WO2007046450A1 - 血栓観測装置および血栓観測方法 - Google Patents

Abstract

血管を模した流路に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除または血液凝固を促進しつつ流して血栓の生成を観測する血栓観測装置であって、該血栓観測装置は、その内部の少なくとも一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材が設けられた血栓生成室と、該血栓生成室に接続されて前記血栓生成室に血液を流入させる流入管と、該流入管に接続されて前記流入管に抗凝固処理を解除する薬剤または血液凝固を促進する薬剤を投入する薬剤管と、を有する血栓観測装置、および、その内部の少なくとも一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材が設けられた血栓生成室に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除または血液凝固を促進しつつ流して血栓の生成を観測する血栓観測方法。

Description

明 細 書

血栓観測装置および血栓観測方法

技術分野

[0001] 本発明は、患者等に投与した抗血栓薬の効能を観測する方法に関し、具体的には

、全血または血小板を含む血漿を用いて血流と同等環境下における血液凝固およ び血小板による血栓形成を総合的に評価する装置および方法に関する。

背景技術

[0002] 例えば、心筋梗塞等のァテローム血栓症は、動脈硬化部位にてァテロームブラー クが壊れ、血流に暴露された組織因子を含むコラーゲン上に、血小板が粘着し、さら に血小板凝集、血液凝固系の活性ィヒが複合的に起こり、閉塞性の重篤な血栓を生 じる。心筋梗塞等の心疾患による死亡は日本においても全死因の 2位を占める重篤 な疾患である。

し力しながら、心筋梗塞等においては動脈硬化領域においてのみ血栓形成が進み 、全身における血栓傾向が極端に進む事はない。このような血栓症における血栓傾 向の評価、抗血栓療法における抗血栓効果のモニタリングには試験管内の試験は 不向きであり、血流の存在下、凝固および血小板 (粘着、凝集)の総合的な評価が重 要である。

[0003] 従来、血液凝固能の評価は、血漿を用いた部分活性化トロンボプラスチン時間 (A PTT)、トロンボプラスチン時間（ΡΤ)、によって検査されている。 ΑΡΤΤは主に内因 系凝固、 ΡΤは外因系凝固を反映する。血小板の検査としては多血小板血漿を用い 、 ADP、コラーゲン等の血小板活性ィ匕物質を加え透過度の変化等によって血小板 の凝集能を評価する事もできる。また、全血凝固時間、カルシウム再添加全血凝固 時間等によって全血の凝固時間の測定もなされる。

さらに、全血を用いた検査系としてはトロンボェラストグラムが用いられ、凝固成分の 活性ィ匕および血小板の凝集等がモニタリングされる。

し力しながら、生体内では血流下で血栓が成長するのに対し、上記の検査方法等 は閉鎖された試験管内での測定であるため、血栓が生体内で成長する状態を観察 することはできない。

[0004] この問題点を解決する提案として、特許文献 1、非特許文献 2、 3には、評価すべき 抗血栓薬が投入された血液をコラーゲンセル上を通過させ、血小板を蛍光標識する 事で血小板の粘着、凝集を共焦点顕微鏡装置によりモニタリングする方法が開示さ れている。

しかし、この文献に記載の発明は、抗凝固薬の存在下で観測を行うために、凝固系 によって起こる血小板の粘着、凝集による血栓が形成されないこと、ないしは、血栓 の生成能の低下を、血小板の形態変化を観測することで評価するものであり、凝固 系と連動した血小板活性ィ匕が反映されない。したがって、抗血小板薬の薬効を評価 するには好ましい発明ではある力 血栓そのものや血栓形成過程全体をモニターす る事はできな!、。また蛍光顕微鏡は高価であり一般の検査に使用するのは困難であ る。

又、特許文献 2には抗凝固処理された血液の流動性を微細な櫛状のシリコンセル を通過させることで測定して 、る。やはり特許文献 2の手法も抗凝固処理された血液 を用いるものであり凝固系の影響は測定できな 、。また本手法による血液粘度は個 人差、 日内差が大きぐ薬剤治療を反映するのは困難な状況である。

血小板は凝固系によって活性ィヒされ、凝固系は活性ィヒ血小板によって促進される 。すなわち抗凝固処理された血液は、血小板の活性化も抑制されてしまい抗血栓薬 の効能を観測することはできない。さりとて、抗凝固処理を行わなければ血液は直ち に凝固してしまうので、試験に供することはできな!、。

特許文献 1 :特開 2004— 251630号公報

特許文献 2 :特許公開 2006— 145345号公報

非特許文献 1 : Blood. 1990;75:390-398

非特許文献 2 : Blood. 1999 Aug 1;94(3):968- 75.

発明の開示

[0005] [発明が解決しょうとする課題]

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、患者等に投与した抗血栓薬の 効能を観測するに際し、全血または血小板を含む血漿 (本明細書においては、これ らをまとめて「血液」と 、う場合がある。 )を用いて血流と同等環境下における血液凝 固および血小板による血栓形成を総合的に評価する装置および方法を提供すること を課題とする。

[0006] [課題を解決するための手段]

前記課題を解決するため、本発明は、血管を模した流路に抗凝固処理された血液 を、抗凝固処理を解除または血液凝固を促進しつつ流して血栓の生成を観測する 血栓観測装置であって、その内部の少なくとも一部に血栓生成を誘発する血栓誘発 材が設けられた血栓生成室と、該血栓生成室に接続されて前記血栓生成室に血液 を流入させる流入管と、該流入管に接続されて前記流入管に血液凝固を促進 (以下 「凝固促進」 t ヽぅ場合がある。 )する薬剤または抗凝固処理を解除する薬剤を投入 する薬剤管と、を有することを特徴とする血栓観測装置を提供する。なお、本発明に ぉ 、て「観測」とは、目視ゃ撮像など血栓形成を視覚的に評価することのみならず、 圧力測定などによって血栓形成の程度を数値化して評価することも含む。

また、本発明は、その内部の少なくとも一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材が 設けられた血栓生成室と、該血栓生成室に接続されて前記血栓生成室に血液を流 入させる流入管と、該血栓生成室に接続されて血栓生成室通過後の血液に血栓形 成防止剤を混和させる血栓形成防止剤流入管と、を有することを特徴とする血栓観 測装置を提供する。

ここで、前記血栓観測装置は、基板上に形成されたものであることが好ましい。 本発明の血栓観測装置においては、さらに、流入管および Zもしくは薬剤管をカロ 圧するポンプ又は血栓形成室に接続されて血栓形成室から血液を排出する排出管 を吸弓 Iするポンプを有することが好まし 、。

本発明の血栓観測装置においては、さらに、圧力測定装置や血栓形成室を撮影 するためのカメラを有することが好ま 、。

そして、前記血栓誘発材がコラーゲンを含むものであることが好ま 、。 前記血栓誘発材が、さらに組織因子 (組織トロンボプラスチン)を含むものであるとよ り好ましい。

[0007] また、本発明は、その内部の少なくとも一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材が 設けられた血栓生成室に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除または血液 凝固を促進しつつ流して血栓の生成を観測することを特徴とする血栓観測方法を提 供する。本発明において、「血液を、抗凝固処理を解除または血液凝固を促進しつ つ流す」とは、流路内で抗凝固解除反応または凝固促進反応が起こっている状態で あればよぐ抗凝固解除剤または凝固促進剤を血液と流路内で混合しながら流す場 合と、抗凝固解除剤または凝固促進剤を血液と混合した後に速やかに流すことを含 む。

本発明の血栓観測方法にぉ 、ては、前記抗凝固処理カ^ェン酸などのカルシウム キレート剤による処理であり、遊離カルシウム供与体によって抗凝固処理を解除する ことが好ましい。

本発明の血栓観測方法においては、前記抗凝固処理がトロンビンアブタマ一によ る処理であり、トロンビンァプタマ一のアンチセンス DNAによって抗凝固処理を解除 することが好ましい。

ここで、本発明の血栓観測方法においては、血栓生成室に抗凝固処理された血液 を、抗凝固処理を解除する操作を行うことなく血液凝固を促進しつつ流して血栓の生 成を観測することが好まし 、。ここで血液凝固を促進する手段としては組織トロンボブ ラスチンの添カ卩が好ましい。

また、本発明の血栓観測方法においては、 1種または複数種の抗凝固処理剤を用 いて抗凝固処理された血液を、用いた抗凝固処理剤に対応する少なくとも 1種の抗 凝固処理解除剤で抗凝固処理を解除することが好ましい。ここで、抗凝固処理剤が 接触相因子阻害剤及びカルシウムキレート剤であり、抗凝固処理解除剤が遊離カル シゥム供与体であることが好ましい。また、抗凝固処理剤が接触相因子阻害剤及び へノ《リンであり、抗凝固処理解除剤がへノリナーゼであることが好ましい。さらに、抗 凝固処理剤が血液凝固 XII因子、カリクレインなどの接触相因子の阻害剤及びトロン ビンァプタマ一であり、抗凝固処理解除剤がトロンビンァプタマ一のアンチセンス DN Aであることが好ましぐ血液凝固 XII因子の阻害剤としてはコーン由来トリプシンイン ヒビターが好ましい。

また、本発明の血栓観測方法においては、前記血栓生成室における血液の流入 時および zまたは流出時の圧力を測定することが好ましい。

さらに、本発明の血栓観測方法においては、血栓誘発材がコラーゲンと組織因子 を含むものであることが好まし 、。

[0008] [発明の効果]

請求項 1にかかる本発明の血栓観測装置によれば、その内部の少なくとも一部に 血栓生成を誘発する血栓誘発材が設けられた血栓生成室と、該血栓生成室に接続 されて前記血栓生成室に血液を流入させる流入管と、該流入管に接続されて前記流 入管に抗凝固処理を解除する薬剤または血液凝固を促進する薬剤を投入する薬剤 管と、を有することにより、抗血栓薬を患者等に投与して採血した血液が血栓形成室 に 、たる流路にお 、て凝固しな 、ように抗凝固処理された血液を、血栓生成室にお いて意図的に血栓を形成させて観測することができるので、抗血栓薬の効能を人体 内に近い環境で具体的に観測することができる。また、採血時に抗凝固処理剤を用 いることができるため、採血後の検体を一定期間保存することができ、検査時期を任 意に選択できる利点を有する。

請求項 2にかかる本発明の血栓観測装置によれば、その内部の少なくとも一部に 血栓生成を誘発する血栓誘発材が設けられた血栓生成室と、該血栓生成室に接続 されて前記血栓生成室に血液を流入させる流入管と、該血栓生成室に接続されて血 栓生成室通過後の血液に血栓形成防止剤を混和させる血栓形成防止剤流入管と、 を有することにより、上記と同様に血栓観測が行えることに加え、血栓形成室の下流 において血液凝固が進むことがないので、圧力測定に影響を与えることが防止でき、 さらに微妙な圧力変化を観測することが出来る。

[0009] ここで、本発明の血栓観測装置が基板上に形成されたものであると少量の血液でも 観測が可能となる。また、流入管および Zもしくは薬剤管を加圧するポンプまたは血 栓形成室に接続されて血栓形成室から血液を排出する排出管を吸引するポンプを 有することで、所定圧力又は所定流速で、所定時間、血液や血液凝固を促進する薬 剤を安定して流すことができる。

