検出濃度測定
　実施例２２で調製した（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）二重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのｓｔｎ　ｍＲＮＡ標準ＲＮＡに対する最低検出濃度を確認した。
　測定方法は、反応温度を５０℃（二重変異体）または４３℃（野生型）、標的ＲＮＡの濃度を１０、５０、１００、３００、５００、１０００コピー／５μＬに変更した他は、実施例２３の同様の方法で行なった。
　各初期ＲＮＡコピー数における（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）二重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及び野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの検出率を表３に示した。表３より（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）二重変異体を用いた時のｓｔｎ　ＲＮＡの検出率は野生型４３℃の検出率より高く、検出率８０％以上を示す最小ＲＮＡ濃度で比較すると、野生型では１０００コピー／５μＬに対し、（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）二重変異体は２００コピー／５μＬであった。両酵素の最適温度条件で比較した場合、（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）変異体は野生型より約５倍感度が向上していることがわかる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　実施例２５　Ｖ６８５Ａ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの作製
　実施例２で作製したｐＣＤＦ−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓプラスミド（図４）のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子より、以下の手順で、アミノ酸配列６８５番目のバリンがアラニンに変異したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体（Ｖ６８５Ａ変異体）を作製した。
（１）ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓ（図４）を鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成及び反応条件にて、ＰＣＲ反応を行なった。なお、合成プライマーはプライマーＶ６８５ＡＦ（配列番号５１）とプライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号１６）の組み合わせ、またはｐＣＤＦＦ４（配列番号４２）とプライマーＶ６８５ＡＲ（配列番号５３）の組み合わせを用いた。
　（試薬組成）（総反応液量：５０μＬ）
　　　各１００ｐＭ　合成ＤＮＡプライマー
　　　５０ｎｇ　鋳型プラスミド
　　　０．１ｍＭ　ｄＮＴＰｓ
　　　０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）、タカラバイオ製）
　　　酵素に付属するバッファー
　（反応条件）
　　　サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９６℃で３０秒加熱後、９６℃・３０秒、５０℃・３０秒、７２℃・１分の温度サイクルを３０回繰り返した。
（２）反応液を１％アガロース電気泳動で分離後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで精製した。
（３）（２）で得られた、２種類の精製ＰＣＲ産物を鋳型として、さらにＰＣＲ反応を行ない、Ｖ６８５Ａ変異体遺伝子を作製した。なお、ＰＣＲ反応における試薬組成、反応条件、及び精製操作は、合成ＤＮＡプライマーとしてプライマーｐＣＤＦＦ４（配列番号４２）とプライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号１６）の組み合わせを使用した他は（１）から（２）と同じ条件である。
（４）（３）で得られたＤＮＡ断片を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩ（タカラバイオ製）で消化後、同じ酵素で消化したｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓベクターにＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（５）（４）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％　ポリペプトン、０．５％　酵母エキス、１％　ＮａＣｌ、０．５％　グルコース、１．５％　寒天、５０μｇ／ｍＬ　カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーをＶ６８５Ａ変異体とした。さらにＶ６８５Ａ変異体は実施例６に示す塩基配列決定法により変異の導入を確認した。その遺伝子配列を配列番号５４に、アミノ酸配列を配列番号５５に示す。
　実施例２６　Ｖ６８５Ａ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの精製と活性評価
　実施例２５で作製したＶ６８５Ａ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌ＪＭ１０９株を用いて、実施例７に示した方法で、Ｖ６８５Ａ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの調製及び活性評価を行なった。なお、転写反応温度は４３から４９℃の範囲に設定し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの酵素量を２０ｎｇ／μＬ、反応時間は３０分間とした。また、対照として野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた。
　各温度において生成したＲＮＡ量を図１４に示した。図１４からＶ６８５Ａ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは野生型よりも反応温度４５℃以上でＲＮＡ生産量が多く、高温での比活性が向上していることがわかる。
　実施例２７　Ｖ６８５Ａ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの熱安定性評価
　実施例２６で調製したＶ６８５Ａ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、実施例２０に示した方法でＶ６８５Ａ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの熱安定性を評価した。なお、加熱処理温度は４６℃に設定し、処理時間は１分、２分、５分間とした。また、対照として野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた。
　残存活性のグラフを図１５に示す。また、図１５のグラフの傾きからＶ６８５Ａ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及び野生型の半減期を求めた結果を表４に示す。表４よりＶ６８５Ａ変異体は野生型よりも半減期が長く、４６℃における熱安定性に優れていることがわかる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　実施例２８　（Ｖ６８５Ａ＋Ｑ７８６Ｍ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの作製
　実施例２５で作製した、Ｖ６８５Ａ変異体Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を挿入したｐＣＤＦ−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓプラスミド（図４）を用いて、以下の方法で、さらにアミノ酸配列７８６番目のグルタミンがメチオニンに変異した（Ｖ６８５Ａ＋Ｑ７８６Ｍ）二重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを作製した。
（１）Ｖ６８５Ａ変異体のｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓを鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成及び反応条件にて、ＰＣＲ反応を行なった。なお、合成プライマーはプライマーＱ７８６ＭＦ（配列番号５６）とプライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号１６）の組み合わせ、またはｐＣＤＦＦ４（配列番号４２）とプライマーＱ７８６ＭＲ（配列番号５７）の組み合わせを用いた。
　（試薬組成）（総反応液量：５０μＬ）
　　　各１００ｐＭ　合成ＤＮＡプライマー
　　　５０ｎｇ　鋳型プラスミド
　　　０．１ｍＭ　ｄＮＴＰｓ
　　　０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）、タカラバイオ製）
　　　酵素に付属するバッファー
　（反応条件）
