WO2008059777A1 - Glucose déshydrogénase dépendante du flavine-adénine dinucléotide modifiée - Google Patents

Glucose déshydrogénase dépendante du flavine-adénine dinucléotide modifiée Download PDF

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WO2008059777A1
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paogdh
fadgdh
modified
amino acid
seq
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PCT/JP2007/071882
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Inventor
Hiroshi Kawaminami
Yuji Tsuji
Masao Kitabayashi
Yoshiaki Nishiya
Original Assignee
Toyo Boseki Kabushiki Kaisha
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)

Definitions

  • the present invention relates to a modified glucose dehydrogenase (GDH) having improved thermostability, a modified FADGDH-dependent glucose dehydrogenase (FADGDH) having flavin adenine dinucleotide (FAD) as a coenzyme, and production thereof
  • GDH glucose dehydrogenase
  • FADGDH FADGDH-dependent glucose dehydrogenase
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • Blood glucose self-measurement is important for diabetics to grasp their normal blood glucose level and use it for treatment.
  • an enzyme using glucose as a substrate is used for sensors used for blood glucose self-measurement.
  • An example of such an enzyme is glucose oxidase (EC 1. 1. 3. 4).
  • Glucose oxidase has been used as an enzyme for blood glucose sensors for a long time because of its high specificity to glucose and excellent heat stability. Dates back about 40 years ago.
  • glucose oxidase the force that can be measured by passing the electrons generated in the process of oxidizing glucose and converting it into D dalcono ⁇ rataton through the mediator to the electrode S, glucose oxidase is a reaction.
  • dissolved oxygen would affect the measured value because the generated protons were easily passed to oxygen.
  • NAD (P) -dependent glucose dehydrogenase in this document, NAD (P) -dependent glucose dehydrogenase is also referred to as NADGDH
  • NADGDH NAD (P) -dependent glucose dehydrogenase
  • PQQGDH Also described as PQQGDH. ) Is maltose that has poor substrate specificity. There is a drawback in that the accuracy of the measured value is impaired because it acts on sugars other than glucose.
  • Patent Document 1 discloses a flavin-binding glucose dehydrogenase derived from the genus Aspergillus (herein, flavin-binding glucose dehydrogenase is also referred to as FADGDH). Since this enzyme has an action on xylose of about 10% of the action on glucose, it may impair the accuracy of the measured value when blood glucose is measured in a person undergoing a xylose tolerance test. With regard to thermal stability, the activity remaining rate is about 89% after treatment at 50 ° C for 15 minutes, and it is said that the stability is excellent! Patent Document 2 reports the gene sequence and amino acid sequence thereof.
  • Patent Document 1 WO2004 / 058958
  • Patent Document 2 WO2006 / Dish 239
  • An object of the present invention is to provide an enzyme that can be used as a blood glucose level measurement reagent that is more practically advantageous than the above-mentioned known enzymes for blood glucose sensors.
  • Patent Document 2 discloses that a flavin-binding glucose dehydrogenase was obtained by liquid culture or wheat bran culture of Aspergillus terreus, and that a flavin-binding glucose dehydrogenase derived from Aspergillus terreus was obtained. It describes that the enzymes obtained by expressing the encoded genes in recombinant Escherichia coli, recombinant mold (Aspergillus oryzae) and recombinant yeast (genus Candida) were purified!
  • Patent Document 2 discloses several examples of property tests of these enzymes and comparison of characteristics when applied to sensors.
  • Patent Document 2 may not satisfy the requirement because the description is not sufficient in terms of industrial requirement.
  • Another object of the present invention is to provide an enzyme that can be used as a blood glucose level measuring reagent that is more practically advantageous by reducing the activity of xylose by appropriately modifying the amino acid sequence of FADGDH derived from Aspergillus oryzae strain. Repeated examination.
  • the aFADG DH obtained from the Aspergillus oryzae by the inventors according to the method described below is a FADGDH obtained by expressing it in E. coli, which maintained about 77% activity at a treatment of 50 ° C for 15 minutes.
  • the thermal stability of the recombinant (raFADGDH) was about 13% after treatment at 50 ° C for 15 minutes.
  • the thermal stability of Aspergillus terreus FADGDH recombinant (rtFADGDH) was about 28% after treatment at 50 ° C for 15 minutes.
  • Item 2 The modified FADGDH according to Item 1, which is derived from a eukaryote.
  • Item 2 FADGDH according to Item 1, which is derived from a filamentous fungus.
  • Item 2 The FADGDH of Item 1, which is derived from an Aspergillus genus.
  • Item 5 The modified FADGDH according to Items 1 to 4, which has improved thermal stability as compared to wild-type flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase (FADG DH).
  • FDG DH flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase
  • Item 5 The modified FADGDH according to any one of Items 1 to 4, wherein the activity remaining rate after heat treatment at 50 ° C. for 15 minutes is 20% or more in a liquid state.
  • Item 5 The modified FADGDH according to any one of Items 1 to 4, wherein the residual activity rate after heat treatment at 50 ° C for 15 minutes is 35% or more in a liquid state.
  • Item 5 The modified FADGDH according to Items 1 to 4, wherein the activity remaining rate after heat treatment at 50 ° C. for 15 minutes is 40% or more in liquid form.
  • Item 5 The modified FADGDH according to Items 1 to 4, wherein the activity remaining rate after heat treatment at 50 ° C for 15 minutes is 70% or more.
  • Item 5 The modified FADGDH according to Items 1 to 4, wherein the activity remaining rate after heat treatment at 50 ° C for 15 minutes is 80% or more.
  • FADGD having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 46 in the sequence listing B female variant FADGDH having a primary structure in which at least one amino acid is substituted, deleted, inserted or added in H.
  • At least I amino acid substitution power K120E, G160E, G160 I, G160P, G160S, G160Q, S162A, S162C, S162D, S162E, S162F, S1 62H, S162L, S162P, G163D, G163K, G163L, G163R, S164F, S164T, S164Y, L165A, L165I, L165N, L165P, L165V, A166C, A166I, A166K, A166L, A166M, A166P, A166S, 167A, S167P, S167R, S167V, N169 K, Y169P, N169 K, Y169P , N169W, L170C, L170F, S171I, S171K, S171M, SI 71Q, S171V, V172A, V172C, V172E, V172I, V172M, V172S, V172W,
  • Item 15 The modified FADGDH according to Item 1 to 14, wherein the pH stability is improved by modification.
  • Item 16 The modified FAD-GDH according to Item 1-15, wherein the residual activity after treatment at 25 ° C for 16 hours at pH 4.5 to pH 6.5 is 80% or more.
  • Item 16 The modified FAD-GDH according to Items 1 to 15, wherein the residual activity after treatment at 25 ° C for 16 hours at pH 4.5 to pH 6.5 is 90% or more.
  • a variant with improved pH stability having an amino acid substitution at position 163, position 167, position 551, force, at least one position in the group consisting of SEQ ID NO: 2, or a position equivalent to the above in another species FADGDH.
  • amino acid substitution is S167P, V551C, (G163 A modified FADGDH having an amino acid substitution at a position of K + V551C), (G163R + V551C) or at a position similar to the above in another species, and having improved pH stability.
  • a vector comprising the gene according to claim 19.
  • a transformant transformed with the vector according to claim 20 is A transformant transformed with the vector according to claim 20.
  • a glucose assembly kit comprising the modified FADGDH according to any one of claims 1 to 18.
  • a glucose sensor comprising the modified FADGDH according to any one of claims 1 to 18.
  • a glucose measurement method comprising the modified FADGDH according to claim 1.
  • Item 27 The modified FADGDH of Item 26, wherein the activity on xylose is 5.0% or less of the activity on glucose.
  • Item 26 The amino acid substitution according to Item 26, which has an amino acid substitution at any force in the group consisting of G53H, G53N, G53K, G53M, G53M, G53V, and G53C, or a position equivalent thereto in IJ No. 2. Modified FADGDH.
  • Item 27 The modified FADGDH of Item 26, which has an amino acid substitution at one or more positions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 at one or more positions in the group consisting of positions 163, 167, and 551, or an equivalent position.
  • Item 32 A gene encoding the modified FADGDH according to any one of Items 26 to 30, a vector containing the gene, a transformant transformed with the vector, and the transformation
  • Item 31 A glucose assembly kit comprising the modified FADGDH of any one of Items 26 to 30.
  • a glucose measurement method comprising the modified FADGDH of any one of Items 26 to 30.
  • the modified FADGDH according to Item 26 is less effective against pentose than the wild-type flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase (FADGDH).
  • An example of the pentose is xylose.
  • the modified FADGDH according to Item 26 has an action on xylose of 5.0% or less of the action on glucose as compared with the wild-type FADGDH.
  • the action on xylose means the relative ratio% (with glucose as 1) of the reaction rate when glucose is used as a substrate and when xylose is used as a substrate.
  • the modified FADGDH of Item 26 preferably has improved thermal stability as compared to wild-type flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase (FADGDH).
  • FDGDH flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase
  • the modified FADGDH according to Item 26 preferably has improved pH stability over the wild-type flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase (FADGDH).
  • the modified FADGDH according to Item 26 is a force that has a residual activity of 80% or more after treatment at 25 ° C. for 16 hours at pH 4.5 to 7.0, or at pH 4.5 to pH 6.5.
  • the residual activity after treatment at 25 ° C. for 16 hours is 80% or more, preferably 90% or more.
  • a modified FADGDH with improved thermal stability over wild-type flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase (FADG DH), preferably from a eukaryote, more preferably from a filamentous fungus, more preferably from the genus Aspergillus FADGD H derived from fungi.
  • FADGDH has an activity remaining rate of 20% or more after heat treatment at 50 ° C. for 15 minutes, preferably 40% or more, more preferably 80% or more. Is preferred.
  • FADGDH having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 at least one amino acid is a modified FADGDH having a primary structure in which substitution, deletion, insertion or addition is performed. 120, 160, 162, 163, 164, 165, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 180, 329, 331, 369, 471
  • a modified FADGD IV with improved thermal stability having amino acid substitutions at position 1 and position 551, force, at least one position in the group consisting of, or equivalent positions in other species.
  • a modified FADGDH having an amino acid substitution at at least one of positions 162, 163, 167 and 551 can be exemplified as a more preferable example.
  • FADGDH flavin adenine dinucleotide-dependent darcos dehydrogenase
  • FAD GDH having an amino acid substitution at an equivalent position and improved thermal stability.
  • the modified FADGDH described in the preceding paragraph which has an equivalent amino acid substitution at any position in the group consisting of the force, or an equivalent position.
  • modified FADGD H having an amino acid substitution at one or more or equivalent positions in the group.
  • FADGDH flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase
  • the FADGDH of any of paragraphs 34 to 41, wherein the residual activity after treatment at 25 ° C for 16 hours at pH 4.5 to pH 6.5 is 80% or more, preferably 90% or more.
  • a variant with improved pH stability having an amino acid substitution at position 163, position 167, position 551, force, at least one position in the group consisting of SEQ ID NO: 2, or a position equivalent to the above in another species FADGDH.
  • At least the amino acid substitution has any one of S167P, V551C, (G163K + V551C), (G163R + V551C), or an amino acid substitution at a position in the same arrangement as described above in other species Modified FADG DH with improved pH stability.
  • Item 45 A glucose assembly kit or glucose sensor comprising the modified FADGDH according to any one of Items 34 to 44.
  • Item 45 A glucose measurement method comprising the modified FADGDH according to any one of Items 34 to 44.
  • the modified FADGDH of the present invention in particular, G163K, G163L, G163R, S167P, V551A, V551C, V551Q, V551S, V551Y, (G160I + S167P), (S162F + S167P), (S167P + N169Y), (S 167P + L171I), (S167P + L171K), (S167 P + L171V), (S167P + V172I), (S167P + V172W), (G163K + V551C) (G163K + V551C) (G163R + V551C) Contributes to improved thermal stability
  • K120E means that K (Lys) at position 120 is substituted with E (Glu).
  • (G160E + S167P) is a substitution of G at position 160 with E and S at position 167
  • the heat-dryable level is a state where the residual activity after treatment at 50 ° C for 15 minutes is 20% or more, preferably 40% or more, and more preferably 60% or more of the remaining activity is present.
  • the improved stability of FADGDH according to the present invention can reduce the heat inactivation of the enzyme during preparation of a glucose measurement reagent, glucose assay kit and glucose sensor, thereby reducing the amount of the enzyme used and improving the measurement accuracy.
  • FIG. 1 pH stability of Asperisolise-derived WT (wild type), modified FADGDH purified preparation. pH3.5-6.3: complicatNoffer, pH6.3-3—7.3, PIPES Knife, pH7.3-3.8.8: Tris HCl buffer, ⁇ 6 ⁇ 0-7 / 7: Phosphate buffer BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the present invention includes a modified FADGDH with improved thermal stability compared to recombinant FADGDH
  • the FADGDH derived from wild-type Aspergillus olise represented by SEQ ID NO: 2 was obtained by the following method.
  • the present inventors estimated and obtained the glucose dehydrogenase gene derived from Aspergillus oryzae using the database of National Center for Biotechnology Information (hereinafter referred to as NCBI), and used the gene to produce Aspergillus oryzae from Escherichia coli. It has been found that glucose dehydrogenase derived from can be obtained.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • lilacinoechinulatum NBRC6231 was obtained by PCR, and the base sequence was determined (1356 bp). Finally, the Aspergillus oryzae GDH gene was estimated and obtained based on this nucleotide sequence. The outline is shown in ⁇ Experiment 1> and ⁇ Experiment 2> below.
  • AOGDH Glucose dehydrogenase derived from Aspergillus oryzae
  • the L dry strain of Aspergillus oryzae TI strain was inoculated on potato dextrose agar (Difco) and incubated at 25 ° C. The mycelium on the restored plate was collected with agar and suspended in filter sterilized water. Production medium (1% malt extract, 1.5% soy peptide, 0.1% MgSO ⁇ 7 hydrate in two 10L jar fermenters
  • the supernatant fraction containing GDH was collected by a centrifuge, and then adsorbed on an Octyl-Sepharose column, and the ammonium sulfate saturation level was recovered.
  • the fraction with GDH activity was recovered by elution with a gradient of 60% to 0%.
  • the obtained GDH solution was desalted using a G-25- Sepharose column, and 60% saturated ammonium sulfate was dissolved in P, and this was adsorbed on the Phenyl- Sepharose column. Gradient elution was performed at a saturation degree of 60% to 0%, and a fraction having GDH activity was recovered. This was further heated at 50 ° C. for 45 minutes, and then centrifuged to obtain a supernatant.
  • the solution obtained through the above steps was used as a purified GDH preparation (AOG DH).
  • AOG DH purified GDH preparation
  • 20 mM potassium phosphate buffer is used as a buffer.
  • Impulse liquid pH 6.5 was used.
  • purification was attempted by various means such as ion exchange chromatography and gel filtration chromatography, but a purified sample with high purity that can be used for partial amino acid sequencing was obtained. I could't.
  • Penicillium lilacinoechinulatum NB RC6231 as a GDH-producing bacterium derived from Penicillium filamentous fungi, culturing and purifying according to the same procedure as the above Aspergillus oryzae TI strain, an almost uniform purified sample by SDS electrophoresis I got it.
  • RNA was purified using Origotex-dt30 (Daiichi Chemicals Co., Ltd.), and RT-PCR was performed using ReverTra-Plus-TM (Toyobo Co., Ltd.) using this as a template. .
  • the obtained product was subjected to agarose electrophoresis, and a portion corresponding to a chain length of 0.5 to 4. Okb was cut out.
  • MagExtractor—PCR & Gel Clean Up— manufactured by Toyobo was used to extract and purify cDNA to obtain a cDNA sample.
  • the NBRC6231-derived GDH purified above is dissolved in Tris—HCl buffer ( ⁇ 6 ⁇ 8) containing 0.1% SDS and 10% glycerol, and Glu-specific V8 endoprotease is then added to a final concentration of 10 g / ml.
