WO2006118195A1 - 安定化フィブリンのプラスミン分解物の免疫学的分析方法 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to an immunological analysis method for a plasmin degradation product of stable fibrin, and more specifically, to a highly sensitive assay method for a plasmin degradation product of stable fibrin by chemiluminescence.
  • analysis includes “detection” for determining the presence or absence of an analyte, and “measurement” for quantitatively or semi-quantitatively determining the amount or activity of the analyte. .
  • Degradation products of human stable fibrin with various proteases are useful as diagnostic markers in clinical diagnostic methods.
  • plasmin degradation product of human stable fibrin that is, P-DDZE, which is a basic unit, and its polymer or oligomer (also called “DD dimer” or “DDZE complex”, for example).
  • DIC intravascular coagulation syndrome
  • agglutination by sensitized latex using a monoclonal antibody specific for the plasmin degradation product of stable fibrin is common. Is used.
  • DVT deep vein thrombosis
  • Stable fibrin that has been cross-linked by the solidification process becomes p- DD / E polymer or oligomer based on P- DD / E and further P- DDZE when subjected to plasmin degradation.
  • PE pulmonary thromboembolism
  • DVT deep vein thrombi
  • Monoclonal antibody JIF-23 is known as a known monoclonal antibody capable of specifically detecting a plasmin degradation product of stable fibrin (Non-patent Document 5). This antibody is a ⁇ chain terminal in the D domain of the plasmin degradation product of human stable fibrin.
  • the thrombosis and secondary fibrinolysis kinetics can be determined by using a measurement method that can specifically analyze plasmin degradation products of stable fibrin present in biological samples. It is easy to know.
  • a measurement method is not particularly limited, and examples thereof include a latex agglutination method and an ELISA method.
  • a latex agglutination method is known as a method for measuring plasmin degradation products of stable fibrin using the JIF-23 antibody that has been widely used in the clinical field.
  • Non-patent Documents 8 and 11 As an ELI SA method using an antibody that recognizes neoantigen of the D domain of a stable fibrin degradation product, for example, Miniveidas (Vimeleu) is known (Non-patent Documents 8 and 11). According to Non-Patent Document 9, ELISA is more sensitive than latex agglutination. It has been reported that it is useful for diagnosis of DVT, and an ELISA method capable of high-sensitivity measurement is being accepted as a method for measuring plasmin degradation products of stable fibrin. For example, the detection sensitivity of the above-mentioned minividus is about 45 ngZmL FEU.
  • each said value and unit are based on description of each nonpatent literature, and unit "g / mL FEU” and “microgram gmL” are the following conversion formulas:
  • Non-patent Document 10 “Thrombosis and Haemostasis” (Germany), 1994, 71 ⁇ , p.1-6
  • Non-Patent Document 2 "Quality Journal of Medicine” J, (UK), 1997, 90 ⁇ , p.437-442
  • Non-Patent Document 3 “Thrombosis and Haemostasis”, (Germany), 1999, 81 ⁇ , ⁇ .493-497
  • Non-Patent Document 4 “Thrombosis and Haemostasis” (Germany), 2000, 83 ⁇ , 191-198
  • Non-Patent Document 5 "Eceptceptor 'Medi Power, Amsterdam”, (Netherlands), 1990, ⁇ .43-48
  • Non-Patent Document 6 “YK National's“ Ixternal Quality Assessment ”Scheme“ Food ”Blood“ Core Grasion, Report “On” Survey 142 (UK National External Quality Assessment Scheme for Blood and Oagulation, Report on Survey 142) J, (UK), May 2004
  • Non-Patent Document 7 “ANNALES DE BIOLOGI E CLINIQUE”, (France), 1988, 46 ⁇ , p.730-733
  • Non-Patent Document 8 “Biomerieux Vidas D-Dimer Package Insert” (USA), September 2003, 008120-4
  • Non-Patent Document 9 "Annals of Internal Medicine” J, (USA), 2004, p.589-602
  • Non-Patent Document 10 “Journal of Thro” mbosis and Haemostasis) ”(UK), 2005, p.377—384
  • Non-Patent Document 11 “British Journal of Ha ematology J, (UK), 2004, p.15-25
  • An object of the present invention is to provide a more sensitive method for analyzing a plasmin degradation product of stable fibrin.
  • the analysis time can be shortened by making the sensitivity higher than the conventional high-sensitivity analysis method.
  • the problem is that the present invention does not react with (a) a stable fibrin, fibrinogen, and a plasmin degradation product of fibrinogen, but appears as a result of plasmin degradation of stable fibrin.
  • One of the monoclonal antibodies (a) and (b) is bound to magnetic particles, the other monoclonal antibody is enzyme-labeled, and a chemiluminescence substrate is used as the substrate for the enzyme. This can be solved by immunological analysis of plasmin degradation products of stable fibrin.
  • the monoclonal antibody (b) does not react with force-stable fibrin, fibrinogen, and a plasmin degradation product of fibrinogen. It is a monoclonal antibody that reacts with neoantigen of the E domain that appears by plasmin degradation of stable fibrin.
  • a test sample possibly containing a plasmin degradation product of stable fibrin
  • the monoclonal antibody (a) contacting the antibody (b), (2) forming the immune complex with an enzyme-labeled monoclonal antibody that forms an immune complex with the magnetic particle-bound monoclonal antibody via a plasmin degradation product of stable fibrin.
  • magnetic particle-bound monoclonal antibody separated in the previous step Stabilized fibrin plasmin degradation product Enzyme-labeled monoclonal antibody immune complex
  • a step of adding a chemiluminescence substrate to cause light emission A step of adding a chemiluminescence substrate to cause light emission, and (4) a step of analyzing the obtained light emission signal.
  • the chemiluminescence substrate is 1,2-dioxetane.
  • the labeling enzyme is alkaline phosphatase.
  • the present invention does not react with (a) stable fibrin, fibrinogen, and plasmin degradation product of fibrinogen, but D domain neoantigen that appears due to plasmin degradation of stable fibrin and A reactive monoclonal antibody, (b) a monoclonal antibody that specifically reacts with a plasmin degradation product of stable fibrin by recognizing a site different from the monoclonal antibody (a), and (c) a chemiluminescent substrate.
  • One of the monoclonal antibodies ( a ) and (b) is bound to a magnetic particle, and the other monoclonal antibody is labeled with an enzyme using the chemiluminescence substrate as a substrate.
  • the present invention relates to a kit for immunological analysis of a plasmin degradation product of stable fibrin.
  • the present invention is characterized by analyzing a plasmin degradation product of stable fibrin contained in a test sample by the immunological analysis method or the immunological analysis kit.
  • the present invention relates to a detection method (diagnosis method) of deep venous thrombosis and Z or pulmonary embolism. The invention's effect
  • a stable plasmin plasmin degradation product can be analyzed with high sensitivity and high specificity, and DVT and Z or pulmonary embolism can be achieved using only conventional DIC. It can also be applied to the diagnosis of symptoms.
  • FIG. 1 Measurement method (black circle) of the present invention using a combination of HIF-23 antibody-immobilized magnetic particles and alkaline phosphatase-labeled No. 36-1 antibody, JIF-23 antibody-immobilized magnetic particles and alkali Results of measurement of dilution series of stable fibrin plasmin degradation products in two types of measurement systems (white circles) for comparison with the phosphatase standard milF-23 antibody It is a graph which shows.
