WO2006022323A1 - ホスホロアミダイト化合物及びオリゴｒｎａの製法 - Google Patents

ホスホロアミダイト化合物及びオリゴｒｎａの製法 Download PDF

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WO2006022323A1
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chemical
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Tadaaki Ohgi
Kouichi Ishiyama
Yutaka Masutomi
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Nippon Shinyaku Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a novel phosphoramidite complex compound in which a novel protecting group is introduced into the hydroxyl group at the 2'-position, and a reagent for introducing the protecting group.
  • Oligoribonucleic acid is useful as an RNA probe for gene analysis, RNA pharmaceutical material (antisense RNA, ribozyme, gene expression control using RNAi), artificial enzyme, and aptamer.
  • Non-patent Document 1 Solid-phase synthesis of oligo RNA was established in the late 1980s. First reported was the use of phosphoramidite compounds using a tert-butyldimethylsilyl (TBDMS) group or a triisoprovirsilyl (TIPS) group as a protective group for the hydroxyl group at the 2-position. This was a solid phase synthesis method (Non-patent Document 1).
  • oligo RNA oligodeoxyribonucleic acid
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • TBDMS group when a TBDMS group is used as a protecting group for the hydroxyl group at the 2′-position, for example, when the hydroxyl group at the 3′-position is phosphoramidite-coated, the TBDMS group that protected the hydroxyl group at the 2′-position is 3 A side reaction that rearranges to the 'position may occur.
  • a substituent having a large steric hindrance such as a TBDMS group
  • a stereo group around the phosphorus atom bonded to the 3 ′ position is crowded, so that an internucleotide bond is formed.
  • the rate of the condensation reaction is reduced, or after oligomerization, when the 2′-position hydroxyl protecting group is removed, cleavage of the internucleotide bond or rearrangement reaction can occur.
  • the 1- (2-cyanoethoxy) ethyl (CEE) group is It is known as a group capable of leaving at the same time as the biskeline protecting group under the conditions (neutral conditions) for removing the biskeline protecting group protecting the 5 'position (Non-patent Document 2). From this finding, Wada has found a phosphoramidite complex compound in which a CEE group that can be deprotected under neutral conditions is introduced into the 2′-position hydroxyl group as a compound for producing oligo RNA (Non-patent Document 3, Non-patent document 4).
  • Non-Patent Document 1 N. A. Usman et al., Journal American Chemical Society, Vol. 109, 7845 (1987)
  • Non-Patent Document 2 discloses a method for modifying the working environment in accordance with the following requirements: a method for modifying the working environment in accordance with the following requirements: a procedure for modifying the working environment in accordance with the following requirements: a procedure for modifying the working environment in accordance with the following requirements: a procedure for modifying the working environment in accordance with the following requirements: a procedure for modifying the working environment in accordance with the following requirements:
  • Non-Patent Document 3 Takeshi Wada, BIO INDUSTRY, Vol. 21, No. 1, 17 (2004)
  • Non-Patent Document 4 T. Umemoto et al., Tetrahedron Letters, Vol. 45, 9529 (2004) Disclosure of Invention
  • An object of the present invention is to provide a useful new phosphoramidite complex, mainly for the purpose of a simple and high yield synthesis method of oligo RNA.
  • Another object of the present invention is to provide a novel ether compound capable of introducing a protecting group that can be easily removed under a neutral condition into a hydroxyl group at the 2′-position.
  • Examples of the present invention include phosphoramidite compounds represented by the following general formula (1) (hereinafter referred to as “the present phosphoramidite compound”).
  • B represents a nucleobase optionally having a protecting group.
  • R 1 represents a substituent represented by the following general formula (2).
  • R 11 , R 12 and R 13 are the same or different and each represents hydrogen or alkoxy.
  • R 2A and R 2B are the same or different and represent a alkyl group or a 5- to 6-membered saturated amino ring group formed by R 2A and R 2B together with the adjacent nitrogen atom.
  • the powerful saturated amino ring group may have one oxygen atom or sulfur atom as a ring constituent atom in addition to the nitrogen atom.
  • WG 2 is the same or different and represents an electron-withdrawing group.
  • nucleobase related to X is not particularly limited as long as it is used for nucleic acid synthesis, and examples thereof include adenine, guanine, cytosine, uracil, and modified products thereof.
  • a “modified product” of a nucleobase is a compound obtained by substituting a nucleobase with an arbitrary substituent.
  • Examples of the substituent related to the “modified product” of B include halogen, acyl, alkyl, aryl
  • Nucleobase according to B is a nucleobase having an amino group, whether it is protected or not.
  • adenine, guanine, and cytosine preferably have a protected amino group.
  • the “amino group protecting group” is not particularly limited as long as it is used as a nucleic acid protecting group. Specifically, for example, benzoyl, 4-methoxybenzoyl, acetyl, propionyl, butyryl. , Isobutyryl, phenylacetyl, phenoxyacetyl, 4 tert butyl phenoxyacetyl, 4 isopropylphenoxyacetyl, and (dimethylamino) methylene.
  • Examples of the “saturated amino ring group” according to R 2 include pyrrolidine-1-yl, piperidine-1-yl, morpholine-1-yl, and thiomorpholine-1-yl.
  • Examples of the “electron-withdrawing group” according to WG 2 include silane-containing nitro, alkylsulfonyl, and halogen. Of these, Ciano is preferred.
  • halogen examples include fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • alkanols having 1 to 6 carbon atoms
  • aroyl having 7 to 13 carbon atoms.
  • formyl, Asechiru, n- propionate - le, Isopuropio - Le, n Buchiriru, isobutyryl, tert- butyryl, valeryl, to Kisanoiru, Benzoiru, naphthoyl, can be mentioned levulinyl.
  • substituent that may be substituted with the alkyl include, but are not limited to, nitrogen, alkyl, alkoxy, and nitro-containing nitro, and 1 to 3 of them are substituted.
  • aryl alkyl In the phosphoramidite compound of the present invention, “aryl alkyl”, “alkoxyalkyl” Examples of the “alkyl” part of the “alkyl”, “monoalkylamino”, “dialkylamino” and “alkylsulfol” are the same as the above “alkyl”.
  • alkoxy in the phosphoramidite complex of the present invention examples include linear or branched alkoxy having 1 to 4 carbon atoms. Specific examples include methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy and tert-butoxy. Of these, those having 1 to 3 carbon atoms are preferred, and methoxy is particularly preferred.
  • alkoxy part of “alkoxyalkyl” in the phosphoramidite compound of the present invention include the same as the above “alkoxy”.
  • aryl of “aryl alkyl” in the phosphoramidite compound of the present invention include aryl having 6 to 12 carbon atoms. Specific examples include phenol, 1-naphthyl, 2-naphthyl and biphenyl. Examples of the substituent that can be substituted with the aryl include halogen, alkyl, alkoxy, and nitro-containing nitro, and 1 to 3 of these are substituted.
  • halogen alkyl
  • alkoxy substituents of “alkyl” and “aryl” in the phosphoramidite compound of the present invention are the same as those described above.
  • the phosphoramidite toy compound of the present invention can be used as a reagent for producing oligo RNA.
  • the phosphoramidite toy compound of the present invention is a phosphoramidite toy compound having an ether-type protecting group that can be removed under a neutral condition at the 2′-position hydroxyl group.
  • the group introduced into the hydroxyl group at the 2 'position is a linear substituent and the steric structure around the phosphorus atom bonded to the hydroxyl group at the 3' position is crowded, it has been used conventionally!
  • the synthesis of oligo RNA is characterized in that the condensation reaction proceeds in a very short time and the condensation yield is good.
  • oligo DNA refers to an oligo nucleic acid that can only have deoxyribonucleic acid (DNA).
  • oligo RNA refers to oligonucleic acid such as ribonucleic acid (RNA) and doxyribonucleic acid (DNA), and at least one oligonucleic acid containing ribonucleic acid (RNA).
  • Specific examples of the phosphoramidite toy compound of the present invention include the following compounds 1. to 5.
  • N 2 Phenoxyacetyl—5, -0- (4, 4, —Dimethoxytrityl) —2, -0- (2 —Cyanethoxymethyl) guanosine 3, 1 O— (2-Chanoethyl N, N-diisopropylpropyl phosphoramidite)
  • FIG. 1 shows a chromatogram obtained by reverse phase HPLC analysis.
  • the vertical axis represents time (minutes) and the horizontal axis represents absorption intensity.
  • the phosphoramidite toy compound of the present invention can be produced as follows.
  • the reaction is performed after the raw material has been thoroughly protected according to a known method and protected with an appropriate protecting group. It is common to do.
  • the protecting group can be removed after the reaction according to a known method such as catalytic reduction, alkali treatment, acid treatment, etc.
  • the phosphoramidite complex of the present invention is a known compound or an intermediate that can be easily produced. From the body, it can be produced, for example, by performing the following steps a to h. This will be described in detail below.
  • An ether-type protecting group that is eliminated under neutral conditions is introduced into the 2′-position hydroxyl group by acting an alkyl ⁇ reagent on the nucleoside derivative represented by the following general formula (14).
  • alkylating reagent examples include ether compounds represented by the following general formula (13).
  • L represents a halogen, an arylthio group, an alkyl sulfoxide group or an alkylthio group.
  • WG 1 has the same meaning as described above.
  • etheric compound (13) examples include the following compounds 1 to 2.
  • the ether compound (13) is a novel alkyl reagent that can introduce an ether-type substituent that can be eliminated under neutral conditions into a hydroxyl group at the 2′-position under basic conditions. It is useful as a reagent for producing the invention phosphoramidite toy compound.
  • the ether compound (13) can be produced by carrying out the following steps 1 to 4.
  • WG 1 has the same meaning as described above.
  • R 3 represents alkyl or aryl.
  • the compound (24) is an ethereal compound (13) in which L is an alkylthio group.
  • Examples of the “alkyl” related to R 3 include the same “alkyl” in the phosphoramidite compound of the present invention.
  • examples of the alkylthiomethylating reagent include a mixed solution of dimethyl sulfoxide, acetic anhydride and acetic acid.
  • the amount of “dimethyl sulfoxide” used is suitably 10 to 200-fold molar amount relative to compound (20), preferably 20 to: L00-fold molar amount.
  • the amount of “acetic acid” used is suitably 10 to 150-fold molar amount relative to compound (20), and preferably 20 to: L 00-fold molar amount.
  • the amount of acetic anhydride used is the compound ( For 20), 10 to 150 times the mono amount is appropriate, 20 to: LOO times the mono amount is preferred! /.
  • the reaction temperature is suitably 0 ° C to 100 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc. Usually, 1 to 48 hours is appropriate.
  • Process 2 is suitably 0 ° C to 100 ° C. The reaction time varies depending on the type of raw materials
  • Compound (25) is a compound in which L in the etheric compound (13) is halogen.
  • Examples of “norogen” according to X 2 include the same “norogen” in the phosphoramidite toy compound of the present invention.
  • This step can be performed by a known method (for example, T. Benneche et al., Synthesis 762 (1983)).
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction.
  • 1S Examples include halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, chlorophenol, carbon tetrachloride, and 1,2-dichloroethane.
  • Examples of the halogenating reagent include sulfuryl chloride and phosphorus oxychloride.
  • the amount of the “halogen reagent” to be used is suitably 1 to 20 times by mole, preferably 1 to 10 times by mole, relative to the compound (24).
  • the reaction temperature is suitably from 0 ° C to 100 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw material used, reaction temperature, etc. Usually, 30 minutes to 24 hours is appropriate.
  • Process 3 Process 3:
  • the compound (25a) is a compound in which L in the ether compound (13) is an arylthio group.
  • Examples of the “aryl” related to R 3A include the same “aryl” in the phosphoramidite compound of the present invention.
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane and acetonitrile.
  • the arylthiolation reagent for example, thienol and 4-methylbenzene thiol can be mentioned.
  • the amount of the “arylthiol reagent” used is suitably 1 to 20 times the molar amount, preferably 1 to 5 times the molar amount relative to the compound (25).
  • the reaction temperature is suitably from 0 ° C to 100 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc., but 1 to 48 hours is usually appropriate.
  • Compound (24a) is a compound in which L in the ether compound (13) is an alkyl sulfoxide group.
  • Examples of the “alkyl” related to R 3 include the same “alkyl” in the phosphoramidite compound of the present invention.
  • This step can be performed by a known method.
  • the solvent used is involved in the reaction If not, it is not particularly limited, but examples thereof include dichloromethane, chloroform, and methanol.
  • the oxidizing agent include methacroperoxybenzoic acid, metaperiodic acid salt, and hydrogen peroxide.
  • the amount of the “oxidant” to be used is suitably 1 to 10-fold mol amount, preferably 1 to 2-fold mol amount based on Compound (24).
  • the reaction temperature is suitably from 0 ° C to 100 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw materials used, the reaction temperature, etc. Power is usually 1 to 48 hours.
  • This step can be performed by reacting an alkylating reagent and a base with compound (14) which is available as a commercial product or can be synthesized according to a method described in the literature, according to a known method.
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include halogen-based hydrocarbons such as dichloromethane, chlorophenol, carbon tetrachloride, and 1,2-dichloroethane.
  • the amount of the “alkylating reagent” to be used is suitably 1 to 20-fold mol amount, preferably 1 to 10-fold mol amount based on Compound (14).
  • an alkylating reagent can be allowed to act after passing through an intermediate produced by reacting compound (14) with a metal reagent and a base.
  • the “metal reagent” that can be used include disodium dibutyltin.
  • the amount of the “metal reagent” to be used is suitably 1 to 20-fold mol amount, preferably 1 to 10-fold mol amount based on Compound (14).
  • “Bases” include pyridine, 2,6-dimethylpyridine, 2,4,6-trimethylpyridine, N-methylimidazole, triethylamine, tributylamine, N, N-diisopropylethylamine, 1 , 8-diazabicyclo [5.
  • the amount of the “base” to be used is appropriately 1 to 20-fold mol amount, preferably 1 to 10-fold mol amount based on Compound (14).
  • the reaction temperature is suitably from 0 ° C to 120 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc. Usually, 30 minutes to 24 hours is appropriate.
  • the compound (24) or (25a) is used as the “alkylating reagent”, it can be carried out as follows. This step is carried out according to a known method (for example, M. Matteucci, Tetrahedron Letters, Vol. 31, 2385 (1990)), and is commercially available or can be synthesized according to the method described in the literature (14)
  • the reaction can be carried out by reacting an alkylating reagent, an acid, and a halogenating agent for the sulfur atom.
  • the amount of the “alkyli reagent” used is suitably 1 to 5 times the molar amount relative to the compound (14), and preferably 1.05 to 3 times the molar amount.
  • Examples of the “acid” include trifluoromethanesulfonic acid, silver trifluoromethanesulfonate, and trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate.
  • the amount of the “acid” used is suitably 0.01 to 20-fold molar amount, preferably 0.02 to 10-fold molar amount relative to compound (14).
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction. For example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, benzene, toluene, xylene, tetrahydrofuran, acetonitrile, or a mixed solvent thereof. Can be mentioned.
  • halogenating agent for sulfur atom examples include N-butyl succinimide (NBS) and N-odosuccinimide (NIS).
  • NBS N-butyl succinimide
  • NMS N-odosuccinimide
  • the amount of the “halogenating agent for sulfur atom” to be used is suitably 1 to 10 times by mole, preferably 1.05 to 5 times by mole, relative to compound (14).
  • the reaction temperature is suitably 78 ° C to 30 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw material used, reaction temperature, etc., but usually 5 minutes to 5 hours is appropriate.
  • compound (24a) is used as the “alkylating reagent”, it can be carried out as follows.
  • This step is carried out according to a known method by allowing an alkyl reagent, an acid anhydride and a base to act on the compound (14) which is available as a commercial product or can be synthesized according to a method described in the literature. be able to.
  • the amount of the “alkylating reagent” to be used is suitably 1 to 5-fold mol amount, preferably 1.05 to 3-fold mol amount based on Compound (14).
  • Examples of the “acid anhydride” include trifluoromethanesulfonic acid anhydride and acetic anhydride.
  • the amount of the “acid anhydride” to be used is suitably 0.01 to 20-fold mol amount, preferably 0.02 to 10-fold mol amount based on Compound (14).
  • Examples of the base include tetramethyl urea and collidine.
  • the amount of “base” used is 0.01 to 20 times the amount of compound (14).
  • a suitable amount is 0.02 to: LO molar amount is preferable.
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, and mixed solvents thereof.
  • the reaction temperature is suitably from ⁇ 78 ° C. to 30 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc., but usually 5 minutes to 24 hours is appropriate.
  • a step of isolating and purifying the nucleoside derivative (15) produced in step a This step can be isolated and purified by using a usual separation and purification means such as thin layer chromatography, silica gel chromatography, etc. from the mixture produced in step a.
  • a usual separation and purification means such as thin layer chromatography, silica gel chromatography, etc. from the mixture produced in step a.
  • step b Separately from step b, by reacting the ribonucleic acid compound represented by the following general formula (16) with an alkylating reagent, the ether-type protecting group that can be eliminated under neutral conditions is located at the 2 ′ position.
  • A represents a silicon substituent represented by the following general formula (18a) or (18b).
  • R 6 represents alkyl.
  • Examples of the “alkyl” related to R 6 include the same “alkyl” as in the phosphoramidite compound of the present invention.
  • alkylating reagent examples include the same as described above.
  • This step can be performed according to a known method by reacting an alkylating reagent and a base with compound (16) which is available as a commercial product or can be synthesized according to a method described in the literature.
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include halogen-based hydrocarbons such as dichloromethane, chlorophenol, carbon tetrachloride, and 1,2-dichloroethane.
  • the amount of the “alkylating reagent” to be used is suitably 1 to 20-fold mol amount, preferably 1 to 10-fold mol amount based on Compound (14).
  • an alkylating reagent can be allowed to act after passing through an intermediate produced by reacting compound (16) with a metal reagent and a base.
  • a metal reagent and a base examples include dibutyltin dichloride and t-butylmagnesium chloride.
  • the amount of the “metal reagent” to be used is suitably 1 to 20-fold mol amount, preferably 1 to 10-fold mol amount based on Compound (16).
  • the amount of the “base” to be used is suitably 1 to 20-fold mol amount, preferably 1 to 10-fold mol amount based on Compound (16).
  • the reaction temperature is suitably from 0 ° C to 120 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw material used, reaction temperature, etc., but usually 30 minutes to 24 hours is appropriate.
  • This step is carried out according to a known method (for example, M. Matteucci, Tetrahedron Letters, Vol. 31, 2385 (1990)), and is commercially available or can be synthesized according to the method described in the literature.
  • Alkylating reagents and halogenating agents for acids and sulfur atoms It is possible to carry out from the above.
  • the amount of the “alkyly reagent” used is suitably 1 to 5 times the molar amount relative to the compound (16), and preferably 1.05 to 3 times the molar amount.
  • the “acid” include trifluoromethanesulfonic acid, silver trifluoromethanesulfonate, and trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate.
  • the amount of the “acid” used is suitably 0.01 to 20-fold molar amount, preferably 0.02 to 10-fold molar amount relative to compound (16).
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction.
  • Examples of the “halogenating agent for sulfur atom” used in this step include N-butyl succinimide (NBS) and N-odosuccinimide (NIS).
  • the amount of the “halogenating agent for sulfur atom” to be used is suitably 1 to 10 times by mole, preferably 1.05 to 5 times by mole, relative to compound (16).
  • the reaction temperature is suitably 78 ° C to 30 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw material used, reaction temperature, etc., but usually 5 minutes to 5 hours is appropriate.
  • compound (24a) is used as the “alkylating reagent”, it can be carried out as follows.
  • This step is carried out according to a known method by allowing an alkyl reagent, an acid anhydride and a base to act on the compound (16) which is available as a commercial product or can be synthesized according to a method described in the literature. be able to.
  • the amount of the “alkylating reagent” to be used is appropriately 1 to 5-fold mol amount, preferably 1.05 to 3-fold mol amount based on Compound (16).
  • Examples of the “acid anhydride” include trifluoromethanesulfonic acid anhydride and acetic anhydride.
  • the amount of the “acid anhydride” to be used is suitably 0.01 to 20-fold mol amount, preferably 0.02 to 10-fold mol amount based on Compound (16).
  • Examples of the base include tetramethyl urea and collidine.
  • the amount of the “base” used is suitably 0.01 to 20-fold mol amount relative to compound (16), and preferably 0.02 to: L0-fold mol amount.
  • the solvent used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,2 dichloroethane, and a mixed solvent thereof.
  • Reaction temperature is-7 8 ° C-30 ° C is suitable.
  • the reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc., but usually 5 minutes to 24 hours is appropriate.