  • the partial digestion was carried out by adding to the mixture and incubating at 37 ° C for 16 hours. This sample was electrophoresed on a gel with an acrylamide concentration of 16% to separate the peptides. Peptide molecules present in this gel were transferred to a PVDF membrane by a semi-dry method using a plotting buffer (1 • 4% glycine, 0.3% Tris, 20% ethanol).
  • the peptide transcribed onto the PVDF membrane is a CBB staining kit (Pierce GelCode
  • the internal amino acid sequence was analyzed using a peptide sequencer.
  • the amino acid sequences IJ obtained were IGGVVDTSLKVYGT (SEQ ID NO: 37) and WGGGTKQ TVRAGKALGGTST (SEQ ID NO: 38). Based on this sequence, a degenerate primer containing a mixed base was prepared, and PCR was performed using NBRC6231-derived cDNA as a template. An amplified product was obtained and confirmed by agarose gel electrophoresis. Met. This band was cut out, extracted and purified using Toyobo's MagEx tractor—PCR & Gel Clean Up—.
  • the purified DNA fragment was subjected to TA cloning with T Arget Clone—Plus— (Toyobo Co., Ltd.), and Escherichia coli JM109 competent cell (Toyobo Co., Ltd.) was transformed with the obtained vector by heat shock. From the transformed clones, colonies that were confirmed to be inserted by blue-white determination were miniprep-extracted using MagExtractor-Plasmid-(manufactured by Toyobo Co., Ltd.), purified, and inserted using plasmid sequence-specific primers. The nucleotide sequence was determined (13 56bp) 0
  • a homologous search was performed using the NCBI BLASTJ website (http: ⁇ www.ncbi.nlm • nih.gov/BLAST/), and the AOGDH gene was estimated.
  • AOGDH estimated by the search The homology at the amino acid level between GDH and the GDH partial sequence derived from P. lilacinoechinulatum NBRC6231 was 49%.
  • mRNA was prepared from Aspergillus oryzae strain TI and cDNA was synthesized. Two types of oligo DNAs shown in SEQ ID NOs: 39 and 40 were synthesized, and the AOGDH gene was amplified using KOD Plus DNA polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) using the prepared cDNA as a template. The DNA fragment was treated with restriction enzymes Ndel and BamHI, and pBluescript (introducing the Ndel site in the form of aligning the atg of the Ndel recognition sequence with the translation start codon atg of LacZ) Ndel— A recombinant plasmid was constructed.
  • Escherichia coli DH5a (Toyobo) Made).
  • a plasmid was extracted from the transformant according to a conventional method, and the base sequence of the AOGDH gene was determined (SEQ ID NO: 41).
  • SEQ ID NO: 41 the base sequence of the AOGDH gene was determined.
  • the database predicted GDH is 588 amino acids, suggesting that the number of amino acid residues is different from TI strain GDH.
  • the sequence was confirmed using TI strain genomic DNA, and the region adjacent to the gene was also confirmed using the RACE method.
  • a recombinant plasmid having a DNA sequence based on the database was constructed using PCR, and transformants were obtained in the same manner. These transformants were cultured with shaking at 30 ° C. for 16 hours in 200 ml of a liquid medium (Terrific broth) containing 100 g / ml ampicillin. When the GDH activity of the cell disruption liquid was confirmed, it was impossible to confirm the GDH activity in the transformant having the GDH sequence estimated from the database. 8.0 U GDH activity was obtained per ml of culture. The GDH activity of the culture supernatant of Aspergillus oryzae TI strain carried out in Example 1 was 0.2 U / ml.
  • AOGDH Aspergillus oryzae-derived glucose dehydrogenase
  • FAD- GDH after cleavage of the signal peptide is mFAD- GDH
  • M is added to the N-terminus of mFAD- GDH, and the N-terminus of mFAD- GDH becomes one amino acid-extended form! /, S2 Expressed.
  • S2 PCR was performed in combination with the primer of SEQ ID NO: 44 using the oligonucleotide of SEQ ID NO: 43 as an N-terminal primer, and a DNA sequence (SEQ ID NO: 1) encoding S2 was obtained in the same procedure. A recombinant plasmid was constructed, and a transformant was obtained in the same manner.
  • This transformant was subjected to liquid culture in TB medium for 1 to 2 days using a 10 L-jar mentorer. After collecting the cells in each culture phase, ultrasonic disruption was performed to confirm GDH activity. By deleting the amino acid sequence that appears to be a signal peptide, Productivity increased.
  • FADGDH derived from wild-type Aspergillus terreus represented by SEQ ID NO: 46 was obtained by the following method.
  • Aspergillus' Tereus NBRC33026 (purchased from National Institute of Technology and Evaluation) L dry specimens were inoculated into potato dextrose agar (Difco) and incubated at 25 ° C for restoration. Prepare 50 ml of 1 ⁇ 5% soybean peptide, 2% glucose, 1% malto extract ⁇ 6.5 in a 500 ml Sakaguchi flask, collect the mycelium on the restored plate together with the agar, and inoculate it at 30 ° C, After 24 hours of shaking culture, the cells were collected. The obtained microbial cells were immediately frozen in liquid nitrogen and pulverized using a Toyobo cool mill.
  • GDH genes derived from Aspergillus oryzae, Penicillium lilacinoechinulatum, and Penicillium italic um were successfully cloned GDH genes derived from Aspergillus oryzae, Penicillium lilacinoechinulatum, and Penicillium italic um, and obtained their base sequence information.
  • the deduced amino acid sequences of the above three types of GDH were aligned, and a dig- enerate primer was prepared based on the sequence of the highly homologous region.
  • PCR was performed using the genomic DNA prepared in ⁇ Experimental Example 4> as a template, amplification products were observed. The amplified product was subcloned and the nucleotide sequence was determined.
  • the coenzyme-linked glucose dehydrogenase derived from Aspergillus * Teleus FERM BP-08578 shown in Patent Document 1 has a very high homology of about 98.5% in terms of amino acid level, and is essentially “Homology” refers to the technical field Optimal alignment when two amino acid sequences are aligned using a known mathematical algorithm in (preferably the algorithm considers the introduction of gaps in one or both of the sequences for optimal alignment). The ratio of the same amino acid residue to all amino acids that overlap with each other. Examples of such an algorithm include, but are not limited to, those described in Non-Patent Documents 1 to 4.
  • Non-Patent Document 1 Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) Vol. 90 p5873-5877
  • Non-Patent Document 2 Needleman et al., J. Mol. Biol. (1970) Vol. 48 p444- 453
  • Non-Patent Document 3 Myers and Miller, CABIOS Vol.4 pi 1-17
  • Non-Patent Document 4 Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) Vol. 85 p2444- 2448
  • peptide peptide prediction was performed using SignalP 3.0 Server. Based on this result, PCR primers were prepared so that sequence amplification with the addition of the start codon (ATG) was amplified (25 codons were deleted) and the N-terminal sequence 25 codons were deleted. 47, 48). Using these primers, gene amplification was performed with KOD Plus DNA polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) using NBRC33026 cDNA as a template.
  • the amplified fragment is treated with the restriction enzymes Ndel and BamHI, and inserted between the Ndel-BamHI sites of pBluescript (the Ndel site is introduced in combination with the ATG of the Ndel recognition sequence in accordance with the translation initiation codon ATG of LacZ)
  • a recombinant plasmid was constructed (pAtGDH-s2-7).
  • Escherichia coli DH5a manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • the transformant was cultured with shaking at 30 ° C.
  • the modified FADGDH of the present invention is obtained by performing amino acid substitution at any force and position shown above in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 46.
  • the "position equivalent to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2" means that the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is homologous to SEQ ID NO: 2 (preferably 60% or more, more preferably 80% or more, more preferably When aligned with another GDH having an amino acid sequence having 90% or more), it means the same position in the alignment.
  • the present invention with improved substrate specificity and / or thermal stability is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in at least one of positions 53, 163, 167, 551 and 551.
  • Examples thereof include modified FADGDH having an amino acid substitution.
  • G53H means that G (Gly) at position 53 is substituted with (His).
  • amino acid substitution of G53H, G53N, G53K, G53M, G53T, G53V, G53C contributes to the improvement of substrate specificity of modified FADGDH
  • amino acid substitution of G53H + S167P, G53N + S167 P, G53N + G163R + V551C Contributes to improved substrate specificity and / or stability of modified FADGDH.
  • the present invention with improved thermal stability comprises the following: 120, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 169
  • Examples include modified FADGDH having an amino acid substitution at at least one of positions 170, 171, 172, 180, 329, 331, 369, 471 and 551.
  • modified FADGDH having an amino acid substitution at at least one of positions 162, 163, 167, 551 and 551.
  • amino acid substitution is K120E, G160E, G160I, G160P, G160S, G160Q, S162A, S162C, S162D, S162E, S162F, S162H, S162L, S162P, G163D, G163K, G163L, G163R, S164F, S164T, S16 4Y, L165A, L165I, L165N, L165P, L165V, A166C, A166I, A166K, Al 66L, A166M, A166P, A166S, 167A, S167P, S167R, S167V, N169K, N169P, N169Y, N169W, L170C, L170F, S171I, S171K, S 171M, S171 Q, S 171V, V172A, V172C, V172E, V172I, V172M, V
  • K120E means that K (Lys) at position 120 is replaced with E (Glu).
  • the amino acid substitution of (S 167P + L171K), (S 167P + L171V), (S 167P + V172I), (S 167P + V172W), (G163K + V551C) (G163R + V551C) is the thermal stability of the modified FADGDH It contributes to the improvement.
  • the amino acid substitution is K116D, K116G, K116L, K116F, K116Q, Q159A, Q159K, Q159N, Q159P, Q159V, Ql 59L, E dish C, N164Y, N164V, N164C, T166F , T166Y, T166W, T167L, T167V, T167S, G175K, S325A, S325G, S325K, S325Q, S325R, S32 5T, S325V, S325Y, S327E, Q365R, V547S, V547C, V547A, V547Q force
  • the type FADGDH is exemplified.
  • K116D means that K (Lys) at position 116 is replaced with D (Asp).
  • Process for producing modified FADGDH modified from FADGDH derived from wild-type Aspergillus oryzae represented by SEQ ID NO: 2 or modification modified from FADGDH derived from wild-type Aspergillus tereus represented by SEQ ID NO: 46 The production method of type FADGDH is not particularly limited, but can be produced by the following procedure.
  • a method for modifying the amino acid sequence constituting FADGDH a commonly used method for modifying genetic information is used. That is, a DNA having genetic information of a modified protein is created by converting a specific base of DNA having the genetic information of the protein, or by inserting or deleting a specific base.
  • a specific method for converting a base sequence in DNA for example, a commercially available kit (Transformer Mutagenesis Kit; Clonetech, EXOI II / Mung Bean Deletion Kit (Stratagene, Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit; Stratagene, etc.) or polymerase chain reaction (PCR).
  • a commercially available kit Transformer Mutagenesis Kit; Clonetech, EXOI II / Mung Bean Deletion Kit (Stratagene, Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit; Stratagene, etc.) or polymerase chain reaction (PCR).
  • the prepared DNA having the genetic information of the modified FADGDH is transferred to a host microorganism in a state of being linked to a plasmid, and becomes a transformant that produces the modified FADGDH.
  • a host microorganism for example, Escherichia coli JM109, Escherichia coli D D5, Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600 and the like can be used.
  • a method for transferring the recombinant vector into the host microorganism for example, when the host microorganism is a microorganism belonging to Escherichia coli, a method of transferring recombinant DNA in the presence of calcium ions can be employed.
  • the elect mouth position method may be used.
  • a commercially available combi- tive cell for example, combitent high JM109; manufactured by Toyobo
  • combitent high JM109 manufactured by Toyobo
  • the thus obtained transformant microorganism can be stably produced with a large amount of modified FADGDH by being cultured in a nutrient medium.
  • the culture form of the host microorganism which is a transformant, should be selected in consideration of the nutritional physiological properties of the host. In most cases, liquid culture is used. Is advantageous.
  • As a nutrient source for the medium those commonly used for culturing microorganisms are widely used. Any carbon compound that can be assimilated can be used as the carbon source. For example, glucose, sucrose, ratatoose, maltose, molasses, pyruvic acid and the like are used.
  • Nitrogen can be reduced by using any available nitrogen compound, for example, peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzed monster, soybean cake alkaline decomposition product, and the like.
  • phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, zinc and other salts, specific amino acids, and specific vitamins are used as necessary.
  • the temperature of the medium can be changed as appropriate within the range in which the bacteria grow and produce modified FA DGDH, but in the case of Escherichia coli, it is preferably about 20 to 42 ° C.
  • the culture temperature varies slightly depending on the conditions. It is usually about 6 to 48 hours if the culture is terminated at an appropriate time in consideration of the time when the modified FADGDH reaches the maximum yield.
  • the pH of the medium can be appropriately changed as long as the bacteria grow and produce the modified protein, but is particularly preferably about pH 6.0 to 9.0.
  • the modified FADGDH is present in the culture solution, filtration, It is used after separating the modified protein-containing solution and the microbial cells by centrifugation or the like.
  • the modified protein is present in the microbial cells, the microbial cells are collected from the obtained culture by a technique such as filtration or centrifugation, and the microbial cells are then subjected to mechanical methods or enzymatic methods such as lysozyme. Destroy, and if necessary, add a chelating agent such as EDTA and / or a surfactant to solubilize the modified FADGDH and separate and collect it as an aqueous solution.
  • a chelating agent such as EDTA and / or a surfactant
  • the modified FADGDH-containing solution thus obtained is subjected to, for example, concentration under reduced pressure, membrane concentration, salting-out treatment with ammonium sulfate, sodium sulfate or the like, or a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, acetone. It may be precipitated by a fractional precipitation method. Further, heating processing and east power point processing are also effective generation means.
  • Purified modified FADGDH can be obtained by gel filtration with an adsorbent or gel filter, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • the invention also features a glucose assembly kit comprising a modified FADGDH according to the invention.
  • the glucose assay kit of the present invention contains a modified FADGDH according to the present invention in an amount sufficient for at least one assay.
  • the kit includes the modified FADG DH of the present invention, plus the buffers required for assembly, mediators, glucose standard solutions for creating calibration curves, and directions for use.
  • the modified FADGDH according to the present invention can be provided in various forms, for example as a lyophilized reagent or as a solution in a suitable storage solution.
  • the invention also features a glucose sensor that uses a modified FADGDH according to the invention.
  • a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode or the like is used, and the enzyme of the present invention is immobilized on this electrode.
  • Immobilization methods include a method using a crosslinking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a photocrosslinkable polymer, a conductive property
  • polymers, redox polymers, and the like or they may be fixed in the polymer or adsorbed and fixed on the electrode together with an electron mediator represented by fuescene or a derivative thereof, or a combination thereof.
  • the modified FADGDH of the present invention is immobilized on a carbon electrode using dartalaldehyde and then has an amine group.
  • Glucose concentration can be measured as follows. Put the buffer in the thermostatic cell and keep it at a constant temperature. Examples of mediators that can be used include potassium ferricyanide and phenazine methosulfate. An electrode on which the modified FAD GDH of the present invention is immobilized is used as a working electrode, and a counter electrode (for example, a platinum electrode) and a reference electrode (for example, an Ag / AgCl electrode) are used. After a constant voltage is applied to the carbon electrode and the current becomes steady, a sample containing glucose is added and the increase in current is measured. Calculate the glucose concentration in the sample according to the calibration curve prepared with a standard concentration of Darcos solution.
  • mediators include potassium ferricyanide and phenazine methosulfate.
  • An electrode on which the modified FAD GDH of the present invention is immobilized is used as a working electrode, and a counter electrode (for example, a platinum electrode) and a reference electrode (for example, an Ag / Ag
  • the activity of FAD-dependent GDH is measured under the following conditions.
  • 3.0 is the volume of the reaction reagent + enzyme solution (ml) 16.3 is the millimolar molecular extinction coefficient (cm 2 / micromol) of this activity measurement condition, 0 ⁇ 1 is the volume of the enzyme solution (ml) 1.0 indicates the optical path length (cm) of the cell.
