WO2005019438A1

WO2005019438A1 - 粘膜免疫賦活作用を有する乳酸菌

Info

Publication number: WO2005019438A1
Application number: PCT/JP2004/012136
Authority: WO
Inventors: Satoko Yamahira; Masamichi Toba; Hiroshi Okamatsu
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2003-08-21
Filing date: 2004-08-18
Publication date: 2005-03-03
Also published as: CN1849388A; AU2004267304A1; US7842495B2; CA2535362C; EP1661983B1; JPWO2005019438A1; US20060182727A1; EP1661983A4; DE602004030922D1; KR101095712B1; KR20060119869A; TWI354701B; TW200514847A; ES2356315T3; CA2535362A1; JP3818319B2; EP1661983A1; AU2004267304B2; HK1093355A1; CN100489086C

Abstract

本発明は、ラクトバチルスONRIC b0239(FERM BP-10064)およびラクトバチルスONRIC b0240(FERM BP-10065)からなる群から選択されるいずれかの乳酸菌、および該乳酸菌を含有する粘膜免疫賦活作用を有する組成物、殊に飲食品または医薬品としての該組成物を提供するものであって、この乳酸菌およびこれを含む組成物は、優れた粘膜免疫賦活作用を奏し得、生体防御機構の強化に有用である。

Description

明細書

粘膜免疫賦活作用を有する乳酸菌

' 技術分野

本発明は、乳酸菌およびこれを含有する組成物、特に粘膜免疫を賦活することができる乳酸菌およびこれを含有する飲食品に関する。

背景技術

漬け物、キムチ、パン、酒、味噌、醤油などの植物性食品から多くの乳酸菌が検出されている。東京農業大学岡田早苗教授は、植物性食品から検出される乳酸菌を植物性乳酸菌と呼び、発酵乳、チーズなどの動物性食品由来の乳酸菌とは区別することを推奨してレる (Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria, Vol.13, No.1 , pp.23- 36 (2002)) 。これは、植物性乳酸菌と動物性乳酸菌とが生育環境において相違し、特に植物性乳酸菌は該菌の利用できる糖の種類が多く、抗菌物質耐性、酵素耐性、酸素耐性などの点でより過酷な環境に適応できる能力を有することに基づいている。本発明者らはこの植物性乳酸菌について研究を重ね、先に、ラクトバチルス ·プランタラム (Lactobacillus o/ante m)に属する一つの乳酸菌 (ONC141株)をスタ一夕一として調製した発酵乳が、ヒトにおいて胃腸内細菌叢を改善すること（久米村恵、戸羽正道、曽川芳郎、清水精一、川口信三、「腸内細菌学雑誌」、 15, 15 (2001 )) 、便秘気味の成人の排便回数を増加させること（戸羽正道、久米村恵、宗行哲、曽川芳郎、吉澤久雄、矢島洋一、松田豊、飯島肇、「腸内細菌学雑誌」、 15, 21

(2001 )) および病原性サルモネラ

の経口感染に対する宿主の抵抗性を増強すること（IgA産生亢進作用、胃腸管粘膜活性化作用）（池永武、山平聡子、名知英樹、戸羽正道、岡松洋、 Milk Science, Vol.51 , No.1， pp.27-32 (2002)) を報告した。

この ONC141株 (発酵乳)にみられるサルモネラ感染の宿主抵抗性の増強効果は、これまで知られている植物性乳酸菌および動物性乳酸菌のうちでも卓越するものであり、従って、該株は粘膜免疫機能を高め、人の生体防御に対する有用性が高いものと考えられた。

発明の開示

本発明の目的は、本発明者らの先の研究に係る乳酸菌に比してもより一層優れた粘膜免疫賦活作用、生体防御機構の向上作用などを奏し得、プロバイオティックスとして有用な新しい乳酸菌、およびこれを含む最終製品（発酵乳、乳酸菌飲料などの飲食品)を提供することにある。

本発明者らは、上記目的を達成するために、植物性乳酸菌を初めとする多種多数の微生物を新たに入手し、それらについてマウスパイエル板細胞培養系を用いて

IgA産生誘導能を調べた。その結果、特に優れた IgA産生誘導能を有する 2つの乳酸菌を見いだした。本発明は、この知見を基礎として更に研究を重ねた結果完成されたものである。

本発明は、下記項 1 -15に記載の要旨の発明を提供する。

項 1 ラクトバチルス ONRに b0239(FERM BP-10064)およびラクトバチルス

ONRIC b0240(FERM BP-10065)からなる群から選択されるいずれかの乳酸菌。

項 2 ラクトバチルス ONFMC b0239(FERM BP-10064)である項 1に記載の乳酸菌。項 3 ラクトバチルス ONRに b0240(FERM BP-10065)である項 1に記載の乳酸菌。項 4 項 1に記載の乳酸菌と、可食性担体または製剤学的に許容される賦形剤もしくは希釈剤とを含有する、粘膜免疫賦活作用を有する組成物。

項 5 飲食品形態である項 4に記載の組成物。

項 6 発酵乳、乳酸菌飲料、発酵野菜飲料、発酵果実飲料または発酵豆乳飲料である項 5に記載の組成物。

項 7 粘膜免疫賦活を要求されるヒトに、項 1 -3のいずれかに記載の乳酸菌を摂取させる、該患者の粘膜免疫賦活方法。

項 8 粘膜免疫賦活を要求されるヒトに、項 4-6のいずれかに記載の組成物を摂取させる、該患者の粘膜免疫賦活方法。

項 9 IgA産生促進処置を要求されるヒトに、項 1 -3のいずれかに記載の乳酸菌を摂取させる、該患者における IgA産生促進方法。

項 10 IgA産生促進処置を要求されるヒトに、項 4-6のいずれかに記載の組成物を摂取させる、該患者における IgA産生促進方法。

項 1 1 ヒトの粘膜免疫陚活のための、項 1 -3のいずれかに記載の乳酸菌の使用。項 12 ヒトの粘膜免疫陚活のための、項 4-6のいずれかに記載の組成物の使用。項 13 ヒトの IgA産生促進のための、項 1 -3のいずれかに記載の乳酸菌の使用。項 14 ヒトの IgA産生促進のための、項 4-6のいずれかに記載の組成物の使用。項 15 項 4-6のいずれかに記載の組成物の製造のための、項 1 -3のいずれかに記載の乳酸菌の使用。

以下、本発明乳酸菌およびこれを含む本発明組成物につき順次説明する。

本発明乳酸菌

本発明乳酸菌は、本発明者らが新たに天然物から以下の通り分離 ·採取（スクリ一二ング）し且つ寄託したものである。それぞれ、ラクトバチルス (Lactobacillus") ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス (Lactobacillus) ONRIC b0240 (FERM BP-10065)と命名される。

("スクリーニング

(1 -1)起源微生物

起源微生物としては、ヒト腸内容物、植物性食品および動物性食品から分離され、大塚製薬株式会社大津栄養製品研究所で保存している乳酸菌を利用する。 .

