WO2006093267A1 - 免疫調節作用を有する発酵組成物 - Google Patents

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WO2006093267A1
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fermented
kelp
lactic acid
acid bacteria
composition
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PCT/JP2006/304087
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Yuji Nonaka
Fumi Izumi
Takayuki Izumo
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Suntory Limited
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    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents

Definitions

  • the present invention relates to a composition having an immunomodulating action, comprising kombu fermented with lactic acid bacteria, more specifically a composition having an immunostimulatory action and / or a composition having an antiallergic action.
  • the present invention also relates to a composition having an immunomodulatory action comprising kelp fermented with lactic acid bacteria, sesame fermented with lactic acid bacteria, and soybean fermented with lactic acid bacteria.
  • steroids may be administered to patients with particularly severe symptoms, but the side effects of these drugs are a problem. Under such circumstances, there is a keen desire for a fundamental cure and prevention method for allergies.
  • Japan has entered an aging society, and deaths due to infectious diseases caused by inferior immunity due to aging are increasing.
  • immunity is reduced by busy modern society and life in a stress environment, and countermeasures are strongly desired.
  • seaweed In Japan, the habit of eating seaweed has long been rooted, and kelp, in particular, is considered a fortune and longevity meal, and is a traditional ingredient also included in vegetarian cuisine.
  • Seaweed is a food that contains abundant minerals such as calcium, sodium, magnesium, phosphorus, iron, and iodine, and dietary fibers such as various vitamins and fucoidan, which are often deficient, and may also have an immunomodulatory action. It is clear.
  • lactic acid fermented foods the recognition that eating them is good for health is increasing with the accumulation of scientific knowledge, and the immunoregulatory action of various lactic acid bacteria and / or lactic acid fermented foods has also become clear. It is coming.
  • seaweed-derived lactic acid fermentation material that combines these two elements is considered an attractive material that can be expected to improve health functions.
  • seaweeds such as kelp have few nutrients that are necessary for the fermenting strains to settle and grow.
  • the cultivation requires a lot of labor, labor and cost. Therefore, the seaweed fermented food and its physiological activity have not been sufficiently examined.
  • Patent Document 1 describes saccharification of seaweeds, that is, for the supply of sugar as a fermentation substrate, seaweeds are decomposed into single cells by cellulase and the like, and then lactic acid bacteria and / or yeasts are used.
  • the seaweed fermented food obtained by the method of fermenting using is disclosed.
  • Patent Document 2 is a fermented food obtained by ingesting and fermenting a Kumonskabi fungus into a mixture of soybeans and kelp and then fermenting it, and then taking it easily. It is possible to disclose delicious foods with excellent nutrition and absorption.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-201
  • Patent Document 2 Japanese Patent No. 2846547
  • An object of the present invention is to provide an excellent immunomodulatory action with high safety by using familiar food materials and imparting an immunomodulating function to the material or enhancing the immunomodulating function of the material. It is to provide a composition.
  • the present inventors succeeded in fermenting kelp, which is usually said to be difficult to ferment, using plant lactic acid bacteria to obtain a fermented product of lactic acid bacteria.
  • the present inventors found that the fermented product was significantly more in comparison with the kelp and Z or lactic acid bacteria alone. It has been found that it exhibits an improved immunomodulatory action (immunostimulatory action, immune balance regulating action).
  • the present inventors have intensively studied for the development of a food material that can exhibit the immunoregulatory function of the fermented lactic acid bacteria of the kelp more efficiently and has an excellent nutritional value.
  • composition containing a combination of kelp fermented with lactic acid bacteria, sesame fermented with lactic acid bacteria, and soybean fermented with lactic acid bacteria It has been found that it exhibits an immunomodulatory action. It was also found that this immunoregulatory effect is significantly greater than the action of lactic acid bacteria alone or unfermented fermentation raw material alone. Moreover, this immunoregulatory effect was maintained even after the composition of the present invention was sterilized by caro heat.
  • the present invention provides:
  • composition having an immunomodulatory action comprising kelp fermented with lactic acid bacteria
  • composition according to 1, wherein the immunomodulating action is an immunostimulating action and Z or antiallergic action;
  • composition according to 1 or 2 wherein the lactic acid bacterium is a plant lactic acid bacterium;
  • composition according to any one of:! To 3, comprising 5 mg or more of kelp fermented with lactic acid bacteria as a single intake; 5.
  • a composition comprising kelp fermented with lactic acid bacteria, sesame fermented with lactic acid bacteria, and soybeans fermented with lactic acid bacteria;
  • composition according to 5 wherein the lactic acid bacterium is a plant lactic acid bacterium;
  • composition according to 5 or 6 which has an immunomodulatory action
  • composition according to 7, wherein the immunomodulating action is an immunostimulating action and Z or antiallergic action
  • a one-time intake contains 1 to 10,000 mg, preferably 10 to 10,000 mg in total of kelp fermented with lactic acid bacteria, sesame fermented with lactic acid bacteria, and soybean fermented with lactic acid bacteria, any power of 5 to 9 4 compositions;
  • composition according to any one of:! To 9, which is a food, drink, food additive, health food, or pharmaceutical composition;
  • the composition of the present invention is manufactured as a food material, it can be taken daily or continuously at an appropriate number of days over a short period or a long period of time when safety is high. Therefore, when ingested as a food or drink or a health food, it is possible to prevent a decrease in immune function caused by various factors by regulating the immune function over a long period of time. In addition, by adjusting the balance of immune functions, it is possible to prevent excessive enhancement of immune functions that adversely affect the living body.
  • composition of the present invention when administered as a pharmaceutical, can relieve or cure various symptoms caused by decreased immune function or excessively increased immune function with moderate power and efficacy.
  • Power S can be.
  • composition of the present invention can efficiently utilize the excellent nutritional value and functionality of kelp, soybeans and sesame.
  • FIG. 1 shows the results obtained by treating mouse-derived macrophages with S-PT84 strain, unfermented kelp, fermented kelp, or fermented cucumber kelp and measuring the amount of IL-12 produced by the macrophages. It is a graph to show.
  • FIG. 2 is a graph showing IL-12 production by macrophages derived from mice fed with unfermented kelp, fermented kelp, unfermented cucumber kelp, or fermented cucumber kelp.
  • FIG. 3 is a graph showing NK activity of spleen lymphocytes derived from mice fed with S-PT84, unfermented kelp, or fermented kelp.
  • FIG. 4 is a graph showing IFN_ or IL_ 4 production of spleen lymphocytes derived from mice fed S-PT84, unfermented kelp, or fermented kelp.
  • FIG. 5 is a graph showing the Thl / Th2 balance of spleen lymphocytes derived from mice fed S-PT84, unfermented kelp, or fermented kelp.
  • FIG. 6 is a graph showing the results obtained by measuring the NK activity of splenic lymphocytes derived from mice orally ingested with S_PT84 and a fermentation composition.
  • FIG. 7 is a graph showing the results obtained by measuring IL 4 production from splenocytes derived from mice that were orally ingested with S-PT84 and a fermented composition, respectively.
  • FIG. 8 is a graph showing the results obtained by measuring IFN ⁇ production from splenocytes derived from mice that were orally ingested with S-—84 and the fermentation composition.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of measuring sputum activity of splenocytes derived from mice that were orally ingested with S-84 and a fermented composition under stress.
  • FIG. 10 is a graph showing the results obtained by measuring IL 4 production from spleen cells derived from mice that were orally ingested with S-84 and the fermented composition at the time of stress loading, respectively.
  • FIG. 11 is a graph showing the results obtained by measuring IFN_ production from spleen cells derived from mice that were orally ingested with S_PT84 and a fermented composition at the time of stress loading, respectively.
  • FIG. 12 shows the results obtained by measuring the total IgE concentration in OVA-induced allergic mice that were orally ingested with S_PT84, unfermented composition, S-PT84 + unfermented composition, and fermented composition. It is a graph to show.
  • FIG. 13 shows the results obtained by measuring IL 4 production from splenocytes derived from OVA-induced allergic mice that were orally ingested with S-PT84 + unfermented composition and fermented composition, respectively. It is a graph.
  • FIG. 14 shows the results obtained by measuring IFN_y production from splenocytes derived from OVA-induced allergic mice that were orally ingested with S-PT84 + unfermented composition and fermented composition, respectively. It is a graph to show.
  • FIG. 15 shows the results obtained by measuring the total amount of IgA in the intestinal lumen of mice that were orally ingested with S_PT84 and the fermentation composition, respectively.
  • FIG. 16 is a graph showing the results obtained by measuring IL_4 production from Peyer's patch cells derived from mice orally ingested with S_PT84 and a fermentation composition, respectively.
  • FIG. 17 is a graph showing the results obtained by measuring IFN-y production from Peyer's patch cells derived from mice that were orally ingested with S_PT84 and a fermentation composition, respectively.
  • FIG. 18 shows the results obtained by measuring the Sale omal 80 tumor size of mice that were orally ingested with unfermented kelp or fermented kelp, respectively.
  • FIG. 19 is a graph showing the results obtained by measuring NK activity of humans ingesting fermented grains.
  • FIG. 20 is a graph showing the amount of change in NK activity in humans fed with fermented grains.
  • FIG. 21 is a graph showing the amount of change in the Thl / Th2 ratio in humans fed with fermented grains.
  • the kombu as used in the present invention is a generic name for brown algae (Laminaria spp.) And its related species, for example, Macombu (L.
  • the powers that are limited to these include: It is not a thing.
  • the kelp used as a raw material of the kelp fermented with the lactic acid bacteria of the present invention includes Use the original kelp algae described above or a dried product from which foreign substances such as sand have been removed. For ease of fermentation, it is preferable to use cut or pulverized kelp, and those seasoned with salt, sugar, amino acid, organic acid, nucleic acid, etc. may be used.
  • Such kelp is generally commercially available, and examples include the trade name “Konbu Powder” (Yaizu Suisan Chemical Co., Ltd.) and the trade name “Konbu Powder” (Sakai Suisan Co., Ltd.).
  • the lactic acid bacteria for fermenting the raw material kelp are not particularly limited as long as they can ferment kelp, and those lyophilized by ordinary methods or those refrigerated can be used.
  • Examples of lactic acid bacteria include Lactobacillus, Lactococcus, Streptcoccus, Bifidobacterium, and Leuconostoc.
  • One or more lactic acid bacteria can be selected and used simultaneously or sequentially.
  • isolated lactic acid bacteria (plant lactic acid bacteria) that survive by utilizing plant components can be fermented even with plant materials that are not rich in nutrients, such as kelp, and high-concentration food salts that are resistant to acids and alkalis.
  • lactic acid bacteria include Lactobacillus plantarum, Lattobacillus pentosus, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus brevisno, Lactobacillus brevisno, Lactobacillus fermentum ), Tetragenococcus 'Nono Rofinore scan (Tetragenococcus halophilus), the "i Lactococcus' Hentosase 1 É1 ⁇ 2 (Pediococcus pent osaceus), and the like.
  • the present applicant has various having immunomodulatory effects from Shibazuke Plant lactic acid bacteria were isolated (see JP 2005-333919 A.) In the present invention, these lactic acid bacteria can also be suitably used.
  • the lactic acid bacteria of the present invention have a purpose of imparting flavor to acetic acid, carbon dioxide gas, alcohol, etc. generated by heterolactic acid fermentation using any type of lactic acid bacteria of homolactic acid fermentation and heterolactic acid fermentation.
  • a large amount of carbon dioxide is generated, handling in the production process using a fermentation tank may be worsened.
  • homolactic fermentation produces a large amount of lactic acid, it can be suitably used in the present invention where there is little risk of spoilage during the fermentation process due to the influence of spoilage bacteria derived from kelp.
  • the lactic acid bacteria fermented kelp of the present invention is usually sterilized by adding water to the raw material kelp, inoculating the lactic acid bacteria and fermenting, and then heating or irradiating (preferably heating).
  • the sterilized fermented kelp can be obtained by filtering or centrifuging (preferably filtering) the sterilized fermented product to remove most dead fungi.
  • sterilization is preferably performed in advance.
  • the temperature and time of the sterilization process may be appropriately set. For example, a sterilization process that is maintained at 90 ° C. for 10 minutes can be exemplified.
  • the fermented liquor may be significantly thickened by kelp-derived polysaccharides, so an enzyme such as alginate lyase may be added to improve workability.
  • the fermentation treatment is performed by adding a starter containing lactic acid bacteria to the sterilized product.
  • a saccharide such as glucose or a nitrogen source such as soybean peptide
  • What is necessary is just to set the temperature and time of a fermentation process suitably according to the property of the lactic acid bacteria to be used.
  • the degree of fermentation can be determined by measuring the pH of the fermented product. In the case of the lactic acid bacteria fermented kelp according to the present invention, the fermentation should be carried out until the pH reaches 5.0 or less.
  • the lactic acid bacteria fermented kelp obtained in this way may be used in a liquid state, but it is preferably pulverized by spray drying or freeze drying from the viewpoint of workability and storage stability.
  • the present invention is characterized in that the immunoregulatory action is enhanced by combining the lactic acid bacteria fermented kelp with sesame fermented with lactic acid bacteria and soybean fermented with lactic acid bacteria.
  • sesame as used in the present invention refers to seeds of Sesamun indicum plants, such as white sesame, black sesame, yellow sesame, and tea sesame, but are not limited thereto. . In addition, these may be used alone or in combination.