  • Example 1 Construction using Glucose ⁇ “FADGDH fever 3 ⁇ 4 ⁇
  • the examination was performed in accordance with the method for measuring FADGDH activity in the test example described above.
  • Aspergillus oryzae or Aspergillus terreus-derived modified FADGDH was dissolved in an enzyme diluent (50 mM potassium phosphate buffer ( ⁇ 5 ⁇ 5), 0.1% TritonX-100) to a concentration of about 2 U / ml. I prepared 50ml of stuff. Two pieces of this enzyme solution with 1.0 ml were prepared. For the control, two modified FADGDH (with 0.1 ml of distilled water added in place of various compounds) were prepared.
  • Example 2 Mutation introduction into FADGDH gene derived from Aspergillus oryzae
  • the modified F which has the ability to produce glucose dehydrogenase, is subjected to mutation treatment using Diversify TM PCR Ramdom Mutagenesis Kit (manufactured by Clontech) using the plasmid as a saddle type according to the protocol.
  • An ADGDH mutant plasmid was prepared, and a plasmid was similarly prepared by the above method.
  • Example 3 Preparation of crude enzyme solution containing modified FADGDH derived from Aspergillus oryzae
  • the transformant was agar medium containing ampicillin (1% polypetone, 0.5%).
  • Bacteria obtained by centrifugation were collected from a part of the culture solution, and a crude enzyme solution was prepared by crushing the cells with glass beads in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0). .
  • Example 4 Screening of II body with improved heat stability
  • glucose dehydrogenase activity was measured by the activity measurement method described above.
  • the crude enzyme solution was heat-treated at 50 ° C. for 15 minutes, and then glucose dehydrogenase activity was measured to obtain three variants with improved thermostability. Plasmids encoding these three variants were named pAOGDH-Ml, pAOGDH_M2, pAOGDH-M3, and pAOGDH-M4.
  • the 162nd serine described in SEQ ID NO: 2 is proline
  • the 167th serine is proline
  • the 471st lysine is arginine
  • the 180th alanine is glycine and the 551th valine is In alanine and pAOGDH-M4
  • the 120th lysine was substituted with glutamic acid
  • the 167th serine with proline and the 369th lysine with arginine.
  • Table 1 The results are shown in Table 1.
  • a synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 3 designed to replace the 160th glycine with multiple types of amino acids using the pAOGDH-S2 plasmid as a saddle type, and a synthetic oligonucleotide complementary thereto, and the 161st tributophane
  • a synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 designed to substitute for an amino acid and a synthetic oligonucleotide complementary thereto, and complementary to a synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 5 designed to substitute the 162nd serine for multiple types of amino acids
  • Synthetic oligonucleotide designed to replace the 163rd glycine with multiple amino acids and the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 6 and its complementary synthetic oligonucleotide, the 164th serine to be replaced with multiple amino acids Designed synthetic oligonucleotide with sequence number 7 and its complementary Synthetic
  • glucose dehydrogenase activity was measured by the activity measuring method described above.
  • the crude enzyme solution was heat-treated at 50 ° C. for 15 minutes, and then glucose dehydrogenase activity was measured to obtain 16 variants with improved thermostability.
  • Plasmids encoding these 16 variants are pAOGDH-M4, pAOGDH_M5, pAOGDH-M6, pAOGDH-M7, pAOGDH-M8, pAOGDH-M9, pAOGDH-M10, pAOGDH-Mil, pAOGDH-M12, pAOGDH- They were named as M13, pAOGDH-M14, pAOGDH-M15, pAOGDH-M16, pAOGDH-M17, pAOGDH_M18, pAOGDH-M19.
  • pAOGDH-M4 pAOGDH-M5, pAOGDH-M6, pAOGDH-M7, pAOGDH-M8, pA OGDH-M9, pAOGDH-M10, pAOGDH-Ml l, pAOGDH-M12, pAOGDH-M13, pA OGDH-M14, A gene that encodes glucose dehydrogenase in DNA sequencer (ABI PRISMTM 3700 DNA Analyzer; manufactured by Perkin-Elmer) to identify mutation sites in pAOGDH-M15, pAOGDH-M16, pAOGDH-M17, pAOGDH-M18, pAOGDH-M19
  • the 160th glycine described in SEQ ID NO: 2 is proline in pAOGDH-M5, the 163rd glycine is lysine in pAOGDH_M6, the 163rd glycine is
  • Arginine, pAOG DH-M9, 167th serine is alanine
  • pAOGDH-M10, 167th serine is proline
  • pAOGDH-Mil 167th serine is arginine
  • pAOGDH-M12, 167th Serine of the eye is valine
  • pAOGDH_M13 is 171 serine is proline
  • pAOGDH-M14 is 551 valine is alanine
  • pAOGDH_M15 is 551 valine is cysteine
  • pAOGDH-M16 is 551 valine is threonine
  • pAOGDH-M17 It was confirmed that 551th valine was replaced with gnoretamine, pAOGDH-M18 was replaced with 551th valine with serine, and pAOGDH_M19 was replaced with 551th palin with tyrosine. The results are shown in Table 2.
  • a synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 20 designed to replace the 160th glycine with multiple amino acids using the pAOGDH- ⁇ plasmid as a saddle type, and a synthetic oligonucleotide complementary to it, and a plurality of 161st tributophanes
  • the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 21 designed to be substituted with the amino acid of SEQ ID NO: 21 and its complementary synthetic oligonucleotide
  • the complementary synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 22 designed to substitute the 162nd serine with multiple types of amino acids
  • Synthetic oligonucleotide designed to replace the 163rd glycine with multiple amino acids, the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 23 and its complementary synthetic oligonucleotide, the 164th serine with multiple amino acids Shi
  • synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 30 designed to replace the 171st serine with several kinds of amino acids and a synthetic oligonucleotide complementary thereto
  • 172nd Synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 31 designed to replace palin with multiple amino acids and synthetic oligonucleotide complementary thereto
  • synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 32 designed to replace 329th valine with multiple amino acids
  • synthetic oligonucleotide complementary to it the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 33 designed to replace the 330th leucine with multiple amino acids, the complementary synthetic oligonucleotide, and the 331st alanine.
  • SEQ ID NO: 34 designed to replace amino acids
  • the QuickChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (manufactured by STRATAGENE) is based on the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 35, which is designed to replace the 551th valine with multiple types of amino acids and its complementary oligonucleotide.
  • the modified FADGDH mutant plasmid having the ability to produce glucose dehydrogenase was prepared according to the protocol, and the plasmid was prepared in the same manner as described above.
  • glucose dehydrogenase activity was measured by the activity measurement method described above.
  • the crude enzyme solution was heat-treated at 50 ° C. for 15 minutes, and then glucose dehydrogenase activity was measured to obtain 57 variants with improved thermostability.
  • Plasmids encoding these 57 variants were designated as pAOGDH-M20, pAOGDH_M21, pAOGDH-M 22, pAOGDH-M23, pAOGDH-M24, pAOGDH-M25, pAOGDH-M26, pAOGDH-M27, pAOGDH—M28, pAOGDH—M29 , PAOGDH—M30, pAOGDH—M31, pAOGDH-M32, pAOGDH-M33, pAOGDH-M34, pAOGDH-M35, pAOGDH-M36, pAOGD H-M37, pAOGDH—M38, pAOGDH—M39 pAOGDH—M40, pAOGDH—M41, H-M42, pAOGDH-M43, pAOGDH-M44, pAOGDH-M45, pAOGDH-M46, pA
  • the 160th position described in SEQ ID NO: 2 was determined using PAOGDH-M20.
  • Glycine is glutamic acid
  • 167th serine is proline
  • pAOGDH_M21 is 160th glycine is isoleucine
  • 167th serine is proline
  • pAOGDH-M22 is 160th glycine is serine glutamine
  • 167th serine is proline
  • pAOGDH- In M23 the 160th glycine is glutamine and the 167th serine is proline.
  • the 162nd serine is in alanine and the 167th serine is in proline.
  • pAOGD H-M25 the 162nd serine is 167th serine is proline
  • pAOGDH-M 26 is 162th serine to aspartic acid
  • 167th serine is proline
  • pAOGDH-M27 is 162th serine to glutamic acid
  • 167th serine is proline
  • Serine is proline
  • pAOGDH_M31 is 163rd glycine is aspartate
  • 167th serine is proline
  • pAOGDH-M32 is 164th serine is phenylalanine
  • 167th serine is proline
  • 164th pAOGDH-M33 is 164 Serine is threonine
  • 167th serine is proline
  • pAOGDH_M34 is 164th serine is tyrosine and 167th serine is proline
  • the 165th leucine is alanine and the 167th serine is proline
  • pAOGDH_M36 the 165th leucine is isoleucine and the 167th serine is proline
  • pAOGDH_M37 the 165th leucine is the asparagine and the 167th serine Proline
  • pAOGDH-M38 165th leucine is proline
  • 167th serine is proline
  • 167th serine becomes proline and 171st leucine becomes isoleucine.
  • 167th serine becomes proline and 171st leucine becomes lysine.
  • pAOGDH-M55 167th serine becomes proline and 171th leucine force.
  • pAOGDH-M10, pAOGDH-M15, pAOGDH_M75, and pAOGDH-M76 were transformed with commercially available E. coli competent cells (E.coli DH5a; manufactured by TOYOBO). Converted. The obtained transformant was cultured in TB medium at a culture temperature of 25 ° C. for 24 hours using a 10 L jar mentor. The cultured cells were collected by centrifugation, suspended in 50 mM phosphate buffer (pH 6.5), treated with nucleic acid, and centrifuged to obtain a supernatant.
  • a saturated amount of ammonium sulfate was dissolved in this to precipitate the target protein, and the precipitate collected by centrifugation was redissolved in 50 mM phosphate buffer ( ⁇ 6 ⁇ 5). Then, gel filtration using G-25 Sepharose column, hydrophobic chromatography using Octyl-Sepharose column and Phenyl-Sepharose column (both elution conditions are 25% saturation to 0% ammonium sulfate concentration gradient to extract peak fraction) Furthermore, ammonium sulfate was removed by gel filtration using a G-25 Sepharose column to obtain a modified FADGDH sample. As shown in Table 4, it was confirmed that the thermal stability of the purified sample was also improved.
  • a buffer solution in the range of pH 3.5 to 8.5 (pH 3.5 to 6.3: 0.1 M acetate buffer, pH 6.3 to 7 3, 0.1 M PIPES notch, pH 7. 3—8.5: 0. 1 M Tris; ⁇ Noffer, pH 6.0—7. 7: 0. 1 M phosphate buffer) were prepared and used.
  • Each GDH was diluted to an enzyme concentration of lU / ml. Dilutions were incubated for 16 hours at 25 ° C to compare the activity before and after incubation.
  • Fig. 1 shows a graph showing the residual activity after incubation relative to the activity before incubation. As shown in Fig. 1, it was confirmed that the range of pH stability range widened!
  • Example 8 Aspergillus Yasu Tereus Introduction of ⁇ into FADGDH
  • Example 9 Preparation of Crude Enzyme Solution Containing Aspergillus terreus-derived Modified FADGDH
  • the obtained colonies were further taken into an LB liquid medium containing ampicillin (100 g / ml). Cultured with shaking overnight at ° C. Bacteria obtained by centrifugation are collected from a part of the culture solution, and a crude enzyme solution is prepared by crushing the cells with glass beads in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0). did.
  • glucose dehydrogenase activity was measured by the activity measurement method described above.
  • the crude enzyme solution was heat-treated at 50 ° C. for 15 minutes, and then glucose dehydrogenase activity was measured.
  • the substrate specificity for various saccharides was measured according to the above-described activity measurement method, and the enzyme activity was measured.
  • the dehydrogenase activity value when glucose is used as the substrate solution and the dehydrogenase activity value when the same saccharide concentration (for example, maltose) is used as the substrate solution instead are measured.
  • the relative value when the measured value was 100 was calculated.
  • the QuickChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE Kit) is based on the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 49, which is designed to replace the 53rd glycine with multiple types of amino acids using this plasmid as a cage, and a synthetic oligonucleotide complementary thereto.
  • the modified FADGDH mutant plasmid having the ability to produce glucose dehydrogenase was prepared according to the protocol, and the plasmid was prepared in the same manner as described above.
  • E. coli D D5 ⁇ After transforming a commercially available E. coli competent cell (E. coli D D5 ⁇ ; manufactured by TOYOBO) with the plasmid pAOGDH-S2 prepared in Example 2, the transformant was agar medium (1% polypeptone containing ampicillin). , 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 1.5% agar; ⁇ ⁇ 7 ⁇ 3), and then the colony obtained by shaking culture at 30 ° C further contained ampicillin (100 g / ml) Ingested in LB liquid medium and cultured overnight at 30 ° C with shaking. Bacterial cells obtained by centrifugation were collected from a part of the culture solution, and a crude enzyme solution was prepared by crushing the microbial cells with glass beads in 50 mM phosphate buffer ( ⁇ 7.0).
  • Example 13 Screening for mutants with improved sputum specificity
  • Plasmids encoding these seven variants were named pAOGDH-Ml, pAOGDH_M2, pAOGDH-M3, pAOGDH-M4, pAOGDH-M5, pAOGDH-M6, and pAOGDH-M7.
  • DNA sequencer (ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer; Perkin-) Elmer) determined the nucleotide sequence of the gene encoding glucose dehydrogenase. As a result, the 53rd glycine described in SEQ ID NO: 2 was cystine in pAOGDH-Ml, and the 53rd glycine described in SEQ ID NO: 2 was specified in pAOGDH-M2.
  • Example 14 Keying of a mutant with improved sputum specificity and / or thermal stability
  • the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 50 designed to replace the 164th serine with a proline, and a complementary synthetic oligonucleotide pAOGDH-M5 as a saddle The synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 50 designed to replace the 164th serine with proline and its complementary synthetic oligonucleotide, pAOGDH-M2, is used as a cage, and the 163rd glycine is changed to arginine.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding glucose dehydrogenase was determined by DNA sequencer (ABI PRISMTM 3700 DNA Analyzer; manufactured by Perkin-Elmer) in the same manner as in Example 4.
  • the sequence was determined by pAOGDH-M8.
  • the 53rd glycine described in number 2 is histidine, the 167th serine is proline, the 53rd glycine described in SEQ ID NO: 2 in pAOGDH-M9 is asparagine, the 167th serine is proline, and pAOGDH- ⁇ It was confirmed that the 53rd glycine described in column No.
  • the crude enzyme solution was heat-treated at 50 ° C for 15 minutes, and glucose dehydrogenase activity was measured. It was confirmed that pAOGDH-M8, pAOGDH-M9, and pAOGDH- ⁇ had improved thermal stability. . The results are shown in Table 2.
  • pAOGDH-M8 As modified FADGDH producing bacteria, pAOGDH-M8, pAOGDH-M9, pAOGDH-MIO A commercially available E. coli DH5-cell (manufactured by TOYOBO) was transformed. The obtained transformant was cultured in TB medium for 24 hours at a culture temperature of 25 ° C. using a 10 L jar mentor. The cultured cells were collected by centrifugation, suspended in 50 mM phosphate buffer (pH 6.5), subjected to nucleic acid removal, and centrifuged to obtain a supernatant.
  • 50 mM phosphate buffer pH 6.5
  • a saturated amount of ammonium sulfate was dissolved in this to precipitate the target protein, and the precipitate collected by centrifugation was redissolved in 50 mM phosphate buffer ( ⁇ 6 ⁇ 5). Then, filter with G-25 sepharose column and hydrophobic quart with Octyl-Sepharose column and Phenyl-Sepharose column (both elution conditions are extracted with peak gradient by applying ammonium sulfate concentration gradient from 25% saturation to 0%). Then, ammonium sulfate was removed by gel filtration using a G-25 Sepharose column to obtain a modified FADGDH sample. As shown in Table 3, it was confirmed that the purified samples had improved thermal stability! /.