(1 -2)スクリーニング方法

目的とする乳酸菌のスクリーニングは、マウスパイエル板細胞培養系を用いて、

IgA産生誘導能を指標として実施する。該スクリーニングの各操作などの詳細は、後記実施例 2に示すとおりである。

(2)スクリーニングされた微生物

(2-1 ) ラクトバチルス ONFUC b0239

(a) 肉眼的特徴

(a-1 ) MRS寒天培地

円形からやや不規則、半球形、平滑、乳白色

(a-2) BL寒天培地

円形からやや不規則、半球形、平滑、白褐色

(b) 顕微鏡的特徴

桿菌で運動性を持たない。芽胞は形成しない。

(c) 生育温度

30〜33でで良好に発育する。

(d) 生理学的、生化学的特徴グラム染色性：陽性

糖資化性

Glycerol

Erythritol

D-Arabinose

し- Arabinose

Ribose

D-Xylose

し- Xylose

Adonitol

β-Methyl-D-Xyloside

Galactose +

D-Glucose +

D-Fructose + D-Mannose + し- Sorbose

Rhamnose

Dulcitol

Inositol

Mannitol

Sorbitol + a-Methy卜 D-Mannoside + a-Methyl-D-Glucoside

N-Acetyl-Glucosamine + Amygdalin + Arbutin + Esculin + Salicin + Cellobiose + Maltose +

Lsctose +

Melibiose +

Saccharose +

Trehalose +

Inulin 一

Melezitose ―

D-Raffinose +

Amidon ―

Glycogen ―

Xylitol - β-Gentiobiose +

D-Turanose -

D-し yxose ―

D-Tagatose 一

D-Fucose ―

し- Fucose ―

D-Arabitol ±

し- Arabitol —

Gluconate 一

2-Keto-Gluconate ―

5-Keto-Gluconate 一

以上の諸性質から、バ一ジイーズ ·マニュアル ·ォブ ·システマティック ·バクテリォロジ一 (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)に照りし、本菌株を Lactobacillus Dlantarumに属する菌株と同定し、 /_acto ac///us ONRに b0239と命名し、平成 15年 8月 6日に、日本国茨城県つくば巿東 1 -1 -1 中央第 6に住所を有する独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (AIST)に寄託番号 FERM P-19469として寄託した。該微生物は、現在、国際寄託に移管されており、その国際寄託番号は FERM BP-10064である。 (2-2) ラクトバチルス ONFUC b0240

(a) 肉眼的特徴

(a-1) MRS寒天培地

円形からやや不規則、半球形、平滑、乳白色 (a-2) BL寒天培地

円形からやや不規則、半球形、平滑、白褐色

(b) 顕微鏡的特徴

桿菌で運動性を持たない。芽胞は形成しない。

(c) 生育温度

30〜33でで良好に発育する。

(d) 生理学的、生化学的特徴

グラム染色性：陽性

糖資化性

Glycerol - Erythritol - D-Arabinose ― L-Arabinose ― Ribose 土 D-Xylose 一し- Xylose ― Adonitol ― β-Methyl-D-Xyloside 一 Galactose + D-Glucose + D-Fructose + D-Mannose + し- Sorbose ― Rhamnose ― Dulciiol ± Inositol

Mannitol +

Sorbitol + a-Methy卜 D-Mannoside

a-Methyl-D-Glucoside

N-Acetyl-Glucosamine +

Amygdalin +

Arbutin +

Esculin + Salicin +

Cellobiose +

Maltose +

Lactose +

Melibiose + Saccharose +

Trehalose

Inulin

Melezitose

D-Raffinose + Amidon

Glycogen

Xylitol

β-Gentiobiose + D-Turanose

D-し yxose

D-Tagatose

D-Fucose

し- Fucose

D-Arabitol し Arabitol - Gluconate - 2-Keto-Gluconate ―

5-Keto-Gluconate ―

以上の諸性質から、パージイーズ ·マニュアル ·ォブ ·システマティック ·バクテリオロン一 (Bergey's Manual of Systematic Bacterioloay)に照らし、本菌株を

Lactobacillus Dlantarumに属する菌株と同定し、 Lactobacillus ONRIC b0240と命名し、平成 15年 8月 6日に、日本国茨城県つくば市東 1 -1 -1 中央第 6に住所を有する独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (AIST)に寄託番号

FERM P-19470として寄託した。該微生物は、現在、国際寄託に移管されており、その国際寄託番号は FERM BP-10065である。

本発明組成物

本発明組成物は、本発明乳酸菌をその有効成分として含有することを必須の要件とする。該組成物は、通常の飲食品と同様に、適当な可食性担体（食品素材）を利用して、飲食品形態乃至医薬品形態に調製される。また、該組成物は、通常の医薬品と同様に、適当な製剤学的に許容される賦型剤乃至希釈剤を利用して、医薬品形態に調製される。

本発明組成物に特有の粘膜免疫賦活作用およびこれに寄与する IgA産生亢進作用は、次のように考えられている。即ち、まず腸管免疫系を構成するパイエル板の M 細胞が管腔にある抗原を取り込む。該抗原は樹状細胞などの抗原提示細胞によって CD4 T細胞に提示される。抗原特異的な T細胞の作用により、未熟な B細胞が成熟しつつ粘膜固有層に移動して最終的に IgA抗体産生細胞に分化する。この IgA産生亢進機構に本発明乳酸菌がどのように関与するかについては現在なお明確ではないが、少なくとも本発明乳酸菌の存在によって IgA産生亢進がなされるためにはパイエル板の M細胞が抗原を取り込む必要があることから、本発明乳酸菌はこの抗原としての機能を果たし得るものであると考えられる。この抗原としての機能を果たすという面から、本発明乳酸菌は、特に生菌である必要はない。通常の一般的加熱滅菌操作によって滅菌されたものであってもよい。但し、乳酸菌は、一般にヨーグルトなどとしてよく知られているように、生菌として摂取されることによって整腸作用、腸内細菌叢改善作用などによる健康維持、長寿などに効果があり、本発明乳酸菌も生菌として摂取される場合にはこれらの効果が期待できることから、生菌として本発明組成物中に配合されるのが好ましい。

本発明乳酸菌 (生菌)はまた、例えば、各乳酸菌の培養液、培養物の粗精製品乃至精製品、それらの凍結乾燥品などとして本発明組成物中に配合することも可能である。

上記培養液は、例えば代表的には、各菌株に適した培地、例えば MRS培地などを用いて、 30 で 16時間程度培養することにより得ることができる。

また菌体は上記培養後に、例えば培養液を 3,000回転/分、 4 ：、 10分間遠心分離して集菌することによって得ることができる。これらは常法に従い精製することができる。更に、上記菌体は凍結乾燥することもできる。かくして得られる凍結乾燥菌体も本発明組成物の有効成分として利用することができる。

本発明組成物中には、必要に応じて更に、本発明微生物の維持、増殖などに適した栄養成分の適量を含有させることができる。該栄養成分の具体例としては、各微生物の培養のための培養培地に利用される例えばグルコース、澱粉、蔗糖、乳糖、デキストリン、ソルビトール、フラクト一スなどの炭素源、例えば酵母エキス、ぺプトンなどの窒素源、ビタミン類、ミネラル類、微量金属元素、その他の栄養成分などの各成分を挙げることができる。ビタミン類としては、例えばビタミン B、ビ夕ミン D、ビタミン C、ビタミン E、ビタミン Kなどを例示できる。微量金属元素としては、例えば亜鉛、セレンなどを例示できる。その他の栄養成分としては、例えば乳果オリゴ糖、大豆オリゴ糖、ラクチュロース、ラクチトール、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖などの各種オリゴ糖を例示できる。これらのオリゴ糖の配合量は、特に限定されるものではないが、通常本発明組成物中に 1-3重量％程度となる量範囲から選ばれるのが好ましい。

飲食品形態の本発明組成物の具体例としては、例えば発酵乳、乳酸菌飲料、発酵野菜飲料、発酵果実飲料、発酵豆乳飲料などを挙げることができる。本明細書及び請求の範囲において、「発酵乳」および「乳酸菌飲料」なる用語は、旧厚生省「乳及び乳製品の成分などに関する省令」第二条 37 「はつ酵乳」および 38 「乳酸菌飲料」の定義に従うものとする。即ち、「発酵乳」とは、乳または乳製品を乳酸菌または酵母で発酵させた糊状または液状にしたものをいう。従つて該発酵乳には飲料形態と共にヨーグルト形態が包含される。また「乳酸菌飲料」とは、乳または乳製品を乳酸菌または酵母で発酵させた糊状または液状にしたものを主原料としてこれを水に薄めた飲料をいう。

発酵野菜飲料、発酵果実飲料および発酵豆乳飲料については後述するとおりである。

本発明組成物の他の飲食品形態の例としては、菌含有マイクロカプセル形態、固形食品形態 (顆粒、粉末 (発酵乳凍結乾燥粉末などを含む)、錠剤、発泡製剤、ガム、グミ、プディングなど)、前記発酵乳および乳酸菌飲料以外の乳製品などを挙げることができる。