  • the form of sesame used as a raw material for sesame fermented with lactic acid bacteria of the present invention is not limited, and can use any of grains, pulverized products, pastes, etc. It is preferable to use a ground paste. Numerous sesame pastes are commercially available, and examples include the trade name “Pure Kneaded Sesame Black” (Takemoto Yushi Co., Ltd.).
  • defatted sesame may be used as a raw material, but it is preferable to use sesame containing oil that has not been defatted from the viewpoint of the nutritional value of sesame. .
  • Soybean as used in the present invention refers to seeds of Glycine max plants, and this includes a large number of varieties that vary depending on the growing period and production area. In the present invention, any variety can be used without particular limitation. Soybeans that are fermented with lactic acid bacteria of the present invention (lactic acid bacteria fermented soybeans) include solid soybeans, soybean flour, soybean oil cake, defatted soybeans, kinako flour, and hydrolysates thereof. Although it can be used without particular limitation, it is preferable to use a powdered one for ease of fermentation.
  • soybean powder is commercially available, and examples include the trade name “Black Soybean Kinako” (Katsubayashi Kobayashi Co., Ltd.) and the trade name “Prolife J” (RIKEN Agricultural Chemical Co., Ltd.).
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising lactic acid bacteria fermented kelp, lactic acid bacteria fermented sesame and lactic acid bacteria soybean (sometimes referred to as "lactic acid bacteria fermented cucumber kon” or “fermented cucumber kon” in this specification).
  • the composition may be prepared by separately fermenting konbu, sesame and soybean raw materials after lactic acid bacteria fermentation, or by mixing konbu, sesame and soybean raw materials to inoculate lactic acid bacteria. May be prepared.
  • Kelp can be preferably used.
  • lactic acid bacteria fermented sesame lactic acid bacteria fermented sesame prepared in the same manner as the above lactic acid bacteria fermented kelp can be used, for example, those described in JP-A No. 2004-173692.
  • lactic acid bacteria fermented soybeans lactic acid bacteria fermented soybeans prepared in the same manner as the above lactic acid bacteria fermented kelp can be used, such as those described in JP-A-2003-335695.
  • the following method can be exemplified as a method for preparing by inoculating lactic acid bacteria by mixing kelp, sesame and soybeans as raw materials, but the method is not limited thereto.
  • kelp, soybeans, and sesame seeds are prepared as fermentation raw materials. These raw materials are optionally processed into powder or paste. Alternatively, purchase a commercially available powder or paste-like material. It may be used as a fermentation raw material.
  • raw materials kelp for example, kelp powder
  • soybeans for example, soybean powder
  • sesame for example, sesame paste
  • the temperature and time of sterilization can be set as appropriate. An example of sterilization at 90 ° C for 10 minutes can be given.
  • lactic acid bacteria are added to the obtained sterilized product (for example, a starter containing lactic acid bacteria or the like is added), and a fermentation process is performed.
  • a saccharide such as dalcose or a nitrogen source such as soybean peptide
  • the degree of fermentation can be determined by measuring the pH of the fermented product. In the case of the composition of the present invention, fermentation is preferably carried out until the pH is 5.0 or less.
  • an enzyme such as alginate lyase is added to reduce the viscosity of the mixture and work. Can be improved.
  • the lactic acid bacteria to be used can be selected in the same manner as in the case of lactic acid bacteria fermented kelp, and it is preferable to use plant lactic acid bacteria.
  • the present inventors have found that Lactobacillus pentosus and Lactobacillus pentosus from a preliminary test using lactic acid bacteria isolated from shiba pickles. It was found that huntahum (Lactooacihus plantarum) can ferment well all of kelp, soybean and sesame. Therefore, among plant lactic acid bacteria, it is possible to suitably use these lactic acid bacteria (Lactobacillus pentosus and Lactobacillus plantarum).
  • lactic acid bacteria are mixed with kelp and sesame as in the above-mentioned Lactobacillus pentosus and Lactobacillus plantarum.
  • Lactobacillus pentosus and Lactobacillus plantarum The ability to use lactic acid bacteria that can ferment all soybeans, or each material What is necessary is just to use multiple types of lactic acid bacteria which can be fermented simultaneously.
  • composition of the present invention that is, the lactic acid bacteria fermented kelp or the lactic acid bacteria fermented cucumber kelp is characterized by having an immunomodulatory action.
  • Immunity is a function of preventing various diseases by protecting the body from countless pathogens and various harmful substances, that is, a function of maintaining the homeostasis of the living body.
  • the immunoregulatory effect referred to in the present invention is an action that activates an immune response when immune function is partially impaired or immune function is reduced due to aging, stress, fatigue, lack of sleep, etc. Action) or an action that suppresses the immune response when the immune function is excessively activated (immunosuppressive action), and the composition of the present invention allows this immunostimulatory action and immunosuppressive action to function appropriately.
  • the immune balance is optimized.
  • T cells that are lymphocytes that recognize antigens, and they are divided into Thl cells and Th2 cells by the produced cytokines. This balance between Thl and Th2 (Thl / Th2 balance) affects the immune response in the living body.
  • Thl when Thl becomes dominant, delayed hypersensitivity (rejection reaction that occurs during organ transplantation)
  • Th2 when Th2 is dominant, antigen-specific IgE antibodies are produced and immediate hypersensitivity (type I allergies such as asthma, allergic rhinitis, hay fever, atopic dermatitis, etc.)
  • type I allergies such as asthma, allergic rhinitis, hay fever, atopic dermatitis, etc.
  • the composition of the present invention (lactic acid bacteria fermented kelp and lactic acid bacteria fermented kombu kelp) is characterized in that the Thl / Th2 balance of the living body is led to a Thl dominant state.
  • Th2 is dominant in type I allergies such as asthma, hay fever and atopic dermatitis. It has also been reported that Th2 is dominant in HIV infection.
  • Thl becomes dominant, the activity of macrophages, NK cells and cytotoxic T cells (CTL) is promoted and the resistance to cancer is increased. Therefore, taking the composition of the present invention on its own or as a food or medicine, Thl is superior. In this situation, not only can I treat and prevent type I allergies, but it can also increase resistance to HIV, cancer and bacterial infections, and prevent and treat them.
  • the composition of the present invention is also characterized by improving the immunity of the intestinal tract.
  • Intestinal immunity is a defense system that exists on the mucosal surface of the intestinal tract in order to eliminate pathogenic agents that enter the intestinal tract from the nose and throat or with food and drink.
  • Peyer's patch distributed in the mucous membrane of the small intestine plays the role of its control tower, and it is known that antibodies (IgA) produced by Peyer's patch attack foreign substances such as pathogenic bacteria.
  • composition of the present invention (lactic acid bacteria fermented kelp or lactic acid bacteria fermented kombu) is useful as a composition for immunomodulation, immunostimulation, immunosuppression, or antiallergy.
  • the composition according to the present invention can be used as a food or drink, a pharmaceutical product, etc., but this composition imparts an immunoregulatory function or enhances an immunoregulatory function to a food material with high nutritional value that is close to it. Because it is safe and highly safe, it is preferably used as a food and drink that can be taken on a daily basis. When used in foods and drinks, it is preferably implemented as a health food having an immunomodulatory action.
  • foods and beverages with indications indicating that they have an immune function-modulating action, an immunostimulating action and / or an antiallergic action are attached to containers and instructions (for example, foods for specific health use or conditionally specified foods). Functional foods such as health foods) are also included.
  • the labeling location (such as the container or instructions attached to it), the container form (such as bottles, cans, plastic bottles, plastic bottles, paper packs, etc.) and the method of labeling (printing, stamping, sealing, etc.) are not limited.
  • the mode of use as food includes the case where the composition of the present invention is used as a food additive.
  • the composition of the present invention when used as a food or drink, the composition may be used as it is, or it may be mixed with various components such as known bases, auxiliaries, sweeteners, acidulants and vitamins.
  • the composition of the present invention can be used as a tablet, capsule, pill, powder, granule, candy, drop, troche, gum, powdered juice, drink, seasoning, It can be provided in the form of processed food, desserts or confectionery.
  • the lactic acid bacteria fermented kelp or lactic acid bacteria fermented cucumber of the present invention has a mild taste. Therefore, one of the preferred forms is a form that allows food and drinks to be chewed and tasted. Specifically, a form like a pill or a form like a biscuit can be illustrated. Pills
  • the oil content is adjusted to 1% or less. This is to prevent oxidative deterioration of the pills due to oil leaching that occurs during storage and the sticking of the pills.
  • the oil content of the pills can be adjusted to 1% or less. That is not always appropriate.
  • the composition contains about 4 to 15% of the oil, and the above-mentioned oil can be exuded.
  • the present inventors have found that the oil content in the process of polishing the dough (a process for polishing the surface of the bare circle) that is usually performed for the purpose of improving the appearance. It was found that exudation occurred remarkably, and it was confirmed that the exudation of oil could be prevented by coating uncoated circle with shellac or sugar without performing this dough polishing process.
  • the food and drink of the present invention can also be used for animals other than humans for the regulation of immune function (immunity activation, antiallergy, etc.).
  • Target animals include pets such as dogs and cats, livestock such as pigs and cattle, poultry such as chickens, laboratory animals such as mice and guinea pigs, and aquaculture and aquatic animals.
  • livestock such as pigs and cattle
  • poultry such as chickens
  • laboratory animals such as mice and guinea pigs
  • aquaculture and aquatic animals As a form of food or drink, it can be used as it is, but it can be added to animal or seafood feed (pet food) or in the form of a supplement. it can.
  • the use as a pharmaceutical can be exemplified by an immunomodulator such as an immunostimulant or an antiallergic agent.
  • the composition of the present invention is usually used in the field of pharmaceutical formulation technology such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, solubilizing agents, suspending agents, coating agents and the like as main agents. It can be formulated using known adjuvants.
  • the dosage form includes pills, tablets, capsules, granules, powders, syrups, suppositories, injections and the like, but is not particularly limited thereto.
  • the administration period is not particularly limited, but continuous administration for 1 week to 10 days or more is more preferable, and constant continuous administration is preferable.
  • the content of the composition of the present invention (lactic acid bacteria fermented kelp or lactic acid bacteria fermented cucumber kelp) in the food or drink or medicament of the present invention is not particularly limited, but is generally 0.1 to 100 wt. %, Preferably 1 to 90% by weight, more preferably about 1 to 50% by weight.
  • a food or pharmaceutical product comprising or containing the composition of the present invention comprises lactic acid bacteria fermented kelp or lactic acid bacteria fermented cucumber as a single dose, in terms of dry weight of 1 to: 10000 mg, Preferably, it contains 10 to 10,000 mg. Since the composition of the present invention is highly safe, there is substantially no upper limit on its content.
  • Test Example 1 Lactic acid bacteria fermentation test (1)
  • the possibility of fermentation of kelp by lactic acid bacteria was investigated.
  • 1 type of lactic acid bacteria (A to F) (see JP 2005-33391 A) was inoculated to 0.5%.
  • the obtained mixture was fermented at 37 ° C. for 48 hours, the pH before and after fermentation was measured, and the number of bacteria after fermentation was measured for lactic acid bacteria A to D.
  • the lactic acid bacteria A (S_PT84) in the table is deposited as FERM ABP-10028 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center.
  • Table 2 shows the results regarding the number of bacteria after fermentation and the pH before and after fermentation. 8 kinds of milk Using any of the acid bacteria, an increase in the number of lactic acid bacteria and / or a decrease in pH was confirmed, and it became clear that kelp fermentation was promoted by the lactic acid bacteria.
  • Test Example 1 The possibility of fermentation of sesame and soybeans by the lactic acid bacteria used in Test Example 1 was examined.
  • sesame use paste-like sesame made by Takemoto Yushi Co., Ltd. (trade name “Pure Kneaded Sesame 'Black”)
  • soybean use powdered soybean made by Kobayashi Katsura Co., Ltd. It was.
  • the pH before and after fermentation was measured, and the number of bacteria after fermentation was measured.
  • the number of bacteria after fermentation was counted for 8 types of lactic acid bacteria for sesame and for lactic acid bacteria A to D for soybeans.
  • Table 3 shows the results regarding the number of bacteria after fermentation and the pH before and after fermentation. An increase in the number of lactic acid bacteria and / or a decrease in pH could be confirmed by using any of the 8 types of lactic acid bacteria, and it became clear that fermentation of sesame seeds and soybeans proceeded with the lactic acid bacteria.
  • kelp powdered kelp (trade name “Konbu Powder”) manufactured by Yaizu Suisan Chemical Co., Ltd. was used (hereinafter referred to as “unfermented kelp”).
  • unfermented kelp Sterile water in which lysate alginate (manufactured by Nagase ChemteX) was dispersed was added to the unfermented kelp and sterilized by heating at 90 ° C for 20 minutes.
  • lactic acid bacteria Rosubishi Chemical Foods
  • yeast extract Mitsubishi Chemical Foods
  • soybean peptide Fruji Oil Co., Ltd.
  • a Balta starter obtained by culturing for an hour was used. This starter was added to the sterilized kelp mixture and fermented at a temperature of about 37 ° C for about 14 hours. After the fermentation is complete, the fermented liquid is sterilized by heating at 90 ° C for 10 minutes, cooled and filtered through a 20 mesh, and the resulting filtrate is spray-dried (Mini Spray Dryer I-B-290, manufactured by Nihon Büch Corporation). Type) to obtain a kelp lactic acid bacteria fermentation composition (hereinafter referred to as “fermented kelp”).
