ES2417481T3

ES2417481T3 - Composición que contiene una bacteria del ácido láctico que produce ecuol

Info

Publication number: ES2417481T3
Application number: ES04746953T
Authority: ES
Inventors: Shigeto Uchiyama; Tomomi Ueno; Toshimi Suzuki
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2004-06-29
Publication date: 2013-08-08
Anticipated expiration: 2024-06-29
Also published as: KR20060028436A; CA2531173C; EP1649760A1; PL2548455T3; SI1649760T1; KR20110044810A; PT2548455T; JPWO2005000042A1; CY1114248T1; DK2548455T3; US20140050703A1; DK1649760T3; WO2005000042A1; BRPI0412180A; MY146563A; ES2601885T3; TWI335353B; KR101043465B1; CN1826059A; AU2004251563B2

Abstract

Composición que contiene Lactococcus garvieae productor de ecuol que comprende, como componente esencial de la misma, un Lactococcus garvieae que presenta la capacidad de utilizar por lo menos un compuesto de daidzeina seleccionado de entre el grupo que consiste en glucosidos de daidzeina, daidzeina y dihidrodaidzeina, para producir ecuol.

Description

Composicion que contiene una bacteria del acido lactico que produce ecuol.

5 Campo de la invencion La presente invencion se refiere a una cepa bacteriana productora de ecuol, a una composicion que comprende dicha cepa bacteriana, y a un metodo de produccion de ecuol mediante la utilizacion de dicha cepa bacteriana.

Antecedentes de la invencion

Hasta el momento se ha informado principalmente en Europa y en los Estados Unidos de que la isoflavona (isoflavona de soja) contenida en las semillas de soja presenta propiedades profilacticas (efecto antiestrogeno) en el cancer de mama, el carcinoma de prostata y otras enfermedades, y que presenta propiedades de alivio (efecto de

15 tipo estrogenico) en la osteoporosis climaterica y posmenopausica, la hiperlipidemia, la hipertension, etc. (H. Adlercreutz et al., Lancet 339:1233, 1992; H. Adlercreutz et al., Lancet 342:1209-1210, 1992; D.D. Baird et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 80:1685-1690, 1995; A.L. Murkies et al., Maturitas 21:198-195, 1995; y D. Agnusdei et al., Bone and Mineral 19(supl.):S43-S48, 1995). Sin embargo, recientemente se ha puesto en duda la eficacia clinica de la isoflavona de soja y, por el contrario, se ha informado de que el ecuol como metabolito activo de la isoflavona de soja es un factor clave en las propiedades esperadas en la aplicacion clinica. De esta manera, se dispone de varios informes que argumentan que en el cancer de mama, el carcinoma de prostata y la osteoporosis climaterica y posmenopausica, la eficacia de la isoflavona de soja resulta superada por la del ecuol, el metabolito de la isoflavona de soja (D. Ingram et al., Lancet 350:990-994,

25 1997; A.M. Duncan et al., Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 9:581-586, 2000; C. Atkinson et al., J. Nutr. 32(3):595S, 2002; H. Akaza et al., Jpn. J. Clin. Oncol. 32(8):296-300, 2002, y S. Uchiyama et al., Ann. Nutr. Metab. 45:113(abs), 2001). Ademas, se presentaron muchas ponencias sobre el tema del ecuol en el IV Simposio Internacional sobre el papel de la soja en la prevencion y tratamiento de enfermedades cronicas (San Diego, USA, 2001), y en diciembre de 2002 tambien se publico una revision completa de los estudios realizados sobre el ecuol. De esta manera, se acepta cada vez mas en circulos academicos que el ecuol es la entidad real responsable de las propiedades de la isoflavona de soja (K.D.R. Settchell et al., J. Nutr. 132:3577-3584, 2002).

35 Ademas, en comparacion con la isoflavona de soja, el ecuol se libera en tejidos tales como el tejido mamario y el tejido prostatico con una eficiencia mucho mayor y este hecho respalda la significancia fisiologica del ecuol (J. Maubach et al., J. Chromatography B. 784:137-144, 2003; T.E. Hedlund et al., The Prostate 154:68-78, 2003). El ecuol es producido por la flora intestinal y se ha informado de que existen diferencias individuales en su produccion. Tambien se ha publicado que aproximadamente 50% de los japoneses son productores de ecuol (S. Uchiyama et al., Ann. Nutr. Metab. 45:113(abs), 2001). Se cree que los individuos que no pueden producir ecuol no presentan bacterias productoras de ecuol en su intestino. En estos individuos se sospecha que los efectos antiestrogeno y de tipo estrogenico esperados podrian no producirse aunque se ingiriesen alimentos de soja procesados. Con el fin de que se puedan expresar los efectos esperados en estos individuos, aparentemente es un

45 curso razonable de accion que ingieran bacterias productoras de ecuol o ecuol mismo. Basandose en la idea anteriormente indicada, se llevaron a cabo investigaciones intensivas y aislaron a partir de heces humanas 3 nuevas cepas de microorganismos y las identificaron: Bacterioides E-23-15 (nO FERM BP-6435), Streptococcus E-23-17 (nO FERM BP-6436) y Streptococcus A6G225 (nO FERM BP-6437), como bacterias productoras de ecuol adecuadas para la expresion de dichos efectos antiestrogeno y de tipo estrogenico, entre otros efectos, y solicitaron una patente que reivindicaba invenciones referentes a dichas cepas de microorganismos productoras de ecuol y a la utilizacion de los microorganismos (documento WO nO 99/07392).

Exposicion de la invencion

55 Se llevaron a cabo estudios adicionales y pudieron aislar y caracterizar una cepa de bacteria del acido lactico perteneciente al genero Lactococcus que puede utilizar el glucosido daidzeina, daidzeina o dihidrodaidzeina para producir ecuol, como nueva cepa de microorganismo que es fundamentalmente diferente de los microorganismos aislados e identificados con anterioridad. La presente invencion se ha desarrollado basandose en el aislamiento y la identificacion anteriormente indicados de esta nueva cepa de bacteria del acido lactico. La presente invencion presenta las invenciones siguientes, resumidas en los parrafos 1 a 13. item 1. Composicion que contiene bacterias del acido lactico productoras de ecuol, como componente esencial de la

65 misma, una cepa de bacteria del acido lactico perteneciente a la especie Lactococcus garvieae que presenta la capacidad de utilizar por lo menos un compuesto de daidzeina seleccionado de entre el grupo que consiste en

glucosidos de daidzeina, daidzeina y dihidrodaidzeina para producir ecuol.

item 2. Composicion segun el item 1, en la que dicha cepa de bacteria del acido lactico perteneciente a Lactococcus es Lactococcus 20-92 depositada con el nO FERM BP-10036.

item 3. Composicion segun el item 1, que comprende ademas por lo menos un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste en compuestos de daidzeina e ingredientes que contienen compuesto de daidzeina.

item 4. Composicion segun el item 3, en la que el ingrediente que contiene compuesto de daidzeina es harina de soja o leche de soja.

item 5. Composicion segun el item 3, que se encuentra en forma de una bebida o de un producto lacteo.

item 6. Composicion segun el item 3, que comprende ademas ecuol.

item 7. Composicion segun el item 6, que se encuentra en forma de un producto de fermentacion de leche de soja.

item 8. Metodo para producir ecuol que comprende la etapa de dejar que una cepa de bacteria del acido lacteo perteneciente a la especie Lactococcus garvieae que presenta la capacidad de utilizar un compuesto de daidzeina para producir ecuol, actue sobre por lo menos un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste en compuestos de daidzeina e ingredientes que contienen compuesto de daidzeina.

item 9. Metodo segun el item 8, en el que dicha cepa de bacteria del acido lactico perteneciente al genero Lactococcus es Lactococcus 20-92, depositada con el nO FERM BP-10036.

item 10. Metodo segun el item 8, en el que el ingrediente que contiene compuesto de daidzeina es harina de soja o leche de soja.

item 11. Cepa de bacteria del acido lactico perteneciente a la especie Lactococcus garvieae depositada con el nO FERM BP-10036.

La composicion que contiene una bacteria del acido lactico productora de ecuol de la invencion se describe en detalle a continuacion.

(1) Cepa de bacteria del acido lactico perteneciente al genero Lactococcus

La composicion que contiene una bacteria del acido lactico productora de ecuol de la invencion comprende, como componente esencial de la misma, una cepa de bacteria del acido lactico perteneciente a la especie Lactococcus garvieae que presenta la capacidad (actividad metabolica) de utilizar por lo menos un compuesto de daidzeina seleccionado de entre el grupo que consiste en glucosidos de daidzeina, daidzeina y dihidrodaidzeina y producir de esta manera ecuol.

Un ejemplo especifico de dicha cepa de bacteria del acido lactico es Lactococcus 20-92 (nO FERM BP-10036), se ha aislado a partir de heces humanas y que han identificado de novo.

Las caracteristicas bacteriologicas de la cepa de bacteria del acido lactico se describen en detalle a continuacion.

I. Estado de crecimiento en el medio

Dicha cepa muestra un crecimiento bueno o normal en agar EG (Eggerth-Gagnon), agar BL (sangre-higado) y GAM (medio anaerobico Gifu) al cultivarla anaerobicamente en un frasco anaerobico con lana de acero a 37OC durante 48 horas o al cultivarla aerobicamente a 37OC durante 48 horas. La morfologia de las colonias es elevada de manera circular o convexa, siendo lisos la superficie y borde perimetral, y adopta un color gris-blanco sobre agar EG y un color pardo-marron sobre agar BL. Morfologicamente es un diplococcus Gram-positivo. Esta cepa no es esporogenica.

II. Caracteristicas bioquimicas

(1): Temperatura de crecimiento optima: 37OC

(2): pH optimo de crecimiento: 7,0

(3): Licuefaccion de la gelatina: -

(4): Produccion de acetoina a partir de acido piruvico: +

(5): Hidrolisis de acido hipurico: -

(6): Hidrolisis de esculina: +

(7): Pirrolidonil-arilamidasa: +

(8): a-Galactosidasa:

(9): �-Galactosidasa:

(10): �-Glucuronidasa: -

(11): Fosfatasa alcalina:

(12): Leucina arilamidasa: +

(13): Arginina dihidrasa: +

(14): Asimilacion de fuentes de carbono: D-Ribosa + L-Arabinosa D-Manitol + D-Sorbitol -Lactosa D-Trehalosa + Inulina D-Rafinosa -Almidon + Glucogeno

(15): Composicion de acidos organicos tras la utilizacion de peptona o glucosa.

Mediante la utilizacion de medio PYF (peptona-extracto de levadura-Fields) (contenido de peptona: aproximadamente 5%) como medio de utilizacion de azucar y medio PYF suplementado con glucosa a una concentracion final de 0,5%, la cepa de la invencion se cultivo aerobicamente a 37OC durante 72 horas y los acidos organicos en los cultivos se sometieron a ensayo mediante HPLC. Se presentan los resultados (unidad: mM) a continuacion, en la Tabla 1.