  • stable fibrin plasmin degradation product refers to a degradation product produced by digesting a stabilized fibrin with plasmin, and includes one or more basic units ⁇ DD It means a decomposed material consisting essentially of / EJ.
  • “Plasmin degradation product of stable fibrin” includes, for example, p-DDZE composed of one basic unit, or p-DD / E polymer or oligomer composed of a plurality of basic units.
  • stabilized fibrin plasmin degradation product for example, “DD dimer” or “DDZ E complex” force may be used.
  • a decomposition product generated by digestion with plasmin may be represented by adding “P” before the name of the decomposition product.
  • degradation products produced by digestion with condylar sphere elastase may be represented by adding “e-” before the name of the degradation product.
  • antibody in the present invention includes antibody fragments that are not only antibodies themselves. Examples of the antibody fragment include Fab, Fab ′, F (ab ′), and
  • Fv Fv
  • sandwich immunocomplexation with stable fibrin, fibrinogen, or plasmin degradation products of fibrinogen The site where stable fibrin appears in the fibrin degradation product digested by plasmin (i.e., neoantigen) is used as an epitope to form a sandwich immune complex. It is an essential condition to have a feature capable of forming.
  • stable fibrin, fibrinogen, and a plasmin degradation product of fibrinogen do not react, but a D domain that appears by plasmin degradation of stable fibrin.
  • Stabilization is achieved by using a monoclonal antibody that reacts with neoantigen (hereinafter referred to as the first antibody or anti-D domain neoantigen antibody) and, as the other monoclonal antibody, recognizes a site different from the first antibody.
  • a monoclonal antibody that reacts specifically with the plasmin degradation product of fibrin hereinafter referred to as the second antibody is used.
  • the first antibody used in the present invention is not particularly limited as long as it is a monoclonal antibody that recognizes the neoantigen of the D domain that appears by plasmin degradation of stable fibrin.
  • a monoclonal antibody that recognizes neoantigen eg, monoclonal antibody JIF-23) can be used.
  • the JIF-23 antibody is a well-known monoclonal antibody that can specifically detect a plasmin degradation product of stable fibrin (for example, Matsuda, M., Terukina, S., Yamazumi, K., Maekawa, H., Soe, G., A
  • the JIF-23 antibody is a stable fibrin granulocyte elastase degradation product (ie, e-DDZE, which is a basic unit, as well as its polymer or oligo), which only reacts with the plasmin degradation product of stabilized fibrin. Also react. Since there are two epitopes of JIF-23 antibody in the molecule of p-DD / E, the basic unit of plasmin degradation product of stable fibrin, stable antibody fibrin can be obtained using JIF-23 antibody alone.
  • the latex reagent for measuring plasmin degradation products of stable fibrin using the JIF-23 antibody is widely used in the clinical field.
  • a second antibody recognizing a site different from the first antibody is combined with the first antibody to construct a detection system for a stable fibrin plasmin degradation product.
  • the second antibody is not particularly limited as long as it is an antibody that specifically recognizes the amino acid sequence newly exposed by plasmin digestion of stable fibrin or its three-dimensional structure.
  • Antibodies that specifically recognize eg, monoclonal antibodies No. 36-1, No. 1—1, No.
  • Antibodies that specifically recognize E domain neoantigen that can be used as the second antibody are stable fibrin, fibrinogen, and fibrinogen.
  • anti-E domain neoantigen antibody that specifically recognize E domain neoantigen
  • fibrinogen a monoclonal antibody that reacts with neoantigen of the E domain that does not react with plasmin degradation product of the stabilized domain, but appears by plasmin degradation of stabilized fipurin
  • Reference Example 1 The antibodies having reaction specificities described in Table 1 (for example, monoclonal antibodies No. 36-1, No. 1-1, No. 5-4) can be used.
  • Antibody No. 36-1 reacts with plasmin degradation product of stabilized fibrin but does not react with granulocyte elastase degradation product of stable fibrin.
  • one of the monoclonal antibodies is used in a state of being bound to magnetic particles, and the other monoclonal antibody is used in an enzyme-labeled state.
  • the magnetic particles used in the present invention are not particularly limited as long as they have magnetism and can be used as a solid phase carrier for immune reaction.
  • the composition of the particles can be composed of a polymer impregnated with a magnetizable material.
  • the surface structure of the particle is not particularly limited as long as it can immobilize the antibody. However, when the antibody is immobilized by physical adsorption, the particle surface property may be hydrophobic. If the antibody is immobilized by a preferred chemical bond, a functional group (e.g.
  • the particle size of the magnetic particles can be, for example, 0.1 to 10 / ⁇ ⁇ , preferably 1 to 5 / ⁇ ⁇ .
  • a known technique can be applied to the method of binding the antibody to the magnetic particles. For example, it is carried out by a physical adsorption method using a hydrophobic interaction or a chemical bonding method.
  • a chemical bonding method for example, a carboxyl group, a succinimide group, an isothiocyanate group, a chlorosulfonyl group, a maleimide group, a hydrazide group, or an amino group can be used.
  • the carboxyl group can be activated using carbodiimide and bound to the amino group of the antibody.
  • the succinimide group, isothiocyanate group, or chlorosulfo group can be directly reacted with an antibody amino group.
  • the maleimide group can be reacted with, for example, an SH group, and an SH group is introduced into an antibody using an S group introduction reagent, or the antibody is reduced and the S group at its hinge site is used. Can be combined.
  • the hydrazide group can be reacted with an antibody sugar chain.
  • the amino group can be reacted with an amino group of an antibody by converting the amino group on the particle into an aldehyde group using dartalaldehyde.
  • the enzyme used for labeling the monoclonal antibody in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme to which chemiluminescence can be applied, and a highly sensitive analysis is possible.
  • the substrate is luminol
  • peroxidase can be used as the labeling enzyme
  • the substrate is luminogen PPD
  • alkaline phosphatase can be used as the labeling enzyme.
  • alkaline phosphatase is used as an enzyme
  • 1,2-dioxetane is used as a substrate from the viewpoint of S ZN ratio.
  • CDP Star is hydrolyzed by alkaline phosphatase and emits light through an intermediate, like AMPPD and CSPD, but its emission intensity is reported to be much stronger than AMPPD and CSPD [Bronstein, I ., Edward s, B., Voyta, J., 1,2— Dioxetanes: Novel
  • Known methods can be used for enzyme labeling of antibodies.
  • a method in which the amino group of the enzyme and the amino group of the antibody are cross-linked using dartalaldehyde, or a functional group (for example, a succinimide group or an isothiocyanate group) that can be bound to the amino group is used as the amino group of the enzyme.
  • a maleimide group introduced through the amino group of the enzyme, and the SH group at the hinge site of the antibody and the like and the enzyme is a horseradish peroxidase
  • a method of converting a sugar chain into an aldehyde group with periodic acid and binding it to an amino group of an antibody is converting a sugar chain into an aldehyde group with periodic acid and binding it to an amino group of an antibody.
  • the immunological analysis method of the present invention is, for example, a manual (manual) or an automated system, as in the known immunological analysis method, except that a combination of specific monoclonal antibodies is used. And can be implemented. For example, a test sample or standard sample, a monoclonal antibody bound to magnetic particles, and an enzyme-labeled monoclonal antibody are brought into contact in a reaction tube, and then incubated at a predetermined temperature (for example, 30 to 40 ° C.). .
  • a predetermined temperature for example, 30 to 40 ° C.
  • test samples that can be analyzed according to the present invention include biological samples that may contain a plasmin degradation product of stable fibrin, such as blood, plasma, serum, or urine.