医薬品形態の具体例としては、経口投与用製剤形態 (水溶液、乳化液、顆粒、粉末、カプセル、錠剤など)を挙げることができる。

これら飲食品形態及び医薬品形態への調製は、常法に従うことができる。またこれら各形態への調製に当たって用いられる担体は、可食性担体乃至製剤学的に許容される賦形剤、希釈剤などの担体のいずれでもよい。飲食品形態への調製およびその際利用できる可食性担体の詳細は、後記「飲食品形態組成物」の項において記述する。特に食品形態の場合は、口当たりのよい味覚改善効果のある担体が好ましい _t 医薬品形態及びその調製に利用できる製剤学的に許容される賦形剤及び希釈剤の詳細は、後記「医薬品形態組成物」の項において詳述する。

本発明組成物中への乳酸菌の配合量は、一般には、本発明組成物 100g中に、菌数が 10⁸〜10"個前後 (生菌数である必要はない。但し、死菌数を含む場合は、殺菌前の生菌数として計数するものとする。以下、同じ)となる量から適宜選択することができる。生菌数の測定は、菌培養用の寒天培地に希釈した試料を塗布して 37 t:下で嫌気培養を行い、生育したコロニー数を計測することにより算出する。この生菌数と濁度とは相関するため、予め生菌数と濁度との相関を求めておくと、生菌数の測定に代えて濁度を測定することによつて上記生菌数を計数できる。上記乳酸菌の配合量は、上記量を目安として、調製される本発明組成物の形態、利用する乳酸菌の種類などに応じて適宜変更することができる。

尚、本発明組成物は、乳酸菌（主に生菌）を含有させるものであるため、該組成物の製品化に当たっては、加熱、加圧などの条件の採用はあまり好ましくない。本発明組成物を例えば固形食品形態に調整するに当たっては、乳酸菌を凍結乾燥菌体として直接処方するか、凍結乾燥菌体を適当なコ一ティング剤で加工して用いるのが好ましい。

飲食品形態組成物

本発明組成物のとり得る好ましい飲食品形態としては、代表的には発酵乳、乳酸菌飲料、発酵野菜飲料、発酵果実飲料、発酵豆乳飲料などを挙げることができる。以下、発酵野菜飲料、発酵果実飲料および発酵豆乳飲料につき詳述すれば、これら各形態への調製は、乳酸菌の栄養源を含む適当な発酵用原料物質、例えば野菜類、果実類、豆乳 (大豆乳化液)などの液中で、乳酸菌を培養して該原料物質を発酵させることによって行うことができる。発酵用原料物質としての野菜類および果実類には、各種野菜および果実の切断物、破砕物、磨碎物、搾汁、酵素処理物、それらの希釈物および濃縮物が含まれる。野菜類には、カポチヤ、ニンジン、トマト、ピ一マン、セロリ、ホウレンソゥ、有色サツマィモ、コーン、ビート、ケ一ル、パセリ、キャベツ、ブロッコリ一などが含まれる。果実類にはリンゴ、モモ、バナナ、イチゴ、ブドウ、スイカ、オレンジ、ミカンなどが含まれる。

野菜および果実の切断物、破砕物および磨砕類は、例えば上記野菜類または果実類を洗浄後、必要に応じて熱湯に入れるなどのブランチング処理した後、クラッシヤー、ミキサー、フードプロセッサ一、パルパ一フィッシャー、マイコロイダ一 (Mycolloider™, 特殊機化工業社製)などを用いて切断、破砕、磨砕することによつて得ることができる。搾汁は、例えばフィルタープレス、ジューサーミキサーなどを用いて調製することができる。また上記磨砕物を濾布などを用いて濾過することによっても搾汁を調製することができる。酵素処理物は、上記切断物、破砕物、磨砕物、搾汁などにセルラーゼ、ぺクチナ一ゼ、ブロトべクチン分解酵素などを作用させることによって調製できる。希釈物には水で 1 -50倍に希釈したものが含まれる濃縮物には、例えば凍結濃縮、減圧濃縮などの手段によって 1 -100倍に濃縮したものが含まれる。

発酵用原料物質の他の具体例である豆乳は、常法に従い、大豆原料から調製することができる。該豆乳には、例えば、脱皮大豆を水に浸漬後、コロイドミルなどの適当な粉砕機を用いて湿式粉碎処理後、常法に従いホモジナイズ処理した均質化液、水溶性大豆蛋白質を水中に溶解した溶解液なども包含される。

乳酸菌を利用した発酵は、予めスターターを用意し、これを発酵用原料物質に接種して発酵させる方法が好ましい。ここでス夕一夕一としては、例えば代表的には予め 90-121 、 5-20分間通常の殺菌処理を行った発酵用原料物質、酵母エキスを添加した 10%脱脂粉乳などに、本発明乳酸菌を接種して培養したものを挙げることができる。このようにして得られるス夕一タ一は、通常、本発明乳酸菌を 10⁷-10⁹ 個/ g培養物程度含んでいる。

スターターに用いる発酵用原料物質には、必要に応じて本発明乳酸菌の良好な生育のための発酵促進物質、例えばグルコース、澱粉、蔗糖、乳糖、デキス卜リン、ソルビトール、フラクトースなどの炭素源、酵母エキス、ペプトンなどの窒素源、ビタミン類、ミネラル類などを加えることができる。

乳酸菌の接種量は、一般には発酵用原料物質含有液 1 mL中に菌体が約 1 x10⁶個以上、好ましくは 1 x10⁷個前後含まれるものとなる量から選ばれるのが適当である。培養条件は、一般に、発酵温度 20-45°C程度、好ましくは 25-37 程度、発酵時間 5- 72時間程度から選ばれる。

尚、上記の如くして得られる乳酸発酵物は、カード状形態（ヨーグルト様乃至プデイング用形態）を有している場合があり、このものはそのまま固形食品として摂取することもできる。該カード状形態の乳酸発酵物は、これを更に均質化することにより、所望の飲料形態とすることができる。この均質化は、一般的な乳化機 (ホモジナイザー)を用いて実施することができる。具体的には、該均質化は、例えばガウリン (GAULIN)社製高圧ホモジナイザ一 (LAB40)を用いて、約 200-1000kgf/cm²、好ましくは約 300-800kgf/cm²の条件で、或いは三和機械工業社製ホモジナイザー (品番： HAx4571， H20-A2など）を用いて、 150kg/cm²またはそれ以上の条件で実施することができる。この均質化によって、優れた食感、とくに滑らかさを有する飲料を得ることができる。尚、この均質化にあたっては、必要に応じて適当に希釈したり、 pH調整のための有機酸類を添加したり、また、糖類、果汁、増粘剤、界面活性剤、香料などの飲料の製造に通常用いられる各種の添加剤を適宜添加することもできる。好ましい添加剤とその添加量 ί力一ド状発酵物重量に対する重量％)の一具体例としては、例えばグルコース 8% (重量％、以下同じ)、砂糖 8%、デキス卜リン 8%、クェン酸 0.1 %、グリセリン脂肪酸エステル 0.2%および香料 0.1 %を挙げることができる。

かくして得られる本発明飲料は、適当な容器に無菌的に充填して最終製品とすることができる。該製品は、滑らかな喉ごしの食感および風味を有している。

その投与 (摂取)量は、これを摂取する生体の年齢、性別、体重、疾患の程度などに応じて適宜決定され、特に限定されるものではない。一般には乳酸菌量が約 10⁶- 10⁹個/ mLとなる範囲から選ばれるのがよい。該製品は一般にその約 50-1 ,000mLを 1 日ヒト 1人あたりに摂取、服用させればよい。

食品形態の本発明組成物の他の具体例としては、発泡製剤形態のそれを挙げることができる。このものは、本発明乳酸菌 (菌体凍結乾燥物) 0.01 -50% (重量％、以下同じ)に、炭酸ナトリウムおよび（または）炭酸水素ナトリウム 10-35%と中和剤 20-70%とを発泡成分として配合することによつて調製できる。ここで用いられる中和剤は、上記炭酸ナトリゥムおよび炭酸水素ナトリゥムを中和させて炭酸ガスを発生させ得る酸性化合物である。該化合物には、例えば代表的にはし酒石酸、クェン酸、フマル酸、ァスコルビン酸などの有機酸が包含される。

