BRPI0412180B1 - Composição contendo bactérias de ácido lático produzindo equol, bem como processo de produção de equol - Google Patents

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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ÇÃO CONTENDO BACTÉRIAS DE ÁCIDO LÁTICO PRODUZINDO E- QUOL, BEM COMO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE EQUOL".
Campo da Invenção A presente invenção refere-se a linhagem bacterial de ácido láti- co produzindo equol, uma composição compreendendo a dita linhagem bac- terial de ácido lático, e um processo de produção de equol através de utiliza- ção da dita linhagem bacterial de ácido lático.
Antecedentes da Invenção Foi anteriormente reportado principalmente na Europa e Estados Unidos da América que isoflavona (isoflavona de soja) contida em sojas tem eficácias profiláticas (efeito anti-estrogênio) em câncer de mama, carcinoma de próstata, e outras doenças e que tem eficácias de alívio (efeito semelhan- te estrogênico) em osteoporose climatérica e pós-menopausa, hiper lipide- mia, hipertensão, etc. (H. Adlercreutz et al., (1992) Lancet, 339, 1233; H.
Adlercreutz et al., (1992) Lancet, 342, 1209-1210; D.D. Baird et al., (1995) J.
Clin. Endocrinol. Metab., 80, 1685-1690; A.L. Murkies et al., (1995) Maturitas., 21, 198-195; e D. Agnusdei et al., (1995) Bone and Mineral., 19 (Supple), S43-S48).
Recentemente, entretanto, dúvidas foram lançadas sobre a efi- cácia clínica de isoflavona de soja e, ao invés, é reportado que equol como o metabolito ativo de isoflavona de soja é um fator chave nas eficácias espe- radas em aplicação clínica. Assim, vários relatórios são disponíveis susten- tando que em câncer de mama, carcinoma da próstata, e osteoporose clima- térica e pós-menopusa, a eficácia de isoflavona de soja é ultrapassada por aquela de equol, o metabolito de isoflavona de soja (D. Ingram et al., (1997) Lancet, 350, 990-994; A. M. Duncan et al., (2000) câncer Epidemiology, Bi- omarkers & Prevention, 9, 581-586; C. Atkinson et al., (2002) J. Nutr., 32(3), 595S; H. Akaza et al., (2002) Jpn J.Clin. Oncol., 32(8), 296-300; e S. Uchi- yama et al., (2001) Ann. Nutr. Metab., 45, 113(abs)).
Além disso, muitas conferências foram liberadas com o objeto de equol no 4th International Symposium on the Role of Soy in Preventing and Treating Chronic Disease (San Diego, USA, 2001), e em dezembro de 2002 uma revisão compreensiva de estudos sobre equol também foi reportada.
Assim, está sendo mais e mais aceito nos círculos acadêmicos que equol é a entidade de eficácias de isoflavona de soja (K.D.R. Settchell et aL, (2002) J. Nutr.,132, 3577-3584).
Além disso, comparado com isoflavona de soja, equol é liberado para tecidos como tecido de mama e tecido de próstata com eficiência muito maior e, a partir deste fato, a significância fisiológica de equol é endossada (J. Maubach etal., (2003) J. Chromatography B., 784,137-144; T.E. Hedlund et al., (2003) The Prostate, 154,68-78).
Equol é produzido pela flora intestinal e o envolvimento de dife- rença individual em sua produção foi reportada. É também reportado que produtores de equol entre os Japoneses totalizam cerca de 50% (S. Uchi- yama et al., (2001) Ann. Nutr. Metab., 45, 113 (abs)). Indivíduos que não podem produzir equol são suspeitos de carecerem de bactérias de produção de equol em seu intestino. Em tais indivíduos, é suspeitado que os espera- dos efeitos antiestrogênio e semelhantes a estrogênico possam não ser es- perados mesmo se alimentos de soja processada forem ingeridos. De modo que os efeitos esperados possam ser expressos em tais indivíduos, parece ser um razoável curso de ação para fazê-los ingerir bactérias produzindo equol ou equol como tal.
Baseado na idéia acima, os inventores conduziram intensas in- vestigações e isolaram de fezes humanas 3 novas cepas de microorganis- mos e identificaram-nas: por exemplo, Bacterioides E-23-15 (FERM BP- 6435), Streptococcus E-23-17 (FERM BP-6436), e Streptococcus A6G225 (FERM BP-6437), como bactérias produzindo equol apropriadas para a ex- pressão dos ditos efeitos anti-estrogênio e semelhante estrogênico, entre outros efeitos, e pediram uma patente reivindicando invenções com relação a estas cepas de microorganismos produzindo equol e utilização dos micro- organismos (WO99/07392).