  • the present inventor used JIF-23 antibody as the first antibody and No. 36-1 antibody (an antibody recognizing the structure of the E domain exposed by digestion with brassin) as the second antibody, The correlation with conventional latex reagents was evaluated by measuring plasmin degradation products of stable fibrin in human plasma.
  • the specificity of the measurement system constructed by combining the antibody that recognizes the structure of the E domain exposed by plasmin digestion with the JIF-23 antibody is different from the measurement system constructed by the JIF-23 antibody alone.
  • the blood Differences in measuring plasmin degradation product of stabilized I spoon fibrin and considered et be those not in.
  • phase 1 basic unit DDZE or fragment D dimer (DD) and fragment E is in a state of degradation
  • phase 3 Fluorancis, Shi. W., Marder, VJ, Barlow, uH, Plasmic degradation of crosslinked fibrin, Journal of Clinical investigation; 66, 1033-1043, 1980
  • Xuyoshio, Kohno Isao, Sakurai Tablets, Michio Matsuda monoclonal antibody (JIF-23) that recognizes the structure of the amino terminal of fragment D Analysis of plasmin degradation products of fibrin
  • Example 1 Stabilized fibrin plasmin degradation product by automated system >>
  • an alkaline phosphatase labeled product of the Fab 'fraction of the monoclonal antibody JIF-23 was prepared by repeating the above procedure except that the JIF-23 antibody was used as a comparative alkaline phosphatase labeled antibody.
  • Particles 1% magnetic particles, 50 L were mixed and reacted at 37 ° C for 5 minutes. Next, using a washing solution containing Triton X-100 as the main component, sample components that did not contribute to the immune reaction and excess labeled antibody were removed, and then magnetic particles bound with the immune complex were removed. It was mixed with CDP-Star (Tropics) (100 L), which is a chemiluminescence substrate, and the luminescence after 1 minute was measured with a photomultiplier.
  • CDP-Star Tropics
  • Fig. 1 shows the measurement method of the present invention (black circle in Fig. 1) using a combination of JIF-23 antibody-immobilized ferromagnetic particles and alkaline phosphatase-labeled No. 36-1 antibody, and JIF-23 antibody-immobilized magnetic particles.
  • Fig. 2 shows the results of measurement of a dilution series of stable fibrin plasmin digest in two types of measurement systems (white circles in Fig. 1) for comparison with a combination of alkaline phosphatase standard milF-23 antibody. .
  • the FEU is about 9 times higher than the FEU, and the increased sensitivity also leads to shortened analysis time.
  • Fig. 2 shows three measurement methods of the present invention, namely, JIF-23 antibody-immobilized magnetic particles and Measurement method of the present invention by combination with alkaline phosphatase labeled No. 36-1 antibody (black circle in Fig. 2), JIF-23 antibody-immobilized magnetic particles and alkaline phosphatase labeled No. 1-1 antibody combined with the present invention
  • the measurement method white square in Fig. 2
  • the measurement method of the present invention (white triangle in Fig. 2) using a combination of JIF-23 antibody-fixed magnetic particles and alkaline phosphatase labeled No. 5-4 antibody.
  • the measurement results of the dilution series of zyfibrin brassine degradation products are shown.
  • any combination of antibodies by using an antibody that recognizes neoantigen in the E domain of stable fibrin as an alkaline phosphatase-labeled antibody, a reactivity similar to that of No. 36-1 can be obtained. Therefore, the use of an antibody recognizing neoantigen in the E domain of a stable fibrin degradation product used for an alkaline phosphatase-labeled antibody shows high universality.
  • the outline is that fibrinogen is treated with plasmin in the presence of Ca 2+ or EGTA! ⁇
  • the fibrinogen degradation product after reaction for 30 minutes, 60 minutes, and 24 hours is converted into dithiothreitol (DTT).
  • DTT dithiothreitol
  • the sample was subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis in the presence or absence, and Western blotting using No. 36-1 antibody was performed. The above procedure was repeated for the plasmin degradation product, fragment D and fragment E of stable fibrin instead of the fibrinogen digest.