Tabla 1

Acido organico: Peptona Glucosa

Acido maleico: nd nd

Acido succinico: 0,00 0,01

Acido lactico: 3,33 27,35

Acido formico: 1,13 0,88

Acido acetico: 3,32 0,57

Acido piroglutamico: 0,12 0,25

Acido propionico: nd nd

Acido i-butirico: nd nd

Acido n-butirico: nd nd

Acido i-valerico: nd nd

Acido n-valerico: nd nd

nd=no detectado

A partir de las caracteristicas de cultivo y bioquimicas anteriormente indicadas, la cepa de la invencion se clasifica como Lactococcus garvieae que es un coco Gram-positivo pero que es diferente de su cepa tipo (Schleifer K.H., Kraus J., Dvorak C., Kilpper-Balz R., Collins M.D. y Fischer W., Transfer of Streptococcus lactis and related streptococci to the genus Lactococcus gen. nov. Syst. Appl. Microbiol. 6:183-195, 1985; ATCC nO 43921 (JCM nO 10343) y ATCC nO 49156 (JCM nO 8735)).

Por lo tanto, se denomino a esta cepa, Lactococcus 20-92 y la depositaron en el National Institute of Advanced Industrial Science and Technology International Patent Organism Depositary, AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japon, el 23 de enero de 2003, bajo el numero de acceso FERM P19189. Este microorganismo ahora es un deposito bajo el Tratado de Budapest y el numero de acceso es FERM BP10036.

Se encontro que dicha cepa asimilaba la glucosa y despues elaboraba acido lactico (acido L-lactico), verificando que pertenece al grupo de bacterias del acido lactico homofermentativas.

Ademas, la secuenciacion del ARNr 16s de dicha cepa revelo una homologia de 99,189% con la cepa tipo Lactococcus garvieae (JCM10343) y una homologia de 99,375% con Enterococcus seriolicida, JCM8735).

De manera incidental, debido a que Enterococcus seriolicida, a la que se ha hecho referencia anteriormente, era similar a Lactococcus garvieae en el analisis de homologia ADN-ADN, se reclasifico en Lactococcus garvieae en 1996. Por lo tanto, Lactococcus garvieae presenta dos cepas tipo (la cepa JCM8753 y la cepa 10343) que presentan un origen diferente. Enterococcus seriolicida (JCM8735) se derivo de rifones de jurel de cola amarilla infectados y el Lactococcus garvieae intrinseco (JCM10343) se derivo a partir de mastitis bovina.

Con el fin de explorar la homologia relativa de Lactococcus 20-92 respecto a las dos cepas tipo anteriormente indicadas, se llevo a cabo una comparacion fenotipica. Se presentan los resultados en la Tabla 2, a continuacion.

Tabla 2

Caracteristicas: Cepa de la invencion JCM10343 JCM8735

Desaminacion (Arg - NH3): ± ± ±

Dependencia de la temperatura del crecimiento

10OC: + + +

15OC: + + +

30OC: + + +

37OC: + + +

40OC: + + -

45OC: - - -

Dependencia del pH del crecimiento

pH 4,5: ± ± ±

pH 7,5: + + +

pH 9,6: + + +

Tolerancia salina (NaCl)

6,5: + + +

Peptidoglicano: Lys-Ala-Gly Lys-Ala-Gly Lys-Ala-Gly

Tipo de quinona: MK-8,9 MK-8,9 Sin quinona

MK indica menaquinona

Resultara evidente a partir de la Tabla 2 que la presente cepa Lactococcus 20-92 concuerda en fenotipo con la cepa tipo (JCM10343) de Lactococcus garvieae pero que es diferente de la cepa tipo (JCM8735) de Enterococcus seriolicida en su comportamiento de crecimiento a 40OC y en la produccion o no produccion de quinona. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, se considero que la presente cepa era afin a Lactococcus garvieae (JCM10343).

La presente cepa Lactococcus 20-92 puede clasificarse entre los lactococos cultivados en leche de la lista GRAS [acronimo en ingles de quot;generalmente reconocido como seguroquot;, de la FDA (Food and Drug Administration, USA)] y su seguridad como alimento se considera elevada.

Con respecto a Lactococcus garvieae, no existe ninguna publicacion que sugiera su patogenicidad para el ser humano y tampoco produce sustancias virulentas, tales como toxinas, de manera que esta especie bacteriana se reconoce generalmente como una especie de seguridad elevada.

Ademas, Lactococcus garvieae hasta el momento ha sido detectado en queso mozzarella, leche cruda, productos carnicos procesados almacenados a baja temperatura, plaa-som (un producto de pescado fermentado ampliamente consumido en Tailandia) y en queso Toma Piemontese, que es un queso italiano artesanal de denominacion de origen protegida (DOP), es decir, queso tradicional en Italia, entre otros, y se informa de que dicho microorganismo se detecta con elevada incidencia, del orden de 105 celulas/gramo, en plaa-som, y de 108 celulas/gramo en queso Toma Piemontese, pero que este alimento presenta una larga historia de alimentacion, lo que garantiza la seguridad de este organismo (P-M. Christine et al., Int. J. Food Microbiol. 73:61-70, 2002; M.G. Fortina et al., Food Microbiol. 20:379-404, 2003).

Por otra parte, se informa de que Enterococcus seriolicida es patogeno para peces cultivados tales como el medregal de Japon. Debido a que Lactococcus 20-92, que es, de esta manera, una cepa de Lactococcus garvieae, se considera filogeneticamente relacionado con Enterococcus seriolicida, existia la preocupacion de su potencial patogeno para peces cultivados. Sin embargo, los estudios realizados comparando micrografias electronicas de Lactococcus 20-92 y de la contrapartida patogenica (Enterococcus seriolicida KG) revelaron que, al contrario que dicha cepa patogenica, la cepa de la invencion no presenta capsula sobre la superficie celular. Por lo tanto, la cepa de la presente invencion se considera que no presenta patogenicidad y que no supone ningun problema de contaminacion ecologica. Esta conclusion tambien resulta corroborada en la descripcion de la literatura siguiente. De esta manera, Yoshida et al. argumentan que la patogenicidad de las celulas microbianas para los peces cultivados se debe a que una capsula presente sobre la superficie celular inhibe la fagocitosis por parte de los macrofagos, con el resultado de que las bacterias particulares no resultan eliminadas y se induce sistemicamente septicemia en los peces cultivados infectados por la bacteria (T. Yoshida et al., Dis. Aquat. Org. 25:81-86, 1996).

Ademas, la cepa de la presente invencion Lactococcus 20-92 retiene la capacidad (actividad) deseada de produccion de ecuol incluso en el caso de fermentacion directa en la leche y presenta la caracteristica de que, para

el mantenimiento de esta capacidad de produccion de ecuol, no resulta necesaria ningun medio de cultivo especial. De esta manera, al llevar a cabo una fermentacion en leche de soja utilizado por si sola, la cepa utiliza compuestos de daidzeina en la leche de soja para elaborar ecuol.

Actualmente no existen informes de bacterias del acido lactico del genero Lactococcus que presenten dicha capacidad de produccion de ecuol. Por lo tanto, la presente invencion proporciona ademas una nueva cepa de bacteria del acido lactico que presenta dicha capacidad de produccion de ecuol.

(2) Compuestos de daidzeina e ingredientes que contienen compuestos de daidzeina

Los compuestos de daidzeina, los cuales son utilizados por la cepa de la presente invencion Lactococcus 20-92, incluyen un glucosido de daidzeina, daidzeina y dihidrodaidzeina. Un ejemplo especifico de dicho glucosido de daidzeina es la daidzina. La daidzina es un glucosido de isoflavona que presenta la daidzeina como aglicona (glucosido de daidzeina). En referencia a la daidzina, es utilizada por dicha cepa de microorganismo para liberar la daidzeina, que es utilizada adicionalmente por la cepa para proporcionar dihidrodaidzeina, a partir de la cual finalmente se produce ecuol.

En la presente invencion, dicho compuesto de daidzeina se utiliza como sustrato. El sustrato incluye no solo compuestos de daidzeina, sino tambien diversos materiales o ingredientes que lo contienen. A titulo de ejemplo representativo de dicho material o ingrediente que contiene compuestos de daidzeina (denominados ingrediente que contiene compuesto de daidzeina), puede mencionarse la isoflavona de soja. La isoflavona de soja ya se encuentra disponible de fuentes comerciales y, en la presente invencion, pueden utilizarse dichos productos comerciales, por ejemplo quot;Fujiflavone P10quot; (marca comercial registrada) de Fujicco Co., Ltd. Ademas, dicho ingrediente que contiene compuesto de daidzeina incluye no solo isoflavona de soja, sino tambien tejidos vegetales, por ejemplo kudzu (=Pueraria thurbergiana Benth) y raiz de kudzu (raiz de maranta), clavo rojo, alfalfa, etc., y derivados de isoflavona originados de los mismos.

Entre los ejemplos adicionales de dicho ingrediente que contiene compuesto de daidzeina se incluyen no solo los materiales alimentarios anteriormente indicados, tales como semilla de soja, kudzu, raiz de maranta, clavo rojo, alfalfa, etc., sino tambien productos procesados de los mismos, tales como harina de semilla de soja (harina de soja), soja hervida, tofu (cuajada de soja), tofu frito, leche de soja, extracto de hipocotilos de soja, etc., productos de fermentacion de los mismos, tales como natto (soja fermentada), salsa de soja, miso, tempeh y bebidas fermentadas de soja. Estos materiales invariablemente contienen compuestos de daidzeina. Ademas, no solo contienen compuestos de daidzeina, sino tambien isoflavonas estrogenicas, tales como genisteina y sus glucosidos (genistina, etc.), gliciteina y sus glucosidos (glicitina, etc.), biochanina A y formononetina, que son precursores de daidzeina y genistina parcialmente metilados y pueden utilizarse ventajosamente en la presente invencion.

(3) Composicion de la invencion

(3-1) Composicion que contiene bacterias del acido lactico productoras de ecuol

La composicion que contiene bacterias del acido lactico productoras de ecuol de la invencion comprende, como componente esencial de la misma, una cepa bacteriana del acido lactico perteneciente a la especie Lactococcus garvieae que presenta la capacidad de actuar sobre el sustrato compuesto de daidzeina o el ingrediente que contiene daidzeina para producir ecuol, siendo Lactococcus 20-92 anteriormente indicado un ejemplo representativo. La cepa de bacteria del acido lactico para la utilizacion como dicho componente esencial habitualmente es una cepa bacteriana viable, aunque no se encuentra limitada a ella, sino que puede ser cualquiera de sus cultivos, preparaciones crudas o purificadas de dichos cultivos, los cuales contienen celulas aisladas, y liofilizados de los mismos.