Descrição da Invenção Os inventores conduziram ainda estudos e tiveram sucesso no isolamento e caracterização de uma cepa bacterial de ácido lático perten- cendo ao gênero Lactococcus que é capaz de utilizar glicosídeo daidzeína, daidzeína, ou diidrodaidzeína para produzir equol como uma nova cepa de microorganismo que é fundamentalmente diferente dos microorganismos isolados e identificados previamente. A presente invenção foi desenvolvida nas bases do isolamento e identificação acima desta nova cepa de bactérias de ácido lático. A presente invenção compreende as seguintes invenções resu- midas em parágrafos 1-13.
Item 1. Uma composição contendo bactérias de ácido lático pro- duzindo equol compreendendo, como um seu componente essencial, uma cepa bacterial de ácido lático pertencendo ao gênero Lactococcus tendo uma habilidade de utilizar pelo menos um composto daidzeína selecionado do grupo consistindo em glicosídeos daidzeína, daidzeína, e diidrodaidzeína para produzir equol.
Item 2. A composição de acordo com o Item 1, onde a dita cepa bacterial de ácido lático pertencendo ao gênero Lactococcus é Lactococcus garvieae.
Item 3. Composição de acordo com o Item 2, onde a dita cepa bacterial de ácido lático pertencendo a Lactococcus é Lactococcus 20-92 depositado sob FERM BP-10036.
Item 4. A composição de acordo com o Item 1 ainda compreen- dendo pelo menos um membro selecionado do grupo consistindo em com- postos daidzeína e ingredientes contendo composto daidzeína.
Item 5. A composição de acordo com o Item 4, onde o ingredien- te contendo composto daidzeína é farinha de soja ou leite de soja.
Item 6. A composição de acordo com o Item 4 que está na forma de uma bebida ou um produto leite.
Item 7. A composição de acordo com o Item 4 ainda compreen- dendo equol.
Item 8. A composição de acordo com o Item 7 que está na forma de um produto de fermentação de leite de soja.
Item 9. Um processo de produção de equil compreendendo a etapa de deixar uma cepa bacterial de ácido lático pertencendo ao gênero Lactococcus tendo uma habilidade de utilizar um composto daidzeína para produzir equol atuar sobre pelo menos um membro selecionado do grupo consistindo em compostos daidzeína e ingredientes contendo composto daidzeína.
Item 10. O processo de acordo com o Item 9, onde a dita cepa bacterial de ácido lático pertencendo ao gênero Ladococcus é Ladococcus game ae.
Item 11. O processo de acordo com o Item 10, onde a dita cepa bacterial de ácido lático pertencendo ao gênero Ladococcus é Ladococcus 20-92 depositado sob FERM BP-10036.
Item 12.0 processo de acordo com o Item 9, onde o ingrediente contendo composto daidzeína é farinha de soja ou leite de soja.
Item 13. Uma cepa bacterial de ácido lático pertencendo ao gê- nero Ladococcus como depositada sob FERM BP-10036. A composição contendo bactérias de ácido lático produzindo e- quol da invenção é descrita em detalhes abaixo. (1)A cepa bacterial de ácido láctico pertencendo ao gênero Ladococcus A composição contendo bactérias de ácido lático produzindo e- quol da invenção compreende, como um seu componente essencial, cepa bacterial de ácido lático pertencendo ao gênero Ladococcus tendo uma ha- bilidade (atividade metabólica) para utilizar pelo menos um composto daidze- ína selecionado do grupo consistindo em glicosídeos daidzeína, daidzeína, e diidrodaidzeína e pelo que produzir equol.
Um especifico exemplo da dita cepa bacterial de ácido lático é Ladococcus 20-92 (FERM BP-10036) que os inventores isolaram de fezes humanas e identificaram de novo.
As características bacteriológicas da cepa bacterial de ácido láti- co são descritas em detalhes abaixo. I. Estado de crescimento sobre o meio Esta cepa mostra crescimento bom ou normal sobre ágar EG (Eggerth-Gagnon), ágar BL (sangue fígado), e GAM (meio anacrótico Gifu) quando cultivada anaerobicamente em um jarro anaeróbico com lã de aço a 37°C por 48 horas ou cultivada aerobicamente a 37°C por 48 horas. A morfo- logia colonial é elevada em uma maneira circular ou convexa, com ambas superfície e borda periférica sendo uniformes, e assume uma cor cinza - branco sobre ágar EG e uma cor castanho - marrom sobre ágar BL. Morfolo- gicamente, é um diplococcus Gram-positivo. Esta cepa não é esporogênica. II. Características bioquímicas (1) temperatura ótima para crescimento: 37°C (2) pH ótimo para crescimento: 7,0 (3) liquefação de gelatina:- (4) produção de acetoína a partir de ácido pirúvico: + (5) hidrólíse de ácido hipúrico: - (6) hidrólíse de esculina: + (7) pirrolidonil aril amidase: + (8) α-galactosidase: - (9) β-galactosidase: - (10) β-glucuronidase: - (11) fosfatase alcalina: - (12) leucina aril amidase: + (13) arginina diidrase: + (14) assimilação de fontes de carbono D-ribose + L-arabinose D-manitol + D-sorbitol Lactose D-trealose + Inulina D-rafinose Amido + Glicogênio (15) Composição de ácido orgânico após utilização de peptona ou glicose Usando meio PYF (peptona - extrato de levedura Fields)(teor de peptona: aproximadamente 5%) usado como meio de utilização de açúcar e meio PYF suplementado com glicose em uma concentração final de 0,5%, a cepa da invenção foi cultivada aerobicamente a 37°C por 72 horas e os áci- dos orgânicos nas culturas foram ensaiados por HPLC. Os resultados (uni- dade: mM) são apresentados abaixo na Tabela 1.
