KR20080077355A - 혈전 관측 장치 및 혈전 관측 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈전 형성 관측 장치로서, 항응고 처리된 혈액을 혈관을 모방한 채널을 통해 항응고 처리를 해제하거나 또는 혈액 응고를 촉진하면서 흐르게 하여 혈전 형성을 관측하는 혈전 관측 장치를 제공한다. 상기 혈전 형성 관측 장치는 내부의 적어도 일부에 혈전 형성을 유발하는 혈전 유발제가 배치된 혈전 형성실; 상기 혈전 형성실에 연결되어 상기 혈전 형성실에 혈액을 유입시키는 유입관; 및 상기 유입관에 연결되어 상기 유입관에 항응고 처리를 해제하는 약제 또는 혈액 응고를 촉진하는 약제를 투입하는 약제관을 포함한다. 또한, 본 발명은 내부의 적어도 일부에 혈전 형성을 유발하는 혈전 유발제가 배치된 혈전 형성실에 항응고 처리된 혈액을 항응고 처리를 해제하거나 또는 혈액 응고를 촉진하면서 유입하는 단계 및 혈전의 형성을 관측하는 단계를 포함하는 혈전 형성을 관측하는 방법을 제공한다.

Description

혈전 관측 장치 및 혈전 관측 방법{APPARATUS FOR MONITORING THROMBUS FORMATION AND METHOD OF MONITORING THROMBUS FORMATION}

본 발명은 환자 등에 투여한 항혈전제의 효능을 관측하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 전혈(whole blood) 또는 혈소판을 포함하는 혈청을 이용하여 혈류와 동등한 환경하에서 혈액 응고 및 혈소판에 의한 혈전 형성을 종합적으로 평가하는 장치 및 방법에 관한 것이다.

예를 들어, 심근경색 등의 죽상혈전증(atherothrombosis)은 동맥 경화부위의 죽상반(atheromatous plaque)이 망가지면 혈류에 노출된 조직 인자를 포함한 콜라겐 상에 혈소판이 점착되고, 여기에 혈소판 응집, 혈액 응고 시스템의 활성화가 복합적으로 일어나 심각한 폐쇄성 혈전을 일으킨다. 심근경색 등의 심장 질환으로 인한 사망은 일본에서만도 전체 사망 원인의 2위를 차지하는 심각한 질환이다.

그러나, 심근경색 등에서는 혈전 형성은 죽상경화 영역에서만 진행되며, 전신에서의 혈전 경향은 극단적으로 진행되는 경우는 없다. 이러한 혈전증에서의 혈전 경향을 평가하거나, 항혈전 요법에서 항혈전 효과를 모니터링하기에는 시험관내 시험은 벅합하지 않으므로, 혈류의 존재하에서 응고 및 혈소판(점착, 응집)에 대한 종합적인 평가가 중요하다.

종래의 혈액 응고능에 대한 평가는 혈청을 이용한 부분 활성화된 트롬보플라스틴 시간(APTT), 트롬보플라스틴 시간(PT) 결정에 의해 수행되었다. APTT는 주로 내인계 응고, PT는 외인계 응고를 반영한다. 혈소판의 검사는 다혈소판 혈청을 이용하고, ADP 및 콜라겐 등의 혈소판 활성화 물질을 투입하여, 투과도의 변화 등에 의해 혈소판의 응집능을 평가할 수도 있다. 또한, 전혈 응고 시간, 즉 칼슘을 재첨가한 후 전혈이 응고되는 시간 등에 의해 전혈 응고 시간을 측정한다.

게다가, 전혈을 이용한 검사 시스템은 트롬보엘라스토그람(thromboelastogram)을 이용하여, 응고 성분의 활성화 및 혈소판의 응집 등을 모니터링한다.

그러나, 생체내에서는 혈전이 혈류하에서 성장하지만, 상기 검사 방법 등은 폐쇄된 시험관내에서의 측정이기 때문에 혈전이 생체내에서 성장하는 상태를 관찰할 수 없다.

이러한 문제점을 해결하기 위한 제안으로서, 특허문헌 1과 비특허문헌 2 및 3에는 평가할 항혈전제가 투입된 혈액을 콜라겐 세포에 통과시키고, 혈소판을 형광 표지함으로써 혈소판의 점착, 응집을 공초점 현미경 장치로 모니터링하는 방법이 개시되어 있다.

그러나, 상기 문헌에 기재된 발명은 항응고제의 존재하에서 관찰을 실시하는 것이므로, 응고 시스템에서 이루어지는 혈소판의 점착 또는 응집으로 인한 혈전은 형성되지 않는지, 또는 혈전의 형성력이 저하되었는지를, 혈소판의 형태 변화를 관측함으로써 평가하게 되며, 이러한 평가에는 응고 시스템과 연동한 혈소판의 활성 화는 반영되지 않는다. 따라서, 항혈소판제의 약효를 평가하는 데에는 바람직한 발명이지만, 혈전 자체나 혈전 형성의 전 과정을 모니터링할 수 없다. 또한, 형광현미경은 고가이므로, 일반적인 검사에 사용하기 어렵다.

또한, 특허문헌 2에서는 항응고 처리된 혈액의 유동성을 미세한 빗형의 실리콘 셀을 통과시킴으로써 측정하고 있다. 이처럼, 특허문헌 2의 방법도 항응고 처리된 혈액을 이용하는 것이므로, 응고 시스템의 영향을 측정할 수 없다. 또한, 상기 방법에서 혈액 점도는 개인차, 일변화(diurnal variation)가 커서, 약제 치료를 반영하기 어려운 실정이다.

혈소판은 응고 시스템에 의해 활성화되고, 응고 시스템은 활성화 혈소판에 의해 촉진된다. 즉, 항응고 처리된 혈액은 혈소판의 활성화도 저해하여, 항혈전제의 효능을 관측할 수 없다. 그러나, 항응고 처리를 행하지 않으면, 혈액은 즉시 응고되어 시험에 사용할 수 없게 된다.

특허문헌 1: 일본 특허 공개공보 2004-251630호

특허문헌 2: 일본 특허 공개공보 2006-145345호

비특허문헌 1: Blood. 1990;75:390-398

비특허문헌 2: Blood. 1999; Aug1;94(3):968-75.

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

본 발명은 상기 상황을 감안하여, 환자 등에 투여한 항혈전제의 효능을 관측할 때 전혈 또는 혈소판을 포함하는 혈청(본 명세서에서는 이를 포괄적으로 "혈액"이라고도 함)을 이용하여 혈류와 동등한 환경하에서의 혈액 응고 및 혈소판에 의한 혈전 형성을 종합적으로 평가하는 장치 및 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

과제를 해결하기 위한 수단

상기한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 항응고 처리를 해체하거나 혈액 응고를 촉진하면서 혈관을 모방한 채널를 통해 항응고 처리된 혈액을 흐르게 하는, 혈전 형성을 관측하는 혈전 관측 장치로서, 내부의 적어도 일부에 혈전 형성을 유발하는 혈전유발제가 배치된 혈전 형성실과, 상기 혈전 형성실에 연결되어 있으며 상기 혈전 형성실에 혈액을 유입시키는 유입관과, 상기 유입관에 연결되어 있으며 상기 유입관에 혈액 응고를 촉진(이하, "응고 촉진"이라고도 함)하는 약제 또는 항응고 처리를 해제하는 약제를 투입하는 약제관을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈전 관측 장치를 제공한다. 한편, 본 발명에서 "관측"은 육안 확인 또는 이미지 촬영 등으로 혈전 형성을 시각적으로 평가하는 것뿐만 아니라, 압력 측정 등에 의해 혈전 형성 정도를 수치화하여 평가하는 것도 포함한다.

또한, 본 발명은 내부에 적어도 일부에 혈전 형성을 유발하는 혈전 유발제가 배치된 혈전 형성실과, 상기 혈전 형성실에 연결되어 있으며 상기 혈전 형성실에 혈액을 유입시키는 유입관과, 상기 혈전 형성실에 연결되어 있으며 혈전 형성실을 통과한 혈액에 혈전 형성 방지제를 혼합하기 위한 혈전 형성 방지제 유입관을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈전 관측 장치를 제공한다.

상기에서, 혈전 관측 장치는 기판 상에 형성된 것이 바람직하다.

본 발명의 혈전 관측 장치는, 또한, 유입관 및/ 또는 약제관을 가압하기 위한 펌프, 또는 혈전 형성실에 연결되어 있으며 혈전 형성실로부터 혈액을 배출시키는 배출관을 흡인하는 펌프를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 혈전 관측 장치는, 또한, 압력 측정 장치나 혈전 형성실을 촬영하기 위한 카메라를 포함하는 것이 바람직하다.

아울러, 상기 혈전 유발제는 콜라겐을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 혈전 유발제는 조직 인자(조직 트롬보플라스틴)를 더 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 내부의 적어도 일부에 혈전 형성을 유발하는 혈전 유발제가 배치된 혈전 형성실에, 항응고 처리된 혈액을, 항응고 처리를 해제 또는 혈액 응고를 촉진하면서 유입시킴으로써, 혈전의 형성을 관측하는 것을 특징으로 하는 혈전 관측 방법을 제공한다. 본 발명에서, "혈액을 항응고 처리를 해제 또는 혈액 응고를 촉진하면서 유입시키는"은 채널내에서 항응고 해제 반응 또는 응고 촉진 반응이 진행되는 상태일 수 있으며, 채널내에서 항응고 해제제(releasing agent) 또는 응고 촉진제를 혈액과 혼합하면서 유입시키는 상태 또는 항응고 해제제 또는 응고 촉진제를 혈액과 혼합한 후 신속하게 유입시키는 경우를 포함한다.

본 발명의 혈전 관측 방법에서, 상기 항응고 처리는 구연산 등의 칼슘 킬레이트제에 의한 처리이며, 유리 칼슘 공여체에 의해 항응고 처리를 해제하는 것이 바람직하다.

본 발명의 혈전 관측 방법에서, 상기 항응고 처리는 트롬빈 앱타머에 의한 처리이며, 트롬빈 앱타머의 안티센스 DNA에 의해 항응고 처리를 해제하는 것이 바람직하다.

상기 본 발명의 혈전 관측 방법에서, 혈전 형성실에 항응고 처리된 혈액을 항응고 처리를 해제하는 조작을 행하지 않고 혈액 응고를 촉진하면서 흐르게 하여 혈전의 형성을 관측하는 것이 바람직하다. 여기서, 혈액 응고를 촉진하는 수단은 조직 트롬보플라스틴의 첨가가 바람직하다.

또한, 본 발명의 혈전 관측 방법에서, 1종 또는 복수 종의 항응고 처리제를 이용하여 항응고 처리한 혈액을, 상기 이용한 항응고 처리제에 대응하는 적어도 1종 이상의 항응고 처리 해제제로, 항응고 처리를 해제하는 것이 바람직하다. 여기에서, 항응고 처리제는 접촉상 인자 저해제(contact phase factor inhibitor) 및 칼슘 킬레이트제이며, 항응고 처리 해제제는 유리 칼슘 공여체인 것이 바람직하다. 또한, 항응고 처리제는 접촉상 인자 저해제 및 헤파린이고, 항응고 처리 해제제는 헤파리나제인 것이 바람직하다. 또한, 항응고 처리제는 혈액 응고 XII 인자, 칼리크레인(kallikrein) 등의 접촉상 인자에 대한 저해제 및 트롬빈 앱타머이고, 항응고 처리 해제제는 트롬빈 앱타머의 안티센스 DNA인 것이 바람직하며, 혈액 응고 XII 인자의 저해제로는 옥수수 유래의 트립신 저해제가 바람직하다.

또한, 본 발명의 혈전 관측 방법에서, 상기 혈전 형성실에 혈액의 유입 및/또는 유출시에 압력을 측정하는 것이 바람직하다.

아울러, 본 발명의 혈전 관측 방법에서, 혈전 유발제는 콜라겐과 조직 인자를 포함하는 것이 바람직하다.

발명의 효과

본 발명의 청구항 제 1항에 따른 혈전 관측 장치는 내부의 적어도 일부에 혈전 형성을 유발하는 혈전 유발제가 배치된 혈전 형성실과, 상기 혈전 형성실에 연결되어 있으며 상기 혈전 형성실에 혈액을 유입시키는 유입관과, 상기 유입관에 연결되어 있으며 상기 유입관에 항응고 처리를 해제하는 약제 또는 혈액 응고를 촉진하는 약제를 투입하는 약제관을 포함함으로써, 항혈전제를 환자 등에 투여한 후 채혈한 혈액이 혈전 형성실에 이르는 채널에서 응고하지 않도록 항응고 처리된 혈액은, 혈전 형성실에서 의도적으로 혈전을 형성시킴으로써 관측할 수 있으므로, 항혈전제의 효능을 인체 내부와 비슷한 환경에서 구체적으로 관측할 수 있다. 또한, 채혈시에 항응고 처리제를 이용할 수 있어, 채혈 후의 검체를 일정 기간 보존할 수 있으며, 검사 시기를 임의로 선택할 수 있는 이점이 있다.

본 발명의 청구항 제 2항에 따른 혈전 관측 장치는 내부의 적어도 일부에 혈전 형성을 유발하는 혈전 유발제가 배치된 혈전 형성실과, 상기 혈전 형성실에 연결되어 있으며 상기 혈전 형성실에 혈액을 유입시키는 유입관과, 상기 혈전 형성실에 연결되어 있으며 혈전 형성실을 통과한 혈액에 혈전 형성 방지제를 혼합시키는 혈전 형성 방지제 유입관을 포함함으로써, 상기와 동일하게 혈전 관측을 실시할 수 있을 뿐만 아니라 혈전 형성실의 하류에서 혈액 응고가 진행되지 않게 되어, 압력 측정에 영향을 미치는 것을 방지할 수 있으며, 게다가 미묘한 압력 변화를 관측할 수 있다.