  • Sesame Soybeans: Kelp is mixed to a weight ratio of 1: 3: 1 (hereinafter also referred to as “unfermented cucumber kelp” or “unfermented composition”) and brown sugar ( 1/3 by weight of sesame and soy peptide (1/15 by weight of sesame) were added as fermentation-enhancing additives.
  • the fermented product was sterilized by heating at 90 ° C. for 10 minutes, cooled and filtered through a 20 mesh, and the obtained filtrate was spray-dried. It is dried with a dryer (Nihon Büch Co., Ltd., mini spray dryer B-290), and the lactic acid bacteria fermentation composition (hereinafter referred to as “fermented cucumber kelp” or “fermentation composition”). Notation).
  • PBS Phosphate-Buffer Salines
  • C57BLZ6 mice 7-week-old male, 10 animals, Shimizu experimental materials
  • intraperitoneal cells were collected aseptically.
  • the collected cells were cultured in RPMI1640 medium containing 10% FBS (usual fetal serum) (day Washed with Mizu Pharmaceutical Co., Ltd.), and red blood cells were removed by hemolysis using a hemolysis buffer. That is, lmL hemolysis buffer (155 mM NH 4 Cl, 10 mM KHC)
  • the non-adherent cells were removed by removing the medium, and the cell culture medium was added again.
  • Unfermented kelp, fermented kelp, and fermented cucumber kelp obtained in Examples 1 and 2 were weighed in a certain amount, ground in a mortar, and suspended in a cell culture medium (unfermented kelp suspension, (Fermented kelp suspension and fermented cucumber suspension) as samples, and add these samples to the above cell plates and add them to the plates so that the final concentrations are: g / mL and 10 x gZmL, respectively. Then, the cells were cultured at 5% CO, 37 ° C for 18 hours. For comparison, S-PT84 (dry dead bacteria)
  • the liquid suspended in the culture medium was added to final concentrations of 1.5 ng / mL and 15 ng / mL, and cultured at 5% CO, 37 ° C for 18 hours.
  • the final concentration of S-PT84 strain is
  • the concentration is equivalent to the amount of 84 strains of S— ⁇ in 1 ⁇ g / mL and 10 ⁇ g / mL fermented cucumber suspension.
  • the amount of cytodynamic in (interleukin 12; IL-12) contained in the culture supernatant was measured with an ELISA kit (OptEIA, BD Pharmingen). In addition, the same measurement was performed using Control (Cont) as a culture solution to which nothing was added.
  • An increase in IL 12 concentration in the culture broth was observed with the addition of unfermented kelp, fermented kelp, and fermented cucumber kelp.
  • IL-12 concentration is increased by fermented kelp with added fermented kelp than when unfermented kombu is added, and IL-12 concentration is increased by fermented cucumber with added fermented kelp than when fermented kelp is added. It was suggested to do. From the above results, it has been clarified that the immunostimulatory effect is higher with fermented kelp than with unfermented kelp and with fermented cucumber kelp than with fermented kelp.
  • C57BLZ6 mice (7-week-old male, 15 mice) were divided into 5 groups of 3 mice so that the average body weight of each group was almost the same.
  • Group composition is untreated group (Control), unfermented kelp administration group (lOmgZ Mouse), fermented kelp administration group (10 mg / mouse), unfermented cucumber kon administration group (10 mg / mouse), and fermented cucumber kon administration group (lOmg / mouse).
  • a suspension was obtained by adding PBS to the unfermented kelp, fermented kelp, unfermented cucumber kelp, and fermented cucumber kelp obtained in Examples 1 and 2 to 20 mg / mL.
  • Each of the obtained solutions was intraperitoneally administered 0.5 mL each.
  • the amount of IL-12 contained in the culture supernatant was measured using an ELISA kit (OptEIA, BD Pharmingen).
  • composition of the present invention has an immunomodulating effect that is so excellent that it cannot be predicted from the fermentation raw material.
  • Example 5 Effects of kelp fermented product on NK activity and Thl / Th2 cell balance (Thl / Th2 ratio)
  • C57BLZ6 mice (6 weeks old male) were divided into 4 groups of 3 mice so that the average body weight of each group was almost the same.
  • the groups consisted of the additive-free group (00111 01), the 3_? 84 administration group, the unfermented kelp administration group, and the fermented kelp administration group.
  • S—PT84 dry dead bacteria
  • S— ⁇ 84 administration group unfermented kelp of Example 1 Fermented kelp administered group
  • fermented kelp (fermented kelp administered group) were orally administered by gavage every day at 500 mg / kg.
  • the amount of S-PT84 in the S-PT84 administration group corresponds to the amount of S-PT84 in the fermented cucumber kelp.
  • RPMI1640 medium containing medium for cell culture (10% urine fetal serum, 0.2% antibiotic-antifungal mixed solution (Nacalai Tesque))
  • Cells were removed by lightly pressing on a medium cell strainer (70 ⁇ m, BD Falcon). The cells were dispersed by pipetting and then centrifuged (1500 rpm, 3 minutes, 4 ° C).
  • spleen lymphocytes were prepared after lysing red blood cells.
  • the NK activity of these spleen lymphocytes was determined by the PINK method (in the PINK method, the target cell Yac_1 was labeled with the hydrophobic membrane fluorescent dye 3, 3'-dioctadecyloxacarbocya nine perchlorate (Dio)
  • PI membrane-impermeable nucleic acid-binding fluorescent dye propidium iodide
  • uninjured Yac_l is detected by flow cytometry with Dio single staining, and injured Yac_l with double staining. This is a method for calculating the cytotoxic activity of mouse splenocytes.
  • the splenic lymphocytes were cultured for 24 hours under stimulation with Concanapalin® (2.5 ⁇ g / mL), and the amounts of IFN- ⁇ and IL-4 produced in the culture supernatant were measured with OptEIA (BD Pharmingen). It was measured by ELISA using
  • NK activity (%) is Yac-1 of mouse spleen lymphocytes (this is a mouse lymphoma-derived cell and is used as a standard cell sensitive to mouse NK cells.
  • Sphere: Yac— 1 20: 1 and 10: 1 data).
  • NK activity increased in the order of the S-PT84 administration group, the unfermented kelp administration group, and the kelp fermented product administration group as compared with the control group.
  • IFN-y / IL_4 The results of IFN-y concentration, IL-4 concentration, and Thl / Th2 (IFN-y / IL_4), which are indicators of balance, are shown in FIGS. 4 and 5, respectively.
  • IFN-y / IL_4 the results of IFN-y concentration, IL-4 concentration, and Thl / Th2 (IFN-y / IL_4), which are indicators of balance, are shown in FIGS. 4 and 5, respectively.
  • the IFN- ⁇ concentration was unchanged in the S-PT84 administration group compared to the control group, but increased in the unfermented kelp administration group and significantly increased in the fermented kelp administration group.
  • the IL-14 concentration was only 40% to 70% higher than that of the control group, which was slightly higher in production in any treatment group.
  • Figure 5 shows that the Thl / Th2 balance is S
  • the PT84 administration group and the unfermented kelp administration group had Thl advantage only in the fermented kelp administration group, which showed no change compared to the target group. From the above results, it has been clarified that fermented kelp has the effect of enhancing steady-state immune function and has the effect of adjusting the Thl / Th2 balance to a Thl-dominated state.
  • Example 6 Effects of fermented cucumber kon on NK activity and Thl / Th2 cell balance (Thl / Th2 ratio)
  • the group composition was an additive-free group (O 011 01), a 3_? Chome 84 intake group (3_? Chome 84), and a fermented cucumber kelp intake group (fermented composition) obtained in Example 2.
  • S-P T84 dried dead bacteria
  • a solid feed supplemented with fermented cucumber to 5% by weight was freely consumed for one week.
  • the amount of S-PT84 in the S-PT84 intake group corresponds to the amount of S-PT84 in the fermented cucumber kelp.
  • spleen lymphocytes were prepared in the same manner as in Example 5.
  • the sputum activity (PINK method) of the obtained splenic lymphocytes and the IL 4 and IFN ⁇ concentrations after stimulation with concanaparin A were measured in the same manner as in Example 5.
  • NK activity (%) is mouse splenic lymphocyte ⁇ ac-1 (mouse lymphoma-derived cell, which is used as a standard cell sensitive to mouse NK cell.
  • the NK activity increased in the S-PT84 intake group compared to the non-addition group, and the increase was even more pronounced in the fermented cucumber intake group. Therefore, it was shown that the composition of the present invention has an immunostimulatory action.
  • composition of the present invention brings the ThlZTh2 balance to a Thl-dominant state.
  • Example 7 Stress-induced immunity reduction and balance of Thl and Th2 cells in fermented cucumber kon Effect on (Thl / Th2 ratio)
  • mice Twenty-four C57BL / 6 mice (6-week-old male) were divided into 4 groups of 6 mice so that the average body weight of each group was almost the same.
  • the groups consisted of the untreated group (Control), the stress load group (Stress), the stress load + S—PT84 intake group (S—PT84), and the stress load + fermented cucumber kelp intake group obtained in Example 2 (fermentation). Composition).
  • the solid feed supplemented with S-PT84 dry dead fungus
  • the solid feed supplemented with fermented cucumber to 5% by weight were ingested freely for one week.
  • the amount of S-PT84 in the S-PT84 intake group corresponds to the amount of S-PT84 in the fermented cucumber kelp.
  • NK activity (%) represents cytotoxicity of mouse spleen lymphocytes against ⁇ ac-1.
  • Stress stress group
  • NK activity decreased in the stress group (Stress) compared to the untreated group.
  • S-PT84 intake group the decrease in NK activity due to stress was suppressed, and in the fermented cucumber kontake group, NK activity was maintained at the untreated group level.
  • IL-4 concentration and IFN- ⁇ concentration are shown in FIGS. As is clear from FIGS. 10 and 11, both IL-4 and IFN- ⁇ concentrations were significantly reduced by stress loading (Stress).
  • Example 8 Antiallergic Action of Fermented Pepper BALB / C mice (7 weeks old ⁇ male) were divided into 6 groups.
  • the group consists of i) untreated group (Normal) (3 animals), ii) control group (Control) (9 animals), iii) S-PT84 (mixed with 0.0075% dry dead bacteria) intake group (12 animals), iv) Unfermented cucumber kon (5% mixed diet) intake group (unfermented composition) (9 animals) obtained in Example 2 V) S_PT84 (0.0075% mixed diet) + Unfermented cucumber kon (5% mixed diet) intake Group (10 animals), vi) Fermented cucumber kon (5% mixed diet) intake group (fermented composition) obtained in Example 2 (fermented composition) (8 animals).
  • S-PT84 For the S-PT84 group and the S-PT84 + unfermented cucumber konjac group, S-PT84 with the number of bacteria corresponding to the number of bacteria contained in the fermented cucumber kon was added to the feed.
  • AIN-93M Oriental Bioservices Co., Ltd.
  • AIN-93M Oriental Bioservices Co., Ltd.
  • OVA ovalbumin
  • 2 mg aluminum hydroxide gel were mixed and intraperitoneally administered to 5 groups of mice except the untreated group.
  • Fig. 12 shows the test results of the total IgE concentration. As is clear from FIG. 12, only the fermented cucumber kelp intake group of the present invention significantly suppressed the increase in IgE.
  • Fig. 13 shows the amount of IL 4 produced after each spleen cell was stimulated with concanaparin A.
  • OVA administration reduced IL 4 production compared to the untreated group (control group).
  • IL-4 production was further reduced in the S-PT84 + unfermented cucumber fed group.
  • IL-14 production increased in the fermented cucumber kelp intake group compared to the control group.
  • Fig. 14 shows the amount of IFN_y produced after concanaline A stimulation of each spleen cell. • By administering VA, the production of IFN-y decreased compared to the untreated group (control group). However, the production of IF N- increased in the S-PT84 + unfermented cucumber kon-take group and the fermented cucumber kon-take group compared to the control group. This effect was particularly strong in the fermented cucumber kelp intake group. [0074] From the results of this Example, it was revealed that the fermented cucumber of the present invention has an antiallergic action. In addition, no anti-allergic effect was observed when ingesting unfermented cucumber jelly or unfermented cucumber kon + lactic acid bacteria. Therefore, in order to exert an antiallergic effect, it has become clear that it is important to ferment sesame seeds, soybeans and kelp with lactic acid bacteria.
  • C57BLZ6 mice (7-week-old male) were divided into 3 groups so that the average body weights were almost the same.
  • the group consists of a control group (Control) (7 animals), an S _PT84 (mixed dry 0.005% feed) intake group (9 animals), and a fermented cucumber kon (5% mixed food) intake group obtained in Example 2 (fermentation). Composition) (9 animals).
  • the S-PT84 group used S-PT84 with the number of bacteria corresponding to the number of bacteria contained in the fermented cucumber kon.
  • AIN-93M basic feed was freely ingested, and in the other groups, AIN-93M basic feed was mixed with the above-specified ingredients and ad libitum.
  • the IgA content in the small intestinal wall extract was determined using ELISA (Purified IgA Antibody for the primary antibody, Biotin Conjugate IgA Ant ibody for the secondary antibody (both manufactured by Southern Biotech)), and Avidin- Horseradish peroxidase Conjugate for color development. Measured).
  • the amount of IgA is shown in FIG. As is apparent from FIG. 15, the amount of IgA in the small intestinal wall extract was significantly increased in the fermented cucumber kontake group compared to the control group. This action of the fermented cucumber of the present invention was stronger than when S-PT84 was ingested alone.