  • the immunological analysis method of the present invention can be applied to various diagnoses such as DIC, DVT, and diagnosis of pulmonary embolism.

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Abstract

　（ａ）安定化フィブリン、フィブリノーゲン、及びフィブリノーゲンのプラスミン分解物とは反応しないが、安定化フィブリンのプラスミン分解により出現するＤドメインのネオアンチゲンと反応するモノクローナル抗体と、（ｂ）前記モノクローナル抗体（ａ）とは異なる部位を認識することにより、安定化フィブリンのプラスミン分解物と特異的に反応するモノクローナル抗体との組合せを使用し、前記モノクローナル抗体（ａ）又は（ｂ）の一方が磁性粒子に結合しており、もう一方のモノクローナル抗体が酵素標識されており、前記酵素の基質としてケミルミネッセンス基質を用いることを特徴とする、安定化フィブリンのプラスミン分解物の免疫学的分析方法を開示する。

Description

明 細 書
安定ィヒフイブリンのプラスミン分解物の免疫学的分析方法
技術分野
[0001] 本発明は、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物の免疫学的分析方法、より具体的 には、ケミルミネッセンスによる安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物の高感度アツセィ 法に関する。
本明細書における用語「分析」には、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出 」と、分析対象物質の量又は活性を定量的又は半定量的に決定する「測定」とが含ま れる。
背景技術
[0002] ヒト安定ィ匕フイブリンの各種プロテアーゼによる分解物は、臨床的診断法における 診断マーカーとして有用である。例えば、ヒト安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物、す なわち、基本単位である P—DDZE、並びにそのポリマー又はオリゴマー（別称とし て、例えば、「D— Dダイマー」又は「DDZE複合体」と称されることがある）は、汎発 性血管内凝固症候群 (DIC)の診断マーカーとして広汎に使用されている。生体試 料中に含有される安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物の測定においては、安定ィ匕フ イブリンのプラスミン分解物に特異的なモノクローナル抗体を用 ヽた感作ラテックスに よる凝集反応が一般的に使用されている。
[0003] 一方、下肢深部静脈血栓症 (DVT)が近年注目されて 、る。国内ではあまり注目さ れてはいなかったが、生活様式の欧米化につれて増加してきた疾患である。血栓症 の状態や血栓の有無を診断あるいは予測することは極めて難しいが、 DVT診断に 最も信頼がおける検査は、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物である（非特許文献 1 及び 2)。凝固過程によって架橋 (crosslink)を受けた安定ィ匕フイブリンは、プラスミン 分解を受けると、 P— DD/Eを基本単位とする p— DD/Eのポリマー又はオリゴマー 、更には P— DDZEとなるので、 P— DDZE又はそのポリマー若しくはオリゴマーを 検出することで、血栓形成と二次線溶の動態を知ることができる。そのため、安定ィ匕 フイブリンのプラスミン分解物を測定することは、血栓の存在を確認する上で極めて 有用である。
[0004] 近年、エコノミークラス症候群として知られる肺血栓塞栓症（PE)がクローズアップさ れている。 PEの多くは、深部静脈血栓 (DVT)が下大静脈、心臓右心系を介して肺 動脈に到達し、血流を途絶させることにより発症するとされている。安定化フイブリン のプラスミン分解物の測定は、 DVTに加えて PEの患者を評価することにお 、て有用 であるとの報告がある (非特許文献 3, 4)。
[0005] 安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物を特異的に検出することのできる公知のモノク ローナル抗体として、モノクローナル抗体 JIF— 23が知られている（非特許文献 5)。こ の抗体は、ヒト安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物の D ドメインにおける γ鎖の Ν末
1A
端のアミノ酸配列 63— 85が遊離したときに露出される Dドメインの Ν末端の立体構 造を認識することが知られている。この JIF— 23抗体を使用して、生体試料中に存在 する安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物を特異的に分析することのできる測定方法 を用いることにより、血栓形成と二次線溶の動態を容易に知ることができる。そのよう な測定方法としては特に限定されないが、例えば、ラテックス凝集法や ELISA法が 挙げられる。
[0006] 従来から臨床の現場で広く使用されている JIF— 23抗体を用いた安定ィ匕フイブリン のプラスミン分解物測定法として、ラテックス凝集法が知られている。安定化フイブリン のプラスミン分解物の値は、非特許文献 6によれば、健常者で 0. 4 gZmL FEU であり、非特許文献 7によれば、 DIC患者で 15. 2± 18. 5 gZmLである。従って、 JIF— 23抗体を用いたラテックス凝集反応 (検出感度 =約 45ngZmL)でも充分検 出することができるものであり、実際に臨床の現場で汎用されている。一方、 DVTの 場合の臨床カットオフ値は、非特許文献 8によれば、 0. 5 /z gZmL FEUと報告され ている。従って、 DIC診断に比べて健常者の値とのわずかな変動をみる必要があり、 正常値域の安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物を正確に定量することができる、より 高感度な測定法の開発が望まれている。
[0007] 安定ィ匕フイブリン分解物の Dドメインのネオアンチゲンを認識する抗体を用いる ELI SA法として、例えば、ミニヴアイダス (ビメリュー社)が公知である（非特許文献 8, 11) 。非特許文献 9によれば、ラテックス凝集法に比べて ELISAの方が感度が高いため 、 DVT診断に有用であると報告されており、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物の 測定法として、高感度測定が可能な ELISA法が受け入れられつつある。例えば、前 記ミニヴアイダスの検出感度は約 45ngZmL FEUである。
なお、前記の各値及び単位は、各非特許文献の記載に基づくものであり、単位「 g/mL FEU」及び「 μ gZmL」は、下記換算式：
Figure imgf000005_0001
により相互変換可能である (但し、前記数値「2」は概算値である）（非特許文献 10)。 非特許文献 1：「トロンボシス ·アンド ·へモスタシス (Thrombosis and Haemostasis)」，（ ドイツ）， 1994年， 71卷， p.1-6
非特許文献 2 :「クオリティ 'ジャーナル'ォブ 'メデイシン（Quality Journal of Medicine) J , (英国）， 1997年， 90卷， p.437-442
非特許文献 3：「トロンボシス ·アンド ·へモスタシス (Thrombosis and Haemostasis)」，（ ドイツ）， 1999年， 81卷， ρ.493- 497
非特許文献 4：「トロンボシス ·アンド ·へモスタシス (Thrombosis and Haemostasis)」，（ ドイツ） , 2000年, 83卷, 191-198
非特許文献 5 :「エタセプタ 'メディ力，アムステルダム（Excepta Medica, Amsterdam)」 , (オランダ） , 1990年， ρ.43-48
非特許文献 6：「ユー ·ケー ·ナショナル 'イクスターナル ·クオリティ ·アセスメント'スキ ーム 'フォ^ ~ ·ブラッド 'コアグレーシヨン，リポート'オン'サーベイ 142 (U.K. National External Quality Assessment scheme for Bloodし oagulation, Report on Survey 142) J , (英国）， 2004年 5月
非特許文献 7 :「ァニュールス 'デ'バイオロジ一'クリューク（ANNALES DE BIOLOGI E CLINIQUE)」， （フランス）， 1988年， 46卷， p.730- 733
非特許文献 8：「ピオメリュ一'バイダス ·ディーダイマ一'パッケージ ·インサート（Biome rieux Vidas D— Dimer Package Insert)」， （米国）， 2003年 9月， 008120—4
非特許文献 9 :「アナルズ 'ォブ 'インターナル 'メデイシン（Annals of Internal Medicine ) J , (米国）, 2004年， p.589-602