  • ribonucleic acid compound (16) is reacted with dimethyl sulfoxide, acetic acid and acetic anhydride to produce a ribonucleic acid compound represented by the following general formula (19). Process.
  • This step is carried out by allowing dimethyl sulfoxide, acetic acid and acetic anhydride to act on a ribonucleic acid compound (16) which is available as a commercial product or can be synthesized according to a method described in the literature according to a known method. can do.
  • the amount of “dimethyl sulfoxide” used is 10 to 200 times the molar force S of the compound (16), and 20 to: LOO times the molar amount is preferable.
  • the amount of “acetic acid” to be used is suitably 10 to 150-fold mol amount, preferably 20 to 100-fold mol amount based on Compound (16).
  • the amount of “acetic anhydride” used is suitably 10 to 150 times the molar amount relative to compound (16), and preferably 20 to: LOO times the molar amount.
  • the reaction temperature is suitably 10 ° C to 50 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc. Usually, 30 minutes to 24 hours is appropriate.
  • This step can be performed by reacting the ribonucleic acid compound (19) with an alcoholic compound (20), an acid, and a halogenating agent for a sulfur atom according to a known method.
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction.
  • dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, benzene, toluene, xylene, tetrahydrofuran, acetonitrile, or a mixed solvent thereof can be used.
  • the amount of the “alcohol compound (20)” used is suitably 1 to 20-fold molar amount, preferably 1 to 10-fold molar amount, relative to Compound (19).
  • Examples of the “acid” include trifluoromethanesulfonic acid, silver trifluoromethanesulfonate, and trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate.
  • Examples of the “halogenating agent for sulfur atom” include N-bromosuccinimide (NBS) and N-odosuccinimide (NIS).
  • the amount of the “halogenating agent for sulfur atom” to be used is suitably 0.1 to 20-fold mol amount, preferably 0.2 to 10-fold mol amount based on Compound (19).
  • the reaction temperature is suitably from 100 ° C to 20 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc., but usually 5 minutes to 12 hours is appropriate. (6) Process f:
  • step c or step e the following general formula (21) The process of manufacturing the ribonucleic acid compound represented by this.
  • This step can be carried out by dissolving compound (17) in an organic solvent and reacting the fluorinating agent and acid as a mixed reagent having an arbitrary mixing ratio.
  • fluorinating agents that can be used in this step include ammonium fluoride, tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF), triethylamine trihydrofluoride, and hydrogen fluoride pyridine.
  • Power S can be.
  • the amount of the “fluorinated agent” used is suitably 0.1 to 20 times the molar amount relative to compound (17), and preferably 0.2 to 10 times the molar amount.
  • the reaction temperature is suitably from 0 ° C to 120 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc., but usually 30 minutes to 24 hours is appropriate. (7) Step g:
  • Examples of “norogen” according to X 3 include the same “norogen” in the phosphoramidite toy compound of the present invention.
  • This step can be carried out by reacting compound (21) with R 3 according to a known method.
  • the amount of R 3 used is suitably 1 to 20-fold molar amount, preferably 1 to 10-fold molar amount relative to compound (21).
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include acetonitrile and tetrahydrofuran.
  • base Includes pyridine, 2,6-dimethylpyridine, 2,4,6-trimethylpyridine, N-methylimidazole, triethylamine, tributylamine, N, N-diisopropylethylamine, 1,8- Examples include organic bases such as diazabicyclo [5. 4. 0] -7-undecene.
  • the amount of the “base” to be used is suitably 1 to 20-fold mol amount, preferably 1 to 10-fold mol amount based on Compound (21).
  • the reaction temperature is suitably from 0 ° C to 120 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc. Usually, 30 minutes to 24 hours is appropriate.
  • step b or step f The nucleoside derivative (15) produced in step b or step f is reacted with a phosphoramidite reagent and, if necessary, an activator, so that the hydroxyl group at the 3 ′ position is phosphorylated.
  • a phosphoramidite reagent and, if necessary, an activator, so that the hydroxyl group at the 3 ′ position is phosphorylated.
  • Examples of the “phosphoramidite sputum reagent” include compounds represented by the following general formulas (22) and (23).
  • R 2a , R 2b and WG 2 are as defined above.
  • X 1 represents halogen.
  • the “norogen” according to X 1 includes “norogen” in the phosphoramidite toy compound of the present invention. The same thing can be mentioned.
  • This step is a reaction in which a phosphoramidite reagent is allowed to act on compound (15) to form a 3′-position hydroxyl group, and can be performed according to a known method. If necessary, an activator can be used.
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include acetonitrile and tetrahydrofuran.
  • the amount of the “phosphoramidite candy reagent” used is suitably 1 to 20 times the molar amount relative to the compound (15), and preferably 1 to: LO times the molar amount.
  • Activators include, for example, 1H-tetrazole, 5-ethylthiotetrazole, 4,5-dichloroimidazole, 4,5-disianomidazole, benzotriazole triflate, imidazole triflate, pyridinium triflate, N, Mention may be made of N-diisopropylethylamine, 2, 4, 6-collidine / N-methylimidazole.
  • the amount of the “activator” to be used is suitably 1 to 20-fold mol amount, preferably 1 to 10-fold mol amount based on Compound (15).
  • the reaction temperature is suitably from 0 ° C to 120 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw material used, reaction temperature, etc., but usually 30 minutes to 24 hours is appropriate.
  • the produced phosphoramidite complex of the present invention can be produced by a method known per se, for example, concentration, liquid conversion, phase transfer, solvent extraction, crystallization, recrystallization, fractional distillation, chromatodara. Separation and purification can be carried out by using the first method.
  • concentration, liquid conversion, phase transfer, solvent extraction, crystallization, recrystallization, fractional distillation, chromatodara Separation and purification can be carried out by using the first method.
  • Examples of the present invention include a method for producing an oligo RNA represented by the following general formula (3), characterized by using the phosphoramidite complex of the present invention.
  • each B independently represents adenine, guanine, cytosine, uracil, thymine, or a modified form thereof.
  • Each R independently represents H or a hydroxyl group, but at least one represents a hydroxyl group.
  • Z represents H or a phosphate group.
  • n represents an integer in the range from 1 to: LOO. ]
  • n is preferably an integer in the range of 10 to 50, and more preferably an integer in the range of 15 to 30.
  • substituent related to the modified form of B include halogen, acyl, alkyl, arylalkyl, alkoxy, hydroxy, amino-containing monoalkylamino-containing dialkylamino, carboxyl, and cyanated nitro. 1-3 are substituted.
  • the production method of the oligo RNA (3) using the phosphoramidite toy compound of the present invention is a force that can be performed according to a known method, for example, by performing the following operations of Step A to Step G. In particular, it can be carried out by condensing the nucleic acid monomer compound in the 3 ′ to 5 ′ direction.
  • those other than the phosphoramidite compounds of the present invention are not particularly limited as long as they are generally used for the synthesis of oligo RNA or oligo DNA.
  • all steps can be manufactured using a manual or a commercially available DNA automatic synthesizer. It is desirable to use an automatic synthesizer in order to simplify the operation method by using an automatic synthesizer and to ensure the accuracy of synthesis.
  • nucleic acid monomer compound is not particularly limited as long as they are generally used for the synthesis of oligo DNA or oligo RNA.
  • Each Bx independently represents zazanine, guanine, cytosine, uracil, thymine or a modified form thereof.
  • Each R 4 independently represents H, acyloxy, or a substituent represented by the following general formula (6).
  • E represents a substituent represented by isyl or the following general formula (7).
  • T represents H, acyloxy, or a substituent represented by the general formula (6) or (7).
  • R 41 Represents a substituent (7).
  • R 2 is Asil
  • R 4 represents H, acyloxy or a substituent (6).
  • solid phase carrier examples include controlled pore glass (CPG), oxalylated-constant glass (eg, Alul et al., Nucleic Acids Research, Vol. 19, 15 27 (1991)). ), TentaGel support-aminoaminoglycol derivative support (see, for example, Wright et al., Tetrahedron Letters, Vol. 34, 3373 (1993)),
  • linker examples include 3-aminopropyl, succiol, and 2,2′-diethanol. Examples include sulfol and long chain alkylamino (LCAA).
  • the compound (26a) and the compound (26b) are compounds supported on a solid phase carrier produced according to a known method or available as a commercial product.
  • a solid phase carrier produced according to a known method or available as a commercial product.
  • Compounds (27) and (28) in which R 4 is substituent (6) can be produced from the phosphoramidite compounds of the present invention according to known methods.
  • the “acid” that can be used in this step include trifluoroacetic acid, dichloroacetic acid, and trichloroacetic acid.
  • the acid that can be used in this step can be used after diluting with a suitable solvent so as to have a concentration of 1 to 5%.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, water, and a mixed solvent thereof.
  • the reaction temperature in the above reaction is preferably 20 ° C to 50 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of acid used and the reaction temperature. Usually, 1 minute to 1 hour is appropriate.
  • the amount of reagent used is supported on a solid support!
  • the molar amount is preferably 1 to 100 times that of the compound to be obtained, more preferably 1 to
  • This step can be carried out by using a nucleic acid monomer compound and an activator on a compound supported on a solid phase carrier.
  • nucleic acid monomer compound examples include the compound represented by the following general formula (29), which is available as a phosphoramidite compound or a commercially available product of the present invention.
  • nucleobase is not particularly limited as long as it is used for nucleic acid synthesis.
  • adenine, guanine, cytosine, thymine or a modified form thereof can be mentioned.
  • the “modified product” has the same meaning as B.
  • substituents for the modified form of B include, for example, halogen, alkyl, arylalkyl
  • Nucleobase according to B is a nucleobase having an amino group, whether it is protected or not.
  • adenine, guanine, and cytosine preferably have a protected amino group.
  • amino-protecting group examples include the same as those described above for B.
  • Examples of the “activator” include the same as described above.
  • the reaction solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include acetonitrile and tetrahydrofuran.
  • the reaction temperature in the above reaction is preferably 20 ° C to 50 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of activator used and the reaction temperature, but usually 1 minute to 1 hour is appropriate.
  • the amount of the reagent to be used is 1 to 100 times the molar amount, more preferably 1 to 10 times the molar amount with respect to the compound supported on the solid phase carrier.
  • step B A step of cabling the 5′-position hydroxyl group of the compound (5) which has not been reacted in the step B.
  • R 5 is methyl, phenoxymeth
  • This step is a reaction for protecting the hydroxyl group at the 5 ′ position, which has not been reacted in Step B, and can be carried out by acting a capping agent on the compound supported on the solid phase carrier. .
  • capping agent examples include acetic anhydride or phenoxyacetic anhydride. Can do.
  • the capping agent can be used by diluting with a suitable solvent so as to have a concentration of 0.05 to 1M.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include pyridine, dichloromethane, acetonitrile, tetrahydrofuran, and a mixed solvent thereof.
  • 4-dimethylaminopyridine or N-methylimidazole can be used as a “reaction accelerator” as necessary.
  • the reaction temperature in the above reaction is preferably 20 ° C to 50 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of capping agent used and the reaction temperature, but usually 1 to 30 minutes is appropriate.
  • the amount of the reagent to be used is 1 to 100 times the molar amount, more preferably 1 to 10 times the molar amount with respect to the compound supported on the solid phase carrier.
  • This step is a reaction for converting trivalent phosphorus to pentavalent phosphorus using an oxidizing agent, and can be performed by allowing an oxidizing agent to act on the compound supported on the solid phase carrier. .
  • the “oxidant” examples include iodine and tert-butyl hydroperoxide.
  • the oxidizing agent used in this step can be diluted with an appropriate solvent so as to have a concentration of 0.05 to 2M.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction.
  • pyridine, tetrahydrofuran, water or a mixed solvent thereof may be mentioned.
  • iodine Z water Z pyridine-tetrahydrofuran or iodine Z pyridine monoacetic acid or a peroxide (such as t-ptyl hydride mouth peroxide z methylene chloride) can be used.
  • the reaction temperature is preferably 20 ° C to 50 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of oxidizing agent used and the reaction temperature, but usually 1 to 30 minutes is appropriate.
  • the amount of the reagent to be used is preferably 1 to: more than 10 to 50 times the molar amount of the compound supported on the solid phase carrier. (5) X @ E:
  • step D the compound (11) produced in the step D is excised from the solid phase carrier force, and each nucleobase and each 2′-hydroxyl protecting group are removed.
  • the cleaving step is a reaction in which oligo RNA having a desired chain length is removed from the solid phase carrier and the linker by a cleaving agent, and the cleaving agent is added to the solid carrier carrying the oligo RNA having the desired chain length. Can be implemented.
  • the protecting group in the nucleobase portion can be removed.
  • Examples of the “cutting agent” include concentrated aqueous ammonia and methylamine.
  • the “cutting agent” that can be used in this step can be used by diluting with water, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, acetonitrile, tetrahydrofuran, or a mixed solvent thereof, for example. Of these, ethanol is preferred.
  • the reaction temperature is suitably 15 ° C to 75 ° C, preferably 15 ° C to 30 ° C, and preferably 18 ° C to 25 ° C. More preferred.
  • the deprotection reaction time is suitably 1-30 hours, 1-24 hours is preferred 1-4 hours is more preferred U ,.
  • the concentration of hydroxyammonium hydroxide in the solution used for deprotection is suitably 20-30% by weight, preferably 25-30% by weight, more preferably 28-30% by weight.
  • the amount of the reagent to be used is suitably 1 to 100 times the molar amount, preferably 10 to 50 times the molar amount of the compound supported on the solid phase carrier! /.
  • the “reagent for removing the protecting group at the 2′-position” acts, for example, by using tetraptyl ammonium fluoride, hydrogen trifluoride′-triethylamine salt. Can be performed.
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include tetrahydrofuran, N-methylpyrrolidone, pyridine, dimethyl sulfoxide or a mixed solvent thereof. If necessary, for example, alkylamine, amidine, thiol, thiol derivative or a mixture thereof can be added as a compound supplementing acrylonitrile which is a by-product in this step.
  • alkylamine examples include linear alkylamine having 1 to 6 carbon atoms. Specifically, for example, methylamine, ethylamine, n-propylamine, n-butylamine, n-pentylamine, and n-hexylamine can be mentioned.
  • amidine examples include benzamidine and formamidine.
  • thiol examples include linear thiols having 1 to 6 carbon atoms. Specifically, for example, methanethiol, ethanethiol, 1-propanthiol, 1-butanethiol, 1-pentanethiol, and 1-hexanethiol can be listed.
  • thiol derivative examples include alcohols or ethers having the same or different linear alkyl thiol group having 1 to 6 carbon atoms. Specifically, for example, 2 mercaptoethanol, 4 mercapto 1-butanol, 6 mercapto 1 monohexanol, mercaptomethyl ether, 2 mercaptoethyl ether, 3-mercaptopropyl ether, 4 mercaptobutyl ether, 5-mercaptopentyl ether, Mention may be made of 6-mercaptohexyl ether.
  • the reaction temperature is preferably 20 ° C to 80 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of deprotecting agent used and the reaction temperature. Usually 1 to 100 hours is appropriate.
  • the amount of the reagent used is preferably 50 to 500-fold molar amount relative to the protecting group to be removed, more preferably 50 to: L00-fold mole Normal separation and purification means such as extraction, concentration, neutralization, filtration, centrifugal separation, recrystallization, silica gel column chromatography, thin layer chromatography, reverse layer o
  • step E A step of removing the 5′-position hydroxyl group of the compound (12) produced in step E.
  • This step is a reaction for finally removing the protecting group for the 5′-position hydroxyl group of the oligo RNA, and can be carried out by allowing an acid to act on the oligo RNA that has been cut out as a solid carrier.
  • Examples of the “acid” that can be used in this step include triclonal acetic acid, dichloroacetic acid, and acetic acid.
  • the acid that can be used in this step can also be diluted with an appropriate solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, water, a buffer solution having a pH of 2 to 5 or a mixed solvent thereof.
  • Examples of the buffer solution include an acetate buffer solution.
  • the reaction temperature in the above reaction is preferably 20 ° C to 50 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of acid used and the reaction temperature, but usually 1 minute to 1 hour is appropriate.
  • the amount of the reagent to be used is 1 to: more than 1 to 10 times the molar amount of the compound supported on the solid support, more preferably 1 to 10 times. [0032] (7) Process G:
  • Step F A step of separating and purifying the compound (3) produced in Step F.
  • the “separation and purification step” refers to usual separation and purification means from the above reaction mixture, such as extraction, concentration, neutralization, filtration, centrifugation, recrystallization, C-force C reverse phase column chromatography, C
  • the desired oligo RNA is isolated and purified by using means such as column chromatography, gel filtration column chromatography, high performance liquid chromatography, dialysis, and ultrafiltration.
  • Examples of the “elution solvent” include acetonitrile, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, water alone, or a mixed solvent in an arbitrary ratio.
  • examples of additives include sodium phosphate, potassium phosphate, sodium chloride salt, potassium salt salt, ammonium acetate, triethylammonium acetate, sodium acetate, acetic acid lithium, Tris-HCl, Ethylenediamine tetraacetic acid can be added at a concentration of lmM to 2M, and the pH of the solution can be adjusted in the range of 1 to 9.
  • an oligo RNA (3) having a desired chain length can be produced.
  • R 4 is a compound (26a) in which substituent (6) is present, y compound (26a) in which R 4 is H or acyloxy, Alternatively, a compound (26b) or the like in which R 2 is alkyloxy can be used.
  • a compound (26a) in which R 4 is H or acyloxy or a compound (26b) in which R 2 is alkyloxy is used as a starting material
  • at least one of the phosphoramidite compounds of the present invention is used as a nucleic acid monomer compound. It is necessary to use a compound.
  • step F is performed before the operation of step E, and then the operation of step E is performed, and then the operation of step G is performed in the next step to isolate and purify oligo RNA.
  • Example 2 5′-0- (4 ⁇ 4′-dimethoxyhytyl _ ⁇ ⁇ 2′-0- ⁇ 2-cyanoe]: xymethyl L) uridine 3, 1 O— (2 cyanoethyl N. N diisopropyl phosphoramidite) Step 1 5′— O— (4.4′-dimethoxytrityl) 2′— O— (2 cyanoethoxymethyl) uridine
  • Step 1 3, .5'—O— (Tetraisopropyldisiloxane 1.3 gil) ⁇ 2, ⁇ 0— (
  • reaction solution was filtered through celite and washed with methylene chloride.
  • organic phase was washed with 1M aqueous sodium hydrogensulfate solution, washed with saturated aqueous sodium hydrogencarbonate solution, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was distilled off. Left.
  • the resulting residue was purified by thin layer chromatography to obtain 3 ′, 5′—O— (tetraisopropyldisiloxane mono-1,
  • the residue was dissolved in ethyl acetate and separated with a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution.
  • the organic phase was washed with a saturated sodium chloride aqueous solution, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was distilled off.
  • the obtained residue was purified by silica gel chromatography to obtain the target compound (26.5 g; yield 98%).
  • Step 1 N A acetyl 3,5'—O— (tetraisopropyldisiloxane 1.3 diol) 2′—O— (2-cyanethoxymethyl) cytidine
  • N 4 acetyleno 3,5,1 O tetraisopropyldisiloxane 1,3 diyl
  • cytidine 1.
  • 975 mg (3.79 mmol) of silver trifluoromethanesulfonate was added, and Molecular Sieves 4A was added and dried. Under ice cooling, 370 mg (2.08 mmol) of N-bromosuccinimide was added, and the reaction vessel was protected from light and stirred for 10 minutes.
  • N-promosuccinimide 7 Omg (0.39 mmol) was added and stirred for 25 minutes. After completion of the reaction, dilute with methylene chloride, wash with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate, dry over anhydrous sodium sulfate, evaporate the solvent, and purify the resulting mixture by silica gel column chromatography. N 4 —acetylyl 3,5,1 O— (tetraisopropyldisiloxane 1,1,3 diyl) -1,2, -0- (2 cyanoethoxymethyl) cytidine was obtained. (936 mg; 81% yield). — NMR (CDC1): 0.90- 1.11 (m, 28H); 2. 28 (s, 3H); 2. 62— 2. 79 (
  • Step 1 N 2 —acetylene 5, -0- ⁇ 4._4'—dim I I: xytil) _— 2, -0- and 2—shear,
  • N 2 acetylyl 5, -0- (4, 4, -dimethoxytrityl) -2, -0 obtained in step 1 -Dissolve 400 mg (0. 563 mmol) of (2 cyanoethoxymethyl) guanosine in 2 mL of methylene chloride, and add 181 mg (l. 4 mmol) of diisopropylethylamine to give 2 cyanoethyl N, N diisopropylchlorophosphoramidite 161 mg (0.668 mmol) was added dropwise and reacted at room temperature for 1 hour.
