WO2007063903A1 - 新規ペプチド化合物 - Google Patents

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WO2007063903A1
WO2007063903A1 PCT/JP2006/323827 JP2006323827W WO2007063903A1 WO 2007063903 A1 WO2007063903 A1 WO 2007063903A1 JP 2006323827 W JP2006323827 W JP 2006323827W WO 2007063903 A1 WO2007063903 A1 WO 2007063903A1
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group
peptide
cancer
antigen
pharmaceutically acceptable
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PCT/JP2006/323827
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English (en)
French (fr)
Inventor
Toshio Nishihara
Masashi Gotoh
Original Assignee
International Institute Of Cancer Immunology, Inc.
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.
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    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production

Definitions

  • the present invention relates to a novel peptide compound that belongs to the field of cancer vaccine therapy and is useful as a cancer immunotherapeutic agent. More specifically, the present invention relates to a WT1-derived cancer antigen peptide derivative that has CTL-inducing activity in vivo and is useful as a cancer vaccine.
  • CTL cytotoxic T cells
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • cancer antigenic peptides that bind to MHC class I molecules are 8 to 12 residues generated by protein degradation in cells. That is, in general, a partial peptide having 8 to 12 residues of a cancer antigen protein may be used as a cancer antigen peptide. In this case, if a glutamine residue or a cysteine residue is contained in the antigen peptide, these amino acid residues are usually naturally oxidized in the air. As a result, it has been reported that the binding to the peptide's original MHC class I molecule and the recognition by the T cell receptor are lowered (see Non-Patent Documents 1 and 2).
  • the tumor suppressor gene WT1 for Wilms tumor is one of the causative genes of Wilms cancer from the analysis of WAGR syndrome, which is associated with Wilms cancer, achromatic, urogenital abnormality, mental retardation, etc. It is a gene isolated from chromosome 11 ⁇ 13, and its amino acid sequence is known (see Non-Patent Document 3).
  • the WT1 gene is highly expressed in human leukemia, and the treatment of leukemic cells with WT1 antisense oligomers suppresses the proliferation of the cells, suggesting that the WT1 gene promotes leukemia cell proliferation. Has been.
  • the WT1 gene is highly expressed in solid cancers such as gastric cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, and ovarian cancer. It was found to be a new cancer antigen protein in leukemia and solid cancer (see Non-Patent Documents 4 and 5). Furthermore, a cancer antigen peptide having a partial sequence ability of the WT1 protein, that is, a natural type cancer antigen peptide was identified (see Patent Documents 1 and 2).
  • WT1 Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu; SEQ ID NO: 1
  • WT1 HLA-A24 Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu; SEQ ID NO: 1
  • the natural peptide and the modified peptide have a cysteine residue at the N-terminus, and are oxidized in the air to form a dimer via a disulfide bond.
  • the dimer is also a cancer.
  • There is a power to be an antigenic peptide see Patent Document 4).
  • Patent Document 1 International Publication No. 00Z06602 Pamphlet
  • Patent Document 2 Pamphlet of International Publication No. OOZ18795
  • Patent Literature 3 Pamphlet of International Publication No. 02Z079253
  • Patent Document 4 International Publication No. 2004Z063217 Pamphlet
  • Non-Patent Document 1 Immunity., 6: 273, 1997
  • Non-Patent Document 2 J. ImmunoL, 160: 2099, 1998
  • Non-Patent Document 3 Cell, 60: 509, 1990
  • Non-Patent Document 4 J. Immunol, 164: 1873-80, 2000
  • Non-Patent Document 5 J. Clin. Immunol, 20, 195-202, 2000
  • Non-Patent Document 6 Clin. Cancer. Res. 8: 2626, 2002
  • the problem to be solved by the present invention is to show CTL-inducing activity in vivo, and a cancer vaccine. It is to provide a novel peptide compound used in cancer immunotherapy.
  • the inventors have developed WT1 protein-derived cancer antigen peptide, WT1 or WT1 (2M
  • HLA-A2402ZKb transgeneic mouse (refer to WO 02/47474, hereinafter also referred to as HLA-A24 mouse). Examined.
  • the present inventors succeeded in obtaining a peptide compound having excellent physical properties and stability.
  • the peptide compound of the present invention has excellent immunogenicity and exhibits excellent CTL inducing activity.
  • peptide-specific T cells derived from the peptide compounds of the present invention are cross-reactive with the natural peptide (WT1) inherent in cancer cells, and are therefore useful as cancer immunotherapeutic agents.
  • cysteine residues of WT1 antigen peptide WT1 and WT1 (2M ⁇ Y) are modified.
  • the power of the modified (modified) peptide compound to maintain the immunogenicity that can be a cancer antigen is completely unknown.
  • the inventors of the present invention for the first time are the thiol groups of the N-terminal cysteine residue. It was also found that a modified product obtained by condensing cysteine, dartathione, or a thiol group of thioglycolic acid with a disulfide bond can be an excellent cancer antigen.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • the present invention provides:
  • Y and Z each independently represent a single bond or a divalent group of a peptide having an amino acid strength of 1 to 10 residues;
  • R 1 represents a hydrogen atom or an alkyl group
  • R 2 represents a hydroxyl group, an amino group, an alkylamino group or a dialkylamino group
  • R 3 represents a hydrogen atom, an alkyl group, an amino group, an alkylamino group, a dialkylamino group, or a substituted or unsubstituted alkylcarboamino group;
  • R 4 is a hydrogen atom, an alkyl group, a carboxy group, a force ruberamoyl group, an alkyl force rubamoyl group, a dialkyl force ruberamoyl group, or the formula (2):
  • n 1 or 2
  • n an integer of 0-2.
  • R 3 represents a hydrogen atom or an alkyl group.
  • R 3 is a substituted alkylcarbo-amino group, a carboxy group, an amino group, an alkylamino group, and a dialkylamino group, which is an alkylcarbo-amino group substituted with one or two selected substituents. 1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof;
  • R 3 is a hydrogen atom or formula (3):
  • R 4 is a carboxy group or a formula (2 ′):
  • R 3 is a group represented by the formula (3):
  • X ′ represents a tyrosine residue or a methionine residue
  • R 1 represents a hydrogen atom or an alkyl group
  • R 2 ′ represents a hydroxyl group, an amino group, an alkylamino group, or a dialkylamino group
  • R 3 ′ Is an amino group, an alkylamino group, a dialkylamino group, or a substituted or unsubstituted alkyl group.
  • R 4 ′ represents a carboxy group, a strong rubamoyl group, an alkyl strong rubamoyl group or a dialkylcarbamoyl group.
  • [16] A method for treating or preventing cancer, the compound represented by any one of [1] to [6] or a pharmaceutically acceptable salt thereof, the antigen-presenting cell according to [8] or [9]
  • a method comprising administering an effective amount for treating or preventing CTL according to any one of [11] to an HLA-A24-positive and WT1-positive cancer patient in need thereof; About.
  • a novel peptide compound useful as a cancer immunotherapeutic agent more specifically, a WT1-derived cancer antigen having CTL-inducing activity in vivo and effective as a cancer vaccine. It became.
  • This peptide is the N-terminal cis of WT1 and WT1 (2M ⁇ Y)
  • the mercapto group of tin is modified in a form that retains its activity as a cancer antigen peptide, and is excellent in physical properties and stability, so that it can be widely used in treatment and research.
  • the novel peptide of the present invention has an advantage that, for example, it is easy to handle without fear of a decrease in activity during in vitro treatment, and can exhibit a stable therapeutic effect.
  • FIG. 1 shows the cytotoxic activity (Specific Lysis) of the peptide compound of Example 1 for each of three mice (black bar in the figure). In the figure, white bars indicate the results of peptide non-pulse (the same applies hereinafter).
  • FIG. 2 shows the cytotoxic activity (Specific Lysis) of the peptide compound of Example 2 for each of three mice.
  • FIG. 3 shows the cytotoxic activity (Specific Lysis) of the peptide compound of Example 3 for each of three mice.
  • FIG. 4 is a graph showing the cytotoxic activity (Specific Lysis) of the peptide compound of Example 4 for each of three mice.
  • FIG. 5 is a graph showing the cytotoxic activity (specific lysis) of the peptide compound of Example 5 for each of three mice.
  • FIG. 6 shows the cytotoxic activity (specific lysis) of the peptide compound of Example 6 for each of three mice.
  • FIG. 7 shows the dose-dependent cytotoxic activity (Specific Lysis) of the peptide compound of Example 1.
  • the X-axis shows the dose per litter (600 g, 200 / zg, 60 ⁇ g, and 20 / zg), and the Y-axis shows the cytotoxic activity (Specific Lysis).
  • 3 mice are used and the mean cytotoxic activity and standard deviation (SD) are shown.
  • FIG. 8 shows the reactivity of peptide-specific T cells obtained by immunizing mice with the peptide conjugate of Example 1 against various peptide pulse cells. In the figure, the shaded bars show the results using cells pulsed with natural peptide (WT1), and the black bars show the results of Example 1.
  • results using cells pulsed with a chido compound are shown, and the white bars show the results using cells pulsed with an influenza-derived peptide. Moreover, the vertical axis
  • FIG. 9 is a graph showing the reactivity of peptide-specific sputum cells in which human PBMC force was also induced by stimulation of the peptide of Example 1 with respect to various peptide pulse cells.
  • “natural peptide” is the result of using cells pulsed with natural peptide (WT1), and “modified peptide”.
  • “Peptide” indicates the results obtained using cells pulsed with the peptide compound of Example 1, and “Peptide non-pulsed” indicates results obtained using cells not pulsed with peptides.
  • the vertical axis in the figure indicates the amount of IFN- ⁇ produced.
  • Trp Tryptophan residue
  • amino acid residue examples include a natural or non-natural ex-amino acid residue, ⁇ amino acid residue, ⁇ -amino acid residue, or ⁇ amino acid residue.
  • natural (X-amino acids specifically, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val
  • X-amino acids specifically, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val
  • homoserine residue homocystine residue
  • ⁇ -alanine ⁇ aminobutanoic acid or ⁇ aminopentanoic acid.
  • amino acid residue When the amino acid residue may have an optical isomer, it may be either L-form or D-form, but L-form is preferred.
  • amino acid sequence of a peptide compound is described according to a conventional method such that the first amino acid residue is located on the left side and the C-terminal amino acid residue is located on the right side.
  • the first aspect of the present invention relates to the compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • X in formula (1) preferably represents a tyrosine residue (Tyr).
  • the “bivalent group of the peptide having 1 to 10 amino acid residues” in Y and Z is the same or different, 1 to 2 of the peptide having the amino acid residue of L0 residue.
  • the amino acid sequence is not particularly limited. Specific examples include amino acid sequences constituting human WTl (Cell, 60: 509, 1990, GenBank Ac No. A38080).
  • Y includes the following 10-residue peptides that also have positions 225 to 234 in human WT1: Asn- Leu- Tyr- Gin- Met- Thr- Ser- Gin- Leu- Glu (SEQ ID NO: 3) or the SEQ ID NO No .: The divalent group of a peptide lacking 1 to 9 amino acid residues at the N-terminus from the peptide represented by 3.
  • the following 10-residue peptide that also has positions 244 to 253 of human WT1 Gly-Ala-Thr-Leu-Lys-Gly-Va-Ala-Ala-Gly (SEQ ID NO: 4 Or a divalent group of a peptide in which the C-terminal 1 to 9 amino acid residues are deleted from the peptide represented by SEQ ID NO: 4.
  • Y and Z preferably represent a single bond.
  • examples of the alkyl group include linear or branched alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms. Specific examples include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a 1 methylethyl group, a butyl group, a 1 methylpropyl group, a 2-methylpropyl group, a 1,1-dimethylethyl group, and a pentyl group.
  • examples of the alkylamino group include linear or branched alkylamino groups having 1 to 6 carbon atoms. Specifically, methylamino group, ethylamino group, propylamino group, 1-methylethylamino group, butylamino group, 1 methylpropylamino group, 2-methylpropylamino group, 1,1-dimethylethylamino group And a pentylamino group.
  • examples of the dialkylamino group include an amino group substituted with two identical or different linear or branched alkyls having 1 to 6 carbon atoms. Specific examples include a dimethylamino group, an ethylmethylamino group, a jetylamino group, a dipropylamino group, a methylpropylamino group, a butylmethylamino group, and a methylpentylamino group.
  • examples of the “alkyl” in the alkylcarbo-lumino group include the same alkyl groups as described above.
  • Examples of the “alkyl” in the alkyl strength ruberamoyl group include the same alkyl as in the alkylamino group.
  • Examples of the “alkyl” in the dialkylcarbamoyl group include the same alkyls in the dialkylamino group, and the two alkyls may be the same or different.
  • R 1 and R 2 preferably represent a hydrogen atom.
  • R 3 represents a substituted alkylcarbo-amino group
  • substituents include a carboxy group, a hydroxyl group, an amino group, an alkylamino group, or a dialkylamino group, and 1 to 4 substituents that are the same or different.
  • 1 or 2 may be substituted.
  • the amino acid residue at W in formula (2) is preferably a glycine residue (Gly).
  • peptide compound of the present invention include the following formulas (4) to (9):
  • the peptide compound of the present invention can be produced according to the method described in the examples of this specification or the method used in usual peptide synthesis. Production methods include literature (Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1975: Basics and experiments of peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1985: Continued drug development No. 14 'Peptide synthesis, Hirokawa Shoten, 1991).
  • the Fmoc method or the Boc method can be used to produce a solid phase synthesizer, and the Bc amino acid or Z amino acid can be produced by sequential condensation using a liquid phase synthesis method (Fmoc is 9 fluorenyl).
  • Methoxycarbo group, Boc is t-butoxycarbo- And z represents a benzyloxycarbonyl group).
  • R and R independently represent a protecting group for a hydrogen atom or a mercapto group.
  • examples of the protecting group for the mercapto group include acetamidomethyl group and a trityl group.
  • the compound of formula (1) can be produced by oxidizing the compound of formula (11) and the compound of formula (12) in an inert solvent.
  • the acid oxidation method a known method for forming a disulfide bond may be appropriately selected in normal peptide synthesis. For example, by mixing two intermediates having a mercapto group in an appropriate solvent and oxidizing the mixture. Can be formed.
  • the oxidation method a known oxidation method, for example, an oxidation method such as air oxidation or iodine oxidation can be used.
  • the solvent water, acetic acid, methanol, black mouth form, DMF or DMSO, or a mixture thereof can be used.
  • Oxidation reactions often give mixtures of symmetric and asymmetric disulfide compounds.
  • the target asymmetric disulfide compound can be obtained by purification by various chromatography or recrystallization.
  • a selective disulfide bond can be formed by mixing an intermediate having an activated mercapto group and an intermediate having a mercapto group. Examples of the intermediate having an activated mercapto group include a mercapto group to which an Npys group (3-to-pyridinesulfuryl group) is bonded.
  • a selective disulfide bond is formed by adding the other intermediate in advance after activating the mercapto group by mixing one intermediate in advance with, for example, 2, 2 'dithiobis (5-tropyridine). (Tetrahedron Letters. Vol. 37. No. 9, pp. 134 7-1350).
  • the compound of the formula (11) can be prepared according to a liquid phase or solid phase peptide synthesis method known to those skilled in the art.
  • the N-terminal amino acid residue may be an N-alkyl amino acid protected with a protecting group as necessary, or N 1, N 2 It can be produced using dialkyl amino acids.
  • N alkylamino acids or N, N dialkylamino acids are prepared by methods well known to those skilled in the art, such as using commercially available products, or reacting alkyl halides in the presence of a base using amino acids or protected amino acids as raw materials. can do.
  • an amino acid protected with a t_butoxycarbonyl group is reacted with an alkylo-ride in the presence of a base such as sodium hydride to form an N-terminal amino group. It can be alkylated as appropriate.
  • Hal represents a bromine atom or an iodine atom
  • Prot represents a protecting group
  • an amidated or alkylamidated amino acid can be used as a raw material as the C-terminal amino acid residue used as the raw material.
  • the compounds of the present invention or intermediates for producing them can be purified by methods known to those skilled in the art.