非特許文献 10 :「ジャーナル'ォブ 'トロンボシス 'アンド'へモスタシス（Journal of Thro mbosis and Haemostasis)」， （英国）， 2005年， p.377— 384
非特許文献 11：「ブリティッシュ ·ジャーナノレ ·ォブ ·へマトロジー（British Journal of Ha ematology) J , (英国）， 2004年， p.15- 25
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明の課題は、より高感度な、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物の分析方法を 提供することにある。従来の高感度分析法より更に高感度化を行うことにより、分析時 間の短縮も可能となる。
課題を解決するための手段
[0010] 前記課題は、本発明による、（a)安定ィ匕フイブリン、フイブリノ一ゲン、及びフイブリノ 一ゲンのプラスミン分解物とは反応しないが、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解により 出現する Dドメインのネオアンチゲンと反応するモノクローナル抗体と、 (b)前記モノク ローナル抗体 (a)とは異なる部位を認識することにより、安定ィ匕フイブリンのプラスミン 分解物と特異的に反応するモノクローナル抗体との組合せを使用し、前記モノクロ一 ナル抗体 (a)又は (b)の一方が磁性粒子に結合しており、もう一方のモノクローナル 抗体が酵素標識されており、前記酵素の基質としてケミルミネッセンス基質を用いるこ とを特徴とする、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物を免疫学的に分析する方法によ り解決することがでさる。
[0011] 本発明の免疫学的分析方法の好ま ヽ態様によれば、前記モノクローナル抗体 (b )力 安定ィ匕フイブリン、フイブリノ一ゲン、及びフイブリノ一ゲンのプラスミン分解物と は反応しな 、が、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解により出現する Eドメインのネオア ンチゲンと反応するモノクローナル抗体である。
本発明の免疫学的分析方法の別の好ましい態様によれば、（1)安定ィ匕フイブリンの プラスミン分解物を含有する可能性のある被検試料と、前記モノクローナル抗体 (a) と、前記モノクローナル抗体 (b)とを接触させる工程、（2)安定ィ匕フイブリンのプラスミ ン分解物を介して磁性粒子結合モノクローナル抗体と免疫複合体を形成した酵素標 識モノクローナル抗体と、前記免疫複合体を形成しな力つた酵素標識モノクローナル 抗体とを分離する工程、 (3)前記工程で分離した磁性粒子結合モノクローナル抗体 安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物 酵素標識モノクローナル抗体免疫複合体に
、ケミルミネッセンス基質を添加して発光させる工程、並びに (4)得られた発光シグナ ルを分析する工程
を含む。
本発明の免疫学的分析方法の更に別の好ま 、態様によれば、ケミルミネッセンス 基質が 1, 2—ジォキセタンである。
本発明の免疫学的分析方法の更に別の好ましい態様によれば、標識酵素がアル カリホスファターゼである。
[0012] 本発明は、（a)安定ィ匕フイブリン、フイブリノ一ゲン、及びフイブリノ一ゲンのプラスミ ン分解物とは反応しないが、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解により出現する Dドメィ ンのネオアンチゲンと反応するモノクローナル抗体、（b)前記モノクローナル抗体（a) とは異なる部位を認識することにより、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物と特異的 に反応するモノクローナル抗体、並びに (c)ケミルミネッセンス基質を含み、前記モノ クローナル抗体 (a)又は (b)の一方が磁性粒子に結合しており、もう一方のモノクロ一 ナル抗体が、前記ケミルミネッセンス基質を基質とする酵素で標識されて!ヽることを特 徴とする、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物の免疫学的分析用キットに関する。
[0013] 本発明は、前記免疫学的分析方法、あるいは、前記免疫学的分析用キットにより、 被検試料に含まれる、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物を分析することを特徴とす る、下肢深部静脈血栓症及び Z又は肺塞栓症の検出方法 (診断方法)に関する。 発明の効果
[0014] 本発明の免疫学的分析方法によれば、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物を高感 度及び高特異的に分析することができ、従来の DICだけでなぐ DVT及び Z又は肺 塞栓症の診断にも適用することができる。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1HIF— 23抗体固定ィ匕磁性粒子とアルカリホスファターゼ標識 No. 36— 1抗体と の組合せによる本願発明の測定方法 (黒丸）と、 JIF— 23抗体固定ィ匕磁性粒子とァ ルカリホスファターゼ標 milF— 23抗体との組合せによる比較用測定方法（白丸）の 2 種の測定系にお 、て、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物の希釈列を測定した結果 を示すグラフである。
[図 2 IF— 23抗体固定ィ匕磁性粒子とアルカリホスファターゼ標識 No. 36— 1抗体と の組合せによる本願発明の測定方法 (黒丸）、 JIF— 23抗体固定ィ匕磁性粒子とアル カリホスファターゼ標識 No. 1 1抗体との組合せによる本願発明の測定方法（白四 角）、及び JIF— 23抗体固定ィ匕磁性粒子とアルカリホスファターゼ標識 No. 5— 4抗 体との組合せによる本願発明の測定方法（白三角）の 3種の測定系において、安定 化フイブリンのプラスミン分解物の希釈列を測定した結果を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 本明細書において、用語「安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物」とは、安定化フイブ リンをプラスミンで消化することにより生成する分解物であって、 1又は複数個の基本 単位 Γρ DD/EJから実質的になる分解物を意味する。「安定ィ匕フイブリンのプラス ミン分解物」には、例えば、前記基本単位 1個からなる p— DDZE、あるいは、前記 基本単位複数個からなる p— DD/Eのポリマー又はオリゴマーが含まれる。「安定化 フイブリンのプラスミン分解物」の別称として、例えば、「D— Dダイマー」又は「DDZ E複合体」力使用されることがある。
[0017] なお、本明細書において、プラスミンで消化されることにより生成する分解物を、そ の分解物の名称の前に「P 」を付与することによって表わすことがある。同様に、顆 粒球エラスターゼで消化されることにより生成する分解物を、その分解物の名称の前 に「e―」を付与することによって表わすことがある。
[0018] 本発明 (本発明の免疫学的分析方法及び本発明の免疫学的分析用キットを含む） では、モノクローナル抗体として、ェピトープの異なる 2種類のモノクローナル抗体を 使用する。なお、本明細書における用語「抗体」には、抗体それ自体だけでなぐそ の抗体断片が含まれる。前記抗体断片としては、例えば、 Fab, Fab'、 F (ab' ) 、又
2 は Fvを用いることができる。サンドイッチィムノアッセィによりヒト安定ィ匕フイブリンのプ ラスミン分解物を特異的に検出するための抗体としては、安定ィ匕フイブリン、フイブリノ 一ゲン、又はフイブリノ一ゲンのプラスミン分解産物とはサンドイッチ免疫複合体を形 成しないが、安定ィ匕フイブリンがプラスミンによって消化されたフイブリン分解産物に 出現する部位 (すなわち、ネオアンチゲン)をェピトープとし、サンドイッチ免疫複合体 を形成することのできる特徴を有することが必須条件である。
[0019] 本発明では、一方のモノクローナル抗体として、安定ィ匕フイブリン、フイブリノ一ゲン 、及びフイブリノ一ゲンのプラスミン分解物とは反応しないが、安定ィ匕フイブリンのブラ スミン分解により出現する Dドメインのネオアンチゲンと反応するモノクローナル抗体（ 以下、第 1抗体又は抗 Dドメインネオアンチゲン抗体と称する）を使用し、もう一方の モノクローナル抗体として、前記第 1抗体とは異なる部位を認識することにより、安定 化フイブリンのプラスミン分解物と特異的に反応するモノクローナル抗体 (以下、第 2 抗体と称する)を使用する。
[0020] 本発明で使用する第 1抗体、すなわち、抗 Dドメインネオアンチゲン抗体は、安定ィ匕 フイブリンのプラスミン分解により出現する Dドメインのネオアンチゲンを認識するモノ クローナル抗体である限り、特に限定されるものではないが、例えば、安定化フィプリ ンのプラスミン分解により、 γ鎖の Ν末端から第 63番目〜第 85番目のアミノ酸配列か らなる断片力 γ鎖力 遊離したときに出現する Dドメインのネオアンチゲンを認識す るモノクローナル抗体 (例えば、モノクローナル抗体 JIF— 23)を用いることができる。