Tabela 1 nd = não-detectado A partir das características de cultura e bioquímicas acima, a cepa da invenção é classificada em Lactococcus garvieae que é um coccus gram-positivo mas difere de seu tipo de cepa (Schleifer, K.H., Kraus, J„ Dvo- rak, C., Kilpper-Balz, R., Collins, M.D. e Físcher, W. Transferof Streptococ- cus lactis and reiated streptococci to the genus Lactococcus gen. Nov. Syst.
Appl. Microbiol., 6, 183-195, 1985; ATCC43921 (JCM10343) e ATCC49156 (JCM8735)) na utilização de amido.
Por isso, os inventores chamaram esta cepa de Lactococcus 20- 92 e depositaram-na com o National Institute of Advanced Industrial Science and Technology International Patent Organism Depositary, AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japan em 23 de janeiro de 2003, sob o número de acesso de FERM P-19189. Este microorganismo é agora colocado sob depósito de Tratado de Budapest, e o número de acesso é FERM BP-10036.
Esta cepa foi verificada assimilar glicose e, então, elaborar ácido lático (ácido L-lático), verificando que é um membro de bactérias de ácido lático homofermentativas.
Além disso, sequenciamento do 16SrRNA desta cepa revelou 99,189% de homologia com o tipo de cepa de Lactococcus garvieae (JCM10343) e 99,375% de homologia com Enterococcus seriolicída, JCM8735).
Incidentalmente, uma vez que Enterococcus seriolicída referido acima foi parecido com Lactococcus garvieae em análise de homologia DNA-DNA, ele foi reclassificado em Lactococcus garvieae em 1996. Por is- so, Lactococcus garvieae tem dois tipos de cepas (cepa JCM8753 e cepa 10343) que são diferentes em origem. Enterococcus seriolicída (JCM8735) foi derivada de rim de olhete infectado e a Lactococcus garvieae intrínseca (JCM10343) foi derivada de mastite bovina.
Para explorar a relativa homologia de Lactococcus 20-92 com os dois tipos de cepas acima, foi feita uma comparação fenotípica. Os resulta- dos são apresentados abaixo na Tabela 2.
Tabela 2 MK representa Menaquinona Será visível a partir da Tabela 2 que a presente cepa de Lacto- coccus 20-92 estava em concordância com o tipo de cepa (JCM10343) de Lactococcus garvieae em fenótipo mas foi diferente do tipo de cepa (JCM8735) de Enterococcus seriolicida em comportamento de crescimento a 40°C e na produção ou não-produção de quinona. Da mesma maneira a presente cepa foi julgada ser parecida com Lactococcus garvieae (JCM10343), A presente cepa de Lactococcus 20-92 pode ser classificada entre Lactococci cultivados - leite no GRAS [acronismo de lista de Generally Recognized As Safe por FDA (Food and Drug Administration, U.S.A)] e sua segurança como um alimento é considerada ser alta.
Com relação a Lactococcus garvieae, não existe um relatório sugerindo sua patogenicidade para seres humanos e não há produção de substâncias virulentas como toxinas, de modo que esta espécie bacterial é genericamente conhecida ser uma espécie de alta segurança.
Além disso, Lactococcus garvieae foi detectado a muito tempo em queijo mozzarella, leite bruto, produtos de carne processados sob esto- cagem de baixa temperatura, plaa-som (um produto de peixe fermentado amplamente consumido na Tailândia), e queijo Toma Piemontese que é um queijo Italiano de origem de denominação protegida (PDO) artesanal, isto é, queijo tradicional na Itália, entre outros, e reportadamente este microorga- nismo é detectado em uma alta incidência da ordem de 105 células/grama a partir de plaa-som e 108 células/grama de queijo Toma Piemontese, mas este alimento tem uma longa história de consumo assegurando a segurança deste organismo. (P-M. Christine et al., (2002) Int. J. Food Microbiol., 73, 61- 70; M.G. Fortina, et al., (2003), Food Microbiol., 20,379-404).