Los cultivos de dicha cepa bacteriana pueden obtenerse tipicamente mediante el procedimiento que comprende cultivar la cepa en un medio adecuado para su crecimiento, por ejemplo medio MRS, a 37OC durante aproximadamente 48 horas. Tras el cultivo, las celulas pueden recuperarse mediante, por ejemplo, centrifugacion delcultivo a 3.000 rpm (4OC) durante 10 minutos. Estas pueden purificarse de la manera convencional. Ademas, estas celulas pueden liofilizarse. Los liofilizados resultantes tambien pueden utilizarse como el componente activo de la composicion de la invencion.

Lo unico que resulta necesario en la composicion de la invencion es que contenga la bacteria (celulas o equivalente) como dicho componente activo de la misma aunque, si se desea, la composicion puede suplementarse con nutrientes adecuados para el mantenimiento (o crecimiento) del microorganismo como dicho componente activo. Los nutrientes indicados anteriormente puede ser, por ejemplo, los medios nutritivos para el cultivo de los microorganismos respectivos, tales como BHI, EG, BL y GAM, tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria.

Entre los ejemplos de otros nutrientes se incluyen diversos oligosacaridos, tales como lactooligosacaridos, oligosacaridos de soja, lactulosa, lactitol, fructooligosacaridos y galactooligosacaridos. La cantidad de dichos

oligosacaridos no se encuentra particularmente restringida, aunque preferentemente se selecciona de entre un intervalo con el que la concentracion final de los mismos en la composicion de la invencion sea de aproximadamente 1% a 3% en peso.

La composicion anteriormente indicada de la invencion, ingerida oralmente, expresa la actividad de produccion de ecuol deseada en el cuerpo del receptor. Generalmente los japoneses presentan el habito de comer alimentos que contienen compuesto de daidzeina, tipicamente los materiales alimenticios o ingredientes anteriormente indicados, por ejemplo soja, productos secundarios de la misma, y productos de fermentacion de la misma y, por lo tanto, la ingesta de la composicion dela invencion resulta en la produccion de ecuol in vivo.

Ademas, en caso necesario, la composicion de la invencion puede suplementarse con cantidades adecuadas de diversas vitaminas, elementos metalicos traza y similares. Entre los ejemplos de dichas vitaminas se incluyen la vitamina B, la vitamina D, la vitamina C, la vitamina E y la vitamina K (particularmente MK-7 (menaquinona-7) derivada de Bacillus natto). Son ejemplos de dichos elementos de metal traza, cinc, selenio, hierro, manganeso, etc.

La cantidad del microorganismo que debe formularse en la composicion de la invencion puede seleccionarse juiciosamente segun el tipo de cepa bacteriana utilizada. A titulo de ejemplo, el numero de organismos (recuento de celulas viables) de Lactococcus 20-92 se ajusta preferentemente a aproximadamente 108 a 109 celulas/100 g de composicion. El recuento de celulas viables se determina de la manera siguiente. Una dilucion de muestra se utiliza para cubrir un medio agar para el cultivo bacteriano y se cultiva aerobicamente a 37OC y se cuentan las colonias formadas. La cantidad del microorganismo indicado anteriormente puede ajustarse juiciosamente segun la forma de la composicion que debe prepararse utilizando la cantidad anteriormente indicada como referencia.

(3-2) Composicion que contiene compuesto de daidzeina de la invencion

La composicion de la invencion puede contener ademas, en caso necesario, por lo menos un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste en los compuestos de daidzeina anteriormente indicados e ingredientes que contienen compuesto de daidzeina. Entre los diversos tipos de compuestos de daidzeina e ingrediente que contiene compuesto de daidzeina, los hipocotilos de soja y los ingredientes alimenticios preparados a partir de los hipocotilos, resultan particularmente preferidos y, entre ellos, resultan todavia mas preferidos los ingredientes alimenticios solubles en agua o emulsionados. Entre otros ejemplos preferidos de dicho ingrediente que contiene compuesto de daidzeina se encuentran la harina de soja y la leche de soja.

Debido al sustrato contenido en la formulacion, una persona no habituada a comer soja e ingredientes alimenticios similares puede ingerir la composicion oralmente, y el microorganismo ingerido utilizara el sustrato formulado para producir el ecuol objetivo dentro del cuerpo.

La cantidad de dicho compuesto de daidzeina y/o ingrediente que contiene compuesto de daidzeina en la composicion no se encuentra particularmente restringida, pero puede ser razonablemente de entre aproximadamente 10 y 25 mg, que es equivalente a la ingesta diaria habitual promedio en Japon.

(3-3) Composicion que contiene ecuol de la invencion

La composicion de la invencion puede contener ademas ecuol.

Generalmente, el apetito de un alimento se ha despertado cuando se ha causado que el material alimentario inicie la fermetnacion del acido lactico, por ejemplo. Ademas, Lactococcus 20-92, que es un ejemplo representativo de microorganismo para la utilizacion en la composicion de la invencion, presenta una capacidad (actividad) de produccion de ecuol muy elevada. La presente invencion proporciona ademas una composicion que contiene ecuol, tal como leche de soja fermentada, que se prepara dejando que dicha cepa de microorganismo actue sobre el ingrediente que contiene compuesto de daidzeina, tal como leche de soja, y de esta manera utilice el compuesto de daidzeina en la leche de soja para elaborar ecuol.

Como sustrato para la utilizacion en dicho aspecto de la invencion, pueden utilizarse los diversos tipos anteriormente indicados de compuesto de daidzeina e ingrediente que contiene compuesto de daidzeina. Entre ellos resultan preferidas las soluciones o emulsiones preparadas a partir de leche de soja, harina de soja o similar.

Un ejemplo especifico preferido de composicion que contiene ecuol de la invencion es el producto de fermentacion obtenido mediante un procedimiento que comprende afadir isoflavona de soja o un material alimentario que lo contiene a un medio adecuado y cultivar el microorganismo de la invencion, preferentemente Lactococcus 20-92, en el mismo para provocar la fermentacion. Mas particularmente, dicha fermentacion puede llevarse a cabo mediante un procedimiento que comprende afadir una cantidad predeterminada del microorganismo de la invencion a una mezcla de una solucion de sustrato esterilizada y un medio nutritivo favorable al crecimiento del microorganismo, tal como BHI, EG, BL o GAM, o a leche de vaca, leche de soja o un zumo vegetal que pueda utilizarse como alimento, y llevar a cabo una reaccion de fermentacion anaerobica o aerobica a 37OC bajo condiciones fijas durante aproximadamente 48 a 96 horas (en caso necesario, puede afadirse un agente de control del pH y un agente

reductor (por ejemplo extracto de levadura, vitamina K1 o similar)). En el procedimiento anteriormente indicado, la cantidad del sustrato puede ser de entre aproximadamente 0,01 y 0,5 mg/ml y el tamafo del inoculo del microorganismo puede seleccionarse del intervalo de entre aproximadamente 1% y aproximadamente 5%.

De esta manera, puede producirse la composicion que contiene ecuol de la invencion. Esta composicion puede aplicarse ventajosamente en la forma anteriormente indicada de un producto de fermentacion como alimento o producto farmaceutico. Ademas, el ecuol producido puede aislarse y purificarse a partir del caldo de cultivo o producto de fermentacion de una manera conocida per se, opcionalmente formulado con cantidades adecuadas de otros ingredientes alimenticios o similares, y procesarse en formas alimenticias o de producto farmaceutico adecuadas.

El aislamiento y la purificacion a las que se ha hecho referencia anteriormente pueden llevarse a cabo mediante, por ejemplo, adsorcion del producto de fermentacion sobre una resina de intercambio ionico (DIAION HP20, producto de Mitsubishi Kasei Corporation), eluyendolo con metanol y concentrando el eluido a sequedad.

La cantidad de ecuol en la composicion de la invencion se selecciona segun al forma de alimento o producto farmaceutico que debe producirse y no se encuentra particularmente restringida. Preferentemente, sin embargo, la cantidad generalmente deberia ser suficiente para que se encuentren contenidos aproximadamente 2 a 5 mg de ecuol en cada 100 g de la composicion total.

La presencia de ecuol en la composicion producto de la invencion puede confirmarse mediante el metodo descrito a continuacion en la presente memoria, en el Ejemplo de ensayo 1.

La composicion que contiene ecuol de la invencion ocupa un lugar elevado en la escala de seguridad debido a que el principio activo, ecuol, es una sustancia de origen natural. Ademas, debido a que se prepara mediante la utilizacion de la cepa de bacteria de acido lactico, el riesgo de contaminacion con compuestos quimicos originados en la linea de produccion es bajo. Como ventajas adicionales, puede mencionarse el rendimiento elevado y el bajo coste, asi como el sabor y aroma sabrosos como alimento.

(3-4) Formas alimenticias

La composicion que contiene bacterias del acido lactico productoras de ecuol de la invencion generalmente se procesa en formas alimenticias que comprenden la cepa bacteriana del acido lactico particular como componente esencial en combinacion con un portador comestible adecuado.

Entre las formas alimenticias especificas de la composicion de la invencion se incluyen la forma de bebida, la forma de producto lacteo diferente de dicha forma de bebida (incluido la forma de leche fermentada), la forma de alimento solido, la forma microencapsulada que contiene celulas, y similares. La composicion de la invencion en la forma de bebida incluye bebidas de bacterias del acido lactico y bebidas que contienen bacterias del acido lactico.

Las expresiones quot;leche fermentadaquot; y quot;bebida con bacterias del acido lacticoquot; tal como se utilizan en la presente memoria se ajustan a las definiciones en el articulo 2-37, quot;Leche fermentadaquot;, y en el articulo 2-38, quot;Bebida con bacterias del acido lacticoquot; de las quot;Regulations relating to the Ingredients etc. of Milks and Milk Productsquot; del anterior Ministerio de Sanidad y Bienestar Social. De esta manera, la expresion quot;leche fermentadaquot; se refiere a una preparacion pastosa o liquida que resulta de la fermentacion de una leche o producto de leche (lacteo) con bacterias del acido lactico o levaduras. Por lo tanto, la quot;leche fermentadaquot; incluye no solo productos en forma de bebida, sino tambien productos en forma de yogur. La expresion quot;bebida con bacterias del acido lacticoquot; se refiere a una bebida preparada mediante la utilizacion de un producto pastoso o liquido resultante de la fermentacion de una leche o producto lacteo con una bacteria o levadura fermentadora del acido lactico a modo de material principal y la dilucion de la misma con agua.

La bebida que contiene bacterias del acido lactico incluye bebidas vegetales fermentadas, bebidas de frutas fermentadas y bebidas de leche de soja fermentada, etc. Entre los ejemplos de elementos en forma de productos lacteos diferentes de la forma de bebida se incluyen productos en forma de cuajada, tales como yogur. La forma de alimento solido incluye granulos, polvos (incluyendo, por ejemplo, polvos secados por congelacion de leche fermentada), comprimidos, comprimidos efervescentes, gomas, pastillas de goma y pudines, etc.