  • Example 10 Site-force-in production promoting effect from intestinal immunity cells by oral intake of fermented cucumber kon
  • C57BLZ6 mice (7-week-old male) were divided into 3 groups so that the average body weights were almost the same.
  • the group consists of a control group (7 animals), an S-PT84 intake group (mixed with 0.0075% dry dead bacteria) (9 animals), and a fermented cucumber kon (5% mixed food) intake group obtained in Example 2 (9 animals: Fermentation composition).
  • the AIN-93M basic feed was freely ingested, and in the other groups, the AIN-93M basic diet was mixed with the above-specified components and freely supplied.
  • the Peyer's patches were removed and cultured for cell culture (10% urine fetal serum, 0.2% antibiotics and antifungals).
  • Fig. 16 shows the test results for IL-4 production
  • Fig. 17 shows the test results for IFN-y production.
  • ddy mice (Japan SLC Co., Ltd.) were divided into 4 groups (10 per group) and water (0.6 mL) or 5 Omg / kg unfermented kelp (500 mg / kg) or fermented kelp (500 mg / kg) Daily oral gavage was administered.
  • Sarcomal 80 sarcoma cells were inoculated subcutaneously into the chest of the mice IX 10 6 cells at a time to prepare Sarcomal 80 tumor-bearing mice.
  • Sarcomal 80 tumor-bearing mice were continuously administered orally for 18 days. During the test period, the tumor diameter was measured, and the tumor size was determined according to the following formula (I) (Fig. 18).
  • the tumor size in the unfermented kelp-administered group and the fermented kelp-administered group each remained lower than that in the control group to which water had been administered, and in the fermented kelp-administered group 11, 15 and 19 days after tumor inoculation Tumor size was significantly smaller. In other words, fermented kelp was found to have a higher antitumor effect.
  • This pill was ingested by 40 healthy volunteers in an ingestion of 30 tablets per day (4.7 gZ as fermented cucumber kelp), and the immunoregulatory effect was examined.
  • the intake test was conducted as a crossover test. In other words, subjects were divided into two groups so that there was no statistical difference based on NK activity, age, and sex, and each group was ingested with fermented grains or the same form of placebo as an intake sampnore (intake period) 1) A 6-week washout period was established. After that, the intake sampnore of each group was replaced, and a placebo or fermented grain was ingested for another month (intake period 11).
  • leukocytes were cultured for 22 hours in the presence of PHA (phytohemagglutinin), IFN- ⁇ and IL-4 production in the culture supernatant was measured, and Thl / Th2 balance was angularly analyzed.
  • PHA phytohemagglutinin
  • Fig. 19 shows the test results of NK activity.
  • Ingestion period I and II significantly increased NK activity by ingesting fermented grains.
  • the amount of change in NK activity during intake periods I and II in FIG. 19 was determined, and the average value was calculated. The results are shown in FIG.
  • the amount of change in NK activity was significantly greater in the fermented grain intake group than in the placebo intake group.
  • IFN ⁇ and IL 4 production from leukocytes after PHA stimulation was measured, and the Thl / Th2 ratio (IFN— ⁇ production / IL 4 production) in the intake periods I and II was measured.
  • the amount of change (difference before and after intake: A Thl / Th2) was determined, and the average value was calculated. The results are shown in FIG. It was suggested that the fermented grain intake group is in a Thl-dominated state due to the intake of fermented grain, which has a significantly larger change in the ThlZTh2 ratio than the placebo group.

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Abstract

免疫賦活作用、抗アレルギー作用等の免疫調節作用を発揮する新規組成物を提供する。 乳酸菌で発酵させた昆布を単独で、または当該昆布を、乳酸菌で発酵させた胡麻、大豆と組み合わせて含む組成物が提供される。この組成物は、バランス良く栄養素を吸収することを可能とし、安全性が高く、優れた免疫調節作用を有する。                                                                               

Description

明 細 書
免疫調節作用を有する発酵組成物
技術分野
[0001] 本発明は、乳酸菌で発酵させた昆布を含有する免疫調節作用を有する組成物、よ り具体的には免疫賦活作用を有する組成物及び/または抗アレルギー作用を有す る組成物に関する。また、本発明は、乳酸菌で発酵させた昆布と、乳酸菌で発酵させ た胡麻と、乳酸菌で発酵させた大豆とを含む免疫調節作用を有する組成物に関する
背景技術
[0002] 近年、アレルギーに関する問題が急激に顕在化している。アレルギーには様々な 疾患があり、花粉症を筆頭にアトピー性皮膚炎、食品アレルギー、アレルギー性鼻炎 、アレルギー性喘息などの患者数が特に多いことが知られ、中でも花粉症の患者数 は飛躍的に増大していることが報告されている。この様な現状に対して、医薬品メー カーを中心にアレルギー克服のための研究が精力的に行われ、数々の製品が開発 された。その代表的なものは、抗アレルギー剤や抗ヒスタミン剤である力 これらの薬 剤はアレルギー発症機序の末端に位置するマスト細胞と呼ばれる顆粒球からの炎症 性物質の放出やレセプターへの作用を特徴としており、一過性の症状緩和をもたら す反面、アレルギー発症の根本には影響しなレ、。また、特に重い症状を有する患者 に対してはステロイド剤などが投与されることがあるが、この類の薬剤においてはその 副作用が問題となっている。このような状況の中、アレルギーの根本的な治療法及び 予防法が熱望されている。一方、 日本は高齢化社会を迎え、加齢による免疫力低下 に起因する高齢者の感染症による死亡が増加している。また、多忙な現代社会及び ストレス環境での生活によっても免疫力が低下することが知られており、その対策が 強く望まれている。
[0003] このような問題に対処するため、免疫調節機能を高めることによって、免疫力を向 上させて感染症を防止しうる、またはアレルギーを予防または治療しうる手段として、 身近な食品素材から製造される、穏やかな免疫調節作用を長期間に亙って発揮し、 ストレス環境下の人々の健康を維持できる、安全な経口摂取組成物を開発することが 急務とされている。
[0004] 日本においては古くから海藻を食する習慣が根付いており、特に昆布は強運食、 長寿食とされ、精進料理にも含まれる伝統食材である。海藻は、不足しがちなカルシ ゥム、ナトリウム、マグネシウム、リン、鉄、ョードなどのミネラルや、各種ビタミン、フコィ ダンなどの食物繊維を豊富に含有する食品であり、免疫調節作用を有することも明ら かになつている。また、乳酸発酵食品に関しては、これを食することが健康に良いと する認識が、科学的知見の集積とともにますます高まりつつあり、種々の乳酸菌及び /乳酸発酵食品の免疫調節作用も明らかになってきている。しかしながら、海藻も、 乳酸発酵食品も、いずれも単独で十分な免疫調節作用を有するとは言いがたい。し たがって、これら二つの要素を併せ持つ海藻由来の乳酸発酵素材が、健康機能の 向上を期待させる魅力的な素材と考えられる。しかし、昆布等の海藻には発酵菌株 が着床、成長するのに必要な栄養素が少ない。また、その培養には多くの手間と労 力と費用を要する。従って、海藻発酵食品及びその生理活性については、十分な検 ff寸がなされていない。
[0005] 海藻発酵物に関して、特許文献 1は、海藻の糖化、即ち発酵基質となる糖の供給 のために海藻類をセルラーゼ等で分解処理して単細胞化し、次レ、で乳酸菌及び/ または酵母を用いて発酵させる方法により得られる海藻発酵食品を開示している。こ の文献は、当該方法でマコンブ及びワカメが発酵されたことを記載しており、また、当 該方法で製造された海藻発酵食品、具体的にはワカメにセルラーゼ及び 3菌種（1種 類の乳酸菌： Lactobacillus brevis NRIFS B5201株と、 2種類の酵母： Debaryomyces hansenii NRIFSY5201株及び Candida zeylanoides NRIF SY5206株）を接種させて発 酵させた食品が、血中中性脂質低減作用及び肝臓脂質低減作用を有することも記 載している。
[0006] また、特許文献 2は、大豆及び昆布の混合物にクモノスカビ属の菌を摂取して発酵 させた後に未発酵の胡麻を混合することにより得られる発酵食品であって、簡便に摂 取することができ、栄養性 ·吸収性に優れた美味な食品を開示している。
特許文献 1 :特開 2003— 201号公報 特許文献 2：特許第 2846547号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明の目的は、身近な食品素材を使用して、当該素材に免疫調節機能を付与し または当該素材の免疫調節機能を高めることにより、安全性の高い優れた免疫調節 作用を有する組成物を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、植物性の乳酸菌を用いて、通常は発酵が困難といわれている昆布 を発酵してその乳酸菌発酵物を得ることに成功した。そして、本発明者らは、この昆 布の乳酸菌発酵物を経口摂取したときの生理活性について検討を重ねた結果、当 該発酵物が昆布単体及び Zまたは乳酸菌単体を摂取した場合と比べて顕著に向上 した免疫調節作用（免疫賦活作用、免疫バランス調整作用）を示すことを見出した。 また、本発明者らは、この昆布の乳酸菌発酵物の免疫調節機能をより効率的に発揮 させることができ、かつ優れた栄養価を有する食品素材の開発に向けて鋭意検討し たところ、乳酸菌で発酵させた昆布と、乳酸菌で発酵させた胡麻及び乳酸菌で発酵 させた大豆とを組み合わせて含む組成物力 驚くべきことに、経口摂取されたときに 予測に反するほど高い免疫賦活作用、抗アレルギー作用等の免疫調節作用を示す ことが判明した。この免疫調節作用は、乳酸菌単独や未発酵の発酵原料単独の作 用より著しく大きいことも判明した。しかも、この免疫調節作用は本発明の組成物をカロ 熱滅菌した後でも維持された。