Por outro lado, Enterococcus seriolicida é reportadamente pato- gênico para peixes cultivados como olhete. Uma vez que Lactococcus 20-92, que é, assim, uma cepa de Lactococcus garvieae, é considerado ser filoge- neticamente relacionado a Enterococcus seriolicida, houve apreensão de seu potencial patogênico para peixes cultivados. Entretanto, os estudos pe- los inventores comparando as micrografias eletrônicas de Lactococcus 20-92 com aquelas da contraparte patogênica (Enterococcus seriolicida KG) reve- laram que diferente da dita cepa patogênica, a cepa da invenção não cápsu- la sobre a superfície de célula. Por isso, a presente cepa é considerada não ter patogenicidade, nem apresenta um problema de contaminação ecológica.
Esta conclusão é também corroborada pela descrição na literatura que se segue. Assim, Yoshida et al. argumenta sobre a patogenicidade de células microbiaís para peixes cultivados que uma cápsula presente sobre a superfí- cie de célula inibe fagocitose por macrófagos, com o resultado de que as bactérias particulares não são mortas mas septicemia é sistemicamente in- duzida em peixes cultivados infectados com as bactérias (T. Yoshida, et al., (1996) Dis. Aquat. Org., 25,81-86).
Além disso, a presente cepa Lactococcus 20-92 retém a deseja- da habilidade de produção de equol (atividade) mesmo no caso de fermen- tação direta em leite e tem a característica de que para a manutenção desta habilidade de produção de equol, nenhum meio de cultura especial é reque- rido. Assim, realizando uma fermentação em leite de soja como usado sozi- nho, a cepa utiliza compostos daidzeína no leite de soja para elaborar equol.
Anteriormente, não há relatório disponível sobre bactérias de ácido lático do gênero Lactococcus que tivessem tal habilidade de produzir equol. Por isso, a presente invenção ainda provê uma nova cepa de bactéria de ácido lático tendo uma tal habilidade de produzir equol. (2) Compostos daidzeína e ingredientes contendo composto daidzeína Compostos daidzeína, que são utilizados pela presente cepa Lacotococcus 20-92, incluem um glicosídeo daidzeína, daidzeína, e diidro- daidzeína. Um específico exemplo do dito glicosídeo daidzeína é daidzina.
Daidzina é um glicosídeo isoflavona tendo daidzeína como a aglicona (glico- sídeo daidzeína). Referindo-se à daidzina, ele é utilizado pela dita cepa de microorganismos para liberar daidzeína que é ainda utilizada pela cepa para render diidrodaidzeína, a partir da qual equol é finaimente produzido.
Na presente invenção, o dito composto daidzeína é usado como o substrato. O substrato inclui não somente compostos daidzeína mas tam- bém vários materiais ou ingredientes contendo o mesmo. Como um exemplo representativo do dito material ou ingrediente contendo os ditos compostos daidzeína (referido como ingrediente contendo composto daidzeína), isofla- vona de soja pode ser mencionada. Isoflavona de soja já é disponível de fontes comerciais e, na presente invenção, tais produtos comerciais, por e- xemplo, "Fujiflavone P10" (marca registrada) de Fujicco Co., Ltd., podem ser usados. Além disso, o dito ingrediente contendo composto daidzeína inclui não somente isoflavona de soja mas também tecidos de plantas tais como, por exemplo, kudzu (=Pueraria thurbergiana Benth) e raiz de kudzu (araru- ta), cravo vermelho, alfafa, etc., e derivados de isoflavona originando-se dos mesmos.
Ainda exemplos do dito ingrediente contendo composto daidzeí- na incluem não somente os materiais alimentícios mencionados acima como soja, kudzu, raiz de kudzu, cravo vermelho, alfafa, etc. mas também seus produtos processados, como farinha de soja, sojas ebulidas, tofu (coalho de soja), coalho de feijão frito, leite de soja, extrato de hipocótilo de soja, etc., seus produtos de fermentação, tais como natto (sojas fermentadas), molho de soja, miso, tempeh, e bebidas de soja fermentadas. Estes materiais inva- riavelmente contêm compostos daidzeína. Além disso, estes não somente contêm compostos daidzeína mas também isoflavonas estrogênicas, como genisteína e seus glicosídeos (genistina, etc.); gliciteína e seus glicosídeos (glicitina, etc.); biochanin A e formononetin que são precursores de daidzeí- na e genistina parcíalmente metilados e podem ser usados com vantagem na presente invenção. (3) Composição da invenção (3-1) Uma composição contendo bactérias de ácido lático produzindo eauol A composição contendo bactérias de ácido lático produzindo e- quol da invenção compreende, como um seu componente essencial, cepa bacterial de ácido lático pertencendo ao gênero Lactococcus tendo uma ha- bilidade para atuar sobre o substrato composto daidzeína ou ingrediente contendo daidzeína para produzir equol, com o Lactococcus 20-92 mencio- nado acima sendo um exemplo representativo. A cepa bacterial de ácido lático para uso como componente essencial usualmente é cepa bacterial viável mas não está limitada a esta e pode ser qualquer de suas cuituras, preparações brutas ou purificadas de tais culturas, que contêm células isola- das, e seus liofilizados.
