WO2005087758A1

WO2005087758A1 - プロアントシアニジン水可溶性結合体およびそれを含有する組成物

Info

Publication number: WO2005087758A1
Application number: PCT/JP2004/019793
Authority: WO
Inventors: Kinya Takagaki; Sadao Mori
Original assignee: Toyo Shinyaku Co., Ltd.
Priority date: 2004-03-15
Filing date: 2004-12-24
Publication date: 2005-09-22
Also published as: JP4648309B2; KR20060130739A; JPWO2005087758A1; US20070184126A1; CA2558975A1

Abstract

本発明は、プロアントシアニジンと、アミノ酸を３個以上含むペプチドとからなる水可溶性結合体を提供する。好ましくは上記ペプチドの平均分子量が７，０００以下である。本発明の水可溶性結合体は、保護安定性が高く、かつ生理活性が保持または高められたプロアントシアニジン、すなわち長期保存においても沈澱を生じず、かつ該生理活性を維持したまま生体内に輸送し得る。

Description

明細書プロアントシァニジン水可溶性結合体およびそれを含有する組成物技術分野

本発明は、プロアントシァニジンを安定化する水可溶性結合体およびそれを含有する組成物に関する。背景技術

プロアントシァニジンは、フラバン一 3—オールおよび/またはフラバン一 3， 4ジオールを構成単位とする重合度が 2以上の縮重合体からなる縮合型タンニンであり、古くから肌の収斂性を高めるなどの整肌効果を目的として使用されている。近年、プロアントシァニジンは、抗酸化作用や美白効果などの種々の活性を有することから、食品、化粧品などへの応用が図られている（特開昭 6 1— 1 6 9 8 2号公報おょぴ特開平 2— 1 3 4 3 0 9号公報）。例えば、タンパク質を配合した化粧料にも応用されている（特開平 1 1 - 7 5 7 0 8号公報、特開平 6 _ 3 3 6 4 2 3号公報および特開 2 0 0 2 - 2 3 8 4 9 7号公報）。

し力、し、プロアントシァニジンは、高い抗酸化力を有するがゆえに酸化されやすく、自己酸ィヒ重合を引き起こす。そのため、着色し易いなどの問題が生じる。さらに、自己酸化重合により、プロアントシァニジンの重合度が高くなるため、水への溶解性が低下し、沈澱が生じ易くなる。このような、重合度が高いプロアントシァニジンは、体内への吸収効率が低下するという問題あ生じる。

特開 2 0 0 1—2 7 0 8 8 1号公報には、プロアントシァニジンに、ヒド口キシル基を有するアミノ酸または該ァミノ酸を含有するジぺプチドを添加することによって、溶液中のプロアントシァニジンの酸化重合による変色を防止することが記載されている。しかし、これらの組み合わせでは、液体状態で長期間保存すると、沈澱を生じる。

さらに、プロアントシァニジンは、体内での消化過程などによる分解によつても、活性を維持した状態を保持できなくなり、吸収効率が悪くなるという問題がある。発明の開示

本発明は、保護安定性が高く、力生理活性が保持または高められたプロアントシァニジン、すなわち長期保存においても沈澱を生じず、かつ該生理活性を維持したまま生体内に輸送し得るプロアントシァニジンを提供することを目的とする。

本発明者等は、上記課題について鋭意検討した結果、驚くべきことに、特定のペプチドをプロアントシァニジンに結合させることによって、長期保存においても沈澱を生じず、生理活性に優れ、かつ該生理活性を維持したまま生体内に輸送し得る、プロアントシァニジンの水可溶性結合体が得られることを見出して、本発明に至った。

本発明の水可溶十生結合体は、プロアントシァニジンと、アミノ酸を 3個以上含むペプチドとからなる。

好ましい実施態様においては、上記ぺプチドの平均分子量が 7 , 0 0 0以下である。

好ましい実施態様においては、上記プロアントシァニジンは、植物抽出物由来である。

本発明の組成物は、上記水可溶性結合体を含有する。

本発明によれば、プロアントシァニジン、特に植物抽出物を用いた場合は、植物抽出物中のプロアントシァニジンと、アミノ酸を 3個以上含むぺプチドとの水可溶性結合体は、プロアントシァニジンの保護安定性に優れ、吸収性がよく、長期保存においても沈澱を生じず、かつプロアントシァニジン由来の生理活性を有する。さらに、消化、吸収過程においても水可溶性結合体中のプロアントシァ-ジンが分解しないため、体内においても該生理活性を保持する。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明のプロアントシァニジンと、アミノ酸を 3個以上含むぺプチドとの水可溶性結合体およぴ該水可溶性結合体を含有する組成物について説明する。なお、以下に説明する構成は、本発明を限定するものでなく、本発明の趣旨の範囲内で種々改変することができることは当業者に明らかである。

(プロアントシァニジン）

本発明の水可溶性結合体に用いられるプロアントシァニジンとは、フラバンー 3—オールおよび/またはフラバン一 3， 4ージオールを構成単位とする重合度が 2以上の縮重合体からなる化合物群をいう。プロアントシァニジンは、ポリフエノール類の一種で、植物が作り出す強力な抗酸化物質である。上記プロアントシァニジンは、松、樫、山挑などの榭皮、ブドウ、ブルーべリー、イチゴ、アポガド、ニセアカシア、コケモモの果実もしくは種子、大麦、小麦、大豆、黒大豆、カカオ、小豆、トチの実の殼、ピーナッツの薄皮、イチヨウ葉などに含まれている。また、西アフリカのコーラナッツ、ペルーのラタニアの根、日本の緑茶にも含まれている。