また、本発明の血栓観測装置が圧力測定装置を有することで血栓形成の程度を数 値化でき、定量的な評価が可能である。 そして、前記血栓誘発材がコラーゲンを含むものであると設置が容易となる。前記 血栓誘発材カ さらにコラーゲンと共に組織トロンボプラスチンなどの組織因子を含 むものであると効果的に血栓生成を誘発することができる。

また、本発明の血栓観測装置が血栓形成室を撮影するためのカメラを有することで 血栓生成の様子を映像として観察し、その映像を保存することも可能である。

[0010] また、請求項 9にかかる本発明の血栓観測方法によれば、その内部の少なくとも一 部に血栓生成を誘発する血栓誘発材が設けられた血栓生成室に抗凝固処理された 血液を、抗凝固処理を解除または血液凝固を促進しつつ流して血栓の生成を観測 することにより、抗血栓薬を患者等に投与して採血した血液が凝固しないように抗凝 固処理された血液を、血液凝固を促進しつつ流して血栓誘発材上の血栓の生成を 観測することができるので、抗血栓薬の効能を人体内に近い環境で具体的に観測す ることができる。また、採血時に抗凝固処理剤を用いることができるため、採血後の検 体を一定期間保存することができ、検査時期を任意に選択できる利点を有する。ここ で、抗凝固処理カ^ェン酸などのカルシウムキレート剤による処理であり、遊離カルシ ゥム供与体によって抗凝固処理を解除すると、試薬の入手が容易であり好ましい。抗 凝固処理がトロンビンァプタマ一による処理であり、トロンビンァプタマ一のアンチセ ンス DNAによって抗凝固処理を解除すると、血液の生理的カルシウムイオン濃度を 反映しつつ検査が可能である。

[0011] また、請求項 12にかかる本発明の血栓観測方法によれば、血栓生成室に抗凝固 処理された血液を、抗凝固処理を解除する操作を行うことなく血液凝固を促進しつつ 流して血栓の生成を観測することもできるので、少量の血液で血栓生成の観察を行う ことができ、被検者の負担を低減することができる。また、この場合、薬剤管は必ずし も必要としないため、血栓観測装置を簡略なものとすることができる。ここで、組織トロ ンボプラスチンを血液凝固促進剤として用いることで、 ΧΠ因子活性ィ匕ゃカリクレイン 活性化を迂回した径路で凝固系が活性化されて血液凝固が促進され、血栓生成室 にて血栓を観測する事が可能である。

[0012] また、 1種または複数種の抗凝固処理剤を用いて抗凝固処理された血液を、用いた 抗凝固処理剤に対応する少なくとも 1種の抗凝固処理解除剤で抗凝固処理を解除 することで容易な操作で血栓形成を観測することもできる。この場合、接触相因子阻 害剤及びカルシウムキレート剤による抗凝固処理を行 ヽ、遊離カルシウム供与体で 抗凝固処理を解除するか、接触相因子阻害剤及びへパリンによる抗凝固処理を行 い、へパリナーゼで抗凝固処理を解除すると、血栓生成観測時に効果を発揮してい る抗凝固処理は、接触相因子阻害剤による抗凝固処理なので、より生理的な条件下

、特にカルシウム、マグネシウム等の血栓症に関連する 2価金属イオンの濃度を反映 したまま血栓の観測を行うことが可能となる。この場合、血液凝固 XII因子、カリクレイ ンなどの接触相因子の阻害剤及びトロンビンアブタマ一による抗凝固処理を行 、、ト ロンビン阻害ァプタマ一のアンチセンス DNAで抗凝固処理を解除すると、長期の血 液保存が可能である。そして、血液凝固 XII因子の阻害剤としてコーン由来トリプシン インヒビターを用いるとより効率よく抗凝固処理を行うことができる。

[0013] 本発明の血栓観測方法においては、血栓生成室における血液の流入時および Z または流出時の圧力を測定することで、極めて簡易な装置で容易に、血栓生成の程 度を数値化でき、定量的な評価が可能である。

そして、血栓誘発材がコラーゲンと組織因子を含むものであると設置が容易となり、 かつ、効果的に血栓生成を誘発することができる。

図面の簡単な説明

[0014] [図 1]本発明の第 1の形態例に係る血栓観測装置を示す概念図である。

[図 2] (a)は本発明の第 1の形態例に係る実施例 3、 5、 6の血栓誘発材 15の設置状 態を示す概念図であり、（b)は本発明の第 1の形態例に係る実施例 3、 5、 6の血栓生 成結果を示す概念図である。

[図 3] (a)は本発明の第 1の形態例に係る実施例 4の血栓誘発材 15の設置状態を示 す概念図であり、 (b)は本発明の第 1の形態例に係る実施例 4の血栓生成結果を示 す概念図である。

[図 4]本発明の第 2の形態例に係る血栓観測装置の要部 (マイクロチップ本体)を示 す概念図である。

[図 5]本発明の第 2の形態例に係る血栓観測装置の要部 (マイクロチップ蓋)を示す 概念図である。 [図 6]本発明の第 2の形態例に係る実施例 7における血栓生成位置を示す概念図で ある。

[図 7]本発明の第 2の形態の他の例に係る血栓観測装置の要部 (マイクロチップ本体 )を示す概念図である。

[図 8]本発明の第 2の形態の他の例に係る血栓観測装置の要部 (マイクロチップ蓋） を示す概念図である。

[図 9]本発明の第 3の形態例に係る血栓観測装置の要部を示す概念図である。 (A) は完成図、（B)はマイクロチップ本体、（C)はマイクロチップ蓋を示す。

[図 10]本発明の血栓観測装置を用いてシステム化した血栓観測システムを示す概念 図である。

[図 11] (A)は 10 Mのェクソサイト I及び IIに対するァプタマ一を加えた血液を 15分 間室温で保存した後に 40 μ Μの両ァプタマ一のアンチセンス DNAを添カ卩しトロンボ エラストグラムで凝固の波形を解析した結果である。 (Β)は採血直後の血液のトロン ボェラストグラムの波形である。

[図 12]本発明の第 4の形態例に係る血栓観測装置の要部を示す概念図である。 (Α) は完成図、（Β)はマイクロチップの蓋、（C)はマイクロチップの基板を示す。

[図 13]実施例 17 (control)、 18 (Heparin)、 19 (レオプロ）の圧力測定結果を示すダラ フ。

[図 14]へパリンを 0 (control)、 0. 2、 0. 5、 1単位 Zml加えたときの圧力測定結果を 示すグラフ。

[図 15]レオプロを 0 (control)、 2、 5、 10 gZmlカ卩えたときの圧力測定結果を示すグ ラフ。

符号の説明

1· ··血栓観測装置、 10、 110、 311、 411· ··血栓生成室、 11、 111· ··流入管、 12、 1 12、 312· ··薬剤管、 13、 313、 413· ··排出管、 14、 114· ··狭窄部位、 15、 115、 31 5· ··血栓誘発材、 16· ··生成された血栓、 20、 21、 320、 420· ··シリンジ、 30、 31、 3 30、 331、 414、 423· ··ポンプ、 40、 41、 340· ··圧力センサー、 100· ··基板（マイクロ チップ本体）、 200· ··基板（マイクロチップ蓋）、 100A、 100B、 100C…接続部、 100 D…圧力計となる回路、 100E…調整弁、 300、 400· ··マイクロチップ (血栓観測装置 )、 306…ポンプ制御ユニット、 307· "コンピューター、 308· "CCDカメラ付蛍光実体 顕微鏡、 317…圧入管、 322、 422…血液凝固防止剤流入管、 412· ··接続チューブ 、 430- CCDカメラ、 431· ··レンズ、 432· ··照明用光源、 433· ··カメラ移動用レール 、 A、 B…血栓観測システム。

発明を実施するための最良の形態

[0016] 以下、最良の形態に基づき、図面を参照して本発明を説明する。

図 1は本発明の血栓観測装置の第 1の形態例を示す概念図である。

[0017] 図 1に示すように、本形態例に係る血栓観測装置 1は、血栓生成室 10と、該血栓生 成室 10に接続されて前記血栓生成室に血液を流入させる流入管 11と、該流入管 1 1に接続されて前記流入管 11に抗凝固処理を解除する薬剤または血液凝固を促進 する薬剤を投入する薬剤管 12とを備える。

[0018] 血栓生成室 10は、内部の一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材が設けられた略 円筒状であり、透明なガラスや熱可塑性榭脂などで製造することができる。血栓誘発 材としては、コラーゲンや vWF (von Willebrand因子）、予め作られた血栓、絹糸 やコットン等の繊維基材などを挙げることができる。これらは一種単独で、または、複 数を組み合わせて使用することができる。これらの内、入手が容易で、取り扱いやす く、実際の血管に近いモデルとなること力 コラーゲンが特に好ましい。コラーゲンに は組織因子が含まれて ヽても良 ヽ。血栓誘発材が血流によって流出しな ヽようコラー ゲンや vWFなどの血栓誘発材は、血栓生成室 10の内部にコーティングされた状態 が望ましい。コーティングの方法は、例えば、コラーゲンのコーティングはガラスまた はポリスチレン表面に特開平 05— 260950号公報や Blood. 1995 Apr 1 ; 85 (7) : 1826- 35.に記載されているように、酸性溶液に溶解し、親水性が付与された基 材を浸漬、洗浄、乾燥するなどの方法にて簡便にコーティングが可能である。

[0019] また、繊維基材ゃ予め作られた血栓などの血栓誘発材は、血栓生成室 10の内部 に固定された状態が望ましい。そして、薄い吸湿性の繊維基材、例えば、コットン、不 織布や織布等にコラーゲンを含浸、乾燥させる事で、より血栓誘発能の高い血栓誘 発材が得られる。また、組織トロンボプラスチンを含むコラーゲン溶液にそれらの基材 を浸漬させ乾燥させると、さらに血栓誘発能が高まる。

血栓誘発材は、血栓生成室 10の内径や観測目的に応じて選択される。心筋梗塞 等のァテローム血栓症をモデルにする場合にぉ ヽてはコラーゲン単独、又はコラー ゲンと組織トロンボプラスチンを含むものであることが好ましぐさらに血栓生成室内の 流路の狭窄を設けることにより、ずり応力が加わる形の血栓生成室であるとさらに好ま しい。また、心原性脳梗塞等の別部位からの血栓が血流によって移動して付着し別 部位の血管を閉塞させるような血栓の試験の場合には、予め少量の血栓を血栓生成 室 10に固着させ、血栓誘発材とし、その上に生成する血栓の成長を観測する事が好 ましい。毛細血管等の血栓症の試験の場合には血栓生成室における流路の内部が 複数の流路に分割され、その幅または太さが 10 m〜30 mに狭められているもの が望ましい。血栓生成室 10が幅または太さが 100 m以下の狭窄部を有する場合 には、その狭窄部に生成した少量の血栓によって流路がより閉塞されるので、別途、 血栓誘発材を用いることなぐ凝固促進剤または抗凝固解除剤によって血栓生成を 観測することができる。したがって、本発明においては、血栓誘発材としてこの狭窄部 を含む。