As culturas da dita cepa bacterial podem ser obtidas tipicamente através do procedimento compreendendo cultura de cepa em um meio apro- priado para seu crescimento, por exemplo, meio MRS, a 37°C por cerca de 48 horas. Seguindo cultura, as células podem ser recuperadas através de, por exemplo, centrifugação de cultura a 3000 rpm (4°C) por 10 minutos. Es- tas podem ser purificadas na maneira convencional. Além disso, estas célu- las podem ser liofilizadas. Os liofilizados resultantes também podem ser utili- zados como o componente ativo da composição da invenção.
Tudo o que é necessário para a composição da invenção é que ela contenha as bactérias (células ou equivalentes) como o dito componente ativo mas, se desejado, a composição pode ser suplementada com nutrien- tes apropriados para a manutenção (ou crescimento) do microorganismo como o dito componente ativo. Os nutrientes mencionados acima podem, por exemplo, ser os meios nutrientes para cultura dos respectivos microor- ganismos, como BHI, EG, BL e GAM, como mencionado anteriormente.
Exemplos de outros nutrientes incluem vários oligossacarídeos, como lacto oligossacarídeo, oligossacarídeo de soja, lactulose, lactitol, fruto oligossacarídeo, e galacto oligossacarídeo. A quantidade de tais oligossaca- rídeos não é particularmente restrita mas é preferivelmente selecionada de uma faixa de modo que sua concentração final na composição da invenção será cerca de 1-3% em peso. A composição da invenção acima, quando tomada oraimente, expressa a desejada atividade de produção de equol no corpo de receptor.
Genericamente os Japoneses têm o hábito de comer alimentos contendo composto daidzeína, tipicamente os materiais ou ingredientes alimentícios mencionados acima, por exemplo, sojas, seus produtos secundários, e seus produtos de fermentação e, por isso, a tomada da composição da invenção resulta na produção de equol in vivo.
Além disso, onde necessário, a composição da invenção pode ser suplementada com apropriadas quantidades de várias vitaminas, ele- mentos metálicos em traços, e assim por diante. Exemplos das ditas vitami- nas incluem vitamina B, vitamina D, vitamina C, vitamina E, e vitamina K [particularmente MK-7 (menaquinona-7) derivada de Bacillus natto]. Exem- plos dos ditos elementos metálicos em traços são zinco, selênio, ferro, man- ganês, etc. A quantidade do microorganismo a ser formulada na composição da invenção pode ser judiciosamente selecionada de acordo com o tipo de cepa bacterial usado. Tomando Lactococcus 20-92 como um exemplo, o número de organismos (contagem de células viáveis) é preferivelmente ajus- tado para cerca de 108~109 células/100 g de composição. A contagem de células viáveis é determinada como se segue. Uma diluição de amostra é revestida sobre um meio ágar para cultura bacterial e cultivada aerobica- mente a 37°C e as colônias formadas são contadas. A quantidade dos mi- croorganismos descrita acima pode ser judiciosamente ajustada de acordo com a forma da composição a ser preparada usando a quantidade mencio- nada acima como uma referência. (3-2) A composição contendo composto daidzeína da invenção A composição da invenção ainda pode conter, se necessário, pelo menos um membro selecionado do grupo consistindo nos compostos daidzeína mencionados anteriormente e ingredientes contendo composto daidzeína. Entre vários tipos de composto daidzeína e ingrediente contendo composto daidzeína, hipocótilos de soja e ingredientes alimentícios prepara- dos partindo com os hipocótilos, são particularmente preferidos, e, entre es- tes, ingredientes alimentícios solúveis em água ou emulsificados são ainda mais preferidos. Entre outros exemplos preferidos do dito ingrediente con- tendo composto daidzeína estão farinha de soja e leite de soja.