本発明に用いられるプロアントシァニジンとしては、重合度の低い縮重合体が好ましい、重合度が 2〜 3 0の縮重合体（ 2〜 3 0量体）が好ましく、重合度が 2〜 1 0の縮重合体（2〜1 0量体）がより好ましく、重合度が 2 〜 4の縮重合体（2〜4量体）がさらに好ましい。この重合度が 2〜4の縮重合体を、本明細書では O P C (オリゴメリック .プロアントシァニジン； oligomeric proanthocyanidin) とレヽう。 O P Cは、ヒ卜の体内では、生成することのできない物質である。特に O P Cは、ペプチドに対する結合力が強いにもかかわらず、 O P Cとペプチドとからなる結合体は、溶液中の沈殿や懸濁が起こらず、粉末や溶液中で安定であり、各成分の単独の効果よりも高い生理活性を有するため好ましい。

上記プロアントシァ-ジンは、 O P Cを含有することが好ましい。 5量体以上のプロアントシァニジンは、ペプチドと結合することによって、懸濁や沈殿を起こし易いが、 O P Cを含有すると、 5量体以上のプロアントシァニジンの凝集による懸濁や沈殿が起きにくくなる。 5量体以上のプロアントシァニジンと O P Cとの割合に特に制限はない。ぺプチドとの凝集による懸濁や沈殿の観点から、好ましくは 5量体以上のプロアントシァニジン 1質量部に対して O P Cが 1質量部以上である。

本発明においては、プロアントシァニジンとして、上記の植物抽出物由来のプロアントシァニジンを用いることが好ましい。特に O P Cを含有する植物抽出物、例えば、樹皮、果実もしくは種子の抽出物が特に好適に用いられる。特に、 O P Cに富む植物抽出物、例えば、 O P Cを 2 0質量。 /。以上、好ましくは 3 0質量％以上、より好ましくは 4 0質量％以上含有する植物抽出物が好ましい。 O P Cを 2 0質量％以上含有する植物抽出物として、松樹皮の抽出物が挙げられる。

プロアントシァニジン、特に O P Cは、上述のように抗酸化物質であるため、ガン'心臓病 ·脳血栓などの成人病の危険率を低下する効果、関節炎 - ァトピー性皮膚炎 ·花粉症などのァレルギ一体質の改善効果などを有することが知られている。

さらに O P Cは、抗酸化作用のほか、口腔内のバクテリア増殖を抑制してプラーク（歯こう）を減少させる効果、血管の弾力性を回復させる効果、肌質を改善させる効果、コラーゲンの増強効果、高脂血症改善効果、血液中でのリポたんぱくが活性酸素によりダメージを受けるのを防止して、損傷した脂肪が血管の内壁に凝集し、コレステロールが付着することを防止する効果、活'性酸素によって分解されたビタミン Eを再生させる効果、ビタミン Eの増強剤としての効果などを有することが知られている。この中でも、血管の弾力性を回復させる効果により血流が改善され得る。さらにべプチドにコラーゲンを用いた場合は、增強効果との相乗作用によって、肌質も改善され得る。プロアントシァニジンを含有する植物抽出物を用いる場合は、植物抽出物中にさらに力テキン類を含有することが好ましい。好ましくは植物抽出物中に 5質量％以上含有する。プロアントシァ-ジンを豊富に含有する上記植物抽出物には、カテキン類が含有され得る。カテキン（catechin) 類とは、ポリヒドロキシフラパン一 3—オールの総称であり、カテキン類としては、 (+ ) 一力テキン、 (一）ーェピカテキン、 (+ ) ーガロカテキン、 (一） —ェピガロカテキン、ェピガロカテキンガレー、ェピカテキンガレートなどが知られている。植物由来の抽出物からは、狭義のカテキンといわれている (+ ) 一力テキンの他、ガロカテキン、ァフゼレキン、ならびに (+ ) - カテキンまたはガロカテキンの 3—ガロイル誘導体が単離されている。

カテキン類は、植物抽出物中に、プロアントシァニジン 1質量部に対して、 0 . 1質量部以上含有されることが好ましい。より好ましくは、 O P Cを 2 0質量％以上含有する原料植物抽出物に、カテキン類が 5質量％以上含有する。例えば、松樹皮抽出物のカテキン類含量が 5質量％未満の場合、 5質量。 /₀以上となるように力テキン類を添加してもよい。力テキン類を 5質量％以上含有し、かつ O P Cを 2 0質量％以上含有する松樹皮抽出物を用いることが最も好ましい。

カテキン類には、発癌抑制作用、動脈硬化予防作用、脂肪代謝異常の抑制作用、血圧上昇抑制作用、血小板凝集抑制作用、抗アレルギー作用、抗ウイルス作用、抗菌作用、虫歯予防作用、口臭防止作用、腸内細菌叢正常化作用、活个生酸素ゃフリ一ラジカルの消去作用、抗酸化作用などがあることが知られている。カテキン類には、血糖の上昇を抑制する抗糖尿病効果があることが知られている。カテキン類は、プロアントシァニジンの凝集沈殿や懸濁をより生じにくくする効果を有する。さらに O P Cとペプチドとの結合を安定ィ匕させ、高い生理活性を発揮させ得る。さらに、カテキン類は、 O P Cの存在下で水溶性が増すと同時に、 O P Cを活性化する性質があり、 O P Cとともに摂取することによって、 O P Cの作用を増強させる。