上記発泡成分の本発明発泡製剤中への配合割合は、得られる本発明製剤を水に溶解させた場合に、溶液が酸性、特に pH約 3.5-4.6程度の酸性を呈するものとなる割合とするのがよい。より具体的には上記割合は炭酸ナトリウムおよび（または）炭酸水素ナトリウム 10-35%および中和剤 20-70%の範囲から選択されるのがよい。特に炭酸ナトリゥムは 11 -31 %、好ましくは 22-26%、炭酸水素ナトリゥムは 10-35%，好ましくは 20-30%の範囲から選ばれるのがよい。その内でも炭酸水素ナトリゥムを単独で 20-25%の範囲で用いるのが最も好ましい。また中和剤は、 20-70%、好ましくは 30-40%の範囲から選択され、特にし酒石酸を 20-25%およびァスコルビン酸を 8-15%の範囲内で使用するのが最も好ましい。

本発泡製剤は、本発明乳酸菌および発泡成分を必須成分として、他に通常知られている各種の添加剤成分、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、表面活性剤、浸透圧調節剤、電解質、甘味料、香料、色素、 pH調節剤などを必要に応じて適宜添加配合されていてもよい。上記添加剤としては、例えば小麦澱粉、馬鈴薯澱粉、コーンスターチ、デキストリンなどの澱粉類；ショ糖、ブドウ糖、果糖、麦芽糖、キシロース、乳糖などの糖類；ソルビトール、マンニトール、マルチト一ル、キシリトールなどの糖アルコール類；カップリングシュガー、パラチノースなどの配糖体；リン酸カルシウム、硫酸カルシウムなどの賦形剤；澱粉、糖類、ゼラチン、アラビアガム、デキストリン、メチルチセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、キサンタンガム、ぺクチン、トラガントガム、カゼイン、アルギン酸などの結合剤乃至増粘剤；ロイシン、イソロイシン、レバリン、シュガ一エステル、硬化油、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、マクロゴールなどの滑沢剤；結晶セルロース (旭化成社製「アビセル」登録商標)、カルポキシメチルセルロース (CMC)、カルボキシメチルセルロースナトリゥム (CMC-Na)、カルポキシメチルセルロースカルシウム

(CMC-Ca)などの崩壊剤；ポリオキシエチレンソルビ夕ン脂肪酸エステル (ポリソルベ一ト)、レシチンなどの表面活性剤；ァスパラテーム、ァリテームなどのジぺプチド；その他ステビア、サッカリンなどの甘味料などを例示できる。これらは必須成分との関係や製剤の性質、製造法などを考慮してその適当量を適宜選択して用いることができる。

更に、本発明発泡製剤中には、ビタミン類、特にシァノコバラミンやァスコルビン酸 (ビタミン C)などの適当量を添加配合することができる。その配合割合は、特に限定はないが、通常ビタミン Cでは 30%までの量、好ましくは約 5-25%の範囲から選ばれるのが好ましい。

本発明発泡製剤の製造法は、基本的には通常のこの種発泡錠剤の製造法と同様とすることができる。即ち、発泡錠剤形態の本発明製剤は、所定量の各成分を抨量、混合し、直接粉末圧縮法、乾式または湿式顆粒圧縮法などに従って調製することができる。

かくして得られる本発明製剤は、これを水中に投入するだけで、経口投与に適した飲料形態となり、これは経口投与される。

その投与 (摂取)量は、これを適用すべき生体の年齢、性別、体重、疾患の程度などに応じて適宜決定され、特に限定されるものではないが、一般には 1錠約 1.5- 6.0qに調製された本発明発泡錠剤の 1 -2錠を 1回に水 100-300mLに溶かして服用させればよい。

医薬品形態組成物

本発明組成物は、有効成分とする本発明乳酸菌と共に、製剤学的に許容される適当な製剤担体を用いて、一般的な医薬製剤組成物の形態に調製されて実用される。該製剤担体としては、通常、この分野で使用されることの知られている充填剤、增量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤あるいは賦形剤を例示できる。これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される _c 上記医薬製剤の投与単位形態としては、各種の形態が選択できる。その代表的なものとしては錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤などが挙げられる。

錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セル口 —ス、ケィ酸、リン酸カリウムなどの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルポキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤；カルポキシメチルセル口一スナトリウム、カルポキシメチルセルロース力ルシゥム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウムなどの崩壊剤；ポリオキシエチレンソルビ夕ン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリゥム、ステアリン酸モノグリセリドなどの界面活性剤；白糖、ステアリン、カカオバタ一、水素添加油などの崩壊抑制剤；第 4級アンモニゥム塩基、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤；グリセリン、デンプンなどの保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケィ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤などを使用できる。

更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤；ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤などを使用できる。

更に、本発明製剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品を含有させることもできる。

本発明製剤中に含有されるべき本発明乳酸菌の量は、特に限定されず広範囲より適宜選択される。通常、医薬製剤中に約 10⁷-10¹²個/投与単位形態程度含有されるものとするのがよい。

上記医薬製剤の投与方法は特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤は経口投与される。

上記医薬製剤の投与量は、その用法、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などにより適宜選択されるが、通常有効成分である本発明乳酸菌の量が 1日当り体重 1 kg当り約 0.5-20mg程度とするのがよく、該製剤は 1日に 1 -4回に分けてヒトに投与することができる。

尚、本発明組成物はその摂取（投与）によって、該組成物中の乳酸菌が下部消化管に常在菌として定着でき、かくして乳酸菌本来の効果、例えば整腸作用、腸内細菌叢改善作用などをも奏し得る。特に好ましい製剤は、腸溶性錠剤形態であり、これによれば胃酸による侵襲を受けることなく乳酸菌を腸に到達させることができる _c 本発明乳酸菌およびこれを含む組成物は、その摂取乃至投与によってヒトの粘膜免疫賦活および IgA産生促進を図り得るものである。従って、本発明はまた、粘膜免疫賦活を要求されるヒトに、本発明乳酸菌を摂取させて、該ヒ卜の粘膜免疫を陚活する方法；粘膜免疫賦活を要求されるヒトに、本発明組成物を摂取させて、該ヒ卜の粘膜免疫を賦活する方法； IgA産生促進を要求されるヒトに、本発明乳酸菌を摂取させて、該ヒトにおける IgA産生を促進する方法；および IgA産生促進を要求されるヒ卜に、本発明組成物を摂取させて、該ヒトにおける IgA産生を促進する方法をも、提供するものである。

更に、本発明はヒトの粘膜免疫賦活のための、本発明乳酸菌の使用；ヒトの粘膜免疫賦活のための本発明組成物の使用；ヒトの IgA産生促進のための、本発明乳酸 . 菌の使用；およびヒ卜の IgA産生促進のための、本発明組成物の使用をも提供する。加えて、本発明は、本発明組成物の製造のための本発明乳酸菌の使用をも提供する。

発明の効果

本発明は、優れた IgA産生誘導能を有し、ヒトの粘膜免疫、特に腸管免疫の賦活作用の改善、および生体防御作用の強化に有効な新しい乳酸菌およびこれを含む組成物、殊に食品または医薬品形態の該組成物を提供する。

図面の簡単な説明

図 1は、本発明乳酸菌の投与が、パイエル板細胞からの IgA産生に及ぼす結果を示すグラフである。

図 2は、本発明乳酸菌の投与が IgG産生に及ぼす影響を明らかにするグラフである。

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例および試験例を挙げる。

実施例 1

以下、本発明組成物の処方例を実施例として示す。

(1 ) 発酵豆乳飲料の調製

下記処方の各成分を抨量混合して、飲料形態の本発明組成物を調製した。

ラクトバチルス ONRIC b0239発酵豆乳 100mL

乳果ォリゴ糖 (55%含量） 10.Og

ビタミン，ミネラル適量

香料適量

水適量

全量 150mL

上記ラクトバチルス ONRに b0239発酵豆乳は、豆乳（蛋白質含量 5g/100mL程度） 1 Lに、ラクトバチルス ONRIC b0239 (FERM BP-10064)を 10⁸個加えて、 37 で 48時間発酵させたものである。その菌体含量は 1 x10⁹個/ mLである。

(2) 発酵乳の調製

下記処方の各成分を抨量混合して、発酵乳形態の本発明組成物を調製した。乳果オリゴ糖（55%含量） 10.0g

ラクトバチルス ONRに b0240発酵乳 100mL ビタミン · ミネラル

香料適量

水適量 .