[0020] 血栓誘発材は、コラーゲンや vWFをコーティングするだけでも良 、が、コーティング 部位の血栓生成室 10を狭窄に構成し狭窄部位 14としておくと、高ずり応力惹起血 小板凝集も観測することができ好まし 、。血栓誘発材としてコラーゲンをコーティング する場合、少なくとも下地となる部位の基材は平滑なガラス又はプラスチックとすると 密着性に優れ好ましい。なお、血栓生成室 10または血栓生成室 10の血栓誘発材が 設けられる部位を着脱可能なカセットに構成しておくと、生成した血栓を洗浄したり、 観察したり、血栓誘発材を交換したりする作業が容易となり好ましい。この場合、カセ ットは、シリコーンゴムのオーリング等で、液密に接続することが好ましい。血栓生成 室 10の流入管 11が接続される端部と反対側の端部には、血液を排出する排出管 1 3が接続され、排出管 13をチーズで分岐しその先端にダイアフラム型等の圧力計 41 を設けることが好ましい。一方、排出管 13の先端は図示しない貯留容器に接続され ることが好ましい。

[0021] 血栓生成室 10に接続される流入管 11は、透明なガラスや熱可塑性榭脂などで製 造することができる。流入管 11の血栓生成室 10に接続される端部と反対側の端部に は、血液を供給するシリンジ 20が接続される。シリンジ 20にポンプ 30として、図示し ない押圧手段にて、シリンジ 20のプランジャーを所定圧力で押圧するように構成する 。ポンプとしては、市販の一般的なポンプを用いてもよいが、エアーの一定圧で押し 出したり、シリンジをプランジャーが上になるよう倒立させ、プランジャーに重りをのせ たりしてシリンジポンプとしてもよ！/、。

流入管 11の血栓生成室 10の近傍に、流入管 11をチーズで分岐しその先端にダイ ァフラム型等の圧力計 40を設けることが好ま 、。

[0022] シリンジ 20内の血液は抗凝固処理されている。抗凝固処理に用いる抗凝固処理剤 としては、クェン酸ナトリウムまたはカリウム、シユウ酸ナトリウムまたはカリウム、 ACD ( Acid Citrate Dextrose)、エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA)塩などを挙げるこ とができる。このような抗凝固処理剤は、粉末、凍結乾燥品、水溶液などの溶液として 使用することができる。これらの抗凝固処理剤の内、一般的な 3. 2%クェン酸ナトリウ ムが容易に入手できることから好ましい。この場合、血液 9容に対してこの抗凝固処 理剤 1容とするのが好ましい。

[0023] 抗凝固処理剤を加えて！/、な！/ヽ全血または血漿などは一般に数分以内で凝固する。

凝固はクェン酸塩などのカルシウムキレート剤の添カ卩によって軽減または消失させる ことができる。特にクェン酸塩は、プロトロンピナーゼならびに外因性および内因性テ ナーゼの集合および機能を妨げることが報告されている。

クェン酸処理した血液は一定期間（例えば、数時間から数日間）にわたつて液体形 態で保存することができ、操作を加えて血球分離物、多血小板および乏血小板血漿 などの血液製剤を作製することもできる。クェン酸塩を含む血漿は、約— 70°C以下 の温度で凍結することにより、長期間 (数力月力 数年)保存可能である。本発明に おいては、この全血や血漿を用いることもでき、その場合もカルシウム等を再添加す ることが好ましい。

しかし、カルシウム等を再添加した全血や血漿は一般に、ほとんどの貯蔵容器内で 接触活性ィ匕のために自然に凝固し、この場合には接触活性ィ匕は約 2〜4分以内で生 じうる。このため、本発明においては、採血してクェン酸処理した新しい血液や保存 用に凍結した後に解凍したクェン酸処理した血液や血小板含有血漿に対して血栓 観測直前にカルシウム等の抗凝固解除剤の添加を行ってもよい。

[0024] その他の抗凝固処理剤としてはへパリン、ヒルジン、ヒルログ（ヒルジン C末端領域 ペプチド）、ァプロチュン、抗トロンビン抗体、トロンビンァプタマ一、コーン由来トリプ シンインヒビター（1977. J. Biol. Chem 252. 8105)等の利用が可能である。こ れらは、血液凝固因子を阻害することで凝固カスケードを阻害することで、血液凝固 を阻害するものであり、本明細書では「凝固因子阻害剤」ということがある。

観測用サンプルを採血する方法としては、シリンジ又は真空採血管に予め上記の 凝固因子阻害剤を入れて採血を行うか、又は、採血直後の血液に凝固因子阻害剤 を速やかに加える等の方法で抗凝固処理した血液を得ることができる。

さらに、凝固因子阻害剤、例えば、へパリンを含む真空採血管等で採血した後、へパ リナーゼと観測目的に適した抗凝固処理剤を加え、へノリナーゼでへノ リンを分解さ せ、観測目的に適した抗凝固処理剤と置き換えることも可能である。また、同様にク ェン酸を含む真空採血管で採血し、塩ィ匕カルシウム及びコーン由来トリプシンインヒ ビターやトロンビンアブタマ一等の観測目的に適した凝固因子阻害剤を加えることで

、観測目的に合わせて抗凝固処理した血液を採血することが可能である。

[0025] 血栓生成室 10に接続される薬剤管 12は、透明なガラスや熱可塑性榭脂などで製 造することができる。薬剤管 12の血栓生成室 10に接続される端部とは反対側の端部 には、抗凝固処理を解除する薬剤または血液凝固を促進する薬剤を供給するシリン ジ 21が接続される。シリンジ 21にポンプ 31として、図示しない押圧手段にて、シリン ジ 21のプランジャーを所定圧力で押圧するように構成する。ポンプとしては、市販の 一般的なポンプを用いてもよいが、エアーの一定圧で押し出したり、シリンジをプラン ジャーが上になるよう倒立させ、プランジャーに重りをのせたりしてシリンジポンプとし てもよい。薬剤管 12には後述するような抗凝固解除剤または凝固促進剤を充填する

[0026] 本発明の血栓観測装置を用いて、血栓観測を行なうには、シリンジ 20内に抗凝固 処理、例えば、クェン酸ナトリウムで処理した全血および血小板血漿 (溶液 A)を充填 する。シリンジ 21内には、抗凝固処理を解除する薬剤、例えば、塩化カルシウム溶液 (溶液 B)を充填する。溶液 Aの凝固カスケードが開始される溶液 Bの濃度（5〜20ミリ モル）になるようにポンプ 30、 31によって流入管 11に溶液 Aと溶液 Bとを供給し、流 入管 11内で混合しつつ、溶液 Aと溶液 Bの混合液を血栓生成室 10に流入させる。 そして、血栓生成室 10の内部の一部には、予め血栓生成を誘発する、例えば、コラ 一ゲン等が塗布されて血栓誘発材が設けられる。この血栓生成室 10は、例えば、透 明なプラスチックチューブで形成することができる。この様な透視可能な血栓生成室 10を通過する血液を観測する装置によって簡便に血栓形成が観測される。

[0027] 血栓形成の観測は、一定時間血液を流した後、コラーゲンで処理されたセル (血栓 生成室 10)内から血液を除去する事によって、目視によって評価する事が出来る。溶 液 Aと溶液 Bを送液するポンプがエアー駆動である場合は、一定圧で溶液 A、溶液 B を送液することで、排出管 13から排出される血流量の低下によって、コラーゲン上で の血栓形成をモニターする事が出来る。または、流入管 11および排出管 13の血栓 生成室 10近傍に圧力計が設けられている場合には、血栓生成室 10の内圧の変化 を見ることでコラーゲン上での血栓形成をモニターする事が出来る。または、血栓生 成室 10の厚みを 500 m以内にする事で顕微鏡による観察が可能である。特に多 血小板血漿を用いた血栓は視認性が高 、ので観察が容易であり、肉眼による血栓 形成の観察も可能である。さらには特許文献 1に記載の方法で血小板を蛍光ラベル し蛍光顕微鏡でモニターする事も可能である。

[0028] クェン酸のようなキレート剤による抗凝固処理を解除する薬剤としては、塩化カルシ ゥム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム等のハロゲン化カルシウム、リン酸カルシウム 、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、重炭酸カルシウム等の無機酸カルシウム塩、蟻 酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、アルギン酸、乳酸、ダルコン酸、グリセリン酸、グリセ口 リン酸等の有機酸のカルシウム塩、などの遊離カルシウム供与体であるカルシウム化 合物を挙げることができる。

[0029] 凝固因子阻害剤 (抗凝固処理剤）により抗凝固処理した場合には、凝固因子阻害 剤に応じた抗凝固解除剤を選択し使用することができる。例えば、へノ^ンを用いて 抗凝固処理した場合の抗凝固解除剤としては、プロタミン、へパリナーゼまたは抗へ ノリン抗体等が利用可能であり、ヒルジン、ヒルログおよびァプロチュンを用いて抗凝 固処理した場合の抗凝固解除剤としては、それぞれ抗ヒルジン抗体、抗ヒルログ抗体 および抗ァプロチュン抗体等の抗凝固解除剤が使用可能である。

抗トロンビン抗体を凝固因子阻害剤に用いて抗凝固処理した場合の抗凝固解除剤 としては、 PPACKトロンビン等の完全に不活性化されたトロンビン、トロンビンの分解 断片およびトロンビン中における抗体認識ェピトープを含有する合成ポリペプチド等 の抗凝固解除剤の使用が可能である。

なお、抗凝固処理、または抗凝固解除に使用される抗体は補体系への影響を最小 限にする為に、パパイン等で Fcドメインを取り除いたものを使用するか鶏卵抗体等の ヒト補体系活性ィ匕能を有さな 、抗体を使用することが望まし 、。

[0030] 1本鎖オリゴ DNAであるトロンビンァプタマ一（Blood. 1993 Jun 15 ; 81 (12)： 3271 -6.又は J Mol Biol. 1997 Oct 10;272(5):688- 98.)を抗凝固処理剤として用い た場合にはトロンビンァプタマ一に対するアンチセンス DNAまたはアンチセンス RN A等のトロンビンアブタマ一に結合し機能を阻害する物質が抗凝固解除剤として使用 可能である。トロンビンアブタマ一はェクソサイト I及び IIを認識する 2種を併用すると、 単独の場合より飛躍的に高い抗凝固処理効果が得られる。この際用いられるアンチ センス DNAは実質的にトロンビンァプタマ一の抗トロンビン機能を無効化するもので あれば、トロンビンァプタマ一の一部に対するものであってもよい。

なお、トロンビンァプタマ一とそのアンチセンス DNAがそれぞれ抗凝固処理剤と抗 凝固解除剤として有効であることを後述の参考例に示す。

[0031] へノリンによって抗凝固処理した場合には、数時間の間に凝固系が活性化される ことはないので、血栓生成を観測するに際して長期間の血液保存が可能となるが、 例えば、へパリン投与を受けた患者力 採血した血液の検査には適さな 、場合があ る。