以下、 O P Cを豊富に含む松樹皮の抽出物を例に挙げて、プロアントシァ二ジンを含有する植物抽出物の調製方法を説明する。

松樹皮抽出物としては、フランス海岸松（Pinus Martima) 、カラマツ、クロマツ、ァカマツ、ヒメコマツ、ゴヨウマツ、チヨゥセンマツ、ハイマツ、リュウキユウマツ、ゥックシマツ、ダイォゥマツ、シロマツ、カナダのケべック地方のァネダなどのマツ目に属する植物の樹皮抽出物が好ましく用いられる。中でも、フランス海岸松（Pinus Martima) の樹皮抽出物が好ましい。フランス海岸松は、南仏の大西洋沿岸の一部に生育している海洋性松をいう。このフランス海岸松の樹皮は、プロアントシァニジン、有機酸、ならびにその他の生理活性成分などを含有し、その主要成分であるプロアントシァ二ジンに、活性酸素を除去する強、抗酸化作用があることが知られている。松榭皮抽出物は、上記の松樹皮を水または有機溶媒で抽出して得られる。水を用いる場合には、温水または熱水が用いることが好ましい。これらの水には、抽出効率を向上させる点から、塩化ナトリウムなどの塩を添加することが好ましい。抽出に用いる有機溶媒としては、食品あるいは薬剤の製造に許容される有機溶媒が用いられ、例えば、メタノール、エタノール、 1ープロパノール、 2—プロパノール、 1—プタノール、 2—プタノール、ァセトン、へキサン- シクロへキサン、プロピレンダリコーノレ、含水エタノール、含水プロピレンダリコール、メチルェチルケトン、グリセリン、酢酸メチル、酢酸ェチル、ジェチルエーテル、ジクロロメタン、食用油脂、 1 , 1， 1 , 2—テトラフルォロェタン、および 1 , 1 , 2—トリクロロェテンが挙げられる。これらの水おょぴ有機溶媒は単独で用いてもよいし、組合わせて用いてもよい。特に、水、熱水、エタノール、含水エタノール、および含水プロピレンダリコールが好ましく、食品、医薬品に用いるときの安全性の観点から、水、熱水、エタノール、および含水エタノールがより好ましい。

松樹皮からプロアントシァニジンを抽出する方法は、特に限定されないが、例えば、加温抽出法、超臨界流体抽出法などが用いられる。

超臨界流体抽出法は、物質の気液の臨界点（臨界温度、臨界圧力）を超えた状態の流体である超臨界流体を用いて抽出を行う方法である。超臨界流体としては、二酸化炭素、エチレン、プロパン、亜酸化窒素（笑気ガス）などが用いられ、二酸ィ匕炭素が好ましく用いられる。

超臨界流体抽出法では、目的成分を超臨界流体によって抽出する抽出工程と、目的成分と超臨界流体とを分離する分離工程からなる。分離工程では、圧力変化による抽出分離、温度変化による抽出分離、または吸着剤 ·吸収剤を用いた抽出分離のいずれを行ってもよい。

また、ェントレーナー添加法による超臨界流体抽出を行ってもよい。この方法は、超臨界流体に、例えば、エタノール、プロパノール、 n—へキサン、アセトン、トルエン、その他の脂肪族低級アルコール類、脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、またはケトン類を 2〜2 O W/V%程度添加し、得られた抽出流体で超臨界流体抽出を行うことによって、 O P C、カテキン類などの目的とする被抽出物の抽出溶媒に対する溶解度を飛躍的に上昇させる、あるいは分離の選択性を増強させる方法であり、効率的に松樹皮抽出物を得る方法である。

松樹皮からの抽出は、複数の抽出方法を組み合わせてもよい。複数の抽出方法を組み合わせることにより、種々の組成の松樹皮抽出物を得ることが可會となる。

上記抽出により得られた松樹皮抽出物は、プロアントシァニジン含有量を増加させる目的で精製してもよい。精製には、通常、酢酸ェチルなどの溶媒が用いられるが、食品、医薬品としての安全性の面から、水またはエタノールを用いて、例えば、限外濾過、あるいは合成吸着剤（ダイヤイオン H P— 2 0、セフアデックス一L H 2 0など）を用いたカラム法またはパッチ法により精製することが好ましい。

本発明の植物抽出物として用いられる松樹皮抽出物は、具体的には、以下のような方法により調製されるが、これは例示であり、この方法に限定されない。

フランス海岸松の樹皮 1 k gを、塩ィ匕ナトリゥムの飽和水溶液 3 Lに入れ、 1 0 0 にて 3 0分間抽出し、抽出液を得る（抽出工程）。その後、抽出液を濾過し、得られる不溶物を塩ィ匕ナトリゥムの飽和溶液 5 0 O m Lで洗浄し、洗浄液を得る（洗浄工程）。この抽出液と洗浄液を合わせて、松榭皮の粗抽出液を得る。

次いで、この粗抽出液に酢酸ェチル 2 5 O m Lを添加して分液し、酢酸ェチル層を回収する工程を 5回行う。回収した酢酸ェチル溶液を合わせて、無水硫酸ナトリウム 2 0 0 gに直接添カ卩して脱水する。その後、この酢酸ェチル溶液を濾過し、濾液を元の 5分の 1量になるまで減圧濃縮する。濃縮された酢酸ェチル溶液を 2 Lのクロロホルムに注ぎ、攪拌して得られる沈殿物を濾過により回収する。その後、この沈殿物を酢酸ェチル 1 0 O m Lに溶解した後、再度 1 Lのクロ口ホルムに添カ卩して沈殿させる操作を 2回繰り返す洗浄工程を行う。この方法により、例えば、 O P Cを 2 0質量％以上含み、かつ力テキン類を 5質量％以上含有する、約 5 gの松樹皮抽出物が得られる。上記松樹皮のような原料植物に由来する抽出物は、 O P Cを乾燥質量換算で好ましくは 2 0質量。 /₀以上、より好ましくは 3 0質量％以上含有する。このように O P Cを高い割合で含有する原料として、松樹皮抽出物が好ましく用いられる。

