JPWO2006118195A1

JPWO2006118195A1 - 安定化フィブリンのプラスミン分解物の免疫学的分析方法

Info

Publication number: JPWO2006118195A1
Application number: JP2007514807A
Authority: JP
Inventors: 毅松屋
Original assignee: 株式会社三菱化学ヤトロン
Priority date: 2005-04-28
Filing date: 2006-04-27
Publication date: 2008-12-18
Anticipated expiration: 2026-04-27
Also published as: JP4772786B2; CN101166977A; US7888057B2; EP1887358B8; EP1887358B1; CN101166977B; ES2366043T3; EP1887358A4; WO2006118195A1; US20090068682A1; EP1887358A1; CA2606169A1

Abstract

（ａ）安定化フィブリン、フィブリノーゲン、及びフィブリノーゲンのプラスミン分解物とは反応しないが、安定化フィブリンのプラスミン分解により出現するＤドメインのネオアンチゲンと反応するモノクローナル抗体と、（ｂ）前記モノクローナル抗体（ａ）とは異なる部位を認識することにより、安定化フィブリンのプラスミン分解物と特異的に反応するモノクローナル抗体との組合せを使用し、前記モノクローナル抗体（ａ）又は（ｂ）の一方が磁性粒子に結合しており、もう一方のモノクローナル抗体が酵素標識されており、前記酵素の基質としてケミルミネッセンス基質を用いることを特徴とする、安定化フィブリンのプラスミン分解物の免疫学的分析方法を開示する。

Description

本発明は、安定化フィブリンのプラスミン分解物の免疫学的分析方法、より具体的には、ケミルミネッセンスによる安定化フィブリンのプラスミン分解物の高感度アッセイ法に関する。
本明細書における用語「分析」には、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象物質の量又は活性を定量的又は半定量的に決定する「測定」とが含まれる。

ヒト安定化フィブリンの各種プロテアーゼによる分解物は、臨床的診断法における診断マーカーとして有用である。例えば、ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解物、すなわち、基本単位であるｐ−ＤＤ／Ｅ、並びにそのポリマー又はオリゴマー（別称として、例えば、「Ｄ−Ｄダイマー」又は「ＤＤ／Ｅ複合体」と称されることがある）は、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の診断マーカーとして広汎に使用されている。生体試料中に含有される安定化フィブリンのプラスミン分解物の測定においては、安定化フィブリンのプラスミン分解物に特異的なモノクローナル抗体を用いた感作ラテックスによる凝集反応が一般的に使用されている。

一方、下肢深部静脈血栓症（ＤＶＴ）が近年注目されている。国内ではあまり注目されてはいなかったが、生活様式の欧米化につれて増加してきた疾患である。血栓症の状態や血栓の有無を診断あるいは予測することは極めて難しいが、ＤＶＴ診断に最も信頼がおける検査は、安定化フィブリンのプラスミン分解物である（非特許文献１及び２）。凝固過程によって架橋（crosslink）を受けた安定化フィブリンは、プラスミン分解を受けると、ｐ−ＤＤ／Ｅを基本単位とするｐ−ＤＤ／Ｅのポリマー又はオリゴマー、更にはｐ−ＤＤ／Ｅとなるので、ｐ−ＤＤ／Ｅ又はそのポリマー若しくはオリゴマーを検出することで、血栓形成と二次線溶の動態を知ることができる。そのため、安定化フィブリンのプラスミン分解物を測定することは、血栓の存在を確認する上で極めて有用である。

近年、エコノミークラス症候群として知られる肺血栓塞栓症（ＰＥ）がクローズアップされている。ＰＥの多くは、深部静脈血栓（ＤＶＴ）が下大静脈、心臓右心系を介して肺動脈に到達し、血流を途絶させることにより発症するとされている。安定化フィブリンのプラスミン分解物の測定は、ＤＶＴに加えてＰＥの患者を評価することにおいて有用であるとの報告がある（非特許文献３，４）。

安定化フィブリンのプラスミン分解物を特異的に検出することのできる公知のモノクローナル抗体として、モノクローナル抗体ＪＩＦ−２３が知られている（非特許文献５）。この抗体は、ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解物のＤ_１Ａドメインにおけるγ鎖のＮ末端のアミノ酸配列６３−８５が遊離したときに露出されるＤ_１ドメインのＮ末端の立体構造を認識することが知られている。このＪＩＦ−２３抗体を使用して、生体試料中に存在する安定化フィブリンのプラスミン分解物を特異的に分析することのできる測定方法を用いることにより、血栓形成と二次線溶の動態を容易に知ることができる。そのような測定方法としては特に限定されないが、例えば、ラテックス凝集法やＥＬＩＳＡ法が挙げられる。