全量 150mL

尚、ラクトバチルス ONRIC b0240発酵乳は、牛乳 1 Lにラクトバチルス

ONRICb0240 (FERM BP-10065)10⁸個を加え、 37 :で 24時間発酵させたものである。その菌体含量は 1 χ10⁸個/ mLである。

(3) 発酵乳凍結乾燥粉末の調製

ラクトバチルス ONRIC b0239 (FERM BP-10064)約 10⁷個/ mLの 1 mLを用いて、牛乳 100gを 37 で 24時間乳酸発酵させた後、得られた発酵産物 (菌体を含む)を凍結乾燥して粉末とした。

上記粉末を用いて、下記処方の各成分を秤量混合して、発酵乳凍結乾燥粉末形の本発明組成物を調製した。その菌体含量は 1 χ10⁹個/ gである。

ラクトバチルス ONRに b0239発酵乳凍結乾燥粉末 2.2g

賦形剤適 *

ビタミン · ミネラル適量

香料適量

全量 20g

尚、陚形剤としては、コーンスターチ 17gを用いた。

(4) 粉末の調製

下記処方の各成分を秤量混合して、粉末形態の本発明組成物を調製した。

カゼイン 4.5g

乳果ォリゴ糖 (55%含量） 10.Og

ラクトバチルス ONRに b0240凍結乾燥粉末 1 .0g

ビタミン · ミネラル適量

香料適量

全量 20g

尚、ラクトバチルス ONRに b0240凍結乾燥粉末は、ラクトバチルス ONRに b0240 (FERM BP-10065)を増殖可能な発酵用原料物質である 10%スキムミルク水溶液中で培養 (37 ：、 24-48時間)した後、凍結乾燥することによって得られたものであり、その菌体含量は 10⁹-10^1G個/ gである。

(5) 顆粒の調製

下記処方の各成分を秤量混合して、顆粒形態の本発明組成物を調製した。

乳果オリゴ糖 (55%含量） 10.0g

ラクトバチルス ON C b0240凍結乾燥粉末 '1.0g

ソルビトール適量

ビタミン 'ミネラル適量

香料適量

全量 20g

尚、ラクトバチルス ONRIC b0240凍結乾燥粉末としては、実施例 1 -(4)と同一のものを用いた。

(6) 菌含有マイクロカプセルの調製

ラクトバチルス ONRに b239 (FERM BP-10064)を実施例 1 -(4)と同様にして凍結乾燥して得られた凍結乾燥粉末 6x10^{1 Q}個/ gを、融点 34 のヤシ硬化油を融解した中に乳果オリゴ糖と共に分散して、乳酸菌、油脂およびオリゴ糖の混合比が 25%、 70%および 5%である融解物を調製した。このものを同心三重ノズルの内側ノズルから平均流速 0.3m/sで、更にその外側の中間ノズルから融点 43tのヤシ硬化油と大豆硬化油との混合物の融解液を平均流速 0.3m/sで、また最外側ノズルから皮膜となるゼラチンぺクチン溶液（85/15v/v)を平均流速 0.3m/sで、それぞれ冷却され流動している油中に同時に滴下させることにより直径 2.5mmの三層構造のシ一ムレスカプセル (1 .4x10⁹個/ gカプセル)を試作した。

このものの内容物、内皮膜および該皮膜の重量比は 35:35:30であった。

このカプセルを通気乾燥後、更に真空乾燥または真空凍結乾燥を行うことによりカプセル中の水分活性を Aw値 0.20以下および熱伝導率 0.16kcal/mhで以下にまで低下させた。尚、 Aw値は電気抵抗式水分活性測定装置（Awメーター、 WA-36C 株式会社芝浦電子製作所）にて測定されたものである。また、熱伝導率はフィッチ (Fitch)法で測定したものである。実施例 2

この例は、本発明乳酸菌の IgA産生誘導能を、 Yasuiらおよび Ikenagaらに記載の方法 CYasui, Η·， et al., Microbial Ecology in Health and Disease, 5， 155 (1992); Ikenaga, T.， et al" Milk Science, 51， 27 (2002)〕に従つてパイエル板細胞培養系を用いて/ n Wiroで試験した例であり、次の通り実施された。

(1 ) 供試動物

近交系雌性マウス SPF/VAF BALB/c AnNCrjを使用した。

試験マウスを入荷後、 1週間検疫した。検疫期間中は MF固形飼料 (オリエンタル酵母社製)および水道水を自由摂取させた。

(2) パイエル板細胞培養法

検疫終了後、各群の体重が均等になるように 80匹のマウスを 10匹ずつ群分けした。群分け後、毎日 10匹のマウスを屠殺し、小腸を取り出し、小腸外側表面にあるパイエル板を切り出し、 MEM培地 [Eagle's MEM (NISSUI社製)、 2mM glutamine (G旧 CO社製)、 1 mM sodium pyrubate (G旧 CO社製)、 MEM nonessential amino acids (G旧 CO社製)]を添加した遠沈管中で氷冷した。メッシュを用いて単一細胞懸濁液を調製し、 5mLの MEM培地でよく洗い込んだ。細胞懸濁液を濾過し、 4で下、 1 ,000回転/分、 10分間遠心処理を行った。遠心後、培養上清を吸引除去し、沈殿を 5mLの MEM培地に懸濁させた。同様の操作を 2回繰り返した後、沈殿を 10mLの

5%FBS (G旧 CO社製)含有 MEM培地に懸濁させ、パイエル板細胞の生細胞数を計数し、細胞浮遊液を 96ゥエル細胞培養用プレートに播いて細胞培養用プレートを調製した。

(3) 供試菌体の調製

本発明乳酸菌として、ラクトバチルス ONRIC b239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス ONRに b240 (FERM BP-10065)を利用した。各菌は、それぞれその培養に適した培地にて定常期まで培養後、遠心して菌体を集菌した (7,000gx10分間、 4°C)。 PBS (-)にて 3回洗浄後、菌体を 5mLの生理食塩水に懸濁させた。菌数を把握するため 660nmにて濁度を測定し、その後、オートクレープにて 100でで 30分間加熱滅菌処理した。 660nmにおける濁度が 1 .0のとき菌数を 2.0x10⁹/mLとした。

1 )培養上清中の !gA濃度の測定上記 (1)で調製したパイエル板細胞を 5%FBS含有 MEM培地に懸濁させて、

2.5x10⁶細胞/ mLに調整し、その 200μΙ_を 96ゥエル細胞培養用プレートに入れた。このプレートの各ゥエルに 2.0x10⁹/mLの供試菌体懸濁液（前記 (3)で調製したもの）を 20/LiL添加し、 37 、 5%C0₂下で 7日間培養した。

上記菌体 20μΙ_に代えて、 50/jg/mLの LPS (Lipopolysaccharide)を 20jL L添加したものを陽性対照とした。

次いで、得られた各培養物上清の総 IgA濃度を市販キットを用いた ELISA法により測定した。

(5) 本発明乳酸菌の ΙαΑ産生促進活性

前記 (4)に従って測定された本発明乳酸菌における総 IgA量を、対照としての MEM 培地に PBS(-) 10 iLを添加して（菌体無添加）同様にして 7日間培養して得た培養物上清の同測定値を基準 (1.0)として、その相対比 (Stimulation Index; S丄)にて、下記表 1に示す。

表 1〜表 4には、既知の各種乳酸菌などについて行った同一試験の結果を併記する。また陽性対照 (LPS 50 ig/mL)における試験結果を「陽性対照」として併記する。表中、 Strain No.に示される微生物保存機関の略号と名称は、それぞれ以下の通りである。

ATCC: アメリカンタイプカルチヤ一コレクション（American Type Culture

Collection; Manassas, VA， U.S.A.)