[0032] 一方、ヒルジン、ヒルログ、抗トロンビン抗体は、凝固系に最終段階ではたらくトロン ビンを阻害することでフイブリノゲンのフイブリンへの変換を阻害する阻害剤であるが 、トロンビンを完全に阻害した場合でも、凝固カスケードの接触相因子 (プレカリクレイ ン、 XII因子等）がゆっくりと活性ィ匕を受けるので、徐々に凝固カスケード上流におけ る活性ィ匕が起こり長期間の血液保存には適さない場合がある。 [0033] また、ァプロチュンは接触相のカリクレインの活性を阻害することで、内因系血液凝 固カスケードを遅延する力 カリクレイン活性の阻害下においても、ゆっくりと凝固カス ケードが活性ィ匕を受け、ァプロチュン存在下においても数時間後には血液が凝固す る。

したがって、採血後数十分程度後の血液の血栓生成の観測においては、トロンビン の阻害剤および Zまたはァプロチュンで抗凝固処理して血栓生成の観測が可能で ある。しかし、観測着手に長時間要する場合や、観測に長時間を要する場合は、好ま しくない場合がある。

採血後 1時間以上経過した後に血栓生成を観測する場合は、トロンビンアブタマ一 とコーン由来トリプシンインヒビターやヒルジンとァプロチュンを併用して抗凝固処理 するか、凝固時間に多大な影響を与えないレベル、例えば、 1単位 Zml未満の少量 のへノ^ンを接触相因子の阻害剤またはトロンビンの阻害剤と併用することが望まし い。

トロンビンァプタマ一はェクソサイト I及び IIに対する 2種類のァプタマ一を併用するこ とで抗凝固処理効果を飛躍的に高めることが可能で、さらに両ァプタマ一のアンチセ ンス DNAで抗凝固処理を即時に解除することが可能である。

[0034] また、コーン由来トリプシンインヒビター (XII因子阻害剤）、ァプロチュン (カリクレイ ン阻害剤）等の接触相因子に対する阻害剤とトロンビンアブタマ一等のトロンビンに 対する阻害剤の両方を検体 (血液）に添カ卩しておき、これにトロンビンァプタマ一のァ ンチセンス DNA (トロンビンァプタマ一の阻害剤）等を加え、トロンビン阻害剤の機能 のみを阻害してトロンビンの機能阻害を解除した後、速やかに検体を血栓生成室に 流せば、例えば、組織因子 (組織トロンボプラスチン)等で外因系凝固カスケードが活 性ィ匕され、血液凝固が促進されて生理的な血栓生成の観測が可能となる。

あるいは、クェン酸等のキレート剤又はへノ リン等の抗凝固処理解除が可能な抗凝 固処理剤とコーン由来トリプシンインヒビターの両方で抗凝固処理を行い、これに塩 化カルシウム等の遊離カルシウム供与体又はへパリナーゼでそれぞれが対応する抗 凝固処理を解除した後、速やかに血栓生成形成室に流して、外因系凝固カスケード の活性ィ匕により血液凝固を促進することも可能である。 この場合、血栓誘発材に組織因子 (組織トロンボプラスチン)を適宜量含ませること が望まし 、。血栓誘発材をコラーゲン及び組織トロンボプラスチンを混和し乾燥させ ることでコーティングしたものを用いると血栓生成室においてのみ血栓生成が進み特 に望まし ヽ。ァテローム血栓のモデルとして組織因子 (組織トロンボプラスチン）を含 むコラーゲン溶液をコートした血栓誘発材を用いると、病理機序を反映した観測を行 うことが可能である。

なお、クェン酸などのカルシウムキレート剤によって抗凝固処理を行った血液に、遊 離カルシウム供与体およびトリプシンインヒビターをカ卩えた後、速やかに血栓形成室 に流して血栓形成を測定することや、へパリンによって抗凝固処理を行った血液に、 へノ リナーゼおよびトリプシンインヒビターをカ卩えた後、速やかに血栓形成室に流し て血栓形成を測定することも可能である。上記のような、 1種または複数種の抗凝固 処理剤を用いて抗凝固処理された血液を、用いた抗凝固剤に対応する少なくとも 1 種の抗凝固処理解除剤を混合した後、速やかに血栓形成室に流して血栓を観測す るという方法には、例えば、後述の図 9に示されるような血栓観測装置が使用できる。

[0035] 上記のヒルジンやトロンビンァプタマ一等のトロンビンの阻害剤、接触相因子に対 する合成低分子阻害剤および蛋白質の抗凝固処理剤は、クェン酸や EDTA等の力 ルシゥム等をキレートする抗凝固処理剤と比較すると高価ではあるものの、カルシゥ ム、マグネシウム、亜鉛等の 2価金属イオンの濃度を変化させることがないので、患者 の血液の本来の濃度における血栓生成をモニタリングに反映することが可能となり、 より患者の病態を反映した観測が可能となる。

[0036] 血液凝固は、活性化 ΧΠ因子やカリクレイン等の接触相因子の阻害により抑制する 事が可能であるが、実際の生理的血栓、止血においては Xllaおよびカリクレインの 活性はあまり関与していないことが報告されている。実際に ΧΠ因子、プレカリクレイン の先天性欠乏症患者においても出血等の所見は全くみられない。特に心筋梗塞等 のァテローム血栓症においては、動脈硬化によるプラークに起因する糸且織因子によ つて凝固系が活性化されることが広く知られており、 XII因子は主に活性ィ匕血小板上 でトロンビンによって活性ィ匕を受ける。よって、 ΧΠ因子ゃプレカリクレインの活性ィ匕阻 害剤または活性化 XII因子やカリクレイン阻害剤を抗凝固処理剤として用いて抗凝固 処理する場合は、抗凝固解除剤を加えなくともよい。抗凝固処理剤の代わりに組織 因子 (組織トロンボプラスチンなど)等の外因系凝固を活性ィ匕する物質を血液に添カロ する、または血栓誘発材に加える事によって、 ΧΠ因子活性ィ匕ゃカリクレイン活性ィ匕を 迂回した径路で凝固系が活性ィ匕されて血液凝固が促進され、血栓生成室にて血栓 を観測する事が可能である。

[0037] 抗凝固解除剤を加えずに、組織因子等の外因系凝固を活性ィ匕する物質の添加〖こ より血液凝固を促進して血栓形成を観測する場合に使用可能な抗凝固処理剤として は、カリクレイン阻害剤である PKSI— 527 (Thromb Res 57 : 889, 1990)、ゃ活 性化 XII因子阻害剤である D— Phe— Arg— CK(Cal Biochem社）等の合成低分 子阻害剤があげられる。また、蛋白質阻害剤として抗カリクレイン抗体、抗プレ力リク レイン抗体、抗凝固 XII因子抗体、抗活性化凝固 XII因子抗体、コーン由来トリプシン インヒビター等の凝固カスケードの接触相プロテアーゼに対する抗体等が挙げられる 抗凝固解除剤を加えずに、外因系凝固を活性ィ匕する物質により血液凝固を促進し て血栓形成を観測する場合、特に入手及び抗凝固能の観点から、クェン酸とコーン 由来トリプシンインヒビター又はトロンビンァプタマ一とコーン由来トリプシンインヒビタ 一によつて、一旦、抗凝固処理を行って血液を保存すると観測操作の自由度を高め ることができ好ましい。そして、血栓観測直前に遊離カルシウム供与体又はトロンビン ァプタマ一のアンチセンス DNAでコーン由来トリプシンインヒビターによる抗凝固処理 を残して部分的に他の抗凝固処理を解除する。この場合、コラーゲン又は組織トロン ボプラスチンを含むコラーゲンをコーティングした血栓誘発材を用いて外因系凝固を 活性ィ匕して血液凝固を促進することがァテローム血栓のモデルとして望ましい。

[0038] 上記の血栓観測に用いる血液を供給するシリンジや真空採血管などの容器は、へ ノリンコーティングされた容器やポリビニルラタトンアミド (PVLA)、ポリ 2メトキシェチ ルアタリレート（PMEA)等の抗血栓性や血液適合性を有する素材でコートされた容器 を用いる事が望ましい。

[0039] 本発明の血栓観測装置の別の形態例では、チューブや血栓生成室はマイクロチッ プ等の微細な流路によって基板上に一体化させることもできる。 図 4は、本発明の血栓観測装置の第 2の形態例の要部の平面図である。図 4の基 板 100には溝が彫られ、回路が形成される。本形態例は、小さな基板上に血栓観測 装置の要部である血栓生成室と、該血栓生成室に接続されて前記血栓生成室に血 液を流入させる流入管と、該流入管に接続されて前記流入管に抗凝固解除剤又は 血液凝固を促進する薬剤を投入する薬剤管とが基板上に一体化した回路としてマイ クロチップ化された形態である。本形態例は、基板に一体ィヒした要部以外は第 1の形 態例と同様である。

図 4の基板 100はマイクロチップの本体となるものであり、その材質は、金属、ガラス やプラスチック、シリコーン等である。血栓等を観察する観点からは透明な材質が好 ましぐ回路を形成する観点からはプラスチックが好ましい。したがって、透明なプラス チックが特に好まし 、。 PDMS (ポリジメチルシロキサン)等のシリコーン榭脂製とした 場合には、密着性に優れるため、蓋部材と接着剤などで接着しなくても圧着すること で回路を形成することが出来る。ポリスチレン製の基盤を用いた場合には流路を PV LAで簡便にコーティングし抗血栓処理をすることが可能である。また PMEAによつ ても簡便かつ効果的に抗血栓処理する事が可能である (参考実験 4参照)。

[0040] 図 5は、図 4の基板 100に重ね合わせて密着してマイクロチップの蓋となる基板の 平面図である。図 5の基板 200は、透明なスライドガラスまたはプラスチック等力もなる 板やシートである。基板 200を蓋として重ね合わせて密着することで、基板 100の回 路が血栓生成室 110、流入管 111および薬剤管 112となる。

[0041] 血栓生成室 110内面に血栓誘発材 115を設けるには、基板 200の設置予定位置 に例えば、コラーゲン等を塗布しておけばよい。基板 200のコラーゲン塗布面を内向 きにした状態で、基板 100と基板 200とを接合や嵌合により密着させると血栓形成室 を有する血栓観測装置が得られる。塗布が容易なので溝のな!、平坦な基板 200にコ ラーゲンを塗布する事が望ましい。また、組織トロンボプラスチンをコラーゲンと混合 して塗布することで、さらに高い血栓誘発能を有する血栓誘発材を得る事が出来好 ましい。そして、塗布したコラーゲンで血栓が形成されやすくするためには、コラーゲ ン塗布部位のガラスをすりガラスにするなど、表面積を上げる処理を加えることが可 能である。 [0042] 基板 100における接続部 100A、接続部 100Bおよび接続部 100Cにはそれぞれ、 流入管、薬剤官および排出管の一部である図示しないチューブが接続され、接続部 100Aおよび接続部 100Bにはチューブを介して図示しないポンプがそれぞれ接続 されている。接続部 100Aからは抗凝固処理された血液が注入され、接続部 100Bか らは抗凝固処理剤に対応する抗凝固解除剤が注入される。

本形態例によれば、極少量の血液で血栓形成の観察ができるので、被検者の負担 力 、さくて済む。また、メパクリン等の蛍光試薬で血小板をラベルする事で、基板 200 側より基板 200に付着した血小板をモニターする事が可能である。