[0009] 本発明はこれらの驚くべき知見に基づいて完成したものである。
[0010] 本発明は、
1.乳酸菌で発酵させた昆布を含有する、免疫調節作用を有する組成物；
2.免疫調節作用が免疫賦活作用及び Zまたは抗アレルギー作用である、 1に記載 の組成物；
3.乳酸菌が植物性乳酸菌である 1または 2に記載の組成物；
4.一回摂取量として、乳酸菌で発酵させた昆布を 5mg以上含有する、：!〜 3のいず れかに記載の組成物； 5.乳酸菌で発酵させた昆布と、乳酸菌で発酵させた胡麻と、乳酸菌で発酵させた大 豆とを含有する組成物；
6.乳酸菌が植物性乳酸菌である、 5に記載の組成物；
7.免疫調節作用を有する 5または 6に記載の組成物；
8.免疫調節作用が免疫賦活作用及び Zまたは抗アレルギー作用である、 7に記載 の組成物；
9.一回摂取量として、乳酸菌で発酵させた昆布と乳酸菌で発酵させた胡麻と乳酸菌 で発酵させた大豆とを合計で l〜10000mg、好ましくは 10〜10000mg含有する、 5〜9のいずれ力 4つに記載の組成物；
10.飲食物、食品添加物、健康食品または医薬組成物である、：!〜 9のいずれか 1つ に記載の組成物；
11.丸剤の形態である、 1〜： 10のいずれ力、 1つに記載の組成物；
12.乳酸菌で発酵させた昆布を有効成分として含有し、免疫調節作用を有する旨の 表示を付した飲食物
である。
発明の効果
[0011] 本発明の組成物は、食品素材力 製造されているため、安全性が高ぐ短期ないし 長期間にわたり、 日常的にまたは適当な日数間隔で継続的に摂取することができる。 したがって飲食物もしくは健康食品として摂取した場合、長期間にわたって免疫機能 を調節することにより、さまざまな要因で起こる免疫機能低下を防止することができる 。また、免疫機能のバランスを調節することにより、生体に悪影響を及ぼす免疫機能 の過度の亢進を防止することができる。
[0012] また、本発明の組成物は、医薬品として投与した場合、免疫機能の低下または免 疫機能の過度の亢進に起因する各種の症状を、穏ゃ力、な効き目で緩和ないし治癒 すること力 Sできる。
[0013] さらに、本発明の組成物は、昆布、大豆及び胡麻の優れた栄養価及び機能性を効 率的に利用することも可能とする。
図面の簡単な説明 [図 1]図 1は、マウス由来マクロファージを S— PT84株、未発酵昆布、発酵昆布、また は発酵胡豆昆で処理して当該マクロファージの IL 12の産生量を測定して得られた 結果を示すグラフである。
[図 2]図 2は、未発酵昆布、発酵昆布、未発酵胡豆昆、または発酵胡豆昆を摂取させ たマウスに由来するマクロファージの IL - 12産生量を示すグラフである。
[図 3]図 3は、 S -PT84,未発酵昆布、または発酵昆布を摂取させたマウスに由来す る脾臓リンパ球の NK活性を示すグラフである。
[図 4]図 4は、 S -PT84,未発酵昆布、または発酵昆布を摂取させたマウスに由来す る脾臓リンパ球の IFN_ または IL_ 4産生量を示すグラフである。
[図 5]図 5は、 S -PT84,未発酵昆布、または発酵昆布を摂取させたマウスに由来す る脾臓リンパ球の Thl/Th2バランスを示すグラフである。
[図 6]図 6は、 S _PT84、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させたマウスに由来する 脾リンパ球の NK活性を測定して得られた結果を示すグラフである。
[図 7]図 7は、 S— PT84、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させたマウスに由来する 脾細胞からの IL 4産生を測定して得られた結果を示すグラフである。
[図 8]図 8は、 S— ΡΤ84、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させたマウスに由来する 脾細胞からの IFN γ産生を測定して得られた結果を示すグラフである。
[図 9]図 9は、ストレス負荷時に S— ΡΤ84、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させたマ ウスに由来する脾細胞の ΝΚ活性を測定した結果を示すグラフである。
[図 10]図 10は、ストレス負荷時に S— ΡΤ84、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させた マウスに由来する脾細胞からの IL 4産生を測定して得られた結果を示すグラフで ある。
[図 11]図 11は、ストレス負荷時に S _PT84、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させた マウスに由来する脾細胞からの IFN_ 産生を測定して得られた結果を示すグラフ である。
[図 12]図 12は、 S_PT84、未発酵組成物、 S— PT84 +未発酵組成物、発酵組成 物をそれぞれ経口摂取させた OVA誘発アレルギーマウスの総 IgE濃度を測定して 得られた結果を示すグラフである。 [図 13]図 13は、 S— PT84 +未発酵組成物、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させた OVA誘発アレルギーマウスに由来する脾細胞からの IL 4産生を測定して得られた 結果を示すグラフである。
[図 14]図 14は、 S— PT84 +未発酵組成物、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させた OVA誘発アレルギーマウスに由来する脾細胞からの IFN_ y産生を測定して得ら れた結果を示すグラフである。
[図 15]図 15は、 S_PT84、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させたマウスの腸管腔 における総 IgA量を測定して得られた結果を示す。
[図 16]図 16は、 S_PT84、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させたマウスに由来す るパイエル板細胞からの IL_ 4産生を測定して得られた結果を示すグラフである。
[図 17]図 17は、 S_PT84、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させたマウスに由来す るパイエル板細胞からの IFN- y産生を測定して得られた結果を示すグラフである。
[図 18]図 18は、未発酵昆布又は発酵昆布をそれぞれ経口摂取させたマウスの Sale omal 80腫瘍サイズを測定して得られた結果である。
[図 19]図 19は、発酵粒を摂取させたヒトの NK活性を測定して得られた結果を示すグ ラフである。
[図 20]図 20は、発酵粒を摂取させたヒトの NK活性の変化量を示すグラフである。
[図 21]図 21は、発酵粒を摂取させたヒトの Thl/Th2比の変化量を示すグラフであ る。
発明を実施するための最良の形態
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本発明でいう昆布とは、褐藻類コンブ科コンブ属（Laminaria spp.)及びその近縁種 の総称をレヽい、例えば、マコンブ (L.japonica)、リシリコンブ (L.japonica var.ochotensi s)、ミツイシコンブ (し angustata)、ナガコンブ (し angustata var.longissima)、ホソメコン ブ (L.religiosa)、ネコァシコンブ (Arthrothamnus bifidus)、トロロコンブ (Kjellmaniella gyrata)、力ゴメ（Kjellmaniella crassifolia)が含まれる力 これらに限定されるものでは ない。
[0016] 本発明の乳酸菌で発酵された昆布 (乳酸菌発酵昆布）の原料となる昆布には、上 記した昆布の原藻もしくはその乾燥品で砂等の異物を取り除いたものを用いる。発酵 のしやすさから、切断または粉末化した昆布を用いるのが好ましぐまた塩、糖、ァミノ 酸、有機酸、核酸等で調味されているものを用いてもよい。このような昆布は一般に 市販されており、商品名「昆布パウダー」（焼津水産化学工業株式会社)や、商品名「 昆布パウダー」（有限会社惣万水産)等を例示できる。
[0017] 原料昆布を発酵させる乳酸菌は、昆布を発酵させることができるものであれば特に 限定されず、通常の方法により凍結乾燥して調製したもの、あるいは冷蔵保存したも のを用いることができる。乳酸菌としては、例えば、ラクトバチルス属（Lactobacillus) , ラタトコッカス属 (Lactococcus)、ストレプトコッカス属（Streptcoccus)、ビフイドバタテリ ゥム属（Bifidobacterium)、ロイコノストック属（Leuconostoc)などを挙げることができ、こ れらのうち一または二以上の乳酸菌を選択し、同時または逐次的に使用できる。中で も、植物成分を資化して生存する単離された乳酸菌 (植物性乳酸菌）は、昆布等の 栄養が豊富でない植物性原料でも発酵できること、酸やアルカリに強ぐ高濃度の食 塩の存在下でも生息できるために食品として利用しやすいこと、ヒトに有用とされる腸 管系で耐性があること等の理由から好適に用いられる。このような植物性乳酸菌とし ては、ラクトバチルス 'プランタラム（Lactobacillus plantarum)、ラタトバチルス'ベント ~~サス (Lactobacillus pentosus)、フクトノヽチノレス'ブレビス (Lactobacillus brevisノ、フク トバチノレス'フアーメンタム (Lactobacillus fermentum)、テトラジェノコッカス 'ノヽロフィノレ ス (Tetragenococcus halophilus)、へ "イ コッカス'ヘントサセ1ノス (Pediococcus pent osaceus)等が挙げられる。なお、本出願人は、しば漬けから免疫調節作用を有する 種々の植物性乳酸菌を単離した（特開 2005— 333919号公報参照）。本発明では、 これらの乳酸菌も好適に用いることができる。
[0018] また、本発明の乳酸菌には、ホモ乳酸発酵とヘテロ乳酸発酵のいずれの発酵形式 の乳酸菌を用いてもよぐヘテロ乳酸発酵で発生する酢酸、炭酸ガス、アルコール等 を香味付与の目的で利用することもできるが、炭酸ガスが大量に発生する場合には、 発酵タンク等を用いる製造工程におけるハンドリングが悪くなる場合もある。一方、ホ モ乳酸発酵は、乳酸を多く生成するため、昆布由来の腐敗菌等の影響により発酵過 程で腐敗を生じる危険性が少なぐ本発明に好適に用いることができる。 [0019] 本発明の乳酸菌発酵昆布は、通常、原料昆布に加水して上記乳酸菌を接種して 発酵させ、その後、加熱または照射 (好ましくは加熱）して発酵物を殺菌する。この殺 菌された発酵物をろ過または遠心分離 (好ましくはろ過）して、ほとんどの死滅した菌 類を除去することにより、乳酸菌発酵昆布を得ることができる。
[0020] 発酵を行う際には、予め滅菌処理を行っておくことが好ましい。滅菌処理の温度及 び時間は適宜設定すればよぐ例えば、 10分間 90°Cに保持される滅菌処理が例示 できる。また、昆布の発酵時には、昆布由来多糖類により、発酵液が著しく増粘する 場合があるので、アルギン酸リアーゼ等の酵素等を加えて作業性を向上させてもよい
[0021] 発酵処理は、上記の滅菌処理物に乳酸菌を含むスターターを加えることにより行う 。この際、発酵促進添加物としてグルコースのような糖類や大豆ペプチドのような窒 素源を添加することが好ましい。発酵処理の温度及び時間は、用いる乳酸菌の性質 により、適宜設定すればよい。発酵の度合いは、発酵処理物の pHを測定することに より判断でき、本発明の乳酸菌発酵昆布の場合、 pHが 5. 0以下になるまで発酵を行 うのがよい。
[0022] このようにして得られた乳酸菌発酵昆布は、液体状のまま使用してもよいが、作業 性'保存性の点から、噴霧乾燥または凍結乾燥により粉末化することが好ましい。
[0023] 古月^: Ι, で させた ^!、古月！ び ^:)
本発明は、上記の乳酸菌発酵昆布に、さらに乳酸菌で発酵させた胡麻と乳酸菌で 発酵させた大豆とを組み合わせることにより、免疫調節作用が増強されることを特徴と する。
[0024] ここで、本発明でいう胡麻とは、 Sesamun indicumの植物の種子をいレ、、例えば白 胡麻、黒胡麻、黄胡麻、茶胡麻などが含まれるが、これらに限定されなレ、。また、これ らを単独で使用しても、複数種類を混合して使用してもよい。本発明の乳酸菌で発酵 された胡麻 (乳酸菌発酵胡麻）の原料となる胡麻の形態は限定されず、粒、粉砕物、 ペースト等いずれも用いることができる力 S、発酵のしゃすさから、胡麻の粉砕物ゃぺ 一ストを用いるのが好ましい。胡麻のペーストは多数市販されており、例えば、商品名 「純練り胡麻黒」（竹本油脂株式会社)等を例示できる。なお、脂肪分の少ない乳酸 菌発酵胡麻を得ることを目的として、原料に脱脂胡麻を用いてもよいが、胡麻の有す る栄養価'機能性の観点から脱脂されていない油分を含む胡麻を用いるのが好まし レ、。
[0025] 本発明でいう大豆とは、 Glycine maxの植物の種子をレ、い、これには生育期間、産 地により異なる多数の品種が含まれる。本発明では特に限定されることなぐいずれ の品種も使用できる。本発明の乳酸菌で発酵された大豆 (乳酸菌発酵大豆）の原料 となる大豆には、固形大豆、大豆粉、大豆カス（soybean oil cake)、脱脂大豆、きな粉 、これらの加水分解物等、いずれも特に限定なく使用することができるが、発酵のし やすさから粉末化したものを用いるのが好ましい。このような大豆粉末は市販されて おり、商品名「黒大豆きなこ」（小林桂株式会社)、商品名「プロライフ J」（理研農産化 ェ株式会社)等を例示できる。なお、脂肪分の少ない乳酸菌発酵大豆を得る目的と して脱脂大豆を用いてもよい。