従来から臨床の現場で広く使用されているＪＩＦ−２３抗体を用いた安定化フィブリンのプラスミン分解物測定法として、ラテックス凝集法が知られている。安定化フィブリンのプラスミン分解物の値は、非特許文献６によれば、健常者で０．４μｇ／ｍＬＦＥＵであり、非特許文献７によれば、ＤＩＣ患者で１５．２±１８．５μｇ／ｍＬである。従って、ＪＩＦ−２３抗体を用いたラテックス凝集反応（検出感度＝約４５ｎｇ／ｍＬ）でも充分検出することができるものであり、実際に臨床の現場で汎用されている。一方、ＤＶＴの場合の臨床カットオフ値は、非特許文献８によれば、０．５μｇ／ｍＬＦＥＵと報告されている。従って、ＤＩＣ診断に比べて健常者の値とのわずかな変動をみる必要があり、正常値域の安定化フィブリンのプラスミン分解物を正確に定量することができる、より高感度な測定法の開発が望まれている。

安定化フィブリン分解物のＤドメインのネオアンチゲンを認識する抗体を用いるＥＬＩＳＡ法として、例えば、ミニヴァイダス（ビメリュー社）が公知である（非特許文献８，１１）。非特許文献９によれば、ラテックス凝集法に比べてＥＬＩＳＡの方が感度が高いため、ＤＶＴ診断に有用であると報告されており、安定化フィブリンのプラスミン分解物の測定法として、高感度測定が可能なＥＬＩＳＡ法が受け入れられつつある。例えば、前記ミニヴァイダスの検出感度は約４５ｎｇ／ｍＬＦＥＵである。
なお、前記の各値及び単位は、各非特許文献の記載に基づくものであり、単位「μｇ／ｍＬＦＥＵ」及び「μｇ／ｍＬ」は、下記換算式：
１μｇ／ｍＬ＝２μｇ／ｍＬＦＥＵ
により相互変換可能である（但し、前記数値「２」は概算値である）（非特許文献１０）。

「トロンボシス・アンド・ヘモスタシス（Thrombosis and Haemostasis）」，（ドイツ），1994年，71巻，p.1-6 「クオリティ・ジャーナル・オブ・メディシン（Quality Journal of Medicine）」，（英国），1997年，90巻，p.437-442 「トロンボシス・アンド・ヘモスタシス（Thrombosis and Haemostasis）」，（ドイツ），1999年，81巻，p.493-497 「トロンボシス・アンド・ヘモスタシス（Thrombosis and Haemostasis）」，（ドイツ），2000年，83巻，191-198 「エクセプタ・メディカ，アムステルダム（Excepta Medica, Amsterdam）」，（オランダ），1990年，p.43-48 「ユー・ケー・ナショナル・イクスターナル・クオリティ・アセスメント・スキーム・フォー・ブラッド・コアグレーション，リポート・オン・サーベイ１４２（U.K. National External Quality Assessment Scheme for BloodCoagulation, Report on Survey 142）」，（英国），2004年５月「アニュールス・デ・バイオロジー・クリニーク（ANNALES DE BIOLOGIE CLINIQUE）」，（フランス），1988年，46巻，p.730-733 「ビオメリュー・バイダス・ディーダイマー・パッケージ・インサート（Biomerieux Vidas D-Dimer Package Insert）」，（米国），2003年９月，008120-4 「アナルズ・オブ・インターナル・メディシン（Annals of Internal Medicine）」，（米国），2004年，p.589-602 「ジャーナル・オブ・トロンボシス・アンド・ヘモスタシス（Journal of Thrombosis and Haemostasis）」，（英国），2005年，p.377-384 「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー（British Journal of Haematology）」，（英国），2004年，p.15-25

本発明の課題は、より高感度な、安定化フィブリンのプラスミン分解物の分析方法を提供することにある。従来の高感度分析法より更に高感度化を行うことにより、分析時間の短縮も可能となる。

前記課題は、本発明による、（ａ）安定化フィブリン、フィブリノーゲン、及びフィブリノーゲンのプラスミン分解物とは反応しないが、安定化フィブリンのプラスミン分解により出現するＤドメインのネオアンチゲンと反応するモノクローナル抗体と、（ｂ）前記モノクローナル抗体（ａ）とは異なる部位を認識することにより、安定化フィブリンのプラスミン分解物と特異的に反応するモノクローナル抗体との組合せを使用し、前記モノクローナル抗体（ａ）又は（ｂ）の一方が磁性粒子に結合しており、もう一方のモノクローナル抗体が酵素標識されており、前記酵素の基質としてケミルミネッセンス基質を用いることを特徴とする、安定化フィブリンのプラスミン分解物を免疫学的に分析する方法により解決することができる。

本発明の免疫学的分析方法の好ましい態様によれば、前記モノクローナル抗体（ｂ）が、安定化フィブリン、フィブリノーゲン、及びフィブリノーゲンのプラスミン分解物とは反応しないが、安定化フィブリンのプラスミン分解により出現するＥドメインのネオアンチゲンと反応するモノクローナル抗体である。
本発明の免疫学的分析方法の別の好ましい態様によれば、（１）安定化フィブリンのプラスミン分解物を含有する可能性のある被検試料と、前記モノクローナル抗体（ａ）と、前記モノクローナル抗体（ｂ）とを接触させる工程、（２）安定化フィブリンのプラスミン分解物を介して磁性粒子結合モノクローナル抗体と免疫複合体を形成した酵素標識モノクローナル抗体と、前記免疫複合体を形成しなかった酵素標識モノクローナル抗体とを分離する工程、（３）前記工程で分離した磁性粒子結合モノクローナル抗体−安定化フィブリンのプラスミン分解物−酵素標識モノクローナル抗体免疫複合体に、ケミルミネッセンス基質を添加して発光させる工程、並びに（４）得られた発光シグナルを分析する工程
を含む。
本発明の免疫学的分析方法の更に別の好ましい態様によれば、ケミルミネッセンス基質が１，２−ジオキセタンである。
本発明の免疫学的分析方法の更に別の好ましい態様によれば、標識酵素がアルカリホスファターゼである。