[0043] なお、回路 100Dは空気が閉塞されて終端が封止可能な回路で、圧力計となる。

回路 100Dは、終端に回路 100Dを圧力計としたときの圧力抜きや感度を上げるため の調整弁 100Eを設けることが好ましい。調整弁 100Eは、キャップや粘着テープで 閉鎖したり、必要な感度に応じて榭脂等の詰め物で容積を変更したりすることができ る。この回路 100Dは血液の侵入により空気と混ざったり、空気が逃散しない程度に 狭く形成される。その太さは基板 100の材質にもよる力 およそ 0. lmm〜0. 5mm 程度である。血栓形成によって血栓観測装置の流入管 111の内圧が高まると、回路 100D内の空気が血液により圧縮されて、その分抗凝固処理された血液が回路 100 D内に侵入する。回路 100D内の血液の移動によって内圧を随時モニターする事が 可能である。

[0044] 上述した本発明の血栓観測装置および Zまたは血栓観測方法によってコラーゲン への血小板の粘着、活性ィ匕血小板上での凝固系の活性化、血小板凝集による活性 化血小板の堆積をモニターする事が可能である。

さらにァテローム血栓症の血栓形成を再現する為に血栓生成室 10、 110に狭窄部 位 14、 114を作ることで高ずり応力惹起血小板凝集も反映した観測が可能である。

[0045] 図 9は本発明の血栓観測装置の第 3の形態例の要部を示す概念図であり、血液凝 固防止剤を血栓生成室より下流の血液に混和する血液凝固防止剤流入管 322およ び圧入管 317を説明するもので、本形態例においては血栓生成室より上流の薬剤 管は設けていない。

第 3の形態例では、抗凝固処理剤（例えば、クェン酸とコーン由来トリプシンインヒビ ター）を加えて採血した血液に、測定直前に抗凝固解除剤 (例えば、遊離カルシウム 供与体)をカ卩えたものをシリンジ 320に入れ、該シリンジに接続された圧入管 317から ミネラルオイルなどの血液圧送用の液体を圧入して血液をマイクロチップ 300へ押し 出す。

サンプルシリンジ 320にかかる圧力の上昇は、血栓の生成による流路の閉塞状況 を示すため、圧力変化をモニターすることで血栓形成を検知することができる。圧力 変化による血栓形成のモニターは、特に閉塞性血栓が形成される強固なァテローム 血栓のモデルの観測に適しており、血栓誘発材としては、特に制限されないが、例え ば、外因系凝固を活性ィ匕して血液凝固を促進する場合は、コラーゲンと組織因子を 用いたものが血栓の観測に有効である。

圧力測定に際しては、血栓形成による流路内の圧力をより正確に測定する為に、 図 9に示すように、血液凝固防止剤流入管 322よりマイクロチップ 300に形成された 流路を経由して血液凝固防止剤を血栓生成室より下流の血液に混和することによつ て、血液が、血栓生成室以降の流路での血栓形成が防止される。これにより、血栓生 成室における血栓の生成にともなう流路の狭窄又は閉鎖による流路内の圧力変化を 特異的にかつ正確に測定することができるので望ましい。

この様な、血液凝固防止剤としては特に制限されず、本発明で用いる抗凝固処理 剤を用いても良いが、コストや取扱性を考慮して、アルカリ又は酸性溶液、アルコー ル、尿素、 SDS類、等の蛋白変性によって血液凝固を防止するものから適宜選択す ることが好ましい。

ここで、本発明の血栓観測装置は、図 9の形態例において、圧入管 317を設ける代 わりに、排出管 313に吸引ポンプを設け、吸引圧力（陰圧)の変化により血栓形成の 程度を測定する装置とすることもできる。この様に構成することにより、後述する層状 に分離する液体によって間接的に血液を押し出すポンプを用いる場合に、血液の量 が少ないと血液とミネラルオイルなどの圧送用液体の接触領域で混合された液体が 送られるおそれがある力 その様な事態を防ぐことが可能でより効率のよい測定が可 能である。

また、本発明の血栓観測装置に血液を供給する容器 (サンプルタンク)をシリンジな どの密閉容器とする必要がなぐ蓋がなく大気に開放された容器とすることができるの で、血栓観測装置を簡素化できる。さらに、本発明の血栓観測装置の流路内部が陰 圧となるので、本発明の血栓観測装置をマイクロチップで形成するに際して、例えば 、マイクロチップ本体とマイクロチップ蓋が完全に接着して 、なくても血液が漏れるこ とがない。場合によっては、マイクロチップ本体とマイクロチップ蓋を嵌合させただけ であっても、嵌合の精度がよければ、そのままで血栓観測装置として使用することが できる。

図 10は、さらにシステム化された血栓観測システム Aを示す。

図 10の血栓観測システム Aは、微量送液ポンプ 330に血液より比重が小さい液体 を充填し、これを圧入管 317より血液が収容されたサンプルシリンジ 320に圧入して 血液の上に重層し、血液をマイクロチップ 300に押し出すものである。押出された血 液は、マイクロチップ内で薬剤管 312から注入された抗凝固解除剤と混合され、血栓 形成室 311に到達する。微量送液ポンプ 330の血液圧送用の液体としては流動パラ フィン、ミネラルオイルやシリコーンオイルなどの各種油脂、生理食塩水等が挙げられ る。この様に、間接的に血液を押し出すことにより微量送液ポンプ 330及び圧力セン サー 340が血液で汚染されることを防ぐことが可能となる。

なお、この様な血液に対して層状に分離する液体によって間接的に血液を押し出 すポンプは、上記いずれの形態例の本発明の血栓観測装置に適用することもできる そして、微量送液ポンプ 330により、サンプルシリンジ 320に力かる圧力は、圧力セ ンサー 340によって測定される。

さらに、この血栓観測システム Aにおいては、画像解析により血栓形成状況をより詳 細に把握することが出来る。特にキナクリン等によって血小板、白血球を蛍光標識し コラーゲンへの粘着及び凝集を観測する場合は、蛍光発色による単位面積あたりの 輝度を画像解析で観測することで観測結果を数値ィ匕し、データとして保存することが 可能である。画像解析は CCDカメラ付蛍光実体顕微鏡 308によって捕らえられた像 をコンピューター 307で処理してディスプレイに表示させることによって行うことができ る。 したがって、この血栓観測システム Aにおいては、画像解析及びサンプルシリンジ 3 20にかかる圧力の変化により総合的な血栓形成状況を判定することができる。

なお、この様な血栓観測システムは、いずれの形態例の本発明の血栓観測装置を 用いてシステム化することができる。

[0047] 図 12は、本発明の血栓観測装置の第 4の形態例を示す概念図であり、血栓生成を 観察するためのカメラを有する血栓観測装置を示す。

この血栓観測装置においては、例えば、クェン酸とコーン由来トリプシンインヒビタ 一で抗凝固処理された血液を、抗凝固処理解除剤 (例えば、遊離カルシウム供与体 )をカ卩えて速やかにシリンジ 420に充填する。排出管 413に接続されたポンプ 414に よって吸引することにより血液を血栓生成室 411に流して血栓を生成させる。吸引圧 力（陰圧)の変化により血栓形成の程度を測定することができる。

また、血栓生成室通過後の血液が凝固して排出管 413が詰まったり、圧力測定に 影響を与えることを防ぐため、血栓形成防止剤流入管 422により血栓形成防止剤を 血栓生成室通過後の血液に混和する。

さらに、マイクロチップ 400の下に、例えば、 CCDカメラからなるカメラ 430を設置す ることで血栓形成を撮像することができ、マイクロチップ上の空間を有効に利用するこ とが可能である。カメラ 430は、レール 433により血栓形成室の下を前後左右に移動 することができる。カメラ 430がその位置を X軸および Y軸として数値ィ匕して記憶する 機能を有するものを用いることで複数の特定箇所を定期的に巡回して撮像すること ができる。この様に構成することにより、カメラ 430の倍率を高く設定しても、血栓生成 室 411の広い範囲にわたって血栓形成過程を経時的に観測する事が可能である。さ らにカメラ 430の周囲に、例えば、 LED力 なる光源 432を備えているとカメラ 430と の位置関係を一定に保持したまま光源 432も同時に移動でき、好ましい。光源 432 は白色光と共に特定の蛍光物質を励起可能な波長光を撮像対象となる蛍光物質に 応じて照射可能とする事で多種の蛍光物質の励起を行うことが可能であり好ましい。 実施例

[0048] 以下に、具体的な実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれ に限定されるものではない。 実施例 1

図 1に示す血栓観測装置を用いて、採血直後の血液 9容量部に対し 3. 2%クェン 酸ナトリウムを 1容量部混合したクェン酸処理血液 (溶液 A) 50mlをシリンジ 20に、 0 . 2MCaCl (溶液 B) 10mlをシリンジ 21に充填し、シリンジ 20、 21を内径 3mmの透

2

明なナイロンチューブチューブ (流入管 11、薬剤管 12)にそれぞれ接続する。両チュ ーブを T字状のジョイント（チーズ）にて合流させ 1本の内径 3mm、長さ 3cmのナイ口 ンチューブ（流入管 11)を介して内径 3mm長さ lcmのポリカーボネート製の血栓生 成室 10に接続する。血栓生成室 10自体を着脱可能なカセットとし、ナイロンチュー ブ (流入管 11)とのつなぎ目にはシリコーンゴムのオーリングを介在させて液密とし、 内部にはガラス製部材をエポキシ系接着剤で固定し、狭窄部位 14を作る。狭窄部位 14の最も絞られた部位の内径 (狭窄部位 14と内壁との最大間隙）が 1. 5mmになる ように設計する。また、血栓生成室 10に同径、同材質のチューブを排出管 13として シリコーンゴムのオーリングを介在させて液密に接続し、図 1に示す血栓観測装置 1 を作製する。なお、流入管 11および排出管 13の血栓生成室 10近傍には、ジョイント (チーズ)を介してフランジ型の圧力計 40、 41をそれぞれ設ける。また、血栓生成室 1 0の内面のガラス製狭窄部材は 1%不溶性コラーゲンタイプ 1 (和光純薬株式会社製） の 0. 1N酢酸溶液に浸漬後乾燥する事で内面のガラス製狭窄部に血栓誘発材 15と してコラーゲンをコーティングする。そして、シリンジ 20、 21をプランジャーが上になる よう倒立させ、溶液 Aを 5mlZ分、溶液 Bを 0. 5mlZ分で流れる様に、それぞれのプ ランジャーに重りをのせてシリンジポンプとする。

[0049] 溶液 Aおよび溶液 Bを 10分間流すと、数分経過したところで流入管 11および排出 管 13の圧力計 40、 41に差が現れ、時の経過と共にその差が大きくなり、同時に排出 管 13から排出される血液も徐々に減少することが確認される。全ての溶液を流し終 わった後、血栓観測装置 1に生理食塩水を流して血栓生成室 10を洗浄すると、血栓 生成室 10に血栓が形成されていることが目視で確認される。