[0021] JIF— 23抗体は、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物を特異的に検出することので きるモノクローナル抗体として周知のモノクローナル抗体である（例えば、 Matsuda, M ., Terukina, S., Yamazumi, K., Maekawa, H., Soe, G., A
monoclonal antibody that recognizes the NH2— terminal conformation of fragment D, Excerpta Medica, Amsterdam; 1990, 43-38)。また、 JIF— 23抗体は、安定化フィ ブリンのプラスミン分解物と反応するだけでなぐ安定ィ匕フイブリンの顆粒球ェラスタ ーゼ分解物（すなわち、基本単位である e— DDZE、並びにそのポリマー又はオリゴ マー）とも反応する。安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物の基本単位である p— DD /Eの分子内には、 JIF— 23抗体のェピトープが 2箇所存在するため、 JIF— 23抗体 を単独で用いて安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物を特異的に検出可能であり、 JIF —23抗体を用いた安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物測定用ラテックス試薬は、臨 床の現場で広く使用されて 、る。
[0022] 本発明では、第 1抗体 (例えば、 JIF— 23抗体)とは異なる部位を認識する第 2抗体 を、第 1抗体と組み合わせて安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物の検出系を構築す る。前記第 2抗体としては、安定ィ匕フイブリンのプラスミン消化により新たに露出された アミノ酸配列又はその立体構造を特異的に認識する抗体であれば特に限定されな いが、例えば、 Eドメインのネオアンチゲンを特異的に認識する抗体 (例えば、モノク ローナル抗体 No. 36 - 1, No. 1— 1、 No. 5—4)、モノクローナル抗体 DD3B6Z 22 (American Diagnostica； Thrombosis Research, 1983年, 31^, p87— 96又 i Drug Coagulation & brinolysis, 1997年， 8卷， p87- 96)、モノクローナル抗体 MA8D3 (IL など； Thrombosis
and Haemostasis, 1989年， 58卷， pl024- 1029)、モノクローナル抗体 P10B5E12C9 (Biomerieux； Clinical
Chemistry, 1996年， 42卷， p410- 415)、モノクローナル抗体 P2C5A10 (Biomerieux ; Clinical Chemistry, 1996年， 42卷， p410- 415)を用いることができる。
[0023] 第 2抗体として用いることができる、 Eドメインのネオアンチゲンを特異的に認識する 抗体 (以下、抗 Eドメインネオアンチゲン抗体と称する）は、安定ィ匕フイブリン、フイブリ ノーゲン、及びフイブリノ一ゲンのプラスミン分解物とは反応しないが、安定化フィプリ ンのプラスミン分解により出現する Eドメインのネオアンチゲンと反応するモノクローナ ル抗体である限り、特に限定されるものではないが、例えば、参考実施例 1の表 1に 記載の反応特異性を有する抗体 (例えば、モノクローナル抗体 No. 36— 1、 No. 1 - 1, No. 5— 4)を用いることができる。 No. 36— 1抗体は、安定化フイブリンのプラ スミン分解物と反応するが、安定ィ匕フイブリンの顆粒球エラスターゼ分解物とは反応 しない。
[0024] 本発明では、モノクローナル抗体の一方を磁性粒子に結合させた状態で使用し、も う一方のモノクローナル抗体を酵素標識した状態で使用する。本発明で用いる磁性 粒子は、磁気を有し、免疫反応の固相担体として使用可能であるものであれば特に 限定されないが、例えば、以下のものを用いることができる。粒子の組成としては、可 磁ィ匕物質を含浸させたポリマーから構成することができる。粒子の表面構造にっ 、て も、抗体を固定ィ匕させることのできるものであれば特に限定されないが、物理吸着に より抗体を固定化させる場合は粒子表面の特性が疎水性であることが好ましぐ化学 結合により抗体を固定ィ匕させる場合は、粒子表面に官能基 (例えば、カルボキシル 基、サクシンイミド基、イソチオシァネート基、クロロスルホ -ル基、マレイミド基、ヒドラ ジド基、アミノ基、又は SH基など）を導入した構造が好ましい。磁性粒子の粒径は、 例えば、 0. 1〜10 /ζ πιのものを用いることができ、好ましくは 1〜5 /ζ πιである。
[0025] 磁性粒子に抗体を結合する方法は、公知の技術を適用することができる。例えば、 疎水性相互作用を利用した物理吸着法又は化学結合法により行われる。化学結合 法により抗体を結合させる場合は、例えば、カルボキシル基、サクシンイミド基、イソチ オシァネート基、クロロスルホニル基、マレイミド基、ヒドラジド基、又はアミノ基を利用 することができる。前記のカルボキシル基の場合、カルボジイミドを用いてカルボキシ ル基を活性化させ、抗体のァミノ基と結合させることができる。前記のサクシンイミド基 、イソチオシァネート基、又はクロロスルホ -ル基は、抗体のァミノ基と直接反応させる ことができる。前記のマレイミド基は、例えば、 SH基と反応させることができ、抗体に S Η基導入試薬を用いて SH基を導入するか、又は抗体を還元してそのヒンジ部位の S Η基を利用して結合させることができる。前記のヒドラジド基は、抗体の糖鎖と反応さ せることができる。前記アミノ基は、ダルタルアルデヒドを用いて粒子上のアミノ基をァ ルデヒド基に変換させ、抗体のァミノ基と反応させることができる。
[0026] 本発明でモノクローナル抗体を標識するのに使用する酵素は、ケミルミネッセンスを 適用可能な酵素である限り、特に限定されるものではなぐ高感度の分析が可能であ る。例えば、基質がルミノールである場合、標識酵素としてペルォキシダーゼを用い ることができ、基質がルミゲン PPDである場合、標識酵素としてアルカリホスファタ一 ゼを用いることができる。特に酵素としてアルカリホスファターゼを用いて、基質として 1, 2—ジォキセタン [より具体的には、 CDP— Star (トロピックス社）]を用いることが S ZN比の面からも有用で好ましい。 CDP— Starは、 AMPPDや CSPDと同様にアル カリホスファターゼにより加水分解され、中間体を経て発光するが、その発光強度は AMPPDや CSPDに比べて非常に強いことが報告されている [Bronstein, I., Edward s, B., Voyta, J.し., 1,2— Dioxetanes: Novel
Chemiluminescent Enzyme Substrates. Application to Immunoassays, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence; 4, 99—丄丄丄 (1989) ; Beck, S.,
Koster, H., Applications of Dioxetane Chemiluminescent Probes to Molecular Biology, Analytical Chemistry; 62, 2258-2270 (1990) ;Tizard, R., Cate,
R.L., Ramachandran, K.L., Wysk, M., Voyta, J.C., Murphy, O.J., Bronstein, I.,
Imaging of DNA Sequences with Chemiluminescence, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.; 8
7,
4514-4518 (1990) ;又は Bronstein, I., Voyta, J.C., Lazzari, K.G., Murphy, O., Edwards, B., Kricka, L.J., Rapid and Sensitive Detection of DNA in Southern Blots with Chemiluminescence, BioTechniques; 8, 310-314 (1990)]。また、 CDP— S tarによる化学発光の立ち上がりは、 AMPPDや CSPDに比べて早ぐその発光は 2 4時間以上持続するため、アルカリホスファターゼを用いた高感度分析法の基質とし て優れている。
[0027] 抗体への酵素標識は、公知方法を用いることができる。例えば、酵素のァミノ基と抗 体のアミノ基をダルタルアルデヒドを用いて架橋する方法、ァミノ基と結合可能な官能 基 (例えば、サクシンイミド基、イソチオシァネート基など）を酵素のアミノ基を介して導 入し、抗体のァミノ基と結合させる方法、酵素のアミノ基を介してマレイミド基を導入し 、抗体のヒンジ部位の SH基などを利用して結合させる方法、酵素が西洋わさびペル ォキシダーゼなどの糖タンパク質である場合、過ヨウ素酸により糖鎖をアルデヒド基に 変換し、抗体のァミノ基と結合させる方法などが挙げられる。