El procesamiento para producir dichas formas puede llevarse a cabo de la manera convencional. Ademas, el portador para la utilizacion en el procesamiento para producir dichas formas puede ser cualquier portador comestible. Son portadores particularmente preferentes aquellos que presentan buenos efectos de sensacion en boca y mejorantes del sabor. Entre los ejemplos de dichos portadores que presentan buenos efectos de sensacion en boca y de mejora del sabor se incluyen edulcorantes artificiales, sorbitol, xilitol y similares. Otros portadores preferentes son, por ejemplo, agentes enmascaradores, tales como trehalosa (producto de Hayashibara), ciclodextrina, Benekote BMI (producto de Kao Corporation), etc.

La bebida que contiene bacterias del acido lactico como forma alimenticia especifica preferente se describe en

detalle a continuacion. El procesamiento para producir dicha bebida puede llevarse a cabo mediante el procedimiento que comprende el cultivo del microorganismo en un material de fermentacion adecuado que contiene nutrientes para el microorganismo, tal como liquidos derivados de vegetales o frutas, leche de soja (soja emulsionada), etc., para provocar de esta manera la fermentacion de dicho material. Entre los vegetales y frutas para la utilizacion como material de fermentacion se incluyen restos vegetales de poda, restos triturados, restos de molienda, zumos exprimidos, productos tratados con enzimas y diluciones o concentrados de los mismos. Entre los vegetales se incluyen calabazas, zanahorias, tomates, pimientos dulces, apio, espinaca, boniatos pigmentados, maiz, remolacha, col verde, perejil, coles y brocoli, etc. Entre las frutas se incluyen manzanas, melocotones, platanos, fresas, uvas, sandias, naranjas y mandarinas, etc.

Los restos de poda, triturados y molidos de vegetales y frutas pueden obtenerse mediante, por ejemplo, el procedimiento que comprende lavar los vegetales o frutas, sometiendolos a un tratamiento de blanqueo, por ejemplo introduciendolos en agua caliente, en caso necesario, y cortandolos, pulverizandolos o moliendolos mediante un triturador, mezclador, procesador de alimentos, despulpador-refinador, molino coloidal Mycolloider, o similar.

Pueden prepararse zumos mediante la utilizacion de un filtro-prensa, exprimidor-mezclador o similar. Los zumos pueden prepararse tambien mediante filtracion de dichos triturados (restos de molienda) a traves de un tejido filtrante

: o similar. Los productos tratados con enzimas pueden prepararse dejando que la celulasa, pectinasa, protopectinasa

: o similar actuan sobre dichos residuos de poda, triturados, molidos o zumos. Entre las diluciones se incluyen las diluciones acuosas de 1 a 50 veces. Entre los concentrados se incluyen los concentrados 1 a 100 veces mediante medios tales como la concentracion por congelacion, la concentracion bajo presion reducida, etc.

La leche de soja es otro ejemplo especifico del material de sustrato de fermentacion que puede prepararse a partir de materiales de soja rutinariamente. La leche de soja incluye un homogenado preparado mediante inmersion de semillas de soja descascarilladas en agua, pulverizacion en humedo de estas semillas de soja utilizando un molino adecuado o similar, y homogeneizacion del pulverizado de la manera rutinaria y una solucion en agua de proteina de soja soluble en agua, etc.

La fermentacion utilizando un microorganismo puede llevarse a cabo mediante inoculacion de dicho material de sustrato de fermentacion con el microorganismo del a invencion e incubando el material inoculado bajo condiciones fijas. El medio opcionalmente puede suplementarse con sustancias inductoras de la fermentacion, garantizando un buen crecimiento del microorganismo utilizado, por ejemplo diversas fuentes de carbono, tales como glucosa, almidon, sacarosa, lactosa, dextrina, sorbitol, fructosa, etc., fuentes de nitrogeno tales como extracto de levadura, peptona, etc., vitaminas y minerales.

El tamafo del inoculo del microorganismo debe ser generalmente equivalente a un recuento de celulas viables no inferior a aproximadamente 1x106 celulas, preferentemente de aproximadamente 1x107 celulas por centimetro cubico de liquido de sustrato de fermentacion. Con respecto a las condiciones de cultivo, la temperatura de fermentacion generalmente se selecciona de entre el intervalo de aproximadamente 20OC a 40OC, preferentemente de aproximadamente 25OC a 37OC, mas preferentemente de 37OC, y el tiempo de fermentacion se selecciona de entre el intervalo de aproximadamente 8 a 24 horas.

Para una fermentacion estable, resulta recomendable preparar un iniciador con anticipacion e inocular el sustrato de fermentacion con el iniciador para la fermentacion. Un iniciador representativo puede ser, por ejemplo, el cultivo obtenido mediante inoculacion de la presente cepa de microorganismo de la invencion en dicho material de sustrato de fermentacion sometido a la esterilizacion habitual a una temperatura de entre 90OC y 121OC durante 5 a 20 minutos previamente, leche desnatada al 10% en polvo suplementada con extracto de levadura o similar, y el cultivo del microorganismo bajo las mismas condiciones que las indicadas anteriormente. El iniciador preparado de esta manera habitualmente contiene aproximadamente 107 a 109 celulas del microorganismo de la invencion por cada gramo de cultivo.

El producto de fermentacion del acido lactico obtenido de la manera anteriormente indicada puede en ocasiones encontrarse en forma de cuajada (una forma de tipo yogur o pudin) y dicho producto puede consumirse directamente como alimento. El producto de fermentacion del acido lactico en dicha forma de cuajada puede homogeneizarse adicionalmente con el fin de preparar la forma de bebida deseada (por ejemplo una bebida de leche de soja fermentada). Esta homogeneizacion puede llevarse a cabo utilizando un homogeneizador ordinario. Mas particularmente, puede llevarse a cabo utilizando un homogeneizador de alta presion de Gaulin [LAB 40] a aproximadamente 200 a 1.000 kgf/cm2, preferentemente a aproximadamente 300 a 800 kgf/cm2, o un homogeneizador de San�a Machine Industry Co. (numero de articulo HA � 4571, H20-A2, etc.) a no menos de 150 kg/cm2. Mediante esta homogeneizacion, puede obtenerse un producto de bebida, particularmente una bebida de leche de soja fermentacion, que presenta una excelente palatabilidad, particularmente una sensacion en boca suave. Durante la realizacion de dicha homogeneizacion, resulta permisible, en caso necesario, para preparar la dilucion apropiada, afadir un acido organico para el ajuste del pH y/o afadir diversos aditivos que se utilizan habitualmente en la preparacion de bebidas, tales como azucares, zumos de fruta, formadores de viscosidad, surfactantes y saborizantes, en cantidades adecuadas. Como ejemplo preferido especifico de cada tipo de aditivo indicado anteriormente y su nivel de adicion (% en peso basado en el peso del producto de fermentacion de forma

cuajada): glucosa al 8% (% en peso, lo mismo se aplica en adelante), azucar al 8%, dextrina al 8%, acido citrico al 0,1%, ester de glicerol-acido graso al 0,2% y saborizante al 0,1%.

La bebida de bacterias del acido lactico de la invencion obtenida de esta manera, tal como una bebida de leche de soja fermentada, puede dispensarse asepticamente en recipientes adecuados de la manera convencional con el fin de proporcionar el producto final. Este producto presenta una buena palatabilidad, permitiendo una deglucion suave y un buen sabor.

La dosis (cantidad ingerida) del producto anteriormente indicado puede seleccionarse juiciosamente segun la edad, sexo, peso corporal y gravedad de la enfermedad del receptor, entre otras variables y no se encuentra particularmente restringida. Generalmente pueden ingerirse 100 a 300 ml al dia de un producto de bebida con un recuento de celulas viables de entre 108 y 109 celulas/ml.

Un ejemplo especifico adicional de la composicion de la invencion en la forma alimenticia es la forma de comprimido efervescente. Esta forma puede prepararse formulando 10% a 35% (% en peso; lo mismo se aplica posteriormente) de carbonato sodico y/o hidrogenocarbonato sodico y 20% a 70% de un neutralizador, a modo de ingredientes efervescentes, con 0,01% a 50% de la bacteria (celulas liofilizadas) de la invencion. El neutralizador que debe utilizarse de esta manera es un compuesto acido capaz de neutralizar dicho carbonato sodico y/o hidrogenocarbonato sodico para generar gas dioxido de carbono. Son ejemplos representativos de dicho neutralizador acidos organicos tales como acido L-tartarico, acido citrico, acido fumarico y acido ascorbico.

La cantidad de dichos ingredientes efervescentes en el producto efervescente de la invencion resulta suficiente para que, al disolver en agua dicho producto de la invencion, la solucion muestre acidez, particularmente una acidez de pH entre 3,5 y 4,6. Mas particularmente, la cantidad puede seleccionarse de entre el intervalo de 10% a 35% de carbonato sodico y/o hidrogenocarbonato sodico y 20% a 70% de neutralizador. Particularmente, la cantidad de carbonato sodico se selecciona de entre el intervalo de 11% a 31%, preferentemente de 22% a 26%; el hidrogenocarbonato sodico de entre el intervalo de 10% a 35%, preferentemente de 20% a 30%. Entre estas opciones alternativas, resulta mas preferente utilizar hidrogenocarbonato sodico por si solo dentro del intervalo de 20% a 25%. La cantidad del neutralizador se selecciona de entre el intervalo de 20% a 70%, particularmente de 30% a 40%. En particular, resulta mas preferente utilizar acido L-tartarico dentro del intervalo de 20% a 25% y acido ascorbico dentro del intervalo de 8% a 15%.

El producto efervescente contiene los microorganismos de la invencion y los ingredientes efervescentes como componentes esenciales y opcionalmente puede contener cantidades adecuadas de diversos aditivos conocidos, tales como excipiente, ligante, desintegrador, lubricante, formador de viscosidad, surfactante, agente modulador de la osmolaridad, electrolito, edulcorante, saborizante, colorante, agente de control del pH y similares. Son ejemplos de los aditivos, almidones tales como almidon de trigo, almidon de patata, almidon de maiz, dextrina, etc.; sacaridos tales como sacarosa, glucosa, fructosa, maltosa, xilosa, lactosa, etc.; alcoholes de azucar, tales como sorbitol, manitol, maltitol, xilitol, etc.; glucosidos de reorganizacion de azucar, tales como azucar de acoplamiento, palatinosa, etc.; excipientes tales como fosfato de calcio, sulfato de calcio, etc.; ligantes/espesantes, tales como almidones, sacaridos, gelatina, goma arabiga, dextrina, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, alcohol polivinilico, hidroxipropilcelulosa, goma xantano, pectina, goma tragacanto, caseina, acido alginico, etc.; lubricantes tales como leucina, isoleucina, L-valina, esteres de azucar, aceites hidrogenados, acido estearico, estearato de mangesio, talco, macrogoles, etc.; desintegradores tales como celulosa microcristalina (Avicel, Asahi Chemical Industry Co., Ltd.), carboximetilcelulosa (CMC), carboximetilcelulosa sodica (CMC-Na), carboximetilcelulosa calcica (CMC-Ca), etc.; surfactantes tales como ester de polioxietilen-sorbitan acido graso (polisorbato), lecitina, etc.; dipeptidos tales como aspartamo, alitamo, etc.; y edulcorantes tales como Stevia, sacarina y similares. Estos pueden seleccionarse juiciosamente y utilizarse en cantidades adecuadas considerando la relacion de cada uno con los componentes esenciales, la proporcion de la preparacion, el metodo de produccion de la preparacion, entre otros factores.