  • it can be purified by various chromatography (for example, silica gel column chromatography, ion exchange column chromatography, gel filtration, or reverse phase chromatography), recrystallization or the like.
  • chromatography for example, silica gel column chromatography, ion exchange column chromatography, gel filtration, or reverse phase chromatography
  • recrystallization solvent an alcohol solvent such as methanol, ethanol or 2-propanol, an ether solvent such as jetyl ether, an ester solvent such as ethyl acetate, an aromatic hydrocarbon solvent such as benzene or toluene.
  • a ketone solvent such as acetone, a hydrocarbon solvent such as hexane, an aprotic solvent such as dimethylformamide or acetonitrile, water, or a mixed solvent thereof can be used.
  • a ketone solvent such as acetone
  • a hydrocarbon solvent such as hexane
  • an aprotic solvent such as dimethylformamide or acetonitrile
  • water or a mixed solvent thereof
  • the compound of the present invention has one or more asymmetric points, it can be produced by using a raw material (amino acid) having the asymmetric point according to a conventional method.
  • optical spectroscopy is performed at an appropriate stage of the production process. You may make a split.
  • an optical resolution method for example, the compound of the present invention or an intermediate thereof in an inert solvent (for example, an alcohol solvent such as methanol, ethanol, or 2-propanol, an ether solvent such as jetyl ether, an ester such as ethyl acetate).
  • Solvents hydrocarbon solvents such as toluene, aprotic solvents such as acetonitrile, and mixed solvents thereof), optically active acids (for example, monocarboxylic acids such as mandelic acid, N-benzyloxylanine, or lactic acid, tartaric acid) , O-diisopropylidene tartaric acid or dicarboxylic acid such as malic acid, or sulfonic acid such as strong sulfonic acid or bromocamphor sulfonic acid), and a diastereomeric method for forming a salt.
  • monocarboxylic acids such as mandelic acid, N-benzyloxylanine, or lactic acid, tartaric acid
  • O-diisopropylidene tartaric acid or dicarboxylic acid such as malic acid
  • sulfonic acid such as strong sulfonic acid or bromocamphor sulfonic acid
  • an optically active amine for example, an organic amine such as ⁇ -phenethylamine, cune, quinidine, cinchidine, cinchonine, strychnine
  • Optical resolution can also be performed by forming a salt.
  • the temperature at which the salt is formed is selected from the range up to the boiling point of the solvent at room temperature. In order to improve the optical purity, it is desirable to raise the temperature to near the boiling point of the solvent. When the precipitated salt is collected by filtration, the yield can be improved by cooling as necessary.
  • the amount of the optically active acid or amine used is in the range of about 0.5 to about 2.0 equivalents, preferably about 1 equivalent, relative to the substrate.
  • Crystals in an inert solvent as necessary for example, alcohol solvents such as methanol, ethanol, 2-propanol, ether solvents such as jetyl ether, ester solvents such as ethyl acetate, hydrocarbon solvents such as toluene) And an aprotic solvent such as acetonitrile and a mixed solvent thereof) to obtain a high purity optically active salt.
  • an aprotic solvent such as acetonitrile and a mixed solvent thereof
  • Examples of the pharmaceutically acceptable salt include acid addition salts and base addition salts.
  • acid addition salts include hydrochlorides, hydrobromides, sulfates, hydroiodides, nitrates, phosphates and other inorganic acid salts, citrates, oxalates, acetates and formates.
  • organic acid salts such as propionate, benzoate, trifluoroacetate, maleate, tartrate, methanesulfonate, benzenesulfonate, paratoluenesulfonate, etc.
  • Organic base salts such as inorganic base salts, triethyl ammonium salts, triethanol ammonium salts, pyridinium salts, diisopropyl ammonium salts, and the like, as well as algin, aspartic acid, and glutamic acid.
  • amino acid salts such as basic or acidic amino acids.
  • the present invention also includes solvates such as hydrates and ethanol solvates of the peptide compound represented by formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Further, the present invention includes a formula (1
  • peptides that lack amino acids, hydrolysis, etc. in the process of condensing optically active ⁇ -amino acids, removing various protecting groups, or cleaving peptides from the resin.
  • Various by-products are produced, such as peptides degraded by oxidation and peptides, and peptides racemized from amino acids.
  • these impurities can be removed to combine high purity peptide peptides by combining various chromatographic methods (eg, silica gel column chromatography, ion exchange column chromatography, gel filtration, or reverse phase chromatography).
  • a compound can be obtained.
  • the peptide compound of the present invention has the property that it can be mass-produced as an active pharmaceutical ingredient even in its physical properties. Specifically, it has properties such as high solubility, excellent stability in solution, or difficulty of gelation when concentrated, and is a large amount in a purification process using column chromatography such as reverse phase HPLC. Even on a scale, a high purity peptide compound can be easily produced as a drug substance.
  • the peptide compound of the present invention is useful as an active ingredient of a CTL inducer in cancer immunotherapy and as an active ingredient of a cancer vaccine. That is, the peptide conjugate of the present invention has excellent immunogenicity and excellent CTL inducing activity as shown in the Examples of the present specification. Surprisingly, the CTL induced by the peptide conjugate of the present invention can recognize the natural peptide of WT1 originally possessed by cancer cells. Therefore, the peptide compound of the present invention is a cancer in which the WT1 gene is expressed, that is, stomach cancer, colon cancer, lung cancer, milk. It can be used as a therapeutic agent or preventive agent (relapse prevention agent) for cancer, germ cell cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer or ovarian cancer.
  • the second aspect of the present invention relates to an antibody that binds specifically to the compound of the present invention represented by formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof (hereinafter sometimes referred to as the antibody of the present invention).
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody using the compound of the present invention as an immunogen without any particular limitation on its form.
  • the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it specifically binds to the compound of the present invention as described above. Specifically, the antibody of the present invention is represented by any one of the above formulas (4) to (9). And an antibody that specifically binds to the compound.
  • the compound of the present invention (for example, a compound represented by any one of formulas (4) to (9)) is used as an immunogen to immunize non-human animals such as rabbits, It can be obtained from the serum of the immunized animal according to a conventional method.
  • a monoclonal antibody it was obtained by immunizing a non-human animal such as a mouse with a compound of the present invention (for example, a compound represented by any of formulas (4) to (9)). It can be obtained from hyperpridoma cells prepared by cell fusion of spleen cells and myeloma cells (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausu bel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4- 11.11).
  • the production of an antibody against the compound of the present invention can also be carried out by enhancing the immunological reaction using various adjuvants depending on the host.
  • adjuvants include Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surfaces such as lysolecithin, pull-mouth polyol, polyion, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin and dinitrophenol.
  • Active substances human adjuvants such as BCG (Bacille Calmette Guerin) and Corynebaterum-Parvum.
  • an antibody that recognizes the compound of the present invention and further an antibody that neutralizes its activity can be easily prepared by appropriately immunizing an animal with the compound of the present invention by a conventional method.
  • Applications of antibodies include affinity chromatography, immunological diagnosis, and the like.
  • the immunological diagnosis can be appropriately selected from immunoblotting, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), fluorescence or luminescence assay.
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA enzyme immunoassay
  • fluorescence or luminescence assay can be performed in cancers that express the WT1 gene, ie gastric cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer. It is effective in the diagnosis.
  • the third aspect of the present invention relates to an antigen-presenting cell on which a complex of the compound of the present invention and HLA-A24 antigen is presented.
  • CTL-inducing activity was observed by administration of the compound of the present invention 1S.
  • Such antigen-presenting cells presenting a complex of the HLA-A24 antigen and the compound of the present invention are effectively used in cell therapy (DC therapy) described later.
  • the antigen-presenting cell of the present invention may be any antigen-presenting cell in which a complex of the compound of the present invention and the HLA-A24 antigen is presented.
  • formula (4) to formula Examples include antigen-presenting cells in which the complex of the compound according to any one of 9) and the HLA-A24 antigen is presented on the cell surface of rod-shaped cells.
  • Antigen-presenting cells used in cell therapy are isolated from cancer patients, and cells having the antigen-presenting ability are isolated and pulsed with the compound of the present invention in vitro, and HLA-A24 It is produced by presenting a complex of an antigen and a compound of the present invention on the cell surface.
  • the “cell having antigen-presenting ability” is not particularly limited as long as it expresses the HLA-A24 antigen capable of presenting the compound of the present invention on the cell surface, but the antigen-presenting ability is not limited.
  • Preferable is a rod-shaped cell, which is considered high.
  • the antigen-presenting cell of the present invention is isolated from, for example, a cancer patient having antigen-presenting ability, Norse the compound of the present invention (for example, the compound described in any one of the formulas (4) to (9)) outside the cell to produce a complex of the HLA-A24 antigen and the compound of the present invention.
  • the compound of the present invention for example, the compound described in any one of the formulas (4) to (9)
  • lymphocytes are isolated from peripheral blood of cancer patients by the Ficoll method, then non-adherent cells are removed, and adherent cells are cultured in the presence of GM-CSF and IL-4.
  • the antigen-presenting cells of the present invention can be prepared by inducing dendritic cells, culturing the cells with the compounds of the present invention, and pulsing them.
  • the antigen-presenting cells of the present invention produced as described above are effectively used in cell therapy (DC therapy) as an CTL inducer and an active ingredient of a cancer vaccine described later.
  • the peptide compound of the present invention is derived from human WT1 and has HLA-A24-restricted CTL-inducing activity (immunogenicity). That is, the fourth aspect of the present invention relates to CTL induced by the peptide compound of the present invention.
  • CTL inducing activity was observed by administration of the compound of the present invention. This is because, in peripheral blood mononuclear cells, there are antigen-presenting cells in which a complex of the compound of the present invention and the HLA-A24 antigen is presented, and CTL that recognizes the cells in which this complex is presented. Indicates that has been induced. Such CTL induced by the peptide compound of the present invention can be effectively used for adoptive immunotherapy described later.
  • the CTL of the present invention may be CTL induced by the peptide compound of the present invention.
  • CTL used in adoptive immunotherapy isolates a patient's peripheral blood lymphocytes from the compound of the present invention (for example, a compound represented by any one of formulas (4) to (9)). It is prepared by stimulating in vitro (Journal of Experimental Medicine 1999, 190: 1669).
  • the CTL of the present invention produced as described above is adopted as an active ingredient of a cancer vaccine. Effectively used for immunotherapy.
  • the compound of the present invention described in the above (1) to (4), the antigen-presenting cell of the present invention, and the CTL of the present invention can be used as a CTL inducer, That is, it can be an active ingredient of a cancer vaccine. This will be specifically described below.
  • Cancer vaccine comprising the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient
  • the compound of the present invention has an ability to induce CTL, and the induced CTL can exert an anticancer action through cytotoxicity or lymphokine production. Therefore, the compound of the present invention can be used as an active ingredient of a cancer vaccine for treating or preventing cancer. That is, the present invention provides a cancer vaccine (pharmaceutical composition as a cancer vaccine) containing the compound of the present invention as an active ingredient.
  • a cancer vaccine pharmaceutical composition as a cancer vaccine
  • the compound of the present invention for example, any one of the formulas (4) to (9) is expressed on the HLA-A24 antigen of the antigen-presenting cell.
  • the cancer vaccine of the present invention is a cancer with an increased expression level of the WT1 gene, for example, blood cancer such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma, gastric cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer. It can be used for the prevention or treatment of solid cancers such as germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer and the like.
  • the present invention provides a method for treating or preventing cancer by administering an effective amount of the cancer vaccine of the present invention to HLA-A24-positive and WT1-positive patients.
  • the cancer vaccine comprising the compound of the present invention as an active ingredient comprises a single cancer antigen peptide, that is, a CTL epitope (for example, a compound represented by any one of formulas (4) to (9)) as an active ingredient.
  • a CTL epitope for example, a compound represented by any one of formulas (4) to (9)
  • CTL epitopes cancer antigen peptides
  • epitopic peptides linked to helper epitopes may be used as active ingredients. That is, in recent years, it has been shown that an epitope peptide in which a plurality of CTL epitopes (antigen peptides) are linked has an efficient CTL inducing activity in vivo.
  • Journal of Immunol ogy 1998, 161: 3186-3194 contains about 30mer of epitope peptide with in vivo binding of cancer antigen protein PSA-derived HLA-A2, -A3, -All, B53-restricted CTL epitope (antigen peptide) It was described that CTLs specific to each CTL epitope were induced. It has also been shown that CTL is efficiently induced by an epitope peptide in which a CTL epitope and a helper epitope are linked.
  • a cancer vaccine comprising the compound of the present invention as an active ingredient can be administered together with a pharmaceutically acceptable carrier, for example, an appropriate adjuvant, or a particulate dosage form so that cellular immunity can be effectively established. Can be administered.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, an appropriate adjuvant, or a particulate dosage form so that cellular immunity can be effectively established.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, an appropriate adjuvant, or a particulate dosage form
  • cell-derived components GM-CSF, interleukin-1 , Interleukin-7 or interleukin-12, etc.
  • plant-derived components GM-CSF, interleukin-1 , Interleukin-7 or interleukin-12, etc.
  • plant-derived components GM-CSF, interleukin-1 , Interleukin-7 or interleukin-12, etc.
  • plant-derived components GM-CSF, interleukin-1 , Interleukin-7 or interleukin-12, etc.
  • plant-derived components e.g., GM-CSF, interleukin-1 , Interleukin-7 or interleukin-12, etc.
  • mineral gels such as aluminum hydroxide
  • surfactants such as lysolecithin, pull mouth nick polyols, -ON, peptide, or oil emulsion (Emulsion formulation).
  • Cell-derived components include lipid A (lipid A), its derivative monophosphoryl lipid A (monophosphoryl lipid A), killed bacteria (including Mycobacterium bacteria such as BCG bacteria), bacteria-derived protein , Polynucleotide), Freund's Incomplete Adjuvant, Freund's Complete Adjuvant, cell wall skeletal components (eg BCG-CWS, etc.), trehalose dimycolate (T DM) and the like.
  • ribosome preparation a particulate preparation bound to beads having a diameter of several meters, a preparation bound to lipid, and the like are also conceivable.
  • Examples of the administration method include intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intravenous administration and the like.
  • the dosage of the compound of the present invention in the preparation can be adjusted as appropriate depending on the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient. Usually 0.0001 mg to 1000 mg, preferably O.OOlmg ⁇ 1000 mg, more preferably 0.1 mg to 10 mg, which is preferably administered once every few days to several months.
  • Cancer vaccine comprising the antigen-presenting cell of the present invention as an active ingredient
  • the present invention provides a cancer vaccine comprising the antigen-presenting cell of the present invention as an active ingredient.
  • lymphocytes have been isolated from the peripheral blood of cancer patients, rod cells are induced, and antigen-presenting cells prepared by pulsing antigen peptides etc. in vitro are returned to the patient by subcutaneous administration.
  • DC therapy has been reported (Cancer Immunol. Immunother., 46: 8 2,1998, J. Immunol., 158: pl796, 1997, Cancer Res., 59: pll84, 1999, Cancer Res., 56 : p 5672, 1996, J. Immunol., 161: p5607, 1998, J. Exp. Med., 184: p465, 1996). Therefore, the antigen-presenting cell of the present invention can be used as an active ingredient of a cancer vaccine in cell therapy.
  • the cancer vaccine comprising the antigen-presenting cells of the present invention as an active ingredient may contain physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), a medium, and the like in order to stably maintain the antigen-presenting cells. I like it.
  • the administration method include intravenous administration, subcutaneous administration, and intradermal administration.
  • the dosage include those described in the above-mentioned literature.
  • the cancer vaccine comprising the antigen-presenting cell of the present invention as an active ingredient is a cancer with an increased expression level of the WT1 gene, for example, hematological cancer such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma, gastric cancer It can be used for the prevention or treatment of solid cancer such as colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer.
  • the present invention provides a cancer vaccine (pharmaceutical composition as a cancer vaccine) comprising the CTL of the present invention as an active ingredient.
  • the CTL of the present invention is effectively used in the following adoptive immunotherapy.
  • a cancer vaccine comprising the CTL of the present invention as an active ingredient is prepared by using physiological saline, phosphate, It preferably contains acid buffered saline (PBS), medium and the like.