本発明は、（ａ）安定化フィブリン、フィブリノーゲン、及びフィブリノーゲンのプラスミン分解物とは反応しないが、安定化フィブリンのプラスミン分解により出現するＤドメインのネオアンチゲンと反応するモノクローナル抗体、（ｂ）前記モノクローナル抗体（ａ）とは異なる部位を認識することにより、安定化フィブリンのプラスミン分解物と特異的に反応するモノクローナル抗体、並びに（ｃ）ケミルミネッセンス基質を含み、前記モノクローナル抗体（ａ）又は（ｂ）の一方が磁性粒子に結合しており、もう一方のモノクローナル抗体が、前記ケミルミネッセンス基質を基質とする酵素で標識されていることを特徴とする、安定化フィブリンのプラスミン分解物の免疫学的分析用キットに関する。

本発明は、前記免疫学的分析方法、あるいは、前記免疫学的分析用キットにより、被検試料に含まれる、安定化フィブリンのプラスミン分解物を分析することを特徴とする、下肢深部静脈血栓症及び／又は肺塞栓症の検出方法（診断方法）に関する。

本発明の免疫学的分析方法によれば、安定化フィブリンのプラスミン分解物を高感度及び高特異的に分析することができ、従来のＤＩＣだけでなく、ＤＶＴ及び／又は肺塞栓症の診断にも適用することができる。

ＪＩＦ−２３抗体固定化磁性粒子とアルカリホスファターゼ標識Ｎｏ．３６−１抗体との組合せによる本願発明の測定方法（黒丸）と、ＪＩＦ−２３抗体固定化磁性粒子とアルカリホスファターゼ標識ＪＩＦ−２３抗体との組合せによる比較用測定方法（白丸）の２種の測定系において、安定化フィブリンのプラスミン分解物の希釈列を測定した結果を示すグラフである。ＪＩＦ−２３抗体固定化磁性粒子とアルカリホスファターゼ標識Ｎｏ．３６−１抗体との組合せによる本願発明の測定方法（黒丸）、ＪＩＦ−２３抗体固定化磁性粒子とアルカリホスファターゼ標識Ｎｏ．１−１抗体との組合せによる本願発明の測定方法（白四角）、及びＪＩＦ−２３抗体固定化磁性粒子とアルカリホスファターゼ標識Ｎｏ．５−４抗体との組合せによる本願発明の測定方法（白三角）の３種の測定系において、安定化フィブリンのプラスミン分解物の希釈列を測定した結果を示すグラフである。

本明細書において、用語「安定化フィブリンのプラスミン分解物」とは、安定化フィブリンをプラスミンで消化することにより生成する分解物であって、１又は複数個の基本単位「ｐ−ＤＤ／Ｅ」から実質的になる分解物を意味する。「安定化フィブリンのプラスミン分解物」には、例えば、前記基本単位１個からなるｐ−ＤＤ／Ｅ、あるいは、前記基本単位複数個からなるｐ−ＤＤ／Ｅのポリマー又はオリゴマーが含まれる。「安定化フィブリンのプラスミン分解物」の別称として、例えば、「Ｄ−Ｄダイマー」又は「ＤＤ／Ｅ複合体」が使用されることがある。

なお、本明細書において、プラスミンで消化されることにより生成する分解物を、その分解物の名称の前に「ｐ−」を付与することによって表わすことがある。同様に、顆粒球エラスターゼで消化されることにより生成する分解物を、その分解物の名称の前に「ｅ−」を付与することによって表わすことがある。

本発明（本発明の免疫学的分析方法及び本発明の免疫学的分析用キットを含む）では、モノクローナル抗体として、エピトープの異なる２種類のモノクローナル抗体を使用する。なお、本明細書における用語「抗体」には、抗体それ自体だけでなく、その抗体断片が含まれる。前記抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、又はＦｖを用いることができる。サンドイッチイムノアッセイによりヒト安定化フィブリンのプラスミン分解物を特異的に検出するための抗体としては、安定化フィブリン、フィブリノーゲン、又はフィブリノーゲンのプラスミン分解産物とはサンドイッチ免疫複合体を形成しないが、安定化フィブリンがプラスミンによって消化されたフィブリン分解産物に出現する部位（すなわち、ネオアンチゲン）をエピトープとし、サンドイッチ免疫複合体を形成することのできる特徴を有することが必須条件である。