なお、上記のように水やエタノールを用いて植物体から抽出した抽出物中には、 5量体以上のプロアントシァニジンも含有されるが、プロアントシァ二ジンの極性溶媒への溶解度から、そのほとんどは 1 0〜 2 0量体以下となる。

(アミノ酸を 3個以上含むぺプチド）

本発明に用いられるぺプチドは、ァミノ酸を 3個以上含んでいればよく、ァミノ酸の種類おょぴその組み合わせに特に制限されない。上記ぺプチドは、動物または植物由来のタンパク質およびその分解物であっても、有機合成によつて得られたぺプチドであってもよい。

上記動物または植物由来のタンパク質およびその分解物としては、例えば、牛、豚、鶏などの畜肉類、魚類、獣乳、卵などに由来する動物性タンパク質；大豆、ニンジン、小麦、トウモロコシ、えんどう豆などに由来する植物性タンパク質；およびこれらの分解物が挙げられる。特に、大豆、コラーゲン、およびニンジンに由来するペプチドが好ましく、大豆分解物、コラーゲンペプチド、およびニンジン由来ペプチドが最も好ましい。タンパク質は、原料をそのまま物理的に粉薛して使用してもよいし、水や有機溶媒などの溶媒を用いた抽出物として用いてもよい。上記タンパク質の分解物は、上記動植物性タンパク質の粉碎物または抽出物を酸、アルカリ、または酵素を用いて分解することによって得られ得る。

コラーゲンは、動物の結合組織を構成する主要タンパク質であり、骨、腱、皮膚、血管壁などに多く含まれる。分子内に 1または複数の 3重らせん構造を有し、構成するポリぺプチド鎖のァミノ酸配列が異なる種々のタイプが存在する。コラーゲンの変性物であるゼラチンは、コラーゲンを含む原料を温

(熱）水抽出することにより得られる分子量 30万から数万程度の水溶性タンパク質であり、アルカリ処理ゼラチン（等電点 4. 8〜5. 3) と酸処理ゼラチン（等電点 7〜 9) とがある。

コラーゲンペプチドは、上記コラーゲンまたはゼラチンを、例えば、以下のように分解することによって得られたものである。まず、牛、豚などの皮または骨を、アル力リ溶液に 2〜 3ヶ月浸漬するアル力リ処理または希塩酸などに短期間浸漬する酸処理を施して、原料に含まれる不純物を除去し、力、つ抽出を容易にするための前処理を行う。例えば、原料が牛骨である場合は、骨の中にリン酸カルシウムなどの無機質が含まれているため、予め希塩酸に漬けて無機質を除去し、これを温（熱）水抽出することによりゼラチンを得る。温（熱）水抽出は、一般には、最初の抽出温度は 50〜60°Cで、 2回目以降は抽出温度を徐々に上げ、最終的には煮沸させる。次いで、得られたゼラチンを、通常用いられる酸あるいは酵素で加水分解する。このようにして、コラーゲンぺプチドが得られる。このようなコラーゲンぺプチドは、巿販されており、容易に入手可能である。例えば、二ツビぺプタイド PBF、二ツビぺプタイド PR A (いずれも（株）二ツビ製）、 SCP— 5000、 SCP—3100 (いずれも新田ゼラチン（株）製）、コラーゲンペプチド D S (協和ハイフーズ株式会社製) 、フアルコニックス CTP (一丸フアルコス株式会社製) などが挙げられる。

大豆分角物は、例えば、大豆を脱脂し、水抽出した豆乳を酸沈殿して得られる分離大豆蛋白質をアルカリによる加水分解処理、酸、酵素、酸化剤又は還元剤を用いた分解処理またはこれらの組合せにより分解し、必要に応じて一定分子量のぺプチドを分画して得られたものであり、市販のものを容易に入手することができる。例えば、ハイエユート S、 R、 D l、 D3、 DC 5,

SMS、 SMP (以上、不二製油株式会社）などが挙げられる。ニンジン由来のペプチドは、動物性コラーゲンとアミノ酸組成が類似しているものが好適である。例えば、 Daucus carota L.由来ペプチドは、コラーゲン類似ペプチドである。

このアミノ酸を 3個以上含むぺプチドの平均分子量は、特に制限されない。好ましくは、平均分子量が 7， 0 0 0以下、より好ましくは平均分子量が 4 0 0〜 7， 0 0 0、さらに好ましくは 4 0 0〜6， 5 0 0、特に好ましくは 4 0 0以上 3， 0 0 0未満である。このようなアミノ酸を 3個以上含むぺプチドを用いることによって、さらに、プロアントシァニジンが有する生理活性を増強することも期待できる。平均分子量が 7， 0 0 0より大きくなると、多くのプロアントシァニジンと結合し、大きな結合体が形成されるため、沈殿や懸濁を生じる場合があり、さらにプロアントシァニジンの生体内の吸収が妨げられる可能性がある。平均分子量が 4 0 0より小さいぺプチドは、長期保存において、凝集沈澱を生じる場合がある。 (水可溶性結合体）