  • Og (36. Om mol) is dissolved in 170 mL of 1,2 dichloroethane, and 16.3 g (126 mmol) of diisopropyl etheramine is dissolved.
  • 12. lg (39.7 mmol) of dibutyltin dichloride was added and reacted at room temperature for 1 hour. Thereafter, the mixture was stirred at 80 ° C. for 15 minutes, and 4.30 g (36. Ommol) of chloromethyl 2-cyanoethyl ether was added dropwise, followed by stirring for 30 minutes.
  • Step 1 N a —Acetyl 1 3 ′. 5′— O— (Tetraisopropyldisiloxane 1 1.3 Dil) 2′— O— (2-Cyanethoxymethyl) adenosine
  • Step 1 N 2 —Phenoxyacetyl- 5 '-0- (4.4'-dimethoxytrityl) 2' -0- (2-Cyanethoxymethyl) guanosine
  • N 2 full enoki Xia cetyl over 5 'O (4, 4'- dimethoxytrityl) was dissolved guanosine 720mg of (Lmmol) in 1, 2 Jikuroroetan 4 mL, diisopropyl E chill ⁇ Min 452mg of (3.5 mmol) was added, followed by 365 mg ( l.2 mmol) of dibutyltin dichloride was added and reacted at room temperature for 1 hour. Thereafter, the temperature was raised to 80 ° C., and 55.4 mg (l.3 mmol) of chloromethyl 2-cyanoethyl ether 1 was added dropwise, and the mixture was stirred as it was for 60 minutes.
  • N 2 phenoxycetyl-5, -0- (4,4, -dimethoxytrityl) — 2, 1, O (2 cyanoethoxymethyl) guanosine obtained in Step 1 was mixed with methyl chloride. Dissolve in 4 mL of Len, add 128.8 mg (0. 996 mmol) of diisopropylethylamine, add 2—Cyanoethyl N, N-diisopropylchlorophosphoramidite 141.5 mg (0.598 mmol), and add 1 at room temperature. Reacted for hours. After the reaction, the solvent was distilled off and the resulting mixture was purified by 3 Og silica gel column chromatography to obtain the target compound (316 mg; yield 79%).
  • Example 15 N a —Acetyl mono 3 ′. 5′— O— (tetraisopropyldisiloxane mono 1.3-diyl) — 2, — O— (2-cyanethoxymethyl) adenosine
  • Step 1 N a Asechiru 3 ,. 5'-O- (tetraisopropyldisiloxane 1.3 Jie
  • N 440 succinimide (440 mg, 1.96 mmol) was added, trifluoromethanesulfonic acid (490 mg, 3.26 mmol) was added, and the mixture was stirred at 45 ° C for 15 min.
  • nucleic acid monomer compounds 5 O- (4, 4, -dimethoxytrityl) -2, O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine 3, mono-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropyl phosphoro Amidite), tetrazole as the condensation catalyst, iodine solution as the oxidizing agent, and acetic anhydride and N-methylimidazole solution as the cabbing solution.
  • reaction mixture was concentrated under reduced pressure, unnecessary peaks were removed with a reverse phase column (ODS), and then purified using an elution solvent (acetonitrile—50 mM triethylamine—acetic acid buffer). After concentrating the residue under reduced pressure, the reaction was carried out for 1 hour at room temperature using a THF solution of 1M tetraptylammonium fluoride to remove the protecting group for the 2′-position hydroxyl group. After desalting the solution, the protecting group at the 5 ′ end was removed with 80% acetic acid (10 minutes at room temperature). After concentration under reduced pressure, the aqueous layer was washed with ether to obtain the desired compound with high purity without purification.
  • ODS reverse phase column
  • Liquid feeding unit LC— 6 A (manufactured by Shimadzu Corporation)
  • Solution A 50 mM triethylamine-acetic acid buffer solution containing 5% acetonitrile
  • Liquid B 50 mM triethylamine acetate buffer containing 90% acetonitrile
  • nucleic acid monomer compounds 5, —O— (4,4, -dimethoxytrityl) -2, —O— (2—cyanethoxymethyl) uridine 3,1 O— (2 cyanethyl N, N diisopropyl phosphoramidite) , N 4 -Acetyl-5, -0- (4, 4, -dimethoxytrityl) -2,-O- (2 cyanoethoxymethyl) cytidine 3, -O- (2 cyanoethinole N, N diisopropyl phosphoramidite ), N 6- acetyl--5, —O— (4, 4, -dimethoxytrityl) — 2, 1 O— (2 cyanoethoxymethyl) adenosine 3, 1 O— (2 cyanoethyl N, N diisopropyl phosphoramidite) , N 2 —phenoxyacetyl-5, -0- (4, 4, —Dimethoxytrity
  • the absorbance (OD) of ultraviolet light with a wavelength of 260 nm was used.
  • the absorbance (OD) was similarly used as the yield of the target compound.
  • Example 20 Adenylyl “3, ⁇ 5 ⁇ —Adenylyl“ 3, ⁇ 5 ⁇ —Uridylyl “3, ⁇ 5,
  • the ether-type protecting group introduced into the 2′-position hydroxyl group is a linear substituent, and the three-dimensional structure around the phosphorus atom bonded to the 3′-position hydroxyl group is crowded. Therefore, compared to the conventionally used phosphoramidite complex, when synthesizing oligo RNA, the condensation reaction proceeds in a very short time and the condensation yield is good. Therefore, by using the phosphoramidite toy compound of the present invention, it has become possible to produce high-purity oligo RNA using a technique almost the same as that of oligo DNA.

Abstract

本発明の目的は、オリゴＲＮＡの合成において有用な新規なホスホロアミダイト化合物を提供する。次の一般式（１）で表されるホスホロアミダイト化合物。 ［式中、ＢＸは、保護基を有していてもよい核酸塩基を表す。Ｒ１は、次の一般式（２）で表される置換基を表す。 ［式中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は、同一又は異なって、水素又はアルコキシを表す。］ Ｒ２ａ、Ｒ２ｂは、同一又は異なって、アルキルを表すか、又は、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂが隣接する窒素原子と一緒になって形成する、５～６員の飽和アミノ環基を表す。かかる飽和アミノ環基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子又は硫黄原子を１個有していてもよい。ＷＧ１、ＷＧ２は、同一又は異なって、電子吸引性基を表す。］    

Description

ホスホロアミダイトイ匕合物及びオリゴ RNAの製法
技術分野
[0001] 本発明は、 2'位の水酸基に新規な保護基を導入した新規ホスホロアミダイトイ匕合物 及び該保護基の導入試薬に関するものである。 背景技術
[0002] オリゴリボ核酸 (オリゴ RNA)は、遺伝子解析の RNAプローブ、 RNA医薬品素材 ( アンチセンス RNA、リボザィム、 RNAiを利用した遺伝子発現制御）、人工酵素、ァ プタマーとして有用である。
オリゴ RNAの固相合成法が確立されたのは 1980年代後半である。最初に報告さ れたのは、 2，位の水酸基の保護基として、 tert—ブチルジメチルシリル (TBDMS) 基、トリイソプロビルシリル (TIPS)基を用いたホスホロアミダイト化合物を使用する RN Aの固相合成法であった (非特許文献 1)。
オリゴ RNAの化学合成は、デォキシリボ核酸 (DNA)のみカゝらなるオリゴデォキシリ ボ核酸 (オリゴ DNA)の場合と比較して注意すべき問題点が多!、。
まず、 2'位の水酸基の保護基として TBDMS基を用いる場合、例えば、 3'位の水 酸基をホスホロアミダイトイ匕する際に、 2'位の水酸基を保護していた TBDMS基が 3' 位に転位する副反応が起こることがある。
また、 2'位の水酸基の保護基として TBDMS基のように立体障害の大きい置換基 を使用すると、 3'位に結合するリン原子の周りの立体が混み合うため、インターヌクレ ォチド結合を生成する縮合反応の速度が低下したり、またオリゴマー化した後、 2'位 の水酸基の保護基を除去する際に、インターヌクレオチド結合の切断や転位反応が 起こりうる。
上記のような問題点を克服するために、現在、より効率的なオリゴ RNA合成を行う ための研究が行われて 、る。
2'位の水酸基の保護基として、 1— (2—シァノエトキシ)ェチル (CEE)基は、 3'位 と 5 '位を保護するビスケィ素保護基を脱離する条件（中性条件）において、ビスケィ 素保護基と同時に脱離する基として知られている (非特許文献 2)。この知見から、和 田は、中性条件において脱保護可能な CEE基を 2'位の水酸基に導入したホスホロ アミダイトイ匕合物をオリゴ RNAを製造するための化合物として見出した (非特許文献 3、非特許文献 4)。
し力しながら、 2'位の水酸基に CEE基を導入することにより、新たに不斉中心が生 じるため、 2'位の水酸基が保護されたオリゴ RNAはジァステレオ混合物となる。した がって、オリゴ RNA製造の過程における精製や単離の操作が複雑になる。また、 2' 位の酸素原子に結合する炭素上にメチルが置換しているので、 3 '位の水酸基に結 合するリン原子の周りにおける立体障害が考えられ、縮合効率の低下及び縮合反応 速度の低下が懸念される。 非特許文献 1 : N. A. Usmanら、 Journal American Chemical Society, Vol. 109, 7845 (1987)
非特許文献 2 : Wolfgang Pfleidererら、 Helvetica Chimica Acta, Vol. 81, 1 545 (1998)
非特許文献 3 :和田 猛、 BIO INDUSTRY, Vol. 21, No. 1, 17 (2004) 非特許文献 4 :T. Umemotoら、 Tetrahedron Letters, Vol. 45, 9529 (2004) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] 本発明の目的は、主として、簡易で高収率のオリゴ RNAの合成法を目指して、有 用な新規なホスホロアミダイトイ匕合物を提供することにある。また、 2'位の水酸基に、 中性条件下にお 、て容易に脱離可能な保護基を導入することができる新規なエー テル化合物を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0004] 本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、上記目的を達成し得る化合物を見出し、 本発明を完成するに至った。 I.本発明に係るホスホロアミダイト化合物
本発明として、次の一般式（1)で表されるホスホロアミダイトイ匕合物（以下、「本発明 ホスホロアミダイト化合物」と 、う。）を挙げることができる。
[化 1]
R1
Bx
R2a 、 Ra
( 1 )
[式中、 Bは、保護基を有していてもよい核酸塩基を表す。
X
R1は、次の一般式（2)で表される置換基を表す。
[化 2]
Figure imgf000005_0001
( 2 )
[式中、尺11、 R12、 R13は、同一又は異なって、水素又はアルコキシを表す。 ]
R2A、 R2Bは、同一又は異なって、アルキルを表すカゝ、又は、 R2A、 R2Bが隣接する窒 素原子と一緒になつて形成する、 5〜6員の飽和アミノ環基を表す。力かる飽和アミノ 環基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子又は硫黄原子を 1個有していて もよい。
Figure imgf000005_0002
WG2は、同一又は異なって、電子吸引性基を表す。 ]
B もので
Xに係る「核酸塩基」としては、核酸の合成に使用される あれば特に制限さ れないが、例えば、アデニン、グァニン、シトシン、ゥラシル又はそれらの修飾体を挙 げることがでさる。
核酸塩基の「修飾体」とは、核酸塩基が任意の置換基で置換されて!ヽる化合物を いう。
Bの「修飾体」に係る置換基としては、例えば、ハロゲン、ァシル、アルキル、ァリー
X
ルアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アミ入モノアルキルアミノ 、ジアルキルァミノ、カルボキシ、シァ入ニトロを挙げることができ、これらが 1〜3個置 換されている。
B に係る「核酸塩基」は、保護されていてもよぐなかでもアミノ基を有する核酸塩基
X
、例えば、アデニン、グァニン、シトシンは、ァミノ基が保護されているのが好ましい。 かかる「ァミノ基の保護基」としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特 に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾィル、 4—メトキシベンゾィル、ァセチル、 プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フエ二ルァセチル、フエノキシァセチル、 4 t ert ブチルフエノキシァセチル、 4 イソプロピルフエノキシァセチル、（ジメチルアミ ノ)メチレンを挙げることができる。
R2に係る「飽和アミノ環基」としては、例えば、ピロリジン— 1—ィル、ピぺリジン— 1 ィル、モルホリン一 1ーィル又はチオモルホリン一 1 ィルを挙げることができる。
WG2に係る「電子吸引性基」としては、例えば、シァ入ニトロ、アルキルスル ホニル、ハロゲンを挙げることができる。なかでも、シァノが好ましい。
本発明ホスホロアミダイトイ匕合物における「ハロゲン」としては、例えば、フッ素、塩素 、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
本発明ホスホロアミダイトイ匕合物における「ァシル」としては、例えば、直鎖状又は分 枝鎖状の炭素数 1〜6のアルカノィル、炭素数 7〜13のァロイルを挙げることができる 。具体的には、例えば、ホルミル、ァセチル、 n—プロピオ-ル、イソプロピオ-ル、 n ーブチリル、イソブチリル、 tert—ブチリル、バレリル、へキサノィル、ベンゾィル、ナフ トイル、レブリニルを挙げることができる。
本発明ホスホロアミダイトイ匕合物における「アルキル」としては、例えば、直鎖状又は 分枝鎖状の炭素数 1〜5のアルキルを挙げることができる。具体的には、例えば、メチ ル、ェチル、 n—プロピル、イソプロピル、 n—ブチル、イソブチル、 sec ブチル、 tert ーブチル、 n—ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、 tert ペンチルを挙げること 力 Sできる。当該アルキルは置換されていてもよぐ力かる置換基としては、例えば、ノヽ ロゲン、アルキル、アルコキシ、シァ入ニトロを挙げることができ、これらが 1〜3個置 換されている。
本発明ホスホロアミダイト化合物における「ァリールアルキル」、「アルコキシアルキ ル」、 「モノアルキルァミノ」、 「ジアルキルァミノ」及び「アルキルスルホ -ル」の「アルキ ル」部分は、前記の「アルキル」と同じものを挙げることができる。
本発明ホスホロアミダイトイ匕合物における「アルコキシ」としては、例えば、直鎖状又 は分枝鎖状の炭素数 1〜4のアルコキシを挙げることができる。具体的には、例えば、 メトキシ、エトキシ、 n—プロポキシ、イソプロポキシ、 n—ブトキシ、イソブトキシ、 sec— ブトキシ、 tert—ブトキシを挙げることができる。なかでも炭素数 1〜3のものが好まし ぐとりわけメトキシが好ましい。
本発明ホスホロアミダイト化合物における「アルコキシアルキル」の「アルコキシ」部 分は、前記の「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
本発明ホスホロアミダイト化合物における「ァリールアルキル」の「ァリール」としては 、例えば、炭素数 6〜12のァリールを挙げることができる。具体的には、例えば、フエ -ル、 1—ナフチル、 2—ナフチル、ビフエ-ルを挙げることができる。当該ァリールは 置換されていてもよぐ力かる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキ シ、シァ入ニトロを挙げることができ、これらが 1〜3個置換されている。
本発明ホスホロアミダイト化合物における「アルキル」、「ァリール」の置換基である「 ハロゲン」、「アルキル」及び「アルコキシ」としては、各々前記と同じものを挙げること ができる。 本発明ホスホロアミダイトイ匕合物は、オリゴ RNAの製造するための試薬として使用 することができる。
また、本発明ホスホロアミダイトイ匕合物は、 2'位の水酸基に中性条件下において脱 離可能なエーテル型保護基を有するホスホロアミダイトイ匕合物である。また、 2 '位の 水酸基に導入された基が直線状の置換基であり、 3 '位の水酸基に結合するリン原子 の周りにおける立体が混み合って ヽな 、ため、従来から使用されて!、るホスホロアミ ダイトイ匕合物と比較して、オリゴ RNAを合成する際、非常に短時間に縮合反応が進 行し、縮合収率がよいという特徴を有する。本発明ホスホロアミダイトイ匕合物を使用す ることにより、オリゴ DNAの製造とほぼ同様の手法を用いて、高純度のオリゴ RNAの 製造が可能となった。 本発明にお 、て「オリゴ DNA」とは、デォキシリボ核酸 (DNA)のみ力もなるオリゴ 核酸をいう。また、本発明において「オリゴ RNA」とは、リボ核酸 (RNA)及びデォキ シリボ核酸 (DNA)カゝらなるオリゴ核酸であり、少なくとも 1つはリボ核酸 (RNA)を含 有するオリゴ核酸をいう。
[0007] 本発明ホスホロアミダイトイ匕合物の具体例としては、次の 1. 〜5.の化合物を挙げる ことができる。
1. N6—ァセチル— 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）—2， -0- (2—シァノエ トキシメチル）アデノシン 3，一 O— (2—シァノエチル N, N—ジイソプロピルホスホ ロアミダイト）
2. N2—ァセチル— 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）—2， -0- (2—シァノエ トキシメチル）グアノシン 3，— O— (2—シァノエチル N, N—ジイソプロピルホスホ ロアミダイト）
3. N2—フエノキシァセチル— 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）—2， -0- (2 —シァノエトキシメチル）グアノシン 3，一 O— (2—シァノエチル N, N—ジイソプロ ピルホスホロアミダイト）
4. N4—ァセチル— 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）—2， -0- (2—シァノエ トキシメチル）シチジン 3，— O— (2—シァノエチル N, N—ジイソプロピルホスホロ アミダイト）