[0050] 実施例 2

実施例 1において、溶液 Aを、さらに未分画へノ リン (ブタ粘膜製)を溶液 Aに対し て lmgZmlになるようにカ卩えたものに代えること以外は、実施例 1と同様に血栓観測 装置 1を作製し、血栓生成観測を行う。

この場合、実施例 1で見られた圧力差の発生や血流量の低下は起こらず、生理食 塩水にて洗浄後の血栓生成室 10に目視では血栓を確認できな!/、。

[0051] 実施例 3

内径 3mm 長さ 5cmのガラス管をカセット式の血栓生成室 10としたこと、シリンジ 2 0、 21をそれぞれ電動モーター駆動のシリンジポンプに接続したこと、および、狭窄 部位 14と狭窄部位 14上に血栓誘発材 15としてコーティングされたコラーゲンに代え て、図 2 (a)に示すようにガラス管の流入管 11との接続部から 5mm内側に入った血 栓生成室 10の内面に長さ 1. 5cmの実施例 1のコラーゲンに浸漬して 4°Cで風乾した 絹糸を血栓誘発材 15として接着剤で接着させたこと以外は、実施例 1と同様に血栓 観測装置 1を作製した。

[0052] シリンジ 20の溶液 Aを 3mlZ分、シリンジ 21の溶液 Bを 0. 3mlZ分で 15分間流し た後、血栓生成室 10を取り外して生理食塩水にて内部を洗浄したところ、絹糸の下 流端を始点として生成されたと見られる下流に向けて広がる図 2 (b)に示す彗星状の 長さ lcm、厚さ約 lmmの血栓 16がガラス管内面に付着している事が目視にて確認 された。ここで、生成された血栓が彗星状となるのは、血流の影響によるものと考えら れる。

なお、血栓の最も広!、部分の幅は約 3mmであった。

[0053] 実施例 4

絹糸に代えて、図 3 (a)に示すように抗凝固処理されていない血液 50 1をガラス管 の内面にパスツールピペットを用いて滴下した後、 15分間室温にて放置する事で直 径が約 2mm程度の円盤状の血栓を血栓誘発材 15として作ったこと以外は、実施例 3と同様に血栓観測装置 1を作製した。

[0054] 実施例 3と同様に、溶液 Aおよび溶液 Bを流した後、血栓生成室 10を取り外して生 理食塩水にて内部を洗浄したところ、血栓誘発材 15としての血栓を包み込んで下流 に向けて広がる図 3 (b)に示す彗星状の長さ lcm、厚さ約 lmmの血栓 16がガラス管 内面に付着している事が目視にて確認された。ここで、生成された血栓が彗星状とな るのは、血流の影響によるものと考えられる。 なお、血栓の最も広!、部分の幅は約 3mmであった。

[0055] 実施例 5

実施例 3において、溶液 Aを、さらに抗凝固処理剤としてアルガトロバン (登録商標 、第一製薬株式会社製)を実施例 3の溶液 Aに対して 0. lmgZmlになるように加え たものに代えたこと以外は、実施例 3と同様に血栓観測装置 1を作製し、血栓生成観 測を行った。

その結果、生理食塩水にて洗浄後のガラス管内に目視では血栓を確認できなかつ た。

[0056] 実施例 6

実施例 3において、溶液 Aとして、全血に対し 1 μ g/mlになるようにヒルジンを添カロ することによって抗凝固処理した血液を用いることおよび溶液 Bとして、全血に対し 1 mgZmlになるように生理食塩水に溶解した抗ヒルジンポリクローナル抗体 (株式会 社コスモバイオ社製)を用いること以外は、実施例 3と同様に血栓観測装置 1を作製 し、血栓生成観測を行う。

この場合、実施例 3とほぼ同様の血栓形成が確認される。

[0057] 実施例 7

採血直後の血液に 10 μ gZmlのァプロチュンと 1 μ gZmlの濃度で組換えヒルジ ン (和光純薬社製)を加えて抗凝固処理を行った全血 (溶液 A) 10mlおよび血液凝 固を促進する薬剤としてトロンボプラスチン試薬 (シスメッタス社製） 1バイアル/ mlを生 理食塩水 1000倍希釈した溶液にパパイン固定榭脂を用いて Fcドメインを分離した 抗ヒルジンポリクローナル抗体 (株式会社コスモバイオ社製） 5mgZmlになるように添 加した溶液 (溶液 B) 1mlを用意する。

血栓観測装置の作製にあたり、ポリジメチルシロキサン製の図 4に示す幅 40mm、 長さ 70mm、厚さ 1. 5mmの基板 100および厚さが lmmで同寸のガラス製の図 5に 示す基板 200を用いる。

[0058] 図 4に示したパターンで基板 100の表面を深さ 0. 5mmの溝で彫って血栓生成室 1 10を含む回路を形成する。溝の幅は流入管 111となる部分が lmmである。回路 10 0Dの長さは 30mmで、終端に直径 lmmの貫通孔を設け調整弁 100Eとし、開閉可 能なキャップで閉鎖する。血栓生成室 110は長さ 30mm、幅は広い部分で 2. 5mm であり、幅 0. 5mmの狭窄部 114を有するものである。そして、接続部 100A、 100B 、として直径 lmmの貫通孔を、接続部 100Cとして直径 2. 5mmの貫通孔を設ける。

[0059] 基板 200には、図 5に示すように基板 100の狭窄部 114を覆う位置に血栓誘発材 1 15としてコラーゲンを幅 10mmの帯状に塗布する。コラーゲン塗布に際しては、基板 200の狭窄部 114に対応する矩形形状にマスキングテープを貼り、その上カもシリコ ーン系剥離剤 SRX— 211 (東レ 'ダウコーユング社)をコーティングする。その後マス キングテープを剥がし、剥離剤未塗布のガラス領域に 1%になるようにコラーゲンタイ プ 1 (和光純薬社)を 0. 1N酢酸に溶解した溶液を滴下し、 25°C1時間放置した後に 剥離剤層上のコラーゲンを精製水で洗い流して狭窄部 114に対応する矩形形状の 剥離剤未塗布のガラス領域のみにコラーゲンを塗布する。

その後、基板 200のコラーゲン塗布面と基板 100の回路形成面を対向させて密着 させる。

[0060] 基板 100の裏面（回路が形成されていない面）から接続部 100A、 100Bに内径 lm mのシリコーンチューブを接続しおよびそれぞれ溶液 Aが充填された 10ml用シリン ジおよび溶液 Bが充填された lml用のシリンジに接続し、それぞれのシリンジをシリン ジポンプに装着する。なお、接続部 100Cには内径 2. 5mmのシリコーンチューブを 接続し排出管とする。

[0061] 接続部 100Aより溶液 Aを 0. 3mlZ分の流速で注入する。接続部 100Bからは溶 液 Bを 0. 03mlZ分の流速で注入する。

5分間それぞれの溶液を接続部 100A、接続部 100Bより流し、接続部 100Aより生 理食塩水を注入し血液を洗 ヽ流した後、確認すると主に基板 200のコラーゲン処理 面の中でも主に図 6の領域 aおよび領域 bに血栓形成が確認される。

[0062] 実施例 8

採血直後の血液に 0. 3mgZmlになるようにパパインによって Fcドメインを切断した 抗 ΧΠ因子ポリクローナル抗体 (コスモバイオ社製)および 0. 3単位になるように未分 画へパリン (ブタ由来 和光純薬社製)を添加して溶液 Aとすること、トロンボプラスチ ン試薬 (第一化学社製)を 50倍希釈して溶液 Bとすること、図 8に示す厚さ lmmの透 明なポリスチレン製の基板 200のコラーゲン塗布領域に前処理として 2g/リットルに なるように過マンガン酸カリウムを濃硫酸に溶解した溶液を滴下し 25°C 10分間反応 させ、その後すばやく精製水で洗浄し、前処理した領域に 1%になるようにコラーゲン タイプ 1(和光純薬)を 0. 1N酢酸に溶解した溶液を滴下し、 25°C1時間放置した後に 精製水で洗い流し、コラーゲンを塗布すること、図 7に示す血栓生成室 110に狭窄部 を有しない基板 100を用いること、以外は実施例 7と同様に血栓観測装置を作成し、 血栓生成観測を行う。なお、基板 100の接続部 100Cは直径 lmmの貫通孔とし、内 径 lmmのシリコーンチューブを排出管として接続する。

[0063] 10分間溶液 Aおよび溶液 Bを流した後、接続部 100Aより生理食塩水を注入して 血液を洗 、流すと、基板 200のコラーゲン塗布領域の流路部分に赤色血栓の付着 が確認される。

[0064] 実飾 19

採血直後の血液に 0. 05mgZmlの濃度にァプロチニン、および 1 gZmlの濃度 に組換えヒルジン (和光純薬社製)をカ卩えて抗凝固処理を行い、さらに 10 Mになる ようにキナクリン (シグマ社)を添加し溶液 Aとしたこと、

接続部 100Bをキャップで閉鎖し、接続部 100Aより lmlZ分の流速で溶液 Aのみ を注入したこと以外は、実施例 7と同様に血栓観測装置を作製し、血栓生成観測を 行った。

[0065] 基板 200側からコラーゲン塗布面に焦点を合わせ、蛍光実体顕微鏡で観察したと ころ、コラーゲン塗布面の一部に緑色のキナクリンの蛍光発色が確認され、経時的に その領域が斑状に広がり、 10分後にはコラーゲン塗布面の大部分で血小板の粘着 によると思われる緑色蛍光発色が確認された。

[0066] 実施例 10

キナリンを添加せずに溶液 Aとしたこと以外は、実施例 9と同様に血栓観測装置を 作製し、血栓生成観測を行った。

接続部 100Aより lmlZ分の流速で血液を注入した。注入中、接続部 100Cのチュ ーブを摘み 2秒間閉鎖したところ、内圧上昇に伴い即座に回路 100D内の血液が分 岐点より 20mmまで進み、接続部 100Cを開通させた力 血液は、分岐点より 20mm 地点からの移動は見られず、圧力上昇が起こった痕跡が確認できた。

[0067] 実施例 11

実施例 8の溶液 Aのへノ《リンに代えてパノ《インによって Fcドメインを切断した抗トロ ンビンポリクローナル抗体 (コスモバイオ社)を 30 μ g/mlになるように添加すること、 実施例 8の溶液 Bにさらに PPACKトロンビンを 5mg/mlになるように添加すること以 外は、実施例 8と同様に血栓観測装置を作製し、血栓生成観測を行う。

15分間溶液 Aおよび溶液 Bを流した後、接続部 100Aより生理食塩水を注入して 血液を洗 、流すと、基板 200のコラーゲン処理領域の流路部分に赤色血栓の付着 が確認される。

[0068] 実施例 12

へパリン 0. 5単位 Zmlおよび 10 μ gZmlのァプロチュンを加えた採血直後の血液 50mlを 800rpmで遠心分離し、上澄みより多血小板血漿（PRP)を作成し溶液 Aとし たこと、

溶液 Bにはトロンボプラスチン試薬（シスメッタス社） 1バイアル/ lmlを生理食塩水に よって 30倍に希釈した溶液を用いたこと、以外は実施例 7と同様に血栓観測装置を 作成し、血栓生成観測を行った。