JCM: 理化学研究所微生物系統保存施設（Japan Collection of Microorganism, The Institute of Physical and Chemical Research, RIKEN)

NRIC: 東京農業大学応用生物化学部菌株保存室（NODAI Culture Collection Center, Tokyo University of Agriculture; Setagaya-ku, Tokyo, Japan) 表 1

1 (続く）

表 2 irain NO. spices SUDSp. igM .i.

INr lU 1 LBCTODaCIIIUS C S6I C S&I 1. nuou ΐ πΐυ Toy L ClODaCIIIUS casei case/ u.yb ΐΜπΐυ ，yi / L3CT0D3CIIIUS casei casei i.Ul

Ι ΗΙし Ι¾ ΐ LQCtODSClllUS C S6I 1.02

I HIU ，9t LBCT0D3CIIIUS cssei cssei i.UU

Ι ΗΙし ΊίίΌθ LQClODBCIIIUS case/ casei 1 -UO

ΝΗΙし 19οο L CTOD CIIIUS casei casei 1.07

LQClODBCIIIUS CUrvBlUS 1

I ID画^^ Η Q7C LBCTODQCIIIUS CUrVdXUS 1.14

LBCTOD CIHUS CUrvBlUS 1.U4

I HIU π9 ο LBCTODaCIIIUS CUiV TUS 1.11 HIし 1979 LQCtobBcillus curvstus U.99

NnlU 0191 Lactobacillus delbrueckii bulgaricus 1.U7

ΝΗΙし 1οο2 Lactobacillus oeiDruecKii lactis

rr HIU \ O L3CT0D3CIIIUS TQitneniu n 1.UU

Ι ΗΙΟ Ul l L CXODQCIIIUS ΤΘΓΓΠΘΠΐυΓΠ l .iy

Ι Ηΐυ Uld LQCtODQCIIIUS TerrnsnTurn 1.U

ΙΝΜΙし U ΙΟΟ LBClODBCIIIUS ΤΘΓΓΠΘΠΐυΓΠ 1.U i iiし ui y L ClODaCHIUS T&rrneniuni に 14

JL^し £C^L/clし〃/ L/ Hcfl ILUI

NRIC 0142 Lactobacillus fermentum 0.94

NRIC 0143 Lactobacillus fermentum 1.04

NRIC 0144 Lactobacillus fermentum 0.97

NRIC 0145 Lactobacillus fermentum 1.09

NRIC 0146 Lactobacillus fermentum 1.05

NRIC 0147 Lactobacillus fermentum 1.05 2 (続く）

MP | Q^Q

LaOlOD CillUS T&rrnenLurn 1 nQ

I .uy i iiし l yo^ aClODQCillUS TGr eniurn 1.uo

I nlU lyoo L CTODaCIIIUS TerrnsnTuni Ί Ί

MDi * Λ Odd L CT0D3CIIIUS nilgarQll u.y4

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I HIし \Ό Ό LBCTOD3CIIIUS pBrBCBSGI u.yo

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INHIし \Ό ί L ClODQCIIlUS pBiQC3S6l pBr3C3Sel u.y4

Ι ΠΙし aCWUaCIIIUS paiaVaoSl

NRIC 1944 Lactobacillus paracasei paracasei 1.00

NRIC 1945 Lactobacillus paracasei paracasei 0.98

NRIC 1946 Lactobacillus paracasei paracasei 1.01

NRIC 1934 Lactobacillus paracasei tolerans 1.09

NRIC 1935 Lactobacillus paracasei tolerans 1.03

NRIC 1938 Lactobacillus paracasei tolerans 1.03

表 3

Strain No. Genus spices subsp. IgA S.I.

NRIC 1939 Lactobacillus paracasei tolerans 1.01

NRIC 1940 Lactobacillus paracasei tolerans 1.01

NRIC 1943 Lactobacillus paracasei tolerans 0.99

NRIC 1947 Lactobacillus paracasei tolerans 0.98

NRIC 0391 Lactobacillus pentosus 1.00

NRIC 0392 Lactobacillus pentosus 1.04

NRIC 0393 Lactobacillus pentosus 1.19

NRIC 0394 Lactobacillus pentosus 1.15

NRIC 1919 Lactobacillus plantarum 1.32

NRIC 1920 Lactobacillus plantarum 1.08

NRIC 1921 Lactobacillus plantarum 1.14

NRIC 1922 Lactobacillus plantarum 1.37

NRIC 1923 Lactobacillus plantarum 0.96

NRIC 1957 Lactobacillus plantarum 1.01

NRIC 1958 Lactobacillus plantarum 1.31

NRIC 1715 Lactobacillus reuteri 0.95

NRIC 1974 Lactobacillus reuteri 1.16

NRIC 1980 Lactobacillus reuteri 1.31

NRIC 1599 Lactobacillus sakei 0.97

NRIC 1600 Lactobacillus sa ei 1.52

NRIC 1601 Lactobacillus sakei 1.07

NRIC 1602 Lactobacillus sakei 1.37

NRIC 1603 Lactobacillus sakei 1.03

NRIC 1575 Leuconostoc lactis 0.85

NRIC 1576 Leuconostoc lactis 0.92

NRIC 1578 Leuconostoc lactis 1.00 3 (続く）

表 4

表 4 (続く）

表"!〜 4に示されるとおり、対照 (PBS)の IgA産生を 1とした場合、陽性対照の平均 S丄は、 13.1を示し、 IgA産生を強く誘導していることが判った。よって本培養系はパイエル板細胞からの IgA産生を評価する上で有用であると判断した。

各種乳酸菌による IgA産生誘導能を見ると、本発明乳酸菌の S丄は、 ONRIC b0239が 5.61、 ONFMC b0240が 6.31であり、他の菌株の 0.8〜1 .4に比べて突出して高い IgA産生誘導能を有することが判った。

IgAは病原微生物の粘膜からの侵入阻止、ウィルス ·毒素の中和、食物アレルゲンの侵入阻止などの働きをしており、このような IgAを高めておくことは生体防御の上で重要である。

実施例 3

この例は、本発明乳酸菌の IgA産生誘導能を/ n wVoで試験したものであり、次の通り実施された。

(1 )供試動物およびその飼育

8週齢 BALB/c雄性マウス 50匹を入荷後、 1週間検疫した。検疫期間中および引き続く試験期間中、実験動物には MF固形飼料 (オリエンタル酵母社製)および水道水を自由摂取させた。

検疫終了後、各実験動物を生理食塩水投与群（15匹）、本発明乳酸菌（生菌）投与群（15匹）および本発明乳酸菌（死菌）投与群（15匹）に群分けた。

(2)経口投与用本発明乳酸菌の調製

経口投与用の本発明乳酸菌（生菌）および本発明乳酸菌（死菌）は、それぞれ以下の方法により調製した。生菌：

Lactobacillus plantarum b0240(FERM BP-10065, 以下、単に「b0240」という）を MRS培地にて定常期まで培養した後、遠心 (3,500回転 Z分 X 10分、 4 :)にて集菌した。生理食塩水にて 2回遠心洗浄後、菌体を生理食塩水に懸濁して、 4 X 1 0⁹