5. 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）—2， -0- (2—シァノエトキシメチル）ゥリ ジン 3，一 O— (2—シァノエチノレ N, N—ジイソプロピルホスホロアミダイト） 図面の簡単な説明
[0008] [図 1]図 1は、逆相 HPLC分析により得られたクロマトグラムを表す。図中、縦軸は、時 間 (分)を示し、横軸は、吸収強度を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0009] II.本発明ホスホロアミダイト化合物の製法
本発明ホスホロアミダイトイ匕合物は、次のようにして製造することができる。 以下に示す製法において、原料が反応に影響を及ぼす置換基 (例えば、ヒドロキシ 、アミ入カルボキシ)を有する場合は、原料をあら力じめ公知の方法に従い、適当な 保護基で保護した後に反応を行うことが一般的である。保護基は、反応後に、接触 還元、アルカリ処理、酸処理などの公知の方法に従い保護基を脱離することができる 本発明ホスホロアミダイトイ匕合物は、公知化合物又は容易に製造可能な中間体か ら、例えば、次の工程 a〜工程 hの操作を実施することにより製造することができる。 以下、詳細に説明する。
(1)工程 a :
次の一般式（14)で表されるヌクレオシド誘導体にアルキルィ匕試薬を作用させること によって、中性条件下において脱離するエーテル型保護基を 2'位の水酸基に導入 する、次の一般式（15)、 （15' )で表されるヌクレオシド誘導体を製造する工程。
[化 3]
Figure imgf000009_0001
WG
( 1 4 ) ( 1 5 ) ( 1 5 ' )
[式中、 WG1は、前記と同義である。 ]
Figure imgf000009_0002
「アルキル化試薬」として、例えば、次の一般式（13)で表されるエーテルィ匕合物を 挙げることができる。
[化 4] しへ^^ WG1
( 1 3 )
[式中、 Lは、ハロゲン、ァリールチオ基、アルキルスルホキシド基又はアルキルチオ 基を表す。 WG1は、前記と同義である。 ]
Lに係る「ノヽロゲン」、「ァリールチオ基」の「ァリール」、「アルキルスルホキシド基」及 び「アルキルチオ基」の「アルキル」としては、本発明ホスホロアミダイト化合物におけ る「ノヽロゲン」、「ァリール」、「アルキル」と同じものを挙げることができる。
エーテルィ匕合物（13)の具体例としては、次の 1.〜2.の化合物を挙げることができ る。
1. クロロメチル 2—シァノエチルエーテル
2. 2—シァノエチノレ メチノレチオメチノレエーテノレ
エーテルィ匕合物（13)は、中性条件下において脱離可能なエーテル型置換基を、 2'位の水酸基に塩基性条件下において導入することができる新規なアルキルィ匕試 薬であり、本発明ホスホロアミダイトイ匕合物を製造するための試薬として有用である。
エーテルィ匕合物（13)は、次に示す工程 1〜工程 4を実施することにより製造するこ とがでさる。
工程 1 :
次の一般式（20)で表されるアルコール化合物をアルキルチオメチル化し、次の一 般式 (24)で表される化合物を製造する工程。
[化 5]
HO〜WG' R3Sへ〜 '
( 2 0 ) ( 2 4 )
[式中、 WG1は、前記と同義である。 R3は、アルキル又はァリールを表す。 ] 化合物（24)は、 Lがアルキルチオ基であるエーテルィ匕合物（13)である。
R3に係る「アルキル」としては、本発明ホスホロアミダイト化合物における「アルキル」 と同じものを挙げることができる。
R3がメチルである場合、アルキルチオメチル化試薬としては、例えば、ジメチルスル ホキシド、無水酢酸及び酢酸の混合溶液を挙げることができる。「ジメチルスルホキシ ド」の使用量は、化合物（20)に対して、 10〜200倍モル量が適当であり、 20〜： L00 倍モル量が好ましい。「酢酸」の使用量は、化合物（20)に対して、 10〜150倍モル 量が適当であり、 20〜： L 00倍モル量が好ましい。「無水酢酸」の使用量は、化合物（ 20)に対して、 10〜150倍モノレ量カ適当であり、 20〜： LOO倍モノレ量カ好まし!/、。反 応温度は、 0°C〜100°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温 度等によって異なる力 通常 1〜48時間が適当である。 工程 2 :
化合物（24)をハロゲンィ匕し、次の一般式 (25)で表される化合物を製造する工程。
[化 6] 3八0〜 へ。〜 WG1
( 2 4 ) ( 2 5 )
[式中、
Figure imgf000011_0001
R3は、前記と同義である。 X2は、ハロゲンを表す。 ]
化合物（25)は、エーテルィ匕合物（13)における Lがハロゲンである化合物である。 X2に係る「ノヽロゲン」としては、本発明ホスホロアミダイトイ匕合物における「ノヽロゲン」 と同じものを挙げることができる。
本工程は、公知の方法（例えば、 T. Bennecheら、 Synthesis 762 (1983) )によ り実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されない 1S 例えば、ジクロロメタン、クロロホノレム、四塩化炭素、 1, 2—ジクロロェタンなどの ハロゲン系炭化水素を挙げることができる。ハロゲン化試薬としては、例えば、塩化ス ルフリル、ォキシ塩化リンを挙げることができる。「ハロゲンィ匕試薬」の使用量は、化合 物（24)に対して、 1〜20倍モル量が適当であり、 1〜10倍モル量が好ましい。反応 温度は、 0°C〜100°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度 等によって異なる力 通常 30分〜 24時間が適当である。 工程 3 :
化合物（25)をァリールチオイ匕し、次の一般式 (25a)で表される化合物を製造するェ 程。
[化 7] X2へ。〜 . R3 へ〜 WG1
( 2 5 ) ( 2 5 a )
[式中、
Figure imgf000012_0001
X2は、前記と同義である。 R3Aは、ァリールを表す。 ]
化合物（25a)は、エーテルィ匕合物（13)における Lがァリールチオ基である化合物 である。
R3Aに係る「ァリール」としては、本発明ホスホロアミダイト化合物における「ァリール」 と同じものを挙げることができる。
本工程は、公知の方法により実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与 しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、ァセトニトリルを挙げること ができる。ァリールチオ化試薬としては、例えば、チォフエノール、 4 メチルベンゼン チオールを挙げることができる。「ァリールチオィ匕試薬」の使用量は、化合物（25)に 対して、 1〜 20倍モル量が適当であり、 1〜5倍モル量が好ましい。反応温度は、 0°C 〜100°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異 なるが、通常 1〜48時間が適当である。 工程 4 :
化合物（24)を酸ィ匕し、次の一般式 (24a)で表される化合物を製造する工程,
[化 8] 〜 〜
0
( 2 4 ) ( 2 4 a )
[式中、
Figure imgf000012_0002
R3は、前記と同義である。 ]
化合物（24a)は、エーテル化合物（13)における Lがアルキルスルホキシド基である 化合物である。
R3に係る「アルキル」としては、本発明ホスホロアミダイト化合物における「アルキル」 と同じものを挙げることができる。
本工程は、公知の方法により実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与 しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロ口ホルム、メタノールを 挙げることができる。酸化剤としては、例えば、メタクロ口過安息香酸、メタ過ヨウ素酸 塩、過酸ィ匕水素を挙げることができる。「酸化剤」の使用量は、化合物（24)に対して 、 1〜 10倍モル量が適当であり、 1〜2倍モル量が好ましい。反応温度は、 0°C〜10 0°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なる 力 通常 1〜48時間が適当である。
[0012] 「アルキル化試薬」として、化合物（25)を使用する場合、以下のように実施すること ができる。
本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従 い合成可能である化合物（14)にアルキル化試薬と塩基とを作用させることにより実 施することができる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、 例えば、ジクロロメタン、クロロホノレム、四塩化炭素、 1, 2—ジクロロェタンなどのハロ ゲン系炭化水素を挙げることができる。「アルキル化試薬」の使用量は、化合物（14) に対して、 1〜20倍モル量が適当であり、 1〜10倍モル量が好ましい。本工程にお いて、必要に応じて、化合物（14)に金属試薬と塩基を作用させ製造される中間体を 経由した後、アルキル化試薬を作用させることもできる。カゝかる「金属試薬」として、例 えば、二塩ィ匕ジブチルスズを挙げることができる。「金属試薬」の使用量は、化合物（ 14)に対して、 1〜20倍モル量が適当であり、 1〜10倍モル量が好ましい。「塩基」と しては、ピリジン、 2, 6—ジメチルビリジン、 2, 4, 6—トリメチルピリジン、 N—メチルイ ミダゾール、トリエチルァミン、トリブチルァミン、 N, N—ジイソプロピルェチルァミン、 1, 8—ジァザビシクロ [5. 4. 0]— 7—ゥンデセンなどの有機塩基を挙げることができ る。「塩基」の使用量は、化合物（14)に対して、 1〜20倍モル量が適当であり、 1〜1 0倍モル量が好ましい。反応温度は、 0°C〜120°Cが適当である。反応時間は、使用 する原料の種類、反応温度等によって異なる力 通常 30分〜 24時間が適当である。
[0013] 「アルキル化試薬」として、化合物（24)又は（25a)を使用する場合、以下のように 実施することができる。 本工程は、公知の方法（例えば、 M. Matteucci, Tetrahedron Letters, Vol. 31 , 2385 (1990) )に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従い合 成可能である化合物（14)に、アルキル化試薬と酸と硫黄原子に対するハロゲン化剤 とを作用させること〖こより実施することができる。「アルキルィ匕試薬」の使用量は、化合 物（14)に対して、 1〜5倍モル量が適当であり、 1. 05〜3倍モル量が好ましい。「酸 」としては、例えば、トリフルォロメタンスルホン酸、トリフルォロメタンスルホン酸銀、トリ メチルシリルトリフルォロメタンスルホネートを挙げることができる。「酸」の使用量は、 化合物（14)に対して、 0. 01〜20倍モル量が適当であり、 0. 02〜10倍モル量が好 ましい。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジク ロロメタン、クロ口ホルム、四塩化炭素、 1, 2—ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キ シレン、テトラヒドロフラン、ァセトニトリル又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。 本工程において使用する「硫黄原子に対するハロゲン化剤」として、例えば、 N ブ 口モスクシンイミド（NBS)、 N—ョードスクシンイミド（NIS)を挙げることができる。「硫 黄原子に対するハロゲン化剤」の使用量は、化合物（14)に対して、 1〜10倍モル量 が適当であり、 1. 05〜5倍モル量が好ましい。反応温度は、 78°C〜30°Cが適当 である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常 5分 〜5時間が適当である。 「アルキル化試薬」として、化合物（24a)を使用する場合、以下のように実施するこ とがでさる。
本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従 い合成可能である化合物（14)に、アルキルィ匕試薬と酸無水物と塩基とを作用させる こと〖こより実施することができる。「アルキル化試薬」の使用量は、化合物（14)に対し て、 1〜5倍モル量が適当であり、 1. 05〜3倍モル量が好ましい。「酸無水物」として は、例えば、トリフルォロメタンスルホン酸無水物、無水酢酸を挙げることができる。「 酸無水物」の使用量は、化合物（14)に対して、 0. 01〜20倍モル量が適当であり、 0. 02〜 10倍モル量が好ましい。塩基としては、例えば、テトラメチルゥレア、コリジン を挙げることができる。「塩基」の使用量は、化合物（14)に対して、 0. 01〜20倍モ ル量が適当であり、 0. 02〜： LO倍モル量が好ましい。使用する溶媒は、反応に関与 しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロ口ホルム、四塩化炭素、 1, 2—ジクロロェタン又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。反応温度は、 - 7 8°C〜30°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって 異なるが、通常 5分〜 24時間が適当である。
[0015] (2)工程 b :
工程 aにお 、て製造されるヌクレオシド誘導体（15)を単離精製する工程。 本工程は、工程 aにおいて製造される混合物カゝら通常の分離精製手段、例えば、 薄層クロマトグラフィー、シリガゲルクロマトグラフィーなどの手段を用いることにより単 離精製することができる。 [0016] (3)工程 c :
工程 bとは別に、次の一般式（ 16)で表されるリボ核酸化合物にアルキル化試薬を 作用させることによって、中性条件下にお 、て脱離するエーテル型保護基を 2 '位の 水酸基に導入した、次の一般式（17)で表されるリボ核酸ィ匕合物を製造する工程。
[化 9]
Figure imgf000015_0001
[式中、 B、 WG1は、前記と同義である。
X
Aは、次の一般式（18a)又は（18b)で表されるケィ素置換基を表す。
[化 10] e 8
'S O- s|— -Si- R6 Re
[式中、 R6は、アルキルを表わす。 ] ] R6に係る「アルキル」としては、本発明ホスホロアミダイト化合物における「アルキル」 と同じものを挙げることができる。
「アルキル化試薬」としては、前記と同じものを挙げることができる。
[0017] 「アルキル化試薬」として、化合物（25)を使用する場合、以下のように実施すること ができる。
本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従 い合成可能である化合物（16)にアルキル化試薬と塩基とを作用させることにより実 施することができる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、 例えば、ジクロロメタン、クロロホノレム、四塩化炭素、 1 , 2—ジクロロェタンなどのハロ ゲン系炭化水素を挙げることができる。「アルキル化試薬」の使用量は、化合物（14) に対して、 1〜20倍モル量が適当であり、 1〜10倍モル量が好ましい。本工程にお いて、必要に応じて、化合物（16)に金属試薬と塩基を作用させ製造される中間体を 経由した後、アルキル化試薬を作用させることもできる。カゝかる「金属試薬」として、例 えば、二塩化ジブチルスズ、 t—ブチルマグネシウムクロライドを挙げることができる。「 金属試薬」の使用量は、化合物（16)に対して、 1〜20倍モル量が適当であり、 1〜1 0倍モル量が好ましい。「塩基」としては、ピリジン、 2, 6—ジメチルビリジン、 2, 4, 6 —トリメチルピリジン、 N—メチルイミダゾール、トリエチルァミン、トリブチルァミン、 N, N—ジイソプロピルェチルァミン、 1, 8—ジァザビシクロ [5. 4. 0]— 7—ゥンデセンな どの有機塩基を挙げることができる。「塩基」の使用量は、化合物（16)に対して、 1〜 20倍モル量が適当であり、 1〜 10倍モル量が好ましい。反応温度は、 0°C〜120°C が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、 通常 30分〜 24時間が適当である。
[0018] 「アルキル化試薬」として、化合物（24)又は（25a)を使用する場合、以下のように 実施することができる。
本工程は、公知の方法（例えば、 M. Matteucci, Tetrahedron Letters, Vol. 31 , 2385 (1990) )に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従い合 成可能である化合物（16)に、アルキル化試薬と酸と硫黄原子に対するハロゲン化剤 とを作用させること〖こより実施することができる。「アルキルィ匕試薬」の使用量は、化合 物（16)に対して、 1〜5倍モル量が適当であり、 1. 05〜3倍モル量が好ましい。「酸 」としては、例えば、トリフルォロメタンスルホン酸、トリフルォロメタンスルホン酸銀、トリ メチルシリルトリフルォロメタンスルホネートを挙げることができる。「酸」の使用量は、 化合物（16)に対して、 0. 01〜20倍モル量が適当であり、 0. 02〜10倍モル量が好 ましい。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジク ロロメタン、クロ口ホルム、四塩化炭素、 1, 2—ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キ シレン、テトラヒドロフラン、ァセトニトリル又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。 本工程において使用する「硫黄原子に対するハロゲン化剤」として、例えば、 N ブ 口モスクシンイミド（NBS)、 N—ョードスクシンイミド（NIS)を挙げることができる。「硫 黄原子に対するハロゲン化剤」の使用量は、化合物（16)に対して、 1〜10倍モル量 が適当であり、 1. 05〜5倍モル量が好ましい。反応温度は、 78°C〜30°Cが適当 である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常 5分 〜5時間が適当である。 「アルキル化試薬」として、化合物（24a)を使用する場合、以下のように実施するこ とがでさる。
本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従 い合成可能である化合物（16)に、アルキルィ匕試薬と酸無水物と塩基とを作用させる こと〖こより実施することができる。「アルキル化試薬」の使用量は、化合物（16)に対し て、 1〜5倍モル量が適当であり、 1. 05〜3倍モル量が好ましい。「酸無水物」として は、例えば、トリフルォロメタンスルホン酸無水物、無水酢酸を挙げることができる。「 酸無水物」の使用量は、化合物（16)に対して、 0. 01〜20倍モル量が適当であり、 0. 02〜 10倍モル量が好ましい。塩基としては、例えば、テトラメチルゥレア、コリジン を挙げることができる。「塩基」の使用量は、化合物（16)に対して、 0. 01〜20倍モ ル量が適当であり、 0. 02〜： L0倍モル量が好ましい。使用する溶媒は、反応に関与 しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロ口ホルム、四塩化炭素、 1, 2 ジクロロェタン又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。反応温度は、 - 7 8°C〜30°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって 異なるが、通常 5分〜 24時間が適当である。
[0020] (4)工程 d:
工程 a〜工程 cとは別に、リボ核酸化合物（16)にジメチルスルホキシドと酢酸と無水 酢酸とを作用させることによって、次の一般式（19)で表されるリボ核酸ィ匕合物を製造 する工程。
[化 11]
Figure imgf000018_0001
[式中、 A、 Bは、前記と同義である。 ]
X
本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従い 合成可能であるリボ核酸ィ匕合物（16)に、ジメチルスルホキシドと酢酸と無水酢酸とを 作用させること〖こより実施することができる。
「ジメチルスルホキシド」の使用量は、化合物（16)に対して、 10〜200倍モル量力 S 適当であり、 20〜： LOO倍モル量が好ましい。「酢酸」の使用量は、化合物（16)に対し て、 10〜150倍モル量が適当であり、 20〜 100倍モル量が好ましい。「無水酢酸」の 使用量は、化合物（16)に対して、 10〜150倍モル量が適当であり、 20〜： LOO倍モ ル量が好ましい。反応温度は、 10°C〜50°Cが適当である。反応時間は、使用する原 料の種類、反応温度等によって異なる力 通常 30分〜 24時間が適当である。
[0021] (5)工程 e :
工程 dにお ヽて製造されるヌクレオシド誘導体（19)に次の一般式（20)で表されるァ ルコールィ匕合物と酸と硫黄原子に対するハロゲン化剤とを作用させることによって、 中性条件下において脱離するエーテル型保護基を 2'位の水酸基に導入した、次の 一般式（17)で表されるリボ核酸化合物を製造する工程。 [化 12]
Figure imgf000019_0001
[式中、 A、 B、 WG1は、前記と同義である。 ]
X
本工程は、公知の方法に従い、リボ核酸化合物（19)に、アルコールィ匕合物（20)と 酸と硫黄原子に対するハロゲン化剤とを作用させることにより実施することができる。 使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメ タン、クロ口ホルム、四塩化炭素、 1, 2—ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン 、テトラヒドロフラン、ァセトニトリル又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。「アル コール化合物（20)」の使用量は、化合物（19)に対して、 1〜20倍モル量が適当で あり、 1〜 10倍モル量が好ましい。「酸」としては、例えば、トリフルォロメタンスルホン 酸、トリフルォロメタンスルホン酸銀、トリメチルシリルトリフルォロメタンスルホネートを 挙げることができる。「硫黄原子に対するハロゲン化剤」としては、例えば、 N ブロモ スクシンイミド (NBS)、 N—ョードスクシンイミド (NIS)を挙げることができる。「硫黄原 子に対するハロゲン化剤」の使用量は、化合物（19)に対して、 0. 1〜20倍モル量が 適当であり、 0. 2〜 10倍モル量が好ましい。反応温度は、 100°C〜20°Cが適当 である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常 5分 〜12時間が適当である。 (6)工程 f :
工程 c又は工程 eにお 、て製造されるリボ核酸ィ匕合物（ 17)の 3 '位と 5，位の水酸基 の保護基を脱離する反応を行うことによって、次の一般式 (21)で表されるリボ核酸ィ匕 合物を製造する工程。
[化 13]
Figure imgf000020_0001
[式中、 A、 B、 WG1は、前記と同義である。 ]
X