本発明の水可溶性結合体は、プロアントシァニジン、特に植物抽出物を用いた場合は、植物抽出物中のプロアントシァニジンと、アミノ酸を 3個以上含むペプチドとからなる。プロアントシァニジンと、アミノ酸を 3個以上含むペプチドとの割合は、特に制限されない。水可溶性結合体中のプロアントシァニジンの保護安定性の点から、プロアントシァニジン 1質量部に対して、アミノ酸を 3個以上含むペプチド、例えば、大豆またはコラーゲン由来のぺプチドを 1質量部以上、より好ましくは 5質量部以上、さらに好ましくは 5 質量部〜 3 0 0質量部、最も好ましくは 5質量部〜 1 5 0質量部含むことが好ましい。 1質量部より少ないと、プロアントシァニジンの保護安定性が十分でない場合があり得る。

本発明の水可溶性結合体は、具体的には、水、エタノールなどの極性溶媒中で、プロアントシァニジン、特に植物抽出物を用いた場合は、植物抽出物中のプロアントシァニジンと、アミノ酸を 3個以上含むぺプチドとを混合することによって製造されることが好ましい。極性溶媒としては、好ましくは水である。混合は、例えば、プロアントシァ-ジンの乾燥粉末を極性溶媒に溶解させたプロアントシァニジン含有溶液と、アミノ酸を 3個以上含むぺプチドを同じ極性溶媒に溶解させたぺプチド含有溶液とを混合する；ぺプチド含有溶液にプロアントシァニジンの乾燥粉末を添加する；プロアントシァ- ジン含有溶液にペプチドの乾燥粉末を添加する；またはプロアントシァニジンの乾燥粉末とぺプチドの乾燥粉末とを混合した後に極性溶媒を添加するなどによって行われ得る。

プロアントシァニジン含有溶液とべプチド含有溶液とを混合する場合、その混合割合に特に制限はない。沈澱を生じさせずに水可溶性結合体を得る点力ら、好ましくはペプチド含有溶液 1容量部に対して、プロアントシァニジン含有溶液が 1 / 5 0容量部以上、より好ましくは 1ノ 1 0容量部以上である。

ぺプチド含有溶液にプロアントシァニジンの乾燥粉末を添加する、あるいはプロアントシァニジン含有溶液にぺプチドの乾燥粉末を添加することによつて混合する場合、攪拌しながら乾燥粉末を添加する、あるいは乾燥粉末を添加した後に攪拌することが、沈澱を防止する点から好ましい。

プロアントシァニジンの乾燥粉末とぺプチドの乾燥粉末とを混合した後に極性溶媒を添加する場合、混合した粉末を攪拌しながら、極性溶媒を嘖霧することが、均一な水可溶性結合体を得る点から好ましい。

得られた水可溶性結合体を、その後、当業者が通常用いる加工方法によつて、粉末ィ匕してもよレ、。粉末化は、例えば、流動層造粒機などを用いて、プ口アントシァニジンとペプチドとの混合粉末を攪拌しながら、極性溶媒を噴霧することによって行われる。粉末にした場合であっても、液状の水可溶性結合体と同様の効果を有し、例えば、プロアントシァェジンは、変色などの劣化が少なく、生理活性が保持または増強されており、生体内でその活性を発揮し得る。さらに、粉末にしておき、使用時に水などの溶媒に再溶解させることが、プロアントシァェジンの変色などの劣化が少ない点から好ましい。本発明の水可溶性結合体は、アミノ酸を 3個以上含むぺプチドを、プロアントシァ-ジン、特に植物抽出物を用いた場合は、植物抽出物中のプロアントシァニジンに結合させることによって、プロアントシァニジンの保護安定性が高められ、かつ生理活性が保持または高められる。そのため、液状で長期保存しても沈澱が生じず、該生理活性を維持したまま生体内に輸送し得る。本発明の水可溶性結合体は、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品、トイレタリー用品などとして利用され、経口投与および経皮投与のいずれの目的で使用しても、その効果を発揮し得る。特に液状の製品などの酸化安定ィヒ剤などとして利用することが好適である。 (水可溶性結合体含有組成物）

本発明の組成物は、上記水可溶性結合体を含有し、必要に応じて、その他の成分を含有し得る。この組成物は、上記水可溶性結合体と同様に、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品、トイレタリー用品などとして利用される。本発明の糸且成物に含有される水可溶性結合体の量は、投与方法や剤形によつて異なり、特に制限されない。好ましくは、糸且成物中に、プロアントシァ二ジンが乾燥質量換算で 0 . 0 0 0 0 1質量％〜 5 0質量⁰ /₀、より好ましくは 0 . 0 0 1質量％〜4 0質量％、さらに好ましくは 0 . 0 1質量％〜2 0 質量％となるように含有される。

本発明の組成物には、上記水可溶性結合体以外に、医薬品、食品、医薬部外品、化粧料などに通常使用される他の成分を、該組成物の効果を損なわない範囲で含有してもよい。このような成分としては、例えば、水、薬効成分、酸化防止剤、他の油剤、保湿剤、界面活性剤、紫外線吸収剤、吸収促進剤、香料、色素、保存剤、増粘剤、キレート剤、防腐防黴剤などを挙げられる。薬効成分としては、活性酸素除去剤、抗酸化剤、消炎鎮痛剤、抗ヒスタミン剤、止痒剤、殺菌剤、ビタミン剤、ホルモン剤などが挙げられる。