여기에서, 본 발명의 혈전 관측 장치가 기판상에 형성된 경우에는 소량의 혈액에서도 관측가능할 수 있다. 또한, 유입관 및/또는 약제관을 가압하는 펌프 또는 혈전 형성실에 연결되어 있으며 혈전 형성실로부터 혈액을 배출하는 배출관을 흡인하는 펌프를 포함하고 있어, 소정 압력 또는 소정의 유속하에서 소정의 시간 동안 혈액이나 혈액 응고를 촉진하는 약제를 안정적으로 유입시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 혈전 관측 장치에 압력 측정 장치가 포함된 경우에는 혈전 형성 정도를 수치화할 수 있으며, 따라서 정량적인 평가를 할 수 있다.

아울러, 상기 혈전 유발제가 콜라겐을 포함하는 경우에 상기 장치를 쉽게 세팅할 수 있다. 상기 혈전 유발제는 콜라겐과 함께 조직 트롬보플라스틴 등의 조직 인자를 더 포함할 때 효과적으로 혈전 형성을 유발할 수 있다.

또한, 본 발명의 혈전 관측 장치가 혈전 형성실을 촬영하기 위한 카메라를 포함하는 경우, 혈전 형성의 상태/모양을 영상으로서 관찰하여 그 영상을 보존할 수 있다.

또한, 청구항 제 9항에 따른 본 발명의 혈전 관측 방법은 내부의 적어도 일부에 혈전 형성을 유발하는 혈전 유발제가 배치된 혈전 형성실에 항응고 처리된 혈액을 항응고 처리를 해제 또는 혈액 응고를 촉진하면서 유입시켜 혈전의 형성을 관측 함으로써, 항혈전제를 환자 등에 투여한 후 채혈한 혈액이 응고하지 않도록 항응고 처리된 혈액을 혈액 응고를 촉진하면서 유입시켜 혈전 유발제 상에서의 혈전의 형성을 관측할 수 있으므로, 항혈전제의 효능을 인체 내부와 비슷한 환경에서 구체적으로 관측할 수 있다. 또한, 채혈시에 항응고 처리제를 이용할 수 있어, 채혈 후 검체를 일정 기간 보존할 수 있으며, 검사 시기를 임의로 선택할 수 있는 이점이 있다. 여기에서, 항응고 처리가 구연산 등의 칼슘 킬레이트제에 의한 처리이고 유리 칼슘 공여체에 의해 항응고 처리를 해제된다면, 시약을 용이하게 구입할 수 있어, 바람직하다. 항응고 처리가 트롬빈 앱타머에 의한 처리이고 트롬빈 앱타머의 안티센스 DNA에 의해 항응고 처리가 해제된다면, 혈액의 생리적 칼슘 이온 농도를 반영하면서 검사를 수행할 수 있다.

또한, 청구항 제 12항에 따른 본 발명의 혈전 관측 방법은 혈전 형성실에 항응고 처리된 혈액을 항응고 처리를 해제하는 조작을 행하지 않고 혈액 응고를 촉진하면서 유입시켜 혈전의 형성을 관측할 수도 있으므로, 소량의 혈액으로도 혈전 형성을 관찰할 수 있으며 피검자의 부담을 낮출 수 있다. 또한, 이런 경우, 약제관이 반드시 필요한 것은 아니므로, 혈전 관측 장치를 단순화할 수 있다. 여기에서, 조직 트롬보플라스틴을 혈액 응고 촉진제로서 이용한다면, XII 인자 활성화나 칼리크레인 활성화를 우회하는 경로로 응고 시스템이 활성화됨으로써 혈액 응고가 촉진되어, 따라서 혈전 형성실에서 혈전을 관측할 수 있다.

또한, 1종 또는 복수 종의 항응고 처리제를 이용하여 항응고 처리한 혈액은 상기 이용한 항응고 처리제에 대응하는 적어도 하나 이상의 항응고 처리 해제제를 사용하여 항응고 처리를 해제하는 용이한 조작으로 혈전 형성을 관측할 수도 있다. 이 경우, 접촉상 인자 저해제 및 칼슘 킬레이트제로 항응고 처리하고 유리 칼슘 공여체로 항응고 처리를 해제하였을 때, 또는 접촉상 인자 저해제 및 헤파린으로 항응고 처리하고 헤파리나제로 항응고 처리를 해제하였을 때, 혈전 형성 관측시에 효과를 발휘하는 항응고 처리는 접촉상 인자 저해제에 의한 항응고 처리이므로, 보다 생리적인 조건하에서, 특히 칼슘, 마그네슘 등의 혈전증에 관련되는 2가 금속 이온의 농도를 반영한 상태로 혈전 관측을 수행할 수 있다. 이 경우, 혈액 응고 XII 인자, 칼리크레인 등의 접촉상 인자에 대한 저해제 및 트롬빈 앱타머에 의한 항응고 처리를 수행한 경우, 트롬빈 저해 앱타머의 안티센스 DNA에 의해 항응고 처리를 해제시켜, 장기의 혈액 보존이 가능하다. 나아가, 혈액 응고 XII 인자의 저해제로서 옥수수 유래 트립신 저해제를 이용하였을 때 보다 효과적으로 항응고 처리를 수행할 수 있다.

본 발명의 혈전 관측 방법이 혈전 형성실에 혈액 유입 및 /또는 유출시시의 압력을 측정하는 단계를 포함하는 경우, 매우 단순한 장치로 용이하게 혈전 형성 정도를 수치화할 수 있으며, 따라서 정량적인 평가를 할 수 있다.

아울러, 혈전 유발제가 콜라겐과 조직 인자를 포함한다면 설치가 용이할 뿐만 아니라 동시에 효과적으로 혈전 형성을 유도할 수 있다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 바람직한 구현예를 토대로 도면을 참조하여 본 발명을 설명한다.

도 1은 본 발명의 혈전 관측 장치에 대한 제1 구현예를 나타낸 개략도이다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 구현예에 따른 혈전 관측 장치(1)는 혈전 형성실(1O), 상기 혈전 형성실(10)에 연결되어 있으며 상기 혈전 형성실에 혈액을 유입시키는 유입관(11), 상기 유입관(11)에 연결되어 있으며 상기 유입관(11)에 항응고 처리를 해제하는 약제나 혈액 응고를 촉진하는 약제를 투입하는 약제관(12)을 구비하고 있다.

혈전 형성실(10)은 내부의 일부에 혈전 형성을 유발하는 혈전 유발제가 제공되어 있는 실질적인 원통형이며, 투명한 유리나 열가소성 수지 등으로 제조할 수 있다. 혈전 유발제로는 콜라겐이나 vWF(von Willebrand 인자), 미리 제조된 혈전, 견사나 코튼 등의 섬유 기재 등을 들 수 있다. 이것들은 1종의 단독으로 또는 복수 개를 조합하여 사용할 수 있다. 이들 중, 입수가 용이하며, 취급하기 쉽고, 실제 혈관과 비슷한 모델이 되는 콜라겐이 특히 바람직하다. 콜라겐에는 조직 인자가 포함되어 있을 수 있다. 혈전 유발제가 혈류에 의해 유출되지 않도록, 콜라겐이나 vWF 등의 혈전 유발제는 혈전 형성실(10)의 내부에 코팅된 상태가 바람직하다. 코팅 방법은, 예를 들면, 콜라겐의 코팅은 일본 특허 공개공보 평 05-260950호 또는 Blood. 1995 Apr 1;85(7) 1826-35에 기재되어 있는 바와 같이, 산성 용액에 콜라겐을 용해시킨 다음 친수성의 기재를 침지, 세정, 건조하는 등의 방법으로 간편하게 유리 또는 폴리스티렌 표면에 코팅할 수 있다.

또한, 섬유 기재나 미리 제조된 혈전 등의 혈전 유발제는 혈전 형성실(10)의 내부에 고정된 상태가 바람직하다. 그리고, 얇은 흡습성의 섬유 기재, 예를 들면, 코튼, 부직포나 직포 등에 콜라겐을 함침 및 건조시킴으로써, 보다 혈전 유발능이 우수한 혈전 유발제를 수득할 수 있다. 또한, 조직 트롬보플라스틴을 포함하는 콜라겐 용액에 그 기재를 침지한 다음 건조하면, 혈전유발능이 더욱 증가한다.

혈전 유발제는 혈전 형성실(10)의 내경이나 관측 목적에 따라 선택된다. 심근경색 등의 죽상혈전증이 모델인 경우에는 콜라겐을 단독으로 또는 콜라겐과 조직 트롬보플라스틴을 포함하는 것이 바람직하며, 아울러 혈전 형성실내에 채널의 협착을 설치하여 전단 응력이 가해지는 형태의 혈전 형성실이 더욱 바람직하다. 또한, 심원성 뇌경색 등의 다른 부위로부터 혈전이 혈류에 의해 이동 및 부착하여 다른 부위의 혈관을 폐쇄시키는 혈전의 경우, 미리 소량의 혈전을 혈전 형성실(10)에 고착시켜 혈전 유발제로 제공한 다음, 그 위에서 형성되는 혈전의 성장을 관측하는 것이 바람직하다. 모세혈관 등의 혈전증의 경우에는, 혈전 형성실에서 채널의 내부가 복수 개의 채널로 분할되어 있으며, 그 폭 또는 두께가 10 μm - 30 μm로 좁은 것인 바람직하다. 혈전 형성실(10)이 폭 또는 두께가 1OO μm 이하의 협착부를 포함하는 경우, 그 협착부에서 형성된 소량의 혈전에 의해 채널이 더욱 폐쇄되므로, 별도의 혈전 유발제를 이용하지 않고도, 응고 촉진제 또는 항응고 해제제에 의해 혈전 형성을 관측할 수 있다. 따라서, 본 발명에서, 혈전 유발제로서 이러한 협착부를 포함한다.

혈전 유발제는 콜라겐이나 vWF로 단순히 코팅하는 것일 수도 있지만, 코팅 부위의 혈전 형성실(10)을 협착하여 협착부(14)를 설치하면, 고전단 응력으로 인한 혈소판 응집도 관측할 수 있어 바람직하다. 혈전 유발제로서 콜라겐을 코팅할 경우, 적어도 기초가 되는 부위의 기재는 평활한 유리 또는 플라스틱으로 하면 밀착성이 우수하므로, 바람직하다. 아울러, 혈전 형성실(10) 또는 혈전 형성실(10)의 혈전 유발제가 있는 부위를 탈착가능한 카세트로 구성하면, 형성된 혈전을 세정하거나, 관찰하거나, 혈전 유발제를 교환하거나 하는 작업을 용이하게 할 수 있어, 바람직하다. 이런 경우, 카세트는 실리콘 고무의 O-ring 등으로 액체에 타이트하게 연결되는 것이 바람직하다. 바람직하기로는, 혈전 형성실(10)의 유입관(11)이 연결되는 말단부와 반대측의 말단부에는 혈액을 배출하는 배출관(13)이 연결되어 있으며, 배출관(13)은 치즈로 분기되고 그 첨단(tip)에 다이어프램형 등의 압력계(41)가 장착되어있을 수 있다. 한편, 배출관(13)의 첨단은 바람직하기로는 도시하지 않은 저장 용기와 연결된다.

혈전 형성실(10)에 연결된 유입관(11)은 투명 유리 또는 열가소성 수지 등으로 제조할 수 있다. 유입관(11)에서 혈전 형성실(10)과 연결되는 말단과 반대 말단에는 혈액을 공급하는 시린지(20)이 연결된다. 시린지(20)는 펌프(30) 및 도시하지 않은 가압 수단과 연결되어 있어, 시린지(20)의 플런저는 소정의 압력으로 눌러지게 된다. 펌프는 시판되는 일반적인 펌프를 이용할 수 있지만, 일정한 압력의 공기로 밀어내거나 시린지를 플런저가 위가 되도록 꺼꾸로 하여 플런저에 하중을 가하는, 시린지 펌프일 수도 있다.

유입관(11)은 혈전 형성실(10) 근처에서, 치즈로 분기되고, 그 첨단에 다이어프램형 등의 압력계 40이 구비된 것이 바람직하다.

시린지(2O)에 있는 혈액은 항응고 처리된다. 항응고 처리에 이용하는 항응고 처리제는 구연산 나트륨, 구연산 칼륨, 옥살산 나트륨, 옥살산 칼륨, ACD(Acid Citrate Dextrose), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 염 등을 들 수 있다. 이러한 항응고 처리제는 분말, 동결 건조품, 수용액 등의 용액으로서 사용할 수 있다. 이들 항응고 처리제들 중에서, 일반적인 3.2% 구연산 나트륨은 용이하게 입수할 수 있는 것이므로, 이것이 바람직하다. 이 경우, 혈액 9 용량에 대해 상기 항응고 처리제 1 용량을 혼합하는 것이 바람직하다.

일반적으로, 항응고 처리제를 첨가하지 않은 전혈 또는 혈청 등은 수분 이내에 응고된다. 응고는 구연산 염 등의 칼슘 킬레이트제의 첨가에 의해 감소 또는 없앨 수 있다. 특히 구연산 염은 프로트로비나제와 외인성 및 내인성 테나제의 응집 및 기능을 방해하는 것이 보고되어 있다.