  • the administration method include intravenous administration, subcutaneous administration, and intradermal administration. Examples of the dosage include those described in the above literature.
  • the cancer vaccine comprising the CTL of the present invention as an active ingredient is a cancer with an increased expression level of the WT1 gene, for example, hematological cancer such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma, gastric cancer, It can be used for the prevention or treatment of solid cancer such as colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer.
  • the compound of Example 2 correspond to the modified form of WT1 (SEQ ID NO: 1), and are each cis.
  • DIPCI Diisopropylcarbodiimide.
  • the crude peptide solution was charged onto a column equilibrated at a 5% concentration of the two solutions. Thereafter, the liquid 2 concentration was 5% for 10 minutes and 15% for 15 minutes, and then the liquid 2 concentration was increased at a rate of 0.1% per minute. Fractions containing the desired product were collected, and acetonitrile was distilled off under reduced pressure and lyophilized to obtain 300 mg of the desired peptide.
  • the crude peptide solution was charged onto a column equilibrated at a concentration of 2 liquids of 10%. Thereafter, the liquid 2 concentration was 10% for 10 minutes and 17% for 15 minutes, and then the concentration of liquid 2 was increased at a rate of 0.05% per minute. Fractions containing the desired product were collected, and acetonitrile was distilled off under reduced pressure and lyophilized to obtain 107 mg of the desired peptide.
  • the crude peptide solution was charged onto a column equilibrated at a concentration of 2 liquids of 10%. Thereafter, the liquid 2 concentration was 10% for 10 minutes and 17% for 15 minutes, and then the concentration of liquid 2 was increased at a rate of 0.05% per minute. Fractions containing the desired product were collected, and acetonitrile was distilled off under reduced pressure and lyophilized to obtain 18 mg of the desired peptide.
  • the crude peptide solution was charged onto a column equilibrated at a concentration of 2 liquids of 10%. Subsequently, the concentration of the two solutions was 10% at 10%, 15% at 20%, and 15 minutes at 23%, and the concentration of the two solutions was increased at a rate of 0.05% per minute. Fractions containing the desired product were collected, and acetonitrile was distilled off under reduced pressure and freeze-dried to obtain 15 mg of the desired peptide.
  • the crude peptide solution was charged onto a column equilibrated at a concentration of 2 liquids of 10%. Subsequently, the liquid 2 concentration was 10% for 10 minutes and 18% for 15 minutes, and then the liquid 2 concentration was increased at a rate of 0.1% per minute. Fractions containing the desired product were collected, and acetonitrile was distilled off under reduced pressure and lyophilized to obtain 30 mg of the desired peptide.
  • Fmoc-Leu-Alko-Oxal (where Alko represents p-alkoxybenzyl alcohol) 10 g (manufactured by Watanabe Chemical; 0.74 mmol / g) in a 50 ml reactor of Advanced ChemTech ACT90 solid-phase synthesizer After washing the resin with DMF or the like (step 1), treat with 25% piperidine (3 min x 1 and 15 min x 1) and cleave the Fmoc group (step 2) The resin was washed again with DMF or the like (step 6) to remove piperidine.
  • Protected peptide oil obtained by the above operation (Boc-Cys (Boc-Cys-OH) -Tyr (tBu) -Thr (tBu) —Trp (Boc) —Asn (Trt) —Gln (Trt) —Met— 200 ml of a mixture of trifluoroacetic acid / ethanedithiol / water / triisopropylpropylsilane (94 / 2.5 / 2.5 / 1) was added to 22.87 g of Asn (Trt) -Leu-Alko-Resin, and the mixture was stirred at room temperature for 4 hours.
  • the drug using each synthetic peptide was adjusted as follows. That is, the synthetic peptides described in Examples 1 to 3, 5, and 6 were adjusted to 40 mg / ml with DMSO. Thereafter, 32.5 1 was mixed with 540 ⁇ 1 of water for injection. Furthermore, a water-in-oil emulsion was prepared by mixing the 550 ⁇ 1 and 700 ⁇ 1 Freund's incomplete adjuvant (Montanide ISA51) using a glass syringe. The peptide described in Example 4 was adjusted to 50 mg / ml with DMSO, while the helper synthetic peptide (FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE, SEQ ID NO: 5) was adjusted to 20 mg / ml with DMSO to 30 ⁇ m each. 1 was mixed with 540 ⁇ l of water for injection, and then mixed with an equal amount of Freund's incomplete adjuvant (IFA) to prepare a water-in-oil emulsion.
  • IFA Freund's incomplete adjuvant
  • Antigen peptide was pulsed at 100 ⁇ g / ml for 1 hour and seeded in a 24-well plate at 7 ⁇ 10 6 cells / well. At this time, 7xl0 5 / well spleen cells of non-peptide pulse were simultaneously added and cultured in vitro at 37 ° C for 5-6 days.
  • EL4 A2402 obtained by introducing a gene expression vector encoding HLA—A2 402 / Kb into EL-4 cells (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. Catalog No. 06-39) as target cells (T) / Kb cells or EL4—A2402 / Kb cells with antigen peptide: WT1 or WT1 (
  • Example 3 Cells pulsed with WT1 (2M ⁇ Y) were used.
  • FIGS. 1 to 6 correspond to the peptide conjugates of Examples 1 to 6, respectively.
  • the Y-axis indicates cytotoxic activity (Specific Lysis)
  • the X-axis indicates three mouse individuals.
  • the results are shown.
  • the results of the dose dependency test of the compound of Example 1 are shown in FIG. Y-axis shows cytotoxic activity (Specific Lysis)
  • X-axis shows dose per individual (600 ⁇ g, 200 g, g, and 20 g).
  • S.D. standard deviation
  • Example 1 The peptide of Example 1 was adjusted to 40 mgZml with DMSO. After mixing 32.5 1 with 540 ⁇ 1 of injection water, add 550 ⁇ 1 to 700 ⁇ 1 of Freund's incomplete adjuvant ⁇ tanide ISA51® (SEPPIC, Inc, Paris, France) and a glass syringe. Mixed with By doing so, water-in-oil emulsion was produced.
  • the plate was washed according to the attached document, and the number of spots was detected with a KS Elispot Research system (Carl Zeiss).
  • the Elispot method is known as an alternative method for cytotoxicity testing (J. Immunological Methods, 1995, 181, 45-54).
  • the results are shown in FIG. As a result, it was found that the peptide of Example 1 can induce HLA-A24-specific cellular immunity that is cross-reactive with the natural peptide.
  • peripheral blood was collected with a vacuum blood collection tube containing heparin.
  • the blood diluted twice with PBS (-) was layered on half of FicoU-Paque (Amersham Biosciences), and then centrifuged at 2000 rpm for 20 minutes.
  • Cell layers containing peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were collected, and 3-4 times the amount of PBS (-) was added and centrifuged at 1800 rpm for 10 minutes. The cell pellet was further washed twice with PBS (-) to recover PBMC.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Non-adherent cell force was also collected using CD8 + T cell isolation kit II (Miltenyi Biotec) to collect CD8 positive T cells.
  • Adherent cells were cultured for 7 days in a lymphocyte culture medium containing lOOOU / ml GM-CSF and lOOOU / ml IL-4, and the floating cells were collected and antigen-presenting cells containing rod-shaped cells (DC). The fraction was used. The collected cells were stored frozen until used for experiments.
  • the peptide of Example 1 was added with 50 ⁇ g / ml mitomycin.
  • the AIM-V medium was supplemented with 50 ⁇ g / ml, cultured for 1 hour, and pulsed. Thereafter, after washing three times with a medium, the peptide of Example 1 was further added at a concentration of 50 g / ml and pulsed for 1 hour to obtain antigen-presenting cells.
  • Peptide pulse antigen-presenting cells were added to CD8 positive T cells on DayO for the first stimulation, and culture was started in a 24-well plate with lymphocyte cultures containing lOng / ml IL-7.
  • T cells were collected, washed, and then peptide-stimulated with peptide-pulsed antigen-presenting cells as in the first time.
  • IL-2 was added to 50 U / ml.
  • T cells were collected on Dayl4 and stimulated a third time in the same way as the first and second time.
  • IL_2 was added so that it became 50 U / ml.
  • T cells were collected and stored frozen.
  • Fig. 9 shows the results of examining the peptide-specific reactivity of sputum cells stimulated with the synthetic peptide of Example 1.
  • the sputum cells stimulated with the peptide of Example 1 hardly react to cells not pulsed with the peptide, but respond well to the cells pulsed with the peptide described in Example 1 and are peptide specific. It became clear that typical sputum cells were induced.
  • the induced peptide-specific sputum cells are the natural peptide (WT1) and the modified peptide.
  • Fmoc-Leu-Alko-Coffin (where Alko is p-alkoxybenzyl alcohol) 10g (Watanabe Chemical; 0.82mmol / g) in the 500ml reaction tank of ACT90 solid-phase synthesizer made by Advanced ChemTech After washing with DMF, etc. (step 1), treat with 25% Pip (piperidine) (3 min x 1 time and 15 min x 1 time) to cleave the Fmoc group (step 2). ), Again with DMF etc. Wash (Step 1) to remove Pip.
  • Protected peptide oil obtained by the above operation H-Cys (Trt) -Tyr (tBu) -Thr (tBu) -Trp (Boc) —Asn (Trt) —Gln (Trt) — Met— Asn (Trt) — 100 ml of a mixture of trifluoroacetic acid / ethanedithiol / water / triisopropylpropylsilane (94 / 2.5 / 2.5 / 1) was placed in Leu—Alko—Resin lO.Og and stirred for 4 hours at room temperature.
  • the resulting crude peptide solution was purified by reverse phase liquid chromatography.
  • Fmoc-Leu-Alko-Coffin (where Alko is p-alkoxybenzyl alcohol) 10g (manufactured by Watanabe Chemical; 0.81mmol / g) in the 500ml reaction tank of the Advanced ChemTech ACT90 solid-phase synthesizer After washing with DMF, etc. (step 1), treat with 25% Pip (piperidine) (3 min x 1 time and 15 min x 1 time) to cleave the Fmoc group (step 2). ), And again washed the resin with DMF (Step 1) to remove Pip.
  • Alko is p-alkoxybenzyl alcohol
  • Step 1 the washing operation in Step 1 was performed, and Fmoc—Met—OH 15.05 g ⁇ Fmoc—Gln (Trt) —OH 24.73 g ⁇ Fmoc—Asn (Trt) —OH 24.17 g, Fmoc— Trp (Boc) —OH 21.33 g ⁇ Fmoc— Thr (tBu) — OH 16.1 g ⁇ Fmoc— Met— OH 15.05 g, Fmoc- Cys (Trt)-OH 23.72 g were added sequentially, and the cup of step 3 was added. A ring reaction was performed.
  • Protected peptide oil obtained by the above operation H- Cys (Trt)-Met- Thr (tBu)-Trp (Boc) -Asn (Trt) -Gln (Trt)-Met- Asn (Trt)-Leu- Alko -Add 130 ml of trifluoroacetic acid / ethanedithiol / water / triisopropylpropylsilane (94 / 2.5 / 2.5 / 1) mixture to 13.0 g of Resin and stir for 4 hours at room temperature.
  • the resulting crude peptide solution was purified by reverse phase liquid chromatography.
  • the peptide compound of the present invention is useful as an active ingredient of a cancer immunotherapeutic agent.