実体顕微鏡を用いて狭窄部位 114の血栓生成観測を 15分間行った。狭窄部位 11 4近辺には血小板塊の付着が複数確認され、血小板塊が付着したりはがれたりを繰 り返しながら、塊の数が増加するとともに、大きさも成長するのが観測された。

[0069] 実施例 13

実施例 12の溶液 Aの PRP20mlに対し、遠心分離した沈殿より採取した赤血球を 5 00 μ 1カロえ溶液 Αとしたこと、

溶液 Bにはトロンボプラスチン試薬（シスメッタス社） 1バイアル/ lmlを生理食塩水に て 30倍に希釈した溶液を用いたこと、

基板 200を全面シリコーン系剥離剤 SRX— 211 (東レ 'ダウコーユング社)をコート したスライドガラスとしたこと、

基板 100の血栓生成室 110の狭窄部 114の上流側に隣接する漸次 2. 5mm幅に 広がる広幅部分の拡幅終点付近に約 1 μ 1の全血を付着させ 10分間室温で放置し 血液を凝固させて予備的な血栓を設け血栓誘発材としたこと、以外は、実施例 7と同 様に A溶液および B溶液を流し、血栓生成観測を行った。

[0070] 15分間実体顕微鏡で血栓付着領域をモニターした。 5分後あたりより予備的な血 栓を基点として下流に向力つて新たに生成した赤色血栓が確認され、 15分後までに 徐々に下流に向かって広がり、幅も 2. 5mm幅まで広がった。血流は形成された血 栓の上や合間を縫うように流れて 、るのが確認された。

[0071] 実施例 14

終濃度 5 μ Μのェクソサイト Iトロンビンァプタマ一（GGTTGGTGTGGTTGG :酉己 列番号 1)および終濃度 30 μ gZmlのコーン由来トリプシンインヒビター（コスモバイ ォ社)を加えた採血直後の血液 50mlを 800rpmで 10分間遠心分離し、上澄みより 多血小板血漿 (PRP)を作成し溶液 Aとしたこと、

150 Mになるようにアンチセンス DNA(CCAACCACACCAACC :配列番号 2 )を生理食塩水に溶解して溶液 Bとしたこと、

血栓誘発材 115の設置に際して、実施例 7のコラーゲン溶液に対しトロンボプラス チン試薬 (シスメッタス社） 1バイアルを lml精製水に溶解し精製水で透析した溶液を 5： 1の割合で混合した溶液をシリコーン未塗布領域に滴下し 4°Cで送風し乾燥したこ と、以外は実施例 7と同様に血栓観測装置を作成し、血栓生成観測を行った。

実体顕微鏡を用いて狭窄部位 114の血栓生成観測を 5分間行った。狭窄部位 114 近辺には血小板塊の付着が複数確認され、血小板塊が付着したりはがれたりを繰り 返しながら、塊の数が増加するとともに、大きさも成長するのが観測された。

[0072] 実施例 15

実施例 14と同手順で PRP作成後、測定直前に 15 Mになるようにアンチセンス D NA (CCAACCACACCAACC：配列番号 2)を添力卩し抗トロンビン処理を解除し溶 液 Aとしたこと、

実施例 9と同様に、接続部 100Bの注入口を閉塞したこと、

実施例 14のコラーゲン溶液に代えてコラーゲンタイプ 1 (細胞培養のディッシュをコ ラーゲンコートするコラーゲン試薬、 Cellmatrix社 Typel—A原液）を用いたこと、 溶液 Aのみを 0. 2mlZ分の流速で 5分間流したこと、以外は実施例 14と同様に血 栓観測装置を作成し、血栓生成観測を行った。

実体顕微鏡を用いて狭窄部位 114の血栓生成観測を行った。狭窄部位 114近辺 には血小板塊の付着が複数確認され、血小板塊が付着したりはがれたりを繰り返し ながら、塊の数が増加するとともに、大きさも成長するのが観測された。

[0073] 実施例 16

図 7に示すパターンで基板の表面を深さ 0. 1mmの溝で彫るとともに、血栓生成室 110の中央付近に長さ lmm、幅 40 /z mの凸条を、間隔 40 mで溝の底部全面に 直立させて仕切壁を残したこと、

実施例 9と同様に、接続部 100Bの注入口を閉塞したこと、

基盤 200を表面無処理の単なるスライドガラスとしたこと、以外は実施例 7と同様に 血栓観測装置を作成した。仕切壁間の隙間 (流路）は毛細血管を模したものである。 採血直後の全血に終濃度 30 gZmlのコーン由来トリプシンインヒビターと終濃度 10 Mのェクソサイト Iトロンビンァプタマ一をカ卩えて抗凝固処理を行った。観測直前 に 30 μ Μになるようにェクソサイト Iトロンビンァプタマ一のアンチセンス DNAをカロえ、 100Aより 0. 05mlZ分の流速で 5分間注入した。

実体顕微鏡を用いて仕切壁間の隙間の血栓生成観測を行ったところ、 5分間の観 測中に順次血栓形成により流路が閉塞し、約半分の流路が血栓形成により閉塞する のが観測された。

[0074] 実施例 17

図 9に示すシリンジ送液系および実施例 7と同材質の図 9の（B)と（C)に示すマイク 口チップの基板と蓋とを圧着させたマイクロチップ 300を用いた。このマイクロチップ 3 00は、血液凝固防止剤流入管 322と排出管 313を実施例 7の排出管と同様に基板 100に接続したものである。但し、図 9のマイクロチップ 300の溝は全て深さ 200 m とし、サンプルシリンジ 320から血液が流入する流路を幅 lmmで長さ 40mmとし、そ の先に 200 μ m幅で長さ 10mmの狭窄な流路からなる血栓生成室 311および血液 凝固防止剤流入管 322に接続される流路を形成した。シスメッタス社 PT試薬 (組織ト ロンボブラスチン） 1バイアルを lmlの精製水に溶解し、精製水に透析したものをコラ 一ゲンタイプ I (新田ゼラチン社製）に対し 1対 1で混合した溶液を図 9に示す血栓誘 発材 315の位置に塗布した。その後 4°Cで、塗布部を風乾させ、血栓生成室 311を 覆い血栓誘発材 315として用いた。シリンジに終濃度がコーン由来トリプシンインヒビ ター： 25 g/mUェクソサイト Iトロンビンァプタマ一： 10 M、ェクソサイト IIトロンビ ンァプタマ一： 10 M (5， - AGTCCGTGGTAGGGC AGGTTGGGGTG ACT 3'：配列番号 3)になるように抗凝固処理剤をカ卩ぇ採血した。採血した血液に対し 測定直前に、それぞれ 40 Mになるようにェクソサイト I及びェクソサイト IIのトロンビ ンァプタマ一に対するアンチセンス DNAを加え、シリンジ（テルモネ土製 1mlシリンジ )を血液で満たし図 9のサンプルシリンジ 320とした。送液ポンプ内の圧力をモニタリ ング可能な微量送液ポンプであるマイフロー（ァーピオテック社製)を図 9の圧入管 3 17に接続しサンプルシリンジ 320にかかる圧力をモニタリングしながら図 9の（A)に 示す様にサンプルシリンジ 320の上部よりミネラルオイルを圧入し、血液をマイクロチ ップ 300に 50 μ lZminの速度で押し出した。

血液凝固防止剤として 1M Tris-HCl pHIOを血液凝固防止剤流入管 322より lZminで流した。圧力測定開始力も 6分後に圧力が上昇しはじめた。

血栓の飛泳による圧力の上下を繰り返しながら 80kPaまで圧力が上昇した（図 13 の control)。

[0075] 実施例 18

実施例 17と同様に抗凝固処理剤を加え採血を行った。その後、さら〖こ 1単位 Zml になるように未分画へパリンを加えたこと以外は、実施例 17と同様の操作を行い、圧 力の測定を行った。圧力は 13分後に上昇しはじめた。圧力は約 lOkPaまで上昇した (図 13の Heparin)。

[0076] 実施例 19

実施例 17と同様に抗凝固処理剤を加え採血を行った。その後、さら〖こ 50 gZml になるようにレオプロ（リリー社)をカ卩えたこと以外は、実施例 17と同様の操作を行い、 圧力の測定を行った。 18分間の観測において圧力の上昇は確認されな力つた（図 1 3のレ才プロ）。

[0077] 実施例 20

3. 2%クェン酸と血液との比が 1 : 9の割合になるようにクェン酸を加えて採血し、さ らにその血液に 25 gZmlになるようにコーン由来トリプシンインヒビターを添力卩し抗 凝固処理を行った。血栓生成観測に際して、抗凝固処理した血液に対し 15mMにな るように塩ィ匕カルシウムを加えた直後に、血液をシリンジ (テルモネ土製 lmlシリンジ）に 加えた後、実施例 17と同様のマイクロチップに 40 lZminの流速で血液を流入さ せ実施例 17と同様のシステムで圧力変化を測定した。圧力は 15分後に上昇を開始 し 60kPa程度まで上昇した。

[0078] 実施例 21

実施例 20と同様に抗凝固処理剤を加え採血を行った。その後、さらにそれぞれ、 0 . 2単位 Zml、 0. 5単位 Zml、 1単位 Zmlのへパリンを加えたこと以外は、実施例 2 0と同様の操作を行い、圧力の測定を行った。結果を図 14に示す。

[0079] 実飾 122

実施例 20と同様に抗凝固処理剤を加え採血を行った。その後、さら〖こ 2 /z gZmlの ReoPro (リリー社)をカ卩えたこと以外は、実施例 20と同様の処理を行い、圧力の測定 を行った。圧力は 20分後に上昇を開始し、 25分後に 15kPaにまで上昇した（図 15)

[0080] 実飾 123

図 12に示すシリンジ送液系および図 12の（B)と（C)に示すマイクロチップの蓋の 基板 200とマイクロチップの本体の基板 100とを圧着させたマイクロチップ 400を用 いた。テフロン (登録商標)チューブ製の排出管 413にはミネラルオイルを満たし、そ の一端をシリコーンゴム製の接続チューブ 412を介してマイクロチップ 400と接続し、 他端を圧力センサーが内蔵された吸引ポンプ 414に接続した。マイクロチップ 400の 流路カもなる流入管にはシリコンゴム製の接続チューブ 412を介してシリンジ 420を 接続した。テフロン (登録商標)チューブ製の血液凝固防止剤流入管 422の一端に は送液ポンプ 423を接続し、他端にはシリコンゴム製の接続チューブ 412を介して血 栓生成室の終端に接続した。この様に、マイクロチップ 400に排出管 413、シリンジ 4 20および血液凝固防止剤流入管 422を接続して血栓観測装置 Bとした。血栓生成 室の下には、レール 433に載せられて駆動可能とされ、 LEDからなる照明光源 432 を備える CCDカメラ 430を設置した。 マイクロチップの溝は全て深さ 120 μ mとした。