[0026] 本発明は、乳酸菌発酵昆布と乳酸菌発酵胡麻と乳酸菌大豆を含む組成物 (本明 細書中、「乳酸菌発酵胡豆昆」や「発酵胡豆昆」と表記することもある）に関する。該組 成物は、昆布、胡麻及び大豆原料をそれぞれ別個に乳酸菌発酵させた後に混合す ることにより調製してもよいし、原料となる昆布、胡麻及び大豆を混合して乳酸菌を接 種させることにより調製してもよい。
[0027] 別個に発酵させた後に混合して調製する場合、すなわち乳酸菌発酵昆布、乳酸菌 発酵胡麻及び乳酸菌発酵大豆を混合する場合、乳酸菌発酵昆布としては、上記の 製造法等により調製された乳酸菌発酵昆布を好適に使用できる。乳酸菌発酵胡麻と しては、上記の乳酸菌発酵昆布と同様にして調製した乳酸菌発酵胡麻ゃ特開 2004 — 173692号公報に記載されたもの等を使用できる。乳酸菌発酵大豆としては、上 記の乳酸菌発酵昆布と同様にして調製した乳酸菌発酵大豆ゃ特開 2003— 33569 5号公報に記載されたもの等を使用できる。
[0028] 原料となる昆布、胡麻及び大豆を混合して乳酸菌を接種させることにより調製する 方法として次の方法を例示できるが、これに限定されるものではなレ、。
[0029] まず、発酵原料である昆布、大豆、胡麻を準備する。これら原料は、場合により加工 して粉末またはペースト状にされる。或いは、市販の粉末またはペースト状材料を購 入して発酵原料として用いてもよい。次に、原料である昆布（例えば、昆布粉末）、大 豆 (例えば、大豆粉末）、胡麻 (例えば、胡麻ペースト）を所定の割合で混合し、加水 して滅菌処理を行う。滅菌処理の温度及び時間は適宜設定すればよぐ 10分間 90 °Cの滅菌処理を例示できる。次いで、得られた滅菌処理物へ乳酸菌を加えて (例え ば、乳酸菌を含むスターター等を加える）発酵処理を行う。発酵処理を行う際は、発 酵促進添加物として、ダルコースのような糖類や大豆べプチドのようなの窒素源を添 加することが好ましい。発酵処理の温度及び時間は、用いる乳酸菌の性質により適 宜設定すればよい。発酵の度合いは、発酵処理物の pHを測定することにより判断で きる。本発明の組成物の場合は、 pHが 5. 0以下になるまで発酵を行うのがよい。な お、滅菌処理工程及び/または発酵処理工程において、原料混合加水物または滅 菌処理物の粘度が高い場合には、アルギン酸リアーゼ等の酵素を加えることにより混 合物の粘度を低減させ、作業性を向上させることができる。
[0030] 発酵が終了したら、加熱殺菌を行い、冷却し、必要に応じて濾過する。加熱殺菌温 度は適宜設定すればよい。このようにして得られた液体状の発酵組成物を使用して もよいが、作業性 ·保存性の点から、かかる液体状の発酵組成物を噴霧乾燥し、粉末 体とすることが好ましい。この粉末は、茶褐色のきめ細かな粉体で、原料由来の香ば しレヽ香りと乳酸菌由来の酸味を有するものである。
[0031] なお、いずれの製造方法においても、用いる乳酸菌としては乳酸菌発酵昆布の場 合と同様に選択することができ、植物性乳酸菌を使用することが好ましい。本発明者 らはしば漬けより単離した乳酸菌を用いた予備試験より、ラクトバチルス ·ペントーサス (Lactobacillus pentosus)及びフクトノヽチノレス ·フ。フンタフム (Lactooacihus plantarum) は、昆布、大豆及び胡麻のいずれも良好に発酵できることが見出した。したがって、 植物性乳酸菌の中でも、これらの乳酸菌（ラタトバチルス.ペントーサス（Lactobacillus pentosus)及びフクトノくテノレス'フフンタフム (Lactobacillus plantarum) )を好適に用レヽ ること力 Sできる。昆布、胡麻及び大豆を混合して乳酸菌を接種させる製造方法におい ては、乳酸菌として、上記のラクトバチルス 'ペントーサス（Lactobacillus pentosus)及 びラクトバチルス ·プランタラム（Lactobacillus plantarum)のように昆布と胡麻と大豆の いずれをも発酵させることが可能な乳酸菌を用いる力、、またはそれぞれの素材を発 酵させることが可能な乳酸菌を複数種類同時に用いればよい。
[0032] 免疫調節作用
本発明の組成物、すなわち乳酸菌発酵昆布または乳酸菌発酵胡豆昆は、免疫調 節作用を有することを特徴としてレヽる。
[0033] 免疫とは、無数にある病原体や様々な有害物質から体を守ることにより各種疾病を 予防する機能、すなわち生体の恒常性を保つ機能であり、免疫機能が過剰に働くか または破綻すると、アレルギー疾患や自己免疫疾患が起こる。本発明でいう免疫調 節作用とは、加齢、ストレス、疲労、睡眠不足等により、免疫機能の一部が破綻する かまたは免疫機能が低下した場合に免疫反応を活性化させる作用（免疫賦活作用） や、免疫機能が過剰に働レ、た場合に免疫反応を抑制させる作用（免疫抑制作用）を 意味し、本発明組成物は、この免疫賦活作用と免疫抑制作用とを適切に機能させる ことによって、免疫バランスの最適化を図るものである。
[0034] 生体内免疫系には、抗原を認識するリンパ球である T細胞が存在し、産生するサイ トカインによって Thl細胞と Th2細胞とに分けられている。この Thlと Th2のバランス (Thl/Th2バランス）が、生体内の免疫反応に影響を与えており、例えば、ァレノレ ギーでは、 Thlが優位になると遅延型過敏症 (臓器移植の際に起こる拒絶反応など の IV型アレルギー）を引き起こし、また、 Th2が優位になると抗原特異的な IgE抗体 が産生され即時性過敏症（喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症、アトピー性皮膚炎など などの I型アレルギー）を引き起こすことが知られている。 Thl細胞は IFN— γを産生 し、 Th2細胞は IL— 4を産生するので、免疫バランスの指標には、この IL— 4と IFN γの比（IFN— γ /IL— 4)を用いることができる。
[0035] 本発明の組成物（乳酸菌発酵昆布及び乳酸菌発酵胡豆昆）は、生体の Thl/Th 2のバランスを Thl優位な状態に導くという特徴がある。上記したように、喘息、花粉 症、アトピー性皮膚炎などの I型アレルギーでは、 Th2が優位な状態になっていること が知られている。また、 HIVの感染においても Th2が優位になることが報告されてい る。さらに、 Thlが優位になると、マクロファージ、 NK細胞や細胞障害性 T細胞（CT L)の活性を促進し、ガンに対する抵抗性が上昇することが知られている。したがって 、本発明の組成物をそれ自体でまたは食品や医薬品などとして摂取して Thlが優位 な状態にすることにより、 I型アレルギーの治療や予防ばかりか、 HIV、ガンや細菌感 染への抵抗性を高め、その予防や治療を行うこともできる。
[0036] 本発明の組成物は、腸管の免疫力を向上させるという特徴をも有している。腸管免 疫とは、腸管に侵入する病原因子を鼻や喉からまたは飲食物等とともに排除するた めに腸管粘膜面に存在する防御システムである。小腸の粘膜に分布するパイエル板 がその司令塔的な役割を果たしており、パイエル板の出す抗体 (IgA)が病原菌ゃゥ ィルスをはじめとする異物を攻撃することが知られている。
[0037] このように、本発明の組成物（乳酸菌発酵昆布または乳酸菌発酵胡豆昆）は、免疫 調節用、免疫賦活用、免疫抑制用、または抗アレルギー用の組成物として有用であ る。
[0038] 飲 医. 。
本発明に係る組成物は、飲食物や医薬品等として用いることができるが、この組成 物は、身近にある栄養価の高い食品素材に免疫調節機能を付与しまたは免疫調節 機能を高めたものであり、安全性の高いものであるから、 日常的に摂取できる飲食物 として用いることが好ましい。飲食物に用いる場合には、免疫調節作用を有する健康 食品として実施することが好適である。ここでレ、う健康食品には、免疫機能調節作用 、免疫賦活作用及び/または抗アレルギー作用を有する旨の表示を容器や説明書 に付した飲食物 (例えば、特定保健用食品や条件付き特定保健用食品のような機能 性食品)も含まれる。表示場所 (容器またはそれに添付した指示書など）、容器形態（ 瓶、缶、ペットボトル、プラスチックボトル、紙パックなど）、及び表示の方法（印刷、刻 印、シールなど）は、何ら限定されない。なお、食品としての使用の態様には、本発明 の組成物を食品添加剤として用いる場合も含まれるものとする。
[0039] 本発明の組成物を飲食物として用いる場合、組成物をそのまま使用してもよぐまた 、公知の基剤、助剤、甘味料、酸味料、ビタミン等の各種成分と混合してユーザーの 嗜好に合う製品としてもよぐ例えば、本発明組成物は、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉 末剤、顆粒剤、キャンデー、ドロップ、トローチ、ガム、粉末ジュース、ドリンク剤、調味 料、加工食品、デザート類または菓子類等の形態で提供することが可能である。また 、本発明の乳酸菌発酵昆布または乳酸菌発酵胡豆昆は、まろやかな呈味を有するも のであるから、好適な形態の 1つは、飲食品を咀嚼して味わうことを可能とする形態で ある。具体的には、丸剤のような形態やビスケットのような形態を例示できる。丸剤は
、通常、油分が 1 %以下に調整されている。これは、保存中に生じる油分の滲出によ る丸剤の酸化劣化や丸剤どおしのくつっきを防止するためである。本発明の乳酸菌 発酵胡豆昆では、脱脂大豆、脱脂胡麻を用いれば丸剤の油分は 1 %以下に調整可 能であるが、素材（特に、胡麻）の栄養価を考えると脱脂したものを用いることが必ず しも適切ではなレ、。脱脂したものを用いない場合には 4〜： 15%程度の油分が組成物 に含まれ、上記した油分の滲出が生じうることになる。本発明者らはこの油分の滲出 を防ぐ丸剤の製造方法を検討した結果、見栄えをよくすることを目的として通常施さ れている生地磨き（素丸の表面を磨く処理）の工程において油分の滲出が著しく発生 することを見出し、この生地磨きの工程を行わず、シヱラックまたは糖で素丸をコーテ イングすることで、油分の滲出を防止できること確認した。
[0040] 本発明の飲食品は、免疫機能の調節（免疫賦活化、抗アレルギー等）のためにヒト 以外の動物にも使用することもできる。対象となる動物としては、犬、猫等のペット類、 豚、牛等の家畜類、ニヮトリ等の家禽類、マウス、モルモット等の実験動物の他、養殖 水産動物等が挙げられる。飲食品の形態としては、それ自体で使用することも可能で あるが、動物または魚介類用の飼料 (ペットフード）に添加しての供与や、サプリメント のような形態での供与を行うことができる。
[0041] 医薬品としての用途は、例えば、免疫賦活剤ゃ抗アレルギー剤のような免疫調節 剤を挙げること力 Sできる。また、本発明組成物は、主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、 滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の医薬の製剤技術分 野において通常使用する公知の補助剤を用いて製剤化することができる。剤型とし ては、丸剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、座剤、注射剤等を挙げる ことができる力 特にこれらに限定されるものではない。投与期間は、特に限定される ものではないが、 1週間〜 10日以上の連続投与がよぐ好ましくは恒常的な連続投 与がよい。
[0042] 本発明の飲食品または医薬品における本発明の組成物（乳酸菌発酵昆布または 乳酸菌発酵胡豆昆）の含有量は特に制限されないが、一般的には 0. 1〜： 100重量 %、好ましくは 1〜90重量％、さらに好ましくは 1〜 50重量％程度である。
[0043] 本発明の組成物からなる、または本発明の組成物を含有する食品または医薬品は 、一回投与分として乳酸菌発酵昆布、または乳酸菌発酵胡豆昆を、乾燥重量換算で 1〜： 10000mg、好ましくは 10〜10000mg含有する力 本発明の組成物は安全性 が高いため、その含有量の上限は実質的に存在しない。
実施例
[0044] 以下に、本発明の組成物について実施例を挙げて詳細に説明する。但し、本発明 は実施例に限定されるものではない。
[0045] 試験例 1 乳酸菌発酵試験（1)
乳酸菌による昆布の発酵の可能性を調べた。昆布には、粉末状の昆布 (焼津水産 化学工業株式会社製の商品名「昆布パウダー」）を用いた。これに、昆布:水 = 5 : 95 (重量比）となるように蒸留水を添加して混合し、この混合液を 110°Cで 1分間滅菌し 、その後、スターターとして表 1に示す 8種類の乳酸菌 (A〜F) (特開 2005— 33391 9号公報参照）のうちの一種を 0· 5%になるように植菌した。得られた混合物を 37°C で 48時間発酵させ、発酵前後における pHを測定し、乳酸菌 A〜Dについては発酵 後の菌数を測定した。なお、表中の乳酸菌 A (S _PT84)は、独立行政法人産業技 術総合研究所特許生物寄託センターに、 FERM ABP— 10028として寄託されて いる。
[0046] [表 1]
【表 1】
Figure imgf000015_0001
[0047] 発酵後の菌数、及び発酵前後における pHについての結果を表 2に示す。 8種の乳 酸菌の内のいずれを用いても乳酸菌数の増加及び/または pHの低下が確認でき、 乳酸菌により昆布の発酵が進むことが明らかとなった。
[表 2]
【表 2】
Figure imgf000016_0001
[0049] 試験例 2 乳酸菌発酵試験（2)
試験例 1で使用した乳酸菌による胡麻及び大豆の発酵の可能性を調べた。胡麻に は、竹本油脂株式会社製のペースト状の胡麻（商品名「純練り胡麻'黒」）を、大豆に は、小林桂株式会社の粉末状大豆 (商品名「黒大豆きな粉」）を用いた。これに、胡 麻:水 = 25： 75 (重量比）、大豆：水 = 15： 85 (重量比）となるように蒸留水を添加して 混合し、試験例 1と同様にして滅菌、発酵処理を行い、発酵前後における pHを測定 し、発酵後の菌数を測定した。なお、発酵後の菌数は、胡麻は 8種の乳酸菌につい て、大豆は乳酸菌 A〜Dについてカウントした。