酸化防止剤は、プロアントシァニジンの酸化に対する安定性をさらに高める目的で添加する。さらに、体内のタンパク質や脂質の酸化を防止し、肌質を改善および保護する効果も得ることができる。酸化防止剤としては、ビタミン Aなどのカロテノイド類、ビタミン B類、ァスコルビン酸、ビタミン E、これらの誘導体またはこれらの塩、 L—システィンおよびこれらの誘導体やその塩、リボフラビン、 S O D、マン-トール、トリプトファン、ヒスチジン、ケルセチン、没食子酸およびその誘導体、茶抽出物、およびダルタチォン酵母抽出物などの抽出物が挙げられる。好ましくは、ァスコルビン酸ならびにその誘導体およびその塩である。

ァスコルビン酸もしくはその誘導体またはその塩（以下、ァスコルビン酸等という）は、プロアントシァニジンの安定性を高めるだけでなく、肌や脂質代謝に相乗的に効果を発揮し、肌質の改善効果（例えば、ハリゃツヤが良くなる効果）および血管保護効果をより高める。ァスコルビン酸等は、プロアントシァニジン 1質量部に対して、好ましくは 0 . 1質量部〜 5 0質量部、より好ましくは 0 . 2質量部〜 2 0質量部となるように含有され得る。

本発明の組成物を食品などの経口投与を目的として利用する場合は、さらに必要に応じて、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料などの添加剤と混合され得る。例えば、ローヤルゼリー、ビタミン、プロテイン、卵殻カルシウムなどのカルシウム、キトサン、レシチン、クロレラ末、ァシタパ末、モロヘイヤ末などの栄養成分としての食品添加物；ステビア末、抹茶パウダー、レモンパウダー、はちみつ、還元麦芽糖、乳糖、糖液などの調味料が混合され得る。そして、この組成物は、ハードカプセル、ソフトカプセルなどのカプセル剤、碇剤、もしくは丸剤などに、あるいは粉末状、顆粒状、茶状、ティーバッグ状、飴状、液体、ペースト状などの形態に成形され得る。これらは、形状または好みに応じて、そのまま飲食してもよく、あるいは水、湯、牛乳などに溶いて飲んでも良い。

本発明の組成物は、経皮投与を目的として、医薬品、医薬部外品、化粧品、トイレタリー用品として使用できる。例えば、化粧水、化粧クリーム、乳液、クリーム、ノック、ヘアトニック、ヘアクリーム、シャンプー、ヘアリンス、トリートメント、ボディシャンプ一、洗顔剤、石鹼、フ了ンデーシヨン、白粉、口紅、リップダロス、頰紅、アイシャドー、整髪料、育毛剤、水性軟膏、油性軟膏、目薬、アイゥォッシュ、歯磨剤、マウスゥォッシュ、シップ、ゲルなどが挙げられる。また、シップやゲルのような担体や架橋剤に保持 ·吸収させ、局部へ貼付するなどの方法により、局所的な長時間投与を行うこともできる。

本発明の,袓成物を経口投与により摂取する場合の一日の投与量は、特に限定されないが、好ましくはプロアントシァニジンとして 0 . 0 2 g〜l gの範囲内で、様々な生理活性を得ることができる。また、経皮投与の場合は、局所的な投与となるため、前記の一定濃度となるように調製したものであれば、生理活性を得ることが可能である。

本発明の a成物を適切な量で摂取した場合、プロアントシァ-ジンおよびアミノ酸を 3個以上含むぺプチドをそれぞれ単独で摂取する場合に比べて、優れた血中の抗酸化力、血流改善効果、肌質改善効果などが得られる。特に、 O P Cを乾燥質量換算で 2 0質量％以上含有する植物抽出物を用いた場合、特に優れた効果が得られる。実施例

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明がこの実施例により制限されないことはいうまでもない。

(実施例 1 ：水可溶性結合体）

松樹皮抽出物（2〜4量体： 40質量％、 5量体以上： 25. 1質量。/。、カテキン： 5. 1質量％、商標名：フラバンジノール、株式会社東洋新薬）を 0. 2質量。 /₀含有する水溶液 0. 5mLと、大豆分解物（平均分子量約 400、ハイ二ユート PM、不二製油株式会社）を 4質量％含有する水溶液 0. 5 mLとを混合して透明な混合液を得た。この混合液中のカテキン類、 2量体の OPC、および 3量体の OPCを、シリカゲルクロマトグラフィー (TLC) により検出することによって、結合体の形成の有無を確認した。すなわち、混合液中において、松樹皮抽出物に通常含有される上記成分の各標品と同じ位置にスポットが出現しなければ、上記成分が結合体を形成していると判断し、出現すれば、結合体を形成していないと判断した。結果を表 1に示す。なお、 TLCは、以下の条件で行い、指標としてカテキン（R f 値： 0. 8) ならびに 2量体および 3量体の OP Cの各標品（2量体：プロアントシァニジン B— 2 (R f値： 0. 6) 、 3量体：プロアントシァ-ジン C一 1 (R f値： 0. 4) ) を用いた：

T L C ：シリ力ゲルプレート（Merck & Co.， Inc.製）

展開溶媒：ベンゼン/ギ酸ェチル /ギ酸（ 2 / 7ノ 1 )

検出試薬：硫酸およびァニスアルデヒド硫酸

サンプル量：各 10 L

(比較例 1〜 3 )

混合液の代わりに、実施例 1の松樹皮抽出物を 0. 1質量％含有する水溶液を用いたこと以外は、実施例 1と同様にして、 TLCにより結合体の形成の有無を確認した（比較例 1) 。上記同様にして、実施例 1の大豆分解物 (平均分子量約 4 0 0 ) を 2質量％含有する水溶液（比較例 2 ) およぴグリシン（分子量 7 5 ：和光純薬工業株式会社製）を 2質量％含有する水溶液