구연산으로 처리된 혈액은 일정 기간(예, 수 시간 내지 수 일간)에 걸쳐 액체형태로 보존할 수 있으며, 조작을 가하여 혈구 분리물, 다혈소판 혈청 및 혈소판 결핍성 혈청 등의 혈액 제제로 만들 수 있다. 구연산 염을 포함하는 혈청은 약 -70 ℃ 이하의 온도에서 동결하여 장기간(수 개월 내지 수 년간) 보존 가능하다. 본 발명에서, 전혈 또는 혈청을 이용할 수도 있으며, 이러한 경우 칼슘 등을 다시 첨가하는 것이 바람직하다.

그러나, 칼슘 등을 재첨가한 전혈 또는 혈청은, 일반적으로, 대부분의 저장 용기내에서 접촉 활성화로 인해 자연적으로 응고되며, 이 경우 접촉 활성화는 약 2 - 4분 이내에 이루어진다. 이로 인하여, 본 발명에서는 채혈한 후 구연산 처리한 새로운 혈액, 보존용으로 동결한 후에 해동시킨 다음에 구연산을 처리한 혈액, 또는 혈소판 함유 혈청에, 칼슘 등의 항응고 해제제를 혈전 관측 직전에 첨가할 수 있다.

기타의 항응고 처리제로는 헤파린, 히루딘, 히룰로그(히루딘 C-말단 영역의 펩티드), 어프로티닌, 항트롬빈 항체, 트롬빈 앱타머, 옥수수 유래 트립신 저해제 (1977, J. Biol. Chem 252.8105) 등을 이용할 수 있다. 이들은 혈액 응고 인자 저해 결과로서 응고 캐스케이드를 저해함으로써 혈액 응고를 저해하며, 그리하여 본 발명에서는 이들을 "응고 인자 저해제"라고 언급할 것이다.

관측용 샘플을 채혈하는 방법은 시린지 또는 진공 채혈관에 미리 상기의 응고 인자 저해제를 넣고 채혈하거나, 또는 채혈 직후의 혈액에 응고 인자 저해제를 신속하게 첨가하는 등의 방법으로, 항응고 처리한 혈액을 얻을 수 있다.

또한, 응고 인자 저해제, 예를 들면, 헤파린을 포함하는 진공 채혈관 등으로 채혈한 후, 헤파리나제와 관측 목적에 적합한 항응고 처리제를 첨가하여 헤파린을 헤파리나제로 분해시켜, 관측 목적에 적합한 항응고 처리제로 교체할 수도 있다. 또한, 동일하게 구연산을 포함하는 진공 채혈관으로 채혈하고, 염화칼슘 및 옥수수 유래 트립신 저해제나 트롬빈 앱타머 등의 관측 목적에 적합한 응고 인자 저해제를 가함으로써, 관측 목적에 맞게 항응고 처리한 혈액을 채혈할 수 있다.

혈전 형성실(10)에 연결되는 약제관(12)은 투명 유리나 열가소성 수지 등으로 제조할 수 있다. 약제관(12)의 혈전 형성실(10)에 연결되는 말단과 반대쪽 말단은 항응고 처리를 해제하는 약제 또는 혈액 응고를 촉진하는 약제를 공급하는 시린지(21)가 연결된다. 시린지(21)는 펌프(31) 및 도시하지 않은 가압 수단과 연결되어 있어, 시린지(21)의 플런저는 소정의 압력으로 눌러지게 되어 있다. 펌프는 시판되는 일반적인 펌프를 이용할 수 있지만, 일정한 압력의 공기로 밀어내거나 시린지를 플런저가 위가 되도록 꺼꾸로 하여 플런저에 하중을 가하는, 시린지 펌프일 수도 있다. 약제관(12)은 하기와 같은 항응고 해제제 또는 응고 촉진제로 충전되어 있다.

본 발명의 혈전 관측 장치를 이용하여 혈전 관측을 수행하기 위해, 시린지(20)에는 항응고 처리, 예를 들면, 구연산 나트륨으로 처리한 전혈 및 혈소판 혈청(용액 A)을 충전한다. 시린지(21)에는 항응고 처리를 해제하는 약제, 예를 들면, 염화칼슘 용액(용액 B)을 충전한다. 용액 A의 응고 캐스케이드가 개시될 수 있는 용액 B의 농도(5 - 20 mmol)가 될 수 있도록, 펌프(30, 31)에 의해 유입관(11)으로 용액 A와 용액 B을 공급하고, 유입관(11)내에서 혼합하면서 용액 A와 용액 B의 혼합액을 혈전 형성실(10)에 유입시킨다. 그리고, 혈전 형성실(10)의 내부 일부분에는 혈전 형성을 유발할 수 있는 예를 들면, 콜라겐 등이 미리 도포되어 있어, 혈전 유발제를 형성한다. 상기 혈전 형성실(10)은 예를 들면, 투명한 플라스틱 관으로 만들 수 있다. 이러한 투시가능한 혈전 형성실(10)을 통과하는 혈액을 관측하는 장치에 의해, 간편하게 혈전 형성을 관측할 수 있다.

혈전 형성의 관측은 일정시간 동안 혈액을 흘린 후, 콜라겐으로 처리된 셀(혈전 형성실 10)에서 혈액을 제거함으로써, 육안 관찰에 의해 수행할 수 있다. 용액 A와 용액 B를 공급하는 펌프가 에어 구동일 경우, 일정한 압력으로 용액 A, 용액 B를 공급할 수 있으며, 따라서 배출관(13)으로부터 배출되는 혈류량의 저하에 의해 콜라겐상의 혈전 형성을 모니터링할 수 있다. 또는, 유입관(11) 및 배출관(13)에 혈전 형성실(10) 근처에 압력계가 장착되어 있는 경우에는, 혈전 형성실(10)의 내압 변화를 관찰함으로써 콜라겐상의 혈전 형성을 모니터링할 수 있다. 또는, 혈전 형성실(10)의 두께를 500 μm 이내로 함으로써 현미경으로 관찰할 수 있다. 특히, 다혈소판 혈청을 이용한 혈전은 가시성이 우수하여 관찰이 용이하고, 육안으로 혈전 형성을 관찰할 수도 있다. 게다가, 상기 특허문헌 1에 기재된 방법으로 혈소판을 형광표지하여, 형광현미경으로 모니터링할 수도 있다.

구연산과 같은 킬레이트제에 의한 항응고 처리를 해제하는 약제로, 염화 칼슘, 브롬화 칼슘, 요오드화 칼슘 등의 할로겐화 칼슘, 인산 칼슘, 황산 칼슘, 질산 칼슘, 중탄산 칼슘 등의 무기산 칼슘 염, 포름산, 아세트산, 피로피온산, 부티르산, 알긴산, 락트산, 글루콘산, 글리세린 산, 글리세로인산 등의 유기산 칼슘 염 등의, 유리 칼슘 공여체인 칼슘 화합물을 들 수 있다.

응고 인자 저해제(항응고 처리제)로 항응고 처리를 수행하였을 때, 응고 인자 저해제에 대응하는 항응고 해제제를 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 헤파린으로 항응고 처리한 경우에는, 항응고 해제제로 프로타민, 헤파리나제 또는 항헤파린 항체 등을 이용할 수 있으며, 히루딘, 히룰로그 및 어프로티닌으로 항응고 처리한 경우에는 항응고 해제제로 각각 항히루딘 항체, 항히룰로그 항체 및 항어프로티닌 항체 등의 항응고 해제제를 사용할 수 있다.

항트롬빈 항체를 응고 인자 저해제를 이용하여 항응고 처리한 경우에, 항응고 해제제로 PPACK 트롬빈 등의 완전히 불활성화된 트롬빈, 트롬빈의 분해 단편 및 트롬빈의 항체 인지 에피토프를 포함하는 합성 폴리펩티드 등의 항응고 해제제를 사용할 수 있다.

한편, 항응고 처리 또는 항응고 해제에 사용되는 항체는 보체 시스템에 대한 영향을 최소화하기 위해 파파인 등으로 Fc 도메인을 제거한 항체나 또는 계란 항체 등의 인간 보체 시스템을 활성화시키는 능력이 없는 항체를 사용하는 것이 바람직하다.

단일 가닥 올리고 DNA인 트롬빈 앱타머(Blood. 1993 Jun 15;81(12):3271-6 또는 J. Mol. Biol. 1997 Oct 10; 272(5):688-98)를 항응고 처리제로 이용하는 경우, 트롬빈 앱타머에 대한 안티센스 DNA 또는 안티센스 RNA 등의 트롬빈 앱타머에 결합하여 기능을 저해시키는 물질을 항응고 해제제로 사용할 수 있다. 트롬빈 앱타머는 엑소사이트 I 및 II를 인지하는 2종을 병용하면, 단독의 경우 보다 훨씬 강한 항응고 처리 효과가 수득된다. 이러한 경우에 이용할 수 있는 안티센스 DNA는 실질적으로 트롬빈 앱타머의 항트롬빈 기능을 무효화하는 것이라면 트롬빈 앱타머의 일부에 대한 것일 수도 있다.

한편, 트롬빈 앱타머와 그 안티센스 DNA가 각각 항응고 처리제 및 항응고 해제제로서 유효하다는 사실은 하기 참고예를 들어 설명된다.

헤파린으로 항응고 처리하였을 때 수시간이내에 응고 시스템은 활성화될 수 없으므로, 혈전 형성을 관측하는 장기간 동안 혈액을 보존할 순 있지만, 예컨대 헤파린 투여받은 환자로부터 채혈한 혈액 검사에는 적합하지 않은 경우도 있다.

한편, 히루딘, 히룰로그, 항트롬빈 항체는 응고 시스템의 최종 단계에서 작용하는 트롬빈을 저해하여 피브리노겐의 피브린으로의 변환을 저해하는 저해제이지만, 트롬빈이 완전히 저해되었을 때에도 응고 캐스케이드의 접촉상 인자(프리-칼리크레인 또는 XII 인자 등)이 점차적으로 활성화되므로, 서서히 응고 캐스케이드 상류의 활성화가 이루어져, 장기간의 혈액 보존에는 적합하지 않다.

또한, 어프로티닌은 접촉상에서 칼리크레인의 활성을 저해하여 내인계 혈액 응고 캐스케이드를 지연시키지만, 칼리크레인의 활성 저해하에서도 응고 캐스케이드는 서서히 활성화되어, 혈액은 어프로티닌 존재하에서도 수 시간후에 응고된다.

따라서, 채혈 후 약 수 십분 후에 혈액의 혈전 형성을 관측함에 있어, 트롬빈의 저해제 및/또는 어프로티닌으로 항응고 처리에 의한 혈전 형성을 관측할 수 있다. 그러나, 관측 착수에 장시간이 필요한 경우나, 관측에 장시간을 소요되는 경우에는 바람직하지 않을 수 있다.

채혈한 지 1시간 이상 경과한 이후에 혈전 형성을 관측하는 경우에는, 트롬빈 앱타머와 옥수수 유래 트립신 저해제, 히루딘 및 어프로티닌을 병용하여 항응고 처리하거나, 또는 응고 시간에 큰 영향을 미치지 않는 수준, 예를 들면, 1 unit/ml 미만의 소량의 헤파린을 접촉상 인자의 저해제 또는 트롬빈의 저해제와 병용 처리할 수 있다.

트롬빈 앱타머를 엑소사이트 I 및 II에 대한 2종의 앱타머와 병용하면 항응고 처리 효과를 비약적으로 높일 수 있으며, 나아가 이들 2개의 앱타머에 대한 안티센스 DNA로 항응고 처리를 즉시 해제시킬 수 있다.

또한, 옥수수 유래 트립신 저해제(XII 인자 저해제), 어프로티닌(칼리크레인 저해제) 등의 접촉상 인자에 대한 저해제와 트롬빈 앱타머 등의 트롬빈에 대한 저해제 모두를 검체(혈액)에 첨가한 다음, 여기에 트롬빈 앱타머의 안티센스 DNA(트롬빈 앱타머의 저해제) 등을 가하여 트롬빈 저해제의 기능만을 저해함으로써 트롬빈의 기능 저해를 해제하고, 신속하게 검체를 혈전 형성실로 유입시키면, 예를 들면, 조직 인자(조직 트롬보플라스틴) 등으로 외인계 응고 캐스케이드가 활성화되어 혈액 응고가 촉진되며, 그로 인해 생리적인 혈전 형성을 관찰할 수 있게 된다.

대안적으로, 구연산 등의 킬레이트제 또는 헤파린 등의 항응고 처리를 해제시킬 수 있는 항응고 처리제와 옥수수 유래 트립신 저해제 둘다를 이용하여 항응고 처리를 수행하고, 여기에 염화칼슘 등의 유리 칼슘 공여체 또는 헤파리나제로 각각에 대한 항응고 처리를 해제시킨 다음 신속하게 혈전 형성실에 유입시킴으로써, 외인계 응고 캐스케이드의 활성화에 의해 혈액 응고를 촉진시킬 수 있다.

이 경우, 혈전 유발제에 조직 인자(조직 트롬보플라스틴)를 적량 포함시키는 것이 바람직하다. 혈전 유발제를 콜라겐 및 조직 트롬보플라스틴과 혼합 및 건조에 의해 코팅하는 경우, 혈전 형성실에 있어서만 혈전 형성이 진행되므로, 특히 바람직하다. 죽상 혈전의 모델로서 조직 인자(조직 트롬보플라스틴)를 포함하는 콜라겐 용액으로 코팅된 혈전 유발제를 이용하는 경우, 병리 메카니즘이 반영된 관측을 수행할 수 있다.