  • SEQ ID NO: 5 Helper synthetic peptide

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Abstract

　式（１）： 〔式中、Ｘはチロシン残基又はメチオニン残基を表し、Ｙ及びＺは単結合等を表し、Ｒ１は水素原子等を表し、Ｒ２は水酸基等を表し、Ｒ３は水素原子、アルキル基、アミノ基等を表し、Ｒ４は水素原子、アルキル基、カルボキシ基等を表し、ｍは１又は２を表し、ｎは０～２の整数を表す。但し、ｎが０を表わす場合、Ｒ３は水素原子又はアルキル基を表す。〕 で表される新規な化合物、又はその薬学上許容される塩、およびその癌免疫療法における使用。

Description

明 細 書
新規ペプチド化合物
技術分野
[0001] 本発明は、癌ワクチン療法の分野に属し、癌免疫療法剤として有用な新規ペプチド 化合物に関する。詳しくは、イン'ビボで CTL誘導活性を有し、癌ワクチンとして有用 な、 WT1由来の癌抗原ペプチドの誘導体に関する。
背景技術
[0002] 生体による癌細胞やウィルス感染細胞等の排除には、細胞性免疫、とりわけ細胞 傷害性 T細胞（以下、 CTLと称する）が重要な働きをしている。 CTLは、癌細胞上の 癌抗原タンパク質由来の抗原ペプチド（癌抗原ペプチド）と MHC (Major Histocompa tibility Complex)クラス I抗原 (ヒトの場合は HLA抗原と称する）により形成される複合 体を認識し、癌細胞を攻撃 '破壊する。
MHCクラス I分子に結合する癌抗原ペプチドは、細胞内でタンパク質が分解される ことにより生成された 8から 12残基であることが一般に知られている。すなわち、一般 に、癌抗原タンパク質の 8から 12残基の部分ペプチドが癌抗原ペプチドとして用いら れる可能性がある。この場合、抗原ペプチド中にグルタミン残基やシスティン残基が 含まれていると、通常、これらのアミノ酸残基が空気中で自然酸化される。これにより 、ペプチド本来の MHCクラス I分子との結合性や T細胞受容体による認識が低くなる ことが報告されて ヽる (非特許文献 1及び 2を参照)。
[0003] ところで、 Wilms腫瘍の癌抑制遺伝子 WT1 (WT1遺伝子）は、 Wilms癌、無紅彩、 泌尿生殖異常、精神発達遅延などを合併する WAGR症候群の解析から Wilms癌の 原因遺伝子の 1つとして染色体 11ρ13から単離された遺伝子であり、そのアミノ酸配 列は公知である（非特許文献 3を参照)。 WT1遺伝子はヒト白血病で高発現しており 、白血病細胞を WT1アンチセンスオリゴマーで処理するとその細胞増殖が抑制され ることなどから、 WT1遺伝子は白血病細胞の増殖に促進的に働いていることが示唆 されている。更に、 WT1遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、皮膚癌、 膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌においても高発現してお り、白血病及び固形癌における新しい癌抗原タンパク質であることが判明した (非特 許文献 4及び 5を参照)。更に、 WT1タンパクの部分配列力もなる癌抗原ペプチド、 すなわち天然型の癌抗原ペプチドが同定された (特許文献 1及び 2を参照)。
[0004] 具体的には、癌抗原タンパク質 WT1の第 235位—第 243位よりなるペプチドである WT1 (Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu；配列番号： 1)は、 HLA-A24
235-243
拘束性の CTL誘導活性を有する癌抗原ペプチドである（非特許文献 6及び特許文献 1を参照)。この WT1 の第 2位のメチォニン残基をチロシン残基に改変した改変
235-243
ペプチド（Cys- Tyr- Thr- Trp- Asn- Gin- Met- Asn- Leu；配列番号： 2、以下当該改変 ペプチドを WT1 (2M→Y)と称する場合もある）は、天然型ペプチドに比べて HLA
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-A24抗原への高 ヽ結合性を有して!/ヽる（特許文献 3を参照)。これら天然型ペプチド WT1 及び改変型ペプチド WT1 (2M→Y)はいずれも免疫療法剤としての開
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発が期待されている。
更には、前記天然型ペプチド及び改変型ペプチドには、 N末端にシスティン残基 が存在し、空気中で酸化されてジスルフイド結合を介した二量体を形成し、当該二量 体も又、癌抗原ペプチドとなり得ることがわ力 ている（特許文献 4を参照)。
特許文献 1：国際公開第 00Z06602号パンフレット
特許文献 2：国際公開第 OOZ18795号パンフレット
特許文献 3：国際公開第 02Z079253号パンフレット
特許文献 4:国際公開第 2004Z063217号パンフレット
非特許文献 1 : Immunity., 6:273, 1997
非特許文献 2 :J.ImmunoL, 160:2099, 1998
非特許文献 3 : Cell, 60:509, 1990
非特許文献 4:J. Immunol, 164:1873-80, 2000
非特許文献 5 : J. Clin. Immunol, 20, 195-202, 2000
非特許文献 6 : Clin. Cancer. Res. 8: 2626, 2002
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明が解決しょうとする課題は、イン'ビボで CTL誘導活性を示し、癌ワクチン として癌免疫療法に用いられる、新規ペプチドィ匕合物を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0006] 発明者らは、 WT1タンパク質由来の癌抗原ペプチド、 WT1 又は WT1 (2M
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→Y)を改変し、物理化学的性質、安定性、生理活性の面で優れた癌抗原ペプチド を創製すべく鋭意検討を行った。すなわち、これらのペプチドを改変したィ匕合物を製 造し、免疫原性について HLA— A2402ZKbトランスジエニックマウス（WO 02/4747 4号公報を参照、以下 HLA— A24マウスとも称する）を用いて調べた。
[0007] その結果、 WT1 及び WT1 (2M→Y)の N末端システィン残基（Cys)を改変
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すること、詳しくは、 N末端システィン残基のチオール基を修飾することによって、物 理ィ匕学的性質及び安定性に優れたペプチドィ匕合物を得ることに成功した。本発明の ペプチド化合物は優れた免疫原性を有し、優れた CTL誘導活性を示す。また本発 明のペプチド化合物により誘導されたペプチド特異的 T細胞は、癌細胞が本来有し ている天然型ペプチド (WT1 )と交叉反応性を示すため、癌免疫療法剤として有
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効である。
従来、 WT1抗原ペプチド： WT1 及び WT1 (2M→Y)のシスティン残基を改
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変 (修飾)したペプチドィ匕合物が、癌抗原となり得る免疫原性を維持する力否かは全く 知られていなカゝつた力 本発明者らは、初めて、 N末端システィン残基のチオール基 と、システィン、ダルタチオン、又はチォグリコール酸のチオール基とをジスルフイド結 合で縮合させることにより得られる改変体が優れた癌抗原となり得ることを見出した。 本発明は、上記の知見を元に完成するに至ったものである。
[0008] 即ち本発明は、
〔1〕 式 (1) :
[化 1]
R1 Y_N
-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-Z-R
Figure imgf000005_0001
〔式中、 Xはチロシン残基又はメチォニン残基を表し、
Y及び Zは、独立して、単結合又は 1〜10残基のアミノ酸力もなるペプチドの二価基 を表し、
R1は水素原子又はアルキル基を表し、
R2は水酸基、アミノ基、アルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基を表し、
R3は水素原子、アルキル基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、又は 置換もしくは無置換のアルキルカルボ-ルァミノ基を表し、
R4は水素原子、アルキル基、カルボキシ基、力ルバモイル基、アルキル力ルバモイル 基、ジアルキル力ルバモイル基、又は式（2)：
[化 2]
Figure imgf000006_0001
(式中、 Wはアミノ酸残基を表す）
で表される基を表し、
mは 1又は 2を表し、
nは 0〜2の整数を表す。但し、 n力 ^を表わす場合、 R3は水素原子又はアルキル基 を表す。〕
で表される化合物、又はその薬学上許容される塩；
〔2〕 R3において、置換アルキルカルボ-ルァミノ基力 カルボキシ基、アミノ基、ァ ルキルアミノ基及びジアルキルアミノ基力 選択される 1又は 2の置換基で置換された アルキルカルボ-ルァミノ基である、〔1〕に記載の化合物又はその薬学上許容される 塩；
〔3〕 R3が水素原子、又は式 (3) :
[化 3]
Figure imgf000006_0002
(式中、 rは 1 3の整数を表す) で表される基であり、
R4がカルボキシ基又は式（2' )：
[化 4]
Figure imgf000007_0001
(式中、 Wはグリシン残基又は β—ァラニン残基を表す）
で表される基である、〔1〕又は〔2〕に記載の化合物、又はその薬学上許容される塩; 〔4〕 R3が式 (3，）：
[化 5]
Figure imgf000007_0002
Η
で表される基であり、
R4がカルボキシメチルカルバモイル基である、〔3〕に記載の化合物、又はその薬学 上許容される塩；
〔5〕 R3が水素原子であり、 R4がカルボキシ基である、〔3〕に記載の化合物、又はそ の薬学上許容される塩；
〔6〕 式 (1 ' )：
[化 6]
Figure imgf000007_0003
〔式中、 X'はチロシン残基又はメチォニン残基を表し、 R1は水素原子又はアルキル 基を表し、 R2'は水酸基、アミノ基、アルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基を表し、 R3'はァミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基又は置換もしくは無置換のアル キルカルボ-ルァミノ基を表し、
R4'はカルボキシ基、力ルバモイル基、アルキル力ルバモイル基又はジアルキルカル バモイル基を表す。〕
で表される化合物、又はその薬学上許容される塩；
〔7〕 〔1〕〜〔6〕の 、ずれかで表される化合物又はその薬学上許容される塩に特異 的に結合する抗体；
〔8〕 〔1〕〜〔6〕の 、ずれかで表される化合物又はその薬学上許容される塩と HLA —A24抗原との複合体が提示されて 、る抗原提示細胞；
〔9〕 〔1〕〜〔6〕の 、ずれかで表される化合物又はその薬学上許容される塩により誘 導された CTL;
〔10〕 〔1〕〜〔6〕のいずれかで表される化合物又はその薬学上許容される塩と HLA A24抗原との複合体を認識する、〔9〕に記載の CTL ;
〔11〕 配列番号： 1に記載のペプチドと HLA—A24抗原との複合体を認識する、〔9 〕に記載の CTL ;
〔12〕 〔1〕〜〔6〕のいずれかで表される化合物もしくはその薬学上許容される塩、〔8 〕に記載の抗原提示細胞又は〔9〕〜〔11〕のいずれかに記載の CTL、及び薬学的に 許容される担体を含有する医薬組成物；
〔13〕 癌ワクチンとして使用される、〔12〕に記載の医薬組成物；
〔14〕 〔1〕〜〔6〕のいずれかで表される化合物もしくはその薬学上許容される塩、〔8 〕に記載の抗原提示細胞又は〔9〕〜〔11〕のいずれかに記載の CTLの、癌ワクチンを 製造するための使用；
〔15〕 〔1〕〜〔6〕のいずれかで表される化合物もしくはその薬学上許容される塩、〔8 〕に記載の抗原提示細胞又は〔9〕〜〔11〕のいずれかに記載の CTLを有効成分とし て含有する、癌免疫療法剤；
〔16〕 癌を治療又は予防するための方法であって、〔1〕〜〔6〕のいずれかで表され る化合物もしくはその薬学上許容される塩、〔8〕に記載の抗原提示細胞又は〔9〕〜〔 11〕のいずれかに記載の CTLの治療又は予防に有効な量を、それを必要としている HLA-A24陽性かつ WT1陽性の癌患者に投与することからなる方法； に関する。
発明の効果
[0009] 本発明により、癌免疫療法剤として有用な新規ペプチド化合物、詳しくは、イン'ビ ボで CTL誘導活性を有し、癌ワクチンとして有効な、 WT1由来の癌抗原を提供する ことが可能となった。このペプチドは、 WT1 及び WT1 (2M→Y)の N末端シス
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ティンのメルカプト基が、その癌抗原ペプチドとしての活性を保持した形で修飾され ており、物理ィ匕学的性質及び安定性に優れているので、治療や研究において広範 に利用することができる。具体的には、本発明の新規ペプチドは、例えば、インビトロ での処理中に活性が低下する恐れがなく取り扱いが容易であり、安定した治療効果 を発揮しうるという利点を有する。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]実施例 1のペプチドィ匕合物の、 3匹のマウス個体毎の細胞傷害活性 (Specific Ly sis)を示す図である（図中、黒棒)。図中、白棒はペプチド非パルスの結果を示す (以 下同じ)。
[図 2]実施例 2のペプチドィ匕合物の、 3匹のマウス個体毎の細胞傷害活性 (Specific Ly sis)を示す図である。
[図 3]実施例 3のペプチドィ匕合物の、 3匹のマウス個体毎の細胞傷害活性 (Specific Ly sis)を示す図である。
[図 4]実施例 4のペプチドィ匕合物の、 3匹のマウス個体毎の細胞傷害活性 (Specific Ly sis)を示す図である。
[図 5]実施例 5のペプチドィ匕合物の、 3匹のマウス個体毎の細胞傷害活性 (Specific Ly sis)を示す図である。
[図 6]実施例 6のペプチドィ匕合物の、 3匹のマウス個体毎の細胞傷害活性 (Specific Ly sis)を示す図である。
[図 7]実施例 1のペプチドィ匕合物の用量依存的な細胞傷害活性 (Specific Lysis)を示 す図である。 X軸に ίま個体当たりの投与量（600 g、 200 /z g、 60 ^ g,及び 20 /z g) を示し、 Y軸に細胞傷害活性 (Specific Lysis)を示す。各用量においては、 3匹のマウ スを利用し、それぞれの細胞傷害活性平均値及び標準偏差 (S.D.)を示す。 [図 8]実施例 1のペプチドィ匕合物でマウスを免疫して得られたペプチド特異的 T細胞 の、各種ペプチドパルス細胞に対する反応性を示す図である。図中、斜線の棒は天 然型ペプチド (WT1 )をパルスした細胞を用いた結果を、黒棒は実施例 1のぺプ
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チドィ匕合物をパルスした細胞を用いた結果を、白棒はインフルエンザ由来ペプチドを パルスした細胞を用いた結果を、それぞれ示す。また図の縦軸はスポットを示す。
[図 9]実施例 1のペプチドの刺激によりヒト PBMC力も誘導したペプチド特異的 Τ細胞 の、各種ペプチドパルス細胞に対する反応性を示す図である。図中「天然型ぺプチ ド」は天然型ペプチド (WT1 )をパルスした細胞を用いた結果を、「改変ペプチド」
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は改変ペプチド (WT1 (2Μ→Υ))をパルスした細胞を用いた結果を、「実施例 1の
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ペプチド」は実施例 1のペプチドィ匕合物をパルスした細胞を用いた結果を、「ペプチド 非パルス」はペプチドをパルスしていない細胞を用いた結果を、それぞれ示す。また 図の縦軸は、産生された IFN- γの量を示す。
発明を実施するための最良の形態
本明細書及び図面において、アミノ酸残基を略号で表示する場合、次の略号で記 述する。
Ala:ァラニン残基
Arg:アルギニン残基
Asn:ァスパラギン残基
Asp :ァスパラギン酸残基
Cys :システィン残基
Gin:グルタミン残基
Glu:グルタミン酸残基
Gly:グリシン残基
His :ヒスチジン残基
lie :イソロイシン残基
Leu:ロイシン残基
Lys :リジン残基
Met :メチォニン残基 Phe：フエ-ルァラニン残基
Pro :プロリン残基
Ser:セリン残基
Thr:トレオニン残基
Trp :トリプトファン残基
Tyr:チロシン残基
Val:パリン残基
[0012] 本明細書にぉ 、て、「アミノ酸残基」としては、天然もしくは非天然の ex -アミノ酸残 基、 β アミノ酸残基、 γ -アミノ酸残基又は δ アミノ酸残基が挙げられる。具体的 には天然の (X—アミノ酸（具体的には、 Ala、 Arg、 Asn、 Asp、 Cys、 Gln、 Glu、 Gly、 His 、 Ile、 Leu、 Lys、 Met, Phe、 Pro, Ser、 Thr、 Trp、 Tyr又は Val)、オル-チン残基、ホモ セリン残基、ホモシスティン残基、 βーァラニン、 γ アミノブタン酸又は δ アミノぺ ンタン酸等が挙げられる。
前記アミノ酸残基に関し、光学異性体があり得る場合は、 L体、 D体のいずれであつ てもよいが、 L体が好ましい。
本明細書において、ペプチドィ匕合物のアミノ酸配列は常法に従って、その Ν末端の アミノ酸残基が左側に位置し、 C末端のアミノ酸残基が右側に位置するように記述す る。
[0013] (1)ペプチド化合物
本発明の第一の態様は、前記式（1)で表される化合物又はその薬学上許容される 塩に関する。
式（1)中の Xは、好ましくはチロシン残基 (Tyr)を表す。