本発明では、一方のモノクローナル抗体として、安定化フィブリン、フィブリノーゲン、及びフィブリノーゲンのプラスミン分解物とは反応しないが、安定化フィブリンのプラスミン分解により出現するＤドメインのネオアンチゲンと反応するモノクローナル抗体（以下、第１抗体又は抗Ｄドメインネオアンチゲン抗体と称する）を使用し、もう一方のモノクローナル抗体として、前記第１抗体とは異なる部位を認識することにより、安定化フィブリンのプラスミン分解物と特異的に反応するモノクローナル抗体（以下、第２抗体と称する）を使用する。

本発明で使用する第１抗体、すなわち、抗Ｄドメインネオアンチゲン抗体は、安定化フィブリンのプラスミン分解により出現するＤドメインのネオアンチゲンを認識するモノクローナル抗体である限り、特に限定されるものではないが、例えば、安定化フィブリンのプラスミン分解により、γ鎖のＮ末端から第６３番目〜第８５番目のアミノ酸配列からなる断片が、γ鎖から遊離したときに出現するＤドメインのネオアンチゲンを認識するモノクローナル抗体（例えば、モノクローナル抗体ＪＩＦ−２３）を用いることができる。

ＪＩＦ−２３抗体は、安定化フィブリンのプラスミン分解物を特異的に検出することのできるモノクローナル抗体として周知のモノクローナル抗体である（例えば、Matsuda, M., Terukina, S., Yamazumi, K., Maekawa, H., Soe, G., A
monoclonal antibody that recognizes the NH2-terminal conformation of fragment
D, Excerpta Medica, Amsterdam; 1990, 43-38）。また、ＪＩＦ−２３抗体は、安定化フィブリンのプラスミン分解物と反応するだけでなく、安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解物（すなわち、基本単位であるｅ−ＤＤ／Ｅ、並びにそのポリマー又はオリゴマー）とも反応する。安定化フィブリンのプラスミン分解物の基本単位であるｐ−ＤＤ／Ｅの分子内には、ＪＩＦ−２３抗体のエピトープが２箇所存在するため、ＪＩＦ−２３抗体を単独で用いて安定化フィブリンのプラスミン分解物を特異的に検出可能であり、ＪＩＦ−２３抗体を用いた安定化フィブリンのプラスミン分解物測定用ラテックス試薬は、臨床の現場で広く使用されている。

本発明では、第１抗体（例えば、ＪＩＦ−２３抗体）とは異なる部位を認識する第２抗体を、第１抗体と組み合わせて安定化フィブリンのプラスミン分解物の検出系を構築する。前記第２抗体としては、安定化フィブリンのプラスミン消化により新たに露出されたアミノ酸配列又はその立体構造を特異的に認識する抗体であれば特に限定されないが、例えば、Ｅドメインのネオアンチゲンを特異的に認識する抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｎｏ．３６−１、Ｎｏ．１−１、Ｎｏ．５−４）、モノクローナル抗体ＤＤ３Ｂ６／２２（American Diagnostica；Thrombosis Research，1983年，31巻，p87-96又はDrug
Coagulation & Fibrinolysis，1997年，8巻，p87-96）、モノクローナル抗体ＭＡ８Ｄ３（ILなど；Thrombosis
and Haemostasis，1989年，58巻，p1024-1029）、モノクローナル抗体Ｐ１０Ｂ５Ｅ１２Ｃ９（Biomerieux；Clinical
Chemistry，1996年，42巻，p410-415）、モノクローナル抗体Ｐ２Ｃ５Ａ１０（Biomerieux；Clinical Chemistry，1996年，42巻，p410-415）を用いることができる。

第２抗体として用いることができる、Ｅドメインのネオアンチゲンを特異的に認識する抗体（以下、抗Ｅドメインネオアンチゲン抗体と称する）は、安定化フィブリン、フィブリノーゲン、及びフィブリノーゲンのプラスミン分解物とは反応しないが、安定化フィブリンのプラスミン分解により出現するＥドメインのネオアンチゲンと反応するモノクローナル抗体である限り、特に限定されるものではないが、例えば、参考実施例１の表１に記載の反応特異性を有する抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｎｏ．３６−１、Ｎｏ．１−１、Ｎｏ．５−４）を用いることができる。Ｎｏ．３６−１抗体は、安定化フィブリンのプラスミン分解物と反応するが、安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解物とは反応しない。

本発明では、モノクローナル抗体の一方を磁性粒子に結合させた状態で使用し、もう一方のモノクローナル抗体を酵素標識した状態で使用する。本発明で用いる磁性粒子は、磁気を有し、免疫反応の固相担体として使用可能であるものであれば特に限定されないが、例えば、以下のものを用いることができる。粒子の組成としては、可磁化物質を含浸させたポリマーから構成することができる。粒子の表面構造についても、抗体を固定化させることのできるものであれば特に限定されないが、物理吸着により抗体を固定化させる場合は粒子表面の特性が疎水性であることが好ましく、化学結合により抗体を固定化させる場合は、粒子表面に官能基（例えば、カルボキシル基、サクシンイミド基、イソチオシアネート基、クロロスルホニル基、マレイミド基、ヒドラジド基、アミノ基、又はＳＨ基など）を導入した構造が好ましい。磁性粒子の粒径は、例えば、０．１〜１０μｍのものを用いることができ、好ましくは１〜５μｍである。