血液が流入する流路を幅 800 mで長さ 7mm、狭窄流路を幅 200 mで長さ 10 mmの流路とした。

マイクロチップの基板 200の、マイクロチップの基板 100に圧着される面の狭窄部の 流路に面する領域に、 PT試薬 (シスメッタス社:組織トロンボプラスチン） 1バイアルを lmlの精製水に溶解し、精製水に透析したものをコラーゲンタイプ I (新田ゼラチン社 製）に対し 1対 1で混合した溶液を塗布した。その後 4°Cで真空乾燥させ、基板 100を 基板 200と圧着させ、血栓生成室 411を有するマイクロチップ 400とした。

抗凝固剤としてクェン酸ナトリウムが封入されている真空採血管で採血を行い、シリ ンジ 420に入れる直前に終濃度 12. 5mMの塩化カルシウムと 25 μ gZmlになるよう にコーン由来トリプシンインヒビターを添カ卩した。

送液ポンプ内の圧力をモニタリング可能な微量送液ポンプであるマイフロー（ァー ピオテック社製)をポンプ 414として排出管 413に接続し、流路の内圧をモニタリング しながら 15 lZminの速度で吸弓 |した。

血液凝固防止剤として 1M Tris-HCl pHIOを血液凝固防止剤流入管 422より 8 lZminで流した。圧力測定開始力も 4分後に主に白色の血栓形成が確認される と共に内圧の低下が確認され 10分後には開始時より 30kPa内圧の低下が確認され た。

また、流路内の血栓形成部位をカメラ 430を移動させながら撮像して血栓の生成を 確認した。血栓の生成が確認された位置を記憶して定期的に巡回して撮像すること により、複数の大きな血栓について経時的な血栓の成長及び崩壊を記録する事が出 こ ο

なお、以下に参考実験を行い、トロンビンァプタマ一とそのアンチセンス DNAがそ れぞれ抗凝固処理剤と抗凝固解除剤として有効であることを示す。 [参考実験 1] 採血直後の血液、これに対し 300 μ gZmlのコーン由来トリプシンインヒビターを 10 分の 1容量添カ卩した血液、これに対し、さらに、 5 Mになるようにェクソサイト Iを認識 するトロンビンァプタマ一をカ卩えた血液、の 3種類の血液の凝固時間をエツペンドル フチューブ (ポリプロピレン製）中にて測定した。サンプルは 1分ごとに上下反転させ 流動性を確認した。無添加の血液の凝固時間は 9分であった。これに対し、トリプシ ンインヒビターを添カ卩した血液の凝固時間は 22分、さらにトロンビンァプタマ一を添 加した血液の凝固時間は 62分であった。

又、 5 Mのェクソサイト Iを認識するトロンビンァプタマ一及び 5 μ Μのェクソサイト I Iを認識するトロンビンアブタマ一を併用した場合には、トリプシンインヒビター無しの 場合においても 3時間後にも血液凝固は確認されな力つた。ェクソサイト I認識トロン ビンァプタマ一： 5，一 GGTTGGTGTGGTTGG 3， 酉己歹 U番号 1ェクソサイト II 認識トロンビンァプタマ一：5' - AGTCCGTGGTAGGGC AGGTTGGGGTG AC T 3'配列番号 3

[0082] [参考実験 2]

また、血漿 200 μ Μに対し、生理食塩水 10 μ 1を添カ卩したサンプル Α、 500 μ Μェ クソサイト I認識トロンビンァプタマ一を 10 μ 1添カ卩したサンプル Β、 500 μ Μェクソサイ Η認識トロンビンァプタマ一と 1500 μ Μェクソサイト I認識トロンビンァプタマ一アン チセンス DNAの溶液を 10 μ 1添カ卩したサンプル Cの ΑΡΤΤをそれぞれ測定したとこ ろ、サンプル Αは 44秒、サンプル Bは 2分以上、サンプル Cは 45秒であった。

[0083] [参考実験 3]

図 11 (A)は 10 μ Μのェクソサイト I及び IIに対するァプタマ一を加えた血液を 15分 間室温で保存した後に 40 μ Μの両ァプタマ一のアンチセンス DNAを添カ卩しトロンボ エラストグラムで凝固の波形を解析したものである。図 11 (B)は採血直後の血液のト ロンボェラストグラムの波形である。

図 11 (A)および（B)の結果より、 2種のトロンビンァプタマ一の添加で血液の保存 が可能で、アンチセンス DNAによってその抗凝固処理が解除されて ヽることが分か る。

以上、参考実験 1〜3の結果よりコーン由来トリプシンインヒビターとトロンビンァプタ マーの組み合わせが全血の凝固を効果的に抑制すること、トロンビンァプタマ一の抗 凝固作用はトロンビンァプタマ一に対するアンチセンス DNAによって無効化されるこ とが明らかである。

[0084] [参考実験 4] 以下、血液の保存及び基板上での血小板粘着に関する PMEAコーティングの有 効性を示す。

1)特開平 4-152952に従い合成した 1%PMEA含有メタノール溶液を 2.5mlアクリル 榭脂容器（内寸 lcm X 1cm X 4.5cm)に塗布し、 90°Cで 10分乾燥した。次に、 3. 2%クェン酸によって抗凝固処理した血液 760 μ 1を非コート容器及び PMEAコート済 容器に加え 5分ごとにピペットで吸引し血液凝固を確認した。

その結果、非コート容器においては 30分で明らかな粘性の上昇がみられ 60分で凝 固したのに対し、 PMEAコート容器では 35分で明らかな粘性の上昇が見られた力 凝 固時間は 90分にまで延長された。

[0085] 2)上記 PMEAを透明アクリル板に平滑にコーティングした。これを実施例 9のコラー ゲンコート板（図 8)の代わりに用い、実施例 9と同様に、血液中のキナクリンラベル血 小板及び白血球の粘着実験を行った。

その結果、非コートアクリル板には血液を流し始めて 10分後には血小板、白血球の 明らかな粘着凝集が確認されたが、 PMEAコートアクリル板には 30分後にも血小板、 白血球の粘着及び凝集は確認されなかった。

上記結果より、本血栓観測装置において血液保存シリンジ、チューブ、基板などを PMEAでコートすることにより、血栓観測室以外の血栓形成が抑制され、血栓観測室 特異的血栓観測が可能である事が示唆された。

[0086] 以上、本発明を好適な実施の形態に基づいて説明してきた力 本発明は上述の実 施例や形態例に限定されるものではなぐ本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の 改変が可能である。例えば、ポンプの圧力を高めに設定し、排出管の内径を小さく取 ることにより流入管内および排出管内に背圧を発生させ、血圧に相当する内圧の負 荷のもとで血流量を調整しつつ、血栓生成をモニタリングする事も可能である。そして 、この時の血流の速度もポンプの圧力と排出管の絞り量で自由に調節する事が可能 である。

産業上の利用の可能性

[0087] 本発明の血栓観測装置および血栓観測方法は、患者等に投与した抗血栓薬の効 能を観測するに際し、全血または血小板を含む血漿を用いて血流と同等環境下にお ける血液凝固および血小板による血栓形成を総合的に評価するために好適に利用 することができる。

Claims

請求の範囲

[1] 血管を模した流路に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除または血液凝固 を促進しつつ流して血栓の生成を観測する血栓観測装置であって、

該血栓観測装置は、その内部の少なくとも一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材 が設けられた血栓生成室と、該血栓生成室に接続されて前記血栓生成室に血液を 流入させる流入管と、該流入管に接続されて前記流入管に抗凝固処理を解除する 薬剤または血液凝固を促進する薬剤を投入する薬剤管と、を有することを特徴とする 血栓観測装置。

[2] 血管を模した流路に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除または血液凝固 を促進しつつ流して血栓の生成を観測する血栓観測装置であって、

該血栓観測装置は、その内部の少なくとも一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材 が設けられた血栓生成室と、該血栓生成室に接続されて前記血栓生成室に血液を 流入させる流入管と、該血栓生成室に接続されて血栓生成室通過後の血液に血栓 形成防止剤を混和させる血栓形成防止剤流入管と、を有することを特徴とする血栓 観測装置。

[3] 前記血栓観測装置は、基板上に形成されたものである請求項 1または 2に記載の 血栓観測装置。

[4] 前記血栓観測装置は、さらに、流入管および Zもしくは薬剤管を加圧するポンプ、 または血栓形成室に接続されて血栓形成室から血液を排出する排出管を吸引する ポンプを有する請求項 1な 、し 3の 、ずれかに記載の血栓観測装置。

[5] 前記血栓観測装置は、さらに、圧力測定装置を有する請求項 1ないし 4のいずれ力ゝ に記載の血栓観測装置。

[6] 前記血栓誘発材がコラーゲンを含むものである請求項 1な 、し 5の 、ずれかに記載 の血栓観測装置。

[7] 前記血栓誘発材が、さらに組織因子を含むものである請求項 6に記載の血栓観測 装置。

[8] 前記血栓観測装置は、さら〖こ、血栓形成室を撮影するためのカメラを有する請求項 1な！、し 7の 、ずれかに記載の血栓観測装置。

[9] その内部の少なくとも一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材が設けられた血栓生 成室に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除または血液凝固を促進しつつ 流して血栓の生成を観測することを特徴とする血栓観測方法。

[10] 抗凝固処理がカルシウムキレート剤による処理であり、遊離カルシウム供与体によ つて抗凝固処理を解除する請求項 9記載の血栓観測方法。

[11] 抗凝固処理がトロンビンァプタマ一による処理であり、トロンビンァプタマ一のアンチ センス DNAによって抗凝固処理を解除する請求項 9記載の血栓観測方法。

[12] 前記血栓生成室に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除する操作を行うこ となく血液凝固を促進しつつ流して血栓の生成を観測する請求項 9記載の血栓観測 方法。

[13] 組織トロンボプラスチンによって血液凝固を促進する請求項 12記載の血栓観測方 法。

[14] 1種または複数種の抗凝固処理剤を用いて抗凝固処理された血液を、用いた抗凝 固処理剤に対応する少なくとも 1種の抗凝固処理解除剤で抗凝固処理を解除する請 求項 9記載の血栓観測方法。

[15] 抗凝固処理剤が接触相因子阻害剤及びカルシウムキレート剤であり、抗凝固処理解 除剤が遊離カルシウム供与体である請求項 14記載の血栓観測方法。

[16] 抗凝固処理剤が接触相因子阻害剤及びへパリンであり、抗凝固処理解除剤がへ ノ^ナーゼである請求項 14記載の血栓観測方法。

[17] 抗凝固処理剤が接触相因子阻害剤及びトロンビンアブタマ一であり、抗凝固処理 解除剤がトロンビンァプタマ一のアンチセンス DNAである請求項 14記載の血栓観測 方法。

[18] 前記接触相因子が血液凝固 XII因子またはカリクレインである請求項 15ないし 17の

V、ずれかに記載の血栓観測方法。

[19] 前記接触相因子が血液凝固 XII因子であり、血液凝固 XII因子阻害剤がコーン由来 トリプシンインヒビターである請求項 18記載の血栓観測方法。

[20] 前記血栓観測方法は、前記血栓生成室における血液の流入時および Zまたは流 出時の圧力を測定する請求項 9な 、し 19の 、ずれかに記載の血栓観測方法。 前記血栓誘発材がコラーゲンと組織因子を含むものである請求項 9なレ、し 20のレ、ず れかに記載の血栓観測方法。