  • amino acid residues involved in the improvement of thermal stability in FAD-GDH can be found, and it has been shown that it can be applied to FAD-GDH of all genera and species.
  • the improved stability of FADGDH according to the present invention can reduce the heat inactivation of the enzyme during preparation of glucose measurement reagents, glucose assay kits, and glucose sensors, thereby reducing the amount of the enzyme used and improving the measurement accuracy. And contribute to industries such as medical-related fields.

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Description

明 細 書
改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グノレコースデヒドロゲナーゼ 技術分野
[0001] 本発明は熱安定性が改良された改変型グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH)に関し 、また、フラビンアデニンジヌクレオチド (FAD)を補酵素とする改変型 FADGDH依 存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FADGDH)、その製造方法及びグルコースセン サーに関するものである。
背景技術
[0002] 血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすため に重要である。血糖自己測定に用いられるセンサにはグルコースを基質とする酵素 が利用されている。そのような酵素の例としては例えばグルコースォキシダーゼ（EC 1. 1. 3. 4)が挙げられる。グルコースォキシダーゼはグルコースに対する特異性が 高く、熱安定性に優れてレ、るとレ、う利点を有してレ、ることから血糖センサ用酵素として 古くから利用されており、その最初の発表は実に 40年ほど前に遡る。グルコースォキ シダーゼを利用した血糖センサにおいては、グルコースを酸化して D ダルコノー δ ラタトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されること で測定がなされる力 S、グルコースォキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡し やすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。
[0003] このような問題を回避するために、例えば NAD (P)依存型グルコースデヒドロゲナ
PQQとも記載する。）依存型グノレコースデヒドロゲナーゼ（EC1. 1. 5. 2 ( EC1. 1
. 99. 17)が血糖センサ用酵素として用いられている。これらは溶存酸素の影響を受 けなレ、点で優位であるが、前者の NAD (P)依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本 書では NAD (P)依存型グルコースデヒドロゲナーゼを NADGDHとも記載する。 )は 安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性がある。一方後者の PQQ依存 型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書では PQQ依存型グルコースデヒドロゲナーゼを
PQQGDHとも記載する。）は、基質特異性に乏しぐマルトースゃラタトースといった グルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまうという欠点が ある。
[0004] また、特許文献 1にはァスペルギルス属由来フラビン結合型グルコースデヒドロゲナ ーゼ（本書ではフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを FADGDHとも記載す る。）が開示されている。本酵素は、キシロースに対する作用性がグルコースに対する 作用性の 10%程度あるため、キシロース負荷試験を受けている人の血糖を測定する 場合、測定値の正確性を損ねてしまう可能性がある。熱安定性については 50°C、 15 分処理で 89%程度の活性残存率であり安定性につ!/、ても優れて!/、るとされて!/、る。 特許文献 2には、その遺伝子配列、アミノ酸配列が報告されている。
特許文献 1： WO2004/058958
特許文献 2： WO2006/皿 239
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の目的は、上述のような公知の血糖センサ用酵素と比較して、さらに実用面 において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することである。
課題を解決するための手段
[0006] 特許文献 2には、ァスペルギルス 'テレウス属野生株を液体培養または小麦フスマ 培養することによりフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを得たこと、および、ァ スペルギルス .テレウス属由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコード する遺伝子を、組換え大腸菌、組換えカビ（ァスペルギルス 'ォリゼ）、組換え酵母（C andida属）でそれぞれ発現させ得られた酵素を精製したことが記載されて!/、る。
[0007] また、特許文献 2には、それらの酵素の性質試験、および、センサーに適用したとき の特性比較につ!/、て!/、くつかの事例が開示されてレ、る。
[0008] しかし本願発明者らは、特許文献 2の酵素は、産業上の要請という観点において、 その記載内容が十分でなぐその要請を満たしていない可能性があると考えた。例え ば、産業上の要請の重要な要件の 1つである大量生産に最も適していると思われた 大腸菌で発現させた酵素について、同様に極めて重要な要件である温度安定性の 記載がない点が挙げられる。そこで本願発明者は、酵素の安定供給という観点から、 該酵素を遺伝子組み換えにより生産することを視野に先行技術を再検討した。また、 ァスペルギルス 'ォリゼ株由来の FADGDHのアミノ酸配列を適宜改変することにより 、キシロースに作用性を低下させ、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に 使用可能な酵素を提供することを目的に検討を重ねた。
[0009] その結果、意外にも、最も大量生産に適していると思われた大腸菌で発現させて取 得した FADGDH組換え体 (rFADGDH)は、熱安定性が野生株から培養，精製し て得られた酵素と比べて大きく劣ることが判明した。
[0010] 例えば、発明者らが後述の方法によりァスペルギルス ·ォリゼから取得した aFADG DHは、 50°C ' 15分処理において約 77%の活性を維持していた力 大腸菌で発現 させて取得した FADGDH組換え体（raFADGDH)の熱安定性は、 50°C · 15分処 理において約 13%程度であった。また、ァスペルギルス.テレウス FADGDH組換え 体（rtFADGDH)の熱安定性も、 50°C · 15分処理にお V、て約 28%程度であった。
[0011] 特許文献 2にその構造や製造方法が記載されている酵素についても、同様に、大 腸菌で発現させて取得した酵素は、熱安定性が、野生株から培養 '精製して得られ た酵素と比べて劣る可能性が高レ、と考えられる。
[0012] これは、遺伝子組み換えにより生産された酵素は、表面に多糖が付加されておらず 、熱安定性が低下したからであると考えられた。
[0013] 血糖センサ用チップの作製工程においては、加熱乾燥処理を施す場合があり、組 換え体を利用する場合には、大幅な熱失活をおこす危険性があり、熱安定性を向上 させる必要があった。
[0014] そこで我々は、大腸菌による遺伝子組み換えにより生産しても十分な熱安定性を有 し、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供すること を目的にさらに検討を重ねた。
[0015] その結果、我々は、ァスペルギルス.オリゼ株由来またはァスペルギルス.テレウス 株由来の FADGDHのアミノ酸配列を適宜改変することにより、上述のような公知の 血糖センサ用酵素の熱安定性に関する欠点を克服して、より実用面において有利な 血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することができた。
[0016] すなわち本発明は以下の通りである。 [項 1コ
改変することにより熱安定性が向上した改変型 FADGDH。
[項 2]
真核生物由来である項 1記載の改変型 FADGDH。
[項 3コ
糸状菌由来である項 1記載の FADGDH。
[項 4コ
Aspergillus属菌由来である項 1記載の FADGDH。
[項 5]
野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FADG DH)よりも熱安定性が向上した項 1〜4記載の改変型 FADGDH。
[項 6]
液状において、 50°C、 15分間の熱処理後の活性残存率が 20%以上であることを特 徴とする項 1〜4記載の改変型 FADGDH。
[項 7]
液状において、 50°C、 15分間の熱処理後の活性残存率が 35%以上であることを特 徴とする項 1〜4記載の改変型 FADGDH。
[項 8コ
液状において、 50°C、 15分間の熱処理後の活性残存率が 40%以上であることを特 徴とする項 1〜4記載の改変型 FADGDH。
[項 9コ
50°C、 15分間の熱処理後の活性残存率が 70%以上であることを特徴とする項 1〜4 記載の改変型 FADGDH。
[項 10]
50°C、 15分間の熱処理後の活性残存率が 80%以上であることを特徴とする項 1〜4 記載の改変型 FADGDH。
[項 11]
配列表の配列番号 2または配列番号 46に記載されたアミノ酸配列を有する FADGD Hにおいて、少なくとも 1つのアミノ酸が置換、欠失、揷入もしくは付加された一次構 造を有する B女変型 FADGDH。
[項 12]
酉己歹 IJ表の酉己歹 IJ番号 2において、 120位、 160位、 162位、 163位、 164位、 165位、 1 66位、 167位、 169位、 170位、 171位、 172位、 180位、 329位、 331位、 369位、 471位及び 551位、力もなる群のうち少なくとも 1つの位置、または、配列表の配列番 号 46 ίこお!/、て 116位、 159位、 161位、 164位、 166位、 167位、 175位、 325位、 3 27位、 365位、 547位の位置、または、他の種における上記と同等の位置において アミノ酸置換を有する熱安定性が向上した改変型 FADGDH。
[項 13]
酉己歹 IJ表の酉己歹 IJ番号 2において少なくとも、アミノ酸置換力 K120E, G160E, G160 I、 G160P, G160S, G160Q, S162A, S162C, S162D, S162E, S162F, S1 62H、 S162L, S162P, G163D, G163K, G163L, G163R, S164F, S164T, S164Y, L165A、 L165I、 L165N、 L165P、 L165V, A166C, A166I, A166K 、 A166L, A166M, A166P, A166S, 167A、 S167P、 S167R、 S167V, N169 K、 N169P、 N169Y、 N169W, L170C、 L170F、 S171I、 S171K、 S171M、 SI 71Q、 S171V、 V172A、 V172C、 V172E、 V172I、 V172M、 V172S、 V172W 、 V172Y、 A180G、 V329Q、 A331C、 A331D、 A331I、 A331K、 A331L、 A3 31M、 Q331V、 K369R、 K471R、 V551A、 V551C、 V551T、 V551Q、 V551S 、V551Y、 (G160E + S167P), (G160I + S167P)、 （G160S + S167P)、 (G16 0Q + S167P), (S162A+S167P), (S162C + S167P)、 （S162D + S167P)、 (S162D + S167P), (S162E + S167P)、 （S162F + S167P)、 (S162H + S16 7P)、 (S162L + S167P), (G163D + S167P)、 （S164F + S167P)、 (S164T + S167P)、 (S164Y+S167P), (L165A+S167P) , (L165I + S167P) , (L165 P + S171K), (L165P + V551C), (L165V+ V551C) , (A166C + S167P) , ( A166I + S167P), (A166K+ S167P) , (A166K+S167P) 、 (A166M + S1
67P)、 (A166P + S167P), (A166S + S167P) , (S167P + N169K)、 (S167P
+ N169P), (S167P + N169Y), (S167P + N169W) , (S167P + L170C) , (S 167P + L170F) , (S167P + S 171I) , (S167P + S 171K) , (S 167P + S171M) 、 (S167P + S171Q) , (S 167P + S171V) , (S167P + V172A)、 (S 167P + V1 72C)、 (S167P + V172E) , (S167P + V172I)、（S167P + V172M)、 (S 167P + V172S)、 (S167P + V172T) , (S167P + V172W) , (S167P + V172Y)、 (S 167P + V329Q) , (S167P + A331C)、（S167P + A331D)、 (S167P + A331I )、 (S167P + A331K) , (S167P + A331L) , (S167P + A331M)、 (S167P + A 331V)、 (G163K + V551C) , (G163R+ V551C)のうちいずれ力、、または、配列 表の酉己歹 IJ番号 46において少なくとも、アミノ酸置換力 K116D, K116G, K116L, K116F, K116Q, Q159A、 Q159K、 Q159N、 Q159P、 Q159V、 Q159L、 E16 1C、 N164Y、 N164V, N164C、 T166F, T166Y, T166W, T167L、 T167V, T167S、 G175K、 S325A、 S325G、 S325K、 S325Q、 S325R、 S325T、 S325 V、 S325Y、 S327E、 Q365R、 V547S、 V547C、 V547A、 V547Qのうちいずれ 力、、または、他の種における上記と同等の位置におけるアミノ酸置換を有する熱安定 性が向上した改変型 FADGDH。
[項 14]
改変することにより pH安定性が向上した項 1〜； 14記載の改変型 FADGDH。
[項 15]
pH4. 5〜pH6. 5において、 25°C、 16時間処理後の残存活性が 80%以上であるこ とを特徴とする項 1〜 15記載の改変型 FAD— GDH。
[項 16]
pH4. 5〜pH6. 5において、 25°C、 16時間処理後の残存活性が 90%以上であるこ とを特徴とする項 1〜 15記載の改変型 FAD— GDH。
[項 17]
配列番号 2において、 163位、 167位、 551位、力、らなる群のうち少なくとも 1つの位 置、または他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸置換を有する pH安定 性が向上した改変体 FADGDH。
[項 18]
配列表の配列番号 2において少なくとも、アミノ酸置換が S167P、V551C、 (G163 K + V551C) , (G163R+V551C)のうちいずれ力、、または、他の種における上記と 同様の配置における位置におけるアミノ酸置換を有する pH安定性が向上した改変 型 FADGDH。
[項 19]
請求項 1〜； 18のいずれかに記載の改変型 FADGDHをコードする遺伝子。
[項 20]
請求項 19に記載の遺伝子を含むベクター。
[項 21]
請求項 20に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
[項 22]
請求項 21に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型 FADGDHの製 造方法。
[項 23]
請求項 1〜 18のいずれかに記載の改変型 FADGDHを含むグルコースアツセィキッ ト。
[項 24]
請求項 1〜 18のいずれかに記載の改変型 FADGDHを含むグルコースセンサー。
[項 25]
請求項 1〜； 18のいずれかに記載の改変型 FADGDHを含むグルコース測定法。
[項 26]
野生型のァスペルギルス.ォリゼ由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性ダルコ 一スデヒドロゲナーゼ（FADGDH)よりも基質特異性が向上した改変型 FADGDH であって、配列番号 2のアミノ酸配列における 53位、もしくは、それと同等の位置にお V、てアミノ酸置換を有する、熱安定性が向上した改変型 FADGDH。
[項 27]
キシロースに対する作用性がグルコースに対する作用性の 5. 0%以下である項 26に 記載の改変型 FADGDH。 アミノ酸置換を、酉己歹 IJ番号 2における、 G53H, G53N、 G53K、 G53M、 G53丁、 G5 3V及び G53Cからなる群のうちいずれ力、、もしくは、それと同等の位置に有する項 2 6に記載の改変型 FADGDH。
[項 29]
配列番号 2のアミノ酸配列における 163位、 167位および 551位からなる群のうちい ずれか 1つ以上の位置、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、 項 26に記載の改変型 FADGDH。
[項 30]
配列番号 2のアミノ酸配列における (G53H+S167P)、（G53N + S167P)、 (G53H + S 167P)および（G53N+G163R+V551C)からなる群のうちいずれ力、、もしくは、 それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、項 29に記載の改変型 FADGDH
〇
[項 31]
項 26〜30のいずれかに記載の改変型 FADGDHをコードする遺伝子であり、さらに 、該遺伝子を含むベクターであり、さらに、該ベクターで形質転換された形質転換体 であり、さらに、該形質転換体を培養することを特徴とする改変型 FADGDHの製造 方法。
[項 32]
項 26〜30のいずれかに記載の改変型 FADGDHを含むグルコースアツセィキット。
[項 33]
項 26〜30のいずれかに記載の改変型 FADGDHを含むグルコース測定方法。 項 26に記載の改変型 FADGDHは、野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存 性グルコースデヒドロゲナーゼ（FADGDH)よりも五炭糖類に対する作用性が低下し ている。五炭糖としてはキシロースが例示できる。項 26に記載の改変型 FADGDH は、野生型の FADGDHよりもキシロースに対する作用性がグルコースに対する作用 性の 5.0%以下である。なお、キシロースに対する作用性とは、グルコースを基質とし た場合とキシロースを基質とした場合の反応速度の相対比％ (グルコースを 1とする） を意味する。 [0017] 項 26に記載の改変型 FADGDHは、野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依 存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FADGDH)よりも熱安定性が向上していることが 好ましい。項 26に記載の改変型 FADGDHは、 50°C、 15分間の熱処理後の活性残 存率が 20%以上であり、好ましくは 40%以上であり、更に好ましくは 70%以上である 。このような安定性を維持することができれば、製剤時に加熱乾燥することが可能とな
[0018] 項 26に記載の改変型 FADGDHは、野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依 存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FADGDH)よりも pH安定性が向上していることが 好ましい。項 26に記載の改変型 FADGDHは、 pH4. 5〜pH7. 0において、 25°C、 16時間処理後の残存活性が 80%以上である力、、または、 pH4. 5〜pH6. 5におい て、 25°C、 16時間処理後の残存活性が 80%以上、好ましくは 90%以上である。
[項 34]
野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FADG DH)よりも熱安定性が向上した改変型 FADGDHであって、好ましくは真核生物由 来、さらに好ましくは糸状菌由来、さらに好ましくは Aspergillus属菌由来の FADGD H。ここで、 FADGDHは、 50°C、 15分間の熱処理後の活性残存率が 20%以上で あること力 S好ましく、さらには 40%以上であることが好ましぐさらには 80%以上である ことが好ましい。
[項 35]