아울러, 구연산 등의 칼슘 킬레이트제에 의해 항응고 처리한 혈액에 유리 칼슘 공여체 및 트립신 저해제를 가한 후 신속하게 혈전 형성실에 유입시켜 혈전 형성을 측정할 수 있으며, 또는 헤파린에 의해 항응고 처리된 혈액에 헤파리나제 및 트립신 저해제를 가한 후 신속하게 혈전 형성실에 유입시켜 혈전 형성을 측정할 수도 있다. 상기와 같이 1종 또는 다수 종의 항응고 처리제로 항응고 처리한 혈액에 이용한 항응고제에 대응하는 적어도 1종 이상의 항응고 처리 해제제를 혼합한 다음 신속하게 혈전 형성실에 유입시켜 혈전을 관측하는 방법에는, 예컨대 하기 도 9에 나타낸 바와 같은 혈전 관측 장치를 사용할 수 있다.

상기의 히루딘이나 트롬빈 앱타머 등의 트롬빈의 저해제, 접촉상 인자에 대한 합성 저분자 저해제 및 단백질의 항응고 처리제는 구연산이나 EDTA 등의 칼슘 등을 킬레이팅하는 항응고 처리제와 비하여 고가이지만, 칼슘, 마그네슘, 아연 등의 2가 금속 이온의 농도를 변화시키지 않으므로, 환자 혈액에서 이들 이온의 고유 농도하에서 혈전 형성을 모니터링하는 것을 반영할 수 있으며, 나아가 환자의 병의 용태를 반영한 관측이 가능해진다.

혈액 응고는 활성화 XII 인자나 칼리크레인 등의 접촉상 인자의 저해에 의해 억제할 수 있지만, 실제 생리 혈전 또는 지혈에 XIIa 및 칼리크레인의 활성은 그다지 기여하지 않는 것으로 보고되어 있다. 실제로 XII 인자, 프리칼리크레인의 선천성 결핍증 환자에서도 출혈 등의 소견은 전혀 관찰되지 않는다. 특히, 심근경색 등의 죽상혈전증에서는, 동맥 경화에 의한 플라크로 인하여 응고 시스템이 조직 인자에 의해 활성화되는 것으로 널리 알려져 있으며, XII 인자는 주로 활성화된 혈소판 상에서 주로 트롬빈에 의해 활성화된다. 따라서, XII 인자나 프리칼리크레인의 활성화를 저해하는 저해제 또는 활성화 XII 인자나 칼리크레인을 저해하는 저해제를 항응고 처리제로 이용하여 항응고 처리하는 경우, 항응고 해제제를 첨가하지 않는 것이 바람직하다. 항응고 처리제 대신, 조직 인자(조직 트롬보플라스틴 등) 등의 외인계 응고를 활성화시키는 물질을 혈액에 첨가하거나 혈전 유발제를 첨가함으로써, XII 인자 활성화나 칼리크레인 활성화를 우회한 경로로 응고 시스템이 활성화되고, 그로 인해 혈액 응고가 촉진되며, 따라서 혈전 형성실에서 혈전을 관측할 수 있다.

항응고 해제제를 첨가하지 않고도 조직 인자 등의 외인계 응고를 활성화시키는 물질을 첨가함으로써 혈액 응고를 촉진시킨 후 혈전 형성을 관측하는 경우에 사용할 수 있는 항응고 처리제로는, 칼리크레인 저해제인 PKSI-527(Thromb Res 57:889, 1990)이나 활성화 XII 인자 저해제인 D-Phe-Arg-CK(Cal Biochem사) 등의 합성 저분자저해제가 있다. 또한, 단백질 저해제로서 항칼리크레인 항체, 항프리칼리크레인 항체, 항응고 XII 인자 항체, 항활성화 응고 XII 인자 항체, 옥수수 유래 트립신 저해제 등의 응고 캐스케이드의 접촉상 프로테아제에 대한 항체 등을 들 수 있다.

항응고 해제제를 첨가하지 않고, 외인계 응고를 활성화시키는 물질에 의해 혈액 응고를 촉진시켜 혈전 형성을 관측하는 경우에는, 특히 입수성 및 항응고능 관점에서, 구연산과 옥수수 유래 트립신 저해제 또는 트롬빈 앱타머와 옥수수 유래 트립신 저해제에 의해 일단 항응고 처리한 다음, 혈액을 보존하면, 관측 조작의 자유도를 높일 수 있어, 바람직하다. 그리고, 혈전 관측 직전에, 유리 칼슘 공여체 또는 트롬빈 앱타머의 안티센스 DNA에 의해 옥수수 유래 트립신 저해제에 의한 항응고 처리를 유지시키고, 부분적으로 다른 항응고 처리를 해제시킨다. 이 경우, 콜라겐 또는 조직 트롬보플라스틴을 포함하는 콜라겐을 코팅한 혈전 유발제를 이용하여 외인계 응고를 활성화시킴으로써 혈액 응고를 촉진하는 것이, 죽상 혈전의 모델로서 바람직하다.

상기의 혈전 관측에 이용되는 혈액을 공급하는 시린지나 진공 채혈관 등의 용기는 헤피린으로 코팅된 용기이거나 폴리비닐 락토아미드(PVLA)나 폴리-2-메톡실에틸 아크릴레이트(PMEA) 등의 항혈전성이나 혈액 적합성 소재로 코트 된 용기를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 혈전 관측 장치의 다른 형태로, 관이나 혈전 형성실은 마이크로칩 등의 미세한 채널에 의해 기판상에 일체화시킬 수도 있다.

도 4는 본 발명의 혈전 관측 장치의 제2 구현예의 주요부 평면도이다. 도 4의 기판(100)에는 홈이 새겨져, 회로가 형성되어 있다. 이러한 구현예는 작은 기판상에 혈전 관측 장치의 주요부인 혈전 형성실과, 상기 혈전 형성실에 연결되어 있으며 상기 혈전 형성실에 혈액을 유입시키는 유입관과, 상기 유입관에 연결되어 있으며 상기 유입관에 항응고 해제제 또는 혈액 응고를 촉진하는 약제를 투입하는 약제관이, 기판상에 일체화된 회로로서 마이크로칩화된 형태다. 이러한 구현예는 기판에 일체화된 주요부 이외에는 제1의 구현예와 동일한다.

도 4의 기판(100)은 마이크로칩의 본체가 되는 것으로, 그 재질은, 금속, 유리, 플라스틱, 실리콘 등이다. 혈전 등을 관찰하는 관점에서는 투명한 재질이 바람직하며, 회로를 형성하는 관점에서는 플라스틱이 바람직하다. 따라서, 투명한 플라스틱이 특히 바람직하다. PDMS(폴리디메틸시록산) 등의 실리콘 수지제로 제조할 경우에는 밀착성이 우수하여 뚜껑 부재를 접착제 등으로 접착하지 않고도 압착에 의해 회로를 형성할 수 있다. 폴리스티렌제의 기반을 이용할 경우에는 채널을 PVLA로 간편하게 코팅하여 항혈전 처리를 수행할 수 있다. 또한 PMEA으로도 간편하고 효과적으로 항혈전 처리할 수 있다(참조예 4 참조).

도 5는 도 4의 기판(100)에 중첩되게 밀착시킨 마이크로칩의 뚜껑이 되는 기판의 평면도이다. 도 5의 기판(200)은 투명한 슬라이드 글라스 또는 플라스틱 등으로 제조된 플레이트나 시트이다. 기판(200)을 뚜껑으로 제공되어 기판(100)에 중첩 및 밀착되며, 기판(100)의 회로는 혈전 형성실(110), 유입관(111) 및 약제관(112)으로 형성될 수 있다.

혈전 형성실(110) 내표면에 혈전 유발제(115)를 제공하기 위해, 기판(200)의 설치 예정 위치에, 예를 들면, 콜라겐 등을 도포할 수 있다. 기판(200)의 콜라겐 도포면을 안쪽 방향으로 한 상태에서 기판(100)과 기판(200)을 접합 또는 피팅(嵌合)에 의해 서로 밀착시키면, 혈전 형성실을 포함하는 혈전 관측 장치를 수득할 수 있다. 도포 용이성으로 인해 홈이 없는 평탄한 기판(200)에 콜라겐을 도포하는 것이 바람직하다. 또한, 조직 트롬보플라스틴을 콜라겐과 혼합 도포는, 높은 혈전 유발능을 포함하는 혈전 유발제를 수득할 수 있어, 바람직하다. 그리고, 도포한 콜라겐에서 혈전이 형성되기 쉽게 하기 위해, 콜라겐 도포 부위의 유리를 불투명 유리로 하는 등의 표면적을 증가시킬 수 있는 처리를 추가로 할 수 있다.

기판(100)의 연결부(100A), 연결부(100B) 및 연결부(100C)에는 각각, 유입관, 약제관 및 배출관의 일부인 도시하지 않은 관이 연결되어 있으며, 연결부(100A) 및 연결부(100B)에는 관을 통해 도시하지 않은 펌프가 각각 연결되어 있다. 연결부(100A)로부터 항응고 처리된 혈액이 주입되며, 연결부(100B)로는 항응고 처리제에 대응하는 항응고 해제제가 주입된다.

본 구현예에서는 극소량의 혈액으로 혈전 형성을 관찰할 수 있어, 피검자의 부담을 적게 할 수 있다. 또한, 메파크린(mepacrine) 등의 형광시약으로 혈소판을 표지하여, 기판(200) 측면으로부터 기판(200)에 부착된 혈소판을 모니터링할 수 있다.

나아가, 회로(100D)는 공기가 차단되게 말단을 밀폐할 수 있는 회로이며, 압력계로서 제공된다. 회로(100D)의 말단에는 회로(100D)를 압력계로 제공하였을 때 압력 감압 또는 감도를 증가시키기 위한 조정 밸브(100E)가 있는 것이 바람직하다. 조정 밸브(100E)는 캡이나 접착 테이프로 폐쇄시킬 수 있으며, 또는 필수 감도에 따라 수지 등의 충전물로 용적을 변경시킬 수 있다. 이 회로(100D)는 혈액의 침입에 의해 공기와 혼합되거나, 공기가 탈출되지 않을 정도로 좁게 형성된다. 그 두께는 기판(100)의 재질에 따라 다르지만, 약 0.1 mm - 0.5 mm 정도이다. 혈전 형성으로 인해 혈전 관측 장치의 유입관(111)의 내압이 증가하면, 회로(100D)내 공기가 혈액에 의해 압축되고, 그만큼 항응고 처리된 혈액은 회로 100 D내에 유입될 수 있다. 회로(100D)내 혈액의 이동에 의해 내압을 수시로 모니터링할 수 있다.

상술한 본 발명의 혈전 관측 장치 및/또는 혈전 관측 방법에 의해 콜라겐 상의 혈소판 점착, 활성화된 혈소판 상에서의 응고 시스템의 활성화, 혈소판 응집에 의한 활성화된 혈소판의 축적을 모니터링할 수 있다.

게다가, 죽상혈전증의 혈전 형성을 재현하기 위해, 혈전 형성실(10, 110)에 협착부(14, 114)를 만들어, 높은 전단 응력으로 인한 혈소판 응집도 반영하여 관츨할 수 있다.

도 9는 본 발명의 혈전 관측 장치의 제3 구현예의 주요부를 나타낸 개략도이며, 혈액 응고 방지제를 혈전 형성실 하류에 위치한 혈액과 혼합하는 혈액 응고 방지제 유입관(322) 및 압입관(317)이 표시되어 있으며, 본 구현예에서는 혈전 형성실의 상류에는 약제관이 구비되어 있지 않다.

제3 구현예에서, 항응고 처리제(예, 구연산과 옥수수 유래 트립신 저해제)를 첨가한 후 채혈한 혈액에 측정 직전에 항응고 해제제(예, 유리 칼슘 공여체)를 첨가하고, 이를 시린지(320)에 넣은 다음, 상기 시린지에 연결된 압입관(317)으로부터 미네랄 오일 등의 혈액 압송(pressure-filling)용 액체를 압입하여, 혈액을 마이크로칩(300)으로 밀어낸다.

샘플 시린지(320)에 인가되는 압력 증가는 혈전 형성으로 인한 채널의 폐쇄 상태를 나타내므로, 압력 변화를 모니터링하여 혈전 형성을 검지할 수 있다. 압력 변화를 통한 혈전 형성의 모니터링은 특히 폐쇄성 혈전이 형성되는 강력한 죽상 혈전 모델을 관측하는데 적합하며, 혈전 유발제는 특별한 제한이 없지만, 예컨대 외인계 응고를 활성화시켜 혈액 응고를 촉진시킬 경우에는 콜라겐과 조직 인자를 이용하는 것이 혈전 관측에 유효하다.

압력 측정 시기에 혈전 형성에 의한 채널내 압력을 보다 정확하게 측정하기 위해, 도 9에 나타낸 바와 같이, 혈액 응고 방지제는 혈액 응고 방지제 유입관(322)과 마이크로칩(300)에 형성된 채널을 통해 혈전 형성실의 하류에 위치한 혈액과 혼합됨으로써, 혈액은 혈전 형성실 이후의 채널에서는 혈전 형성이 방지된다. 이로 인해, 혈전 형성실에서의 혈전 형성에 따르는 채널의 협착 또는 폐쇄에 의한 채널 내 압력 변화를 특이적으로 동시에 정확하게 측정할 수 있어, 바람직하다.