Devido ao substrato contido na formulação, uma pessoa não acostumada a comer sojas e ingredientes alimentícios semelhantes pode tomar a composição oralmente, e o microorganismo utiliza o substrato for- mulado para produzir o equol objetivo no corpo. A quantidade do dito composto daidzeína e/ou ingrediente con- tendo composto daidzeína na composição não é particularmente restrita mas pode ser razoavelmente cerca de 10-25 mg que é equivalente à tomada diá- ria usual pelo Japonês médio. (3-3) Composição contendo eauol da invenção A composição da invenção ainda pode conter equol. Generica- mente, o apetite de alguém por um alimento é aguçado quando o material alimentício é feito sofrer fermentação com ácido lático, por exemplo. Além disso, Lactococcus 20-92, que é um exemplo representativo de microorga- nismo para uso na composição da invenção, tem uma habilidade (atividade) de produção de equol muito alta. A presente invenção ainda provê uma composição contendo equol, tal como leite de soja fermentado, que é prepa- rada por permissão da dita cepa de microorganismo atuar sobre um ingredi- ente contendo composto daidzeína tal como leite de soja, e pelo que deixa-lo utilizar o composto daidzeína no leite de soja para elaborar equol.
Como o substrato para uso neste aspecto da invenção, os vários tipos mencionados acima de composto daidzeína e ingrediente contendo composto daidzeína podem ser empregados. Entre estes, soluções e emul- sões preparadas a partir de leite de soja, farinha de soja ou similares são preferidos.
Como um exemplo específico preferido da composição contendo equol da invenção é o produto de fermentação obtido por um processo que compreende adição de isoflavona de soja ou um material alimentício conten- do a mesma a um meio apropriado e cultivando o microorganismo da inven- ção, preferivelmente Ladococcus 20-92, ali para causar fermentação. Mais particularmente, tal fermentação pode ser efetuada através de procedimento que compreende adição de uma quantidade predeterminada do microorga- nismo da invenção a uma mistura de uma solução de substrato esterilizada e um meio nutriente favorável para crescimento do microorganismo, tal como BHI, EG, BL ou GAM, ou a leite de vaca, leite de soja, ou um suco vegetal que pode ser usado como alimento, e realizando uma reação de fermenta- ção anaeróbíca ou aeróbica a 37°C sob condições estacionárias por cerca de 48-96 horas [onde necessário, um agente de controle de pH e um agente redutor (por exemplo, extrato de levedura, vitamina K1( ou similares) pode ser adicionado]. No procedimento acima, a quantidade do substrato pode ser cerca de 0,01-0,5 mg/mL e o tamanho de inóculo do microorganismo podem ser selecionados da faixa de cerca de 1 a cerca de 5%.
Desta maneira, a composição contendo equol da invenção pode ser produzida. Esta composição pode ser aplicada com vantagem na forma descrita acima de um produto de fermentação como um alimento ou um pro- duto farmacêutico. Além disso, o equol produzido pode ser isolado e purifi- cado do caldo de cultura ou produto de fermentação na maneira conhecida per se, opcionalmente formulado com apropriadas quantidades de outros ingredientes alimentícios ou similares, e processado em apropriadas formas alimentícias ou formas de produto farmacêutico. O isolamento e purificação referidos acima podem ser obtidos através de, por exemplo, adsorção de produto de fermentação sobre uma resina de troca de íons (DIAION HP20, produto de Mitsubishi Kasei Corpora- tion), eluindo a mesma com metanol, e concentrando o eluato à secura. A quantidade de equol na composição da invenção é seleciona- da de acordo com a forma de produto alimentício ou farmacêutico a ser pro- duzida e não é particularmente restrita. Preferivelmente, entretanto, a quan- tidade deve ser genericamente tal que cerca de 2-5 mg de equol estarão contidos em cada 100 g da composição totai. A presença de equol na composição produto da invenção pode ser confirmada através do processo descrito a seguir no Exemplo de Teste 1. A composição contendo equol da invenção classifica-se alto na escala de segurança porque o ingrediente ativo equol é uma substância o- correndo naturalmente. Além disso, devido a ser preparado através do uso de cepa bacterial de ácido lático, o risco de contaminação com compostos químicos originando-se da linha de produção é baixo. Como vantagens adi- cionais, alto rendimento e baixo custo assim como sabor salgado e aroma como alimento podem ser mencionados. (3-4) Formas de alimento A composição contendo bactérias de ácido lático produzindo e- quol da invenção é genericamente processada em formas de alimento com- preendendo a particular cepa bacterial de ácido lático como um componente essencial em combinação com um apropriado veículo comestível.
Formas alimentícias específicas da composição da invenção in- cluem a forma de bebida, forma de produto de leite outra que não a dita for- ma de bebida (inclusive de forma de leite fermentado), forma de alimento sólido, forma microencapsulada contendo célula, e assim por diante. A com- posição da invenção na forma de bebida inclui bebidas de bactérias de ácido lático e bebidas contendo bactérias de ácido lático.