(比較例 3 ) についても、 T L Cにより結合体の形成の有無を確認した。結果を表 1に併せて示す。表 1

+は各標品と同じ位置にスポットが検出されたことを示す。

一は各標品と同じ位置にスポットが検出されたことを示す。

表 1の結果からわかるように、実施例 1の松樹皮抽出物と大豆分解物との混合液から、カテキンは検出されたが、 2量体および 3量体のプロアントシァ-ジン（O P C) は検出されなかった。これに対して、比較例 1の松樹皮抽出物含有溶液からは、カテキン、ならびに 2量体おょぴ 3量体のプロアントシァニジン（O P C) がいずれも検出され、比較例 2の大豆分解物含有溶液からはいずれも検出されなかった。このように、松樹皮抽出物と大豆分解物とを混合すると、松榭皮抽出物に本来含有される 2量体および 3量体のプ口アントシァニジン（O P C) が検出されなくなることがわかる。これは、松樹皮抽出物中の 2量体以上のプ口アントシァニジンと大豆分解物とが水可溶性の結合体を形成するためと考えられる。 (実施例 2 ：凝集沈殿評価）

(1) プロアントシァニジン含有溶液の調製

実施例 1で用いた松樹皮抽出物（以下、松樹皮抽出物 Aという） 20 gを、 S e p h a d e x LH— 20 (フ了ルマシァパイォテク株式会社製) に供して分離し、乾燥粉末質量で 7. 6 gの 2〜 4量体おょぴ 5. 1 gの 5量体以上のプロアントシァニジンを回収した。なお、 S e p h a d e x LH— 20による分離は、以下の条件で 2回行った。

まず、水で膨潤させた S e p h a d e x LH— 20をカラム体積で 50 OmLとなるように 50 X 50 Ommのカラムに充填し、 50 OniLのエタノールで洗浄した。上記松樹皮抽出物 10 gを 20 OmLのエタノールに溶解し、これをカラムに通液して吸着させた後、 100〜80% (v/v) ェタノール一水混合溶媒でグラジェント溶出し、 10 OmLずつ分取した。各画分について、シリカゲルクロマトグラフィー（TLC) により、 2〜4量体の O PCの各標品（2量体：プロアントシァニジン B— 2 (R f値： 0. 6) 、 3量体：プロアントシァニジン C_ 1 (R g : 0. 4) 、 4量体：シンナムタンニン A₂ (R f値： 0. 2) ) を指標として、 O PCの溶出を検出した。 TLCの条件は、実施例 1と同様である。

O PCが検出された画分を集め、凍結乾燥して粉末を得た。次いで、 OP Cが検出されなくなったカラムに、 50% (v/v) 水一アセトン混合溶媒 l O O OmLを通液し、 5量体以上のプロアントシァニジンを溶出させ、回収した画分を凍結乾燥させて粉末を得た。

得られた 5量体以上のプロアントシァニジン 0. l gと、上記の松樹皮抽出物 Aの粉末 1 gとを混合し、 2〜4量体（OPC) を 36質量％および 5 量体以上のプロアントシァニジンを 31質量％含む松樹皮抽出物を調製した (以下、松樹皮抽出物 Bという）。

上記で得られた松榭皮抽出物 Bを、最終濃度が 0. 2質量％となるように水溶液に溶解した（これをプロアントシァニジン含有溶液 1とする）。これとは別に、上記松樹皮抽出物 Aの OPC画分をプロアントシァニジン含有溶液 2、および上記 5量体以上のプ口アントシァニジン画分をプロアントシァ二ジン含有溶液 3とした。

(2) ペプチドおよびアミノ酸含有溶液の調製

コラーゲン（平均分子量 30万：株式会社高研製）、二ツビぺプタイド P A— 100 (平均分子量 10， 000 :株式会社二ツビ製）、コラーゲンぺプチド D S (平均分子量 7 , 000 :協和ハイフーズ社製）、 S CP- 500 0 (平均分子量 5， 000 ：新田ゼラチン株式会社製）、フアルコニックス

CTP (平均分子量 3, 000 ：一丸フアルコス株式会社製）、 -ッピぺプタイド PA— 10 (平均分子量 1， 000 ：株式会社二ツビ製）、大豆分解物（平均分子量約 400、ハイ二ユート PM、不二製油株式会社）、セリン一グルタミン酸のジぺプチド (シグマアルドリツチジャパン) およびグリシン（分子量 75 ：和光純薬工業株式会社製）を用いて、これらのコラーゲン、コラーゲンぺプチド、またはアミノ酸が 10. 0質量％となるように水溶液を各 2 m Lずつ調製した。

(3) 評価

上記のように調製したペプチドまたはアミノ酸溶液各 lmLに、上記プロアントシァニジン含有溶液 1〜 3を 1 m Lずつそれぞれ混合した。これらの溶液を、 1週間室温で放置し、 1週間後に沈殿および懸濁の有無を目視により観察した。また、 40°Cで 6ヶ月間放置した後にも、沈殿および懸濁の有無を目視により観察した。結果を表 2に示す。なお、対照として、 lmLのプロアントシァニジン含有溶液 1に 1 m Lの水を加えた溶液 (対照 1 ) 、 1 mLのプロアントシァニジン含有溶液 1に 1 mLのァスコルビン酸含有溶液 (0. 1質量％) を混合した溶液（対照 2) を設け、上記同様に、沈澱および懸濁の有無を目視により観察した。