Ademas, en la preparacion efervescente de la invencion, pueden formularse vitaminas, particularmente cianocobalamina y acido ascorbico (vitamina C) en cantidades adecuadas. La cantidad no se encuentra particularmente limitada, aunque habitualmente puede afadirse vitamina C, por ejemplo, al 30% como maximo, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 5% a 25%.

El metodo de produccion de la preparacion efervescente de la invencion puede ser fundamentalmente similar al metodo convencional de produccion de comprimidos efervescentes de este tipo. De esta manera, la preparacion de la invencion en forma de comprimido efervescente puede prepararse dosificando cantidades predeterminadas de los ingredientes respectivos, mezclandolos, y procesando el total mediante el metodo de compresion directa de los polvos o el metodo de granulacion seca o humeda-compresion, por ejemplo.

La preparacion de la invencion, obtenida de esta manera, puede convertirse en una forma de bebida adecuada para la administracion oral simplemente introduciendola en agua y administrandola oralmente.

La dosis (cantidad consumida) puede establecerse juiciosamente segun la edad, sexo, peso corporal, severidad de la enfermedad del receptor, entre otras variables, y no se encuentra particularmente limitada, aunque generalmente

pueden disolverse 1 a 2 comprimidos de la forma de comprimido efervescente de la invencion, que pesan aproximadamente 1,5 a 6,0 g por comprimido, en 100 a 300 ml de agua, que se ingieren en cada dosis.

Las proporciones de mezcla particularmente preferentes del sustrato compuesto de daidzeina o del ingrediente que contiene compuesto de daidzeina, la cepa de bacteria del acido lactico particular y otros ingredientes formulados opcionalmente en la composicion de la invencion, por cada 100 g de la composicion, son: el compuesto de daidzeina

o ingrediente que contiene compuesto de daidzeina en el intervalo de aproximadamente 10 a 50 mg, calculados como daidzeina; el numero de bacterias de la cepa de bacteria del acido lactico en el intervalo de 109 a 1010 celulas (recuento de celulas viables), y los oligosacaridos y otros, en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 g.

Debido a que la composicion que contiene bacterias del acido lactico productoras de ecuol de la invencion esta disefada para contener un microorganismo (principalmente bacterias vivas), tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria, condiciones tales como la aplicacion de calor y presion no resultan recomendables en el procesamiento de la composicion en los productos finales. Por lo tanto, en el procesamiento de la composicion de la invencion en formas de producto tales como barras, granulos, polvos y comprimidos, resulta preferente formular directamente el microorganismo en forma de celulas liofilizadas o utilizar celulas liofilizadas tratadas con un agente de recubrimiento adecuado.

Sin embargo, la composicion que contiene bacterias del acido lactico productoras de ecuol de la invencion no resulta necesario que contengan esencialmente bacterias vivas. En el caso de que dicha composicion que comprende bacterias viables y dicho compuesto de daidzeina o similar que dichas bacterias pueden utilizar contiene ecuol producido por bacterias, puede someterse a una esterilizacion por calor rutinaria para matar las bacterias. Dicha esterilizacion por calor a la que se somete la composicion inhibe los deterioros de sabor y aroma causados por la fermentacion excesiva de las bacterias viables formuladas en la composicion durante el almacenamiento o distribucion en el mercado.

(3-5) Formas de producto farmaceutico

La composicion que contiene bacterias del acido lactico productoras de ecuol de la invencion puede procesarse en preparaciones farmaceuticas que generalmente contienen dicha cepa bacteriana del acido lactico definida como componente esencial conjuntamente con un portador farmaceuticamente aceptable adecuado.

El portador incluye diversos diluyentes y excipientes, tales como rellenos, formadores de volumen, ligantes, humectantes, desintegradores, surfactantes, lubricantes, etc., que es conocido que son utilizados en la tecnica. Pueden utilizarse selectivamente segun la forma de dosificacion unitaria de la preparacion.

Como forma de dosificacion unitaria de la preparacion farmaceutica puede utilizarse selectivamente una diversidad de formas. Las formas representativas son comprimidos, pildoras, polvos, soluciones, suspensiones, emulsiones, granulos, capsulas y supositorios.

El portador que puede utilizarse en el procesamiento para producir la forma de comprimido incluye diversos excipientes, tales como lactosa, sacarosa, cloruro sodico, glucosa, urea, almidon, carbonato calcico, caolin, celulosa cristalina, acido silicico, fosfato potasico, etc.; ligantes, tales como agua, etanol, propanol, jarabe simple, solucion de glucosa, solucion de almidon, solucion de gelatina, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc.; desintegrantes, tales como carboximetilcelulosa sodica, carboximetilcelulosa calcica, hidroxipropilcelulosa de baja sustitucion, almidon seco, alginato sodico, agar en polvo, laminaran en polvo, hidrogenocarbonato sodico, carbonato calcico, etc.; surfactantes, tales como esteres de acidos grasos de polioxietilen-sorbitan, laurilsulfato sodico, monoglicerido de acido estearico, etc.; inhibidores de la desintegracion, tales como sacarosa, estearina, manteca de cacao hidrogenado, aceites hidrogenados, etc.; inductores de la absorcion, tales como bases de amonio cuaternario, laurilsulfato sodico, etc.; humectantes, tales como glicerol, almidon, etc.; adsorbentes, tales como almidon, lactosa, caolin, bentonita, silice coloidal, etc.; y lubricantes, tales como talco purificado, estearatos, acido borico en polvo, polietilenglicol, y similares.

Ademas, en caso necesario, pueden prepararse comprimidos en las formas que presentan recubrimientos convencionales, tales como comprimidos recubiertos de azucar, comprimidos recubiertos de gelatina, comprimidos de recubrimiento enterico, comprimidos recubiertos de pelicula, etc., o en forma de comprimidos de doble capa o comprimidos multicapa.

El portador que puede utilizarse en la formacion de pildoras incluye diversos excipientes, tales como glucosa, lactosa, almidon, manteca de cacao, aceites vegetales hidrogenados, caolin, talco, etc.; ligantes, tales como goma arabiga en polvo, goma tragacanto en polvo, gelatina, etanol, etc., y desintegradores, tales como laminaran, agar, y similares.

Los portadores que pueden utilizarse en la formacion de supositorios comprenden polietilenglicol, manteca de cacao, alcoholes superiores, esteres de alcohol superior, gelatina y gliceridos semisinteticos, etc. El producto encapsulado puede fabricarse generalmente mediante la mezcla de las bacterias de la invencion con diversos tipos de portadores

farmaceuticos, tales como los indicados anteriormente, y utilizando la mezcla para rellenar capsulas duras o capsulas elasticas blandas de la manera convencional.

Ademas, en caso necesario, pueden incorporarse colorante, conservante, saborizante, corrector, edulcorante y otros farmacos en el producto farmaceutico de la invencion.

La cantidad del microorganismo de la invencion que debe incorporarse en la preparacion de la invencion no se encuentra particularmente limitada sino que puede seleccionarse juiciosamente de entre un amplio intervalo. La proporcionada generalmente recomendada es de aproximadamente 108 a 1010 celulas/g de preparacion farmaceutica.

El metodo de administracion de la preparacion farmaceutica anteriormente indicado no se encuentra particularmente limitado sino que puede establecerse segun las formas de preparacion, diversos factores del paciente tales como edad, sexo, etc., y la gravedad de la enfermedad. Por ejemplo, los comprimidos, pildoras, soluciones, suspensiones, emulsiones, granulos y capsulas se administran oralmente y los supositorios se administran rectalmente.

La dosis de dicha preparacion farmaceutica puede establecerse juiciosamente segun el metodo de administracion, la edad del paciente, el sexo y otros factores, y la gravedad de la enfermedad, aunque preferentemente es de aproximadamente 0,5 a 20 mg/dia en terminos del microorganismo de la invencion, es decir, de principio activo, por kg de peso corporal. Esta preparacion puede administrarse en 1 a 4 dosis divididas al dia.

Con la ingestion (administracion) de la composicion de la invencion, el microorganismo en la composicion alcanza estando vivo el tracto digestivo inferior o se establece en el como parte de la flora intestinal, en donde se expresa la eficacia esperada. En este aspecto, la forma de preparacion particularmente preferente es el comprimido de recubrimiento enterico, con el que puede transportarse el microorganismo al intestino sin resultar atacada por el acido gastrico.

La composicion que contiene las bacterias del acido lactico productoras de ecuol de la invencion tal como se ha obtenido de la manera anteriormente indicada resulta util para la profilaxis y tratamiento sintomaticos de malestar y/o osteoporosis posmenopausica y alteraciones climatericas en mujeres de mediana edad y ancianas. Dicha profilaxis y tratamiento pueden llevarse a cabo mediante la administracion de una cantidad efectiva de dicha composicion de la invencion en mujeres de mediana edad o ancianas para las que se requiere, o conseguir que la ingieran. La cantidad efectiva indicada anteriormente no se encuentra particularmente limitada en la medida en que resulte suficiente para prevenir y controlar las diversas manifestaciones de la osteoporosis y las alteraciones climatericas que acompafan al malestar y/o menopausia en mujeres de mediana edad y ancianas. Como regla general, sin embargo, la dosis puede seleccionarse generalmente de manera que la cantidad de ecuol excretada en la orina de la persona que ha ingerido la composicion de la invencion alcance por lo menos 5 Imoles (aproximadamente 1,2 mg/dia).

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 es una representacion esquematica que muestra la relacion entre el tiempo de incubacion hasta el recuento de celulas viables determinado mediante el protocolo de ensayo descrito en el Ejemplo de ensayo 1.

La figura 2 es una representacion esquematica que muestra la relacion entre el tiempo de incubacion y la capacidad de produccion de ecuol (puntuacion) determinadas mediante el protocolo de ensayo descrito en el Ejemplo de ensayo 1.

La figura 3 es una representacion esquematica que muestra la relacion entre el tiempo de incubacion y la produccion de ecuol determinada mediante el protocolo de ensayo descrito en el Ejemplo de ensayo 1.

La figura 4 es una representacion esquematica que muestra el curso temporal de la concentracion de cada uno de los compuestos de daidzeina y ecuol en el cultivo segun el seguimiento realizado de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo de ensayo 2.

La figura 5 es una representacion esquematica que muestra la relacion entre el periodo de almacenamiento y la capacidad de produccion de ecuol (puntuacion) determinadas segun el protocolo de ensayo descrito en el Ejemplo de ensayo 3.