[0028] 本発明の免疫学的分析方法は、特定のモノクローナル抗体の組合せを使用するこ と以外は、従来公知の免疫学的分析方法と同様に、例えば、マニュアル (手動）又は 、 自動化システムを用いて、実施することができる。例えば、被検試料又は標準試料 と、磁性粒子に結合したモノクローナル抗体と、酵素標識したモノクローナル抗体とを 反応チューブ内で接触させ、次いで、所定温度 (例えば、 30〜40°C)でインキュベー トする。前記反応チューブの外壁に磁石を接触させることにより、抗体結合磁性粒子 を反応チューブ内壁に捕獲した状態で、反応チューブ内の任意の洗浄を行い、次い で、反応チューブ内にケミルミネッセンス基質を添加し発光させる。得られたシグナル を検出し、被検試料又は標準試料中に存在する安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物 の量を分析する。磁性粒子を用いることで、インキュベーション後の試料液との分離、 洗浄液との分離を磁石を用いて正確に行えるため、ブランクの低減等の面でも有利 である。本発明により分析することのできる被検試料としては、安定ィ匕フイブリンのプ ラスミン分解物を含む可能性のある生体試料、例えば、血液、血漿、血清、又は尿な どを挙げることができる。
[0029] 本発明者は、第 1抗体として JIF— 23抗体を、第 2抗体として No. 36— 1抗体 (ブラ スミン消化により露出される Eドメインの構造を認識する抗体)をそれぞれ使用し、従 来のラテックス試薬との相関性をヒト血漿中の安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物の 測定により評価した。 (1)「JIF— 23抗体単独で構築されたラテックス凝集法」と「JIF —23抗体単独で構築された抗体固定ィ匕磁性粒子とアルカリホスファターゼ標識抗体 を用いた測定系」、及び (2)「JIF— 23抗体単独で構築されたラテックス凝集法」と「JI F— 23抗体固定ィ匕磁性粒子とプラスミン消化後の Eドメインを認識するモノクローナ ル抗体のアルカリホスファターゼ標識物を用いた測定系」では、安定ィ匕フイブリンのプ ラスミン分解物を含むヒト血漿 (50検体)を検体群として用いた相関試験における回 帰直線の傾き、切片、及び相関係数に優位な差は認められないことから、 JIF— 23抗 体単独で構築された測定系に対して、プラスミン消化により露出される Eドメインの構 造を認識する抗体を JIF— 23抗体と組み合わせて構築された測定系の特異性は、血 漿中の安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物を測定する上では差は無いものと考えら れる。
[0030] Francisらの報告によると、イン'ビボ（in vivo)では、血流及び α プラスミンインヒビ
2
ターの作用により、安定ィ匕フイブリンのプラスミンによる分解は、フェーズ一 4 [基本単 位 DDZE、又はフラグメント D二量体 (DD)及びフラグメント Eまで分解が進んだ状 態]まで進まず、フェーズ 3 (基本単位 DDZEのポリマー又はオリゴマー）で止まつ て ヽることを推測し、徐らはそれを裏付けるデータを報告して ヽる [Francis, し. W.， Marder, V.J., Barlow, u.H., Plasmic degradation of crosslinked fibrin, Journal of Clinical investigation; 66, 1033-1043, 1980 ;徐吉夫、河野功、桜井錠治 、松田道生，フラグメント Dのァミノ末端の構造を認識するモノクローナル抗体 (JIF— 23)を用いたフイブリンのプラスミン分解産物の解析，
血栓止血学会誌， 5, 105-113, 1994] oこれらの報告は、前記相関試験（1)及び（2) の相関性に差がな 、と 、う結果を強く示唆して 、る。 実施例
[0031] 以下、実施例によって本発明を具体的に説明する力 これらは本発明の範囲を限 定するものではない。
[0032] 《実施例 1：自動化システムによる安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物のアツセィ》
(1)抗 Dドメインネオアンチゲンモノクローナル抗体 JIF— 23固定ィ匕磁性粒子の作製 JIF— 23抗体のペプシン消化による F (ab ' ) 画分の作製は、松屋らの報告（Matsuy
2
a, T., Tashiro, Hoshino, N., Shioata, N., Nagasaki, Y.,
Kataoka, K., A core-shell-type fluorescent nanosphere possessing reactive PEG tethered chains on the surface for zeptomole detection of protein in
time-resolved fluorometric immunoassay; Anal. Chem., 75, 6124-6132, 2003)に準じ て行った。
[0033] JSR社製カルボキシル基導入磁性粒子（粒径 2. 5 m)の 50mmolZL - MES緩 衝液（pH6. 5)の 1%懸濁液（lOmL)へ、 lOOmgZmLカルボジイミド水溶液（lmL )を添加し、室温で 1時間転倒混和した。 14000rpmで 15分間遠心分離を行って磁 性粒子を回収し、 50mmol/L— MES緩衝液（pH6. 5)で 2回洗浄した。 50mmol ZL— MES緩衝液 (pH6. 5)で調製し IF— 23抗体 F (ab，） 溶液（200 gZlO
2
mL)と、前記磁性粒子とを混合し、室温で 1時間転倒混和した。その後、 14000rpm で 15分間遠心分離を行って未反応の抗体溶液を除去し、 0. lmol/L-Tris -HC 1 (ρΗ8. 0)を用いて調製した 0. 3%ゥシ血清アルブミン溶液（lOmL)をカ卩え、室温 で 30分間転倒混和した。 14000rpmで 15分間遠心分離を行ってゥシ血清アルブミ ン溶液を除去し、 0. 01%ツイーン (Tween)— 20を含む 10mmol/L— Tris— HC1 (pH8. 0)緩衝液で抗体固定ィ匕磁性粒子を洗浄した後、以後の実験に供した。
[0034] (2)抗 Eドメインネオアンチゲンモノクローナル抗体 No. 36— 1、 No. 1— 1、又は No . 5—4のアルカリホスファターゼ標識物の作製
プラスミン消化後の Eドメインを認識する No. 36— 1抗体、 No. 1—1抗体、又は No . 5— 4抗体の Fab，画分の作製は、松屋らの報告（Matsuya, T., Tashiro, S.， Hoshin o, N., Shibata, N., Nagasaki, Y.,
Kataoka, K., A core-shell-type fluorescent nanosphere possessing reactive PEG tethered chains on the surface for zeptomole detection of protein in time-resolved fluorometric immunoassay; Anal. Chem., 75, 6124-6132, 2003)に準じ て行った。モノクローナル抗体 No. 36 - 1, No. 1— 1、 No. 5— 4の反応性は、後述 の参考実施例 1に示すとおりである。
[0035] 得られたモノクローナル抗体 No. 36— 1、 No. 1— 1、又は No. 5— 4の Fab，画分 へのアルカリホスファターゼの標識は、石川らの報告 [Ishikawa, E., Imagawa, M., Ha snida, oshitake, S., Hamaguchi,
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New York, 1988]に準じて実施した。
[0036] また、比較用のアルカリホスファターゼ標識抗体として、 JIF— 23抗体を用いること 以外は、前記操作を繰り返すことにより、モノクローナル抗体 JIF— 23の Fab'画分の アルカリホスファターゼ標識物を調製した。
[0037] (3)安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物の調製
安定化フイブリンのプラスミン分解物の調製は、 Olexaらの報告 [Olexa, S.A., Budz ynski, A.Z., Primary soluble plasmic degradation
product of human cross-linked fibrin. Isolation and stoicniometry of the (DD)E complex; Biochemistry, 18, 991-995, 1979]に従って調製した。また、安定化フイブリ ンのプラスミン分解物が更に分解して生じるフラグメント D及びフラグメント Eは、 Masc iらの報告 [Masci,
P.P., Whitaker, A.N., Winzor, D.J., A simple chromatographic procedure for the purification of the D dimmer fragment from crosslinked fibrin; Analytical
Biochemistry, 147, 128-135, 1985]に従って調製した。
[0038] (4)抗体固定ィ匕磁性粒子及びアルカリホスファターゼ標識抗体を用いた安定ィ匕フィ ブリンのプラスミン分解物の測定 3%ゥシ血清アルブミンを含む 20mmolZL— Tris— HC1 (pH7. 0)緩衝液を用い て調製された安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物の希釈列を試料として用いた。まず 、試料（50 L)と、 No. 36— 1抗体、 No. 1—1抗体、又は No. 5— 4抗体 Fab '画 分のアルカリホスファターゼ標識物（50 μ L)と、 JIF— 23抗体 F (ab， ) 画分固定化磁