[0050] 発酵後の菌数、及び発酵前後の pHについての結果を表 3に示す。 8種の乳酸菌 のいずれを用いても乳酸菌数の増加及び/または pHの低下が確認でき、乳酸菌に より胡麻及び大豆の発酵が進むことが明らかとなった。
[0051] [表 3]
【表 3】
Λ B C D R F G H
107cuf/g 30 73 28 40 33 1 5
胡
初発 p H 6. 1 3
麻
最終 Ρ ί ΐ 4. 58 4. 50 4. 6T 4. 68 4. 77 4. 74 5, 22 5. 16
107cu f/g 73 56 92 106 - - - - 大
初発 p H 6. 08
豆
最終 P H 4. 36 4. 33 4. 5 1 4. 54 4. 53 4. 54 4. 28 4. 24 [0052] 実施例 1 昆布の乳酸菌発酵物の調製
昆布には、焼津水産化学工業株式会社製の粉末状昆布 (商品名「昆布パウダー」） を用いた (以下、これを「未発酵昆布」と表記する)。未発酵昆布に、アルギン酸リア一 ゼ (ナガセケムテックス社製）を分散させた滅菌水を添加し、 90°Cで 20分間加熱滅菌 した。スターターとして、乳酸菌（ラタトバシラス'ペントーサス S— PT84株）を、 2%グ ルコース、 1%酵母エキス（三菱化学フーズ株式会社)、 1%大豆ペプチド（不二製油 株式会社製）の栄養条件下で 20時間培養させて得られたバルタスターターを用いた 。このスターターを、滅菌処理を行った昆布混合液に添加し、温度約 37°Cで約 14時 間発酵を行った。発酵終了後、発酵液を 90°C、 10分で加熱殺菌し、冷却して 20メッ シュで濾過し、得られたろ液を噴霧乾燥機 (日本ビュッヒ株式会社製 ミニスプレード ライヤ一 B-290型）により乾燥させて、昆布の乳酸菌発酵組成物（以下、これを「発酵 昆布」と表記する）を得た。
[0053] 実施例 2 胡麻 '大豆'昆布混合物 (胡豆昆）の乳酸菌発酵物の調製
胡麻には、竹本油脂株式会社製の「純練り胡麻 ·黒」を、大豆には、小林桂株式会 社の「黒大豆きな粉」を、昆布には、実施例 1同様アルギン酸リアーゼ（ナガセケムテ ックス社製)で処理した焼津水産化学工業株式会社製の「昆布パウダー」を用いた。 胡麻：大豆：昆布が 1 : 3 : 1 (重量比）となるように混合し (以下、これを「未発酵胡豆昆 」または「未発酵組成物」とも表記する）、この混合物に黒砂糖 (胡麻に対して重量比 で 1/3)、大豆ペプチド（胡麻に対して重量比で 1/15)を発酵促進添加物として添 加した。この胡麻 ·大豆 ·昆布混合物を実施例 1と同様にして発酵させた後、発酵物 を 90°C、 10分で加熱殺菌し、冷却して 20メッシュで濾過し、得られたろ液を噴霧乾 燥機 (日本ビュッヒ株式会社製 ミニスプレードライヤー B-290型）により乾燥させて、 胡麻'大豆 ·昆布混合物の乳酸菌発酵組成物（以下、これを「発酵胡豆昆」または「発 酵組成物」とも表記する）を得た。
[0054] 実施例 3 マクロファージからの IL_ 12産生に対する促進作用（In vitro試験）
C57BLZ6マウス（7週齢 ·雄、 10匹、清水実験材料）の腹腔内に、一匹あたり 5m Lの PBS (Phosphate-Buffer Salines)を投与し、無菌的に腹腔内細胞を回収した。回 収した細胞を細胞培養用培地（10%FBS (ゥシ胎児血清)含有 RPMI1640培地（日 水製薬株式会社)）にて洗浄し、溶血バッファーを用いて赤血球を溶血除去した。す なわち、回収した細胞に lmLの溶血バッファー（155mM NH Cl、 10mM KHC
4
O、 0, ImM EDTA)を加えて、室温で 2〜3分静置し、細胞培養用培地を 9mL加
3
えた。攪拌した後、遠心分離（20°C、 1500rpm、 3分間）し、沈殿物を細胞培養用培 地にて 1回洗浄した。血球計算板を用いて細胞数を計測し、 l X 106cells/mLの濃 度の液を細胞培養用培地で調製し、この液を 48穴カルチャープレート（組織培養プ レート）に、一穴あたり 500 z Lを播種した。これを 5%C〇、 37°Cにて 3時間培養した
2
後、培地を除くことにより非接着性細胞を除去し、再度細胞培養用培地を添加した。
[0055] 実施例 1及び 2で得た未発酵昆布、発酵昆布、及び発酵胡豆昆を一定量秤量して 乳鉢で粉砕し、細胞培養用培地に懸濁した液 (未発酵昆布懸濁液、発酵昆布懸濁 液、発酵胡豆昆懸濁液）を試料として得て、これら試料を上記の細胞プレートに、最 終濃度がそれぞれ、： g/mL及び 10 x gZmLになるようにプレートに添カ卩して、 5 %CO、 37°Cにて 18時間培養した。また、比較として S— PT84 (乾燥死菌）を細胞
2
培養用培地に懸濁した液を、最終濃度が 1. 5ng/mL及び 15ng/mLになるように 添加して、 5% CO、 37°Cにて 18時間培養した。なお、 S— PT84株の最終濃度は、
2
1 μ g/mL及び 10 μ g/mLの発酵胡豆昆懸濁液中の S— ΡΤ84株量に相当する 濃度である。培養上清中に含まれるサイト力イン (インターロイキン 12； IL— 12)量を ELISAキット（〇ptEIA、 BD Pharmingen社）により測定した。また、何も添加しな い培養液を Control (Cont)として同様に測定を行った。
[0056] 培養上清中 IL 12濃度の試験結果 (N = 2の平均値）を図 1に示した。未発酵昆 布、発酵昆布、発酵胡豆昆の高濃度の添加により、培養液中 IL 12濃度の上昇が 認められた。また、未発酵昆布を添加した場合よりも発酵昆布の添カ卩により IL— 12 濃度が増加すること、さらに発酵昆布を添加した場合よりも発酵胡豆昆の添カ卩により I L一 12濃度が増加することが示唆された。以上の結果から、未発酵昆布よりも発酵昆 布で、また発酵昆布よりも発酵胡豆昆で免疫賦活作用が高いことが明らかとなった。
[0057] 実施例 4 マクロファージからの IL— 12産生に対する促進作用（Ex vivo試験）
C57BLZ6マウス（7週齢 ·雄、 15匹）を各群の平均体重がほぼ同じになるように 3 匹ずつ 5群に分けた。群構成は無処置群（Control)、未発酵昆布投与群（lOmgZ マウス）、発酵昆布投与群（10mg/マウス）、未発酵胡豆昆投与群（10mg/マウス） 、発酵胡豆昆投与群（lOmg/マウス）とした。 Controlを除く各投与群では、実施例 1及び 2で得た未発酵昆布、発酵昆布、未発酵胡豆昆及び発酵胡豆昆を、 20mg/ mLとなるように PBSを添加して懸濁液を得て、得られた液をそれぞれ 0. 5mLずつ 腹腔内投与した。投与 18時間後に腹腔内に 5mLの PBSを投与し、無菌的に腹腔内 細胞を回収した。回収した細胞を細胞培養用培地で洗浄し、実施例 3のように、溶血 バッファーを用いて赤血球を除去した。血球計算板を用いて細胞数を計測し、 2 X 1 06cells/mLの濃度の液を細胞培養用培地を用いて調製し、この液を 48穴カルチヤ 一プレート（組織培養プレート）に、一穴あたり 500 を播種した。これを 5%CO、 3
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7°Cにて 3時間培養した後、非接着性細胞を除去し、最終濃度力 Sl00ng/mLになる ように LPS (リポポリサッカライド）を添カ卩して 5%CO、 37°Cにて 24時間培養した。培
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養上清中に含まれる IL—12量を ELISAキット（〇ptEIA、 BD Pharmingen社）に より測定した。
[0058] 培養上清中 IL— 12濃度の測定結果 (N = 2〜 3の平均値）を図 2に示した。この結 果から明らかなように、未発酵昆布投与群及び未発酵胡豆昆投与群では IL— 12濃 度の増加は認められなかったが、発酵昆布投与群及び発酵胡豆昆投与群では高い IL 12産生増加が認められ、特に発酵胡豆昆投与群で IL 12産生量が有意に上 昇した。以上の結果から、未発酵昆布、未発酵胡豆昆には LPS刺激によるマクロファ ージ活性化を増強する効果はなぐその効果は発酵昆布、発酵胡豆昆にあること、ま た発酵昆布よりも発酵胡豆昆でその効果がさらに高いことが明らかとなった。
[0059] 実施例 3および 4の結果は、本発明の組成物が、その発酵原料から予測できないほ ど優れた免疫調節作用を有することを示している。
[0060] 実施例 5 昆布発酵物の NK活性及び Thl細胞と Th2細胞のバランス（Thl/Th2 比）に対する効果
C57BLZ6マウス（6週齢 ·雄） 12匹を各群の平均体重がほぼ同じになるように 3匹 ずつ 4群に分けた。群構成は、無添加群（〇011 01)、 3_?丁84投与群、未発酵昆 布投与群及び発酵昆布投与群とした。無添加群を除く各投与群では、 S— PT84 (乾 燥死菌）を一匹あたり 0. 75mg/kg (S— ΡΤ84投与群）、実施例 1の未発酵昆布 (未 発酵昆布投与群)及び発酵昆布 (発酵昆布投与群）を一匹あたり 500mg/kg、連日 強制経口投与した。なお、 S— PT84投与群における S— PT84の量は、発酵胡豆昆 中の S— PT84の量に相当する。投与開始 7日目に脾臓を無菌的に摘出後、細胞培 養用培地（10%ゥシ胎児血清、 0. 2%抗生物質一抗真菌剤混合溶液 (Nacalai T esque社製）を含む RPMI1640培地）中セルストレーナ一（70 μ m、 BD Falcon社 製）上で軽く圧迫することにより、細胞を取り出した。 pipettingにより細胞を分散させた 後、遠心分離（1500rpm、 3分間、 4°C)した。実施例 3のように、赤血球を溶血除去 した後、脾リンパ球を調製した。この脾リンパ球の NK活性を PINK法（PINK法とは、 標的細胞である Yac_ 1を疎水性膜系蛍光色素 3， 3' -dioctadecyloxacarbocya nine perchlorate (Dio)で標識し、さらに、死細胞の核を膜不透過性核酸結合蛍 光色素 propidium iodide (PI)により二重染色し、傷害されなかった Yac_lは Dio 単染色、傷害された Yac_ lは二重染色でフローサイトメトリーで検出することにより、 マウス脾細胞の細胞障害活性を算出する方法である）により測定した。また、この脾リ ンパ球をコンカナパリン Α (2.5 μ g/mL)刺激下で 24時間培養し、培養上清中に産 生された IFN— γ及び IL— 4の量を OptEIA(BD Pharmingen社)を用いた ELISA 法にて測定した。
[0061] NK活性の結果を図 3に示した。図 3中、 NK activity(%)はマウス脾リンパ球の Y ac— 1 (これはマウスリンパ腫由来細胞であり、マウス NK細胞に感受性の細胞として 標準的に使用されている。結果はマウス脾リンパ球: Yac— 1 = 20 : 1及び 10 : 1のデ ータを示している。）に対する細胞傷害性を表している。図 3から明らかなように、対照 群に比較して S— PT84投与群、未発酵昆布投与群、昆布発酵物投与群の順に NK 活性は増加した。
[0062] IFN- y濃度及び IL— 4濃度、バランスの指標である Thl/Th2 (IFN- y /IL _4)の結果をそれぞれ図 4、 5に示した。図 4から明らかなように、 IFN— γ濃度量は 対照群に比較して S— PT84投与群では変化がなかったが、未発酵昆布投与群で 増加し、発酵昆布投与群で有意に増加した。一方、 IL一 4濃度については対照群に 比較していずれの投与群でもわずかに産生が高かった力 40〜70%の増加に留ま つた。これら結果をもとに作成された図 5によると、 Thl/Th2バランスに関しては、 S PT84投与群、未発酵昆布投与群では対象群と比較して変化がなぐ発酵昆布投 与群でのみ Thl優位となった。以上の結果から、発酵昆布には定常状態の免疫機 能を増強させる効果があること、また Thl/Th2バランスを Thl優位な状態に調節す る作用を有することが明らかとなった。
[0063] 実施例 6 発酵胡豆昆の NK活性及び Thl細胞と Th2細胞のバランス（Thl/Th2 比）に対する効果
C57BLZ6マウス（6週齢 ·雄） 18匹を各群の平均体重がほぼ同じになるように 6匹 ずつ 3群に分けた。群構成は、無添加群（〇011 01)、 3_?丁84摂取群（3 _?丁84) 及び実施例 2で得た発酵胡豆昆摂取群 (発酵組成物）とした。各摂取群では、 S -P T84 (乾燥死菌）を 0.0075重量％となるように添加した固形飼料、発酵胡豆昆を 5重 量％となるように添加した固形飼料を 1週間自由摂取させた。なお、 S— PT84摂取 群における S— PT84の量は、発酵胡豆昆中の S— PT84の量に相当する。摂取開 始 8日目に脾臓を摘出し、実施例 5と同様にして脾リンパ球を調製した。得られた脾リ ンパ球の ΝΚ活性（PINK法）、並びにコンカナパリン A(2.5 /i g/mL、 24時間）刺 激後の IL 4及び IFN γ濃度を実施例 5と同様に測定した。
[0064] ΝΚ活性の結果を図 6に示した。図 6中、 NK activity(%)はマウス脾リンパ球の Υ ac— 1 (マウスリンパ腫由来細胞で、マウス NK細胞に感受性の細胞として標準的に 使用されている。結果はマウス脾リンパ球: Yac— 1 = 80 : 1のデータを示している。 ) に対する細胞傷害性を表している。図 6から明らかなように、無添加群に比較して S— PT84摂取群は NK活性が上昇し、発酵胡豆昆摂取群でその上昇はさらに顕著とな つた。従って、本発明組成物は免疫賦活作用を有することが示された。
[0065] IL— 4濃度、 IFN— y濃度の結果をそれぞれ図 7、 8に示した。図 7から明らかなよ うに、 IL— 4濃度については S— PT84摂取及び発酵胡豆昆摂取による変化は認め られなかった。一方、図 8によると、 IFN— γ濃度に関しては、無添加群に比較して S 一 ΡΤ84摂取群で上昇し、発酵胡豆昆摂取群ではその上昇はさらに顕著となった。
[0066] 即ち、この実施例から、本発明組成物は、 ThlZTh2バランスを Thl優位な状態に することが明らかとなった。
[0067] 実施例 7 発酵胡豆昆のストレス誘発免疫低下及び Thl細胞と Th2細胞のバランス (Thl/Th2比）に対する効果