La figura 6 es una representacion esquematica que muestra los comportamientos dependientes del tiempo de incubacion de la cepa productora de ecuol (cambios en la tasa de crecimiento, en la capacidad de produccion de ecuol y en la cantidad producida de ecuol) determinados mediante el experimento descrito en el Ejemplo de ensayo 1-3.

La figura 7 es una representacion esquematica que muestra la relacion entre el tiempo de incubacion hasta un recuento de celulas viables, determinada mediante el protocolo de ensayo descrito en el Ejemplo de ensayo 4.

Mejor modo de poner en practica la invencion

Los ejemplos siguientes de produccion de la composicion que contiene bacterias del acido lactico productoras de ecuol de la invencion pretenden describir la presente invencion con mayor detalle y no deben interpretarse en modo 5 alguno como definitorios de la invencion.

Ejemplo 1

(1) Produccion de bebida de leche de soja fermentada

10 Se mezclaron los ingredientes siguientes segun la formula con el fin de preparar la composicion de la invencion en forma de una bebida de leche de soja fermentada.

Cultivo de fermentacion de proteina de soja soluble en agua 100 ml Vitaminas y minerales c.s. Saborizante c.s. Agua c.s. Total 150 ml

15 El cultivo fermentativo anteriormente indicado de proteina de soja soluble en agua se obtuvo mediante disolucion de 13 g de proteina de soja soluble en agua en 100 ml de agua, afadiendo 108 a 109 celulas de Lactococcus 20-92 (nO FERM BP-10036) y llevando a cabo la fermentacion a 37OC durante 24 a 48 horas. La proteina de soja soluble en agua contenia aproximadamente 1 a 2 mg, calculados como daidzeina, de compuestos de daidzeina en cada gramo.

(2) Produccion de una leche fermentada

Se mezclaron los ingredientes siguientes segun la formula con el fin de preparar la composicion de la invencion en una forma de leche fermentada.

25 Leche fermentada con Lactococcus 20-92 100 ml Vitaminas y minerales c.s. Saborizante c.s. Agua c.s. Total 150 ml.

La leche fermentada con Lactococcus 20-92 se obtuvo mediante la adicion de 108 a 109 celulas de Lactococcus 2092 (nO FERM BP-10036) a 1 litro de leche de vaca (que presenta un contenido de solidos no grasos lacteos de 8,5%

o superior y un contenido de materias grasas lacteas de 3,8% o superior) y llevar a cabo la fermentacion a 37OC 30 durante 24 a 48 horas.

(3) Produccion de unos polvos liofilizados de leche de soja fermentada

Utilizando aproximadamente 109 celulas de Lactococcus 20-92 (nO FERM BP-10036) y 100 g de leche de soja

35 (solidos de soja 10%, contenido de compuesto de daidzeina: 10 a 15 mg calculados como daidzeina), se llevo a cabo la fermentacion del acido lactico a 37OC durante 72 a 96 horas para la produccion de ecuol. Este producto de fermentacion se liofilizo con el fin de preparar unos polvos. El contenido de ecuol de los polvos determinado mediante HPLC fue de 0,1% a 0,3% en peso.

40 Los polvos obtenidos anteriormente y diversos otros ingredientes se pesaron segun la formula siguiente y se mezclaron con el fin de preparar la composicion de la invencion en forma de polvos (forma alimenticia y forma de producto farmaceutico).

Polvos liofilizados de leche de soja fermentada 2,2 g (contenido de ecuol: 0,005 g) Excipiente (almidon de maiz) 17 g Vitaminas y minerales c.s. Saborizante c.s. Total 20 g

45 (4) Produccion de unos polvos

Se pesaron los ingredientes siguientes segun la formula y se mezclaron con el fin de preparar la composicion de la invencion en una forma de polvos (forma alimenticia y forma de producto farmaceutico).

Polvos liofilizados de Lactococcus 20-92 4,1 g Excipiente (lactosa) 1,0 g

Vitaminas y minerales c.s. Saborizante c.s. Total 20 g

Se obtuvieron unos polvos liofilizados de Lactococcus 20-92 medinte el cultivo de Lactococcus 20-92 (nO FERM BP10036) en un medio de cultivo liquido adecuado (MRS) (37OC, 24 a 48 horas), recolectando y suspendiendo las celulas cultivadas en leche desnatada al 10%, y liofilizando la suspension. El contenido de celulas de los polvos era

5 de 109 a 1010 celulas/g.

Los polvos anteriormente indicados se mezclaron en unos polvos que contenian daidzeina, afadiendo ademas 4,1 g de polvos de isoflavona de soja semipurificada.

10 La ingestion de los polvos que contenian daidzeina obtenidos de esta manera resulto en excreciones urinarias de ecuol de aproximadamente 5 Imoles (aproximadamente 1,2 mg) al dia, indicando claramente que la cantidad de ecuol correspondiente a las excreciones anteriormente indicadas puede producirse in vivo.

(5) Produccion de granulos

15 Se pesaron los ingredientes siguientes segun la formula y se mezclaron para preparar la composicion de la invencion en una forma granular (forma alimenticia y forma de producto farmaceutico).

Polvos de isoflavona de soja semipurificada 4,1 g Polvos liofilizados de Lactococcus 20-92 1,0 g Ester de acido de sacarosa c.s. Vitaminas y minerales c.s. Saborizante c.s. Total 20 g

20 Los polvos liofilizados de Lactococcus 2-92 utilizados fueron los utilizados anteriormente, en (1).

La ingestion de la composicion anteriormente indicada resulto en la administracion concurrente de daidzeina y bacterias productoras de ecuol en el intestino grueso, permitiendo de esta manera la produccion de ecuol en el mismo.

25 Se proporcionan a continuacion ejemplos de ensayo referentes a la cepa de bacteria de acido lactico productora de ecuol de la invencion.

Ejemplo de ensayo 1

30 Ensayo de tasa de crecimiento, capacidad (actividad) de produccion de ecuol y cantidad producida de ecuol

(1) Protocolo de ensayo

35 Se incubo Lactococcus 20-92 (107 a 109 celulas/g) en 5 ml de caldo BRI (un medio liquido de cultivo (medio de base)) anaerobicamente a 37OC durante 24 horas y el cultivo se diluyo a 102 y a 104 celulas con el medio de base.

El cultivo obtenido tras completar la incubacion y las diluciones del mismo preparadas anteriormente se mezclaron, 0,2 ml de cada una, con 5 ml de medio de base suplementado con daidzeina (daidzeina afadida a caldo BRI hasta

40 una concentracion final de 10 Ig/ml), con 5 ml de leche de vaca y con 5 ml de leche de soja, respectivamente, y se cultivaron anaerobicamente a 37OC. Se fijo el tiempo de incubacion en 8, 24, 48, 72 y 96 horas en el caso del medio de base suplementado con 10 Ig/ml de daidzeina y de leche de soja, y en 8, 24 y 48 horas en el caso de la leche de vaca.

45 Antes de iniciar la incubacion y al final de cada periodo de incubacion, se muestrearon porciones de 0,1 ml y 0,2 ml del cultivo y se sometieron respectivamente a recuento de celulas y al ensayo de la capacidad (actividad) productora de ecuol. Ademas, para el medio de base que contenia 10 Ig/ml de daidzeina y para la leche de soja, se muestrearon 0,5 ml de cada cultivo antes del inicio de la incubacion y al final de cada periodo de incubacion y se determino la cantidad de ecuol producida en cada muestra.

50 Se determino el numero de bacterias de la manera siguiente. Se diluyo cada muestra de 0,1 ml con PBS(-) (producto de Nissui Co.) para preparar diluciones de 104, 105, 106 y 107 veces y se utilizo 0,1 ml de cada una de estas diluciones para cubrir, respectivamente, medio agar GAM y se incubaron aerobicamente a 37OC durante 24 horas. Se contaron las colonias formadas sobre el medio para la utilizacion como numero de bacterias.

55 La capacidad (actividad) de produccion de ecuol se sometio a ensayo de la manera siguiente. Se mezclaron 0,2 ml de cada muestra con 5 ml de medio de base suplementado con daidzeina (cada uno por triplicado) y se incubaron

anaerobicamente a 37OC durante 96 horas. Tras completar la incubacion, se obtuvieron muestras de 0,5 ml de los cultivos respetivos y se extrajeron dos veces respectivamente con porciones de 5 ml de acetato de etilo y se cuantifico la daidzeina, la dihidrodaidzeina (producto intermedio) y el ecuol mediante HPLC. Ademas, basandose en la cantidad total, se calculo el porcentaje de ecuol. Se puntuaron los resultados en la escala de 5 puntos siguiente y se utilizo la puntuacion media de 3 muestras como indice de la capacidad (actividad) de produccion de ecuol.

4: Ecuol (90% o mas)

3: Ecuol producido, reduciendose la cantidad de daidzeina a menos de 50% (formacion de producto intermedio)

2: Ecuol producido, daidzeina residual (50% o mas) (formacion de producto intermedio)

1: Producto intermedio producido, ecuol no producido

0: no se produce ni producto intermedio ni ecuol, reduciendose la cantidad de daidzeina.

La cantidad de ecuol producida se determino de la manera siguiente. Se extrajo cada muestra de 0,5 ml dos veces con porciones de 5 ml de acetato de etilo y se cuantificaron mediante HPLC las cantidades de daidzeina, dihidrodaidzeina (producto intermedio) y ecuol en el extracto. A continuacion, se utilizaron las concentraciones respectivas para calcular la cantidad de ecuol producida.

(2) Resultados de ensayo

(2-1) Los resultados del recuento de las celulas (tasa de crecimiento) se presentan en la figura 1.

En la representacion esquematica, (1) representa el resultado obtenido en el caso en que se utiliza el medio de base suplementado con daidzeina, (2) representa el resultado obtenido en el caso en que se utilizo leche de soja, y (3) representa el resultado obtenido al utilizar leche de vaca. En cada diagrama, el eje horizontal representa el tiempo de incubacion (h) y el eje vertical representa el recuento de celulas viables (log(UFC/ml)).

Puede observarse a partir de los diagramas respectivos, que la tasa de crecimiento de la cepa de la invencion es buena y, con independencia del tamafo de inoculo utilizado, la etapa estacionaria de crecimiento se alcanzo invariablemente en 8 horas de incubacion en todos los medios: medio de base suplementado con daidzeina, leche de soja y leche de vaca. Se encontro que el recuento de celulas viables se estabilizaba en 109,1-9,4 UFC/ml en el medio de base suplementado con daidzeina, en 108,5-8,7 UFC/ml en leche de soja y en 108,0-8,4 UFC/ml en leche de vaca.

(2-2) Los valores de capacidad (actividad) de produccion de ecuol encontrados se presentan en la figura 2.