이러한 혈액 응고 방지제는 특별히 제한되지 않으며, 본 발명에서 이용하는 항응고 처리제를 사용할 수도 있지만, 비용이나 취급성을 고려하여 염기성 또는 산성용액, 알코올, 요소, SDS류 등의 단백질 변성에 의해 혈액 응고를 방지하는 것들 중에서 적절하게 선택하는 것이 바람직하다.

도 9의 구현예에서, 본 발명의 혈전 관측 장치는 압입관(317) 대신 배출관(313) 상에 흡인 펌프를 구비하여, 상기 장치로 흡인 압력(음압)의 변화를 토대로 혈전 형성 정도를 측정할 수 있다. 이렇게 구성함으로써, 후술된 바와 같이, 층으로 분리된 액체를 통해 간접적으로 혈액을 압출하는 펌프를 이용할 경우, 혈액의 양이 적으면 혈액과 미네랄 오일 등의 압송용 액체의 접촉 영역에서 혼합된 액체가 공급될 우려가 있지만 이와 같은 사태를 막을 수 있어, 보다 효율적인 측정을 할 수 있다.

또한, 본 발명의 혈전 관측 장치에 혈액을 공급하는 용기(샘플 탱크)로서 시린지 등의 밀폐 용기를 이용할 필요가 없으며, 뚜껑이 없고 대기에 개방된 용기를 사용할 수 있어, 혈전 관측 장치를 단순화할 수 있다. 게다가, 본 발명의 혈전 관측 장치의 채널 내부는 음압이므로, 본 발명의 혈전 관측 장치를 마이크로칩으로 형성할 경우에, 예를 들면, 마이크로칩 본체와 마이크로칩 뚜껑이 완전히 접착되지 않아도 혈액은 새지 않는다. 경우에 따라, 마이크로칩 본체와 마이크로칩 뚜껑을 피팅시키는 것 만으로도 피팅의 정밀도가 우수하다면, 그대로 혈전 관측 장치로 사용할 수 있다.

도 10은 더욱 시스템화된 혈전 관측 시스템 A를 나타낸다.

도 10의 혈전 관측 시스템 A는 미량 액체 수송 펌프(330)에 혈액보다 비중이 낮은 액체를 충전시키고, 이것을 압입관(317)에 의해 혈액이 수용되어 있는 샘플 시린지(320)에 밀어내어 혈액 위에 중층시켜, 혈액을 마이크로칩(300)에 압출시키는 것이다. 압출된 혈액은 마이크로칩내에서 약제관(312)으로부터 주입된 항응고 해제제와 혼합되어, 혈전 형성실(311)에 도달하게 된다. 미량 액체 수송 펌프(330)의 혈액압송용의 액체로 액체 파라핀, 미네랄 오일이나 실리콘 오일 등의 각종 유지, 생리 식염수 등을 들 수 있다. 이러한 방식으로 혈액을 간접 압출함으로써, 미량 액체 수송 펌프(330) 및 압력 센서(340)가 혈액으로 오염되는 것을 막을 수 있다.

아울러, 이러한 혈액에 대하여 층으로 분리되는 액체에 의해 간접적으로 혈액을 압출시키는 펌프는 상기 어떠한 구현예에 따른 본 발명의 혈전 관측 장치에 적용할 수 있으며, 미량 액체 수송 펌프(330)에 의해 샘플 시린지(320)에 인가되는 압력은 압력 센서(340)로 측정한다.

게다가, 상기 혈전 관측 시스템 A에서는 이미지 분석에 의해 혈전 형성 상황을 보다 상세하게 파악할 수 있다. 특히, 퀴나크린 등으로 혈소판, 백혈구를 형광 표지하여 콜라겐 상의 점착 및 응집을 관측하는 경우에는, 형광 색상 발색으로 인한 단위 면적 당의 휘도를 이미지 분석에 의해 관측하여 관측 결과를 수치화하고, 데이터로 저장할 수 있다. 이미지 분석은 CCD 카메라가 장착된 형광 입체 현미경(308)으로 포착한 이미지를 컴퓨터(307)로 처리하여 디스플레이에 나타냄으로써, 수행할 수 있다.

따라서, 혈전 관측 시스템 A에서는 이미지 분석 및 샘플 시린지(320)에 인가된 압력의 변화를 통해 종합적인 혈전 형성 상황을 판단할 수 있다.

또한, 이러한 혈전 관측 시스템은 모든 구현예에 따른 본 발명의 혈전 관측 장치에 적용하여 시스템화할 수 있다.

도 12는 본 발명의 혈전 관측 장치에 대한 제4 구현예를 나타낸 개략도로, 혈전 형성을 관찰하기 위한 카메라를 포함하는 혈전 관측 장치를 나타낸다.

상기 혈전 관측 장치에서는, 예를 들면, 구연산과 옥수수 유래 트립신 저해제로 항응고 처리한 혈액에 항응고 처리 해제제(예, 유리 칼슘 공여체)를 가한 다음 이를 신속하게 시린지(420)에 충전시킨다. 배출관(413)에 연결된 펌프(414)로 흡인하여, 혈액을 혈전 형성실(411)에 흘려보내고, 그로 인해 혈전을 형성시킨다. 흡인 압력(음압)의 변화로 혈전 형성 정도를 측정할 수 있다.

또한, 혈전 형성실을 통과한 후에 혈액이 응고되어 배출관(413)을 막거나 또는 압력 측정에 영향을 미치는 것을 방지하기 위해, 혈전 형성 방지제 유입관(422)을 통해 혈전 형성 방지제를 혈전 형성실을 통과한 이후의 혈액에 혼합한다.

아울러, 마이크로칩(400) 하부에 예를 들면, CCD 카메라와 같은 카메라(430)를 설치함으로써 혈전 형성을 촬영할 수 있으며, 마이크로칩 위의 공간을 효율적으로 이용할 수 있다. 카메라(430)는 레일(433)을 이용하여 혈전 형성실 아래에서 전후 좌우로 이동할 수 있다. 카메라(430)는 그 위치를 X축 및 Y축으로 수치화하여 기억하는 기능을 포함하는 것을 이용함으로써, 여러 곳의 특정 지점을 정기적으로 순회하면서 촬영할 수 있다. 이러한 구성에 의해, 카메라(430)의 배율을 높게 설정하여도 혈전 형성실(411)의 넓은 범위에서 이루어지는 혈전 형성 과정을 경시적으로 관측할 수 있다. 또한, 바람직하게는, 카메라(430) 주위에, 예를 들면, LED와 같은 광원(432)이 구비되어 있으면 카메라(430)와의 위치 관계를 일정하게 유지한 상태로 광원(432)도 동시에 이동시킬 수 있다. 바람직하기로는, 광원(432)은 백색광과 함께 특정 형광 물질을 여기시킬 수 있는 파장의 광을 촬영 대상이 되는 형광 물질에 따라 조사하여, 다양한 형광 물질을 여기시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 제1 구현예에 따른 혈전 관측 장치를 나타낸 개략도이다.

도 2에서 (a)는 본 발명의 제1 구현예에 따른 실시예 3, 5, 6의 혈전 유발제(15)의 설치 상태를 나타낸 개략도이고, (b)는 본 발명의 제1 구현예에 따른 실시예 3, 5, 6의 혈전 형성 결과를 나타낸 개략도이다.

도 3에서 (a)는 본 발명의 제1 구현예에 따른 실시예 4의 혈전 유발제(15)의 설치 상태를 나타낸 개략도이고, (b)는 본 발명의 제1 구현예에 따른 실시예 4의 혈전 형성 결과를 나타낸 개략도이다.

도 4는 본 발명의 제2 구현예에 따른 혈전 관측 장치의 주요부(마이크로칩 본체)를 나타낸 개략도이다.

도 5는 본 발명의 제2 구현예에 따른 혈전 관측 장치의 주요부(마이크로칩 뚜껑)를 나타낸 개략도이다.

도 6은 본 발명의 제2 구현예에 따른 실시예 7의 혈전 형성 위치를 나타낸 개략도이다.

도 7은 본 발명의 제2 구현예에 따른 다른 예로 혈전 관측 장치의 주요부(마이크로칩 본체)를 나타낸 개략도이다.

도 8은 본 발명의 제2 구현예에 따른 다른 예로 혈전 관측 장치의 주요부(마이크로칩 뚜껑)를 나타낸 개략도이다.

도 9는 본 발명의 제3 구현예에 따른 혈전 관측 장치의 주요부를 나타낸 개략도이다. (A)는 완성도이고, (B)는 마이크로칩 본체이고, (C)은 마이크로칩 뚜껑이다.

도 10은 본 발명의 혈전 관측 장치를 이용하여 시스템화한 혈전 관측 시스템을 나타낸 개략도이다.

도 11에서 (A)는 엑소사이트(exosite) I 및 II에 대한 각 앱타머 10 μM를 가한 혈액을 15분간 실온에서 둔 후, 상기 2개의 앱타머에 대한 안티센스 DNA 40μM를 첨가하여, 트롬보엘라스토그램으로 응고 파형을 분석한 결과이다. (B)은 채혈한 직후 혈액의 트롬보엘라스토그램 파형이다.

도 12는 본 발명의 제4 구현예에 따른 혈전 관측 장치의 주요부를 나타낸 개략도이다. (A)는 완성도이고, (B)는 마이크로칩의 뚜껑이고, (C)은 마이크로칩의 기판이다.

도 13은 실시예 17(대조군), 18(헤파린), 19(레오프로)의 압력 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 14는 헤파린을 0(대조군), 0.2, 0.5, 1 unit/ml로 첨가하였을 때의 압력 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 15는 레오프로를 0(대조군), 2, 5, 10 μg/ml로 첨가하였을 때의 압력 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

부호의 설명

1… 혈전 관측 장치,

10, 110, 311, 411… 혈전 형성실,

11, 111… 유입관,

12, 112, 312… 약제관,

13, 313, 413… 배출관,

14, 114… 협착 부위,

15, 115, 315… 혈전 유발제,

16… 형성된 혈전,

20, 21, 320, 420… 시린지,

30, 31, 330, 331, 414, 423… 펌프,

40, 41, 340… 압력 센서,

100… 기판(마이크로칩 본체),

200… 기판(마이크로칩 뚜껑),

100A, 100B, 100C… 연결부,

100D… 압력 시스템 회로,

100E… 조정값,

300, 400… 마이크로칩(혈전 관측 장치),

306… 펌프 제어 유닛,

307… 컴퓨터,

308… CCD 카메라가 장착된 형광입체현미경,

317… 압입관,

322, 422… 혈액 응고 방지제 유입관,

412… 연결관,

430… CCD 카메라,

431… 렌즈,

432… 조명용 광원,

433… 카메라 이동용 레일,

A, B… 혈전 관측 시스템.

이하, 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

도 1에 나타낸 혈전 관측 장치를 이용하여, 채혈 직후의 혈액 9 부피부(part by volume)에 대하여 3.2% 구연산 나트륨을 1부피부를 혼합한 구연산 처리 혈액(용액 A) 50 ml을 시린지(20)에 충전하고, 0.2M CaCl(용액 B) 10 ml을 시린지(21)에 충전한 다음, 시린지(20)와 시리진(21)을 내경이 3 mm인 투명한 나일론관(유입관(11), 약제관(12))에 각각 연결한다. 이들 관을 T자형의 조인트(치즈)로 연결한 다음, 내경이 3 mm이고 길이가 3 cm인 하나의 나일론관(유입관(11))을 통해, 내경이 3 mm이고 길이가 1 cm인 폴리카보네이트로 만들어진 혈전 형성실(10)에 연결시 킨다. 혈전 형성실(10)은 자체로 착탈가능한 카세트로 제작되며, 카세트와 나일론관(유입관(11)) 사이의 연결부에는 실리콘 고무로 만들어진 O 링을 개재시켜, 액체가 새지 않도록 하고, 카세트의 내부에는 유리제 부재를 에폭시계 접착제로 고정시켜 협착부(14)를 만든다. 협착부(14)의 가장 좁은 부분의 내경(협착부(14)와 내벽간의 최대 간극)이 1.5 mm가 되도록 설계한다. 또한, 혈전 형성실(10)에 동일한 내경 및 동일한 재질의 관을 배출관(13)하여 실리콘 고무로 만들어진 O 링을 개재시켜서 액체가 새지 않도록 연결시켜, 도 1의 혈전 관측 장치(1)를 만든다. 한편, 유입관(11) 및 배출관(13)의 혈전 형성실(10) 주변은 조인트(치즈)를 통해 프렌지(flange)형의 압력계(40, 41)를 각각 장착한다. 또한, 혈전 형성실(10)의 내표면상의 유리로 만든 협착부는 1% 불용성 콜라겐 타입I(Wako Pure Chemical Industries Ltd)의 0.1N 아세트산 용액에 침지한 다음 건조하여, 내표면의 유리 협착부에 혈전 유발제(15)로서 콜라겐을 코팅한다. 그리고, 시린지(20, 21)은 플런저가 위로 오도록 돌리고, 용액 A를 5 ml/분, 용액 B을 0.5 ml/분으로 흐르도록 각각의 플런저에 하중을 가하여 시린지 펌핑되게 한다.