本工程は、化合物（17)を有機溶媒に溶解し、フッ素化剤と酸とを任意の混合比の 混合試薬として反応させることにより実施することができる。本工程に使用しうる「フッ 素化剤」としては、例えば、フッ化アンモ-ゥム、テトラ n—ブチルアンモ -ゥムフルォ リド (TBAF)、トリエチルァミントリハイドロフルオリド、フッ化水素ピリジンを挙げること 力 Sできる。「フッ素ィ匕剤」の使用量としては、化合物（17)に対して、 0. 1〜20倍モル 量が適当であり、 0. 2〜 10倍モル量が好ましい。反応温度は、 0°C〜120°Cが適当 である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常 30 分〜 24時間が適当である (7)工程 g :
工程 fにおいて製造されるリボ核酸ィ匕合物（21)の 5'位の水酸基に酸性条件下に お!ヽて脱離する保護基 (R1)を導入する、リボ核酸化合物（15)を製造する工程。
[化 14] WG1
[式中 表す。 ]
Figure imgf000020_0002
X3に係る「ノヽロゲン」としては、本発明ホスホロアミダイトイ匕合物における「ノヽロゲン」 と同じものを挙げることができる。
本工程は、公知の方法に従い、化合物（21)に R 3を作用させることにより実施す ることができる。 R 3の使用量は、化合物（21)に対して、 1〜20倍モル量が適当で あり、 1〜10倍モル量が好ましい。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限 定されないが、例えば、ァセトニトリル、テトラヒドロフランを挙げることができる。「塩基 」としては、ピリジン、 2, 6—ジメチルビリジン、 2, 4, 6—トリメチルピリジン、 N—メチ ルイミダゾール、トリエチルァミン、トリブチルァミン、 N, N—ジイソプロピルェチルアミ ン、 1, 8—ジァザビシクロ [5. 4. 0]— 7—ゥンデセンなどの有機塩基を挙げることが できる。「塩基」の使用量は、化合物（21)に対して、 1〜20倍モル量が適当であり、 1 〜10倍モル量が好ましい。反応温度は、 0°C〜120°Cが適当である。反応時間は、 使用する原料の種類、反応温度等によって異なる力 通常 30分〜 24時間が適当で ある。 (8)工程 h:
工程 b又は工程 fにおいて製造されるヌクレオシド誘導体（15)にホスホロアミダイト 化試薬と、必要に応じて活性化剤とを作用させることによって、 3'位の水酸基がホス ホロアミダイトイ匕された本発明ホスホロアミダイトイ匕合物を製造する工程。
[化 15]
Figure imgf000021_0001
[式中、 B、
Figure imgf000021_0002
WG2は、前記と同義である。 ]
「ホスホロアミダイトイ匕試薬」としては、例えば、次の一般式（22)、 （23)で表される化 合物を挙げることができる。
[化 16]
X1 N
^2^Ρ^Ά WQ2〜P、
2A R2A
( 2 2 ) ( 2 3 )
[式中、 R2a、 R2b、 WG2は、前記と同義である。 X1は、ハロゲンを表す。 ]
X1に係る「ノヽロゲン」としては、本発明ホスホロアミダイトイ匕合物における「ノヽロゲン」 と同じものを挙げることができる。
本工程は、化合物（15)にホスホロアミダイト試薬を作用させて、 3'位の水酸基をホ スホロアミダイトイ匕する反応であり、公知の方法に従い実施することができる。必要に 応じて、活性化剤を使用することもできる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ 特に限定されないが、例えば、ァセトニトリル、テトラヒドロフランを挙げることができる
「ホスホロアミダイトイ匕試薬」の使用量は、化合物（15)に対して、 1〜20倍モル量が 適当であり、 1〜： LO倍モル量が好ましい。「活性化剤」としては、例えば、 1H—テトラ ゾール、 5—ェチルチオテトラゾール、 4, 5—ジクロロイミダゾール、 4, 5—ジシァノィ ミダゾール、ベンゾトリアゾールトリフラート、イミダゾールトリフラート、ピリジ-ゥムトリフ ラート、 N, N—ジイソプロピルェチルァミン、 2, 4, 6—コリジン/ N—メチルイミダゾ ールを挙げることができる。「活性化剤」の使用量は、化合物（15)に対して、 1〜20 倍モル量が適当であり、 1〜 10倍モル量が好ましい。反応温度は、 0°C〜120°Cが 適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通 常 30分〜 24時間が適当である。
このようにして、製造される本発明ホスホロアミダイトイ匕合物は、それ自体公知の手 段、例えば、濃縮、液性変換、転溶、溶媒抽出、結晶化、再結晶、分留、クロマトダラ フィ一等により分離精製することができる。 III.オリゴ RNAの製法
本発明として、本発明ホスホロアミダイトイ匕合物を用いることを特徴とする、次の一般 式（3)で表されるオリゴ RNAの製法を挙げることができる。
以下に詳述する。
[化 17]
Figure imgf000023_0001
[式中、各 Bは独立して、アデニン、グァニン、シトシン、ゥラシル、チミン又はそれらの 修飾体を表す。各 Rは、それぞれ独立して、 H又は水酸基を表すが、少なくとも 1つは 水酸基を表す。 Zは、 H又はリン酸基を表す。 nは、 1〜： LOOの範囲内にある整数を表 す。]
nは、 10〜50の範囲内にある整数が好ましぐまた、より好ましくは、 15〜30の範囲 内にある整数である。
Bの修飾体に係る置換基としては、例えば、ハロゲン、ァシル、アルキル、ァリール アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アミ入モノアルキルアミ入ジアルキルァミノ、カル ボキシ、シァ入ニトロを挙げることができ、これらが 1〜3個置換されている。
Bの修飾体に係る「ノヽロゲン」、 「ァシル」、 「アルキル」、 「ァリールアルキル」、 「アル コキシ」、 「アルコキシアルキル」、 「ァミノ」、 「モノアルキルァミノ」、 「ジアルキルァミノ」 としては、各々本発明ホスホロアミダイトイ匕合物と同じものを挙げることができる。 本発明ホスホロアミダイトイ匕合物を用いるオリゴ RNA (3)の製法は、公知の方法に 従い行うことができる力 例えば、次に示す工程 A〜工程 Gの操作を実施することに より、段階的に 3'から 5'の方向へ核酸モノマー化合物を縮合することにより行うこと ができる。
下記工程に使用されている化合物及び試薬のうち、本発明ホスホロアミダイトイ匕合 物以外については、オリゴ RNA又はオリゴ DNAの合成に一般的に使用されている ものであれば特に限定されない。また、既存の核酸合成試薬を用いた場合と同様、 すべての工程をマニュアル又は市販の DNA自動合成機を用いて製造することがで きる。自動合成機で行うことにより操作法の簡便化、また合成の正確性の点カゝら自動 合成機を用いる方法が望ましい。また、下記工程 A〜工程 Gに記載されている化合 物及び試薬のうち、核酸モノマー化合物以外については、オリゴ DNA又はオリゴ RN Aの合成に一般的に使用されているものであれば特に限定されない。 (1) X@A:
次の一般式 (4)で表される化合物に酸を作用させることによって、 5 '位の水酸基の 保護基を脱離して、次の一般式 (5)で表される化合物を製造する工程。
[化 18]
Figure imgf000024_0001
(4 ) ( 5 )
[式中、 n、
Figure imgf000024_0002
WG2は前記と同義である。各 Bxは、それぞれ独立して、了ザニン、グ ァニン、シトシン、ゥラシル、チミン又はそれらの修飾体を表す。各 R4は、それぞれ独 立して、 H、ァシルォキシ又は次の一般式 (6)で表される置換基を表す。
[化 19]
( 6 )
[式中、 WG1は、前記と同義である。 ]
Eは、ァシル又は次の一般式（7)で表される置換基を表す。
[化 20]
-Q- Iリンカー卜固相担体 ( 7 )
[式中、 Qは、単結合又は次の一般式 (8)で表される置換基を表す,
[化 21]
Figure imgf000025_0001
[式中 WG2は、前記と同義である。 ]]
Tは、 H、ァシルォキシ、上記一般式 (6)又は（7)で表される置換基を表す。
但し、 E又は Tのどちらか一方は、置換基（7)を表す。 ]
本工程は、固相担体に担持された次の一般式（26a)、（26b)で表される化合物 (n = 1である化合物 (4) )、又は、工程 A〜工程 Dの操作を行うことにより製造される固 相担体に担持されたオリゴ RNA若しくはオリゴ DNA (n= 2〜： L00である化合物（4) ) (以下、「固相担体に担持された化合物」という。）に酸を作用させることにより実施す ることがでさる。
[化 22]
Figure imgf000025_0002
[式中、 R41!ま、置換基（7)を表す。 R2は、ァシル
Figure imgf000025_0003
ォキシを表す。 R4は、 H、ァシルォキシ又は置換基 (6)を表す。 ]
R2、 R4の「ァシルォキシ」に係る「ァシル」としては、例えば、ァセチル、プロピオ-ル 、ブチリル、イソブチリル、ベンゾィル、 4ーメトキシベンゾィル、フエ二ルァセチル、フ エノキシァセチル、 4— tert—ブチルフエノキシァセチル、 4—イソプロピルフエノキシ ァセチルを挙げることができる。
「固相担体」としては、例えば、定孔ガラス（controlled pore glass ; CPG)、ォキ サリル化—定孔ガラス（例えば、 Alulら， Nucleic Acids Research, Vol. 19, 15 27 (1991)を参照）、 TentaGel支持体ーァミノポリエチレングリコール誘導体ィ匕支持 体（例えば、 Wrightら， Tetrahedron Letters, Vol. 34, 3373 (1993)を参照）、
Poros—ポリスチレン Zジビュルベンゼンのコポリマーを挙げることができる。
「リンカ一」としては、例えば、 3—ァミノプロピル、スクシ-ル、 2, 2'ージエタノール スルホ -ル、ロングチェーンアルキルアミノ（LCAA)を挙げることができる。
化合物（26a)、化合物（26b)は、公知の方法に従 、製造される又は市販品として 入手できる固相担体に担持された化合物であり、好ましい態様としては、例えば、次 の一般式（27)、 (28)で表される化合物を挙げることができる。
[化 23]
[式中
Figure imgf000026_0001
R4が置換基 (6)である化合物（27)、 (28)は、本発明ホスホロアミダイト化合物から 公知の方法に従!ヽ製造することができる。 本工程に使用しうる「酸」としては、例えば、トリフルォロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロ 口酢酸を挙げることができる。本工程に使用しうる酸は、 1〜5%の濃度になるように適 当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特 に限定されないが、ジクロロメタン、ァセトニトリル、水又はこれらの混合溶媒を挙げる ことができる。上記反応における反応温度は、 20°C〜50°Cが好ましい。反応時間は 、使用する酸の種類、反応温度によって異なる力 通常 1分〜 1時間が適当である。 使用する試薬の量は固相担体に担持されて！ヽる化合物に対して 1〜 100倍モル量 がよぐより好ましくは 1〜10倍モル量である。 (2)工程 B :
工程 Aにおいて製造される化合物（5)に、活性化剤を用いて核酸モノマー化合物 を縮合させ、次の一般式 (9)で表される化合物を製造する工程。
Figure imgf000027_0001
( 5 ) ( 9 )
[式中、 R4、 T、 WG2は、前記と同義である。 ]
Figure imgf000027_0002
本工程は、固相担体に担持された化合物に核酸モノマー化合物と活性化剤とを作 用させること〖こより実施することができる。
「核酸モノマー化合物」としては、本発明ホスホロアミダイトイ匕合物又は市販品として 入手可能な次の一般式 (29)で表される化合物を挙げることができる。
[化 25]
Figure imgf000027_0003
( 2 9 )
[式中、 は、保護基を有していてもよい
Figure imgf000027_0004
核酸塩基を表す。 ]
B に係る「核酸塩基」としては、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限さ
Y
れず、例えば、アデニン、グァニン、シトシン、チミン又はそれらの修飾体を挙げること ができる。
当該「修飾体」は、前記 Bと同義である。
X
Bの修飾体に係る置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、ァリールアルキル
Y
、アルコキシ、ヒドロキシ、アミ入モノアルキルアミ入ジアルキルァミノ、カルボキシ、 シァ入ニトロを挙げることができ、これらが 1〜3個置換されている。 B の修飾体に係る「ノヽロゲン」、 「ァシル」、 「アルキル」、 「ァリールアルキル」、 「アル γ
コキシ」、 「アルコキシアルキル」、 「ァミノ」、 「モノアルキルァミノ」、 「ジアルキルァミノ」 としては、各々本発明ホスホロアミダイトイ匕合物と同じものを挙げることができる。
B に係る「核酸塩基」は、保護されていてもよぐなかでもアミノ基を有する核酸塩基
Y
、例えば、アデニン、グァニン、シトシンは、ァミノ基が保護されているのが好ましい。 かかる Bの「ァミノ基の保護基」としては、前記 Bと同じものを挙げることができる。
Y X
「活性化剤」としては、前記と同じものを挙げることができる。
反応溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ァセトニト リル、テトラヒドロフランを挙げることができる。上記反応における反応温度は、 20°C〜 50°Cが好ましい。反応時間は、使用する活性化剤の種類、反応温度によって異なる が、通常 1分〜 1時間が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持されてい る化合物に対して 1〜 100倍モル量がよぐより好ま くは 1〜 10倍モル量である。
(3)工程 C :
工程 Bにおいて未反応である化合物（5)の 5'位の水酸基をキヤッビングする工程。
[化 26]
Figure imgf000028_0001
( 5 ) ( 1 0 )
[式中、 B、 E、 n、 R4、 T、 WG2は、前記と同義である。 R5は、メチル、フエノキシメチ
X
ルを表す。 ]
本工程は、工程 Bにおいて未反応であった 5'位の水酸基を保護する反応であり、 固相担体に担持されたィ匕合物にキャップ化剤を作用することにより実施することがで きる。
「キャップ化剤」としては、例えば、無水酢酸又はフ ノキシ酢酸無水物を挙げること ができる。キャップ化剤は、 0. 05〜1Mの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使 用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ピリ ジン、ジクロロメタン、ァセトニトリル、テトラヒドロフラン又はこれらの混合溶媒を挙げる ことができる。また、本工程において必要に応じて、「反応促進剤」として、例えば、 4 ージメチルァミノピリジン、 N—メチルイミダゾールを使用することができる。上記反応 における反応温度は、 20°C〜50°Cが好ましい。反応時間は、使用するキャップ化剤 の種類、反応温度によって異なるが、通常 1分〜 30分が適当である。使用する試薬 の量は固相担体に担持されている化合物に対して 1〜100倍モル量がよぐより好ま しくは 1〜 10倍モル量である。 (4)工程 D :
工程 Bにおいて製造される化合物（9)に酸化剤を作用させることによって亜リン酸 基をリン酸基に変換する工程。
[化 27]
Figure imgf000029_0001
( 9 ) ( 1 1 )
[式中、 B、 E、 n、 R\ R4、 T、 ま、前記と同義である。 ]
X
本工程は、 3価のリンから 5価のリンに酸化剤を使用して変換する反応であり、固相 担体に担持されたィ匕合物に酸化剤を作用させることにより実施することができる。
「酸化剤」としては、例えば、ヨウ素、 tert—ブチルヒドロペルォキシドを挙げることが できる。また、本工程に使用する酸化剤は、 0. 05〜2Mの濃度になるように適当な溶 媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定 されないが、ピリジン、テトラヒドロフラン、水又はこれらの混合溶媒を挙げることができ る。例えば、ヨウ素 Z水 Zピリジンーテトラヒドロフランあるいはヨウ素 Zピリジン一酢酸 や過酸化剤 (t—プチルノヽイド口パーォキシド zメチレンクロライドなど）を用いることが できる。反応温度は、 20°C〜50°Cが好ましい。反応時間は、使用する酸化剤の種類 、反応温度によって異なるが、通常 1分〜 30分が適当である。使用する試薬の量は 固相担体に担持されている化合物に対して 1〜： LOO倍モル量がよぐより好ましくは 1 0〜50倍モル量である。 (5) X@E :
工程 Dにお 、て製造される化合物（11)を固相担体力 切り出し、各核酸塩基部及 び各 2'位の水酸基の保護基を脱離する工程。
[化 28]
[式中、 B、 る。 ]
Figure imgf000030_0001
切り出し工程は、所望の鎖長のオリゴ RNAを切り出し剤によって、固相担体及びリ ンカーから外す反応であり、所望の鎖長のオリゴ RNAが担持された固体担体に切り 出し剤を添加することにより実施することができる。本工程において、核酸塩基部の 保護基を脱離することができる。
「切り出し剤」としては、例えば、濃アンモニア水、メチルァミンを挙げることができる 。本工程に使用しうる「切り出し剤」は、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロ ピルアルコール、ァセトニトリル、テトラヒドロフラン又はこれらの混合溶媒で希釈して 使用することもできる。なかでも、エタノールが好ましい。
反応温度は、 15°C〜75°Cが適当であり、 15°C〜30°Cが好ましぐ 18°C〜25°Cが より好ましい。脱保護反応時間は、 1〜30時間が適当であり、 1〜24時間が好ましぐ 1〜4時間がより好ま U、。脱保護に使用される溶液中の水酸ィ匕アンモ-ゥムの濃度 は、 20〜30重量％が適当であり、 25〜30重量％が好ましぐ 28〜30重量％がより 好ましい。使用する試薬の量は、固相担体に担持されている化合物に対して 1〜10 0倍モル量が適当であり、 10〜 50倍モル量が好まし!/、。
2'位の水酸基の保護基を脱離する工程は、「2'位の水酸基の保護基を脱離する 試薬」として、例えば、テトラプチルアンモ -ゥムフルオリド、三フッ化水素'トリェチル アミン塩を作用させることにより行うことができる。使用する溶媒としては、反応に関与 しなければ特に限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、 N—メチルピロリドン、ピ リジン、ジメチルスルホキシド又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。必要であ れば、本工程における副生成物であるアクリロニトリルを補足する化合物として、例え ば、アルキルァミン、アミジン、チオール、チオール誘導体又はこれらの混合物を添 カロすることができる。「アルキルァミン」としては、例えば、直鎖状の炭素数 1〜6のァ ルキルアミンを挙げることができる。具体的には、例えば、メチルァミン、ェチルァミン 、 n—プロピルアミン、 n—ブチルァミン、 n—ペンチルァミン、 n—へキシルアミンを挙 げることができる。「アミジン」としては、例えば、ベンズアミジン、ホルムアミジンを挙げ ることができる。「チオール」としては、例えば、直鎖状の炭素数 1〜6のチオールを挙 げることができる。具体的には、例えば、メタンチオール、エタンチオール、 1 プロパ ンチオール、 1 ブタンチオール、 1 ペンタンチオール、 1一へキサンチオールを挙 げることができる。「チオール誘導体」としては、例えば、同一又は異なる直鎖状の炭 素数 1〜6のアルキルチオール基を有するアルコール又はエーテルを挙げることがで きる。具体的には、例えば、 2 メルカプトエタノール、 4 メルカプト 1ーブタノール 、 6 メルカプト 1一へキサノール、メルカプトメチルエーテル、 2 メルカプトェチル エーテル、 3—メルカプトプロピルエーテル、 4 メルカプトブチルエーテル、 5—メル カプトペンチルエーテル、 6—メルカプトへキシルエーテルを挙げることができる。反 応温度は、 20°C〜80°Cが好ましい。反応時間は、使用する脱保護剤の種類、反応 温度によって異なる力 通常 1時間〜 100時間が適当である。使用する試薬の量は 除去される保護基に対して 50〜500倍モル量がよぐより好ましくは 50〜： L00倍モル 上記反応混合物から通常の分離精製手段、例えば、抽出、濃縮、中和、濾過、遠 心分離、再結晶、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、逆層 o
DSカラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲノレろ過カラムクロ マトグラフィー、透析、限界ろ過などの手段を用いることにより、 5'位が保護されたオリ ゴ RNAを単離精製することができる。 (6)工程 F :
工程 Eにお ヽて製造される化合物（ 12)の 5 '位の水酸基を脱離する工程。
[化 29]
Figure imgf000032_0001
[式中、 B、 n、 R、
Figure imgf000032_0002
Zは、前記と同義である。 ]
本工程は、最終的にオリゴ RNAの 5 '位の水酸基の保護基を脱離する反応であり、 固体担体力 切り出されたオリゴ RNAに酸を作用させることにより実施することができ る。
本工程において使用しうる「酸」としては、例えば、トリクロ口酢酸、ジクロロ酢酸、酢 酸等を挙げることができる。本工程に使用しうる酸は、適当な溶媒で希釈して使用す ることもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメ タン、ァセトニトリル、水、 pHが 2〜5の緩衝液又はこれらの混合溶媒を挙げることが できる。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液を挙げることができる。上記反応におけ る反応温度は、 20°C〜50°Cが好ましい。反応時間は、使用する酸の種類、反応温 度によって異なるが、通常 1分〜 1時間が適当である。使用する試薬の量は固相担 体に担持されている化合物に対して 1〜： LOO倍モル量がよぐより好ましくは 1〜10倍 [0032] (7)工程 G :
工程 Fにお ヽて製造される化合物（3)を分離精製する工程。
「分離精製工程」とは、上記反応混合物から通常の分離精製手段、例えば、抽出、 濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、 C力 C の逆相カラムクロマトグラフィー、 C
8 18
力も c 逆相カートリッジカラム、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交
8 18
換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトダラ フィ一、透析、限界ろ過などの手段を単独若しくは組み合わせて用いることにより、所 望のオリゴ RNAを単離精製する工程である。
「溶出溶媒」としては、例えば、ァセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピル アルコール、水の単独溶媒もしくは任意の比率の混合溶媒を挙げることができる。こ の場合添加物として、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕 カリウム、酢酸アンモ-ゥム、酢酸トリェチルアンモ-ゥム、酢酸ナトリウム、酢酸力リウ ム、トリス塩酸、エチレンジァミン四酢酸を lmM〜2Mの濃度で添カ卩し、溶液の pHを 1〜9の範囲で調整することもできる。