C57BL/6マウス（6週齢 ·雄） 24匹を各群の平均体重がほぼ同じになるように 6匹 ずつ 4群に分けた。群構成は、無処置群（Control)、ストレス負荷群 (Stress),ストレ ス負荷 + S— PT84摂取群（S— PT84)及びストレス負荷 +実施例 2で得た発酵胡 豆昆摂取群 (発酵組成物）とした。各摂取群では、 S— PT84 (乾燥死菌）を 0.0075 重量％となるように添加した固形飼料、発酵胡豆昆を 5重量％となるように添加した 固形飼料を 1週間自由摂取させた。なお、 S— PT84摂取群における S— PT84の量 は、発酵胡豆昆中の S— PT84の量に相当する。摂取開始 8日目に、ストレス負荷群 18匹を 1度水浸（submerge)させた後、先端に空気穴を施した 50mLのポリエチレン チューブに入れ、 24時間拘束した。無処置群は 24時間、絶水、絶食とした。その後 、実施例 5と同様に脾臓を摘出して脾リンパ球を調製し、 NK活性 (PINK法)を測定 した。またコンカナパリン A(2.5 z gZmL、 24時間）刺激後の IL— 4及び IFN_ γ濃 度を測定した。
[0068] ΝΚ活性の結果を図 9に示した。図 9中、 NK activity(%)はマウス脾リンパ球の Υ ac— 1に対する細胞傷害性を表している。図 9から明らかなように、無処理群に比較 してストレス負荷群（Stress)では NK活性が低下した。 S— PT84摂取群ではストレス による NK活性の低下が抑制され、発酵胡豆昆摂取群では無処置群レベルに NK活 性が維持された。 IL— 4濃度、及び IFN— γ濃度の結果を図 10、 11に示した。図 10 、 11から明らかなように、ストレス負荷により IL— 4及び IFN—γ濃度がともに顕著に 低下した（Stress)。この群においては IFN— γ濃度の低下が IL 4濃度の低下より 顕著であったため、 Thl/Th2バランスは Th2優位な状態となったと理解される。スト レス下における IL— 4濃度については S— PT84摂取及び発酵胡豆昆摂取による変 化は認められなかった。一方 IFN— γ濃度はストレス負荷群に比較して S— PT84摂 取群で上昇し、発酵胡豆昆摂取群ではその上昇はさらに顕著となった。
[0069] 以上の結果から、胡麻 '大豆'昆布の乳酸菌発酵物 (発酵胡豆昆）は定常状態の免 疫機能を増強させるだけでなぐストレス時の免疫低下を抑制することが明らかとなつ た。またこの効果は乳酸菌単独ではなぐ発酵胡豆昆で顕著に認められた。
[0070] 実施例 8 発酵胡豆昆の抗アレルギー作用 BALB/Cマウス（7週齢 ·雄）を 6群に分けた。群構成は、 i)無処置群（Normal) (3 匹）、 ii)対照群 (Control) (9匹）、 iii) S— PT84 (乾燥死菌 0.0075%混餌)摂取群（1 2匹）、 iv)実施例 2で得た未発酵胡豆昆（5%混餌)摂取群 (未発酵組成物）（9匹）、 V ) S _PT84 (0.0075%混餌） +未発酵胡豆昆（5%混餌)摂取群（10匹）、 vi)実施 例 2で得た発酵胡豆昆（5%混餌)摂取群 (発酵組成物）（8匹）とした。なお、 S— PT 84群及び S— PT84 +未発酵胡豆昆摂取群には発酵胡豆昆に含まれる菌数に相 当する菌数の S— PT84を飼料に添加した。無処置群、対照群には AIN— 93M (ォ リエンタルバイオサービス株式会社製）基本飼料を、その他の群には、 AIN- 93M に上記に特定した成分を混餌させて調製した特別飼料を、それぞれ自由摂取させた 。摂取開始から 1週間後及び 2週間後に、 20 x gの卵白アルブミン (OVA)と 2mgの 水酸化アルミニウムゲルを混和して、無処置群を除く 5群のマウスに腹腔内投与した 。摂取開始から 4週間後に心臓採血を行い、血清飼料を調製し、血清中の総 IgE濃 度を測定した。また、このとき脾細胞も分離'培養し、コンカナパリン A (2.5 i g/mL) 刺激下で 24時間培養し、培養上清中に産生された IFN— y及び IL 4の量を測定 した。総 IgE、 IFN- γ、 IL— 4の測定は OptEIA(BD Pharmingen社製)を用いた ELISA法にて測定した。なお、それぞれの群における飼料の総摂取量は、いずれも 約 3. 0gであった。
[0071] 総 IgE濃度の試験結果を図 12に示した。図 12から明らかなように、本発明の発酵 胡豆昆摂取群のみ有意に IgEの上昇を抑制した。
[0072] それぞれの脾細胞をコンカナパリン Aで刺激した後の IL 4産生量を図 13に示し た。 OVA投与を行うことで無処置群と比較して IL 4の産生量が低下した（対照群） 。 IL— 4産生量は、 S— PT84 +未発酵胡豆昆摂取群においてさらに低下した。しか しながら、発酵胡豆昆摂取群では、 IL一 4の産生量が対照群と比較して上昇した。
[0073] それぞれの脾細胞をコンカナパリン A刺激した後の IFN_ y産生量を図 14に示し た。〇VA投与を行うことで IFN— yの産生量が無処置群と比較して低下した（対照 群)。し力、しながら、 S— PT84 +未発酵胡豆昆摂取群、発酵胡豆昆摂取群では、 IF N- の産生量が対照群と比較して上昇した。この効果は、特に発酵胡豆昆摂取群 が強く示した。 [0074] この実施例の結果から、本発明の発酵胡豆昆は抗アレルギー作用を有することが 明らかとなった。また、未発酵胡豆昆、未発酵胡豆昆 +乳酸菌の摂取では抗アレル ギー作用が認められなかった。したがって、抗アレルギー作用を発揮させるためには 、胡麻 ·大豆 ·昆布を乳酸菌発酵させることが重要であることが明らかとなった。
[0075] 実施例 9 発酵胡豆昆の経口摂取による IgA分泌増強作用
C57BLZ6マウス（7週齢 ·雄）を平均体重がほぼ同じになるように 3群に分けた。群 構成は、対照群（Control) (7匹）、 S _PT84 (乾燥死菌 0.0075%混餌)摂取群（9 匹）、及び実施例 2で得た発酵胡豆昆（5%混餌)摂取群 (発酵組成物）（9匹）とした。 なお、 S— PT84群は、発酵胡豆昆に含まれる菌数に相当する菌数の S— PT84を用 いた。対照群には、 AIN-93M基本飼料を、その他の群には、 AIN— 93M基本飼 料に上記に特定した成分を混餌させて調製した特別飼料を、それぞれ自由摂取させ た。摂取開始 1週間後に、小腸を摘出し、内部を PBSで洗浄後、 4倍量の 0.05%Tw een20を含む PBSを添カ卩し、ポリトロンホモジナイザーにて均質化した。遠心分離後 の上清を回収し、小腸壁抽出物を得た。小腸壁抽出物中の IgA量は、 ELISA法（一 次抗体は Purified IgA Antibody, 二次抗体は Biotin Conjugate IgA Ant ibody (ともに Southern Biotech社製）を使用し、発色には Avidin— Horseradish peroxidase Conjugate 用いた)で測疋した。
[0076] IgA量を図 15に示した。図 15から明らかなように、発酵胡豆昆摂取群では対照群 と比較して小腸壁抽出物中の IgA量が有意に上昇した。本発明の発酵胡豆昆のこの 作用は、 S— PT84を単独で摂取した場合より強かった。
[0077] 実施例 10 発酵胡豆昆の経口摂取による腸管免疫担当細胞からのサイト力イン産 生促進作用
C57BLZ6マウス（7週齢 ·雄）を平均体重がほぼ同じになるように 3群に分けた。群 構成は、対照群（7匹）、 S— PT84摂取群（乾燥死菌 0.0075%混餌）（9匹)及び実 施例 2で得た発酵胡豆昆（5%混餌)摂取群（9匹:発酵組成物）とした。対照群には AIN-93M基本飼料を、その他の群には、 AIN— 93M基本飼料に上記に特定した 成分を混餌させて調製した特別飼料を、それぞれ自由摂取させた。 1週間後にパイ エル板を摘出し、細胞培養用培地（10%ゥシ胎児血清、 0. 2%抗生物質一抗真菌 剤混合溶液（Nacalai Tesque社製）を含む RPMI1640培地）中のセルストレーナ 一（70 /i m、 BD Falcon社製）上で軽く圧迫することにより、細胞を取り出し、パイエ ル板細胞試料を調製した。 10%FBS添加 RPMI培地中で細胞 5 X 106個にコンカナ バリン A2. 5 z gZmLを 24時間作用させ、上清中に産生される IL— 4及び IFN_ y 量を〇ptEIA(BD Pharmingen社)を用いた ELISA法で測定した。 IL— 4産生量の 試験結果を図 16、 IFN- y産生量の試験結果を図 17に示した。
[0078] 図 16及び図 17から明らかなように、発酵胡豆昆摂取マウスから調製したパイエル 板細胞では対照群と比較して IFN_ 及び IL_4産生量が有意に上昇した。一方、 乳酸菌摂取群（S— PT84)においては、このような作用は認められな力、つた。
[0079] 実施例 9及び 10の結果から、乳酸菌単独ではなぐ発酵胡豆昆を経口摂取した場 合のみ、腸管免疫賦活作用が認められることが明らかとなった。本発明の発酵組成 物のこのような効果は、発酵原料の作用からは到底予測できるものではなレ、。
[0080] 実施例 11 昆布発酵物の抗腫瘍効果
ddyマウス（日本 SLC (株））を 4群（1群につき 10匹）に分け、水（0· 6mL)または 5 Omg/kg未発酵昆布（500mg/kg)または発酵昆布（500mg/kg)を連日強制経 口投与した。強制経口投与開始 2日目にマウス胸部に Sarcomal80肉腫細胞を I X 106cellsずつ皮下接種し、 Sarcomal80担癌マウスを調製した。 Sarcomal80担癌 マウスには継続して 18日間経口投与を行った。試験期間中、腫瘍径を測定し、下記 の（I)式に従い腫瘍サイズを求めた（図 18)。その結果、未発酵昆布投与群と発酵昆 布投与群での腫瘍サイズはそれぞれ水を投与していた対照群に比較して低く推移し 、発酵昆布投与群では腫瘍接種 11、 15および 19日後の腫瘍サイズが有意に小さか つた。つまり、発酵昆布のほうが高い抗腫瘍効果があることがわかった。
(I)腫瘍サイズ (mm2) =最大径 (mm) X最小径 X 3. 14 実施例 2で調製した胡麻と大豆と昆布の乳酸菌発酵組成物 (発酵胡豆昆）を用い、 表 4に示す配合で発酵胡豆昆含有の丸剤（以下、発酵粒と称する。 ) (一粒の重量 : 3 50mg)を製造した。具体的には発酵胡豆昆に加え、賦形剤、味調整のための甘味 剤などの原料を混ぜ合わせ、練合機にて練合した後、製丸機にて丸剤として成型し た。その後適度に乾燥させた後、粒表面をシェラックでコートした。なお、発酵胡豆昆 の性質上、丸剤製造において一般的に行われる素丸表面の磨き工程は行わなかつ た。また、併せて発酵胡豆昆が含まれていない丸剤 (発酵粒と同様の形態）をプラセ ボとして製造した。表 4にそれぞれの配合を示した。
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【表 4】
Figure imgf000026_0001
[0082] この丸剤を社内健常人ボランティア 40名に 1日あたり 30粒 (発酵胡豆昆として 4. 7 gZ日）摂取させ、免疫調節作用について検討を行った。摂取試験は、クロスオーバ 一試験で行った。すなわち、被験者を、 NK活性、年齢、性別を基準に統計学的に 差がないように二群に分け、摂取サンプノレとして、発酵粒または同じ形態のプラセボ を各群に 4週間摂取させ (摂取期間 1)、 6週間のゥォッシュアゥト期間を設けた。その 後、各群の摂取サンプノレを入れ替えて、さらに 1ヶ月間プラセボまたは発酵粒を摂取 させた (摂取期間 11)。摂取期間の前後に採血を行い、 Ficoll— Hypaque比重遠沈 法（Nycomed Pharma社）により、白血球を調製し、 NK活性を測定した。 NK活性 に関しては、 K562をターゲット細胞とした細胞傷害活性を、白血球: K562 = 20 : l で、 PINK法を用いて測定した。また、白血球を PHA (phytohemagglutinin)存在下で 22時間培養し、培養上清中の IFN— γ、 IL— 4産生量を測定し、 Thl/Th2バラン スを角军析した。
[0083] NK活性の試験結果を図 19に示す。摂取期間 I、 IIともに発酵粒を摂取することによ り有意に NK活性が上昇した。図 19における摂取期間 I、 IIおける NK活性の変化量 ( 摂取前後での差： Δ ΝΚ活性)を求め、その平均値を算出した。結果を図 20に示す。 発酵粒摂取群はプラセボ摂取群と比較して、有意に NK活性の変化量が大きかった [0084] 次に、 PHA刺激後の白血球からの IFN γと IL 4の産生量を測定し、摂取期間 I、 IIおける Thl/Th2比（IFN— γの産生量/ IL 4の産生量）の変化量 (摂取前 後での差： A Thl/Th2)を求め、その平均値を算出した。結果を図 21に示す。発 酵粒摂取群は、プラセボ群と比較して有意に ThlZTh2比の変化量が大きぐ発酵 粒摂取によって Thl優位な状態となることが示唆された。
[0085] 本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなぐ特許請求の範囲で種々 の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組 み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

Claims

請求の範囲
[1] 乳酸菌で発酵させた昆布を含有する、免疫調節作用を有する組成物。
[2] 免疫調節作用が免疫賦活作用及び Zまたは抗アレルギー作用である、請求項 1に 記載の組成物。
[3] 乳酸菌が植物性乳酸菌である請求項 1または 2に記載の組成物。
[4] 乳酸菌で発酵させた昆布と、乳酸菌で発酵させた胡麻と、乳酸菌で発酵させた大豆 とを含有する組成物。
[5] 乳酸菌が植物性乳酸菌である請求項 4に記載の組成物。
[6] 免疫調節作用を有する請求項 4または 5に記載の組成物。
[7] 免疫調節作用が免疫賦活作用及び/または抗アレルギー作用である、請求項 6に 記載の組成物。
[8] 飲食物、食品添加物、健康食品または医薬組成物である、請求項:!〜 7のいずれか
1項に記載の組成物。
[9] 丸剤の形態である、請求項 1〜8のいずれ力 1項記載の組成物。
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