磁性粒子に抗体を結合する方法は、公知の技術を適用することができる。例えば、疎水性相互作用を利用した物理吸着法又は化学結合法により行われる。化学結合法により抗体を結合させる場合は、例えば、カルボキシル基、サクシンイミド基、イソチオシアネート基、クロロスルホニル基、マレイミド基、ヒドラジド基、又はアミノ基を利用することができる。前記のカルボキシル基の場合、カルボジイミドを用いてカルボキシル基を活性化させ、抗体のアミノ基と結合させることができる。前記のサクシンイミド基、イソチオシアネート基、又はクロロスルホニル基は、抗体のアミノ基と直接反応させることができる。前記のマレイミド基は、例えば、ＳＨ基と反応させることができ、抗体にＳＨ基導入試薬を用いてＳＨ基を導入するか、又は抗体を還元してそのヒンジ部位のＳＨ基を利用して結合させることができる。前記のヒドラジド基は、抗体の糖鎖と反応させることができる。前記アミノ基は、グルタルアルデヒドを用いて粒子上のアミノ基をアルデヒド基に変換させ、抗体のアミノ基と反応させることができる。

本発明でモノクローナル抗体を標識するのに使用する酵素は、ケミルミネッセンスを適用可能な酵素である限り、特に限定されるものではなく、高感度の分析が可能である。例えば、基質がルミノールである場合、標識酵素としてペルオキシダーゼを用いることができ、基質がルミゲンＰＰＤである場合、標識酵素としてアルカリホスファターゼを用いることができる。特に酵素としてアルカリホスファターゼを用いて、基質として１，２−ジオキセタン［より具体的には、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（トロピックス社）］を用いることがＳ／Ｎ比の面からも有用で好ましい。ＣＤＰ−Ｓｔａｒは、ＡＭＰＰＤやＣＳＰＤと同様にアルカリホスファターゼにより加水分解され、中間体を経て発光するが、その発光強度はＡＭＰＰＤやＣＳＰＤに比べて非常に強いことが報告されている［Bronstein, I., Edwards, B., Voyta, J.C., 1,2-Dioxetanes: Novel
Chemiluminescent Enzyme Substrates. Application to Immunoassays, Journal of
Bioluminescence and Chemiluminescence; 4, 99-111 (1989)；Beck, S.,
Koster, H., Applications of Dioxetane Chemiluminescent Probes to Molecular
Biology, Analytical Chemistry; 62, 2258-2270 (1990)；Tizard, R., Cate,
R.L., Ramachandran, K.L., Wysk, M., Voyta, J.C., Murphy, O.J., Bronstein, I.,
Imaging of DNA Sequences with Chemiluminescence, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.; 87,
4514-4518 (1990)；又はBronstein, I., Voyta, J.C., Lazzari, K.G., Murphy, O.,
Edwards, B., Kricka, L.J., Rapid and Sensitive Detection of DNA in Southern
Blots with Chemiluminescence, BioTechniques; 8, 310-314 (1990)］。また、ＣＤＰ−Ｓｔａｒによる化学発光の立ち上がりは、ＡＭＰＰＤやＣＳＰＤに比べて早く、その発光は２４時間以上持続するため、アルカリホスファターゼを用いた高感度分析法の基質として優れている。

抗体への酵素標識は、公知方法を用いることができる。例えば、酵素のアミノ基と抗体のアミノ基をグルタルアルデヒドを用いて架橋する方法、アミノ基と結合可能な官能基（例えば、サクシンイミド基、イソチオシアネート基など）を酵素のアミノ基を介して導入し、抗体のアミノ基と結合させる方法、酵素のアミノ基を介してマレイミド基を導入し、抗体のヒンジ部位のＳＨ基などを利用して結合させる方法、酵素が西洋わさびペルオキシダーゼなどの糖タンパク質である場合、過ヨウ素酸により糖鎖をアルデヒド基に変換し、抗体のアミノ基と結合させる方法などが挙げられる。

本発明の免疫学的分析方法は、特定のモノクローナル抗体の組合せを使用すること以外は、従来公知の免疫学的分析方法と同様に、例えば、マニュアル（手動）又は、自動化システムを用いて、実施することができる。例えば、被検試料又は標準試料と、磁性粒子に結合したモノクローナル抗体と、酵素標識したモノクローナル抗体とを反応チューブ内で接触させ、次いで、所定温度（例えば、３０〜４０℃）でインキュベートする。前記反応チューブの外壁に磁石を接触させることにより、抗体結合磁性粒子を反応チューブ内壁に捕獲した状態で、反応チューブ内の任意の洗浄を行い、次いで、反応チューブ内にケミルミネッセンス基質を添加し発光させる。得られたシグナルを検出し、被検試料又は標準試料中に存在する安定化フィブリンのプラスミン分解物の量を分析する。磁性粒子を用いることで、インキュベーション後の試料液との分離、洗浄液との分離を磁石を用いて正確に行えるため、ブランクの低減等の面でも有利である。本発明により分析することのできる被検試料としては、安定化フィブリンのプラスミン分解物を含む可能性のある生体試料、例えば、血液、血漿、血清、又は尿などを挙げることができる。