配列番号 2に記載されたアミノ酸配列を有する FADGDHにおいて、少なくとも 1つの アミノ酸が置換、欠失、揷入もしくは付加された一次構造を有する改変型 FADGDH であり、 ί列えば、酉己歹 IJ番号 2において、 120位、 160位、 162位、 163位、 164位、 16 5位、 166位、 167位、 170位、 171位、 172位、 180位、 329位、 331位、 369位、 4 71位及び 551位、力、らなる群のうち少なくとも 1つの位置、または、他の種における上 記と同等の位置においてアミノ酸置換を有する熱安定性が向上した改変型 FADGD Η。ここで、 162位、 163位、 167位及び 551位の少なくとも 1つの位置においてァミノ 酸置換を有する改変型 FADGDHがさらに好ましいものとして例示できる。
[項 36] 野生型のァスペルギルス.ォリゼ由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性ダルコ 一スデヒドロゲナーゼ（FADGDH)よりも熱安定性が向上した改変型 FADGDHで あって、配列番号 2のアミノ酸配列における 163位および/または 551位、もしくは、 それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、熱安定性が向上した改変型 FAD GDH。
[項 37]
酉己歹 IJ番号 2のアミノ酸酉己歹 IJにおける、 G163D, G163K, G163し、 G163R, V551A 、 V551C、 V551T、 V551Q、 V551S、 V551Y、 (G163D + S167P) , (L165P + V551C) , (L165V + V551C) , (G163K + V551C)、（G163R+ V551C)力も なる群のうちいずれ力、、もしくは、それと同等の位置において同等のアミノ酸置換を有 する、前パラグラフ記載の改変型 FADGDH。
[項 38]
配列番号 2のアミノ酸配列における 163位および/または 551位に加えて、さらに、 1 20位、 160位、 162位、 164位、 165位、 166位、 167位、 170位、 171位、 172位、 180位、 329位、 331位、 369位および 471位力、らなる群のうちレヽずれ力、 1つ以上の 位置、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、改変型 FADGD H。
[項 39]
野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FADG DH)よりも pH安定性が向上した改変型 FADGDHであって、好ましくは真核生物由 来、さらに好ましくは糸状菌由来、さらに好ましくは Aspergillus属菌由来の FADGD H。
[項 40]
配列番号 2のアミノ酸配列における 163位および/または 551位に加えて、さらに、 1 67位、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、 pH安定性が向 上した改変型 FADGDHである。
[項 41]
配列番号 2のアミノ酸配列における S167P、 V551C、（G163K + V551C)、 (Gl 63R+V551C) 力もなる群のうちいずれ力、、もしくは、それと同等の位置において 同等のアミノ酸置換を有する、前パラグラフ記載の改変型 FADGDHである。
[項 42]
pH4. 5〜pH6. 5において、 25°C、 16時間処理後の残存活性が 80%以上、好まし くは 90%以上である項 34〜41のいずれかの FADGDH。
[項 43]
配列番号 2において、 163位、 167位、 551位、力、らなる群のうち少なくとも 1つの位 置、または他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸置換を有する pH安定 性が向上した改変体 FADGDH。
[項 44]
配列番号 2において少なくとも、アミノ酸置換が S167P、V551C、 (G163K + V551 C)、 （G163R+V551C)のうちいずれ力、、または、他の種における上記と同様の配 置における位置におけるアミノ酸置換を有する pH安定性が向上した改変型 FADG DH。
[項 45]
項 34〜44の!/、ずれかに記載の改変型 FADGDHをコードする遺伝子、該遺伝子を 含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を培養する ことを特徴とする改変型 FADGDHの製造方法。
[項 46]
項 34〜44のいずれかに記載の改変型 FADGDHを含むグルコースアツセィキットま たはグルコースセンサー。
[項 47]
項 34〜44のいずれかに記載の改変型 FADGDHを含むグルコース測定法である。 本発明の改変型 FADGDHにおいて、特に、 G163K、 G163L、 G163R、 S167P 、 V551A、 V551C、 V551Q、 V551S、 V551Y、 (G160I + S167P) , (S 162F + S 167P)、 (S167P + N169Y) , (S 167P + L171I) , (S167P + L171K) , (S167 P + L171V) , (S167P + V172I) , (S167P + V172W) , (G163K + V551C) (G 163R+V551C)のアミノ酸置換は、改変型 FADGDHの熱安定性の向上に寄与す [0020] ここで、 「K120E」は、 120位の K (Lys)を E (Glu)に置換することを意味する。また 、 「（G160E + S167P)」は、 160位の Gを Eに、 167位の Sを Pにそれぞれ置換する こと、 +はその両方の置換を有する多重 (この例では二重）変異体であることを意味 する。
[0021] 加熱乾燥可能なレベルとは、 50°C、 15分処理後の残存活性が 20%以上存在する 状態であり、好ましくは 40%以上の残存活性が存在する状態であり、更に好ましくは 、 60%以上の残存活性が存在する状態である。
発明の効果
[0022] 本発明による FADGDHの安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアツ セィキット及びグルコースセンサー作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使 用量低減や測定精度の向上を可能にする。
図面の簡単な説明
[0023] [図 1]ァスペルォリゼ由来 WT (野生型）、改変型 FADGDH精製標品の pH安定性を示 t。 pH3. 5—6. 3 :„ノ ッファー、 pH6. 3—7. 3、 PIPESノ ッファー、 pH7. 3〜 8. 8 :トリス塩酸バッファー、 ρΗ6· 0〜7· 7 :リン酸バッファーをそれぞれ用いた。 発明を実施するための最良の形態
[0024] 本発明は組み換え FADGDHよりも熱安定性が向上した改変型 FADGDHを含む
〇
[0025] 配列番号 2で示される野生型のァスペルギルス'ォリゼ由来の FADGDHは、以下 の方法により入手した。
[0026] 本発明者らは、 National Center for Biotechnology Information (以下 NCBIと表記） のデータベースを利用し、ァスペルギルス.ォリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ 遺伝子を推定、取得し、該遺伝子を用い、大腸菌よりァスペルギルス ·ォリゼ由来の グルコースデヒドロゲナーゼを取得できることを見出した。
[0027] ァスペルギルス.ォリゼ由来 GDH遺伝子を取得するために、 自社保有のァスペル ギルス.ォリゼ TI株の培養上清から、各種クロマトグラフィーを用いて GDHの精製を 試みたが、高純度の GDHを得るのは困難であり、遺伝子取得の常法の 1つである部 分アミノ酸配列を利用したクローニングは断念せざるを得なくなった。しかしながら、 我々は Penicillium lilacinoechinulatum NBRC623 朱が GDHを生産することを見出し 、精製酵素を用いて部分アミノ酸配列の決定に成功した。ついで、決定したアミノ酸 配列を元に、 PCR法により、 P. lilacinoechinulatum NBRC6231由来 GDH遺伝子を一 部取得し、塩基配列を決定した（1356bp)。最終的に、この塩基配列を元に、ァスぺ ルギルス 'ォリゼ GDH遺伝子を推定、取得した。その概要を以下の <実験例 1〉< 実験例 2〉に示す。
<実験例 1 >
[ァスペルギルス.ォリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下 AOGDHとも記載）遺 伝子の推定]
[ 1 ]ァスペルギルス 'ォリゼ由来 GDHの取得
ァスペルギルス.ォリゼ TI株の L乾燥菌株をポテトデキストロース寒天培地（Difco 製）に植菌し 25°Cでインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の 菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。 2基の 10L容ジャーファーメ ンタ一中に生産培地（1 %麦芽エキス、 1. 5%大豆ペプチド、 0. l %MgSO · 7水和
4 物、 2%グルコース、 pH6. 5) 6Lを調製し、 120°C 15分オートクレーブ滅菌して放冷 した後、上記の菌糸懸濁液を接種し、 30°C、通気攪拌培養を行った。培養開始から 64時間後に培養を停止し、菌糸体を濾過により除去して GDH活性を含む濾過液を 回収した。回収した上清を限外ろ過膜 (分子量 10, 000カット）により低分子物質を除 去した。次いで、硫酸アンモニゥムを 60%飽和度となるように添加、溶解し、硫安分 画を行い、遠心機により GDHを含む上清画分を回収後、 Octyl— Sepharoseカラム に吸着させ、硫酸アンモニゥム飽和度 60%〜0%でグラジェント溶出して GDH活性 のある画分を回収した。得られた GDH溶液を、 G— 25— Sepharoseカラムを用いて 脱塩を行った後、 60%飽和度の硫酸アンモニゥムを添力 P、溶解し、これを Phenyl— Sepharoseカラムに吸着させ、硫酸アンモニゥム飽和度 60%〜0%でグラジェント溶 出して GDH活性のある画分を回収した。更にこれを 50°Cで 45分加温した後、遠心 分離を行って上清を得た。以上の工程を経て得られた溶液を精製 GDH標品（AOG DH)とした。尚、上記精製過程においては、緩衝液として 20mM リン酸カリウム緩 衝液（pH6. 5)を使用した。さらに、 AOGDHの部分アミノ酸配列を決定するため、ィ オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種手段により精製を 試みたものの、部分アミノ酸配列決定に供することのできる高純度の精製標品を得る ことはできなかった。
[2]ぺニシリウム属糸状菌由来 GDHの取得
ぺニシリウム属糸状菌由来の GDH生産菌として Penicillium lilacinoechinulatum NB RC6231を用い、上記ァスペルギルス.ォリゼ TI株と同用の手順に従って、培養およ び精製を行い、 SDS電気泳動でほぼ均一な精製標品を取得した。
[cDNAの作製]
Penicillium lilacinoechinulatum NBRC6231につ!/、て上記方法に従!/、（ただしジャー フアーメンターでの培養時間は 24時間）培養を実施し、濾紙濾過により菌糸体を回 収した。得られた菌糸は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、クールミル (東洋紡社 製）を用いて菌糸を粉砕した。粉砕菌体より直ちにセパゾール RNA 1 (ナカライテス ク社製）を用いて本キットのプロトコールに従ってトータル RNAを抽出した。得られた トータル RNAからは Origotex— dt30 (第一化学薬品社製）をもちいて mRNAを精 製し、これをテンプレートに ReverTra-Plus-TM (東洋紡社製）を用いて RT— PCRを 行った。得られた産物はァガロース電気泳動を行い、鎖長 0. 5〜4. Okbに相当する 部分を切り出した。切り出したゲル断片から MagExtractor— PCR&Gel Clean Up - (東洋紡社製）を用レ、て cDNAを抽出 ·精製して cDNAサンプルとした。
[GDH遺伝子部分配列の決定]
上記で精製した NBRC6231由来 GDHを 0. 1 %SDS、 10%グリセロールを含有 する Tris— HClバッファー（ρΗ6· 8)に溶解し、ここに Glu特異的 V8エンドプロテア 一ゼを終濃度 10 g/mlとなるよう添加し 37°C16時間インキュベートすることで部分 分解を行った。このサンプルをアクリルアミド濃度 16%のゲルを用いて電気泳動して ペプチドを分離した。このゲル中に存在するペプチド分子を、プロット用バッファー（1 • 4%グリシン、 0.3%トリス、 20%エタノール）を用いてセミドライ法により PVDF膜に転 写した。 PVDF膜上に転写したペプチドは CBB染色キット（PIERCE社製 GelCode
Blue Stain Reagent)を用いて染色し、可視化されたペプチド断片のバンド部 分 2箇所を切り取ってペプチドシーケンサ一により内部アミノ酸配列の解析を行った。 得られたアミノ酸配歹 IJは IGGVVDTSLKVYGT (配列番号 37)および WGGGTKQ TVRAGKALGGTST (配列番号 38)であった。この配列を元にミックス塩基を含有 するディジェネレートプライマーを作製し、 NBRC6231由来 cDNAをテンプレートに PCRを実施したところ増幅産物が得られ、ァガロースゲル電気泳動により確認したと ころ 1. 4kb程度のシングルバンドであった。このバンドを切り出して東洋紡製 MagEx tractor— PCR&Gel Clean Up—を用いて抽出.精製した。精製 DNA断片は T Arget Clone —Plus—（東洋紡社製）により TAクローユングし、得られたベクター で大腸菌 JM109コンビテントセル (東洋紡社製）をヒートショックにより形質転換した。 形質転換クローンのうち青白判定でインサート揷入が確認されたコロニーについて M agExtractor - Plasmid - (東洋紡社製）を用いてプラスミドをミニプレップ抽出.精 製し、プラスミド配列特異的プライマーを用いてインサートの塩基配列を決定した（13 56bp) 0
[AOGDH遺伝子の推定]
決定した塩基配列を元に「NCBI BLASTJのホームページ（http：〃 www.ncbi.nlm • nih.gov/BLAST/)力、らホモロジ一検索を実施し、 AOGDH遺伝子を推定した。検索 により推定した AOGDHと P.lilacinoechinulatum NBRC6231由来 GDH部分配列との アミノ酸レベルでの相同性は 49%であった。
<実験例 2 >
[ァスペルギルス.ォリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得、大腸菌への 導入]
AOGDH遺伝子を取得するために、ァスペルギルス 'ォリゼ TI株の菌体より mRN Aを調製し、 cDNAを合成した。配列番号 39、 40に示す 2種類のオリゴ DNAを合成 し、調製した cDNAをテンプレートとして KOD Plus DNAポリメラーゼ（東洋紡社 製）を用いて AOGDH遺伝子増幅した。 DNA断片を制限酵素 Ndel、 BamHIで処 理し、 pBluescript (LacZの翻訳開始コドン atgに合わせ Ndel認識配列の atgを合 わせる形で Ndelサイトを導入したもの） Ndel— BamHIサイトに揷入し、組換えプラス ミドを構築した。この組換えプラスミドを用いて、ェシエリヒア'コリー DH5 a (東洋紡社 製）を形質転換した。形質転換体より、常法に従いプラスミドを抽出し、 AOGDH遺伝 子の塩基配列の決定を行った (配列番号 41)。この結果、 cDNA配列から推定され るアミノ酸残基は 593アミノ酸 (配列番号 42)からなることが明ら力、となった。データべ ース予想される GDHは 588アミノ酸であり TI株 GDHとアミノ酸残基数が異なること が示唆された。なお、該遺伝子については、 TI株ゲノム DNAを用いて配列を確認し 、遺伝子隣接領域についても RACE法を用いて確認を行った。また、 PCR法を用い て、データベースに基づく DNA配列をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質転 換体を取得した。これら形質転換体を 100 g/mlのアンピシリンを含む液体培地（ Terrific broth) 200ml中で、 30°C、 16時間振とう培養を行った。菌体破砕液につい て GDH活性を確認したところ、データベースより推定した GDHの配列を有する形質 転換体では GDH活性が確認できなかった力 TI株由来 GDHの配列を有する形質 転換体については菌体内に培養液 lml当たり 8. 0Uの GDH活性が得られた。尚、 実施例 1で実施したァスペルギルス 'ォリゼ TI株の培養上清の GDH活性は、 0. 2U / mlであつに。
[0031] <実験例 3 >
[ァスペルギルス.ォリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下 AOGDHと示す）遺 伝子の大腸菌 の導入]
シグナルペプチド切断後の FAD— GDHを mFAD— GDHとした場合、 mFAD— GDHの N末端に Mのみ付加して mFAD— GDHの N末端が 1アミノ酸分のびた形態 となって!/、るものを S2と表現した。
[0032] S2では、配列番号 43のオリゴヌクレオチドを N末端側プライマーとして、配列番号 4 4のプライマーとの組合せで PCRを行い、同様手順にて、 S2をコードする DNA配列 (配列番号 1)をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質転換体を取得した。
[0033] なお、この改変 FAD— GDHの DNA配列を持つプラスミドは、 DNAシーケンシン グにて配列上誤りがないことを確かめた。
[0034] この形質転換体を TB培地にて 10L—ジャーフアーメンターを用いて 1〜2日間液 体培養した。各培養フェーズの菌体を集菌した後、超音波破砕して GDH活性を確 認した。シグナルペプチドと思われるアミノ酸配列を削除することにより、その GDH生 産性が増大した。
[0035] 配列番号 46で示される野生型のァスペルギルス ·テレウス由来の FADGDHは、以 下の方法により入手した。
[0036] <実験例 4 >
cDNAの調製
ァスペルギルス 'テレウス NBRC33026 (独立行政法人製品評価技術基盤機構より購 入） L乾標本をポテトデキストロース寒天培地（Difco製）に植菌し 25°Cでインキュべ ートすることにより復元させた。 500ml 坂口フラスコに 1 · 5%大豆ペプチド、 2%グ ルコース、 1 %マルトエキス ρΗ6· 5を 50ml調製し、復元させたプレート上の菌糸を寒 天ごと回収して植菌し、 30°C，24時間振とう培養を行い、菌体を回収した。得られた 菌体は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、東洋紡製クールミルを用いて、粉砕し た。粉砕菌体より直ちにナカライテスタ社製セパゾール RNA Iを用いて本キットのプ 口トコールに従ってトータル RNAを抽出し、これをテンプレートに東洋紡製 ReverTra- Plus-™を用いて RT— PCRを行!/ヽ cDNAを調製した。
[0037] <実験例 5 >
GDH遺伝子の西 R列決定
我々は Aspergillus oryzae、 Penicillium lilacinoechinulatum、および Penicillium italic um由来 GDH遺伝子のクローユングに成功し、その塩基配列情報を取得している。ァ スペルギルス.テレウスより GDH遺伝子をクローユングするために、上記 3種の GDHの 推定アミノ酸配列をァラインさせ、相同性の高い領域の配列をもとに、デイジエネレー トプライマーを作製した。 <実験例 4 >で作製したゲノム DNAをテンプレートに PCR を実施したところ、増幅産物が認められた。増幅産物をサブクローユングし、塩基配 列を決定した。決定した GDH部分配列を元に、該配列部分の 5'側および 3'側隣接 領域を RACE法により決定した。決定した遺伝子領域の開始コドンから終始コドンま での配列を配列番号 45に、また、本配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号 46 に示す。なお、特許文献 1に示されているァスペルギルス *テレウス FERM BP-08578 由来補酵素結合型グルコース脱水素酵素とは、アミノ酸レへ"ルで約 98.5%と非常に 高い相同性をもち、本質的に同等であると考えられる。「相同性」とは、当該技術分野 において公知の数学的アルゴリズムを用いて 2つのアミノ酸配列をァラインさせた場 合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのため に配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮しうるものである）における、ォ 一バーラップする全アミノ酸に対する、同一アミノ酸残基の割合（％)を意味する。こ のようなアルゴリズムの例としては、非特許文献 1〜4に記載のものが挙げられるが、 これらに限定されない。
非特許文献 1 : Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) Vol.90 p5873- 5877 非特許文献 2 : Needleman et al., J. Mol. Biol. (1970) Vol.48 p444- 453
非特許文献 3 : Myers and Miller, CABIOS Vol.4 pi 1-17
非特許文献 4 : Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) Vol.85 p2444- 2448
[0038] <実験例 6 >
GDH組椽ぇプラスミドおよび組椽ぇ体の作製