式（ 1 )中の Y及び Zにおける「 1〜 10残基のアミノ酸残基力 なるペプチドの二価基 」としては、同一もしくは異なる、 1〜： L0残基のアミノ酸残基力もなるペプチドの二価 基が挙げられ、そのアミノ酸配列は特に限定は無い。具体的には、ヒト WTl(Cell,60:5 09,1990、 GenBank Ac No.A38080)を構成するアミノ酸配列を挙げることができる。具 体的には、 Yとしては、ヒト WT1の第 225位〜第 234位力もなる以下の 10残基のぺプ チド： Asn- Leu- Tyr- Gin- Met- Thr- Ser- Gin- Leu- Glu (配列番号： 3)、又は該配列番 号： 3で表されるペプチドから N末端の 1〜9個のアミノ酸残基が欠損したペプチドの 二価基を挙げることができる。また、 Zとしては、ヒト WT1の第 244位〜第 253位力もなる 以下の 10残基のペプチド： Gly- Ala- Thr- Leu- Lys- Gly- Va卜 Ala- Ala- Gly (配列番号 :4)、又は該配列番号: 4で表されるペプチドから C末端の 1〜9個のアミノ酸残基が 欠損したペプチドの二価基を挙げることができる。
Y及び Zは好ましくは単結合を表す。
[0014] 本明細書において、アルキル基としては、炭素数 1〜6の直鎖又は分枝のアルキル 基が挙げられる。具体的には、メチル基、ェチル基、プロピル基、 1 メチルェチル基 、ブチル基、 1 メチルプロピル基、 2-メチルプロピル基、 1, 1ージメチルェチル基、 ペンチル基等が挙げられる。
本明細書において、アルキルアミノ基としては、炭素数 1〜6の直鎖又は分枝のァ ルキルアミノ基が挙げられる。具体的には、メチルァミノ基、ェチルァミノ基、プロピル アミノ基、 1ーメチルェチルァミノ基、ブチルァミノ基、 1 メチルプロピルアミノ基、 2- メチルプロピルアミノ基、 1, 1ージメチルェチルァミノ基、ペンチルァミノ基等が挙げら れる。
本明細書において、ジアルキルアミノ基としては、 2個の同一もしくは異なる炭素数 1〜6の直鎖又は分枝のアルキルで置換されたァミノ基が挙げられる。具体的には、 ジメチルァミノ基、ェチルメチルァミノ基、ジェチルァミノ基、ジプロピルアミノ基、メチ ルプロピルアミノ基、ブチルメチルァミノ基、メチルペンチルァミノ基等が挙げられる。 本明細書において、アルキルカルボ-ルァミノ基における「アルキル」としては、前 記アルキル基と同じものが挙げられる。アルキル力ルバモイル基における「アルキル」 としては、前記アルキルアミノ基におけるアルキルと同じものが挙げられる。ジアルキ ルカルバモイル基における「アルキル」としては、前記ジアルキルアミノ基におけるァ ルキルと同じものが挙げられ、 2つのアルキルは同一もしくは異なっていてもよい。
[0015] R1及び R2は好ましくは水素原子を表す。
R3が置換アルキルカルボ-ルァミノ基を表す場合の置換基としては、カルボキシ基 、水酸基、アミノ基、アルキルアミノ基、又はジアルキルァミノ基が挙げられ同一もしく は異なる置換基が 1〜4個、好ましくは 1もしくは 2個置換して 、てもよ 、。 式（2)中の Wにおけるアミノ酸残基として、好ましくはグリシン残基 (Gly)を挙げる とがでさる。
本発明のペプチドィ匕合物として、具体的には、以下の式 (4)〜（9)：
[化 7]
Figure imgf000013_0001
[化 8]
Figure imgf000013_0002
[化 9]
Figure imgf000013_0003
[化 10]
Figure imgf000013_0004
[化 11]
Figure imgf000014_0001
及び
[化 12]
Figure imgf000014_0002
で表される化合物を挙げることができる。
本発明のペプチドィ匕合物は、本明細書実施例に記載された方法、又は通常のぺ プチド合成において用いられる方法に準じて製造することができる。製造方法として は、文献（ぺプタイド 'シンセシス（Peptide Synthesis), Interscience, New York, 1966; ザ ·プロテインズ（The Proteins) Vol.2,Academic Press Inc., New York, 1976;ぺプ チド合成、丸善 (株)、 1975 ;ペプチド合成の基礎と実験、丸善 (株)、 1985 ;医薬品の 開発 続 第 14卷 'ペプチド合成、広川書店、 1991)等に記載されている方法が挙げ られる。例えば、 Fmoc法もしくは Boc法を用いて固相合成機で製造する方法や、 Bo c アミノ酸もしくは Z アミノ酸を液相合成法で逐次縮合させて製造する方法が挙げ られる（Fmocは 9 フルォレニルメトキシカルボ-ル基、 Bocは t—ブトキシカルボ- ル基、 zはべンジルォキシカルボ-ル基をそれぞれ表わす）。
本発明の化合物を製造するための中間体において、アミノ基、カルボキシ基、メル カプト基等の官能基は、必要に応じて保護、脱保護の技術を用い、適当な保護基で 保護し、また脱保護することができる。好適な保護基、保護する方法、及び脱保護す る方法としては、「Protective Groups in Organic synthesis 2nd Edition (John Wiley & Sons, Inc.； 1990)」等に詳細に記載されて!ヽる。
[0018] 具体的には、以下の反応式で示される製造方法を例示することができる。
〔反応式 1〕
[化 13]
Figure imgf000015_0001
(1-2)
Figure imgf000015_0002
(式中、 X、 Y、 Z、
Figure imgf000015_0003
R2、 R3、 R4、 m及び nは前記と同義であり、 R及び R，は独立し て、水素原子もしくはメルカプト基の保護基を表わす。 )
ここで、メルカプト基の保護基としてはァセトアミドメチル基又はトリチル基等が挙げ られる。
[0019] すなわち、式（1 1)の化合物と式（1 2)の化合物を、不活性溶媒中で酸化させ ることによって、式（1)の化合物を製造することができる。 酸ィ匕方法としては、通常のペプチド合成で、ジスルフイド結合を形成させる公知の 方法を適宜選択すればよぐ例えば、メルカプト基を持つ 2つの中間体を適当な溶媒 中に混合し酸化することにより形成できる。酸化法としては公知の酸化法、例えば空 気酸化、ヨウ素酸化等の酸化法を用いることができる。溶媒としては水、酢酸、メタノ ール、クロ口ホルム、 DMFもしくは DMSO等、又はこれらの混合液を用いることがで きる。酸ィ匕反応によりしばしば対称、非対称性ジスルフイド化合物の混合物を与える。 目的の非対称性ジスルフイドィ匕合物は種々のクロマトグラフィー、又は再結晶等で精 製すること〖こよって得ることができる。あるいは活性ィ匕されたメルカプト基をもつ中間 体とメルカプト基をもつ中間体を混合することにより選択的なジスルフイド結合を形成 することができる。活性ィ匕されたメルカプト基をもつ中間体としては、 Npys基（3— -ト 口 2—ピリジンスルフエ-ル基）が結合したメルカプト基等が挙げられる。あるいは、 あらかじめ一方の中間体と例えば 2, 2' ジチォビス（5 -トロピリジン)を混合する ことによりメルカプト基を活性ィ匕した後、他方の中間体を加えることにより選択的なジ スルフイド結合を形成することができる（Tetrahedron Letters. Vol. 37. No. 9, pp. 134 7-1350)。
式（1 1)の化合物は、当業者に公知の液相もしくは固相のペプチド合成法に準じ て調製することができる。
また、式（1— 1)の化合物の N末端がアルキルィ匕されている場合には、 N末端のァ ミノ酸残基として、必要に応じて保護基で保護された N アルキルアミノ酸もしくは N , N ジアルキルアミノ酸を用いて製造することができる。 N アルキルアミノ酸もしく は N, N ジアルキルアミノ酸は、市販品を用いるか、アミノ酸又は保護アミノ酸を原 料にして、塩基の存在下にアルキルノヽライドを反応させる等、当業者に周知の方法 で調製することができる。例えば、下記〔反応式 2〕に示されるとおり、 t_ブトキシカル ボニル基で保護されたアミノ酸に、水素化ナトリウム等の塩基の存在下に、アルキル ノ、ライドを反応させ、 N末端のアミノ基を適宜アルキルィ匕することができる。
〔反応式 2〕 Η-Χ-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-Z- ·
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000017_0002
(式中、 X、 Z、
Figure imgf000017_0003
m及び Rは前記と同義であり、 Halは臭素原子若しくはヨウ素 原子を表し、 Protは保護基を表わす。 )
また、 C末端がアミドィ匕又はアルキルアミド化されている場合には、原料として用いる C末端アミノ酸残基として、アミド化もしくはアルキルアミド化されたアミノ酸を原料に用 いることがでさる。
[0021] 本発明の化合物、又はそれらを製造するための中間体は当業者に公知の方法で 精製することができる。例えば、種々のクロマトグラフィー（例えば、シリカゲルカラムク 口マトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過、もしくは逆相クロマト グラフィ一）、又は再結晶等で精製することができる。例えば、再結晶溶媒としては、メ タノール、エタノールもしくは 2—プロパノール等のアルコール系溶媒、ジェチルエー テル等のエーテル系溶媒、酢酸ェチル等のエステル系溶媒、ベンゼンもしくはトルェ ン等の芳香族炭化水素系溶媒、アセトン等のケトン系溶媒、へキサン等の炭化水素 系溶媒、ジメチルホルムアミドもしくはァセトニトリル等の非プロトン系溶媒、水、又はこ れらの混合溶媒等を用いることができる。その他精製方法としては、実験化学講座（ 日本化学会編、丸善) 1卷等に記載された方法等を用いることができる。
[0022] 本発明の化合物において、 1つ以上の不斉点がある場合、通常の方法に従って、 その不斉点を有する原料 (アミノ酸)を用いることによって、製造することができる。ま た、本発明の化合物の光学純度を上げるために、製造工程の適当な段階で光学分 割などを行ってもよい。光学分割法として例えば、本発明の化合物もしくはその中間 体を不活性溶媒中（例えばメタノール、エタノール、もしくは 2—プロパノール等のァ ルコール系溶媒、ジェチルエーテル等のエーテル系溶媒、酢酸ェチル等のエステル 系溶媒、トルエン等の炭化水素系溶媒、又はァセトニトリル等の非プロトン系溶媒、及 びこれらの混合溶媒）、光学活性な酸 (例えば、マンデル酸、 N—ベンジルォキシァ ラニン、もしくは乳酸等のモノカルボン酸、酒石酸、 o—ジイソプロピリデン酒石酸もし くはリンゴ酸等のジカルボン酸、又は力ンファースルフォン酸もしくはブロモカンファー スルフォン酸等のスルホン酸）と塩を形成させるジァステレオマー法により行うことが できる。本発明の化合物もしくはその中間体がカルボキシ基等の酸性官能基を有す る場合は、光学活性なァミン (例えば α—フエネチルァミン、キュン、キニジン、シンコ 二ジン、シンコニン、ストリキニーネ等の有機ァミン）と塩を形成させることにより光学分 割を行うこともできる。
[0023] 塩を形成させる温度としては、室温力 溶媒の沸点までの範囲から選択される。光 学純度を向上させるためには、一旦、溶媒の沸点付近まで温度を上げることが望まし い。析出した塩を濾取する際、必要に応じて冷却し収率を向上させることができる。 光学活性な酸、又はァミンの使用量は、基質に対し約 0. 5〜約 2. 0当量の範囲、好 ましくは 1当量前後の範囲が適当である。必要に応じ結晶を不活性溶媒中（例えばメ タノール、エタノール、 2—プロパノール等のアルコール系溶媒、ジェチルエーテル 等のエーテル系溶媒、酢酸ェチル等のエステル系溶媒、トルエン等の炭化水素系溶 媒、ァセトニトリル等の非プロトン系溶媒及びこれらの混合溶媒)で再結晶し、高純度 の光学活性な塩を得ることもできる。また、必要に応じて光学分割した塩を通常の方 法で酸又は塩基で処理しフリー体として得ることもできる。
[0024] 薬学上許容される塩としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。例えば、酸 付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸 塩等の無機酸塩、クェン酸塩、シユウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息 香酸塩、トリフルォロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼ ンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、塩基付加塩と しては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモ-ゥム塩等の 無機塩基塩、トリェチルアンモ -ゥム塩、トリエタノールアンモ-ゥム塩、ピリジ-ゥム 塩、ジイソプロピルアンモ-ゥム塩等の有機塩基塩等が挙げられ、さらにはアルギ- ン、ァスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性あるいは酸性アミノ酸といったアミノ酸 塩が挙げられる。
[0025] また、本発明には、式（1)で示されるペプチドィ匕合物又はその薬学上許容される塩 の水和物、エタノール溶媒和物等の溶媒和物も含まれる。さらに、本発明には、式（1
)で示されるペプチド化合物のあらゆるジァステレオマー、ェナンチォマー等の存在 するあらゆる立体異性体、及びあらゆる態様の結晶形のものも包含している。
一般にペプチドィ匕合物の製造においては、光学活性な α—アミノ酸を縮合するェ 程、種々の保護基を除去する工程又はペプチドを榭脂から切り出す工程等で、ァミノ 酸が欠損したペプチド、加水分解や酸化等により分解したペプチド、アミノ酸がラセミ 化したペプチド等種々の副生成物が生ずる。実験室スケールでは、種々のクロマトグ ラフィー（例えば、シリカゲノレカラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフ ィー、ゲルろ過、もしくは逆相クロマトグラフィー）を組み合わせることによって、これら の不純物を除去し高純度のペプチドィ匕合物を得ることができる。し力しながら、医薬 品として提供するために工業的なスケールで高純度のペプチドィ匕合物を得ることは 容易ではない。
本発明のペプチドィ匕合物は、その物理ィ匕学的性質においても、医薬品原薬として 大量製造可能な性質を有する。具体的には、溶解性が高い、溶液中安定性に優れ ている、又は濃縮された際にゲルィ匕しにくい等の性質を有し、逆相 HPLC等のカラム クロマトグラフィーによる精製工程で、大量スケールにおいても容易に高純度のぺプ チドィ匕合物を原薬として製造することができる。
[0026] 本発明のペプチドィ匕合物は、癌免疫療法における CTL誘導剤の有効成分として、 又癌ワクチンの有効成分として有用である。すなわち本発明のペプチドィ匕合物は、本 明細書実施例に示すとおり、優れた免疫原性を有し、優れた CTL誘導活性を示す。 また、本発明のペプチドィ匕合物によって誘導される CTLは、驚くべきことに、癌細胞 が本来保有する WT1の天然型ペプチドを認識することができる。従って、本発明のぺ プチドィ匕合物は、 WT1遺伝子が発現している癌、すなわち胃癌、大腸癌、肺癌、乳 癌、胚細胞癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌又は卵巣癌等の治療 薬又は予防薬 (再発防止薬)として用いることができる。
[0027] (2)抗体
本発明の第二の態様は、式（1)で表される本発明の化合物又はその薬学上許容さ れる塩に特異的に結合する抗体 (以下本発明の抗体と称する場合がある）に関する。 本発明の抗体は、その形態に特に制限はなぐ本発明の化合物を免疫原とするポリ クローナル抗体であっても、またモノクローナル抗体であっても良 、。
本発明の抗体は前記のように本発明の化合物に特異的に結合するものであれば 特に制限されないが、具体的には、前述の式 (4)〜式（9)のいずれかで表される化 合物に特異的に結合する抗体を挙げることができる。
[0028] これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従 つて製造すること; 0できる (し urrent protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et a 1. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜丄丄 .13、 Antibodies; A Labora tory Manual, Lane, H, D.ら編, Cold Spring Harber Laboratory Press出版 New York 1989)。
[0029] 具体的には、本発明の化合物（例えば式 (4)〜式（9)のいずれかで表される化合 物）を免疫原として用い、家兎等の非ヒト動物を免疫し、該免疫動物の血清から常法 に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、本発明の化 合物（例えば式 (4)〜式（9)の ヽずれかで表される化合物）をマウス等の非ヒト動物 に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイプリドー マ細胞の中から得ることができる (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausu bel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11)。
[0030] 本発明の化合物に対する抗体の作製は、宿主に応じて種々のアジュバントを用い て免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。そのようなアジュバントには、 フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン 、プル口-ックポリオル、ポリア-オン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットへモ シァニン及びジニトロフエノールのような表面活性物質、 BCG (カルメット ゲラン桿 菌）やコリネバタテリゥム-パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。 [0031] 以上のように本発明の化合物を用いて常法により適宜動物を免疫することにより、 本発明の化合物を認識する抗体、さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製 できる。抗体の用途としては、ァフィユティークロマトグラフィー、免疫学的診断等が挙 げられる。免疫学的診断は、ィムノブロット法、放射免疫測定法 (RIA)、酵素免疫測 定法 (ELISA)、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。このような免疫学 的診断は、 WT1遺伝子が発現している癌、すなわち胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚 細胞癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の診断において 有効である。