Os termos "leite fermentado" e "bebida de bactérias de ácido lático" como aqui usados estão em conformidade com as definições em Arti- go 2-37 "Leite Fermentado" e Artigo 2-38 "Bebida de Bactérias de Ácido Lá- tico" das "Regulations relating to the Ingredients etc. of Milks and Milk Pro- ducts" do Ministry of Health and Welfare. Assim, "leite fermentado" significa uma preparação pastosa ou líquida resultante da fermentação de um leite ou produto de leite (laticínio) com bactérias de ácido lático ou leveduras. Por isso, o "leite fermentado” inclui não somente produtos de forma de bebida mas também produtos de forma de iogurte. A "bebida de bactérias de ácido lático" significa uma bebida preparada através do uso de um produto pasto- so ou líquido resultante da fermentação de um leite ou um produto de leite com uma bactéria de fermentação de ácido lático ou levedura como um ma- terial chefe e diluindo o mesmo com água. A bebida contendo bactérias de ácido lático inclui drinques vege- tais fermentados, drinques de fruta fermentados, e drinques de leite de soja fermentados, etc. Exemplos de itens na forma de produtos de leite outros que não a forma de bebida incluem produtos de forma de coalho como iogur- te. A forma de alimento sólido inclui grânulos, pós (inclusive de, por exemplo, pós secados - congelados de leite fermentado), comprimidos, comprimidos efervescentes, gomas, gotas de goma e sobremesas, etc.
Processamento nestas formas pode ser realizado na maneira convencional. Além disso, o veículo para uso no processamento em tais formas pode ser qualquer veículo comestível. Veículos particularmente pre- feridos são aqueles tendo boa sensação bucal e efeitos de aperfeiçoamento de sabor. Exemplos de tais veículos tendo boa sensação bucal e efeitos de aperfeiçoamento de sabor incluem adoçantes artificiais, sorbitol, xilitol, e as- sim por diante. Outros veículos preferidos são, por exemplo, agentes masca- radores tais como trealose (produto de Hayashibara), ciclodextrina, Beneko- te BMI (produto de Kao Corporation), etc. A bebida contendo bactérias de ácido lático como uma forma de alimento específica preferida é descrita em detalhes abaixo. Processamento em uma tal bebida pode ser realizado através do procedimento que compre- ende cultura de microorganismos em um apropriado material de fermentação contendo nutrientes para o microorganismo, como fluidos derivados de vege- tais ou frutos, leite de soja (soja emulsificada), etc. para pelo que causa fer- mentação do dito material. Os vegetais e frutos para uso como o material de fermentação inclui cortes, triturações, moagens, sucos espremidos, produtos tratados com enzima, e suas diluições ou concentrados. Os vegetais incluem abóboras, cenouras, tomates, pimenta doce, aipo, espinafre, batatas doces pigmentadas, milho, beterrabas, couve, salsa, repolhos, e brócolis, etc. Os frutos incluem maçãs, pêssegos, bananas, morangos, uvas, melancias, la- ranjas e laranjas mandarin, etc.
Os cortes, triturações e moagens de vegetais e frutos podem ser obtidos através de, por exemplo, procedimento que compreende lavagem de vegetal ou fruto, sujeição do mesmo a um tratamento de branqueamento, por exemplo, colocação em água quente, onde necessário, e corte, pulveri- zação ou moagem do mesmo por meio de um triturador, misturador, proces- sador de alimentos, acabador de polpa, Mycolloider, ou similar. Sucos po- dem ser preparados através do uso de um filtro prensa, misturador formador de suco, ou similar. Sucos também podem ser preparados por filtração das ditas triturações (moagens) através de um pano de filtro ou similar. Os pro- dutos tratados com enzima podem ser preparados permitindo que celulase, pectinase, protopectinase, ou similar atuem sobre os ditos cortes, tritura- ções, moagens ou sucos. As diluições incluem diluições aquosas de 1 a 50 vezes. Os concentrados incluem aqueles concentrados 1 a 100 vezes por meios tais como concentração de congelamento, concentração sob pressão reduzida, etc.
Leite de soja que é um outro exemplo específico do material substrato de fermentação pode ser preparado a partir de materiais de soja na maneira de rotina. O leite de soja inclui um homogenato preparado por imersão de sojas descascadas em água, pulverização úmida destas sojas com um apropriado moinho ou similar, e homogeneização de pulverizado na maneira rotineira e uma solução de proteína de soja solúvel em água, etc. A fermentação usando um microorganismo pode ser realizada através de inoculação de dito material substrato de fermentação com o mi- croorganismo da invenção e incubação de material inoculado sob condições estacionárias. O meio opcionalmente pode ser suplementado com substân- cias de promoção de fermentação assegurando bom crescimento dos micro- organismos usados, por exemplo, várias fontes de carbono como glicose, amido, sacarose, lactose, dextrina, sorbitol, frutose, etc., fontes de nitrogênio como extrato de levedura, peptona, etc., vitaminas e minerais. O tamanho de inóculo do microorganismo deve ser generica- mente equivalente a uma contagem de células viáveis de não menos que cerca de 1 x 106 células, preferivelmente cerca de 1 x 107 células por centí- metro cúbico do fluido de substrato de fermentação. Com relação a condi- ções de cultura, a temperatura de fermentação é genericamente selecionada da faixa de cerca de 20-40°C, preferivelmente cerca de 25-37°C, mais prefe- rivelmente 37°C e o tempo de fermentação é selecionado da faixa de cerca de 8-24 horas.