配列番号 45の DNA配列がコードするアミノ酸配列について、 SignalP 3.0 Serverを 利用して、シダナルへ °プチド予測を行った。この結果を元に、シダナルへ °プチ ドを除去すベぐ N末端配列 25コドンが削除され、開始コドン (ATG)を付加した配 列増幅が増幅されるように PCRプライマーを作製した (配列番号 47、 48)。これらの プライマーを用いて、 NBRC33026 cDNAをテンプレートとして KOD Plus DNAポ リメラーゼ (東洋紡社製）により遺伝子増幅を実施した。増幅断片は制限酵素 Ndel、 BamHIで処理し、 pBluescript (LacZの翻訳開始コドン ATGに合わせ Ndel認識配 列の ATGを合わせる形で Ndelサイトを導入したもの）の Ndel— BamHIサイト間に 揷入し、組換えプラスミドを構築した (pAtGDH-s2-7)。この組換えプラスミドを用いて、 ェシエリヒア'コリー DH5 a (東洋紡社製）を形質転換し、ァスペルギルス'テレウス由 来 GDH組換え体を取得した。該形質転換体を 100 H g/mlのアンピシリンを含む 液体培地（Terrific broth) 200ml中で、 30°C、 16時間振とう培養を行った。菌体破砕 液について GDH活性を確認したところ、菌体内に培養液 lml当たり 1. 0Uの GDH 活性が得られた。
[0039] 本発明の改変型 FADGDHは、配列番号 2または配列番号 46のアミノ酸配列にお ける上記で示されるいずれ力、位置においてアミノ酸置換を行うことにより得られる。 [0040] 例えば、「配列番号 2のアミノ酸配列と同等の位置」とは、配列番号 2アミノ酸配列と 、配列番号 2と相同性 (好ましくは 60%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましく は 90%以上）を持つアミノ酸配列を有する他の GDHとを、ァラインさせた場合に、そ のアラインメントにおける同一の位置を意味する。
[0041] 基質特異性、及び/または、熱安定性の改良された本発明は、配列番号 2のァミノ 酸配列において、 53位、 163位、 167位、位及び 551位の少なくとも 1つの位置にお いてアミノ酸置換を有する改変型 FADGDHが例示される。
配列番号 2のアミノ酸配列において、アミノ酸置換が G53H、 G53N、 G53K、 G53 M、 G53丁、 G53V、 G53C、 G163R, S167P、 V551C力、らなる群力、ら選 ίίれる改 変型 FADGDH。
[0042] ここで、「G53H」は、 53位の G (Gly)を (H i s)に置換することを意味する。
特に、 G53H、 G53N、 G53K、 G53M、 G53T、 G53V、 G53Cのアミノ酸置換は、 改変型 FADGDHの基質特異性の向上に寄与し、 G53H+S167P, G53N + S167 P、 G53N + G163R+V551Cのアミノ酸置換は、改変型 FADGDHの基質特異性 、及び/または、安定性の向上に寄与する。
[0043] 熱安定性の改良された本発明は、配列番号 2のアミノ酸配列において、 120位、 16 0位、 162位、 163位、 164位、 165位、 166位、 167位、 169位、 170位、 171位、 1 72位、 180位、 329位、 331位、 369位、 471位及び 551位の少なくとも 1つの位置 においてアミノ酸置換を有する改変型 FADGDHが例示される。上記のうち、 162位 、 163位、 167位、位及び 551位の少なくとも 1つの位置においてアミノ酸置換を有 する改変型 FADGDH。
[0044] 配列番号 2のアミノ酸配列において、アミノ酸置換が K120E、 G160E、 G160I、 G 160P、 G160S、 G160Q、 S 162A、 S 162C、 S162D、 S 162E、 S162F、 S162H 、 S162L、 S162P、 G163D、 G163K、 G163L、 G163R、 S164F、 S164T、 S16 4Y、 L165A、 L165I、 L165N、 L165P、 L165V, A166C, A166I, A166K, Al 66L、 A166M, A166P, A166S, 167A、 S167P、 S167R、 S167V, N169K、 N169P、 N169Y、 N169W, L170C、 L170F、 S171I、 S171K、 S 171M、 S171 Q、 S 171V、 V172A、 V172C、 V172E、 V172I、 V172M、 V172S、 V172W, V 172Y、 A180G、 V329Q、 A331C、 A331D、 A331I、 A331K、 A331L、 A331 M、 Q331V、 K369R、 K471R、 V551A、 V551C、 V551T、 V551Q、 V551S、 V 551Yからなる群力も選ばれる改変型 FADGDH。
[0045] ここで、 「K120E」は、 120位の K (Lys)を E (Glu)に置換することを意味する。
[0046] 特に、 G163K、 G163L, G163R, S167P, V551A、 V551C、 V551Q、 V551S 、V551Y、 (G160I + S 167P) , (S162F + S167P)、 （S 167P + N169Y)、 (S16 7P + L171I) , (S 167P + L171K) , (S 167P + L171V) , (S 167P + V172I)、 (S 167P + V172W) , (G163K + V551C) (G163R + V551C)のアミノ酸置換は、改 変型 FADGDHの熱安定性の向上に寄与する。
[0047] また、酉己歹 IJ番号 46のアミノ酸酉己歹 IJにおいて、 116位、 159位、 161位、 164位、 166 位、 167位、 175位、 325位、 327位、 365位及び 547位の,少なくとも 1つの位置に おいてアミノ酸置換を有する改変型 FADGDHが例示される。
[0048] 好ましくは配列番号 46のアミノ酸配列において、アミノ酸置換が K116D、 K116G 、 K116L, K116F、 K116Q, Q159A、 Q159K、 Q159N、 Q159P、 Q159V、 Ql 59L、 E皿 C、 N164Y、 N164V, N164C、 T166F, T166Y, T166W, T167L 、 T167V, T167S、 G175K、 S325A、 S325G、 S325K、 S325Q、 S325R、 S32 5T、 S325V、 S325Y、 S327E、 Q365R、 V547S、 V547C、 V547A、 V547Q力、 らなる群から選ばれる改変型 FADGDHが例示される。
[0049] ここで、 「K116D」は 116位の K (Lys)を D (Asp)に置換することを意味する。
[0050] 配列番号 2で示される野生型のァスペルギルス'ォリゼ由来の FADGDHを改変し た改変型 FADGDHの製造法または、配列番号 46で示される野生型のァスペルギ ルス ·テレウス由来の FADGDHを改変した改変型 FADGDHの製造法は特に限定 されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。 FADGDHを構成 するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法 が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有する DNAの特定の塩基を変換 することにより、或いは特定の塩基を揷入または欠失させることにより、改変タンパク 質の遺伝情報を有する DNAが作成される。 DNA中の塩基配列を変換する具体的な 方法としては、例えば市販のキット (Transformer Mutagenesis Kit;Clonetech社， EXOI II/Mung Bean Deletion Kit;Stratagene製， Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit;Stratagene製など)の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法 (PCR)の利用が挙げら れる。
[0051] 作製された改変型 FADGDHの遺伝情報を有する DNAは、プラスミドと連結された 状態にて宿主微生物に移入され、改変型 FADGDHを生産する形質転換体となる。 この際のプラスミドとしては、例えば、ェシエリヒア'コリー JM109、ェシエリヒア'コリー D Η5 ·、ェシエリヒア'コリー W3110、ェシエリヒア'コリー C600などが利用できる。宿主微 生物に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がェシエリヒア 'コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換え DNAの移 入を行う方法などを採用することができる、更にエレクト口ポレーシヨン法を用いても良 い。更には市販のコンビテントセル (例えばコンビテントハイ JM109;東洋紡績製）を用 いても良い。
[0052] こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多 量の改変型 FADGDHを安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培 養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよぐ通常多く の場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。培地 の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源とし ては資化可能な炭素化合物であればよぐ例えば、グルコース、シユークロース、ラタ トース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素減としては利用可能な 窒素化合物であればよぐ例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分怪 物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マ グネシゥム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、 特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培地温度は菌が発育し、改変型 FA DGDHを生産する範囲で適日変更し得るが、ェシエリヒア'コリーの場合、好ましくは 20〜42°C程度である。培養温度は条件によって多少異なる力 改変型 FADGDHが 最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよぐ通常は 6〜 48時間程度である。培地 pHは菌が発育し改変体タンパク質を生産する範囲で適宜 変更しうるが、特に好ましくは pH6.0〜9.0程度である。 [0053] 培養物中の改変型 FADGDHを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利 用することもできる力 一般には常法に従って改変型 FADGDHが培養液中に存在 する場合は、濾過、遠心分離などにより、改変タンパク質の含有溶液と微生物菌体と を分離した後に利用される。改変タンパク質が菌体内に存在する場合には得られた 培養物から濾過または遠心分離などの手法により菌体を採取し、次 V、でこの菌体を 機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じて EDTA 等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加して改変型 FADGDHを可溶化し、水 溶液として分離採取する。
[0054] このようにして得られた改変型 FADGDH含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮 、さらに、硫酸アンモニム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、 例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめれば よい。また、加温処理や東電点処理も有効な生成手段である。吸着剤或いはゲル濾 過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフ ィニティークロマトグラフィーにより、精製された改変型 FADGDHを得ることができる
[0055] グルコースアツセィキット
本発明はまた、本発明に従う改変型 FADGDHを含むグルコースアツセィキットを特徴 とする。本発明のグルコースアツセィキットは、本発明に従う改変型 FADGDHを少なく とも 1回のアツセィに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型 FADG DHに加えて、アツセィに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作 製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型 FADGDHは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存 溶液中の溶液として提供することができる。
[0056] グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型 FADGDHを用いるグルコースセンサーを特徴 とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に 本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子 マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性 ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフエ口センあるいはその誘導体に代 表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定し てもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、ダルタルアルデヒド を用いて本発明の改変型 FADGDHをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有
Figure imgf000024_0001
[0057] グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うこと力 Sできる。恒温セルに緩衝液を 入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フエナ ジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型 FAD GDHを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えば Ag /AgCl電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になつ た後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のダルコ一 ス溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を 計算すること力 Sでさる。
実施例
[0058] 本発明にお!/、て、 FAD依存型 GDHの活性測定は以下の条件で行う。
[試験例]
<試薬〉
50mM PIPES緩衝液 pH6. 5 (0. l %TritonX— 100を含む）
163mM PMS溶液
6. 8mM 2, 6—ジクロロフエノールインドフエノール（DCPIP)溶液
1M D—グルコース溶液
上記 PIPES緩衝液 15· 6ml, DCPIP溶液 0· 2ml、 D—グルコース溶液 4mlを混 合して反応試薬とする。
<測定条件 >
反応試薬 2. 9mlを 37°Cで 5分間予備加温する。 GDH溶液 0. 1mlを添加しゆるや かに混和後、水を対照に 37°Cに制御された分光光度計で、 600nmの吸光度変化を 5分記録し、直線部分から 1分間あたりの吸光度変化（A OD )を測定する。盲検
TEST
は GDH溶液の代わりに GDHを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に 1分間あ たりの吸光度変化（ Δ OD )を測定する。これらの値から次の式に従って GDH
BLANK
活性を求める。ここで GDH活性における 1単位（U)とは、濃度 200mMの D—ダルコ ース存在下で 1分間に 1マイクロモルの DCPIPを還元する酵素量として定義している 活性 (U/ml) =
{ - ( Δ ΟΌ - Δ ΟΌ ) X 3. O X希釈倍率 }/{ 16. 3 X 0. 1 X 1. 0}
TEST BLANK
なお、式中の 3. 0は反応試薬 +酵素溶液の液量 (ml) 16. 3は本活性測定条件 におけるミリモル分子吸光係数 (cm2/マイクロモル）、 0· 1は酵素溶液の液量 (ml) 1. 0はセルの光路長（cm)を示す。
[0059] 施例 1 :グルコ一 》用いた改 」FADGDH熱 ¾^件の检討
検討は、先述の試験例の FADGDH活性の測定方法に準じて行った。
まず、ァスペルギルス ·ォリゼまたはァスペルギルス ·テレウス由来改変型 FADGDHを 約 2U/mlになるように酵素希釈液（50mM リン酸カリウム緩衝液（ρΗ5· 5)、 0· 1 % TritonX— 100)にて溶解したものを 50ml用意した。この酵素溶液を 1. 0mlとし たものを 2本用意した。コントロールには、夫々の改変型 FADGDH (各種化合物の代 わりに蒸留水 0. 1mlを添加したものを 2本用意した。
[0060] 2本のうち、 1本は 4°Cで保存し、もう 1本は、 50°C 15分間処理を施した。処理後、 夫々のサンプルの FADGDH活性を測定した。各々、 4°Cで保存したものの酵素活 性を 100として、 50°C 15分間処理後の活性値を比較して活性残存率（％)として算 uし/
[0061] 実施例 2：ァスペルギルス ·オリゼ由来 FADGDH遺伝子への変異導入
野生型 FADGDHをコードする遺伝子（配列番号 1)を含む組み換えプラスミド pAOGD H-S2で市販の大腸菌コンビテントセル (E.coli DH5a; TOYOBO社製)を形質転換した 後、形質転換体をアンピシリン (50mg/ml;ナカライテスタ社製)を含んだ液体培地（1% ポリペプトン、 0.5%酵母エキス、 0.5%NaCl ;pH7.3)を摂取し、 30°Cでー晚振とう培養し て得られた菌体から、常法によりプラスミドを調整した。該プラスミドを铸型として用い Diversify™PCR Ramdom Mutagenesis Kit(Clontech社製)を用いた変異処理をそのプ ロトコールに従って実施し、グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型 F ADGDH変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
[0062] 実施例 3：ァスペルギルス ·オリゼ由来改変型 FADGDHを含む粗酵素液の調整
実施例 2で調整したプラスミドで市販の大腸菌コンビテントセル (E.coli DH5a ; TOYO BO社製)を形質転換した後、形質転換体をアンピシリンを含んだ寒天培地（1%ポリぺ プトン、 0.5%酵母エキス、 0.5%NaCl、 1.5%寒天； pH7.3)に塗布した後、 30°Cでー晚振 とう培養して得られたコロニーをさらにアンピシリン (100 g/ml)を含んだ LB液体培地 に摂取し、 30°Cで一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得ら れた菌体を回収し、 50mMのリン酸緩衝液 (pH7.0)中でガラスビーズで該菌体を破砕 することにより粗酵素液を調製した。
[0063] 実施例 4 :熱安定件が向上した栾 II体のスクリーニング
実施例 3の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナー ゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を 50°Cで 15分間加熱処理した後、グルコース デヒドロゲナーゼ活性を測定し、 3種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これ ら 3種の改変体をコードするプラスミドを pAOGDH- Ml、 pAOGDH_M2、 pAOGDH-M3 、 pAOGDH- M4と命名した。
[0064] pAOGDH-Ml, pAOGDH_M2、 pAOGDH_M3、 pAOGDH- M4の変異箇所を同定す るために DNAシークェンサ一 (ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer;Perkin_Elmer製)で グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、 pAOG DH-M1で配列番号 2記載の 162番目のセリンがプロリン、 pAOGDH_M2では 167番目 のセリンがプロリンに 471番目のリジンがアルギニン、 pAOGDH-M3では 180番目のァ ラニンがグリシンに 551番目のバリンがァラニン、 pAOGDH-M4では 120番目のリジン がグルタミン酸に 167番目のセリンがプロリンに 369番目のリジンがアルギニンに置換 されていることが確認された。結果を表 1に示す。
[0065] [表 1]
Figure imgf000027_0001