本発明者は、第１抗体としてＪＩＦ−２３抗体を、第２抗体としてＮｏ．３６−１抗体（プラスミン消化により露出されるＥドメインの構造を認識する抗体）をそれぞれ使用し、従来のラテックス試薬との相関性をヒト血漿中の安定化フィブリンのプラスミン分解物の測定により評価した。（１）「ＪＩＦ−２３抗体単独で構築されたラテックス凝集法」と「ＪＩＦ−２３抗体単独で構築された抗体固定化磁性粒子とアルカリホスファターゼ標識抗体を用いた測定系」、及び（２）「ＪＩＦ−２３抗体単独で構築されたラテックス凝集法」と「ＪＩＦ−２３抗体固定化磁性粒子とプラスミン消化後のＥドメインを認識するモノクローナル抗体のアルカリホスファターゼ標識物を用いた測定系」では、安定化フィブリンのプラスミン分解物を含むヒト血漿（５０検体）を検体群として用いた相関試験における回帰直線の傾き、切片、及び相関係数に優位な差は認められないことから、ＪＩＦ−２３抗体単独で構築された測定系に対して、プラスミン消化により露出されるＥドメインの構造を認識する抗体をＪＩＦ−２３抗体と組み合わせて構築された測定系の特異性は、血漿中の安定化フィブリンのプラスミン分解物を測定する上では差は無いものと考えられる。

Ｆｒａｎｃｉｓらの報告によると、イン・ビボ（in vivo）では、血流及びα_２プラスミンインヒビターの作用により、安定化フィブリンのプラスミンによる分解は、フェーズ−４［基本単位ＤＤ／Ｅ、又はフラグメントＤ二量体（ＤＤ）及びフラグメントＥまで分解が進んだ状態］まで進まず、フェーズ−３（基本単位ＤＤ／Ｅのポリマー又はオリゴマー）で止まっていることを推測し、徐らはそれを裏付けるデータを報告している［Francis,
C.W., Marder, V.J., Barlow, G.H., Plasmic degradation of crosslinked fibrin,
Journal of Clinical investigation; 66, 1033-1043, 1980；徐吉夫、河野功、桜井錠治、松田道生, フラグメントＤのアミノ末端の構造を認識するモノクローナル抗体（ＪＩＦ−２３）を用いたフィブリンのプラスミン分解産物の解析,
血栓止血学会誌, 5, 105-113, 1994］。これらの報告は、前記相関試験（１）及び（２）の相関性に差がないという結果を強く示唆している。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１：自動化システムによる安定化フィブリンのプラスミン分解物のアッセイ》
（１）抗Ｄドメインネオアンチゲンモノクローナル抗体ＪＩＦ−２３固定化磁性粒子の作製
ＪＩＦ−２３抗体のペプシン消化によるＦ（ａｂ’）_２画分の作製は、松屋らの報告（Matsuya, T., Tashiro, S., Hoshino, N., Shibata, N., Nagasaki, Y.,
Kataoka, K., A core-shell-type fluorescent nanosphere possessing reactive PEG
tethered chains on the surface for zeptomole detection of protein in
time-resolved fluorometric immunoassay; Anal. Chem., 75, 6124-6132, 2003）に準じて行った。

ＪＳＲ社製カルボキシル基導入磁性粒子（粒径２．５μｍ）の５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）の１％懸濁液（１０ｍＬ）へ、１００ｍｇ／ｍＬカルボジイミド水溶液（１ｍＬ）を添加し、室温で１時間転倒混和した。１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行って磁性粒子を回収し、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で２回洗浄した。５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で調製したＪＩＦ−２３抗体Ｆ（ａｂ’）_２溶液（２００μｇ／１０ｍＬ）と、前記磁性粒子とを混合し、室温で１時間転倒混和した。その後、１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行って未反応の抗体溶液を除去し、０．１ｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて調製した０．３％ウシ血清アルブミン溶液（１０ｍＬ）を加え、室温で３０分間転倒混和した。１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行ってウシ血清アルブミン溶液を除去し、０．０１％ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液で抗体固定化磁性粒子を洗浄した後、以後の実験に供した。

（２）抗Ｅドメインネオアンチゲンモノクローナル抗体Ｎｏ．３６−１、Ｎｏ．１−１、又はＮｏ．５−４のアルカリホスファターゼ標識物の作製
プラスミン消化後のＥドメインを認識するＮｏ．３６−１抗体、Ｎｏ．１−１抗体、又はＮｏ．５−４抗体のＦａｂ’画分の作製は、松屋らの報告（Matsuya, T., Tashiro, S., Hoshino, N., Shibata, N., Nagasaki, Y.,
Kataoka, K., A core-shell-type fluorescent nanosphere possessing reactive PEG
tethered chains on the surface for zeptomole detection of protein in
time-resolved fluorometric immunoassay; Anal. Chem., 75, 6124-6132, 2003）に準じて行った。モノクローナル抗体Ｎｏ．３６−１、Ｎｏ．１−１、Ｎｏ．５−４の反応性は、後述の参考実施例１に示すとおりである。