용액 A 및 용액 B를 10분간 흘려주면, 수 분후에 유입관(11) 및 배출관(13)의 압력계(40, 41) 간에 차이가 나타나는데, 이러한 차이는 시간에 따라 증가하며, 동시에 배출관(13)로부터 배출되는 혈액도 서서히 감소되는 것이 확인되었다. 모든 용액을 흘려준 후, 혈전 관측 장치(1)에 생리 식염수를 유입시켜 혈전 형성실(10)을 세정하였을 때, 혈전 형성실(10)에 혈전이 형성된 것으로 가시적으로 확인되었다.

실시예 2

실시예 1에서 용액 A에 미분획화한 헤파린(돼지 점막으로부터 제조)을 용액 A에 대해 1 mg/ml이 되도록 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 혈전 관측 장치(1)를 제작하여, 혈전 형성을 관측하였다.

이 경우, 실시예 1에서 나타난 압력 차이 발생이나 혈류량의 저하는 나타나지 않았고, 생리 식염수로 세정한 이후에 혈전 형성실(10)에서의 혈전 형성은 가시적으로 확이할 수 없었다.

실시예 3

내경이 3 mm이고 길이가 5 cm인 유리관을 카세트 타입의 혈전 형성실(10)로 사용하고; 시린지(20, 21)을 각각 전동 모터에 의해 구동되는 시린지 펌프에 연결시키고; 협착부(14)와 협착부(14)상에 혈전 유발제(15)로서 코팅된 콜라겐 대신에 도 2(a)에 도시된 바와 같이 유리관과 유입관(11)의 연결부로부터 5 mm 안쪽에 있는 혈전 형성실(10)의 내표면상에 실시예 1의 콜라겐에 침지하고 4 ℃에서 공기중에서 건조시킨 길이 1.5 cm의 견사를 혈전 유발제(15)로서 접착제에서 접착시킨 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 혈전 관측 장치(1)를 만들었다.

시린지(20)의 용액 A를 3 ml/분으로, 시린지(21)의 용액 B를 0.3 ml/분으로 15분간 흘려준 후, 혈전 형성실(10)을 탈착시켜 생리 식염수로 내부를 세정한 결과, 견사의 하단 끈을 시작점으로 형성되어 하류로 퍼지는 것으로 보이는, 도 2(b)에 나타낸 바와 같은 조성상(comet shape)의 길이 1 cm 및 두께 약 1 mm인 혈전(16)이 유리관내표면에 부착된 것이 가시적으로 확인되었다. 여기에서, 형성된 혈전이 조성상인 것은 혈류의 영향인 것으로 생각된다.

한편, 혈전의 가장 넓은 부분의 폭은 약 3 mm이었다.

실시예 4

견사 대신 도 3 (a)에 도시한 바와 같이 항응고 처리하지 않은 혈액 5 ㎕를 유리관의 내표면에 파스퇴르 피펫을 이용하여 적하하고 15분간 실온에서 방치함으로써 지름이 약 2 mm 정도인 디스크형의 혈전을 혈전 유발제(15)로서 만드는 것을 제외하고는, 실시예 3과 동일하게 혈전 관측 장치(1)를 제작하였다.

실시예 3과 동일하게, 용액 A 및 용액 B을 흘린 다음, 혈전 형성실(10)을 탈착시켜 생리 식염수로 내부를 세정한 결과, 혈전 유발제(15)로서 혈전 주변을 둘러싸면서 하류 방향으로 퍼지는 도 3(b)에 나타난 바와 같은 길이 1 cm 및 두께 약 1mm인 조성상의 혈전(16)이 유리관 내표면에 부착된 것을 가시적으로 확인하였다. 여기에서, 형성된 혈전이 조성상인 것은 혈류의 영향인 것으로 생각된다. 다.

한편, 혈전의 가장 넓은 부분의 폭은 약 3 mm이었다.

실시예 5

실시예 3에서, 용액 A에 항응고 처리제로서 Argatroban(등록상표, Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd)를 실시예 3의 용액 A에 대해 0.1 mg/ml이 되도록 더욱 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 3과 동일하게 혈전 관측 장치(1)를 제작하여, 혈전 형성을 관측하였다.

그 결과, 생리 식염수로 세정한 후, 유리관에서 혈전을 가시적으로 확인할 수 없었다.

실시예 6

실시예 3에서, 용액 A로 전혈에 1 μg/ml이 되도록 히루딘을 첨가하여 제조한 항응고 처리 혈액을 이용하고, 용액 B으로 전혈에 1 mg/ml이 되도록 생리 식염수에 용해시킨 항히루딘 다클론성 항체(COSMO BIO CO. LTD)을 이용한 것을 제외하고는, 실시예 3과 동일하게 혈전 관측 장치(1)를 제작하여, 혈전 형성을 관측하였다.

이 경우, 실시예 3과 거의 동일한 혈전 형성이 확인되었다.

실시예 7

채혈 직후의 혈액에 1O μg/ml의 어프로티닌과 1 μg/ml의 농도의 재조합 히루딘(Wako Pure Chemical Industries, Ltd)를 첨가하여 항응고 처리한 전혈(용액 A) 10 ml 및 혈액 응고를 촉진하는 약제로서 트롬보플라스틴 시약(Sysmex corporation) 1 vial/ml을 생리 식염수에 1000배 희석한 용액에서 파파인이 고정된 수지를 이용하여 Fc 도메인을 분리한 항히루딘 다클론성 항체(COSMO BIO CO. LTD)가 5 mg/ml이 되게 첨가된 용액(용액 B) 1 ml을 준비하였다.

혈전 관측 장치의 제작시, 폴리디메틸 실록산으로 만든 도 4에 나타낸 폭 40 mm x 길이 70 mm x 두께 1.5 mm의 기판(100)과 두께가 1 mm인 동일 크기의 유리로 만든 도 5의 기판(200)을 이용하였다.

도 4의 패턴으로 기판(100)의 표면에 깊이 0.5 mm의 홈을 파고 혈전 형성실(11O)을 포함하는 회로를 만든다. 홈의 폭은 유입관(111)이 되는 부분은 1 mm이다. 회로(1O0D)의 길이는 30 mm이고, 말단에 지름 1 mm의 관통 구멍을 만들어 조 정 밸브(100E)로 하며, 개폐가능한 캡으로 밀폐한다. 혈전 형성실(110)은 길이가 30 mm이고 폭은 넓은 부분이 2.5 mm이고 폭이 0.5 mm인 협착부(114)를 포함한다. 그리고, 연결부(100A, 100B)로서 지름 1 mm의 관통 구멍을 만들고, 연결부(100C)로는 지름 2.5 mm의 관통 구멍을 만든다.

기판(200)에는 도 5에 도시한 바와 같이 기판(100)의 협착부(114)를 덮는 위치에 혈전 유발제(115)로서 콜라겐을 폭 10 mm의 띠 형태로 도포한다. 콜라겐 도포시, 기판(200)의 협착부(114)에 해당되는 직사각형의 마스킹 테이프를 붙이고, 그 위에 실리콘계 박리제 SRX-211(DOW Corning Toray Co. Ltd)을 코팅한다. 그 후 마스킹 테이프를 벗기고, 박리제를 도포하지 않은 유리 부분에 1%로 콜라겐 타입I(Wako Pure Chemical Industries, Ltd)을 0.1N 아세트산에 용해한 용액으로 적하하고, 25 ℃에서 1시간 방치한 다음, 박리제층 상의 콜라겐을 정제수에서 씻어 제거하여, 협착부(114)에 해당되는 직사각형의 박리제 미도포-유리 부분에만 콜라겐을 도포한다.

그 후, 기판(200)의 콜라겐 도포면과 기판(100)의 회로 형성면을 서로 밀착시킨다.

연결부(100A, 100B)는 기판(100)의 뒷면(회로가 형성되어 있지 않은 면)으로부터 내경 1 mm의 실리콘관에 연결시키고, 각각 용액 A가 충전된 10 ml 규격의 시린지 및 용액 B이 충전된 1 ml 규격의 시린지에 연결한 다음, 각각의 시린지에 시린지 펌프를 장착한다. 또한, 연결부(100C)에는 내경 2.5mm의 실리콘관을 연결하여, 이를 배출관으로 한다.

연결부(100A)로부터 용액 A를 0.3 ml/분의 유속으로 주입한다. 연결부(100B)로부터 용액 B를 0.03 ml/분의 유속으로 주입한다.

5분간 각각의 용액을 연결부(100A) 및 연결부(100B)로부터 흘려주고, 연결부(100A)로부터 생리 식염수를 주입하여 혈액을 씻어버렸고, 확인한 결과 주로 기판(200)의 콜라겐 처리한 면에서, 도 6의 영역a 및 영역b에 혈전이 형성된 것으로 확인되었다.

실시예 8

채혈 직후의 혈액에 0.3 mg/ml이 되게 파파인으로 Fc 도메인을 절단한 항 XII 인자 다클론성 항체(COSMO BIO CO. LTD) 및 0.3 unit가 되게 미분획 헤파린(돼지 유래, Wako Pure Chemical Industries, Ltd)을 첨가하여 이를 용액 A로 하고, 트롬보플라스틴 시약(Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd)을 50배 희석한 것을 용액 B로 하고, 도 8에 나타낸 두께 1 mm의 투명한 폴리스티렌 기판(200)상의 콜라겐 도포 영역에 전처리로서 2 g/L로 과망간산 칼륨을 농축 황산에 용해시킨 용액을 적하하여 25 ℃에서 10분간 반응시킨 다음 신속하게 정제수로 세정하고 상기 전처리 영역에 1%로 콜라겐 타입I(Wako Pure Chemical Industries, Ltd)을 0.1N 아세트산에 용해시킨 용액으로 적하하여 25 ℃에서 1시간 방치한 후 정제수로 세정함으로써 콜라겐을 도포하고, 도 7에 나타낸 혈전 형성실(110)로 협착부가 없는 기판(100)을 이용하는 것을 제외하고는, 실시예 7과 동일하게 혈전 관측 장치를 만들어 혈전 형성을 관측하였다. 한편, 기판(1OO)의 연결부(1OOC)는 지름 1 mm의 관통 구멍을 통해 제공되며, 배출관으로서 내경 1 mm의 실리콘관에 연결된다.

10분간 용액 A 및 용액 B을 흘려준 다음, 연결부(100A)로부터 생리 식염수를 주입하여 혈액을 씻어 버린 결과, 기판(200)의 콜라겐 도포 영역의 채널 부분에서 적색 혈전의 부착이 확인되었다.

실시예 9

채혈 직후의 혈액에 0.05 mg/ml의 농도로 어프로티닌을 첨가한 다음 1 μg/ml의 농도로 재조합 히루딘(Wako Pure Chemical Industries, Ltd)을 첨가하여 항응고 처리를 수행한 다음, 10μM이 되도록 퀴나크린(Sigma Co., Ltd)을 첨가하여 이를 용액 A로 하고, 연결부(100B)는 캡으로 폐쇄하고 연결부(100A)를 통해 1 ml/분의 유속으로 용액 A만을 주입하는 것을 제외하고는, 실시예 7과 동일하게 혈전 관측 장치를 제작하여 혈전 형성을 관측하였다.

기판(200) 측의 콜라겐 도포면에 초점을 맞추어 형광 입체 현미경으로 관찰한 결과, 콜라겐 도포면의 일부분에서 녹색으로 퀴나크린 형광물질의 발색이 확인되었으며, 이러한 영역은 시간에 따라 반점 영역으로서 퍼졌으며, 10분 후에는 콜라겐 도포면 대부분은 혈소판의 점착에 의한 것일 수 있는 녹색 형광 발색이 확인되었다.

실시예 10

퀴날린을 첨가하지 않고 용액 A를 준비한 것을 제외하고는, 실시예 9과 동일하게 혈전 관측 장치를 제작하여 혈전 형성을 관측하였다.

연결부(100A)에서 1 ml/분의 유속으로 혈액을 주입하였다. 주입하는 중에 연결부(100C)의 관을 죄어 2초간 막았을 때, 내압 상승으로 수반되는 회로(100D)내 분기점으로부터 20 mm까지 혈액이 즉석에서 이동하였으며, 이후 연결부(100C)를 개통한 다음에는 혈액은 분기점에서 20mm 지점까지 이동하지 않아, 압력 상승의 증거를 확인할 수 있었다.

실시예 11

실시예 8의 용액 A에 헤파린 대신에 파파인으로 Fc 도메인을 절단한 항트롬빈 다클론성 항체(COSMO BIO CO. LTD)를 30 μg/ml이 되도록 첨가하고, 실시예 8의 용액 B에 PPACK 트롬빈을 5 mg/ml이 되도록 추가적으로 첨가하는 것을 제외하고는, 실시예 8과 동일하게 혈전 관측 장치를 제작하여 혈전 형성을 관측하였다.

15분간 용액 A 및 용액 B을 흘린 후, 연결부(100A)로부터 생리 식염수를 주입하여 혈액을 씻어 버렸을 때, 기판(200)의 콜라겐 처리 영역의 채널 부분에서 적색 혈전의 부착이 확인되었다.

실시예 12

헤파린 0.5 unit/ml 및 어프로티닌 10 μg/ml의 첨가한 채혈 직후의 혈액 50 ml을 800 rpm으로 원심분리하여 상청액으로부터 다혈소판 혈청(PRP)을 준비하여 이를 용액 A로 사용하고, 용액 B는 트롬보플라스틴 시약(Sysmex corporation) 1 vial/ml을 생리 식염수에 30배로 희석한 용액을 사용하는 것을 제외하고는, 이외는 실시예 7과 동일하게 혈전 관측 장치를 제작하여 혈전 형성을 관측하였다.