[0032] (3)抗原提示細胞
本発明の第三の態様は、本発明の化合物と HLA-A24抗原との複合体が提示され た抗原提示細胞に関する。
後述の実施例において、本発明の化合物の投与により CTL誘導活性が認められた 1S これは、末梢血単核球中に、本発明の化合物と HLA-A24抗原との複合体の提 示された抗原提示細胞が存在し、そして、この複合体の提示された細胞を特異的に 認識する CTLが誘導されたことを示すものである。このような、 HLA-A24抗原と本発 明の化合物との複合体の提示された抗原提示細胞は、後述する細胞療法 (DC療法 )において有効に用いられる。
[0033] 本発明の抗原提示細胞は、本発明の化合物と HLA-A24抗原との複合体が提示さ れた抗原提示細胞であれば良ぐ具体的には、例えば式 (4)〜式（9)のいずれかに 記載の化合物と HLA-A24抗原との複合体が榭状細胞の細胞表面に提示された抗原 提示細胞を挙げることができる。
[0034] 細胞療法 (DC療法）にお ヽて用いられる抗原提示細胞は、癌患者から抗原提示能 を有する細胞を単離し、この細胞に本発明の化合物を体外でパルスして、 HLA-A24 抗原と本発明の化合物との複合体を細胞表面に提示させることにより作製される。こ こで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明の化合物を提示可能な HLA-A24抗原 を細胞表面に発現して 、る細胞であれば特に限定されな 、が、抗原提示能が高 、と されて 、る榭状細胞が好ま 、。
[0035] 本発明の抗原提示細胞は、例えば癌患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、 該細胞に本発明の化合物（例えば式 (4)〜式（9)のいずれかに記載の化合物）を体 外でノルスし、 HLA-A24抗原と本発明の化合物との複合体を作製することにより得ら れる (Cancer Immunol. Immunother., 46:82, 1998、 J. Immunol. ,lti8:pl79b, 1997、 Cancer Res., 59:pll84, 1999)。榭状細胞を用いる場合は、例えば、癌患者の末梢血からフ イコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞を GM-CSF 及び IL-4存在下で培養して榭状細胞を誘導し、当該榭状細胞を本発明の化合物と 共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することがで きる。
以上のようにして作製された本発明の抗原提示細胞は、後述する CTLの誘導剤、 癌ワクチンの有効成分として、細胞療法 (DC療法）において有効に用いられる。
[0036] (4) CTL
本発明のペプチド化合物、は、ヒト WT1に由来し、 HLA— A24拘束性の CTL誘 導活性 (免疫原性)を有する。すなわち、本発明の第四の態様は、本発明のペプチド 化合物により誘導される CTLに関する。
後述の実施例において、本発明の化合物の投与により CTL誘導活性が認められた 。これは、末梢血単核球中に、本発明の化合物と HLA-A24抗原との複合体の提示さ れた抗原提示細胞が存在し、そして、この複合体の提示された細胞を認識する CTL が誘導されたことを示すものである。このような、本発明のペプチドィ匕合物により誘導 された CTLは、後述する養子免疫療法にぉ 、て有効に用いられる。
[0037] 本発明の CTLは、本発明のペプチド化合物により誘導された CTLであれば良いが 、具体的には、例えば式 (4)〜式（9)の 、ずれかで表される化合物と HLA-A24抗原 との複合体を認識する CTL、天然型ペプチド (WT1 ：配列番号： 1)と HLA-A24抗
235-243
原との複合体を認識する CTLを挙げることができる。
[0038] 養子免疫療法において用いられる CTLは、患者の末梢血リンパ球を単離し、これを 本発明の化合物（例えば式 (4)〜式（9)の 、ずれかで表される化合物）によってイン 'ビトロで刺激する等により作製される（Journal of Experimental Medicine 1999, 190: 1669)。
以上のようにして作製された本発明の CTLは、癌ワクチンの有効成分として、養子 免疫療法にぉ 、て有効に用いられる。
[0039] (5)癌ワクチンとしての医薬組成物
上記（1)〜(4)に記載した本発明の化合物、本発明の抗原提示細胞、及び本発明 の CTLは、それぞれの物質に応じた適切な形態とすることにより、 CTLの誘導剤、す なわち癌ワクチンの有効成分とすることができる。以下、具体的に説明する。
[0040] 1)本発明の化合物又はその薬学上許容される塩を有効成分とする癌ワクチン
本発明の化合物は、 CTLの誘導能を有するものであり、誘導された CTLは、細胞傷 害作用やリンフォカインの産生を介して抗癌作用を発揮することができる。従って本 発明の化合物は、癌の治療又は予防のための癌ワクチンの有効成分とすることがで きる。すなわち本発明は、本発明の化合物を有効成分として含有する癌ワクチン (癌 ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。本発明の癌ワクチンを HLA-A24陽性かつ WT1陽性の患者に投与すると、抗原提示細胞の HLA-A24抗原に本発明化合物 (例 えば式 (4)〜式（9)の 、ずれかで表される化合物）が提示され、提示された HLA-A2 4抗原複合体特異的 CTLが増殖して癌細胞を破壊することができ、従って、癌の治療 又は予防が可能となる。本発明の癌ワクチンは、 WT1遺伝子の発現レベルの上昇を 伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血 液性の癌や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺 癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防又は治療のために使用することが できる。
よって、本発明は別の態様として、本発明の癌ワクチンの有効量を HLA-A24陽性 かつ WT1陽性の患者に投与することにより、癌を治療又は予防するための方法を提 供する。
[0041] 本発明の化合物を有効成分とする癌ワクチンは、単一の癌抗原ペプチド、すなわち CTLェピトープ (例えば式 (4)〜式（9)の 、ずれかで表される化合物）を有効成分と するものであっても、また他の癌抗原ペプチド（CTLェピトープ)やヘルパーェピトー プを連結したェピトープペプチドを有効成分とするものであっても良 、。すなわち近 年、複数の CTLェピトープ (抗原ペプチド)を連結したェピトープペプチドが、イン'ビ ボで効率的に CTL誘導活性を有することが示されている。例えば Journal of Immunol ogy 1998, 161: 3186-3194には、癌抗原タンパク質 PSA由来の HLA-A2, -A3, -All, B53拘束性 CTLェピトープ（抗原ペプチド）を連結した約 30merのェピトープペプチド 力 イン'ビボでそれぞれの CTLェピトープに特異的な CTLを誘導したことが記載され て 、る。また CTLェピトープとヘルパーェピトープとを連結させたェピトープペプチド により、効率的に CTLが誘導されることも示されている。このようなェピトープペプチド の形態で投与した場合、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受け て生じた個々の抗原ペプチドが HLA抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗 原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的な CTLが体内で効率的 に増殖し、癌細胞を破壊する。このようにして癌の治療又は予防が達成される。
[0042] また本発明の化合物を有効成分とする癌ワクチンは、細胞性免疫が効果的に成立 するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントとともに投与 したり、粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献 (Clin. Microbiol. Rev., 7:277-289, 1994)に記載のものなどが応用可能であり、具体的には 、菌体由来成分、 GM- CSF、インターロイキン一 2、インターロイキン一 7もしくはインタ 一ロイキン 12等のサイト力イン、植物由来成分、海洋生物由来成分、水酸化アルミ -ゥムの如き鉱物ゲル、リソレシチン、プル口ニックポリオールの如き界面活性剤、ポ リア-オン、ペプチド、又は油乳濁液 (ェマルジヨン製剤）などを挙げることができる。 菌体由来成分としては、リピド A (lipid A)、その誘導体であるモノホスホリルリピド A(m onophosphoryl lipid A)、細菌（BCG菌等の Mycobacterium属細菌が挙げられる）の死 菌、細菌由来のタンパク質、ポリヌクレオチド）、フロイント不完全アジュバント（Freund' s Incomplete Adjuvant 、フロイント^ g全 ンュノヽント (Freund s Complete Adjuvant)、 細胞壁骨格成分 (例えば、 BCG-CWS等が挙げられる）、トレハロースジミコレート (T DM)等が挙げられる。
また、リボソーム製剤、直径数 mのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを 結合させた製剤なども考えられる。
[0043] 投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げら れる。製剤中の本発明の化合物の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重 等により適宜調整することができる力 通常 0.0001mg〜1000mg、好ましくは O.OOlmg 〜1000mg、より好ましくは 0.1mg〜10mgであり、これを数日ないし数月に 1回投与する のが好ましい。
[0044] 2)本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチン
本発明は、本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンを提供する。
近年、癌患者の末梢血からリンパ球を分離し、その中から榭状細胞を誘導し、イン' ビトロで抗原ペプチド等をパルスして調製した抗原提示細胞を皮下投与などにより患 者に戻す細胞療法（DC療法）が報告されている（Cancer Immunol. Immunother., 46 :8 2,1998、 J.Immunol.,158:pl796,1997、 Cancer Res.,59:pll84,1999、 Cancer Res.,56:p 5672, 1996、 J.Immunol.,161: p5607,1998、 J.Exp.Med., 184: p465,1996)。従って前 記本発明の抗原提示細胞を、細胞療法における癌ワクチンの有効成分として使用す ることがでさる。
[0045] 本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンは、抗原提示細胞を安定に維 持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS)、培地等を含むことが好ま しい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与 量は、前記文献記載の投与量が例示される。
前記癌ワクチンを患者の体内に戻すことにより、 HLA-A24陽性かつ WT1陽性の患 者の体内で効率良く特異的な CTLが誘導され、癌を治療又は予防することができる。 本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンは、 WT1遺伝子の発現レベル の上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫 などの血液性の癌や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌 、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防又は治療のために使用 することができる。
[0046] 3)本発明の CTLを有効成分とする癌ワクチン
本発明は、本発明の CTLを有効成分とする癌ワクチン (癌ワクチンとしての医薬組 成物）を提供する。本発明の CTLは、以下の養子免疫療法において有効に用いられ る。
メラノーマにおいて、患者本人の腫瘍内浸潤 T細胞を体外で大量に培養し、これを 患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている (J. Natl. Cancer. Inst., 86: 1159, 1994) oまたマウスのメラノーマでは、脾細胞をイン'ビトロで癌抗原ペプチド TR P— 2で刺激し、癌抗原ペプチドに特異的な CTLを増殖させ、該 CTLをメラノーマ移 植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（J. Exp. Med., 185:453, 1 997 )。これは、抗原提示細胞の HLA抗原と癌抗原ペプチドとの複合体を特異的に 認識する CTLをイン'ビトロで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明の 化合物を用いて、イン'ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して癌特異的 CTLを増や した後、この CTLを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。従って前記本発明 の CTLを、養子免疫療法における癌ワクチンの有効成分として使用することができる 本発明の CTLを有効成分とする癌ワクチンは、 CTLを安定に維持するために、生理 食塩水、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、培地等を含むことが好ましい。投与方法とし ては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量としては、前記文 献記載の投与量が例示される。
前記癌ワクチンを患者の体内に戻すことにより、 HLA-A24陽性かつ WT1陽性の患 者の体内で CTLによる癌細胞の傷害作用が促進され、癌細胞を破壊することにより、 癌を治療することができる。本発明の CTLを有効成分とする癌ワクチンは、 WT1遺伝 子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄 腫、悪性リンパ腫などの血液性の癌や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌 、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防又は治 療のために使用することができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定 されるものではない。
また、以下の実施例において、実施例 2の化合物、実施例 4の化合物、及び実施例 6の化合物は WT1 (配列番号： 1)の修飾体に該当するものであり、それぞれシス
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チン修飾体、ダルタチオン修飾体、及びチォグリコール酸修飾体である。一方、実施 例 1の化合物、実施例 3の化合物、及び実施例 5の化合物は WT1 (2M→Y) (配
235-243
列番号： 2)の修飾体に該当するものであり、それぞれシスチン修飾体、ダルタチオン 修飾体、及びチォグリコール酸修飾体である。 実施例
[0048] 実施例で用いられる略号は、以下のとおり：
Boc： t—ブトキシカノレボニノレ
Npys： 3--トロ- 2-ピリジンスルフエ-ル
t- Bu:t—ブチル
Trt :トリフエニルメチル
Fmoc: 9-フルォレニルメチルォキシカルボニル
DMF：ジメチルホルムアミド
HOBT： N-ヒドロキシベンゾトリアゾール
DIPCI：ジイソプロピルカルボジイミド。
[0049] 実施例 1
式 (4)で示されるペプチドの合成：
[化 14]
Figure imgf000027_0001
下記の製造例 1により得られたペプチド 1.5g、 Boc- Cys(Npys)- OH 600mgをジメチ ルスルホキシド 20ml中に混合し 20分間室温攪拌した。反応液にァセトニトリル 600mlを 加え氷冷下攪拌後、沈殿物を濾取した。濾上物はァセトニトリル、ジェチルエーテル で洗浄後減圧乾燥することにより Boc-Cys- OHがジスルフイド結合で結合したぺプチ ド 1.65gを得た。このペプチド 0.53gをトリフルォロ酢酸 5mlに溶解し 10分間室温攪拌し た。トリフルォロ酢酸を減圧留去後、残渣をァセトニトリル-酢酸-水（10/10/90)の混 合液 110mlに溶解し HPLC精製した。
ポンプ： Shimazu製； LC- 8A型
カラム： YMC ODS-A 3cm X 25cmL, 10
溶出液 1 : H O/0.1%TFA 溶出液 2 : CH CN/0.1%TFA
3
流速： 20ml/min
検出： UV220nm
2液濃度 5%で平衡ィ匕させたカラムに粗ペプチド溶液をチャージした。その後 2液濃 度 5%で 10分間、 15%で 15分間送液しその後 1分間あたり 0.1%の割合で 2液濃度を上昇 させた。 目的物を含む分画を集め、ァセトニトリルを減圧留去し凍結乾燥することによ り目的とするペプチド 300mgを得た。
'質量分析： LC- ESI/MS m/z =1292 [M+l]+ (理論値 = 1291.5)
実施例 2
式（5)で示されるペプチドの合成：
[化 15]
Figure imgf000028_0001
実施例 1と同様な方法で、下記の製造例 2により得られたペプチド 500mgと Boc-Cys (Npys)-OH 200mgを反応させた後、トリフルォロ酢酸中で Boc基を除去し HPLC精製 することにより目的とするペプチド 104mgを得た。