得られたモノクローナル抗体Ｎｏ．３６−１、Ｎｏ．１−１、又はＮｏ．５−４のＦａｂ’画分へのアルカリホスファターゼの標識は、石川らの報告［Ishikawa, E., Imagawa, M., Hashida, S., Yoshitake, S., Hamaguchi,
Y., & Ueno, T., Enzyme-labeling of antibodies and their fragments for
enzyme immunoassay and immunohistochemical staining; J. Immunoassay, 4,
209-327, 1983及びIshikawa, E., Hashida, S., Kohno, T. & Tanaka, K., Methods
for enzyme-labeling of antigens, antibodies and their fragments; In:
Nonisotopic Immunoassay, T.T. Ngo (ed.), p27-55, Plenum Publishing Corporation,
New York, 1988］に準じて実施した。

また、比較用のアルカリホスファターゼ標識抗体として、ＪＩＦ−２３抗体を用いること以外は、前記操作を繰り返すことにより、モノクローナル抗体ＪＩＦ−２３のＦａｂ’画分のアルカリホスファターゼ標識物を調製した。

（３）安定化フィブリンのプラスミン分解物の調製
安定化フィブリンのプラスミン分解物の調製は、Ｏｌｅｘａらの報告［Olexa, S.A., Budzynski, A.Z., Primary soluble plasmic degradation
product of human cross-linked fibrin. Isolation and stoichiometry of the (DD)E
complex; Biochemistry, 18, 991-995, 1979］に従って調製した。また、安定化フィブリンのプラスミン分解物が更に分解して生じるフラグメントＤ及びフラグメントＥは、Ｍａｓｃｉらの報告［Masci,
P.P., Whitaker, A.N., Winzor, D.J., A simple chromatographic procedure for the
purification of the D dimmer fragment from crosslinked fibrin; Analytical
Biochemistry, 147, 128-135, 1985］に従って調製した。

（４）抗体固定化磁性粒子及びアルカリホスファターゼ標識抗体を用いた安定化フィブリンのプラスミン分解物の測定
３％ウシ血清アルブミンを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液を用いて調製された安定化フィブリンのプラスミン分解物の希釈列を試料として用いた。まず、試料（５０μＬ）と、Ｎｏ．３６−１抗体、Ｎｏ．１−１抗体、又はＮｏ．５−４抗体Ｆａｂ’画分のアルカリホスファターゼ標識物（５０μＬ）と、ＪＩＦ−２３抗体Ｆ（ａｂ’）_２画分固定化磁性粒子（１％磁性粒子、５０μＬ）とを混合し、３７℃で５分間反応させた。次に、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を主成分とする洗浄液を用いて、免疫反応に寄与しなかった試料成分や、余剰の標識抗体を除去した後、免疫複合体が結合した磁性粒子をケミルミネッセンス基質であるＣＤＰ−Ｓｔａｒ（トロピックス社）（１００μＬ）と混合し、１分後の発光をフォトマルチプライヤーにて計測した。

また、比較例として、Ｎｏ．３６−抗体Ｆａｂ’画分のアルカリホスファターゼ標識物の代わりに、ＪＩＦ−２３抗体Ｆａｂ’画分のアルカリホスファターゼ標識物を用いること以外は、前記操作を繰り返した。

（５）安定化フィブリンのプラスミン分解物の測定結果
図１に、ＪＩＦ−２３抗体固定化磁性粒子とアルカリホスファターゼ標識Ｎｏ．３６−１抗体との組合せによる本願発明の測定方法（図１における黒丸）と、ＪＩＦ−２３抗体固定化磁性粒子とアルカリホスファターゼ標識ＪＩＦ−２３抗体との組合せによる比較用測定方法（図１における白丸）の２種の測定系において、安定化フィブリンのプラスミン分解物の希釈列を測定した結果を示す。
認識するエピトープの異なる２種類のモノクローナル抗体（ＪＩＦ−２３抗体及びＮｏ．３６−１抗体）を用いることにより、ＪＩＦ−２３抗体単独で構築した測定系に比べて、安定化フィブリンのプラスミン分解物に対する反応性がおよそ６倍向上した。その検出感度はおよそ１７分の分析時間で０．００５μｇ／ｍＬＦＥＵであり、安定化フィブリン分解物のＤドメインのネオアンチゲンを認識する抗体を用いた従来のＥＬＩＳＡ法（ビメリュー社ミニヴァイダス：およそ３５分の分析時間）（非特許文献８，１１）の検出感度４５ｎｇ／ｍＬ
ＦＥＵに対しておよそ９倍向上しており、高感度化により分析時間の短縮にも繋がっている。

図２に、本願発明の３種類の測定方法、すなわち、ＪＩＦ−２３抗体固定化磁性粒子とアルカリホスファターゼ標識Ｎｏ．３６−１抗体との組合せによる本願発明の測定方法（図２における黒丸）、ＪＩＦ−２３抗体固定化磁性粒子とアルカリホスファターゼ標識Ｎｏ．１−１抗体との組合せによる本願発明の測定方法（図２における白四角）、及びＪＩＦ−２３抗体固定化磁性粒子とアルカリホスファターゼ標識Ｎｏ．５−４抗体との組合せによる本願発明の測定方法（図２における白三角）において、安定化フィブリンのプラスミン分解物の希釈列を測定した結果を示す。
何れの抗体の組合わせにおいても、アルカリホスファターゼ標識抗体に安定化フィブリンのＥドメインのネオアンチゲンを認識する抗体を用いることにより、Ｎｏ．３６−１と同程度の反応性を得ることができ、アルカリホスファターゼ標識抗体に用いる安定化フィブリン分解物のＥドメインのネオアンチゲンを認識する抗体の使用において、普遍性が高いことを示している。