CFU/mLに調整した。

死菌

上記で得た生菌懸濁液を、ォ一トクレーブ (121 ，15分加熱)処理後、洗浄用ソニケ一夕一 (BRANSON 2510)で 45分間超音波処理を行った。

(3)試験方法

上記 (2)で調製した本発明乳酸菌（生菌および死菌）のそれぞれを、試験開始より 7日間（5匹）、 14日間（5匹）または 21日間（5匹）に亘つて、本発明乳酸菌 (生菌）投与群（5+5+5=15匹）および本発明乳酸菌（死菌）投与群（5+5+5=15 匹）の各群マウスに、毎朝、経口投与 (10⁹ CFU/250/iL/匹/日）した。各投与期間終了後に、各群マウスを断頭屠殺してチューブに採血し、 4^下、 3000回転/分、 10分間遠心分離して血清を調製した。また、以下の方法によりパイエル板細胞を調製した。即ち、各群マウスを屠殺後、小腸を摘出し、これを眼科用ハサミで小腸外側表面からパイエル板を切り出し、不完全培地 (incomplete medium; 10mg Gentamycin 添加 RPMI1640培地)を添加した 24ウェルマイク口プレートに入れて氷冷した。メッシュを用いて単一細胞懸濁液を調製し、 5mLの不完全培地で良く洗った。得られた細胞浮遊液を濾過し、 4t:下、 1 ,000回転 Z分で 10分間遠心分離処理した。遠心分離処理後、培養上清を吸引除去し、沈殿を 5mLの不完全培地に懸濁させた。上記洗浄、濾過、遠心分離、培養上清の吸引除去操作を、更に 1回繰り返した後、得られた沈殿をパイエル板細胞とした。

また、コントロールとしての生理食塩水投与群（15匹）のマウスは、本発明乳酸菌（生菌および死菌）を与えることなく飼育し、同様に試験開始より 7日間 (5匹)、 14日間 (5匹)および 21日間 (5匹)後に、血清およびパイエル板細胞を調製した。

IqA産生試験

調製した各パイエル板細胞（沈殿）を、 0.5mLの完全培地 (2mMしグルタミン、 50/J メルカプトエタノール、 100U/mLペニシリン、 10C¾ug/mLストレプトマイシン、 10%FBS添加 RPMI1640培地)に懸濁させて、細胞濃度を 2 X 10⁶細胞/ mLに調整し、生細胞数をカウント後、細胞浮遊液を 100 Iずつ 96ゥエル細胞培養用プレートの各ゥエルに播種した。

パイエル板細胞が産生する IgA量は、パイエル板細胞をそのまま培養し、産生される IgA量を調べる方法と、この培養系に更にパイエル板細胞刺激物質として本発明乳酸菌（死菌）を添加して培養し、産生される IgA量を調べる方法との 2つの方法により検討した。後者の方法は、実際の生体内におけるパイエル板細胞の環境に近いものと想定される。即ち、この試験で本発明乳酸菌（生菌または死菌）を経口投与する場合は、摂取された乳酸菌は何らかの形でパイエル板細胞に刺激を与えることが予想される。

パイエル板細胞刺激物質としての本発明乳酸菌（死菌）は、下記方法に従って調製した。

パイエル板細胞刺激用本発明乳酸菌 (死菌）

前記で調製した経口投与用の本発明乳酸菌 (生菌)の懸濁液を、更にリン酸バッファ一で菌数が 10⁷CFU/mL(660nmでの濁度 0.275)となるように希釈し、得られた菌体懸濁液を、オートクレープ (121で， 15分加熱)処理後、洗浄用ソニケ一夕一

(BRANSON 2510)で 45分間超音波処理した。

パイエル板細胞刺激物質を利用する方法は、パイエル板細胞刺激用本発明乳酸菌 (死菌) 10μ1_を各ゥエルに添加し、さらに FCSを含まない RPM11640を 100μΙ_各ゥェルに添加し、 37 ：、 5%C0₂下で 7日間パイエル板細胞を培養した。パイエル板細胞刺激物質を利用しない方法では、上記本発明乳酸菌 (死菌)の代わりに 10 /Lの生理食塩水を各ゥエルに添加して、以下同様の操作によってパイエル板細胞を培養した。

(4)測定

細胞培養液から遠心分離にて培養上清を回収し、該培養上清中に分泌される総 IgA濃度の測定に供するまで- 80でで凍結保存した。

上記培養上清中の総 IgA濃度の測定および血清中の総 IgG濃度の測定は、いずれも市販のキットを用いた EUSA法により測定した。

(5)結果

結果を図 1 (!gA濃度)および図 2(lgG濃度)に示す。図 1は、培養上清中の IgA濃度（ g/mL) を示す棒グラフである。図中、白抜き棒は、コントロールとしての生理食塩水投与群（「生理食塩水」と表示）の結果である。網掛け棒は、本発明乳酸菌 (b0240生菌)投与群（「b0240生菌」と表示）の結果である。黒塗り棒は、本発明乳酸菌 (b0240死菌)投与群（「b0240死菌」と表示）の結果である。無刺激は、各群マウス由来のパイエル板細胞の培養系に本発明乳酸菌 (死菌)を添加することなく培養した場合を示す。菌体刺激は、各群マウス由来のパイエル板細胞の培養系に本発明乳酸菌 (死菌)を添加して該菌の刺激下に培養した場合を示す。各結果は、各群供試マウス 5匹について得られた結果を平均土標準偏差 (Mean土 SD)で表示する。各結果の上に表示した P値は、スチューデンッ t-テスト (Student t-test)におけるコントロールに対する危険率を示す。

該図に示される結果から、次のことが明らかである。

(1) 7日間投与の場合：

菌体刺激の場合、本発明乳酸菌（死菌）投与群は、生理食塩水投与のコント口 —ルょりも有意に高値を示した (P=0.010)。

(2) 14日間投与の塲合：

無刺激の場合、本発明乳酸菌（死菌）投与群（無刺激の黒塗り棒参照）は、コントロール（生理食塩水投与後無刺激）よりも、有意に高値を示した (P=0.048)_c また、菌体刺激を行った場合は、本発明乳酸菌（死菌）を投与した群および本発明乳酸菌（生菌）を投与した群のいずれも、コントロール（生理食塩水投与）に比して有意に高値を示した (それぞれ P=0.034および P=0.002)。更に、

(3) 21日間投与の場合：

無刺激の場合、本発明乳酸菌（死菌）を投与した群は、コントロール群よりも有意に高値を示した (P=0.047)。

また、菌体刺激を行った場合、本発明乳酸菌（生菌）投与群および本発明乳酸菌（死菌）投与群は、コントロール群よりもいずれも有意に高値を示した (それぞれ P=0,015および Ρ=0·005)。

図 2は、本発明乳酸菌（死菌）の 21日間投与が IgG産生に及ぼす影響を明らかにする棒グラフであり、縦軸は血清 IgG濃度（； ug/mL) を示す。

該図に示される結果から、本発明乳酸菌 (死菌)の投与は、コントロール（生理食塩水投与）に比して有意に高い血清 IgG濃度を示すことが判る（P=0.0064)。また本発明乳酸菌 (生菌)の投与も、コントロール（生理食塩水投与）に比して、高い血清 IgG濃度を示すことが判る。

以上の結果より、本発明乳酸菌は、パイエル板に存在する免疫担当細胞あるいは腸管上皮細胞とその周辺の免疫担当細胞を刺激することで粘膜免疫応答を誘導し、最終的にパイエル板細胞からの総 IgA産生を高めたものと推定される。また、本発明乳酸菌の投与は、 IgAのみならず血清中の IgGも高めることが判った。これらのことから、本発明乳酸菌の摂取は、粘膜免疫のみならず全身免疫も賦活し、これらの 2段構えで生体の免疫応答を賦活し、体の内と外から生体を防御する可能性が示唆される。このような作用が生菌のみならず死菌においても認められることから、本発明乳酸菌は、経口ワクチン的なプロバイオテイクスの新たな活用法として期待できるものと考えられる。

実施例 4

この試験は本発明乳酸菌の摂取がインフルエンザ下気道感染の防御に有効であることを明らかにするものである。

粘膜免疫は、粘膜上に病原体が付着した際の最初に行われる感染防御機構である (Brandtzaeg, P. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 146:13 1989) 。粘液中の分泌型 IgA(S-lgA)は、バクテリア、ウィルスなどの病原体に対する防御作用を示す

(Czinn, S, J，. et al Vaccine 1 1 :637 1993; Renegar, K. et al J. Immunol. 146:1972 1991 ) とともに、微生物の産生する毒素を中和する役割も担っている