입체 현미경으로 협착부(114)의 혈전 형성을 15분간 관측하였다. 협착부(114) 주변에 부착된 혈소판 덩어리들이 다수개 확인되었으며, 혈소판 덩어리는 부착과 탈착을 계속 반복하면서 덩어리의 수가 증가하고 동시에 크기도 성장하는 것으로 관측되었다.

실시예 13

실시예 12의 용액 A의 PRP 20 ml에 원심분리한 침전물로부터 취한 적혈구를 50 ㎕ 첨가하여 용액 A를 준비하고, 용액 B로는 트롬보플라스틴 시약(Sysmex corporation) 1 vial/ml을 생리 식염수로 30배 희석한 용액을 사용하고, 기판(200)의 전체면을 실리콘계 박리제 SRX-211(DOW Corning Toray Co. Ltd)로 코팅하여 슬라이드 글라스를 준비하고, 기판(100)의 혈전 형성실(110)의 협착부(114)의 상류측에 인접한 폭이 2.5 mm으로 점차 넓어지는 확장부(widening portion)의 확장 종점 부근에 약 1 ㎕의 전혈을 부착시켜 10분간 실온에서 방치하여 혈액을 응고시키고, 예비적인 혈전을 만들어 이를 혈전 유발제로서 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 7과 동일한 방식으로 A 용액 및 B 용액을 흘린 후, 혈전 형성을 관측하였다.

15분간 입체 현미경으로 혈전이 부착된 영역을 모니터링하였다. 약 5분후에 예비적인 혈전을 기점으로하여 하류 방향으로 새로 형성된 적색 혈전이 확인되었으며, 15분까지 서서히 하류 방향으로 확장되고 폭도 2.5 mm까지 넓어졌다. 혈류는 형성된 혈전을 따라 또는 혈전들 사이의 갭에 흐르는 것으로 확인되었다.

실시예 14

최종 농도 5μM의 엑소사이트I 트롬빈 앱타머(GGTTGGTGTGGJTGG: 서열 번호 1) 및 최종 농도 30 μg/ml의 옥수수 유래 트립신 저해제(COSMO BIO CO. LTD)를 첨가한 채혈 직후의 혈액 50 ml을 800 rpm으로 10분간 원심분리하고, 상청액으로부터 다혈소판 혈청(PRP)을 준비하여 이를 용액 A로 사용하고, 150 μM이 되도록 안티센 스 DNA(CCAACCACACCAACC: 서열 번호 2)를 생리 식염수에 용해하여 이를 용액 B로 사용하고, 혈전 유발제(115)를 설치하는 시기에 실시예 7의 콜라겐 용액에 트롬보플라스틴 시약(Sysmex corporation) 1 바이알을 1 ml 정제수에 용해하고 정제수에서 투석한 용액을 5: 1의 비율로 혼합하고 이 용액을 실리콘 미도포 영역에 적하한 다음 4 ℃에서 공기중에 건조하는 것을 제외하고는, 실시예 7과 동일하게 혈전 관측 장치를 제작하여 혈전 형성을 관측하였다.

입체 현미경을 이용하여 협착부(114)의 혈전 형성을 5분간 관측하였다. 협착부(114) 부근에서 부착된 혈소판 덩어리 다수개가 확인되었으며, 이는 부착과 탈착을 계속 반복하면서 덩어리의 수가 증가하는 동시에 크기도 성장하는 것으로 관측되었다.

실시예 15

실시예 14와 동일한 과정으로 PRP을 준비하고 측정 직전에 15 μM이 되도록 안티센스 DNA(CCAACCACACCAACC: 서열 번호 2)를 첨가하여 항트롬빈 처리를 해제하고 이를 용액 A로 사용하였고, 실시예 9과 동일하게 연결부(10OB)의 주입 개방을 폐쇄시키고, 실시예 14의 콜라겐 용액 대신 콜라겐 타입I(세포 배양 접시에 콜라겐을 코팅하기 위한 콜라겐 시약, Cellmatrix, Type I-A 원액)을 이용하고, 용액 A만 0.2 ml/분의 유속으로 5분간 흘려보내는 것을 제외하고는, 실시예 14과 동일하게 혈전 관측 장치를 제작하여 혈전 형성을 관측하였다.

입체 현미경을 이용하여 협착부(114)의 혈전 형성을 5분간 관측하였다. 협착부(114) 부근에서 부착된 혈소판 덩어리 다수개가 확인되었으며, 이는 부착과 탈 착을 계속 반복하면서 덩어리의 수가 증가하는 동시에 크기도 성장하는 것으로 관측되었다.

실시예 16

도 7에 나타낸 패턴으로 기판의 표면을 깊이 0.1 mm의 홈을 만들고, 동시에 혈전 형성실(110)의 중앙 부근에 길이 1 mm, 폭 40 μm의 볼록한 열(convex row)을 40 μm 간격으로 홈의 기저부 전면에 바로 세워 경계벽을 두고, 실시예 9와 동일하게 연결부(10OB)의 주입 개방을 폐쇄하고, 기판(200)을 표면 처리하지 않은 단순한 슬라이드 글라스로 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 7과 동일하게 혈전 관측 장치를 제작하였다. 경계벽 사이의 갭은 모세혈관을 모방한 것이다.

채혈 직후의 전혈에 최종 농도 30μg/ml로 옥수수 유래 트립신 저해제와 최종 농도 10 μM의 엑소사이트I 트롬빈 앱타머를 첨가하여, 항응고 처리하였다. 관측 직전에 30 μM이 되도록 엑소사이트I 트롬빈 앱타머에 대한 안티센스 DNA를 첨가하고, 이를 100A로부터 0.05 ml/분의 유속으로 5분간 주입하였다.

입체 현미경을 이용하여 경계벽 사이의 갭에서의 혈전 형성을 관측한 결과, 관측 5분동안 순차적인 혈전 형성에 의해 채널이 폐쇄되었고, 약 절반의 채널들이 혈전에 의해 폐쇄되는 것으로 관측되었다.

실시예 17

도 9에 나타낸 시린지형의 액체 공급 시스템을 사용하였고, 실시예 7과 동일 재질의 도 9의 (B)과 (C)로 나타낸 마이크로칩 기판과 뚜껑을 압착시킨 마이크로칩(300)을 사용하였다. 이 마이크로칩(300)은 혈액 응고 방지제 유입관(322)과 배 출관(313)을 실시예 7의 배출관과 동일하게 기판(100)에 연결시킨 것이다. 단, 도 9의 마이크로칩(300)의 도랑(groove)은 모두 깊이 200 μm이며, 샘플 시린지(320)로부터 혈액이 유입되는 채널의 폭은 1 mm이고 길이는 40 mm이며, 상기 200 μm 폭 x 길이 10 mm의 좁은 채널로 구성된 혈전 형성실(311) 및 혈액 응고 방지제 유입관(322)에 에 연결되는 채널을 형성한다. Sysmex corporation PT 시약(조직 트롬보플라스틴) 1바이알을 1 ml의 정제수에 용해한 다음 정제수에 투석한 산물을 콜라겐 타입I(Nitta gelatin Inc.)와 1:1로 혼합한 용액을 도 9에 나타낸 혈전 유발제(315) 위치에 도포하였다. 그 후 4 ℃에서 공기중에 건조시키고 이를 혈전 형성실(311)에 덮어, 혈전 유발제(315)로 사용하였다. 시린지에 옥수수 유래 트립신 저해제, 엑소사이트I 트롬빈 앱타머 및 엑소사이트II 트롬빈 앱타머(5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGJTGGGGTGACT -3': 서열 번호 3)의 최종 농도가 각각 25 μg/ml, 10μM 및 10μM이 되도록 항응고 처리제를 첨가한 후, 채혈하였다. 측정 직전에, 채혈한 혈액에 각각 40 μM이 되도록 엑소사이트I 및 엑소사이트II의 트롬빈 앱타머에 대한 안티센스 DNA를 첨가하고, 시린지(Terumo corporation, 1 m1 시린지)에 혈액을 채워 도 9의 샘플 시린지(320)로 사용하였다. 액체 공급 펌프내 압력을 모니터링할 수 있는 미량-액체 공급 펌프인 마My Flow(Arbiotec Co., Ltd)를 도 9의 압입관(317)에 연결시키고, 샘플 시린지(320)에 인가되는 압력을 모니터링하면서 도 9(A)에 나타낸 바와 같이 샘플 시린지(320)의 상부로부터 미네랄 오일을 압입하여, 혈액을 마이크로칩(300)에 5 ㎕/min의 속도로 압출하였다.

혈액 응고 방지제로서 1M Tris-HCl(pH 10)을 혈액 응고 방지제 유입관(322) 으로부터 5 ㎕/min으로 흘려 주었다. 압력 측정 개시 시간으로부터 6분 후에 압력이 상승하기 시작하였다.

혈전의 이동에 의한 압력의 상하 변화가 반복되면서 80 kPa까지 압력이 상승하였다(도 13의 대조군).

실시예 18

실시예 17과 동일하게 항응고 처리제를 첨가하여, 채혈을 수행하였다. 다음으로, 1 unit/ml으로 미분획 헤파린을 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 17과 동일하게 처리하여 압력을 측정하였다. 압력은 13분 후에 상승하기 시작하였다. 압력은 약 10k Pa까지 상승하였다(도 13의 "헤파린").

실시예 19

실시예 17과 동일하게 항응고 처리제를 첨가하여, 채혈을 수행하였다. 다음으로, 50 μg/ml으로 ReoPro(LILLY Co., Ltd)를 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 17과 동일하게 처리하여 압력을 측정하였다. 18분 동안의 관측시, 압력 상승은 확인되지 않았다(도 13의 "ReoPro").

실시예 20

3.2% 구연산과 혈액의 비가 1:9가 되도록 구연산을 첨가하여 채혈하고, 또한 그 혈액에 25 μg/ml이 되도록 옥수수 유래 트립신 저해제를 첨가하여 항응고 처리하였다. 혈전 형성 관측시에, 항응고 처리한 혈액에 15 mM이 되도록 염화 칼슘을 첨가하고 즉시 혈액을 시린지(Terumo corporation, 1 ml 시린지)에 넣은 후, 실시예 17과 동일한 마이크로칩에 4 ㎕/min의 유속으로 혈액을 흐르게 하여 실시예 17 과 동일한 시스템에서 압력 변화를 측정하였다. 압력은 15분 후에 상승하기 시작하여 약 60 kPa으로 상승하였다.

실시예 21

실시예 20과 동일하게 항응고 처리제를 첨가하여 채혈하였다. 그 후, 각각 02 unit/ml, 0.5 unit/ml, 1 unit/ml의 헤파린을 더욱 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 20과 동일하게 진행하여 압력을 측정하였다. 그 결과는 도 14에 나타낸다.

실시예 22

실시예 20과 동일하게 항응고 처리제를 첨가하여 채혈하였다. 그 후, 2μg/ml의 ReoPro(LILLY Co., Ltd)을 더욱 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 20과 동일하게 진행하여 압력을 측정하였다. 압력은 20분 후에 상승하기 시작하여, 25분 후에는 15 kPa까지 상승하였다(도 15).

실시예 23

도 12에 나타낸 시린지 액체 공급 시스템과 도 12의 (B) 및 (C)에 나타낸 마이크로칩의 뚜껑의 기판(200)과 마이크로칩의 본체의 기판(100)을 압착시킨 마이크로칩(400)을 사용하였다. 테프론(등록상표) 관으로 만든 배출관(413)에는 미네랄 오일 넣고, 한쪽 말단은 실리콘 고무로 만든 연결관(412)를 통해 마이크로칩(400)과 연결시키고, 다른 말단은 압력 센서가 내장된 흡인 펌프(414)에 연결하였다. 마이크로칩(400)의 채널을 형성하는 유입관은 실리콘 고무로 만든 연결관(412)을 통해 시린지(420)에 연결된다. 테프론(등록상표) 관으로 만든 혈액 응고 방지제 유입관(422)의 한쪽 말단은 액체 공급 펌프(423)와 연결시키고, 다른 말단은 실리 콘 고무로 만든 연결관(412)을 통해 혈전 형성실의 종결 말단과 연결시킨다. 이렇게, 마이크로칩(400)에 배출관(413), 시린지(420) 및 혈액 응고 방지제 유입관(422)을 연결하여 이를 혈전 관측 장치B로 하였다. 혈전 형성실 아래에는, 레일(433)에 실어 구동가능한 LED로 이루어진 광원(432)을 구비하는 CCD 카메라(430)를 설치하였다.

마이크로칩의 도랑은 모두 깊이 120μm으로 하였다.

혈액이 유입되는 채널의 폭은 800 μm이고 길이는 7 mm이며, 좁은 채널의 폭은 200 μm이고 길이는 10 mm의이다.

마이크로칩의 기판(100)에 압착되는 표면 상에 협착부의 채널이 만나는 마이크로칩 기판(200) 영역에, PT 시약(Sysmex corporation: 조직 트롬보플라스틴) 1 바이알을 1 ml의 정제수에 용해한 다음 정제수에 투석한 산물을 콜라겐 타입I(Nitta gelatin Inc.)에 1:1로 혼합한 용액을 도포하였다. 그 후, 4 ℃에서 진공 건조하고, 기판(100)을 기판(200)과 압착시켜, 혈전 형성실(411)을 포함하는 마이크로칩(400)을 준비하였다.

항응고제로서 구연산 나트륨이 봉입된 진공 채혈관으로 채혈한 다음 시린지(420)에 넣기 직전에 최종 농도 12.5 mM의 염화 칼슘과 25 μg/ml의 옥수수 유래 트립신 저해제를 첨가하였다.