pAOGDH-S2のプラスミドを铸型として、 160番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置 換するよう設計した配列番号 3の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴ ヌクレオチド、 161番目のトリブトファンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配 列番号 4の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 162番目 のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号 5の合成オリゴヌクレオ チドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 163番目のグリシンを複数種のアミノ酸 に置換するよう設計した配列番号 6の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成 オリゴヌクレオチド、 164番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列 番号 7の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 165番目の ロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号 8の合成オリゴヌクレオ チドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 166番目のァラニンを複数種のアミノ 酸に置換するよう設計した配列番号 9の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合 成オリゴヌクレオチド、 167番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配 列番号 10の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 168番 目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号 11の合成オリゴヌク レオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 169番目のァスパラギンを複数種 のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号 12の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補 的な合成オリゴヌクレオチド、 170番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設 計した配列番号 13の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド 、 171番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号 14の合成オリ ゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 172番目のパリンを複数種 のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号 15の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補 的な合成オリゴヌクレオチド、 329番目のパリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設 計した配列番号 16の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド 、 330番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号 17の合成 オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 331番目のァラニンを複 数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号 18の合成オリゴヌクレオチド、 551番 目のパリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号 19の合成オリゴヌク レオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、 QuickChange™Site-Direct ed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、そのプロトコールに従って、変異操 作を行い、 グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型 FADGDH変異プ ラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調整した。
[0067] 実施例 4で調整したプラスミドで市販の大腸菌コンビテントセル (E.coli DH5a ; TOY OBO社製)を形質転換した後、実施例 3と同様に粗酵素液を調製した。
[0068] 上記の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ 活性を測定した。また、同粗酵素液を 50°Cで 15分間加熱処理した後、グルコースデヒ ドロゲナーゼ活性を測定し、 16種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これら 16 種の改変体をコードするプラスミドを、 pAOGDH-M4、 pAOGDH_M5、 pAOGDH-M6 、 pAOGDH- M7、 pAOGDH- M8、 pAOGDH- M9、 pAOGDH- M10、 pAOGDH- Mi l、 p AOGDH- M12、 pAOGDH- M13、 pAOGDH- M14、 pAOGDH- M15、 pAOGDH- M16、 pAOGDH-M17、 pAOGDH_M18、 pAOGDH— M19と命名した。
[0069] pAOGDH- M4、 pAOGDH- M5、 pAOGDH- M6、 pAOGDH- M7、 pAOGDH- M8、 pA OGDH- M9、 pAOGDH- M10、 pAOGDH- Ml l、 pAOGDH- M12、 pAOGDH- M13、 pA OGDH- M14、 pAOGDH- M15、 pAOGDH- M16、 pAOGDH- M17、 pAOGDH- M18、 p AOGDH-M19の変異箇所を同定するために DNAシークェンサ一 (ABI PRISMTM 370 0DNA Analyzer;Perkin-Elmer製)でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子 の塩基配列を決定した結果、 pAOGDH-M5で配列番号 2記載の 160番目のグリシン がプロリン、 pAOGDH_M6では 163番目のグリシンがリジン、 pAOGDH_M7では 163番 目のグリシンがロイシン、 pAOGDH_M8では 163番目のグリシンがアルギニン、 pAOG DH- M9では 167番目のセリンがァラニン、 pAOGDH- M10では 167番目のセリンがプロ リン、 pAOGDH- Mi lでは 167番目のセリンがアルギニン、 pAOGDH- M12では 167番 目のセリンがバリン、 pAOGDH_M13では 171番目のセリンがプロリン、 pAOGDH-M14 では 551番目のバリンがァラニン、 pAOGDH_M15では 551番目のバリンがシスティン、 pAOGDH- M16では 551番目のバリンがスレオニン、 pAOGDH- M17では 551番目のバ リンがグノレタミン、 pAOGDH- M18では 551番目のバリンがセリン、 pAOGDH_M19では 551番目のパリンがチロシンに置換されていることが確認された。結果を表 2に示す。
[表 2]
Figure imgf000029_0001
実施例 5：多重栾 II体の作製 熱安定件
pAOGDH-ΜΙΟのプラスミドを铸型として、 160番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置 換するよう設計した配列番号 20の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリ ゴヌクレオチド、 161番目のトリブトファンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した 配列番号 21の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 162 番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号 22の合成オリゴヌ クレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 163番目のグリシンを複数種の アミノ酸に置換するよう設計した配列番号 23の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的 な合成オリゴヌクレオチド、 164番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計し た配列番号 24の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 16 5番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号 25の合成オリ ゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 166番目のァラニンを複数 種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号 26の合成オリゴヌクレオチドとそれに相 補的な合成オリゴヌクレオチド、 168番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう 設計した配列番号 27の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオ チド、 169番目のァスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号 28 の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 170番目の口イシ ンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号 29の合成オリゴヌクレオチドと それに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 171番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換 するよう設計した配列番号 30の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌ クレオチド、 172番目のパリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号 31 の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 329番目のバリン を複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号 32の合成オリゴヌクレオチドとそ れに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 330番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換 するよう設計した配列番号 33の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌ クレオチド、 331番目のァラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号 34の合成オリゴヌクレオチド、 551番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設 計した配列番号 35の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド を基に、 QuickChange™Site- Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、 そのプロトコールに従って、変異操作を行い、 グルコースデヒドロゲナーゼの生産能 を有する、改変型 FADGDH変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミド を調製した。
pAOGDH-M15のプラスミドを铸型として、 163番目のグリシンを複数種のアミノ酸に 置換するよう設計した配列番号 36の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成ォ リゴヌクレオチドを基に、 QuickChange™Site-Directed Mutagenesis it(STRATAGEN E製)を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、 グルコースデヒドロゲナ ーゼの生産能を有する、改変型 FADGDH変異プラスミドを作製し、上記方法により同 様にプラスミドを調製した。
[0073] 実施例 4で調整したプラスミドで市販の大腸菌コンビテントセル (E.coli DH5a ; TOY OBO社製)を形質転換した後、実施例 3と同様に粗酵素液を調製した。
[0074] 上記の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ 活性を測定した。また、同粗酵素液を 50°Cで 15分間加熱処理した後、グルコースデヒ ドロゲナーゼ活性を測定し、 57種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これら 57 種の改変体をコードするプラスミドを、 pAOGDH-M20、 pAOGDH_M21、 pAOGDH-M 22、 pAOGDH- M23、 pAOGDH- M24、 pAOGDH- M25、 pAOGDH- M26、 pAOGDH- M27、 pAOGDH— M28、 pAOGDH— M29、 pAOGDH— M30、 pAOGDH— M31、 pAOGDH -M32、 pAOGDH- M33、 pAOGDH- M34、 pAOGDH- M35、 pAOGDH- M36、 pAOGD H-M37、 pAOGDH— M38、 pAOGDH— M39 pAOGDH— M40、 pAOGDH— M41、 pAOGD H-M42、 pAOGDH- M43、 pAOGDH- M44、 pAOGDH- M45、 pAOGDH- M46、 pAOG DH-M47、 pAOGDH— M48、 pAOGDH— M49、 pAOGDH— M50、 pAOGDH— M51、 pAO GDH-M52, pAOGDH- M53、 pAOGDH- M54、 pAOGDH- M55、 pAOGDH- M56、 pA OGDH- M57、 pAOGDH- M58、 pAOGDH- M59、 pAOGDH- M60、 pAOGDH- M61、 p AOGDH- M62、 pAOGDH- M63、 pAOGDH- M64、 pAOGDH- M65、 pAOGDH- M66、 pAOGDH- M67、 pAOGDH- M68、 pAOGDH- M69、 pAOGDH- M70、 pAOGDH- M71 、 pAOGDH- M72、 pAOGDH- M73、 pAOGDH- M74、 pAOGDH- M75、 pAOGDH- M7 6と命名した。
[0075] pAOGDH— M20、 pAOGDH— M21、 pAOGDH— M22、 pAOGDH— M23、 pAOGDH— M2 4、 pAOGDH- M25、 pAOGDH- M26、 pAOGDH- M27、 pAOGDH- M28、 pAOGDH- M 29、 pAOGDH- M30、 pAOGDH- M31、 pAOGDH- M32、 pAOGDH- M33、 pAOGDH- M34、 pAOGDH- M35、 pAOGDH- M36、 pAOGDH- M37、 pAOGDH- M38、 pAOGDH -M39 pAOGDH— M40、 pAOGDH— M41、 pAOGDH— M42、 pAOGDH— M43、 pAOGDH -M44、 pAOGDH- M45、 pAOGDH- M46、 pAOGDH- M47、 pAOGDH- M48、 pAOGD H-M49、 pAOGDH- M50、 pAOGDH- M51、 pAOGDH- M52、 pAOGDH- M53、 pAOG DH-M54, pAOGDH- M55、 pAOGDH- M56、 pAOGDH- M57、 pAOGDH- M58、 pAO GDH-M59, pAOGDH- M60、 pAOGDH- M61、 pAOGDH- M62、 pAOGDH- M63、 pA OGDH- M64、 pAOGDH- M65、 pAOGDH- M66、 pAOGDH- M67、 pAOGDH- M68、 p AOGDH- M69、 pAOGDH- M70、 pAOGDH- M71、 pAOGDH- M72、 pAOGDH- M73、 pAOGDH-M74、 pAOGDH_M75、 pAOGDH- M76の変異箇所を同定するために DNA シークェンサ一 (ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer ； Perkin- Elmer製)でダルコ一 スデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、 PAOGDH-M20 で配列番号 2記載の 160番目のグリシンがグルタミン酸に 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH_M21では 160番目のグリシンがイソロイシンに 167番目のセリンがプロリン、 p AOGDH-M22では 160番目のグリシンがセリングルタミンに 167番目のセリンがプロリン 、 pAOGDH-M23では 160番目のグリシンがグルタミンに 167番目のセリンがプロリン、 p AOGDH- M24では 162番目のセリンがァラニンに 167番目のセリンがプロリン、 pAOGD H-M25では 162番目のセリンがシスティンに 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH-M 26では 162番目のセリンがァスパラギン酸に 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH-M 27では 162番目のセリンがグルタミン酸に 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH-M28 では 162番目のセリンがフエ二ルァラニンに 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH-M 29では 162番目のセリンがヒスチジンに 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH_M30で は 162番目のセリンがロイシンに 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH_M31では 163 番目のグリシンがァスパラギン酸に 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH-M32では 1 64番目のセリンがフエ二ルァラニンに 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH-M33で は 164番目のセリンがスレオニンに 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH_M34では 1 64番目のセリンがチロシンに 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH-M35では 165番 目のロイシンがァラニンに 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH_M36では 165番目 のロイシンがイソロイシンに 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH_M37では 165番目 のロイシンがァスパラギンに 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH-M38では 165番目 のロイシンがプロリンに 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH_M39では 165番目の口 イシン力 Sバリンに 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH_M40では 166番目のァラニン がシスティンに 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH-M41では 166番目のァラニンが イソロイシンに 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH_M42では 166番目のァラニンが リジンに 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH-M43では 166番目のァラニンが口イシ ンに 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH- M44では 166番目のァラニンがメチ才ニン に 167番目のセリンがプロリン、 pAOGDH-M45では 166番目のァラニンがプロリンに 16 7番目のセリンがプロリン、 pAOGDH_M46では 166番目のァラニンがセリンに 167番目 のセリンがプロリン、 pAOGDH-M47では 167番目のセリンがプロリンに 169番目のァス パラギンがリジン、 pAOGDH-M48では 167番目のセリンがプロリンに 169番目のァスパ ラギンがプロリン、 pAOGDH-M49では 167番目のセリンがプロリンに 169番目のァスパ ラギンがチロシン、 pAOGDH-M50では 167番目のセリンがプロリンに 169番目のァス パラギンがトリプトファン、 pAOGDH-M51では 167番目のセリンがプロリンに 170番目 のロイシンがシスティン、 pAOGDH_M52では 167番目のセリンがプロリンに 170番目の ロイシンがフエ二ルァラニン、 pAOGDH_M53では 167番目のセリンがプロリンに 171番 目のロイシンがイソロイシンに、 pAOGDH_M54では 167番目のセリンがプロリンに 171 番目のロイシンがリジン、 pAOGDH-M55では 167番目のセリンがプロリンに 171番目の ロイシン力 Sメチォニン、 pAOGDH-M56では 167番目のセリンがプロリンに 171番目の口 イシンがグルタミン、 pAOGDH-M57では 167番目のセリンがプロリンに 171番目のロイ シンがバリン、 pAOGDH-M58では 167番目のセリンがプロリンに 172番目のバリンがァ ラニン、 pAOGDH-M59では 167番目のセリンがプロリンに 172番目のバリンがシスティ ンに、 pAOGDH-M60では 167番目のセリンがプロリンに 172番目のバリンがグルタミン 酸、 pAOGDH-M61では 167番目のセリンがプロリンに 172番目のバリンがイソロイシン 、 pAOGDH-M62では 167番目のセリンがプロリンに 172番目のバリンカ Sメチォニン、 pA OGDH-M63では 167番目のセリンがプロリンに 172番目のバリンがシスティン、 pAOG DH-M64では 167番目のセリンがプロリンに 172番目のバリンがグルタミン酸、 pAOGD H-M65では 167番目のセリンがプロリンに 172番目のバリンがトリプトファン、 pAOGDH -M66では 167番目のセリンがプロリンに 172番目のバリンがにチロシン、 pAOGDH-M 67では 167番目のセリンがプロリンに 329番目のバリンがグルタミン、 pAOGDH_M68で は 167番目のセリンがプロリンに 331番目のァラニンがシスティン、 pAOGDH-M69では 167番目のセリンがプロリンに 331番目のァラニンがァスパラギン酸、 pAOGDH-M70で は 167番目のセリンがプロリンに 331番目のァラニンがイソロイシン、 pAOGDH-M71で は 167番目のセリンがプロリンに 331番目のァラニンがリジン pAOGDH-M72では 167番 目のセリンがプロリンに 331番目のァラニンがロイシン、 AOGDH-M73では 167番目の セリンがプロリンに 331番目のァラニンがメチォニン、 pAOGDH- M74では 167番目の セリンがプロリンに 331番目のァラニン力 Sパリンに置換されていることが確認された。結 果を表 3に示す。