[0033] 工程 A〜工程 Dの操作を繰り返すことにより、所望の鎖長のオリゴ RNA (3)を製造 することができる。なお、本製法においてオリゴ RNA (3)を製造するための出発原料 として、 R4が置換基 (6)である化合物（26a)、 R4が H若しくはァシルォキシであるィ匕 合物（26a)、又は R2がアルキルォキシである化合物（26b)等を使用することができる 。但し、出発原料として、 R4が H若しくはァシルォキシである化合物（26a)、又は R2 がアルキルォキシである化合物（26b)を使用した場合、核酸モノマー化合物として、 少なくとも 1つは本発明ホスホロアミダイトイ匕合物を使用する必要がある。
また、本製法において、工程 Eの操作を行う前に工程 Fの操作を行い、その後工程 Eの操作を行 、、次 、で工程 Gの操作を行うことによりオリゴ RNAを単離精製するこ とちでさる。 実施例 [0034] 以下に実施例を揚げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらのみに限 定されない。
[0035] 実施例 1 クロロメチル 2—シァノエチルエーテル
工程 1 メチルチオメチル 2—シァノエチルエーテルの製造
3—ヒドロキシプロピオ-トリル 32g (450mmol)をジメチルスルホキシド 450mlに溶 解し、無水酢酸 324mL、酢酸 23 lmLを加え室温で 24時間攪拌した。炭酸水素ナト リウム 990gを水 4. 5Lに溶解したものを調製し、これに反応液を一時間かけて滴下し た。そのまま一時間攪拌し、反応液を酢酸ェチルにて抽出し、無水硫酸マグネシウム にて乾燥、溶媒留去し得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製 し、無色油状物のメチルチオメチル 2—シァノエチルエーテルを 4 lg得た（収率 70 %)。
'H-NMRCCDCl )： 2. 18 (s, 3H) ;2. 66 (t, 2H, J = 6. 3Hz) ;3. 77 (t, 2H,
3
J = 6. 3Hz) ;4. 69 (s, 2H) 工程 2 クロロメチル 2—シァノエチルエーテルの製诰
工程 1で得られたメチルチオメチル 2—シァノエチルエーテル 3. 3g(25mmol)を 70mLの塩化メチレンに溶解させ、氷冷下 2mL(25mmol)の塩化スルフリルを滴下 し、さらに室温にて一時間反応させた。反応後、溶媒を留去し真空中にて蒸留し、 目 的化合物を無色油状物として 2. 5g得た (収率 85%)。 沸点： 84— 85°C(0. 3Torr) — NMR(CDC1 )： 2. 72 (t, 2H, J = 6. 3Hz) ;3. 92 (t, 2H, J = 6. 3Hz)； 5
3
. 52(s, 2H)
[0036] 実施例 2 5'-0-(4^ 4'-ジメトキシヒチル _} ~2'-0-{2-シァノエ]:キシメチ ル）ゥリジン 3，一 O— (2 シァノエチル N. N ジイソプロピルホスホロアミダイト） 工程 1 5'— O— (4. 4'—ジメトキシトリチル） 2'— O—（2 シァノエトキシメチル) ゥリジンの製造
5，一 O— (4, 4，一ジメトキシトリチル）ゥリジン 546mg (lmmol)を 1, 2 ジクロロェ タン 4mLに溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 452mg (3. 5mmol)をカ卩え、ついで 365mg (l. 2mmol)の二塩化ジブチルスズを加えた後、室温で一時間反応した。そ の後 80°Cにしクロロメチル 2 シァノエチルエーテル 155. 4mg (l. 3mmol)を滴 下、そのまま 30分間攪拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に反応 液を加え塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し 、得られた混合物を 30gのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、 5'— O— ( 4, 4，—ジメトキシトリチル） 2，— O— (2 シァノエトキシメチル）ゥリジンを得た（19 7mg ;収率 34%)。 — NMR (CDC1 )： 2. 47 (d, IH, J = 7. 8Hz) ; 2. 69 (t, 2H, J = 6. 3Hz) ; 3
3
. 55 (dd, IH, 11. 3, 2. 2Hz) ; 3. 62 (dd, IH, 11. 3, 2. 2Hz) ; 3. 83 (s, 6H)； 3. 87 (t, 2H, J = 6. 3Hz) ;4. 07—4. 08 (m, IH) ;4. 32 (dd, IH, J= 5. 3, 1. 9Hz) ;4. 54 (q, IH, J = 5. 3Hz) ;4. 94, 5. 11 (2d, 2H, J = 6. 9Hz) ; 5. 32 (d , IH, J = 8. 2Hz) ; 6. 00 (d, IH, J= l. 9Hz) ; 6. 85— 6. 88 (m, 4H) ; 7. 29— 7. 41 (m, 9H) ; 8. 02 (d, IH, J = 8. 2Hz) ; 8. 53 (br. s, IH)
ESI-Mass : 652[M + Na] + 工程 2 5'— O— (4. 4'—ジメトキシトリチル） 2'— O—（2 シァノエトキシメチル) ゥリジン 3，一 O— (2 シァノエチル N. N ジイソプロピルホスホロアミダイト）の製 造
工程 1で得られた 5，— O— (4, 4，ージメトキシトリチル）ー2，— O—（2 シァノエト キシメチル）ゥリジン 209mg (0. 332mmol)、テトラゾール 23mg (0. 332mmol)を ァセトニトリル 2mLに溶解し 150mgの（0. 498mmol)の 2 シァノエチル N, N, N ', N' テトライソプロピルホスホロジアミダイトを滴下し、 45°Cで 1.5時間反応させた 。反応後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え酢酸ェチルにて抽出し、無水硫酸 マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し得られた混合物を 20gのシリカゲルカラムクロマト グラフィ一にて精製し、 目的化合物を得た（200mg;収率 73%)。
ESI-Mass:852[M + Na] + 実施例 3 2，一 O—（2 シァノエトキシメチノレ）ゥリジン
工程 1 3，.5'—O—(テトライソプロピルジシロキサン 1.3 ジィル）ー2，ー0—（
2—シァノエトキシメチル）ゥリジンの製诰
3', 5，一 O— (テトライソプロピルジシロキサン一 1, 3 ジィノレ）ゥリジン 150mg(0. 3mmol)をアルゴン雰囲気下テトラヒドロフラン 7mLに溶解し、メチルチオメチル 2 —シァノエチルエーテル 54mg(0.4mmol)、モレキュラーシーブス 4A100mgをカロ え、 10分攪拌した。 0°Cにしトリフルォロメタンスルホン酸 10mg(0.06mmol)のテト ラヒドロフラン 2mL溶液をカ卩ぇ攪拌した後、 N ョードスクシンイミド 92mg(0.4mmo 1)を加え、 1時間攪拌した。反応液をセライトろ過し、塩化メチレンにて洗浄した後、有 機相を 1Mのチォ硫酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄、飽和炭酸水素ナトリウム水溶 液にて洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去した。得られた残渣を薄 層クロマトグラフィーにて精製し、 3', 5'— O— (テトライソプロピルジシロキサン一 1,
3 ジィル） -2'-0- (2 シァノエトキシメチル）ゥリジンを得た（150mg;収率 85 %)。 — NMR(CDC1 )： 0.97-1.12(m, 28H) ;2.68— 2.73 (m, 2H) ;3.78
3
-3.86 (m, 1H) ;3.96—4.05 (m, 2H) ;4.12—4.30 (m, 4H) ;5.0— 5.04 (m, 2H) ;5.70 (d, 1H, J = 8.2Hz) ;5.75 (s, 1H) ;7.90 (d, 1H, J = 8.2Hz) ;9.62 (br. s, 1H)
ESI-Mass:570[M + H] + 工程 2 2'—O—（2—シァノエトキシメチル)ゥリジンの製造
工程 1で得られた 3，， 5，—O—(テトライソプロピルジシロキサン 1, 3 ジィル） 2， -0- (2 シァノエトキシメチル）ゥリジン 200mg (0. 35mmol)をメタノール 2mL に溶解し、フッ化アンモ-ゥム 65mg (l. 76mmol)をカ卩ぇ 50°Cにて 5時間加熱攪拌 した。放冷後ァセトニトリルを加え攪拌し、ろ過濃縮した。得られた残渣をシリカゲル力 ラムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た（108mg ;収率 94%)。 — NMR (CD OD)： 2. 72— 2. 76 (t, 2H, J = 6. 2Hz) ; 3. 68— 3. 92 (m, 4
3
H) ;4. 00-4. 03 (m, 1H) ;4. 26—4. 32 (m, 2H) ;4. 81—4. 95 (m, 2H) ; 5. 71 (d, 1H, J = 8. 1Hz) ; 6. 00 (d, 1H, J = 3. 3Hz) ; 8. 10 (d, 1H, J = 8. 1Hz
)
ESI-Mass : 350[M + Na] +
[0038] 実施例 4 5'— O— (4. 4'—ジメトキシトリチル）—2'— O— (2 シァノエトキシメチ ル)ゥリジンの觀告
2， O （2 シァノエトキシメチル）ゥリジン 14g (43mmol)をピリジンで共沸し真 空ポンプで 30分乾燥した。テトラヒドロフラン 300mLに溶解し、アルゴン雰囲気下ピ リジン 68g (856mmol)、モレキュラーシーブス 4A20gをカ卩ぇ 10分攪拌した。これに 4, 4'—ジメトキシトリチルクロライド 19. 6g (57. 8mmol)を 3回に分けて 1時間ごとに 加え、さらに 1時間攪拌した。メタノール 10mLを加え 2分攪拌した後、セライトろ過し 酢酸ェチルにて洗净した。ろ液を濃縮後、残渣を酢酸ェチルに溶解し、飽和炭酸水 素ナトリウム水溶液と分液した。有機相を飽和塩ィ匕ナトリウム水溶液にて洗浄、無水 硫酸マグネシウムにて乾燥後溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフ ィ一にて精製し、 目的化合物を得た（26. 5g ;収率 98%)。
[0039] 実施例 5 ァセチル - 5' -0- (4^ 4' -ジメ上キシ b]チル _) 2，— O 2 シ. ァノエトキシメチノレ）シチジン 3 '— O—（2—シァノエチノレ N. N—ジイソプロピノレホ スホロアミダイト）
工程 1 Νά—ァセチル— 5，— Ο—（4. 4，ージメトキシトリチル）ー 2' -0-し 2—シァ.
Figure imgf000038_0001
Ν4—ァセチルー 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）シチジン 588mg (lmmol) を 1, 2—ジクロロェタン 4mLに溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 452mg (3. 5mm ol)をカ卩え、ついで 365mg (l. 2mmol)の二塩化ジブチルスズを加えた後、室温で 一時間反応した。その後 80°Cにしクロロメチル 2—シァノエチルエーテル 155. 4m g (l. 3mmol)を滴下、そのまま 60分間攪拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリ ゥム水溶液に反応液をカ卩ぇ塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシウムにて 乾燥、溶媒留去し、得られた混合物を 30gのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて 精製し、 N4—ァセチル— 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）—2， -0- (2—シァ ノエトキシメチル）シチジンを得た（219mg；収率 35%)。 — NMR (CDC1 )： 2. 19 (s, 3H) ; 2. 56 (d, 1H, J = 8. 8Hz) ; 2. 65 (t, 2H,
3
J = 6. 2Hz) ; 3. 55 (dd, 1H, 10. 5, 2. 5Hz) ; 3. 63 (dd, 1H, 10. 5, 2. 5Hz)； 3. 82 (s, 6H) ; 3. 86 (t, 2H, J = 6. 2Hz) ;4. 09—4. 14 (m, 1H) ;4. 28 (d, 1H , J = 5. 1Hz) ;4. 44—4. 49 (m, 1H) ;4. 97, 5. 24 (2d, 2H, J = 6. 9Hz) ; 5. 9 6 (s, 1H) ; 6. 86 -6. 88 (m, 4H) ; 7. 09 (d, 1H, J = 6. 9Hz) ; 7. 26— 7. 42 (m , 9H) ; 8. 48 (d, 1H, J = 6. 9Hz) ; 8. 59 (br. s, 1H)
ESI-Mass : 693 [M + Na] + 工程 2 ァセチル— 5'— O— (4. 4'—ジメトキシトリチル）—2' -0- (2—シァ ノエトキシメチル）シチジン 3'—O— (2—シァノエチル N. N—ジイソプロピルホス ホロアミダイト）の製造
工程 1で得られた N4—ァセチルー 5， -0- (4, 4，ージメトキシトリチル）ー2， -0 一（2—シァノエトキシメチル） シチジン 205mg (0. 306mmol)を塩化メチレン 2mL に溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 105mg (0. 812mmol)をカ卩ぇ 2 シァノエチ ル N, N ジイソプロピルクロ口ホスホロアミダイト 116mg (0. 49mmol)を滴下し、室 温で 1時間反応させた。反応後、溶媒を留去し得られた混合物を 20gのシリカゲル力 ラムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た（242mg ;収率 91%)。
ESI-Mass : 871 [M + H] + 実施例 6 NA—ァセチノレー 2' -0- (2 シァノエトキシメチノレ）シチジン
工程 1 NA ァセチルー 3，. 5'—O—(テトライソプロピルジシロキサン 1. 3 ジィ ル） 2'— O—（2—シァノエトキシメチル）シチジンの製诰
N4 ァセチノレ 3，， 5，一 O （テトライソプロピルジシロキサン 1 , 3 ジィル）シ チジン 1. OOg (l. 89mmol)とメチルチオメチル 2 シァノエチルエーテル 500mg (3. 79mmol)を混合し、トルエン 10mLとテトラヒドロフラン 10mLの混合溶媒に溶解 した。ついでトリフルォロメタンスルホン酸銀 975mg (3. 79mmol)を加え、モレキユラ ーシーブス 4Aを加え、乾燥した。氷冷下、 N—ブロモスクシンイミド 370mg (2. 08m mol)を加え、反応容器を遮光し、 10分間撹拌した。さらに N—プロモスクシンイミド 7 Omg (0. 39mmol)を追カ卩し、 25分間撹拌した。反応終了後、塩化メチレンをカ卩えて 希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムにて乾 燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、 N 4—ァセチルー 3，， 5，一 O— (テトライソプロピルジシロキサン一 1, 3 ジィル）一2， -0- (2 シァノエトキシメチル）シチジンを得た。（936mg ;収率 81%)。 — NMR (CDC1 )： 0. 90- 1. 11 (m, 28H) ; 2. 28 (s, 3H) ; 2. 62— 2. 79 (
3
m, 2H) ; 3. 78- 3. 89 (m, 1H) ; 3. 96—4. 04 (m, 2H) ;4. 19—4. 23 (m, 3H ) ;4. 30 (d, 1H, J= 13. 6Hz) ; 5. 00 (d, 1H, J = 6. 8Hz) ; 5. 09 (d, 1H, J=6. 8Hz) ; 5. 77 (s, 1H) ; 7. 44 (d, 1H, J = 7. 5Hz) ; 8. 30 (d, 1H, J = 7. 5Hz) ; 10 . 13 (s, 1H) ESI-Mass : 611 [M + H] 工程 2 N ァセチルー 2，—O—（2—シァノエトキシメチノレ)シチジンの製造
工程 1で得られた N4—ァセチノレー 3' , 5' O （テトライソプロピノレジシロキサン 1, 3 ジィル）— 2，— O— (2 シァノエトキシメチル）シチジン 500mg (0. 819mm ol)をテトラヒドロフラン 2. 5mLとメタノール 2. 5mLの混合溶媒に溶解し、フッ化アン モ -ゥム 150mg (4. lOmmol)をカ卩え、 50°Cで 4時間反応させた。反応終了後、ァ セトニトリルにて希釈、濾過し、溶媒を留去し得られた混合物をシリカゲルカラムクロ マトグラフィ一にて精製し、 目的化合物を得た（210mg ;収率 70%)。 — NMR (D O)： 2. 13 (s, 3H) ; 2. 66— 2. 71 (m, 2H) ; 3. 72— 3. 78 (m, 3
2
H) ; 3. 90 (dd, 1H, 13. 0, 2. 6Hz) ;4. 06—4. 11 (m, 1H) ;4. 20 (dd, 1H, J = 7. 1, 5. 2Hz) ;4. 29 (dd, 1H, J = 5. 1, 2. 9Hz) ;4. 83 (d, 1H, J = 7. 2Hz) ;4. 94 (d, 1H, J = 7. 2Hz) ; 5. 95 (d, 1H, J = 2. 9Hz) ; 7. 25 (d, 1H, J = 7. 6 Hz) ; 8. 25 (d, 1H, J = 7. 6Hz)
ESI— Mass : 391 [M + Na] + 実施例 7 N^—ァセチル— 5'— O— (4. 4'—ジメトキシトリチル）—2'— O— (2 シ
Figure imgf000040_0001
2，—O— (2 シァノエトキシメチル）シチジン 9. 9g (26. 8mmol)をピリジンで共沸 し真空ポンプで 30分乾燥した。テトラヒドロフラン 190mLに溶解し、アルゴン雰囲気 下ピリジン 43g (538mmol)、モレキュラーシーブス 4A20gをカロえ 10分攪拌した。こ れに 4, 4，一ジメトキシトリチルクロライド 11. 8g (34. 9mmol)を 3回に分けて 1時間 ごとに加え、さらに 1時間攪拌した。メタノール 2mLを加え 2分攪拌した後、セライトろ 過し酢酸ェチルにて洗浄した。ろ液をエバポレーターで濃縮後残渣を酢酸ェチルに 溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と分液した。有機相を飽和塩ィ匕ナトリウム水 溶液にて洗浄、無水硫酸マグネシウムにて乾燥後溶媒留去した。得られた残渣をシ リカゲルクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た（15g ;収率 83%)。 実施例 8 N2—ァセチル— 5， -0- (4. 4，—ジメトキシトリチル）—2，— O— (2—シ ァノエトキシメチル）グアノシン 3，一O— (2—シァノエチル N. N—ジイソプロピル ホスホロアミダイト）
工程 1 N2—ァセチルー 5， -0-{4._4'—ジメ I：キシ チル )_— 2， -0-し 2—シァ,
Figure imgf000041_0001
Ν2—ァセチル— 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）グアノシン 627mg (lmmol) を 1, 2—ジクロロェタン 4mLに溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 452mg (3. 5mm ol)をカ卩え、ついで 365mg (l. 2mmol)の二塩化ジブチルスズを加えた後、室温で 一時間反応した。その後 80°Cにしクロロメチル 2—シァノエチルエーテル 155. 4m g (l. 3mmol)を滴下、そのまま 60分間攪拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリ ゥム水溶液に反応液をカ卩ぇ塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシウムにて 乾燥、溶媒留去し、得られた混合物を 30gのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて 精製し、 N2—ァセチル— 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）—2， -0- (2—シァ ノエトキシメチル）グアノシンを得た (450mg；収率 63%)。 — NMR (CDC1 )： 1. 92 (s, 3H) ; 2. 47— 2. 51 (m, 2H) ; 2. 68 (br. s, 1H)
3
; 3. 30 (dd, 1H, 10. 7, 3. 8Hz) ; 3. 47 (dd, 1H, 10. 7, 3. 8Hz) ; 3. 55— 3. 6 0 (m, 1H) ; 3. 65- 3. 70 (m, 1H) ; 3. 74, 3. 75 (2s, 6H) ;4. 22—4. 23 (m, 1 H) ;4. 55-4. 58 (m, 1H) ;4. 78, 4. 83 (2d, 2H, J = 7. 0Hz) ; 5. 01 (t, 1H, J = 5. 1Hz) ; 5. 99 (d, 1H, J = 5. 1Hz) ; 6. 76— 6. 79 (m, 4H) ; 7. 17— 7. 44 ( m, 9H) ; 7. 88 (s, 1H) ; 8. 36 (br. s, 1H) ; 12. 06 (br. s, 1H) 工程 2 N2—ァセチル— 5'— O— (4. 4'—ジメトキシトリチル）—2' -0- (2—シァ ノエトキシメチル）グアノシン 3 '— O— (2—シァノエチル N. N—ジイソプロピルホ スホロアミダイト）の製造
工程 1で得られた N2—ァセチルー 5， -0- (4, 4，ージメトキシトリチル）ー2， -0 - (2 シァノエトキシメチル）グアノシン 400mg (0. 563mmol)を塩化メチレン 2mL に溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 181mg (l. 4mmol)をカ卩ぇ 2 シァノエチル N, N ジイソプロピルクロ口ホスホロアミダイト 161mg (0. 68mmol)を滴下し、室温 で 1時間反応させた。反応後、溶媒を留去し得られた混合物を 20gのシリカゲルカラ ムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た (471mg ;収率 92%)。 実施例 9 Ns—ァセチル— 5， -0- (4. 4，—ジメトキシトリチル）—2， O— (2 シ ァノエトキシメチノレ）アデノシン 3，一O— (2 シァノエチノレ N. N ジイソプロピノレ ホスホロアミダイト）
工程 1 Ns ァセチル 5， O _(4._4， ジメトキシトリチノレ） 2， O し 2 シァ.