En la figura 2, (1) representa el resultado obtenido en el caso en que se utilizo medio de base suplementado con daidzeina, (2) representa el resultado obtenido en el caso en que se utilizo leche de soja, y (3) representa el resultado obtenido en el caso en que se utilizo leche de vaca. En cada diagrama, el eje horizontal representa el tiempo de incubacion (h) y el eje vertical representa la puntuacion de actividad.

Resulta evidente a partir de los resultados presentados en la figura 2 que la capacidad (actividad) de produccion de ecuol tiende a incrementarse con el tiempo en cualquiera de los medios: medio de base suplementado con daidzeina, leche de soja y leche de vaca. Tambien pudo confirmarse que, incluso en los casos en que se utilizo leche de vaca y leche de soja, existia una capacidad (actividad) sostenida de produccion de ecuol de la cepa de la invencion.

(2-3) Resultados de la determinacion de la cantidad de ecuol producida

Las cantidades de ecuol producidas en el medio de base suplementado con daidzeina y en leche de soja (aproximadamente 80 Ig/ml calculados como daidzeina) fueron las mostradas en la figura 3.

En referencia a la figura 3, (1) representa el resultado obtenido en el caso en que se utilizo el medio de base suplementado con daidzeina, y (2) representa el resultado obtenido en el caso en que se utilizo leche de soja. En cada diagrama, el eje horizontal representa el tiempo de incubacion (h) y el eje vertical representa la concentracion de ecuol (Ig/ml).

En ambos medios, empezo a notarse la produccion de ecuol en la hora 48 tras el inicio de la incubacion. En el caso en que se utilizo leche de soja, la cantidad de ecuol producida variaba segun el tamafo del inoculo y particularmente al nivel de inoculacion de 4,00%, la produccion de ecuol fueron de incluso 57,0 Ig/ml alcanzada la hora 96 de incubacion.

Aunque en la leche de soja no menos de 90% de la daidzeina que actua como precursor del ecuol se encuentra presente en forma de glucosido (en forma de glucosa unida), ya no se observo el pico correspondiente al glucosido en el cromatograma posterior a la incubacion y este hecho sugiere que la cepa de la invencion descompone el glucosido (actividad de -glucosidasa), proporcionando daidzeina y metabolizando adicionalmente esta daidzeina en ecuol.

Ejemplo de ensayo 2

Ruta de produccion de ecuol en Lactococcus 20-92

(1) Protocolo de ensayo

Se cultivo aerobicamente Lactococcus 20-92 (107 celulas/ml) en 5 ml de caldo BRI (un medio liquido de cultivo, medio de base) a 37OC durante 24 horas y se mezclaron 0,2 ml del cultivo resultante con 5 ml de medio de base suplementado con daidzeina y la mezcla se incubo anaerobicamente a 37OC. Se fijo el tiempo de incubacion en 8, 24, 30, 36, 48, 51, 54, 60, 84 y 96 horas.

Antes de iniciar la incubacion y al final de cada periodo de incubacion, se extrajeron muestras de 0,5 ml y se determinaron las concentraciones de daidzeina, dihidrodaidzeina (producto intermedio) y ecuol en cada muestra.

(2) Resultados

Los resultados obtenidos se presentan en la figura 4.

La figura 4 es una representacion esquematica de los cambios durante el tiempo de la concentracion de daidzeina (izquierda), la dihidrodaidzeina (centro) y el ecuol (derecha). En cada diagrama, el eje horizontal representa el tiempo de incubacion (h) y el eje vertical representa la concentracion (Ig/ml) de la sustancia correspondiente.

Resultara evidente a partir de los datos presentados en la figura 4 que la concentracion de daidzeina empezo a caer en la hora 48 de incubacion, que se formo el compuesto intermediario dihidrodaidzeina durante el periodo entre la hora 48 y la hora 60, y que la produccion de ecuol se inicio en la hora 48. Tambien pudo confirmarse que el metabolismo de la daidzeina en ecuol se habia completado sustancialmente en la hora 60.

Aunque los resultados proporcionados anteriormente indican que el metabolismo de la daidzeina en ecuol se producia pasando por dicho compuesto intermediario, dihidrodaidzeina, los resultados tambien sugieren que la formacion de dihidrodaidzeina y el metabolismo de la misma en ecuol tienen lugar en paralelo.

Ejemplo de ensayo 3

Estabilidad a baja temperatura de leches fermentadas que contienen la cepa Lactococcus 20-92

(1) Protocolo de ensayo

Se cultivo Lactococcus 20-92 en 5 ml de un medio liquido de cultivo (medio d base) anaerobicamente a 37OC durante 24 horas; se utilizo el cultivo resultante para inocular 1 l y 2 l de leche de vaca y 1 l de leche desnatada comercial (10% de solidos), respectivamente, al nivel de 4% y se cultivo aerobicamente bajo condiciones fijas a 37OC durante 48 horas. Los cultivos se almacenaron a 4OC.

En el caso de la leche de vaca, se llevo a cabo un seguimiento de la capacidad (actividad) de produccion de ecuol semanalmente tras completar el cultivo hasta la semana 4 de almacenamiento a baja temperatura (4OC). Ademas, se reservaron dos de los tubos y se almacenaron hasta el dia 42 y 51, respectivamente, y se determino la actividad en cada caso.

En el caso de la leche desnatada, se determino la actividad tras completarse el cultivo y en la semana 1 y dia 34 de almacenamiento a baja temperatura (4OC).

Las puntuaciones de actividad antes del almacenamiento y al final de cada periodo de almacenamiento se generaron mediante el metodo anteriormente indicado, que comprendia inocular 5 ml de medio de base suplementado con 10 Ig/ml de daidzeina al nivel del 4% (0,2 ml) por triplicado, cultivando el microorganismo anaerobicamente a 37OC durante 96 horas y determinando las concentraciones de daidzeina, dihidrodaidzeina (producto intermedio) y ecuol para las puntuaciones de actividad.

(2) Resultados

Se presentan los resultados en la figura 5. En la figura 5, el eje horizontal representa el periodo de almacenamiento (dias) y el eje vertical representa la puntuacion de actividad.

Resulta evidente a partir de dicha representacion esquematica de los resultados que, en cuanto a la leche de vaca, se mantiene la capacidad (actividad) de produccion de ecuol hasta la semana 4 de almacenamiento a baja temperatura (4OC) tras haberse completado el cultivo en ambos casos (1 l y 2 l). Ademas, en el caso de los 2 l de leche de vaca, se encontro una actividad sostenida hasta el dia 51, que fue el ultimo dia de seguimiento de la

estabilidad de almacenamiento a 4OC. En el caso de 1 l de leche desnatada comercial, tambien se sostenia aparentemente la capacidad (actividad) de produccion de ecuol hasta el dia 34, el ultimo de dia de seguimiento de la estabilidad de almacenamiento a baja temperatura (4OC) tras completarse el cultivo.

Los resultados anteriormente proporcionados indican que la leche fermentada preparada mediante la utilizacion de Lactococcus 20-92 es capaz de conservar la actividad incluso bajo condiciones de almacenamiento a baja temperatura y, por lo tanto, tambien resulta adecuada para la distribucion de alimento.

La relacion entre la tasa de crecimiento de Lactococcus 20-92 y su capacidad (actividad) de produccion de ecuol y la cantidad de ecuol producida que se deduce de los resultados obtenidos en los Ejemplos de ensayo 1 a 3 indicados anteriormente puede representarse esquematicamente tal como se muestra en la figura 6.

De esta manera, aunque las condiciones de cultivo variaban segun los diferentes medios de cultivo, la capacidad (actividad) de produccion de ecuol puede mantenerse tanto en etapa de crecimiento como en la etapa estacionaria. Por otra parte, con respecto a la cantidad producida de ecuol, aparentemente el enzima empieza a expresarse o a activarse para producir ecuol tras un cierto tiempo de retardo en la etapa estacionaria.

Ejemplo de ensayo 4

Ensayo de tolerancia a los jugos gastricos de la leche fermentada preparada mediante la utilizacion de Lactococcus 20-92

(1) Protocolo de ensayo

Se cultivo anaerobicamente Lactococcus 20-92 en 5 ml de un medio liquido para el crecimiento anaerobico (caldo BHI, medio de base) a 37OC durante 24 horas. El cultivo resultante (109 celulas/g) se utilizo para inocular 1 l de leche de vaca al nivel de 4% y se incubo aerobicamente bajo condiciones fijas a 37OC durante 48 horas. Tras completarse el cultivo, la leche se almaceno a 4OC y, al considerarla leche fermentada, se sometio al ensayo siguiente.

A modo de jugos gastricos artificiales, se prepararon tampones de glicina 50 mM-HCl suplementados con pepsina al 0,045% (pH 2,5 y pH 3,0). A modo de control se preparo tampon de glicina 50 mM-HCl (pH 6,0).

A 9 ml de cada jugo gastrico artificial se afadio 1 ml de la leche fermentada almacenada a temperatura baja y la mezcla se incubo (se cultivo) aerobicamente bajo condiciones fijas en un incubador a 37OC.

Se fijo el tiempo de incubacion en 1 h, 2 h y 3h, y se muestrearon alicuotas de 0,1 ml y 0,2 ml de cada cultivo antes del inicio de la incubacion y al final de cada periodo de incubacion, y se sometieron a la determinacion del recuento de celulas viables (en el caso de 0,1 ml) y de capacidad (actividad) de produccion de ecuol (en el caso de 0,2 ml).

La determinacion del recuento de celulas viables se llevo a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo de ensayo 1-(1), que comprendia muestrear 0,1 ml de cada cultivo, diluir la muestra 104, 105, 106 y 107 veces con PBS(-) de Nissui, utilizando 0,1 ml de cada dilucion para recubrir medio agar GAM, incubando el medio inoculado aerobicamente a 37OC durante 24 horas y realizando un recuento de las colonias formadas sobre el agar GAM.

La determinacion de la capacidad (actividad) de produccion de ecuol se llevo a cabo segun el procedimiento descrito anteriormente, en el Ejemplo de ensayo 1-(1), que comprendia inocular 5 ml de medio de base suplementado con daidzeina con 0,2 ml (4%) de la muestra (por triplicado), incubar el medio inoculado anaerobicamente a 37OC durante 96 horas y medir las concentraciones de daidzeina, dihidrodaidzeina (producto intermedio) y ecuol en el medio para las puntuaciones de actividad.

(2) Resultados

Los resultados obtenidos se presentan en la figura 7-A (recuento de celulas viables) y B (concentracion de ecuol).

En la figura 7-A, el eje horizontal representa el tiempo de incubacion (h) y el eje vertical representa el recuento de celulas viables (log(UFC/ml) en la leche).

En la figura 7-B, el eje horizontal representa el tiempo de incubacion (h) y el eje vertical representa la actividad de ecuol (puntuacion).