　　　サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９６℃で３０秒加熱後、９６℃・３０秒、５０℃・３０秒、７２℃・１分の温度サイクルを３０回繰り返した。
（２）反応液を１％アガロース電気泳動で分離後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで精製した。
（３）（２）で得られた、２種類の精製ＰＣＲ産物を鋳型として、さらにＰＣＲ反応を行ない、（Ｖ６８５Ａ＋Ｑ７８６Ｍ）変異体遺伝子を作製した。なお、ＰＣＲ反応における試薬組成、反応条件、及び精製操作は、合成ＤＮＡプライマーとしてプライマーｐＣＤＦＦ４（配列番号４２）とプライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号１６）の組み合わせを使用した他は（１）から（２）と同じ条件である。
（４）（３）で得られたＤＮＡ断片を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩ（タカラバイオ製）で消化後、同じ酵素で消化したｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓベクターにＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（５）（４）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％　ポリペプトン、０．５％　酵母エキス、１％　ＮａＣｌ、０．５％　グルコース、１．５％　寒天、５０μｇ／ｍＬ　カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーを（Ｖ６８５Ａ＋Ｑ７８６Ｍ）変異体とした。さらに（Ｖ６８５Ａ＋Ｑ７８６Ｍ）変異体は実施例６に示す塩基配列決定法により変異の導入を確認した。その遺伝子配列を配列番号５８に、アミノ酸配列を配列番号５９に示す。
　実施例２９　（Ｖ６８５Ａ＋Ｑ７８６Ｍ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの精製と活性評価
　実施例２８で作製した（Ｖ６８５Ａ＋Ｑ７８６Ｍ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌ＪＭ１０９株を用いて、実施例７に示した方法で、（Ｖ６８５Ａ＋Ｑ７８６Ｍ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの調製及び活性評価を行なった。なお、転写反応温度は４３から５０℃の範囲に設定し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの酵素量を２０ｎｇ／μＬ、反応時間は３０分間とした。また、対照として野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた。
　各温度において生成したＲＮＡ量を図１６に示した。図１６から（Ｖ６８５Ａ＋Ｑ７８６Ｍ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは野生型よりも反応温度４５℃以上でＲＮＡ生産量が多く、高温での比活性が向上していることがわかる。

Claims (16)

  1. 配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち少なくとも、７８６番目のグルタミン、１７９番目のリジン及び６８５番目のバリンからなる群から選ばれる少なくとも１つに相当するアミノ酸残基が、他のアミノ酸に置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して、熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
  2. 配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基が疎水性アミノ酸に置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
  3. 配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはメチオニンに置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
  4. 配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、さらに、少なくとも１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸、アスパラギン、システインのいずれかに置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して、熱安定性及び比活性が向上していることを特徴とする、請求項２又は３に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
  5. 配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸、アスパラギン、システインのいずれかに置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
  6. 配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、さらに、少なくとも６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基が中性または弱疎水性アミノ酸に置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して、熱安定性及び比活性が向上していることを特徴とする、請求項２から５のいずれか１項に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
  7. 配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、さらに、少なくとも６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して、熱安定性及び比活性が向上していることを特徴とする、請求項６に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
  8. 配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基が中性または弱疎水性アミノ酸に置換され、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較して熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とする、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
  9. 配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換され、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較して熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とする、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
  10. 配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換され、さらに、１７９番目のリジン及び／または７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
  11. 配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換され、さらに、１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸に置換、及び／または７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはメチオニンに置換されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
  12. 請求項１から１１のいずれか１項に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子。
  13. 請求項１から１１のいずれか１項に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子を発現してＴ７ＲＮＡポリメラーゼを生産することのできる細胞。
  14. 請求項１から１１のいずれか１項に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子を発現させることによるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの生産方法。
  15. 請求項１から１１のいずれか１項に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体を用いてＲＮＡを製造する方法。
  16. 請求項１から１１のいずれか１項に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体を用いてＲＮＡを増幅する方法。
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