2
性粒子（1%磁性粒子、 50 L)とを混合し、 37°Cで 5分間反応させた。次に、トリトン (Triton) X— 100を主成分とする洗浄液を用いて、免疫反応に寄与しな力つた試料 成分や、余剰の標識抗体を除去した後、免疫複合体が結合した磁性粒子をケミルミ ネッセンス基質である CDP— Star (トロピックス社）（100 L)と混合し、 1分後の発光 をフォトマルチプライヤーにて計測した。
[0039] また、比較例として、 No. 36 抗体 Fab'画分のアルカリホスファターゼ標識物の 代わりに、 JIF— 23抗体 Fab，画分のアルカリホスファターゼ標識物を用いること以外 は、前記操作を繰り返した。
[0040] (5)安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物の測定結果
図 1に、 JIF— 23抗体固定ィ匕磁性粒子とアルカリホスファターゼ標識 No. 36— 1抗 体との組合せによる本願発明の測定方法（図 1における黒丸）と、 JIF— 23抗体固定 化磁性粒子とアルカリホスファターゼ標 milF— 23抗体との組合せによる比較用測定 方法（図 1における白丸）の 2種の測定系にお 、て、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分 解物の希釈列を測定した結果を示す。
認識するェピトープの異なる 2種類のモノクローナル抗体 (JIF— 23抗体及び No. 3 6 1抗体)を用いることにより、 JIF 23抗体単独で構築した測定系に比べて、安定 化フイブリンのプラスミン分解物に対する反応性がおよそ 6倍向上した。その検出感 度はおよそ 17分の分析時間で 0. 005 /z gZmL FEUであり、安定ィ匕フイブリン分 解物の Dドメインのネオアンチゲンを認識する抗体を用いた従来の ELIS A法 (ビメリ ユー社ミニヴアイダス:およそ 35分の分析時間）（非特許文献 8, 11)の検出感度 45η
FEUに対しておよそ 9倍向上しており、高感度化により分析時間の短縮にも繋がって いる。
[0041] 図 2に、本願発明の 3種類の測定方法、すなわち、 JIF— 23抗体固定ィ匕磁性粒子と アルカリホスファターゼ標識 No. 36— 1抗体との組合せによる本願発明の測定方法 ( 図 2における黒丸）、 JIF— 23抗体固定ィ匕磁性粒子とアルカリホスファターゼ標識 No . 1—1抗体との組合せによる本願発明の測定方法（図 2における白四角）、及び JIF —23抗体固定ィ匕磁性粒子とアルカリホスファターゼ標識 No. 5— 4抗体との組合せ による本願発明の測定方法（図 2における白三角）において、安定ィ匕フイブリンのブラ スミン分解物の希釈列を測定した結果を示す。
何れの抗体の組合わせにお 、ても、アルカリホスファターゼ標識抗体に安定ィ匕フィ ブリンの Eドメインのネオアンチゲンを認識する抗体を用いることにより、 No. 36— 1と 同程度の反応性を得ることができ、アルカリホスファターゼ標識抗体に用いる安定ィ匕 フイブリン分解物の Eドメインのネオアンチゲンを認識する抗体の使用にお 、て、普 遍性が高 、ことを示して 、る。
[0042] 《参考実施例 1 :モノクローナル抗体 No. 36— 1、 No. 1— 1、及び No. 5—4の認識 部位の確認》
モノクローナル抗体 No. 36— 1、 No. 1— 1、及び No. 5— 4の反応特異性は、特 公平 5— 48119号公報の実施例 5に記載の方法により確認した。すなわち、バイオラ ッド社の Zeta— Probe Blotting Mewbraues Instruction Manualに従って、ウェスタンブロ ッティングにより確認した。
その概略は、フイブリノ一ゲンを Ca2+又は EGTAの存在下でプラスミン処理を行!ヽ 、 30分、 60分、及び 24時間反応後のフイブリノ一ゲン分解物を、ジチオスレィトール (DTT)存在又は非存在下で SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、 No. 36 —1抗体を用いるウェスタンブロッテイングを実施した。また、前記フイブリノ一ゲン分 解物に代えて、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物、フラグメント D及びフラグメント E についても、前記操作を繰り返した。
[0043] 結果を表 1に示す。表 1において、記号「（―；)」は結合反応性がないことを意味し、 記号「（ + )」は結合反応性が有ることを意味する。表 1の結果より、 No. 36— 1抗体、 No. 1—1抗体、及び No. 5— 4抗体力 安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解により出 現する Eドメインのネオアンチゲンと反応することが判明した。
[0044] [表 1] 抗原 反応性
フイブリノーゲン (一）
X (一）
Y (+ )
フラグメント D二量体 (一）
(DD) E (+ )
e a r l y D (一）
D c a t e (一）
D e g t a (一）
A a (-)
B j3 (一）
y (一）
y— y (一）
1 γ 5 (一）
E 1， E 2 (+ )
E 3 (+ ) 産業上の利用可能性
本発明の免疫学的分析方法は、各種診断、例えば、 DIC、 DVT,肺塞栓症の診 断の用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。

Claims

請求の範囲
[1] (a)安定ィ匕フイブリン、フイブリノ一ゲン、及びフイブリノ一ゲンのプラスミン分解物とは 反応しないが、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解により出現する Dドメインのネオアン チゲンと反応するモノクローナル抗体と、
(b)前記モノクローナル抗体 (a)とは異なる部位を認識することにより、安定化フィプリ ンのプラスミン分解物と特異的に反応するモノクローナル抗体と
の組合せを使用し、前記モノクローナル抗体 (a)又は (b)の一方が磁性粒子に結合 しており、もう一方のモノクローナル抗体が酵素標識されており、前記酵素の基質とし てケミルミネッセンス基質を用いることを特徴とする、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分 解物を免疫学的に分析する方法。
[2] 前記モノクローナル抗体 (b)力 安定ィ匕フイブリン、フイブリノ一ゲン、及びフイブリノ 一ゲンのプラスミン分解物とは反応しないが、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解により 出現する Eドメインのネオアンチゲンと反応するモノクローナル抗体である、請求項 1 に記載の免疫学的分析方法。
[3] (1)安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物を含有する可能性のある被検試料と、前記 モノクローナル抗体 (a)と、前記モノクローナル抗体 (b)とを接触させる工程、
(2)安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物を介して磁性粒子結合モノクローナル抗体と 免疫複合体を形成した酵素標識モノクローナル抗体と、前記免疫複合体を形成しな 力つた酵素標識モノクローナル抗体とを分離する工程、
(3)前記工程で分離した磁性粒子結合モノクローナル抗体 安定ィ匕フイブリンのブラ スミン分解物—酵素標識モノクローナル抗体免疫複合体に、ケミルミネッセンス基質 を添加して発光させる工程、並びに
(4)得られた発光シグナルを分析する工程
を含む、請求項 1又は 2に記載の免疫学的分析方法。
[4] ケミルミネッセンス基質が 1, 2 ジォキセタンである、請求項 1〜3のいずれか一項 に記載の免疫学的分析方法。
[5] 標識酵素がアルカリホスファターゼである、請求項 1〜4のいずれか一項に記載の 免疫学的分析方法。
[6] (a)安定ィ匕フイブリン、フイブリノ一ゲン、及びフイブリノ一ゲンのプラスミン分解物とは 反応しないが、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解により出現する Dドメインのネオアン チゲンと反応するモノクローナル抗体、
(b)前記モノクローナル抗体 (a)とは異なる部位を認識することにより、安定化フィプリ ンのプラスミン分解物と特異的に反応するモノクローナル抗体、並びに
(c)ケミルミネッセンス基質
を含み、
前記モノクローナル抗体 (a)又は (b)の一方が磁性粒子に結合しており、もう一方の モノクローナル抗体が、前記ケミルミネッセンス基質を基質とする酵素で標識されて いることを特徴とする、安定ィ匕フイブリンのプラスミン分解物の免疫学的分析用キット。
[7] 請求項 1〜5のいずれか一項に記載の免疫学的分析方法、あるいは、請求項 6に 記載の免疫学的分析用キットにより、被検試料に含まれる、安定ィ匕フイブリンのプラス ミン分解物を分析することを特徴とする、下肢深部静脈血栓症及び Z又は肺塞栓症 の検出方法。
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