Figure imgf000042_0001
N6 ァセチル— 5，— O— (4, 4，—ジメトキシトリチル）アデノシン 22. Og (36. Om mol)を 1, 2 ジクロロェタン 170mLに溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 16. 3g ( 126mmol)を加え、ついで 12. lg (39. 7mmol)の二塩化ジブチルスズをカ卩えた後 、室温で一時間反応した。その後 80°Cにし 15分間撹拌後、クロロメチル 2 シァノ ェチルエーテル 4. 30g (36. Ommol)を滴下、そのまま 30分間撹拌した。反応終了 後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に反応液を加え塩化メチレンにて抽出を行い無 水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロ マトグラフィ一にて精製し、 N6 ァセチル一 5， -0- (4, 4，一ジメトキシトリチル） - 2，—O—（2 シァノエトキシメチル）アデノシンを得た。（7. 47g ;収率 33%) — NMR (CDC1 )： 2. 51 (t, 2H, J = 6. 2Hz) ; 2. 58 (d, 1H, J = 5. 5Hz)； 2
3
. 61 (s, 3H) ; 3. 45 (dd, 1H, J= 10. 7, 4. OHz) ; 3. 54 (dd, 1H, J= 10. 7, 3. 2Hz) ; 3. 62- 3. 79 (m, 2H) ; 3. 79 (s, 6H) ;4. 25 (br. q, 1H, J〜4. 6Hz) ;4 . 59 (q, 1H, J = 5. 2Hz) ;4. 87—4. 94 (m, 3H) ; 6. 23 (d, 1H, J=4. 4Hz) ; 6 . 80-6. 83 (m, 4H) ; 7. 22— 7. 32 (m, 7H) ; 7. 40— 7. 43 (m, 2H) ; 8. 20 (s , 1H) ; 8. 61 (br. s, 1H) ; 8. 62 (s, 1H) ESI-Mass : 695 [M + H] + 工程 2 Na—ァセチル— 5' O— (4. 4'—ジメトキシトリチル）—2' -0- (2 シァ ノエトキシメチル）アデノシン 3，一 O (2 シァノエチル N. N ジイソプロピルホ スホロアミダイト）の製造
工程 1で得られた N6 ァセチルー 5， -0- (4, 4，ージメトキシトリチル）ー2， -0 — (2 シァノエトキシメチル）アデノシン 10. 0g (14. 4mmol)を塩化メチレン 75mL に溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 4. 7g (36mmol)をカ卩ぇ 2 シァノエチル N, N ジイソプロピルクロ口ホスホロアミダイト 4. 82g (20. 3mmol)を滴下し、室温で 1 時間反応させた。反応後、溶媒を 30mL程度残して留去し得られた反応混合物をシ リカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た（12. Og ;収率 93%
) o
ESI-Mass : 895 [M + H] + 実施例 10 Na ァセチルー 2' -0- (2 シァノエトキシメチル）アデノシン
工程 1 Na—ァセチル一 3' . 5'— O— (テトライソプロピルジシロキサン一 1. 3 ジィ ル） 2'— O—（2—シァノエトキシメチル）アデノシンの製诰
N—ョードスクシンイミド 245mg (l. 09mmol)とトリフルォロメタンスルホン酸銀 280 mg (l. 09mmol)を塩化メチレン 8mLに懸濁させ、モレキュラーシーブス 4Aをカロえ 、乾燥した。ここに、 N6 ァセチルー 3，， 5， -0- (テトライソプロピルジシロキサン一 1, 3 ジィル）アデノシン 400mg (0. 73mmol)とメチルチオメチル 2 シァノエチ ルエーテル 145mg (l. l lmmol)を塩化メチレン 4mLに溶解し、氷冷下で加えた。 そのまま 3時間撹拌した。反応終了後、塩化メチレンを加えて希釈し、チォ硫酸ナトリ ゥム水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行 、、無水硫酸マグネシウム にて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精 製し、 N6 ァセチルー 3，， 5，— O— (テトライソプロピルジシロキサン— 1, 3 ジィル ) - 2' -0- (2 シァノエトキシメチル）アデノシンを得た。（201mg ;収率 45%) H— NMR(CDCl): 0.98— 1.11 (m, 28H) ;2.62(s, 3H) ;2.69 (td, 2H,
3
6.5, J=l.5Hz) ;3.81-3.89 (m, IH) ;4.02—4.09 (m, 2H) ;4.17(d, 1
H, J = 9.4Hz) ;4.28 (d, IH, J=13.4Hz) ;4.50 (d, IH, J=4.5Hz) ;4.67( dd, IH, J = 8.8, 4.5Hz) ;5.02 (d, IH, J = 7. OHz) ;5.08 (d, IH, J = 7. OH z) ;6. 10(s, IH) ;8.34 (s, 1H);8.66 (s, 1H);8.67(s, IH)
ESI-Mass:636[M + H] + 工程 2 Ns ァセチルー 2'—O—（2—シァノエトキシメチル）アデノシンの製诰
工程 1で得られた N6 ァセチルー 3，， 5， -0- (テトライソプロピルジシロキサン
I, 3 ジィル）一 2，一 O— (2 シァノエトキシメチル）アデノシン 300mg(0.47mm ol)を、酢酸 0. lmLと 0.5Mテトラブチルアンモ-ゥムフルオリドのテトラヒドロフラン 溶液 2mLの混合溶液に溶解し、室温で 2時間撹拌した。反応終了後、得られた反応 混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た。 (160m g;収率 86%)。 — NMR(DMSO— d6)： 2.25 (s, 3H) ;2.53— 2.68 (m, 2H) ;3.41— 3. 46 (m, IH) ;3.56— 3.64 (m, 2H) ;3.69— 3.73 (m, IH) ;4.00—4.01 (m , IH) ;4.36-4.37 (m, IH) ;4.72—4.78 (m, 3H) ;5.20 (bt, 2H) ;5.41( d, IH, J = 5.2Hz) ;6.17(d, IH, J = 5.7Hz) ;8.66 (s, IH) ;8.72 (s, IH) ;1 0.72 (s, IH)
ESI— Mass:415[M + Na] + 実施例 11 Ns ァセチル一 5，一 O （ 4，一ジメ キシヒリチル）一 2，一 O—（2—
Figure imgf000044_0001
N6 ァセチルー 2， -0- (2 50g(24.2mm ol)を脱水ピリジン lOOmLに溶解し、濃縮して乾燥した後、アルゴン雰囲気下、脱水 ピリジン lOOmLに溶解した。氷冷下、 4, 4，—ジメトキシトリチルクロリド 10.7g(31. 2mmol)を加え、室温で 1時間 20分反応した。反応終了後、塩化メチレンにて希釈し 、水にて洗浄を行い無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシ リカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た。 (13.8g;収率 82 %) 実施例 12 N2—フエノキシァセチル一 5' -0- (4.4'—ジメトキシトリチル） 2' - O （2 シァノエトキシメチノレ）グアノシン 3，—O— (2 シァノエチノレ N. N ジィ ソプロピルホスホロアミダイト）
工程 1 N2—フエノキシァセチルー 5' -0- (4.4'ージメトキシトリチル） 2' -0- ( 2—シァノエトキシメチル)グァノシンの製诰
N2 フエノキシァセチルー 5' O (4, 4'—ジメトキシトリチル）グアノシン 720mg (lmmol)を 1, 2 ジクロロェタン 4mLに溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 452mg (3.5mmol)を加え、ついで 365mg(l.2mmol)の二塩化ジブチルスズをカ卩えた後 、室温で一時間反応した。その後 80°Cにしクロロメチル 2 シァノエチルエーテル 1 55.4mg(l.3mmol)を滴下、そのまま 60分間攪拌した。反応終了後、飽和炭酸水 素ナトリウム水溶液に反応液を加え塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシ ゥムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物を 30gのシリカゲルカラムクロマトグラフィ 一にて精製し、 N2—フエノキシァセチル— 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）—2 '-Ο- (2 シァノエトキシメチル）グアノシンを得た（384mg;収率 48%)。 — NMR(CDC1 )： 2.47-2.51 (m, 2H) ;2.58 (br. s, 1H) ;3.42 (dd, 1
3
H, 10.1, 3.8Hz) ;3.46 (dd, 1H, 10.1, 3.8Hz) ;3.53— 3.57 (m, 1H) ;3 .69-3.73 (m, 1H) ;3.77(s, 6H) ;4.24—4.26 (m, 1H) ;4.48—4.50 (m , 1H) ;4.61-4.65 (m, 2H) ;4.83, 4.87 (2d, 2H, J=7. OHz) ;4.88 (t, 1 H, J = 5.7Hz) ;6.05 (d, 1H, J = 5.7Hz) ;6.80— 6.82 (m, 4H) ;6.92— 6. 96 (m, 3H) ;7.07— 7.11 (m, 2H) ;7.20— 7.42 (m, 9H) ;7.84 (s, 1H) ;8. 99 (s, 1H) ; 11. 81 (br. s, 1H) ESI-Mass : 825 [M + Na] + 工程 2 N2—フエノキシァセチルー 5'—O— (4. 4'ージメトキシトリチル） 2' -0- (2—シァノエトキシメチル）グアノシン 3'— O— (2—シァノエチル N. N—ジィソプ 口ピルホスホロアミダイトの製造
工程 1で得られた N2—フエノキシァセチルー 5， -0- (4, 4，ージメトキシトリチル） — 2，一 O (2 シァノエトキシメチル）グアノシン 320mg (0. 399mmol)を塩化メチ レン 4mLに溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 128. 8mg (0. 996mmol)を加え 2 —シァノエチル N, N—ジイソプロピルクロ口ホスホロアミダイト 141. 5mg (0. 598m mol)を滴下し、室温で 1時間反応させた。反応後、溶媒を留去し得られた混合物を 3 Ogのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た（316mg ;収 率 79%)。
ESI-Mass : 1003 [M + H] + 実施例 13 N2—フエノキシァセチルー 2' -0- (2 シァノエトキシメチル）グアノシ 工程 1 N2—フエノキシァセチルー 3' . 5' -0- (テトライソプロピルジシロキサン 1 . 3 ジィル） 2'— O—（2 シァノエトキシメチル）グアノシンの製造
N2 フエノキシァセチルー 3' , 5，一 O— (テトライソプロピルジシロキサン一 1, 3- ジィル）グアノシン 2. 0g (3. Ommol)をテトラヒドロフラン 16mLに溶解し、メチルチオ メチル 2 シァノエチルエーテル 0. 99g (7. 6mmol)、モレキュラーシーブス 4A1 . Ogを加え、アルゴン雰囲気下一 45°Cで 10分攪拌した。トリフルォロメタンスルホン 酸 0. 68g (4. 5mmol)のテトラヒドロフラン 5mL溶液をカ卩ぇ攪拌した後、 N ョードス クシンイミド 1. 02g (4. 5mmol)を加え、 15分攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナト リウム水溶液を加え、ろ過後酢酸ェチルにて抽出、有機相を 1Mのチォ硫酸水素ナト リウム水溶液にて洗浄、水、次いで飽和塩ィ匕ナトリウム水溶液にて洗浄し、無水硫酸 マグネシウムにて乾燥、溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー にて精製し、 N2—フエノキシァセチルー 3，， 5， -0- (テトライソプロピルジシロキサ ン一 1 , 3 ジィル） 2，一 O— (2 シァノエトキシメチル）グアノシンを得た（2. Og； 収率 89%)。 — NMR(CDC1 )： 0.99-1.11 (m, 28H) ;2.59— 2.77 (m, 2H) ;3.82
3
—4.05 (m, 3H) ;4.15 (d, 1H, J = 9.3Hz) ;4.25—4.35 (m, 2H) ;4.52—4 .56 (dd, 1H, J = 9.3, 4.3Hz) ;5.00, 5.07 (2d, 2H, J=7.2Hz) ;5.95(s, 1H)6.99-7.12(m, 3H) ;7.35— 7.40 (m, 2H) ;8.09 (s, 1H) ;9.38 (br. s , 1H) ;11.85 (br. s, 1H)
ESI-Mass:766[M + Na] + 工程 2 N2—フエノキシァセチルー 2'—O—（2—シァノエトキシメチル）グアノシンの 製诰
1Mテトラプチルアンモ -ゥムフルオリド Zテトラヒドロフラン溶液 2.83mL(2.83m mol)に酢酸 0.14mL(0.14mmol)をカ卩えた溶液を調整する。工程 1で得られた N2 —フエノキシァセチルー 3', 5，一 O— (テトライソプロピルジシロキサン一 1, 3 ジィ ル）一 2，一 O— (2 シァノエトキシメチル）グアノシン 1.0g(l.35mmol)をテトラヒド 口フラン 2.83mLに溶解し、上で調整した溶液を加えアルゴン雰囲気下室温で 1時 間攪拌した。反応液を減圧下濃縮後、塩化メチレンに溶解しシリカゲルクロマトグラフ ィ一にのせ精製し、 目的化合物を得た。 (0.67g;収率 99%)。 — NMR(DMSO— d6)： 2.59— 2.66 (m, 2H) ;3.41— 3.63 (m, 4H) ;3. 98 (m, 1H) ;4.32 (m, 1H) ;4.58—4.62 (t, 1H, J = 5.3Hz) ;4.71—4.78 ( dd, 2H, J=13. 1, 6.8Hz) ;4.87(s, 2H) ;5.12(s, 1H)5.37 (s, 1H) ;5.97 (d, 1H, J = 6. lHz)6.96-6.99 (m, 3H) ;7.28— 7.34 (m, 2H) ;8.30 (s, 1 H) ; 11. 78 (br. s, 2H)
ESI-Mass : 500[M-H] "
[0048] 実施例 14 N2—フエノキシァセチル一 5'— O— (4. 4'—ジメトキシトリチル） 2' -
N2 フエノキシァセチルー 2， -0- (2 シァノエトキシメチル）グアノシン 660mg ( 1. 32mmol)をピリジンで共沸し真空ポンプで 30分乾燥した。テトラヒドロフラン 9mL に溶解し、アルゴン雰囲気下ピリジン 2. lg (26. 4mmol)、モレキュラーシーブス 4A 600mgを加え 10分攪拌した。これに 4, 4'—ジメトキシトリチルクロライド 540mg (l. 58mmol)を 3回に分けて 1時間ごとに加え、さらに 1時間攪拌した。メタノール 2mLを 加え 2分攪拌した後、セライトろ過し酢酸ェチルにて洗浄した。ろ液をエバポレーター で濃縮後残渣を酢酸ェチルに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と分液した。有 機相を飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄、無水硫酸マグネシウムにて乾燥後溶媒 留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得 た（800mg ;収率 75%)。
[0049] 実施例 15 Na—ァセチル一 3' . 5'— O— (テトライソプロピルジシロキサン一 1. 3— ジィル）— 2，— O— (2—シァノエトキシメチル）アデノシン
工程 1 Na ァセチルー 3，. 5'—O—(テトライソプロピルジシロキサン 1. 3 ジィ
N6 ァセチルー 3，， 5，— O— (テトライソプロピルジシロキサン— 1, 3 ジィル）ァ デノシン 2. 00g (3. 62mmol)をジメチルスルホキシド 25mLに溶解し、無水酢酸 17 . 5mL、酢酸 12. 5mLをカ卩ぇ室温で 14時間撹拌した。反応終了後、水 200mLに反 応液を加え、酢酸ェチルにて抽出を行い、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄 を行い、無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラ ムクロマトグラフィーにて精製し、 N6 ァセチルー 3，， 5， -0- (テトライソプロピルジ シロキサン— 1, 3 ジィル）—2，—Ο—メチルチオメチルアデノシンを得た。 （1. 36g ；収率 61%)
H— NMR(CDC1 )： 0.96— 1.11 (m, 28H) ;2.20 (s, 3H) ;2.61 (s, 3H)；
3
4.03 (dd, 1H, J=13.4, 2.4Hz) ;4.18 (d, 1H, J = 9.1Hz) ;4.27 (d, 1H, J = 13.4Hz) ;4.63-4.71 (m, 2H) ;5.00 (d, 1H, J=ll.5Hz) ;5.07 (d, 1H , J=ll.5Hz) ;6.09 (s, 1H) ;8.31 (s, 1H) ;8.65(s, 1H) ;8.69(s, 1H)
ESI-Mass:635[M + Na] + 工程 2 Ns—ァセチル一 3'.5 '—Ο— (テトライソプロピルジシロキサン一 1.3 ジィ ル） 2'— Ο—（2—シァノエトキシメチル）アデノシンの製诰
工程 1で得られた Ν6 ァセチルー 3，， 5， -0- (テトライソプロピルジシロキサン 1, 3 ジィル）—2，—Ο—メチルチオメチルアデノシン 1.00g(l.63mmol)を、テト ラヒドロフラン 25mLに溶解した。 3 ヒドロキシプロピオ-トリル 5.88g(82.7mmol) を加え、モレキュラーシーブス 4Aをカ卩えて乾燥し、— 45°Cに冷却した。 N ョードス クシンイミド 440mg(l.96mmol)を加え、ついでトリフルォロメタンスルホン酸 490m g(3.26mmol)を加えた後、 45°Cで 15分間撹拌した。反応終了後、冷却したまま トリェチルァミンをカ卩えて中和し、塩化メチレンにて希釈、チォ硫酸ナトリウム水溶液と 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒 留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合 物を得た。（722mg;収率 71%)。 実施例 16 ゥリジリル一「3'→5Ί—ゥリジリル一「3'→5Ί—ゥリジリル一「3'→5Ί ゥリジリル一「3 '→5 Ί ゥリジリル一「3 '→5 Ί ゥリジリル一「3 '→5 Ί ゥリジリ ルー「3'→5Ί—ゥリジリル一「3'→5Ί—ゥリジリル一「3'→5Ί—ゥリジリル一「3' →5Ί—ゥリジリル一「3，→5Ί—ゥリジリル一「3，→5Ί—ゥリジリル一「3，→5Ί—ゥ リジリル一「3，→5 Ί ゥリジリル一「3，→5 Ί ゥリジリル一「3，→5 Ί ゥリジリル一 丄 3，→5，〕—ゥ JJジリノレ—「3，→5，，_— ジリル— [_3，→5，ュ— ジリノレ— Γ3'→5' \ ーゥリジン
市販の 2，/3，—O—ベンゾィル—5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）ゥリジンを 担持した CPG固相担体（37mg, 1 μ mol)をグラスフィルター付きカラムに入れ、核 酸自動合成機 (Expedite™：アプライドバイォシステムズ社)を使用して、標記化合 物のオリゴ RNAの合成を行った。
核酸モノマー化合物として、 5，— O— (4, 4，ージメトキシトリチル）ー2，— O— (2— シァノエトキシメチル）ゥリジン 3，一 O— (2—シァノエチル N, N—ジイソプロピル ホスホロアミダイト）を、縮合触媒としてテトラゾールを、酸化剤としてヨウ素溶液を、キ ャッビング溶液として無水酢酸と N—メチルイミダゾール溶液を使用した。核酸モノマ 一化合物を 20回縮合させた後、切り出し剤として 10Mのメチルァミンのエタノール水 溶液を用いて、室温中 1〜2時間かけて CPG固相担体からの切り出し及び各リン酸 部位の保護基の脱離反応を行った。反応混合物を減圧下、濃縮後、逆相カラム (O DS)にて不要ピークを除去後、溶出溶媒 (ァセトニトリル— 50mM トリェチルァミン —酢酸緩衝液)を用いて精製した。残渣を減圧下濃縮後、 1Mのテトラプチルアンモ -ゥムフルオリドの THF溶液を用いて室温 1時間反応し、 2'位の水酸基の保護基を 脱離した。溶液を脱塩処理後、 80%酢酸にて 5 '末端の保護基を除去した (室温下 1 0分)。減圧下濃縮後、水層をエーテル洗浄し、精製をすることなぐ高純度の目的化 合物を得た。
MALDI—TOF—MS :計算値 6367. 52 [M+H] +
実測値 6366. 50 [M+H] + 高純度であることは、図 1の逆相 HPLC分析の結果から明らかである。測定条件は 下記のとおりである。 測定条件：