(Brandtzaeg, P APMIS 103:1 1995; Kilian, M. et al Microbiol. Rev. 52:296 1988) ' 近年、感染症に対する医薬品において、粘膜免疫機構を介した感染防御効果を狙つた研究開発が盛んに行われている。インフルエンザ感染は、免疫系の未発達な小児、免疫機能の低下した高齢者などにおいて死亡例が高く、これまでのワクチンに代わるより有効なワクチンの開発が望まれている。具体的には、インフルエンザは、毎年流行型が変わることから、現行の経皮投与で産生される特異性の高い IgGから、ウィルス侵入部位の粘膜免疫で産生される特異性のゆるやかな IgAを介した粘膜ヮクチンの開発が種々試みられている。乳酸菌を用いた発酵乳を代表とする食品についても、 S-lgAを介した感染防御作用が報告されている。例えば、 Yasuiらは乳幼児下痢症の主要起因ウィルスであるロタウィルスのマウス感染実験を実施し、母親マウスに B. ibreレ e YIT4064株を摂取させ、次いで母親マウスの母乳を子マウスに摂取させた結果、子マウスの下痢症が抑制されることを報告している（H. Yasui et al Infect. Dis. 172:403. 1995) 。また、 Yasuiらは、気道粘膜 S-lgA、血清 IgGの液性免疫および細胞性免疫が関与するィンフルェンザ感染に対する S.わ rev/e YIT4064株の感染防御作用が、血中の特異的 IgGの上昇によるものとも報告している（H. Yasui et al Clin. Diagn. Lab. Immunil. 6:186 1999) 。

本発明者らは、乳酸菌の IgAを介した感染防御効果を明らかにするため、インフルェンザウィルス (IFV)を下気道にまで到達させる下気道感染モデルマウスを用いて、本発明組成物 (本発明乳酸菌を利用して調製した発酵乳)の摂取による感染防御効果を、感染後の生存日数を指標として検討した。本試験は以下の通り実施された <

(1 )供試動物

日本チヤ一ルス ·リバー株式会社より入荷した近交系雌性 SPF/VA/VAFマウス (系統名： BALB/c AnNCrj)(5週齢)を 4日間、以下の条件で検疫後、体重による群分け（蒸留水群、牛乳群および本発明乳酸菌含有発酵乳群）を行った。

餌 Z給餌法： MF固形飼料 (オリエンタル酵母株式会社） Z 自由摂取

水給水法：水道水給水瓶による自由摂取

環境：温度： 23 ±2° C、湿度： 60 ± 10%

照明時間：明期 7:00〜19:00、喑期 19:00〜7:00

(2)試験方法

各群マウス (n=45)に、 MF固形飼料（オリエンタル酵母社製）と共に、被験物 ((1 ) 蒸留水、（2)牛乳または (3)本発明乳酸菌含有発酵乳)を、 2週間摂取させた。

被験物としての牛乳は、 LL牛乳 (大阿蘇牛乳：らくのうマザーズ社製)を蒸留水で 75° /。に希釈して利用した。被験物としての本発明乳酸菌含有発酵乳は、 10%スキムミルク水溶液に懸濁し- 80 で凍結保存しておいた L .plantarum ONRIC b0240をス夕一夕一として、牛乳 1 Uこス夕一夕一 (生菌数 10⁸個)を加え、 33でで 16時間発酵させたものである。本発明乳酸菌含有発酵乳の菌体含量は 5χ10⁷個/ mLである。これを蒸留水で 75%に希釈して試験に利用した。

被験物は給水瓶による自由摂取とし、摂取量は摂取前後の被験物の重量減少量とした。摂取開始 2週間後に、各群実験動物をケタラールにより麻酔後、その一方の鼻腔に IFV液 50 Lを経鼻接種 (10、 10²または 10³pfu/50 jL PBS/匹、それぞれの濃度における n=15)して、 IFVをマウスに感染させた。その後、各群実験動物の生死を毎日観察した。被験物は感染後から死亡を確認するまで与え続けた。

使用 IFV株としては、大塚製薬株式会社微生物研究所に保存されている IFV:

A/PR/8/34/H1 N1株を用いた。該株を 0.1 %BSAおよび 10mM HEPESを含有する

MEM培地に懸濁させ、次いで PBS(+)を用いて 10〜10³pfu/5(¾uLとなるように希釈し、 IFVの接種用ウィルス液を調製した。なお、 PBS(+)は PBS (-)粉末（コ一ジンバィォ社製） 9,55g、 CaCI₂ (無水） 100,00mgおよび MgCI₂ (無水） 46.90mgを蒸留水に溶解して 1 ,000mLとして調製した。

結果

各群マウスの生存日数を、 IFV経鼻摂取後、毎日朝（8:30-9:00) および夕方

(17:30-18:00)の二回、確認した。

その結果、蒸留水を摂取させたコントロール群および牛乳を摂取させた対照群では、接種ウィルス量を 10²pfu/匹とした場合、いずれも 7日目までに全例が死亡した _c 接種ウィルス量を 10³pfu/匹とした場合、いずれも 6日目夕方までに全例が死亡した。これに対して、本発明乳酸菌含有発酵乳を摂取させた群では、コントロール群に対して、実験動物の生存日数を延長する傾向が認められた。

また、接種ウィルス量を 10pfu/匹とした場合、全ての群において 14日目で 70%以上が生存しており、本発明乳酸菌含有発酵乳を摂取させた群では、 86.7%が生存しており、コントロール群のそれ (80%)に対して、生存率を延長させる傾向が認められた。

また、各群マウスの体重を被験物摂取開始から感染日までは 2日毎に、感染後は毎朝（8:30-9:00) 、電子天抨を用いて測定した。なお、測定は各測定日において生存していたマウスについて行い、得られた値は全測定値の平均値で示した。

その結果、全ての群において、 2日目から若干の体重減少が認められた。体重変化の推移は、各群において同様であり、差は認められなかった。本試験の結果および前記実施例 2および 3に示される試験の結果から、総合的に判断して、本発明乳酸菌およびこれを含む発酵乳は、 IFV感染に対して、感染防御果を奏し得ると考えられる。

産業上の利用可能性

本発明は、免疫賦活作用および IgA産生促進作用を有する乳酸菌およびこれを含む組成物を提供するものであり、これらは病原微生物などの粘膜からの侵入を阻止する生体防御効果を奏し得る。

Claims

請求の範囲

I . ラクトバチルス ONFHC b0239(FERM BP-10064)およびラクトバチルス ONRに b0240(FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも 1種である乳酸菌。 2. ラクトバチルス ONFMC b0239(FERM BP-10064)である請求項 1に記載の乳酸菌。

3. ラクトバチルス ONRに b0240(FERM BP-10065)である請求項 1に記載の乳酸菌。

4. 請求項 1に記載の乳酸菌を含有する粘膜免疫賦活作用を有する組成物。

5. 飲食品形態である請求項 4に記載の組成物。

6. 発酵乳、乳酸菌飲料、発酵野菜飲料、発酵果実飲料または発酵豆乳飲料である請求項 5に記載の組成物。

7. 粘膜免疫賦活を要求されるヒトに、請求項 1 -3のいずれかに記載の乳酸菌を摂取させる、該患者の粘膜免疫賦活方法。

8. 粘膜免疫賦活を要求されるヒトに、請求項 4-6のいずれかに記載の組成物を摂取させる、該患者の粘膜免疫賦活方法。

9. IgA産生促進処置を要求されるヒトに、請求項 1 -3のいずれかに記載の乳酸菌を摂取させる、該患者における IgA産生促進方法。 10. IgA産生促進処置を要求されるヒトに、請求項 4-6のいずれかに記載の組成物を摂取させる、該患者における IgA産生促進方法。

I I . ヒトの粘膜免疫賦活のための、請求項 1 -3のいずれかに記載の乳酸菌の使用。

12. ヒトの粘膜免疫賦活のだめの、請求項 4-6のいずれかに記載の組成物の使用。

13. ヒ卜の IgA産生促進のための、請求項 1 -3のいずれかに記載の乳酸菌の使用。

14. ヒトの IgA産生促進のための、請求項 4-6のいずれかに記載の組成物の使用。

15. 請求項 4-6のいずれかに記載の組成物の製造のための、請求項 1 -3のいずれかに記載の乳酸菌の使用。