[表 3]
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000034_0002
実施例 6：ァスペルギルス ·オリゼ由 ¾改栾型 FAD GDHの
改変型 FADGDH生産菌として、 pAOGDH-M10、 pAOGDH-M15、 pAOGDH_M75、 p AOGDH- M76で市販の大腸菌コンビテントセル (E.coli DH5a； TOYOBO社製)を形質 転換した。得られた形質転換体を 10L容ジャーフアーメンターを用いて、 TB培地に培 養温度 25°Cで 24時間培養した。培養菌体を遠心分離で集めた後、 50mMのリン酸 バッファー（pH6. 5)に懸濁し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。これに硫 酸アンモニゥムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた 沈殿を 50mMのリン酸バッファー（ρΗ6· 5)に再溶解させた。そして G— 25セファロ ースカラムによるゲルろ過、 Octyl—セファロースカラムおよび Phenyl—セファロース カラムによる疎水クロマト (溶出条件は共に 25%飽和〜 0%の硫酸アンモニゥム濃度 勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらに G— 25セファロースカラムに よるゲルろ過で硫酸アンモニゥムを除去し改変型 FADGDHサンプルとした。表 4に示 すように精製標品においても熱安定性が向上していることが確認された。
[表 4]
Figure imgf000035_0001
[0079] 実施例 7 : DH安定性
実施例 6で得た精製標品について pH安定性を知るために、 pH3. 5〜8. 5の範囲 の緩衝液（pH3. 5〜6. 3 : 0. 1M酢酸バッファー、 pH6. 3〜7. 3、 0. 1M PIPES ノ ッファー、 pH7. 3—8. 5 : 0. 1Mトリス;^ ノ ッファー、 pH6. 0—7. 7 : 0. 1Mリン 酸バッファー）を調製し、これらを用いて各 GDHを酵素濃度 lU/mlとなるよう希釈し た。希釈液を 25°Cで 16時間インキュベートしてインキュベート前後の活性を比較した 。インキュベート前の活性に対するインキュベート後の活性残存率を示したグラフを 図 1に示す。図 1に示すように pH安定域の幅が広がって!/、ることが確認された。
[0080] 実施例 8：ァスペルギルス ·テレウス由夹 FADGDH遣伝子への栾 導入
我々はァスペルギルス 'ォリゼ由来 GDH遺伝子のクローユングに成功し、その塩基 配列情報を取得している。また、熱安定性を指標としたスクリーニングを実施し、熱安 定性向上に効果のあるアミノ酸部位を同定している。そこで、ァスペルギルス 'ォリゼ 由来 GDHの推定アミノ酸配列とァスペルギルス ·テレウス由来 GDHの推定アミノ酸 配列をァラインさせ、ァスペルギルス'テレウス由来 GDHにおいて、ァスペルギルス' ォリゼ FADGDHで熱安定性向上に効果のあった部位に対応するァミノ残基を同定 した。
[0081] 実験例 6で作製した組換えプラスミド pAtGDH-s2-7を铸型として用い、 116番目のリ ジンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補 的な合成オリゴヌクレオチド、 159番目のグルタミンを複数種のアミノ酸に置換するよう 設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 161番目 のグルタミン酸を複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそ れに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 164番目のァスパラギンを複数種のアミノ酸に 置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチ ド、 166番目のスレオニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌタレ ォチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 167番目のスレオニンを複数種のァ ミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌ クレオチド、 175番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴ ヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 325番目のセリンを複数種の アミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴ ヌクレオチド、 327番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴ ヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、 365番目のグルタミンを複数種 のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリ ゴヌクレオチド、 547番目のパリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリ ゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基 QuickChange™Site-Dire cted Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、そのプロトコールに従って、変異 操作を行い、市販の大腸菌コンビテントセル (E.coli DH5a ; TOYOBO社製)を形質転 換し、アンピシリンを含んだ寒天培地（1%ポリペプトン、 0.5%酵母エキス、 0.5%NaCl、 1. 5%寒天； pH7.3)に塗布した後、 30°Cでー晚培養した。
[0082] 実施例 9：ァスペルギルス ·テレウス由来改変型 FADGDHを含む粗酵素液の調整 得られたコロニーをさらにアンピシリン (100 g/ml)を含んだ LB液体培地に摂取し、 30 °cで一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を 回収し、 50mMのリン酸緩衝液 (pH7.0)中でガラスビーズで該菌体を破砕することによ り粗酵素液を調製した。
[0083] 実施例 10 :熱安定性が向上した変異体のスクリーニング
実施例 9の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナー ゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を 50°Cで 15分間加熱処理した後、グルコース デヒドロゲナーゼ活性を測定した。
[0084] これら FADGDHの遺伝子配列については、 DNAシークェンサ一 (ABI PRISMTM 3 700DNA Analyzer;Perkin-Elmer製)により配列確認を実施した。加熱処理前の活性 に対する加熱処理後の残存活性率（％)を表 5に示した。この結果より、組換え体を 用いて熱安定性が向上したァスペルギルス'テレウス由来グルコースデヒドロゲナー ゼを取得すること可能となった。
[0085] [表 5]
変異アミノ酸 50°Cxl5min 残存率 (％)
K116D 38
K116G 39
K116L 44
K116F 63
K116Q 42
Q159A 44
Q159K 76
Q159N 54
Q159P 44
Q159V 44
Q159L 35
E161C 52
N164Y 58
N164V 83
N164C 48
T166F 88
T166Y 84
T166W 77
T167L 50
T167V 61
T167S 43
G175K 43
S325A 44
S325G 35
S325K 45
S325Q 40
S325R 38
S325T 41
S325V 36
S325Y 36
S327E 35
Q365R 35
V547S 71
V547C 44
V547A 87
V547Q 73 改変前 28 [0086] また、種々の糖類に対する基質特異性につ!/、ては、上記の活性測定方法に従!/、、 酵素活性を測定した。グルコースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値とそれ に代えて同じモル濃度の比較対象の糖類 (例えばマルトース）を基質溶液とした場合 の脱水素酵素活性値を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を 100とした 場合の相対値を求めた。
[0087] 上記で得られた種々の変異体の基質特異性は良好であった。
[0088] 実施例 11： FADGDH遺伝子 の変異導入
野生型 FADGDHをコードする遺伝子（配列番号 1)を含む組み換えプラスミド pAOGD H-S2で市販の大腸菌コンビテントセル (E.coli DH5 -； TOYOBO社製)を形質転換した 後、形質転換体をアンピシリン (50 · g/ml;ナカライテスタ社製)を含んだ液体培地（ 1%ポ リペプトン、 0.5%酵母エキス、 0.5%NaCl ;pH7.3)を摂取し、 30°Cでー晚振とう培養して 得られた菌体から、常法によりプラスミドを調整した。該プラスミドを铸型として 53番目 のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号 49の合成オリゴヌク レオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、 QuickChange™Site-Direct ed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、そのプロトコールに従って、変異操 作を行い、 グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型 FADGDH変異プ ラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
[0089] 列 12 :己ケ FADGDH» す effiii薪夜の言周製
実施例 2で調整したプラスミド pAOGDH-S2で市販の大腸菌コンビテントセル (E.coli D Η5 ·； TOYOBO社製)を形質転換した後、形質転換体をアンピシリンを含んだ寒天培 地（1%ポリペプトン、 0.5%酵母エキス、 0.5%NaCl、 1.5%寒天； ρΗ7·3)に塗布した後、 30 °Cでー晚振とう培養して得られたコロニーをさらにアンピシリン (100 g/ml)を含んだ L B液体培地に摂取し、 30°Cで一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離 によって得られた菌体を回収し、 50mMのリン酸緩衝液 (ρΗ7·0)中でガラスビーズで該 菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
[0090] 実施例 13：某晳特異性が向上した変異体のスクリーニング
実施例 3の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースならびにキシロ 一スを基質として活性を測定したところ、 7種の基質特異性が向上した変異体を取得 した。これら 7種の改変体をコードするプラスミドを pAOGDH-Ml、 pAOGDH_M2、 pA OGDH— M3、 pAOGDH— M4、 pAOGDH— M5、 pAOGDH— M6、 pAOGDH— M7と命名し た。
[0091] pAOGDH— Ml、 pAOGDH— M2、 pAOGDH— M3、 pAOGDH— M4、 pAOGDH— M5、 pA OGDH-M6, pAOGDH-M7の変異箇所を同定するために DNAシークェンサ一 (ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer;Perkin- Elmer製)でグルコースデヒドロゲナーゼをコ一 ドする遺伝子の塩基配列を決定した結果、 pAOGDH-Mlで配列番号 2記載の 53番 目のグリシンがシスティン、 pAOGDH-M2で配列番号 2記載の 53番目のグリシンがヒ スチジン、 pAOGDH_M3で配列番号 2記載の 53番目のグリシンがリジン、 pAOGDH- M4で配列番号 2記載の 53番目のグリシンがメチォニン、 pAOGDH-M5で配列番号 2 記載の 53番目のグリシンがァスパラギン、 pAOGDH-M6で配列番号 2記載の 53番目 のグリシンがスレオニン、 pAOGDH-M7で配列番号 2記載の 53番目のグリシンがバリ ンに置換されて!/、ることが確認された。結果を表 1に示す。
[0092] [表 6]
Figure imgf000040_0001
[0093] 実施例 14 :某晳特異性、及び/または、熱安定性が向上した変異体の作鍵
実施例 13で調整したプラスミド pAOGDH_M2を铸型として、 164番目のセリンをプロリ ンに置換するよう設計した配列番号 50の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な 合成オリゴヌクレオチド、 pAOGDH-M5を铸型として、 164番目のセリンをプロリンに 置換するよう設計した配列番号 50の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成 オリゴヌクレオチド、 pAOGDH-M2を鍀型として、 163番目のグリシンをアルギニンに 置換するよう設計した配列番号 51の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成 オリゴヌクレオチド、さらに 551番目のパリンをシスティンに置換するよう設計した配列 番号 52の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチドをもとに 実施例 2の方法と同様に変異操作を行い、基質特異性、及び/または、熱安定性に 優れた改変型 FADGDHを作製し上記の方法と同様にプラスミドを調整した。変異箇 所を同定するため実施例 4の方法と同様に DNAシークェンサ一 (ABI PRISMTM 3700 DNA Analyzer;Perkin-Elmer製)でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の 塩基配列を決定した結果、 pAOGDH-M8で配列番号 2記載の 53番目のグリシンがヒ スチジンに、 167番目のセリンがプロリンに、 pAOGDH-M9で配列番号 2記載の 53番 目のグリシンがァスパラギンに、 167番目のセリンがプロリンに、 pAOGDH-ΜΙΟで酉己 列番号 2記載の 53番目のグリシンがァスパラギンに、 163番目のグリシンがアルギニ ンに、 551番目のパリンがシスティンに置換していることが確認された。実施例 4と同 様の活性測定法により、グルコースならびにキシロースを基質として活性を測定したと ころ、 pAOGDH- M8、 pAOGDH- M9、 pAOGDH- MIOは基質特異性が向上している ことが確認された。熱安定性を測定するため実施例 3の方法と同様に、 pAOGDH-M 8、 pAOGDH_M9、 pAOGDH_M10の粗酵素液を調整し、上述した活性測定法により グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を 50°Cで 15分間加熱 処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、 pAOGDH-M8、 pAOGDH- M9、 pAOGDH-ΜΙΟは熱安定性が向上していることが確認された。結果を表 2に示 す。
[0094] [表 7]
Figure imgf000041_0001
[0095] 実施例 15：改栾型 FADGDHの敗得
改変型 FADGDH生産菌として、 pAOGDH- M8、 pAOGDH- M9、 pAOGDH- MIOで巿 販の大腸菌コンビテントセル (E.coli DH5 -； TOYOBO社製)を形質転換した。得られた 形質転換体を 10L容ジャーフアーメンターを用いて、 TB培地に培養温度 25°Cで 24 時間培養した。培養菌体を遠心分離で集めた後、 50mMのリン酸バッファー（pH6. 5)に懸濁し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニゥムを 飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を 50mMのリ ン酸バッファー（ρΗ6· 5)に再溶解させた。そして G— 25セファロースカラムによるゲ ノレろ過、 Octyl—セファロースカラムおよび Phenyl—セファロースカラムによる疎水ク 口マト（溶出条件は共に 25%飽和〜 0%の硫酸アンモニゥム濃度勾配をかけてピー クフラクシヨンを抽出）を実施し、さらに G— 25セファロースカラムによるゲルろ過で硫 酸アンモニゥムを除去し改変型 FADGDHサンプルとした。表 3に示すように精製標品 にお!/、ても熱安定性が向上して!/、ることが確認された。
[表 8]
Figure imgf000042_0001
産業上の利用可能性
本発明により、 FAD— GDHにおいて熱安定性向上に関与しているアミノ酸残基を 見出すことができ、あらゆる属、種の FAD— GDHにもあてはまる可能が示された。ま た、本発明による FADGDHの安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースァ ッセィキット及びグルコースセンサー作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使 用量低減や測定精度の向上を可能にし、医療関連分野などの産業に貢献するところ 大である。

Claims

請求の範囲
[1] 野生型のァスペルギルス'ォリゼ由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性ダル コースデヒドロゲナーゼ（FADGDH)よりも熱安定性が向上した改変型 FADGDHで あって、配列番号 2のアミノ酸配列における 163位および/または 551位、もしくは、 それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、熱安定性が向上した改変型 FAD GDH。
[2] 野生型のァスペルギルス'ォリゼ由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性ダル コースデヒドロゲナーゼ（FADGDH)よりも基質特異性が向上した改変型 FADGD Hであって、配列番号 2のアミノ酸配列における 53位、もしくは、それと同等の位置に おいてアミノ酸置換を有する、基質特異性が向上した改変型 FADGDH。
[3] 野生型のァスペルギルス .テレウス由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グ ルコースデヒドロゲナーゼ（FADGDH)よりも熱安定性が向上した改変型 FADGDH であって、酉己歹 IJ番号 46において、 116位、 159位、 161位、 164位、 166位、 167位 、 175位、 325位、 327位、 365位及び 547位、力、らなる群のうちいずれ力、、もしくは それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、熱安定性が向上した改変型 FAD GDH。
[4] 請求項 1〜3のいずれかに記載の改変型 FADGDHをコードする遺伝子。
[5] 請求項 4に記載の遺伝子を含むベクター。
[6] 請求項 5に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
[7] 請求項 6に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型 FADGDHの製 造方法。
[8] 請求項 1〜3のいずれかに記載の改変型 FADGDHを含むグルコースアツセィキッ 卜。
[9] 請求項 1〜3のいずれかに記載の改変型 FADGDHを含むグルコースセンサー。
[10] 請求項 1〜3のいずれかに記載の改変型 FADGDHを含むグルコース測定法。
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