HPLC 装置
送液ユニット： LC— 6 A (島津製作所社製） 検出器: SPD— 6 A (島津製作所社製）
逆相 HPLCカラム
Mightysil RP— 18GPく 4. 6mm φ xl5cm> (関東化学社製）
カラム温度 ：35°C
移動相
グラジェント：リニアグラジェント 20分（B液： 0% - 70%)
A液： 5%ァセトニトリルを含む 50mMトリェチルァミン—酢酸緩衝液
B液： 90%ァセトニトリルを含む 50mMトリェチルァミン 酢酸緩衝液 移動相の流量 ：lmlZ分
紫外線可視分光器検出波長： 260nm 実施例 17 シチジリル一「3 '→5 Ί ゥリジリル一「3 '→5 Ί ゥリジリル一「3 '→5 Ί 一アデ二リル一「3'→5Ί—シチジリル一「3'→5Ί—グァニリル一「3'→5Ί—シチ ジリル一「3，→5 Ί ゥリジリル一「3，→5 Ί グァニリル一「3，→5 Ί アデ二リル 「3，→5 Ί グァニリル一「3，→5 Ί ゥリジリル一「3，→5 Ί アデ二リル一「3，→5 ' 1 シチジリル一「3 '→5 Ί ゥリジリル一「3 '→5 Ί ゥリジリル一「3 '→5 Ί—シチ ジリノレー「3 '→5 Ί グァニリノレー「3 '→5 Ί アデ二リノレー「3 '→5 Ί ゥリジン 市販の 2，/3，—Ο ベンゾィル—5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）ゥリジンを 担持した CPG固相担体（37mg, 1 μ mol)をグラスフィルター付きカラムに入れ、核 酸自動合成機 (Expedite™：アプライドバイォシステムズ社)を使用して、標記化合 物のオリゴ RNAの合成を行った。
核酸モノマー化合物として、 5，— O— (4, 4，ージメトキシトリチル）ー2，— O— (2— シァノエトキシメチル）ゥリジン 3，一 O— (2 シァノエチル N, N ジイソプロピル ホスホロアミダイト）、 N4—ァセチル— 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）—2，— O 一（2 シァノエトキシメチル）シチジン 3，—O—（2 シァノエチノレ N, N ジイソ プロピルホスホロアミダイト）、 N6 ァセチル— 5，— O— (4, 4，—ジメトキシトリチル） — 2，一 O— (2 シァノエトキシメチル）アデノシン 3，一 O— (2 シァノエチル N, N ジイソプロピルホスホロアミダイト）、 N2—フエノキシァセチルー 5， -0- (4, 4， —ジメトキシトリチル） 2，一 O— (2 シァノエトキシメチル）グアノシン 3，一 O— (2 —シァノエチル N, N—ジイソプロピルホスホロアミダイト）を、縮合触媒として 5—ェ チルチオテトラゾールを、酸化剤としてヨウ素溶液を、キヤッビング溶液としてフエノキ シ酢酸無水物と N—メチルイミダゾール溶液を使用した。核酸モノマー化合物を 19 回縮合させた後、固相上で、 5'末端の水酸基の保護基の除去を行った後、切り出し 剤として、濃アンモニア水—エタノール混合液（3 : 1)を用いて、 40°C、 4時間かけて CPG固相担体からの切り出し及び各リン酸部位の保護基の脱離反応及び塩基の保 護基の除去を行った。反応混合物を減圧下、濃縮後、 10%の n—プロピルァミン、 0 . 6%の 2 メルカプトェチルエーテルを含む 1Mのテトラブチルアンモ -ゥムフルオリ ドの THF溶液を用いて室温 1時間反応し、 2'位の水酸基の保護基を脱離した。溶液 を脱塩処理後、 DEAE—イオン交換榭脂（TOYOPEARL DEAE— 650)にて精 製し、高純度の目的化合物を得た（1120D ；収率 58%)。
260
ここで、 目的化合物の収量として、波長 260nmの紫外線の吸光度 (OD )を用い
260 た。以下、同様に吸光度 (OD )を目的化合物の収量とした。
260
MALDI—TOF— MS :計算値 6305. 9 [Μ + ΗΓ
実測値 6304. 8 [Μ+Η] + 実施例 18 アデ二リル一「3，→5Ί—シチジリル一「3，→5Ί—アデ二リル一「3，→5 ーゥリジリル一「3，→5Ί—シチジリル一「3，→5Ί—アデ二リル一「3，→5Ί—シ チジリル一「3，→5Ί—ゥリジリル一「3，→5Ί—ゥリジリル一「3，→5Ί—アデ二リル 一「3'→5Ί—シチジリル一「3'→5Ί—グァニリル一「3'→5Ί—シチジリル一「3' →5Ί—ゥリジリル一「3，→5Ί—グァニリル一「3，→5Ί—アデ二リル一「3，→5Ί— グァニリル一「3，→5Ί—ゥリジリル一「3，→5Ί—アデ二リル一「3，→5Ί—シチジリ ルー「3'→5Ί—ゥリジリル一「3'→5Ί—ゥリジリル一「3'→5Ί—シチジリル一「3' →5Ί—グァニリル一「3，→5Ί—アデ二リル一「3，→5Ί—アデ二リル一「3，→5Ί アデ二リル一「3，→5Ί—ゥリジリル一「3，→5Ί—グァニリル一「3，→5Ί—ゥリジ ン 実施例 17と同様にして目的化合物を得た（920D ；収率 31 %)。
260
MALDI—TOF— MS :計算値 9519. 8 [M + H] +
実測値 9520. 4 [M+H] +
[0053] 実施例 19 ゥリジリル一 「3'→5Ί—ゥリジリル一 「3'→5Ί—ゥリジリル一 「3'→5Ί 一ゥリジリル一 「3 '→5 Ί ゥリジリル一 「3 '→5 Ί ゥリジリル一 「3 '→5 Ί ゥリジリ ルー「3'→5Ί—ゥリジリル一「3'→5Ί—ゥリジリル一「3'→5Ί—ゥリジリル一「3' →5Ί—ゥリジリル一 「3，→5Ί—ゥリジリル一 「3，→5Ί—ゥリジリル一 「3，→5Ί—ゥ リジリル一 「3，→5 Ί ゥリジリル一 「3，→5 Ί ゥリジリル一 「3，→5 Ί ゥリジリル 「3，→5Ί—ゥリジリル一 「3，→5Ί—ゥリジリル一 「3，→5Ί—ゥリジリル一 「3，→5Ί 一ゥリジリル一 「3 '→5 Ί ゥリジリル一 「3 '→5 Ί ゥリジリル一 「3 '→5 Ί ゥリジリ ルー「3 '→5 Ί ゥリジリル一 「3 '→5 Ί ゥリジリル一 「3 '→5 Ί ゥリジリル一 「 3 ' →5Ί—ゥリジリル一 「3，→5Ί—ゥリジリル一 「3，→5Ί—ゥリジリル一 「3，→5Ί—ゥ リジリル一 「3，→5 Ί ゥリジリル一 「3，→5 Ί ゥリジリル一 「3，→5 Ί ゥリジリル一 「3，→5Ί—ゥリジリル一 「3，→5Ί—ゥリジリル一 「3，→5Ί—ゥリジリル一 「3，→5Ί ゥリジリル一 「3 '→5 Ί ゥリジリル一 「3 '→5 Ί ゥリジン 実施例 17と同様にして目的化合物を得た（2540D ；収率 65%)。
260
MALDI—TOF— MS :計算値 12185. 8 [M + H] +
実測値 12183. 3 [M+H] +
[0054] 実施例 20 アデ二リル一 「3，→5Ί—アデ二リル一 「3，→5Ί—ゥリジリル一 「3，→5，
1 シチジリル一 「3，→5Ί アデ二リル一 「3，→5Ί—シチジリル一 「3，→5Ί—ァ デニリル一「3，→5Ί—グァニリル一「3，→5Ί—アデ二リル一「3，→5Ί—アデニリ ル一し 3，→5，1—^ジ] Jル 丄3，→5'〕一シチジリノレ一 「3，→5 _ーグァ-リノレ一 「3， →5Ί—ゥリジリル一「3，→5Ί—シチジリル一「3，→5Ί—グァニリル一「3，→5Ί— ゥリジリル一「3，→5Ί—アデ二リル一「3，→5Ί—ゥリジリル一「3，→5Ί—グァニリ ルー「3，→5Ί—シチジリル一「3，→5Ί—アデ二リル一「3，→5Ί—グァニリル一「3 '→5Ί—ゥリジリル一「3，→5Ί—グァニリル一「3，→5Ί—アデ二リル一「3，→5Ί アデ二リル一「3，→5 ーアデ二リル一「3，→5 ーアデ二リル一「3，→5Ί—シチ ジリルー「3'→5Ί—ゥリジリル一「3'→5Ί—シチジリル一「3'→5Ί—ゥリジリル一「 3 '→5 Ί シチジリル一「3 '→5 Ί ゥリジリル一「3 '→5 Ί ゥリジリル一「3 '→5 Ί シチジリル一「3，→5Ί—アデ二リル一「3，→5Ί—アデ二リル一「3，→5Ί—チミ ジン 実施例 17と同様にして目的化合物を得た（750D ；収率 19%)。
260
MALDI—TOF—MS :計算値 12731. 8 [Μ+ΗΓ
実測値 12731. 7 [Μ+Η] + 実施例 21 ゥリジリル一「3，→5，1一グァニリル一「3，→5，1一アデ二リル一「3，→5， 1 アデ二リル一「3，→5，1 ゥリジリル一「3，→5，1 アデ二リル一「3，→5，1ーシチ ジリルー「3，→5，1 アデ二リル一「3，→5，1 アデ二リル一「3，→5，1 アデ二リル 一「3，→5 Ί ゥリジリル一「3，→5 Ί シチジリル一「3，→5 Ί アデ二リル一「 3 ' →5Ί—シチジリル一「3，→5Ί—アデ二リル一「3，→5Ί—グァニリル一「3，→5Ί アデ二リル一「3，→5Ί—アデ二リル一「3，→5Ί—ゥリジリル一「3，→5Ί—シチ ジリルー「3'→5Ί—グァニリル一「3'→5Ί—ゥリジリル一「3'→5Ί—シチジリル 「3，→5Ί—グァニリル一「3，→5Ί—ゥリジリル一「3，→5Ί—アデ二リル一「3，→5 ーゥリジリル一「3'→5Ί—グァニリル一「3'→5Ί—シチジリル一「3'→5Ί—ァ デニリル一「3，→5Ί—グァニリル一「3，→5Ί—ゥリジリル一「3，→5Ί—グァニリル 一「3，→5Ί—アデ二リル一「3，→5Ί—アデ二リル一「3，→5Ί—アデ二リル一「3' →5Ί—アデ二リル一「3，→5Ί—シチジリル一「3，→5Ί—ゥリジリル一「3，→5Ί シチジ ルー [3'→5'Jーゥ _リジリノレー「3，→5Ί_—シチジ '2ルーし 3，→5，1ー ジ リル一「3，→5Ί—ゥリジリル一「3，→5Ί—シチジリル一「3，→5Ί—アデ二リル一「 3，→5Ί—アデ二リル一「3，→5Ί—ゥリジリル一「3，→5Ί—ゥリジリル一「3，→5Ί シチジリル一「3 '→5 Ί ゥリジリル一「3 '→5 Ί ゥリジリル一「3 '→5 Ί ゥリジリ ルー「3，→5Ί—アデ二リル一「3，→5Ί—チミジン 実施例 17と同様にして目的化合物を得た (830D ；収率 15%)。
260
MALDI—TOF—MS :計算値 17476. 6 [Μ+ΗΓ
実測値 17474. 6 [Μ+Η] + 産業上の利用可能性
本発明ホスホロアミダイトイ匕合物は、 2'位の水酸基に導入されたエーテル型保護基 が直線状の置換基であり、 3'位の水酸基に結合するリン原子の周りにおける立体が 混み合って 、な 、ため、従来から使用されて 、るホスホロアミダイトイ匕合物と比較して 、オリゴ RNAを合成する際、非常に短時間に縮合反応が進行し、縮合収率がよい。 したがって、本発明ホスホロアミダイトイ匕合物を使用することにより、オリゴ DNAの製 造とほぼ同様の手法を用いて、高純度のオリゴ RNAの製造が可能となった。

Claims

請求の範囲
[1] 次の一般式（1)で表されるホスホロアミダイトイ匕合物。
[化 30]
R1
Bx
( 1 )
[式中、 Bは、保護基を有していてもよい核酸塩基を表す。 R1は、次の一般式 (2)で
X
表される置換基を表す。
[化 31]
Figure imgf000056_0001
( 2 )
.12 、13>
[式中、尺11、 R , ま、同一又は異なって、水素又はアルコキシを表す。」 R2a、 R2bは、同一又は異なって、アルキルを表す力、又は、 R2a、 R2bが隣接する窒素 原子と一緒になつて形成する、 5〜6員の飽和アミノ環基を表す。力かる飽和アミノ環 基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子又は硫黄原子を 1個有していても よい。
Figure imgf000056_0002
WG2は、同一又は異なって、電子吸引性基を表す。 ]
WG1がシァノである、請求項 1に記載のホスホロアミダイト化合物。
請求項 1又は 2記載のホスホロアミダイト化合物を用いることを特徴とする、次の一般 式（3)で表されるオリゴ RNAの製法。
[化 32]
Figure imgf000056_0003
[式中、各 Bは、それぞれ独立して、アデニン、グァニン、シトシン、ゥラシル、チミン又 はそれらの修飾体を表す。各 Rは、それぞれ独立して、 H又は水酸基を表すが、少な くとも 1つは水酸基を表す。 Zは、 H又はリン酸基を表す。 nは、 1〜： LOOの範囲内にあ る整数を表す。 ]
下記工程 A〜Gを含む、請求項 3記載のオリゴ RNA (3)の製法。
工程 A:
次の一般式 (4)で表される化合物に酸を作用させることによって、 5'位の水酸基の 保護基を脱離して、次の一般式 (5)で表される化合物を製造する工程、
[化 33]
Figure imgf000057_0001
( 4 ) ( 5 )
[式中、 nは前記と同義である。各 Bxは、それぞれ独立して、保護基を有していてもよ い核酸塩基を表す。 R1は、次の一般式 (2)で表される置換基を表す。
[化 34]
Figure imgf000057_0002
[式中、尺11、 R"、 Rldは、同一又は異なって、水素又はアルコキシを表す。 ] 各 WG2は、電子吸引性基を表す。各 R4は、それぞれ独立して、 H、ァシルォキシ又 は次の一般式 (6)で表される置換基を表す。
[化 35]
( 6 ) [式中、 WG1は、電子吸引性基を表す。 ]
Eは、ァシル又は次の一般式（7)で表される置換基を表す。
[化 36]
— Hリンカート 相担体 i (7)
[式中、 Qは、単結合又は次の一般式 (8)で表される置換基を表す。
[化 37]
Figure imgf000058_0001
(8)
[式中 WG2は、前記と同義である。 ]]
Τは、 Η、ァシルォキシ、上記一般式 (6)又で表される置換基を表す。
但し、 Ε又は Τのどちらか一方は、置換基（7)である。 ]
工程 Β:
工程 Αにおいて製造される化合物（5)に、活性化剤を用いて核酸モノマー化合物を 縮合させ、次の一般式 (9)で表される化合物を製造する工程、
[化 38]
Figure imgf000058_0002
(5) (9)
[式中、 R4、 T、 WG2は、前記と同義である。 ]
Figure imgf000058_0003
工程 c:
工程 Bにおいて未反応である化合物（5)の 5'位の水酸基をキヤッビングする工程、 [化 39]
Figure imgf000059_0001
[式中、 B、 E、 n、 R T、 WG ま、前記と同義である。 Rは、メチル、フエノキシメチ
X
ルを表す。 ]
工程 D:
工程 Bにおいて製造される化合物（9)に酸化剤を作用させることによって亜リン酸基 をリン酸基に変換する工程、
[化 40]
Figure imgf000059_0002
(9) (1 1)
[式中、 R4、 T、 WG2は、前記と同義である。 ]
Figure imgf000059_0003
工程 E:
工程 Dにお 、て製造される化合物（11)を固相担体力 切り出し、各核酸塩基部及 び各 2'位の水酸基の保護基を脱離する工程、
[化 41]
Figure imgf000060_0001
[式中、 B、 B、 E、 n、 R、 R\ R、 T、 WG、 Zは、前記と同義である。 ]
x
工程 F :
工程 Eにお ヽて製造される化合物（ 12)の 5 '位の水酸基を脱離する工程、
[化 42]
Figure imgf000060_0002
[式中、 B、 n、 R、
Figure imgf000060_0003
Zは、前記と同義である。 ]
工程 G :
工程 Fにお ヽて製造されるオリゴ RNA (3)を分離精製する工程。
[5] 工程 A〜Dを繰り返すことにより所望の鎖長のオリゴ RNA (3)を製造する、請求項 4 に記載のオリゴ RNAの製法。
[6] 工程 Eにおいて、アルキルァミン、アミジン、チオール、チオール誘導体又はこれらの 混合物を添加することを特徴とする、請求項 4〜5の 、ずれか〖こ記載のオリゴ RN Aの 製法。
[7] 次の一般式（ 13)で表されるエーテルィ匕合物。
[化 43]
( 1 3) [式中、 Lは、ハロゲン、ァリールチオ基、アルキルスルホキシド基又はアルキルチオ 基を示し、 WG1は、電子吸引性基を表す。 ]
WG1がシァノである、請求項 7に記載のエーテルィ匕合物。
下記工程 a〜hを含む、次の一般式（1)で表されるホスホロアミダイトイ匕合物の製法。
[化 44]
Figure imgf000061_0001
( 1 )
[式中、 Bは、保護基を有していてもよい核酸塩基を表す。 R1は、次の一般式 (2)で
X
表される置換基を表す。
[化 45]
Figure imgf000061_0002
[式中、尺11、 R"、 Rldは、同一又は異なって、水素又はアルコキシを表す。 ] R2a、 R2bは、同一又は異なって、アルキルを表す力、又は、 R2a、 R2bが隣接する窒素 原子と一緒になつて形成する、 5〜6員の飽和アミノ環基を表す。力かる飽和アミノ環 基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子又は硫黄原子を 1個有していても よい。
Figure imgf000061_0003
WG2は、同一又は異なって、電子吸引性基を表す。 ]
工程 a :
次の一般式（14)で表されるヌクレオシド誘導体にアルキルィ匕試薬を作用させること によって、中性条件下において脱離するエーテル型保護基を 2'位の水酸基に導入 する、次の一般式（15)、（15' )で表されるヌクレオシド誘導体を製造する工程、 [化 46] R，0
Figure imgf000062_0001
(14) (15) (15' )
[式中、 WG1は、前記と同義
Figure imgf000062_0002
である。 ]
1Mb:
工程 aにお 、て製造されるヌクレオシド誘導体（15)を単離精製する工程、 工程 c:
工程 bとは別に、次の一般式（16)で表されるリボ核酸ィ匕合物にアルキルィ匕試薬を作 用させることによって、中性条件下にお 、て脱離するエーテル型保護基を 2 '位の水 酸基に導入した、次の一般式（17)で表されるリボ核酸ィ匕合物を製造する工程、 [化 47]
Figure imgf000062_0003
(16) (17)
[式中、 B、 は、前記と同義である。 Aは、次の一般式（18a)又は（18b)で表さ
X
れるケィ素置換基を表す。
[化 48]
R6 R6 R«
-S卜 0— Sト — SI—
R6 R6 RE
(18 a) (18 b)
[式中、 R6は、アルキルを表わす。 ]]
工程 d:
工程 a〜cとは別に、リボ核酸化合物（16)にジメチルスルホキシドと酢酸と無水酢酸と を作用させることによって、次の一般式（19)で表されるリボ核酸ィ匕合物を製造するェ 程、 [化 49]
Figure imgf000063_0001
[式中、 A、 Bは、前記と同義である。 ]
X
工程 e :
工程 dにお 、て製造されるヌクレオシド誘導体（19)に次の一般式（20)で表されるァ ルコールィ匕合物と酸と硫黄原子に対するハロゲン化剤とを作用させることによって、 中性条件下において脱離するエーテル型保護基を 2'位の水酸基に導入した、次の 一般式（17)で表されるリボ核酸化合物を製造する工程、
[化 50]
Figure imgf000063_0002
[式中、 A、 B、 WG1は、前記と同義である。 ]
X
工程 f :
工程 c又は eにお 、て製造されるリボ核酸ィ匕合物（ 17)の 3 '位と 5 '位の水酸基の保護 基を脱離する反応を行うことによって、次の一般式 (21)で表されるリボ核酸ィ匕合物を 製造する工程、
[化 51]
Figure imgf000063_0003
[式中、 A、 B、 WG1は、前記と同義である。 ]
X
工程 g :
工程 fにおいて製造されるリボ核酸ィ匕合物（21)の 5'位の水酸基に酸性条件下にお ヽて脱離する保護基 (R1)を導入する、リボ核酸化合物（15)を製造する工程、
[化 52]
[式中 。 ]
Figure imgf000064_0001
工程 h:
工程 b又は gにお 、て製造されるヌクレオシド誘導体（ 15)にホスホロアミダイト化試薬 と、必要に応じて活性化剤とを作用させることによって、 3'位の水酸基がホスホロアミ ダイト化された、次の一般式（1)で表されるホスホロアミダイトイ匕合物を製造する工程
[化 53]
[式 又は異なって、アルキ
Figure imgf000064_0002
ルを表すか、又は、 R2\ R2bが隣接する窒素原子と一緒になつて形成する、 5〜6員 の飽和アミノ環基を表す。力かる飽和アミノ環基は、窒素原子の他に環構成原子とし て酸素原子又は硫黄原子を 1個有していてもよい。 WG2は、電子吸引性基を表す。 ] [10] アルキル化試薬が、次の一般式（13)で表されるエーテルィ匕合物である、請求項 9に 記載のホスホロアミダイトイ匕合物の製法。
[化 54] しへ〜 WG1
( 1 3 )
[式中、 Lは、ハロゲン、ァリールチオ基、アルキルスルホキシド基又はアルキルチオ 基を示し、 WG1は、電子吸引性基を表す。 ]
[11] WG1がシァノである、請求項 9又は 10のいずれかに記載のホスホロアミダイトイ匕合物 の製法。
[12] ホスホロアミダイト化試薬が、次の一般式（22)又は（23)で表される化合物である、請 求項 9〜： L 1のいずれかに記載のホスホロアミダイトイ匕合物の製法。
[化 55]
Figure imgf000065_0001
[式中、 R2a、 R2bは、同一又は異なって、アルキルを表す力、又は、 R2a、 R2bが隣接す る窒素原子と一緒になつて形成する、 5〜6員の飽和アミノ環基を表す。かかる飽和 アミノ環基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子又は硫黄原子を 1個有し ていてもよい。 WG2は、電子吸引性基を表す。 X1は、ハロゲンを表す。 ]
活性化剤が、 1H—テトラゾール、 5—ェチルチオテトラゾール、 5—ベンジルメルカプ トー 1H—テトラゾール、 4, 5—ジクロロイミダゾール、 4, 5—ジシァノイミダゾール、ベ ンゾトリアゾールトリフラート、イミダゾールトリフラート、ピリジ-ゥムトリフラート、 N, N ージイソプロピルェチルァミン又は 2, 4, 6—コリジン ZN—メチルイミダゾールである 、請求項 9〜 12の 、ずれかに記載のホスホロアミダイトイ匕合物の製法。
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