'質量分析： LC- ESI/MS m/z =1260 [M+l]+ (理論値 = 1259.5)
実施例 3
式 (8)で示されるペプチドの合成：
[化 16] Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH
(8)
Figure imgf000029_0001
製造例 1により得られたペプチド 240mgと 2,2'-ジチォビス（5-二トロピリジン） 60mgを ジメチルスルホキシド 6ml中に混合し 1時間室温攪拌した。反応液に還元型ダルタチ オン 120mgをカ卩ぇ 30°Cにて 1時間攪拌した。さらに還元型ダルタチオン 60mg、ジメチ ルスルホキシド 4mlを追加し 30分間攪拌後ァセトニトリル 200mlを加え生じた沈殿物を 濾取、減圧乾燥することにより粗ペプチド 440mgを得た。得られた粗ペプチドをァセト 二トリル-酢酸-水（10/10/90)の混合液 110mlに溶解し HPLC精製した。
ポンプ： Shimazu製； LC- 8A型
カラム： YMC ODS-A 3cm X 25cmL, 10
溶出液 1 : H O/0.1%TFA
2
溶出液 2 : CH CN/0.1%TFA
3
流速： 20ml/min
検出： UV220nm
2液濃度 10%で平衡ィ匕させたカラムに粗ペプチド溶液をチャージした。その後 2液濃 度 10%で 10分間、 17%で 15分間送液しその後 1分間あたり 0.05%の割合で 2液濃度を上 昇させた。 目的物を含む分画を集め、ァセトニトリルを減圧留去し凍結乾燥すること により目的とするペプチド 107mgを得た。
'質量分析： LC- ESI/MS m/z =1477 [M+l]+ (理論値 = 1477.5)
実施例 4
式（9)で示されるペプチドの合成：
[化 17] Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH
(9)
Figure imgf000030_0001
製造例 2により得られたペプチド 120mgと 2,2'-ジチォビス（5-二トロピリジン） 30mgを ジメチルスルホキシド 3ml中に混合し 1時間室温攪拌した。反応液に還元型ダルタチ オン 30mgをカ卩ぇ 30分間室温攪拌後、水 lmlを加え還元型ダルタチオン 30mgを追カロし さらに 20分間攪拌した。反応液にァセトニトリル 100mlを加え生じた沈殿物を濾取、減 圧乾燥することにより粗ペプチド 160mgを得た。得られた粗ペプチドをァセトニトリル- 酢酸-水 (5/5/45)の混合液 55mlに溶解し HPLC精製した。
ポンプ： Shimazu製； LC- 6A型
カラム： YMC ODS-A 2cm X 25cmL, 10
溶出液 1 : H O/0.1%TFA
2
溶出液 2 : CH CN/0.1%TFA
3
流速： 10ml/min
検出： UV220nm
2液濃度 10%で平衡ィ匕させたカラムに粗ペプチド溶液をチャージした。その後 2液濃 度 10%で 10分間、 17%で 15分間送液しその後 1分間あたり 0.05%の割合で 2液濃度を上 昇させた。 目的物を含む分画を集め、ァセトニトリルを減圧留去し凍結乾燥すること により目的とするペプチド 18mgを得た。
'質量分析： LC- ESI/MS m/z =1445 [M+l]+ (理論値 = 1445.5)
実施例 5
式 (6)で示されるペプチドの合成：
[化 18]
Figure imgf000031_0001
製造例 1により得られたペプチド 240mgと 2,2'-ジチォビス（5-二トロピリジン） 60mgを ジメチルスルホキシド 6ml中に混合し 1時間室温攪拌した。反応液にチォグリコール酸 ナトリウム lOOmgをカ卩ぇ 30°Cにて 30分間攪拌した。さらにチォグリコール酸ナトリウム 50 mg、ジメチルスルホキシド 4ml、水 2mlを追加し 30分間攪拌後ァセトニトリル 200mlをカロ え生じた沈殿物を濾取、減圧乾燥することにより粗ペプチド 305mgを得た。得られた 粗ペプチドをァセトニトリル-酢酸-水（30/30/270)の混合液 330mlに溶解し、濾過後 濾液を HPLC精製した。
ポンプ： Shimazu製； LC- 8A型
カラム： YMC ODS-A 3cm X 25cmL, 10
溶出液 1 : H O/0.1%TFA
2
溶出液 2 : CH CN/0.1%TFA
3
流速： 20ml/min
検出： UV220nm
2液濃度 10%で平衡ィ匕させたカラムに粗ペプチド溶液をチャージした。その後 2液濃 度 10%で 10分間、 20%で 15分間、 23%で 15分間送液しその後 1分間あたり 0.05%の割合 で 2液濃度を上昇させた。 目的物を含む分画を集め、ァセトニトリルを減圧留去し凍 結乾燥することにより目的とするペプチド 15mgを得た。
'質量分析： LC- ESI/MS m/z =1263 [M+l]+ (理論値 = 1262.5)
実施例 6
式（7)で示されるペプチドの合成：
[化 19]
Figure imgf000032_0001
製造例 2により得られたペプチド 240mgと 2,2'-ジチォビス（5-二トロピリジン） 60mgを ジメチルスルホキシド 6ml中に混合し 1時間室温攪拌した。反応液にチォグリコール酸 ナトリウム 50mgをカ卩ぇ 30分間攪拌した。さらにチォグリコール酸ナトリウム 50mgを追カロ し 30°Cにて 1時間攪拌後ァセトニトリル 200mlをカ卩ぇ生じた沈殿物を濾取、減圧乾燥 することにより粗ペプチド 194mgを得た。得られた粗ペプチドをァセトニトリル-酢酸-水 (10/20/90)の混合液 120mlに溶解し、濾過後濾液を HPLC精製した。
ポンプ： Shimazu製； LC- 8A型
カラム： YMC ODS-A 3cm X 25cmL, 10
溶出液 1 : H O/0.1%TFA
2
溶出液 2 : CH CN/0.1%TFA
3
流速： 20ml/min
検出： UV220nm
2液濃度 10%で平衡ィ匕させたカラムに粗ペプチド溶液をチャージした。その後 2液濃 度 10%で 10分間、 18%で 15分間送液しその後 1分間あたり 0.1%の割合で 2液濃度を上 昇させた。 目的物を含む分画を集め、ァセトニトリルを減圧留去し凍結乾燥すること により目的とするペプチド 30mgを得た。
'質量分析： LC- ESI/MS m/z =1230 [M+l]+ (理論値 = 1230.4)
実施例 7
式 (4)で示されるペプチドの合成：
1.保護ペプチド榭脂 (Boc- Cys(Boc- Cys- OH)- Tyr(tBu)- Thr(tBu)- Trp(Boc)- Asn(Tr t)— Gln(Trt)— Met— Asn(Trt)— Leu— Alko— Resinの合成 BocHN
Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko- esin (10)
COOH
NHBoc
Fmoc-Leu-Alko-榭脂（ここで、 Alkoは p—アルコキシベンジルアルコールを表す） 1 0g (渡辺化学製； 0.74mmol/g)を Advanced ChemTech社製 ACT90型固相合成機の 50 0ml反応槽内に入れ、ー且この榭脂を DMF等で洗浄後（工程 1)、 25%ピぺリジンで処 理 (3分 X 1回及び 15分 X 1回）して Fmoc基を切断後（工程 2)、再び DMF等で榭脂を 洗浄し（工程 6)、ピぺリジンを除去した。この反応槽内に、 Fmoc-Asn(Trt)- OH 13.25 gと HOBT (1—ヒドロキシベンゾトリァゾール） 3.4gを NMP(N—メチルピロリジノン） 200 mlに溶解した溶液を加え、更に DIPCI (N, N，—ジイソプロピルカルボジイミド） 3.42ml を加えて 60分間室温撹拌を行った（工程 3)。 NMPで榭脂を洗浄し（工程 4)、 Fmoc- Asn(Trt)-OH 13.25gと HOBT 3.4gと DIPCI 3.42mlを用いて再度カップリング反応を行 つた（工程 3)。榭脂を洗浄後（工程 6) 25% Ac 0 (無水酢酸)で 3分 xl回、 15分 X 2回
2
攪拌することにより未反応のアミノ基をキヤッビングした (工程 5)。榭脂を洗浄し (工程 6 )、脱保護（工程 2)、洗浄操作 (工程 6)を行うことにより、 H- Asn(Trt)- Leu- Alko-榭脂 とした。同様にして Fmoc- Met- OH 8.25g、 Fmoc- Gln(Trt)- OH 13.56g、 Fmoc- Asn(Tr t)-OH 13.25gゝ Fmoc— Trp(Boc)— OH 11.69gゝ Fmoc— Thr(tBu)— OH 8.82gゝ Fmoc— Tyr( tBu)- OH 10.2g、 (Boc-Cys-OH) 19.56gを用いてカップリング反応を行った。但しカツ
2
プリングが困難な場合はカップリングを 3回繰り返して行った。 N末端の (Boc-Cys- OH ) (Ν,Ν'— t-ブトキシカルボ-ルシスチン)を縮合後、工程 6の洗浄操作を実施し、ジ
2
ェチルエーテル 200mlで 2回洗浄後減圧乾燥することにより Boc- Cys(Boc- Cys- OH)- Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)— Asn(Trt)— Gln(Trt)— Met— Asn(Trt)— Leu— Alko— Resin ( (式（10)のペプチドレジン)） 22.87gを得た。上記合成工程の概要を表に示す。
<合成工程 >
[表 1] 工程 処理回数 時間 (分）
1) 洗浄 DMF 200ml X3 0.3
MeOH 200ml XI 0.3
DMF 200ml X3 0.3
2) 脱保護 25%ピペリジン/ DMF 200ml 3.0
200ml 15.0
3) カツプリング 各ァミノ基保護アミノ酸 （3当量） 60X1
H0BT (3当量） DIPCI (3当量） MP 200ral
4) 洗浄 NMP 200ml X 2 0.3
5) キヤッビング 25%無水醉¾/01^ 200ml 3.0
200ml 15.0
6) 洗浄 DMF 200ml X5 0.3
MeOH 200ml XI 0.3
DMF 200ml X5 0.3
[0057] 2.保護ペプチド榭脂の脱保護
上記操作によって得られた保護ペプチド榭脂 (Boc- Cys(Boc- Cys- OH)- Tyr(tBu)- T hr(tBu)—Trp(Boc)—Asn(Trt)—Gln(Trt)— Met— Asn(Trt)— Leu— Alko— Resin 22.87gにトリフ ルォロ酢酸/エタンジチオール/水/トリイソプロビルシラン (94/2.5/2.5/1)混合液 200m 1を加え、室温で 4時間攪拌した。反応液を濾過後濾液を氷冷下ジェチルエーテル 4 00mlにカ卩えた。沈殿物をグラスフィルターで濾取しジェチルエーテルで洗浄後、減圧 乾燥することにより粗ペプチド 8.27gを得た。
[0058] 3.粗ペプチドの精製
得られた粗ペプチド 2.76gを 20%酢酸水 (1400ml)とァセトニトリル (35ml)の混合液に 溶解後、不溶物を濾去し逆相液体クロマトグラフィーにより精製した。
ポンプ： Shimazu製； LC- 8A型
カラム： YMC ODS-A 5cm X50cmL, 15- 溶出液 1:H O/0.1%TFA
2
溶出液 2:CH CN/0.1%TFA 検出： UV280nm
カラムを 2液濃度 10%で平衡ィ匕させた後粗ペプチド溶液をチャージした。 2液濃度 10 %で 30分間送液した後 120分間かけて 2液濃度を 34%に上昇させた。 目的物を含む分 画を集め、ァセトニトリルを減圧留去し凍結乾燥することにより目的とするペプチド H- Cys(H-Cys-OH)-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH (式（4)のペプチド） 0.9 lgを得た。
試験例 1
(マウスの免疫 (1))
実施例 1〜6で得た各抗原ペプチドの免疫原性にっ 、て、 HLA— A2402/Kbトラ ンスジヱニックマウス（WO 02/47474号公報、以下 HLA—A24マウスとも称する）を 利用することにより評価した。 1ペプチドにっき 3匹のトランスジエニックマウスに免疫 することにより、それぞれのペプチドの免疫原性を評価した。
各合成ペプチドを用いた薬剤は以下にように調整した。即ち、実施例 1〜3、 5、 6に 記載の合成ペプチドを DMSOにて 40mg/mlに調整した。その後、当該 32.5 1を注 射用水 540 μ 1と混合した。更に、当該 550 μ 1と 700 μ 1のフロイントの不完全アジュバン ト（Montanide ISA51)とをガラスシリンジを用いて混合することにより water- in- oilエマ ルシヨンを作製した。実施例 4記載のペプチドにつ!/、ては DMSOにて 50mg/mlに調 整し、一方ヘルパー合成ペプチド（FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE、配列番号 ： 5)を DMSOに 20mg/mlに調整して、それぞれ 30 μ 1を注射用水 540 μ 1と混合した後 、等量のフロイント不完全アジュバント（IFA)と混合することにより water-in- oilェマル シヨンを作製した。
その後、当該薬剤の 200 μ 1を HLA— A2402/Kbトランスジエニックマウスの尾根 部の皮内に免疫した。実験開始 7— 8日後に脾臓を摘出し、スライドガラスのフロスト 部分にて擦り破壊し、脾細胞を回収'調製した。 ACKバッファー（0.15M NH Cl、 10m
4
M KHCO ,、 O.lmM EDTA, pH7.2-7.4)にて溶血処理した脾細胞の一部に免疫した
3
抗原ペプチドを 100 μ g/mlで 1時間パルスして 7χ106個/ wellで 24穴プレートに播種し た。このとき、非ペプチドパルスの 7xl05個/ wellの脾細胞を同時に加えて 37°C下で 5 -6日間イン 'ビトロ刺激培養した。ここでは、 RPMI— 1640培地に 10%FCS、 lOmM HEPES、 20mM L—グルタミン、 1 mMピルビン酸ナトリウム、 ImM MEM非必須アミ ノ酸、 1%MEMビタミン、 55 M 2-メルカプトエタノールを添カ卩した培地にて培養した
[0060] 次に、再刺激開始 5— 6日後に、常法に従って細胞傷害性試験を行った。標的細 胞 (T)として、 EL— 4細胞（大日本製薬株式会社、カタログ No. 06-39)に HLA— A2 402/Kbをコードする遺伝子発現ベクターを導入して得られた EL4— A2402/Kb細 胞、あるいは当該 EL4—A2402/Kb細胞に抗原ペプチド： WT1 又は WT1 (
235-243 235-243
2M→Y) )をパルスした細胞を用いた。具体的には実施例 1、実施例 3、実施例 5のぺ プチドの評価に関しては WT1 (2M→Y)をパルスした細胞を用い、実施例 2、実
235-243
施例 4、実施例 6のペプチドの評価に関しては WT1 をパルスした細胞を用いた。
235-243
これらの細胞は 1. 85MBq/106個で51 Crラベルし、ペプチドパルスは 100 g/mlで 1 時間実施した (ラベル時間 2時間、ラベル開始 1時間後にペプチドを添加)。イン'ビト 口培養した脾細胞 (E)による標的細胞 (T)に対する傷害活性を51 Crリリースアツセィ ( J.ImmunoL, 159:4753, 1997)により測定した。このとき、 E/T比 80において作用させ た。
[0061] 結果を、図 1〜7に示す。図 1〜6は、それぞれ、実施例 1〜6のペプチドィ匕合物に 対応しており、図中、 Y軸は細胞傷害活性 (Specific Lysis)を示し、 X軸は 3匹のマウ ス個体毎の結果を示す。また、実施例 1の化合物の用量依存性試験の結果を図 7〖こ 示す。 Y軸は細胞傷害活性 (Specific Lysis)を示し、 X軸は個体当たりの投与量 (600 μ g、 200 g、 g、及び 20 g)を示す。各用量においては、 3匹のマウスを利用し 、それぞれの細胞傷害活性平均値及び標準偏差 (S.D.)を示す。図から明らかな通り 、すべての合成ペプチドが CTL誘導活性を有すること、すなわち免疫原性を有する ことが判明した。
[0062] 試験例 2
(マウスの免疫 (2))
実施例 1のペプチドを DMSOにて 40mgZmlに調整した。その後、当該 32.5 1を注 射用水 540 μ 1と混合したのち、 550 μ 1を 700 μ 1のフロイントの不完全アジュバント Μοη tanide ISA51(登録商標） (SEPPIC, Inc, Paris, France)とガラスシリンジを用いて混合 することにより water-in-oilエマルシヨンを作製した。
[0063] 次に、当該薬剤の 200 1を HLA-A2402/Kbトランスジエニックマウスの尾根部の皮 内に免疫した。実験開始 7日後に、常法により脾臓の摘出および脾細胞を調製した（ WO 02/47474号公報）。その後、 mouse IFN gamma ELISPOT set (Enzyme - Linked Immunospot) (フジサヮ、カタログ番号 BD-551083)を用いて測定した。方法は添付書 に従って行ない、 1ゥエルあたり 5xl05 cellsの脾細胞を注ぎ、更に、実施例 1のぺプチ ド、天然型ペプチド (WT1 ),またはインフルエンザウイルス由来ペプチド（ASNEN
235-243
METM、 HLA-A24非結合性の negative controlペプチド）を含む細胞培地（最終濃度 10— 6 M)を注いだ。その後、約 18時間 37°C COインキュベーターで培養した。
2
添付書に従ってプレートを洗浄し、 KS Elispot Researchシステム（Carl Zeiss社製） にてスポット数を検出した。尚、 Elispot法は細胞傷害性試験の代替法として知られて いる手法である（J.Immunological Methods, 1995, 181, 45-54)。結果を図 8に示す。 その結果、実施例 1のペプチドは、天然型ペプチドに交叉反応性を示す HLA-A24特 異的な細胞性免疫を誘導できることが判明した。
[0064] 試験例 3
(ヒト PBMCを用いた試験）
HLA-A24陽性の健常人よりへパリン入りの真空採血管にて末梢血 50mlを採血した 。 2倍に PBS (-)で希釈した血液を半量の FicoU- Paque (Amersham Biosciences社）に重 層した後、 2000rpmで 20分間遠心した。末梢血単核球 (PBMC)を含む細胞層を回収 し、 3〜4倍量の PBS (-)をカ卩え、 1800rpmで 10分間遠心した。細胞ペレットを PBS (-)で 更に 2回洗浄し、 PBMCを回収した。