《参考実施例１：モノクローナル抗体Ｎｏ．３６−１、Ｎｏ．１−１、及びＮｏ．５−４の認識部位の確認》
モノクローナル抗体Ｎｏ．３６−１、Ｎｏ．１−１、及びＮｏ．５−４の反応特異性は、特公平５−４８１１９号公報の実施例５に記載の方法により確認した。すなわち、バイオラッド社のZeta-Probe Blotting Mewbraues Instruction Manualに従って、ウェスタンブロッティングにより確認した。
その概略は、フィブリノーゲンをＣａ^２＋又はＥＧＴＡの存在下でプラスミン処理を行い、３０分、６０分、及び２４時間反応後のフィブリノーゲン分解物を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）存在又は非存在下でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、Ｎｏ．３６−１抗体を用いるウェスタンブロッティングを実施した。また、前記フィブリノーゲン分解物に代えて、安定化フィブリンのプラスミン分解物、フラグメントＤ及びフラグメントＥについても、前記操作を繰り返した。

結果を表１に示す。表１において、記号「（−）」は結合反応性がないことを意味し、記号「（＋）」は結合反応性が有ることを意味する。表１の結果より、Ｎｏ．３６−１抗体、Ｎｏ．１−１抗体、及びＮｏ．５−４抗体が、安定化フィブリンのプラスミン分解により出現するＥドメインのネオアンチゲンと反応することが判明した。

本発明の免疫学的分析方法は、各種診断、例えば、ＤＩＣ、ＤＶＴ、肺塞栓症の診断の用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。

Claims

（ａ）安定化フィブリン、フィブリノーゲン、及びフィブリノーゲンのプラスミン分解物とは反応しないが、安定化フィブリンのプラスミン分解により出現するＤドメインのネオアンチゲンと反応するモノクローナル抗体と、
（ｂ）前記モノクローナル抗体（ａ）とは異なる部位を認識することにより、安定化フィブリンのプラスミン分解物と特異的に反応するモノクローナル抗体と
の組合せを使用し、前記モノクローナル抗体（ａ）又は（ｂ）の一方が磁性粒子に結合しており、もう一方のモノクローナル抗体が酵素標識されており、前記酵素の基質としてケミルミネッセンス基質を用いることを特徴とする、安定化フィブリンのプラスミン分解物を免疫学的に分析する方法。
前記モノクローナル抗体（ｂ）が、安定化フィブリン、フィブリノーゲン、及びフィブリノーゲンのプラスミン分解物とは反応しないが、安定化フィブリンのプラスミン分解により出現するＥドメインのネオアンチゲンと反応するモノクローナル抗体である、請求項１に記載の免疫学的分析方法。
（１）安定化フィブリンのプラスミン分解物を含有する可能性のある被検試料と、前記モノクローナル抗体（ａ）と、前記モノクローナル抗体（ｂ）とを接触させる工程、
（２）安定化フィブリンのプラスミン分解物を介して磁性粒子結合モノクローナル抗体と免疫複合体を形成した酵素標識モノクローナル抗体と、前記免疫複合体を形成しなかった酵素標識モノクローナル抗体とを分離する工程、
（３）前記工程で分離した磁性粒子結合モノクローナル抗体−安定化フィブリンのプラスミン分解物−酵素標識モノクローナル抗体免疫複合体に、ケミルミネッセンス基質を添加して発光させる工程、並びに
（４）得られた発光シグナルを分析する工程
を含む、請求項１又は２に記載の免疫学的分析方法。
ケミルミネッセンス基質が１，２−ジオキセタンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫学的分析方法。
標識酵素がアルカリホスファターゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫学的分析方法。
（ａ）安定化フィブリン、フィブリノーゲン、及びフィブリノーゲンのプラスミン分解物とは反応しないが、安定化フィブリンのプラスミン分解により出現するＤドメインのネオアンチゲンと反応するモノクローナル抗体、
（ｂ）前記モノクローナル抗体（ａ）とは異なる部位を認識することにより、安定化フィブリンのプラスミン分解物と特異的に反応するモノクローナル抗体、並びに
（ｃ）ケミルミネッセンス基質
を含み、
前記モノクローナル抗体（ａ）又は（ｂ）の一方が磁性粒子に結合しており、もう一方のモノクローナル抗体が、前記ケミルミネッセンス基質を基質とする酵素で標識されていることを特徴とする、安定化フィブリンのプラスミン分解物の免疫学的分析用キット。
請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫学的分析方法、あるいは、請求項６に記載の免疫学的分析用キットにより、被検試料に含まれる、安定化フィブリンのプラスミン分解物を分析することを特徴とする、下肢深部静脈血栓症及び／又は肺塞栓症の検出方法。