Puede deducirse lo siguiente a partir de los resultados presentados en las figs. 7-A y 7-B. De esta manera, en la solucion de tampon a pH 6,0, el recuento de celulas viables se sostuvo al nivel de 108 celulas/ml hasta la hora 3 y en este punto tambien se sostenia la capacidad (actividad) de produccion de ecuol. En el jugo gastrico artificial a pH 3,0, se sostuvo el recuento de celulas viables hasta la hora 3 de incubacion y en este punto tambien se sostenia la actividad. Por otra parte, en el jugo gastrico artificial a pH 2,5, se inicio una caida marcada del recuento de celulas

viables en la hora 2 de incubacion y la actividad tambien desaparecio.

En un estudio en el mismo sistema de ensayo indicado anteriormente, los probioticos (microorganismos que pasan hasta el canal intestinal vivos y muestran actividad fisiologica ahi) presentes en el mercado se informa que no varia su recuento de celulas viables a pH 3,0 pero que se reduce significativamente a pH 2,5. Esto implica que la tolerancia al jugo gastrico a pH 3,0 permite que estos microorganismos pasen por el estomago vivos. Por lo tanto, la leche fermentada preparada mediante la utilizacion de Lactococcus 20-92 se espera razonablemente que lleve los organismos vivos hasta el intestino, dejando que muestren una actividad sostenida en la parte inferior del intestino delgado y en el intestino grueso.

Ejemplo de ensayo 5

Ensayo de tolerancia biliar de Lactococcus 20-92

Se determino la tolerancia a la bilis con VITEK GPI Card (Nippon Biomerieux Co., Ltd.) y se evaluo mediante la utilizacion de las tasas de crecimiento de la cepa de la invencion en bilis al 10% y al 40% como indicadores.

(1): Protocolo de ensayo

Se extendio Lactococcus 20-92 (108-9 celulas) sobre agar tripticasa de soja suplementado con 5% de sangre ovina y se cultivo aerobicamente a 37OC durante 24 horas. La colonias sobre el medio tras completarse el cultivo se levantaron con un asa de platino y se preparo una suspension homogenea del mismo en solucion salina esteril al 0,5%. Esta suspension se aplico a una tarjeta GPI de VITEK y, tras incubar durante 15 horas a 35OC, se evaluo la tasa de crecimiento de la cepa en presencia de bilis mediante la utilizacion del pigmento (indicador de pH). Se preparo la bilis mediante disolucion de una cantidad predeterminada de bilis en polvo en agua destilada esteril y se aplico a la tarjeta previamente.

(2): Resultados

Los resultados del ensayo anteriormente indicado muestran que Lactococcus 20-92 crece en bilis al 10% y al 40%, demostrando tolerancia a la bilis al 40%.

Ejemplo de ensayo 6

Ensayo de hemolisis de Lactococcus 20-92

(1): Protocolo de ensayo

Se extendio Lactococcus 20-92 (108-9 celulas) sobre agar tripticasa de soja suplementado con sangre ovina al 5% y se cultivo anaerobicamente (N2:CO2:H2=8:1:1) a 37OC durante 24 a 48 horas. Se observo la porcion circundante a la colonia formada sobre el medio tras completarse el cultivo y se evaluo el potencial hemolitico segun el grado de descomposicion de los componentes hematicos (despigmentacion o decoloracion).

(2): Resultados

Como resultado del ensayo anteriormente indicado, no se observo despigmentacion (aparicion de una zona incolora transparente) en torno a la colonia, indicando que Lactococcus 20-92 no provoca la -hemolisis y, en este aspecto, es un microorganismo seguro.

Ejemplo de ensayo 7

Ensayo de actividad enzimatica infiltrante de celulas de Lactococcus 20-92

Con respecto a la invasion sistemica de las bacterias del acido lactico ingeridas, una depresion en la funcion defensiva del mesenterio o la alteracion del mesenterio mismo puede considerarse como el factor en el lado huesped. Como factor en el lado bacteria, puede indicarse su actividad enzimatica (enzimas infiltrantes de celulas) que descomponen los proteoglicanos complejos de lipido-proteina que constituyen el mesenterio.

El presente ensayo estaba destinado a investigar si Lactococcus 20-92 presentaba actividades de enzima infiltrante de celulas, es decir actividades de colagenasa (gelatinasa), hialuronidasa y sialidasa (neuraminidasa), o no, y se llevo a cabo de la manera siguiente.

(1) Protocolo de ensayo

Se extendio Lactococcus 20-92 (tamafo de extension: 108-9 celulas) sobre medio agar suplementado con sangre y se cultivaron anaerobicamente (N2:CO2:H2=8:1:1) a 37OC durante 24 a 48 horas.

Las colonias sobre el medio despues del cultivo se levantaron con un asa de platino y se suspendieron en agua destilada esteril para preparar una suspension homogenea. Mediante la utilizacion de esta suspension, se investigo la presencia o ausencia de colagenasa (gelatinasa) con ApiTM (Nippon Biomerieux Co., Ltd.) utilizando la degradacion de la gelatina como indicador.

Ademas, el ensayo de si Lactococcus 20-92 presenta actividades de hialuronidasa y sialidasa (neuraminidasa) o no se llevo a cabo mediante un procedimiento que comprendia incubar Lactococcus 20-92 en solucion de tampon de Tris-HCl (pH 7,0) que contenia acido hialuronico o acido sialico como sustrato (37OC, aerobico, 15 minutos para la actividad de sialidasa y 24 horas para la actividad de hialuronidasa) y medir los grados de reduccion de las concentraciones de los sustratos respectivos.

(2) Resultados

Lactococcus 20-92 no mostraba actividades de colagenasa (gelatinasa), hialuronidasa y sialidasa (neuraminidasa).

De esta manera, en vista del hecho de que la cepa de la invencion no presentaba enzimas infiltrantes de celulas que constituyesen un factor de infectividad, se confirmo que la cepa tambien era un microorganismo altamente seguro desde el punto de vista de la infectividad.

Ejemplo de ensayo �

Ensayo de resistencia a vancomicina

La adquisicion de resistencia a antibioticos (mutacion) por las bacterias ha sido una cuestion de grave preocupacion en los ultimos afos. No es raro que pacientes infectados por bacterias que han adquirido resistencia a antibioticos mueran porque no responden a los antibioticos. En particular, la aparicion de bacterias resistentes a la vancomicina (REV) es una cuestion gravemente preocupante en el campo de la medicina clinica actual. Ademas, existe la preocupacion de que si los organismos ingeridos que contienen el gen de resistencia a la vancomicina alcanzan y se establecen en el intestino, en donde entraran en contacto con microorganismos virulentos o infecciosos (bacterias patogenicas), el gen de resistencia a la vancomicina podria transferirse a las bacterias patogenicas, resultando en que estas bacterias tambien adquieran la resistencia a la vancomicina. Por lo tanto, resulta necesario, como minimo, que los microorganismos que se utilizan como probioticos no sean organismos resistentes a la vancomicina.

El presente ensayo estaba destinado a investigar la susceptibilidad de Lactococcus 20-92 a la vancomicina y se llevo a cabo de la manera siguiente.

(1): Protocolo de ensayo

Se llevo a cabo el ensayo de susceptibilidad a la vancomicina utilizando Sensi-Disk (producto de Nippon Becton-Dickinson Company, Ltd.). Se extendieron Lactococcus 20-92 (tamafo de extension: 108 -9 celulas) sobre medio agar GAM, se aplico un disco que contenia 30 Ig de vancomicina sobre el medio y se llevo a cabo un cultivo aerobico a 37OC durante 24 horas. Despues del tiempo de incubacion indicado, se midio el diametro de la zona de inhibicion formada en torno al disco y se evaluo segun una tabla de evaluacion.

(2): Resultados

El diametro de la zona de inhibicion para Lactococcus 20-92 fue de 11,9 ± 0,2 mm y la evaluacion de la susceptibilidad segun la tabla de evaluacion fue positiva (susceptible=10 mm). Este resultado indica que la cepa de la invencion no es una cepa resistente a la vancomicina y, por lo tanto, se considera segura.

En el Ejemplo 2, a continuacion, se proporciona un ejemplo de produccion de ecuol a partir de daidzeina mediante la utilizacion de la cepa de bacteria del acido lactico de la invencion.

Ejemplo 2

Produccion de ecuol

Se preparo un ml de suspension que contenia 107 a 109 celulas de Lactococcus 20-92 (nO FERM BP-10036) en medio GAM para el cultivo de bacterias anaerobicas y esta suspension se afadio a 100 g de leche de soja (concentracion de solidos: aproximadamente 2,2%). La mezcla se incubo anaerobicamente a 37OC durante 72 a 96 horas y se realizo un seguimiento mediante HPLC del ecuol producido en el cultivo. El contenido de compuesto daidzeina de dicha leche de soja era de 95 Ig/ml calculado como daidzeina.

El resultado indica la formacion de 10,7 ± 6,3 Ig/ml (media ± desviacion estandar de 3 experimentos) de ecuol en el cultivo de leche de soja anteriormente indicado.

Los resultados anteriores demuestran claramente que mediante la explotacion del microorganismo de la invencion puede producirse ecuol a partir de compuestos de daidzeina contenidos en materiales alimentarios con una buena eficiencia y a bajo coste.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composicion que contiene Lactococcus garvieae productor de ecuol que comprende, como componente esencial de la misma, un Lactococcus garvieae que presenta la capacidad de utilizar por lo menos un compuesto de

5 daidzeina seleccionado de entre el grupo que consiste en glucosidos de daidzeina, daidzeina y dihidrodaidzeina, para producir ecuol.
2. Composicion segun la reivindicacion 1, en la que dicho Lactococcus garvieae es Lactococcus 20-92 depositado

como FERM BP-10036. 10
3.

Composicion segun la reivindicacion 1, que comprende ademas harina de soja o leche de soja.
4.

Composicion segun la reivindicacion 1, que se encuentra en forma de una bebida o de un producto lacteo.

15 5. Composicion segun la reivindicacion 1, que se encuentra en forma de un producto de fermentacion de leche de soja.
6. Lactococcus garvieae que presenta la capacidad de utilizar por lo menos un compuesto de daidzeina

seleccionado de entre el grupo que consiste en glucosidos de daidzeina, daidzeina y dihidrodaidzeina, para producir 20 ecuol.
7.

Lactococcus garvieae segun la reivindicacion 6, como se ha depositado como FERM BP-10036.
8.

Utilizacion de una composicion que contiene Lactococcus garvieae productor de ecuol que comprende como

25 componente esencial de la misma Lactococcus garvieae para la produccion de ecuol utilizando por lo menos un compuesto de daidzeina seleccionado de entre el grupo que consiste en glucosidos de daidzeina, daidzeina y dihidrodaidzeina.
9. Utilizacion segun la reivindicaicon8, en la que dicho Lactococcus garvieae es Lactococcus 20-92, depositado con 30 el nO FERM BP-10036.
10.Utilizacion segun la reivindicacion 8, en la que la composicion comprende ademas harina de soja o leche de soja.
11.Utilizacion segun la reivindicacion 8, en la que la composicion se encuentra en forma de una bebida o de un 35 producto lacteo.