[0065] PBMCをリンパ球用培養液（RPMI1640 :AIM V= 1： 1、 NEAA、 10%FCS)に懸濁し 、培養フラスコで 2時間培養し、非付着細胞を回収した。非付着細胞力も CD8+ T cell アイソレーションキット II (Miltenyi Biotec社）を用いて CD8陽性の T細胞を回収した。 付着細胞は、 lOOOU/mlの GM- CSFと lOOOU/mlの IL-4を含むリンパ球用培養液で 7日 間培養し、浮遊細胞を回収して榭状細胞 (DC)を含む抗原提示細胞画分とした。回 収した細胞は、実験に使用するまで凍結して保存した。
[0066] 上記で調製した DC細胞画分に実施例 1のペプチドを 50 μ g/mlのマイトマイシンを 含む AIM-V培地に 50 μ g/ml添カ卩して 1時間培養し、パルスした。その後、培地で 3回 洗浄後、更に実施例 1のペプチドを 50 g/mlの濃度で添加し、 1時間パルスして抗原 提示細胞とした。 DayOに CD8陽性の T細胞にペプチドパルス抗原提示細胞を添加し て 1回目の刺激を行い、 24穴プレートで lOng/mlの IL-7を含むリンパ球用培養液で培 養を開始した。 Day7に T細胞を回収し、洗浄後、 1回目と同様にペプチドパルスした 抗原提示細胞でペプチド刺激を行った。翌日（Day8)に 50U/mlになるように IL-2を添 加した。 Dayl4に T細胞を回収し、 1回目、 2回目と同様な方法で 3回目の刺激を行つ た。翌日（Dayl5)に 50U/mlになるように IL_2を添カ卩した。 Day21に T細胞を回収して 凍結保存した。
各種ペプチド（天然型ペプチド (WT1 )、改変ペプチド (WT1 (2M→Y))また
235-243 235-243
は実施例 1のペプチド）をパルスした 2 X 104個の VA13/A2402細胞（HLA-A2402発現 )、またはペプチドをパルスしていない 2 X 104個の VA13/A2402細胞に対して、 1 X 105 個の Day21の T細胞を添カ卩し、 18時間後に上清を回収して、 ELISAで IFN- γ量を測 し 7こ。
[0067] 実施例 1の合成ペプチドで刺激した Τ細胞のペプチド特異的反応性の検討結果を 図 9に示す。実施例 1のペプチドで刺激した Τ細胞は、ペプチドをパルスしていない 細胞に対してほとんど反応しな 、が、実施例 1に記載のペプチドをパルスした細胞に 良好に反応しており、ペプチド特異的な Τ細胞が誘導されていることが明らかになつ た。また誘導されたペプチド特異的な Τ細胞は、天然型ペプチド (WT1 )及び改
235-243 変ペプチド (WT1 (2Μ→Υ) )をパルスした細胞に対しても同様に反応性を示した
235-243
[0068] 製造例 1
1.保護ペプチド榭脂 (Η- Cys(Trt)- Tyr(tBu)- Thr(tBu)- Trp(Boc)- Asn(Trt)- Gln(Trt)- Met- Asn(Trt)- Leu- Alko- Resinの合成
Fmoc-Leu-Alko-榭脂（ここに、 Alkoは p—アルコキシベンジルアルコール） 10g (渡 辺化学製； 0.82mmol/g)を Advanced ChemTech社製 ACT90型固相合成機の 500ml反 応槽内に入れ、ー且この榭脂を DMF等で洗浄後（工程 1)、 25%Pip (ピペリジン)で処 理 (3分 X 1回及び 15分 X 1回）して Fmoc基を切断後（工程 2)、再び DMF等で榭脂を 洗浄し（工程 1)、 Pipを除去した。この反応槽内に、 Fmoc- Asn(Trt)- OH 24.46gと HO BT (1—ヒドロキシベンゾトリァゾール） 6.28gを NMP(N—メチルピロリジノン） 200mlに 溶解した溶液を加え、更に DIPCI (N, N，—ジイソプロピルカルボジイミド） 6.3mlをカロ えて 30分間室温撹拌を行った（工程 3)。 30分後、 NMPで榭脂を洗浄し (工程 4)、 Fm oc- Asn(Trt)- OH 24.46gと HOBT 6.28gと DIPCI 6.3mlを用いて再度カップリング反応 を行い（工程 5)、 Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Alko榭脂を合成した。その後、工程 2の脱保 護操作を行い、 H- Asn(Trt)- Leu- Alko-榭脂とした。次いで、工程 1の洗浄操作を行 い、 Fmoc— Met— OH 15.23g、 Fmoc— Gln(Trt)— OH 25.04g、 Fmoc— Asn(Trt)— OH 24.46 g、 Fmoc— Trp(Boc)— OH 21.59gゝ Fmoc— Thr(tBu)— OH 16.3g、 Fmoc— Tyr(tBu)— OH 18. 84g、 Fmoc- Cys(Trt)- OH 24.01gを順次加え、工程 3のカップリング反応を行った。伹 し Fmoc-Thr(tBu)- OHにつ!/、てはカップリングを 3回繰り返して行った後、得られた榭 脂を DMFで洗浄後、 25% Ac 0 (無水酢酸)で 15分 X 2回で未反応のアミノ基をキヤッ
2
ビングした。 N末端の Fmoc- Cys(Trt)- OHを縮合後、工程 2の脱保護操作を行い、ェ 程 6の洗浄操作を実施し、 H- Cys(Trt)- Tyr(tBu)- Thr(tBu)- Trp(Boc) -Asn(Trt)- Gin (Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-Resinを得た。上記合成工程の概要を表に示す。 <合成工程 >
[表 2]
工程 処理回数 時間 (分）
1) 洗浄 DMF 200ml X6 0.3
MeOH 200ml XI 0.3
DMF 200ml X3 0.3
2) 脱保護 25%ピペリジン/ DMF 200ml 3.0
200ml 15.0
3) カツプリング 各ァミノ基保護アミノ酸 （5当量） 30X1
H0BT (5当量） DIPCI (5当量） MP 200ral
4) 洗浄 NMP 200ml X 2 0.3
5) カツプリング 各ァミノ基保護アミノ酸 （5当量） 30X1
H0BT (5当量） DIPCI (5当量） NMP 200ml
6) 洗浄 DMF 200ml X5 0.3
MeOH 200ml XI 0.3
DMF 200ml X2 0.3
[0070] 2.保護ペプチド榭脂の脱保護
上記操作によって得られた保護ペプチド榭脂 (H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp( Boc)—Asn(Trt)—Gln(Trt)— Met— Asn(Trt)— Leu— Alko— Resin lO.Ogにトリフルォロ酢酸/ェ タンジチオール/水/トリイソプロビルシラン (94/2.5/2.5/1)混合液 100mlをカ卩え、室温 で 4時間攪拌した。反応液を氷冷下 t—ブチルメチルエーテル 625mlにカ卩え、 15分間 攪拌後不溶物をグラスフィルターで濾取した。濾上物を約 100mlの tーブチルメチルェ 一テルで 5回洗浄し、洗浄後の濾上物を 6M塩酸グァニジン水溶液 1Lで抽出するこ とにより粗ペプチド溶液を得た。
[0071] 3.粗ペプチドの精製
得られた粗ペプチド溶液を逆相液体クロマトグラフィーにより精製した。
ポンプ： Shimazu製； LC- 8A型
カラム： YMC ODS-A 5cm X50cmL, 15- 溶出液 1:H O/0.1%TFA
2
溶出液 2:CH CN/0.1%TFA 検出： UV220nm
水浴で 50°Cに保温したカラムを 2液濃度 10%で平衡ィ匕させた後粗ペプチド溶液をチ ヤージした。 2液濃度 10%で 30分間送液した後 40分間かけて 2液濃度を 20%に上昇さ せ更に 360分間かけて 2液濃度を 40%に上昇させた。目的物を含む分画を集め、ァセ トニトリルを減圧留去し凍結乾燥することにより目的とするペプチド (H-Cys-Tyr-Thr- Trp- Asn- Gin- Met- Asn- Leu- OH (配列番号： 2) 1.50gを得た。
[0072] ·アミノ酸分析
加水分解： 1%フエノール /6N塩酸水、 110°C 10時間
分析法:ニンヒドリン法
Asx: 1.96(2) Thr: 1.05(1) Glx: 1.06(1) Met: 1.05(1) * Leu:(l) Tyr:0.87(l) *) Leu=基準アミノ酸（ )内 理論値
'質量分析： LC- ESI/MS m/z =1173 [M+l]+ (理論値 = 1172.5)
•アミノ酸配列分析: N末 2残基目 Tyrから、 C末 Leuまで順次確認した。
[0073] 製造例 2
1.保護ペプチド榭脂 (H- Cys(Trt)- Met- Thr(tBu)- Trp(Boc)- Asn(Trt)- Gln(Trt)- Met- Asn(Trt)- Leu- Alko- Resinの合成
Fmoc-Leu-Alko-榭脂（ここに、 Alkoは p—アルコキシベンジルアルコール） 10g (渡 辺化学製； 0.81mmol/g)を Advanced ChemTech社製 ACT90型固相合成機の 500ml反 応槽内に入れ、ー且この榭脂を DMF等で洗浄後（工程 1)、 25%Pip (ピペリジン)で処 理 (3分 X 1回及び 15分 X 1回）して Fmoc基を切断後（工程 2)、再び DMF等で榭脂を 洗浄し（工程 1)、 Pipを除去した。この反応槽内に、 Fmoc-Asn(Trt)- OH 24.17gと HO BT (1—ヒドロキシベンゾトリァゾール） 6.2gを NMP(N—メチルピロリジノン） 200mlに溶 解した溶液を加え、更に DIPCI (N, N，—ジイソプロピルカルボジイミド） 6.2mlをカロえ て 30分間室温撹拌を行った（工程 3)。 30分後、 NMPで榭脂を洗浄し (工程 4)、 Fmoc - Asn(Trt)- OH 24.17g、 HOBT 6.2g及び DIPCI 6.2mlを用いて再度カップリング反応 を行い（工程 5)、 Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Alko榭脂を合成した。その後、工程 2の脱保 護操作を行い、 H- Asn(Trt)- Leu- Alko-榭脂とした。次いで、工程 1の洗浄操作を行 い、 Fmoc— Met— OH 15.05gゝ Fmoc— Gln(Trt)— OH 24.73gゝ Fmoc— Asn(Trt)— OH 24.17 g、 Fmoc— Trp(Boc)— OH 21.33gゝ Fmoc— Thr(tBu)— OH 16.1gゝ Fmoc— Met— OH 15.05g 、 Fmoc- Cys(Trt)- OH 23.72gを順次加え、工程 3のカップリング反応を行った。但し F moc-Thr(tBu)- OHにつ!/ヽてはカップリングを 3回繰り返して行った後、得られた榭脂 を DMFで洗浄後、 25%Ac 0 (無水酢酸）で 15分 X 2回で未反応のアミノ基をキヤッピン
2
グした。 N末端の Fmoc- Cys(Trt)- OHを縮合後、工程 2の脱保護操作を行い、工程 6 の洗净操作を実施し、 H— Cys(Trt)— Met— Thr(tBu)— Trp(Boc)— Asn(Trt)— Gln(Trt)— Met— Asn(Trt)-Leu-Alko- Resinを得た。上記合成工程の概要は製造例 1の表に記載され た工程と同じである。
[0074] 2.保護ペプチド榭脂の脱保護
上記操作によって得られた保護ペプチド榭脂 (H- Cys(Trt)- Met- Thr(tBu)- Trp(Boc) -Asn(Trt)-Gln(Trt)- Met- Asn(Trt)- Leu- Alko- Resin 13.0gにトリフルォロ酢酸/エタン ジチオール/水/トリイソプロビルシラン (94/2.5/2.5/1)混合液 130mlをカ卩え、室温で 4 時間攪拌した。反応液を氷冷下ジェチルエーテル 800mlに加え、 15分間攪拌後不溶 物をグラスフィルターで濾取した。濾上物を約 100mlのジェチルエーテルで 5回洗浄 し、洗浄後の濾上物を 6M塩酸グァニジン水溶液 1.3Lで抽出することにより粗ぺプ チド溶液を得た。
[0075] 3.粗ペプチドの精製
得られた粗ペプチド溶液を逆相液体クロマトグラフィーにより精製した。
ポンプ： Shimazu製； LC- 8A型
カラム： YMC ODS-A 5cm X 50cmL, 15- 溶出液 1 : H O/0.1%TFA
2
溶出液 2 : CH CN/0.1%TFA
3
流速： 60ml/ mm
検出： UV220nm
水浴で 50°Cに保温したカラムを 2液濃度 10%で平衡ィ匕させた後粗ペプチド溶液をチ ヤージした。 2液濃度 10%で 30分間送液した後 40分間かけて 2液濃度を 20%に上昇さ せ更に 360分間かけて 2液濃度を 40%に上昇させた。 目的物を含む分画を集め、ァセ トニトリルを減圧留去し凍結乾燥することにより目的とするペプチド (H-Cys-Met-Thr- Trp- Asn- Gin- Met- Asn- Leu- OH (配列番号： 1) 2.32gを得た。
[0076] ·アミノ酸分析
加水分解： 4Nメタンスルホン酸、 110°C 17時間
分析法:ニンヒドリン法
Asx: 1.87(2) Thr:0.93(l) Glx:0.95(l) Met: 1.72(2) *Leu:(l) Trp:0.80(l) *) Leu=基準アミノ酸（ )内 理論値
'質量分析： LC- ESI/MS m/z =1141 [M+l]+ (理論値 = 1140.5)
•アミノ酸配列分析: N末 2残基目 Metから、 C末 Leuまで順次確認した。
産業上の利用可能性
[0077] 本発明のペプチドィ匕合物等は、癌免疫療法剤の有効成分として、有用である。
[0078] 配列表フリーテキスト
配列番号 1：ペプチド誘導体
配列番号 2：ペプチド誘導体
配列番号 3：ペプチド誘導体
配列番号 4：ペプチド誘導体
配列番号 5：ヘルパー合成ペプチド

Claims

請求の範囲
式 (1) :
[化 1]
Figure imgf000044_0001
〔式中、 Xはチロシン残基又はメチォニン残基を表し、
Y及び Zは、独立して、単結合又は 1〜10残基のアミノ酸力もなるペプチドの二価基 を表し、
R1は水素原子又はアルキル基を表し、
R2は水酸基、アミノ基、アルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基を表し、
R3は水素原子、アルキル基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、又は 置換もしくは無置換のアルキルカルボ-ルァミノ基を表し、
R4は水素原子、アルキル基、カルボキシ基、力ルバモイル基、アルキル力ルバモイル 基、ジアルキル力ルバモイル基、又は式（2)：
[化 2]
Figure imgf000044_0002
(式中、 Wはアミノ酸残基を表す）
で表される基を表し、
mは 1又は 2を表し、
nは 0〜2の整数を表す。但し、 nが 0を表す場合、 R3は水素原子又はアルキル基を 表す。〕
で表される化合物、又はその薬学上許容される塩。
R3において、置換アルキルカルボ-ルァミノ基力 カルボキシ基、アミノ基、アルキ ルァミノ基及びジアルキルアミノ基カゝら選択される 1又は 2の置換基で置換されたアル キルカルボニルァミノ基である、請求項 1に記載の化合物又はその薬学上許容される 塩。
R3が水素原子、又は式 (3) :
[化 3]
Figure imgf000045_0001
H
(式中、 rは 1〜3の整数を表す）
で表される基であり、
R4がカルボキシ基又は式（2' )：
[化 4]
Figure imgf000045_0002
(式中、 Wはグリシン残基又は β—ァラニン残基を表す）
で表される基である、請求項 1又は 2に記載の化合物、又はその薬学上許容される塩
R3が式 (3' )：
[化 5]
Figure imgf000045_0003
Η
で表される基であり、
R4がカルボキシメチルカルバモイル基である、請求項 3に記載の化合物、又はその 薬学上許容される塩。
[5] R3が水素原子であり、 R4がカルボキシ基である、請求項 3に記載の化合物、又はそ の薬学上許容される塩。
[6] 式 (1 ' ) : [化 6]
ひ,）
Figure imgf000046_0001
〔式中、 X'はチロシン残基又はメチォニン残基を表し、 R1'は水素原子又はアルキル 基を表し、 R2'は水酸基、アミノ基、アルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基を表し、 R3'はァミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基又は置換もしくは無置換のアル キルカルボ-ルァミノ基を表し、
R4'はカルボキシ基、力ルバモイル基、アルキル力ルバモイル基又はジアルキルカル バモイル基を表す。〕
で表される化合物、又はその薬学上許容される塩。
請求項 1〜6のいずれかで表される化合物又はその薬学上許容される塩に特異的 に結合する抗体。
請求項 1〜6のいずれかで表される化合物又はその薬学上許容される塩と HLA— A24抗原との複合体が提示されて 、る抗原提示細胞。
請求項 1〜6のいずれかで表される化合物又はその薬学上許容される塩により誘導 された CTL。
請求項 1〜6のいずれかで表される化合物又はその薬学上許容される塩と HLA— A24抗原との複合体を認識する、請求項 9に記載の CTL。
配列番号： 1に記載のペプチドと HLA— A24抗原との複合体を認識する、請求項 9に記載の CTL ;
請求項 1〜6のいずれかで表される化合物もしくはその薬学上許容される塩、請求 項 8に記載の抗原提示細胞又は請求項 9〜： L 1のいずれかに記載の CTL、及び薬学 的に許容される担体を含有する医薬組成物。
癌ワクチンとして使用される、請求項 12に記載の医薬組成物。
請求項 1〜6のいずれかで表される化合物もしくはその薬学上許容される塩、請求 項 8に記載の抗原提示細胞又は請求項 9〜： L 1のいずれかに記載の CTLの、癌ワク チンを製造するための使用。
[15] 請求項 1〜6のいずれかで表される化合物もしくはその薬学上許容される塩、請求 項 8に記載の抗原提示細胞又は請求項 9〜： L 1のいずれかに記載の CTLを有効成 分として含有する、癌免疫療法剤。
[16] 癌を治療又は予防するための方法であって、請求項 1〜6のいずれかで表される化 合物もしくはその薬学上許容される塩、請求項 8に記載の抗原提示細胞又は請求項
9〜11のいずれかに記載の CTLの治療又は予防に有効な量を、それを必要として いる HLA-A24陽性かつ WT1陽性の癌患者に投与することからなる方法。
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