액체 공급 펌프내 압력을 모니터링할 수 있는 미량-액체 수송 펌프인 My Flow(Arbiotec Co., Ltd)를 펌프(414)로서 배출관(413)에 연결하여, 채널의 내압을 모니터링하면서 1 ㎕/min의 속도로 흡인하였다.

혈액 응고 방지제로서 1M Tris-HCl pH10을 혈액 응고 방지제 유입관(422)으로 8 ㎕/min으로 흘려 주었다. 압력 측정을 시작한 지 4분 후에 주로 백색의 혈전 형성과 동시에 내압의 저하가 확인되었고, 10분 후에는 시작시보다 30kPa의 내압 저하가 확인되었다.

또한, 채널내의 혈전 형성 부위를 카메라(430)를 이동시키면서 촬영하여 혈전의 형성을 확인하였다. 혈전의 형성이 확인된 위치를 기억하여 정기적으로 순회 촬영함으로써, 복수 개의 큰 혈전에 대한 경시적인 혈전 성장 및 붕괴를 기록할 수 있었다.

아울러, 하기 참조예는 트롬빈 앱타머와 그 안티센스 DNA가 각각 항응고 처리제와 항응고 해제제로서 유효함을 확인하기 위해 수행하였다.

참조예 1

채혈 직후의 혈액, 상기 혈액에 300 μg/ml의 옥수수 유래 트립신 저해제를 1/10 용량으로 첨가한 혈액, 이 혈액에 5 μM이 되도록 엑소사이트I을 인지하는 트롬빈 앱타머를 더욱 첨가한 혈액, 이렇게 3종류의 혈액의 응고 시간을 에펜도르프 튜브(폴리프로필렌으로 제조)에서 측정하였다. 샘플은 1분마다 상하 꺼꾸로 흔들어, 유동성을 확인하였다. 무첨가 혈액의 응고 시간은 9분이었다. 이에 반해, 트립신 저해제를 첨가한 혈액의 응고 시간은 22분이고, 여기에 트롬빈 앱타머를 더욱 첨가한 혈액의 응고 시간은 62분이었다.

또한, 5 μM의 엑소사이트I을 인지하는 트롬빈 앱타머 및 5 μM의 엑소사이트II를 인지하는 트롬빈 앱타머를 병용한 경우에는, 트립신 저해제가 없는 경우에 도 3시간 후에는 혈액 응고가 확인되지 않았다. 엑소사이트I을 인지하는 트롬빈 앱타머: 5'- GGTTGGTGTGGTTGG - 3' 서열번호 1, 엑소사이트II를 인지하는 트롬빈 앱타머: 5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTrGGGGTGAC T-3' 서열번호 3.

참조예 2

또한, 혈청 200 μM에 대하여, 생리 식염수 1 ㎕을 첨가한 샘플 A, 500 μM 엑소사이트I를 인지하는 트롬빈 앱타머를 1 ㎕ 첨가한 샘플 B, 500 μM의 엑소사이트I을 인지하는 앱타머와 1500 μM의 엑소사이트I을 인지하는 트롬빈 앱타머 안티센스DNA 용액을 1 ㎕ 첨가한 샘플 C의 APTT를 각각 측정한 결과, 샘플 A는 44초, 샘플 B는 2분 이상, 샘플 C은 45초였다.

참조예 3

도 11(A)은 10 μM의 엑소사이트I 및 II에 대한 앱타머를 첨가한 혈액을 15분간 실온에서 둔 후, 40 μM의 양쪽 앱타머의 안티센스 DNA를 첨가하여 트롬보엘라스토그램으로 응고의 파형을 해석한 것이다. 도 11(B)은 채혈 직후 혈액의 트롬보엘라스토그램의 파형이다.

도 11(A) 및 (B)의 결과로부터, 2종의 트롬빈 앱타머를 첨가하여 혈액을 보존할 수 있으며, 안티센스 DNA에 의해 그 항응고 처리를 해제시킬 수 있음을 알 수 있다.

이상, 참조예 1 - 3의 결과로부터, 옥수수 유래 트립신 저해제와 트롬빈 앱타머의 조합이 전혈의 응고를 효과적으로 억제하며, 트롬빈 앱타머의 항응고 작용은 트롬빈 앱타머에 대한 안티센스 DNA에 의해 무효화된다는 것이 명확해진다.

참조예 4

이하, 혈액의 보존 및 기판상에서의 혈소판 점착에 대한 PMEA 코팅의 유효성을 나타낸다.

1) 일본 특허 공개공보 평 4-152952호에 따라 합성한 1% PMEA를 함유하는 메탄올 용액을 2.5 ml의 아크릴 수지 용기(내경: 1cm × 1cm × 4.5cm)에 도포하고, 90 ℃에서 10분간 건조하였다. 그 다음으로, 3.2% 구연산에 의해 항응고 처리한 혈액 76 ㎕을 비-코팅 용기 및 PMEA-코팅 용기에 첨가하고, 5분마다 피펫으로 흡인하여 혈액 응고를 확인하였다.

그 결과, 비-코팅 용기에서는 30분에 명확한 점성 상승이 확인되었고 60분에는 응고가 확인되었지만, PMEA-코팅 용기에서는 35분에 명확한 점성 상승은 확인되었지만 응고 시간은 90분으로 연장되었다.

2) 상기 PMEA를 투명 아크릴판에 평평하게 코팅하였다. 이것을 실시예 9의 콜라겐 코팅 플레이트(도 8)의 대신 사용하고, 실시예 9과 동일하게 실시하여 혈중 퀴나크린-표지된 혈소판 및 백혈구의 점착성을 테스트하였다.

그 결과, 비-코팅 아크릴 플레이트에 혈액이 흐른 지 10분 후에 혈소판, 백혈구가 명확하게 점착 또는 응집된 것이 확인되었지만, PMEA 코팅 아크릴 플레이트에서는 30분 이후에도 혈소판, 백혈구의 점착 및 응집은 확인되지 않았다.

상기 결과로부터, 본 발명의 혈전 관측 장치에서, 혈액 보관 시린지, 관, 기판 등을 PMEA로 코팅함으로써, 혈전 관측실 이외의 다른 우치에서는 혈전 형성이 억제되어, 혈전 관측실 특이적인 혈전 관측이 가능함이 시사되었다.

이상, 본 발명은 바람직한 실시예를 들어 설명되지만, 본 발명은 전술한 실시예나 구현예로 한정되지 않으며, 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위내에서 다양한 변형을 가할 수 있다. 예를 들어, 펌프의 압력을 높게, 배출관의 내경을 작게 설정하여 유입관내 및 배출관내에 역압을 발생시킴으로써, 혈압에 대응되는 내압의 부하하에서의 혈류량을 조정하면서 혈전 형성을 모니터링할 수 있다. 또한, 혈류의 속도도 펌프의 압력과 배출관의 조절 정도를 자유롭게 조절할 수 있다.

본 발명의 혈전 관측 장치 및 혈전 관측 방법은 환자 등에 투여한 항혈전제의 효능을 관측함에 있어 전혈 또는 혈소판을 포함하는 혈청을 이용하여 혈류와 동등한 환경하에서 혈액 응고 및 혈소판에 의한 혈전 형성을 종합적으로 평가하는데 바람직하게 이용할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> FUJIMORI KOGYO CO., LTD. <120> APPARATUS FOR MONITORING THROMBUS FORMATION AND METHOD OF MONITORING THROMBUS FORMATION <130> OP-C6262-PCT <150> JP2005-302557 <151> 2005-10-18 <150> JP2005-308065 <151> 2005-10-24 <150> JP2005-334594 <151> 2005-11-18 <150> JP2005-358448 <151> 2005-12-13 <150> JP2006-36148 <151> 2006-02-14 <150> JP2006-234270 <151> 2006-08-30 <160> 3 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> exosite I thrombin aptamer <400> 1 ggttggtgtg gttgg 15 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> antisense DNA <400> 2 ccaaccacac caacc 15 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> exosite I thrombin aptamer <400> 3 agtccgtggt agggcaggtt ggggtgact 29

Claims (21)

1. 혈관을 모방한 채널을 통해 항응고 처리된 혈액을 항응고 처리를 해제하거나 또는 혈액 응고를 촉진하면서 흐르게 하여 혈전 형성을 관측하는 혈전 관측 장치로서,

   내부의 적어도 일부분에 혈전 형성을 유발하는 혈전 유발제가 배치된 혈전 형성실;

   상기 혈전 형성실에 연결되어 상기 혈전 형성실에 혈액을 유입시키는 유입관; 및

   상기 유입관에 연결되어 상기 유입관에 항응고 처리를 해제하는 약제 또는 혈액 응고를 촉진하는 약제를 투입하는 약제관

   을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈전 관측 장치.
2. 혈관을 모방한 채널을 통해 항응고 처리된 혈액을 항응고 처리를 해제하거나 또는 혈액 응고를 촉진하면서 흐르게 하여 혈전 형성을 관측하는 혈전 관측 장치로서,

   상기 혈전 관측 장치는

   내부의 적어도 일부분에 혈전 형성을 유발하는 혈전 유발제가 배치된 혈전 형성실;

   상기 혈전 형성실에 연결되어 상기 혈전 형성실에 혈액을 유입시키는 유입 관; 및

   상기 혈전 형성실에 연결되어 혈전 형성실을 통과한 혈액에 혈전 형성 방지제를 혼합하기 위한 혈전 형성 방지제 유입관

   을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈전 관측 장치.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 장치는 기판상에 형성된 것인 혈전 관측 장치.
4. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한항에 있어서, 상기 혈전 관측 장치는 유입관 및/또는 약제관을 가압하기 위한 펌프 또는 혈전 형성실에 연결되어 혈전 형성실로부터 혈액을 배출시키는 배출관을 흡인하는 펌프를 포함하는 것인 혈전 관측 장치.
5. 제 1항 내지 제4항중 어느 한항에 있어서, 압력 측정 장치를 더 포함하는 혈전 관측 장치.
6. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한항에 있어서,상기 혈전 유발제는 콜라겐을 포함하는 것인 관측 장치.
7. 제 6항에 있어서, 상기 혈전 유발제는 조직 인자(tissue factor)를 더 포함하는 것인 혈전 관측 장치.
8. 제 1항 내지 제 7항중 어느 한항에 있어서, 혈전 형성실을 촬영하기 위한 카메라를 더 포함하는 혈전 관측 장치.
9. 혈전 관측 방법으로서,

   내부의 적어도 일부에 혈전 형성을 유발하는 혈전 유발제가 배치된 혈전 형성실에 항응고 처리된 혈액을 항응고 처리를 해제하거나 또는 혈액 응고를 촉진하면서 흐르게 하여, 혈전의 형성을 관측하는 것을 특징으로 하는 혈전 관측 방법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 항응고 처리는 칼슘 킬레이트제에 의한 처리이며, 유리 칼슘 공여체에 의해 항응고 처리를 해제하는 것인 혈전 관측 방법.
11. 제 9항에 있어서, 상기 항응고 처리는 트롬빈 앱타머에 의한 처리이며, 트롬빈 앱타머의 안티센스 DNA에 의해 항응고 처리를 해제하는 것인 혈전 관측 방법.
12. 제 9항에 있어서, 혈전 형성실에 항응고 처리된 혈액을 항응고 처리를 해제하는 조작을 행하지 않고 혈액 응고를 촉진하면서 흐르게 하여 혈전의 형성을 관측하는 것인 혈전 관측 방법.
13. 제 12항에 있어서, 조직 트롬보플라스틴에 의해 혈액 응고를 촉진하는 혈전 관측 방법.
14. 제 9항에 있어서, 1종 또는 복수 종의 항응고 처리제를 이용하여 항응고 처리한 혈액을, 상기 이용한 항응고 처리제에 대응하는 1종 이상의 항응고 처리 해제제로 항응고 처리를 해제하는 혈전 관측 방법.
15. 제 14항에 있어서, 항응고 처리제는 접촉상 인자 저해제(contact phase factor inhibitor) 및 칼슘 킬레이트제이며, 항응고 처리 해제제는 유리 칼슘 공여체인 혈전 관측 방법.
16. 제 14항에 있어서, 항응고 처리제는 접촉상 인자 저해제 및 헤파린이고, 항응고 처리 해제제는 헤파리나제인 혈전 관측 방법.
17. 제 14항에 있어서, 항응고 처리제는 접촉상 인자 저해제 및 트롬빈 앱타머이고, 항응고 처리 해제제는 트롬빈 앱타머의 안티센스 DNA인 혈전 관측 방법.
18. 제 15항 내지 제 17항중 어느 한항에 있어서, 상기 접촉상 인자는 혈액 응고 XII 인자 또는 칼리크레인(kallikrein)인 혈전 관측 방법.
19. 제 18항에 있어서, 상기 접촉상 인자는 혈액 응고 XII 인자이고, 혈액 응고 XII 인자의 저해제는 옥수수 유래의 트립신 저해제인 혈전 관측 방법.
20. 제 9항 내지 제 19항중 어느 한항에 있어서, 상기 혈전 관측 방법은 혈전 형성실에서의 혈액의 유입 및/또는 유출시에 압력을 측정하는 단계를 포함하는 것인 혈전 관측 방법.
21. 제 9항 내지 제 20항중 어느 한항에 있어서, 상기 혈전 유발제는 콜라겐과 조직 인자를 포함하는 것인 혈전 관측 방법.

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