O cn

表 2からわかるように、混合液を室温にて 1週間保存した場合、 2〜4量体のプロアントシァニジン（プロアントシァ-ジン含有溶液 2 ) または O P Cを含むプロアントシァニジン (プロアントシァニジン含有溶液 1 ) と、ァミノ酸（グリシン）および 2個以上のアミノ酸が結合したペプチド（セリン —グルタミン酸ジぺプチド、大豆分解物、ならびに平均分子量 1， 0 0 0、 3， 0 0 0、 5， 0 0 0，および 7 , 0 0 0のコラーゲンペプチド）、水のみ（対照 1 ) 、またはァスコルビン酸（対照 2 ) との混合液では、ほとんど懸濁が見られなかった。し力し、これらのうちで、 4 0 °Cにて 6力月間保存した場合は、上記プロアントシァニジン含有溶液と、アミノ酸（グリシン）、 2個以下のアミノ酸を含むペプチド（セリン一グルタミン酸ジペプチド）、水のみ（対照 1 ) 、またはァスコレビン酸（対照 2 ) との混合液に沈殿ゃ懸濁が見られた。また、平均分子量 3 0 0 , 0 0 0のコラーゲンを用いた場合は、ゲルイ匕した固形分が析出した。本発明のプロアントシァニジンと、 3個以上（平均分子量 4 0 0以上）のアミノ酸を含むペプチドとの結合体のうち、水可溶性の結合体は、優れた保存安定性を示し、沈殿や懸濁を生じにくいことが分かる。

(実施例 3 ：プロアントシァニジン保護効果）

実施例 1で用いた松樹皮抽出物 A、実施例 2で用いたセリン一グルタミン酸のジぺプチドおよび大豆分解物、ならびに大豆より抽出し分解処理を行つていない大豆蛋白質（平均分子量 1 0， 0 0 0以上、不二製油株式会社）のそれぞれの乾燥粉末を、流動層造粒機を用いて、水を噴霧しながら、食品

(顆粒品）を製造した（食品 1〜4 ) 。配合量を以下に示す。表 3

単位は質量部

5週齢のラット（日本チャールズリバ一株式会社）に、一般の固形飼料 (MF ；オリエンタル酵母株式会社）を与えて 1週間馴化させた後、眼底より採血し、血液中の SOD活性を測定キット（SODテストヮコ一：和光純薬株式会社）を用いて測定した。測定後、 SOD活性の平均値が均一になるように 1群 6匹ずつ計 5群に割り振った。これとは別に、上記食品 1〜4をそれぞれ、松樹皮抽出物の最終濃度が 1 OmgZmLとなるように精製水に混合した（試験液 1〜4) 。この混合液を、含有される松樹皮抽出物が 10 0mg/k g体重となるように、各群のラットにゾンデを用いて経口投与した。対照として、精製水を投与した群を設けた。経口投与 45分後および 9 0分後に、再度眼底から採血を行い、 SOD活性を測定した。結果を表 4に示す。表 4

平均値土標準誤差表 4の結果から、試験液 1 (松樹皮抽出物と大豆分解物とを用いた食品 1 含有）は、試験液 2 (松樹皮抽出物と大豆蛋白質とを用いた食品 2含有）試験液 3 (松樹皮抽出物とセリン一グルタミン酸のジぺプチドとを用いた食品 3含有）、試験液 4 (松樹皮抽出物のみを用いた食品 4含有）、または精製水（食品非含有）に比べて、血中の SOD活性が高まっていることがわかる。このことは、試験液 1において、プロアントシァニジンの生理活性の一つである抗酸化活性を消化過程から少なくとも保護し、吸収されて、ブロアントシァニジンによる生体内の S O D活性が増強されていることを示す。また、松樹皮抽出物と大豆蛋白質とを用いた食品 2を含む試験液 2では、摂取後 45分後の SOD活性が、特に低いことから、吸収の阻害が起こっていると考えられる。

(実施例 4 ：食品組成物の製造）

下記の配合量で飲料（500mL) を製造した

大豆べプチド（平均分子量 700) 0. 1質量％松樹皮抽出物 0. 02質量％ァスコルビン酸ナトリウム 0. 016質量％果糖 0. 3質量％オレンジ果汁 1 . 0質量％水

(実施例 5 ：外用剤の製造）

下記の配合量で外用剤（化粧水）を調製した。この化粧水は、塗布することにより、表皮の血流改善効果と保湿性に優れており、沈殿のない安定な外用剤であった：

コラーゲンぺプチド（平均分子量 1， 0 0 0 ) 0 . 0 5質量％松樹皮抽出物 0 . 0 5質量％ェチノレアノレコーノレ 2 0質量⁰ /₀

1， 3ーブチレングリコーノレ 1 0質量％

アラントイン 0 . 2質量。/。

水産業上の利用可能性

本発明の水可溶性結合体は、プロアントシァニジンとアミノ酸を 3個以上含むぺプチドと力らなる。この水可溶性結合体は、プロアントシァニジンの保護安定性が高められ、かつ生理活性が保持または高められる。そのため、液状で長期保存しても沈澱が生じず、該生理活性を維持したまま生体内に輸送し得る。本発明の水可溶性結合体は、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品、トイレタリー用品などとして利用され、経口投与および経皮投与のいずれかの目的で使用される。特に液状の製品などの酸化安定化剤として利用することができる。

Claims

請求の範囲

1 . プロアントシァ-ジンと、アミノ酸を 3個以上含むペプチドとからなる、水可溶性結合体。

2 . 前記ペプチドの平均分子量が 7， 0 0 0以下である、請求項 1に記載の結合体。

3 . 前記プロアントシァニジンが、植物抽出物由来である、請求項 1または 2に記載の結合体。

4 . 請求項 1〜3のいずれかの項に記載の水可溶性結合体を含有する、組成物。