Para fermentação estável, é recomendável preparar um iniciador em avanço e inocular o material substrato de fermentação com o iniciador para fermentação. O iniciador representativo pode, por exemplo, ser cultura obtida por inoculação de presente cepa de microorganismos da invenção no dito material de substrato de fermentação submetido a usual esterilização a 90-121°C por 5-20 minutos anteriormente, leite em pó desnatado 10% su- plementado com extrato de levedura, ou similar e cultivo de microorganismo sob as mesmas condições como acima. O iniciador assim preparado usual- mente contém cerca de 107-109 células do microorganismo da invenção por grama da cultura. O produto de fermentação de ácido lático obtido da maneira a- cima pode às vezes ser uma forma coalho (uma forma semelhante a iogurte ou semelhante à sobremesa) e um tal produto pode ser diretamente tomado como um alimento. O produto de fermentação de ácido lático na dita forma de coalho pode ser ainda homogeneizado para preparar a desejada forma de bebida (por exemplo, uma bebida de leite de soja fermentado). Esta ho- mogeneização pode ser realizada usando um homogeneizador comum. Mais particularmente, ela pode ser realizada usando homogeneizador de alta pressão de Gaulin [LAB 40] em cerca de 200-1000 kgf/cm2, preferivelmente cerca de 300-800 kgf/cm2, ou um homogeneizador Sanwa Machine Industry Co. (número de artigo: HA x 4571, H20-A2, etc.) em não menos que 150 kg/cm2. Através desta homogeneização, um produto de bebida, particular- mente uma bebida de leite de soja fermentado, que tem excelente palatalabi- lidade, particularmente uma sensação bucal suave, pode ser obtida. Na rea- lização da dita homogeneização, é permissível, onde necessário, para reali- zar apropriada diluição, adicionar um ácido orgânico para ajuste de pH, e/ou adição de vários aditivos que são usualmente empregados na fabricação de bebidas, tais como açúcares, sucos de frutas, reforçadores de viscosidade, tensoativos, e aromas, em quantidades apropriadas. Como um exemplo pre- ferido específico de cada tipo de aditivo mencionado acima e seu nível de adição (% em peso baseado no peso do produto de fermentação em forma de coalho) são: glicose 8% (% em peso, o mesmo se aplica a seguir), açúcar 8%, dextrina 8%, ácido cítrico 0,1%, éster de ácido glicerol graxo 0,2%, e aroma 0,1%.
Assim, a bebida de bactérias de ácido lático obtida da invenção tal como uma bebida de leite de soja fermentado pode ser assepticamente dispensada em apropriados recipientes na maneira convencional para pro- vimento de produto final. Este produto tem boa palatalabilidade permitindo que seja engolido de modo uniforme e um bom sabor. A dosagem (quantidade de tomada) do produto acima pode ser judiciosamente selecionada de acordo com a idade, sexo, peso do corpo, e seriedade de doença do receptor, entre outras variáveis, e não é particular- mente restrita. Genericamente, 100-300 mL de um produto de bebida com uma contagem de células viáveis de 108-109 células/mL podem ser ingeridos por dia.
Ainda um exemplo específico da composição da invenção na forma de alimento é a forma de comprimido efervescente. Esta forma pode ser preparada através de formulação de 10-35% (% em peso; o mesmo se aplica abaixo) de carbonato de sódio e/ou hidrogenocarbonato de sódio e 20-70% de um neutralizador, como ingredientes efervescentes, com 0,01 - 50% das bactérias (células liofilizadas) da invenção. O neutralizador para ser usado desta maneira é um composto ácido capaz de neutralizar o dito car- bonato de sódio e/ou hidrogenocarbonato de sódio para gerar gás dióxido de carbono. Exemplos representativos do dito neutralizador são ácidos orgâni- cos como ácido L-tartárico, ácido cítrico, ácido fumárico e ácido ascórbico. A quantidade de ditos ingredientes efervescentes no produto efervescente da invenção é tal que quando este produto da invenção é dis- solvido em água, a solução mostra acidez, particularmente uma acidez de pH de cerca de 3,5-4,6. Mais particularmente, a quantidade pode ser sele- cionada da faixa de 10-35% de carbonato de sódio e/ou hidrogenocarbonato de sódio e 20-70% neutralizador. Particularmente, a quantidade de carbona- to de sódio é selecionada da faixa de 11-31%, preferivelmente 22-26%; hi- drogenocarbonato de sódio da faixa de 10-35%, preferivelmente 20-30%.
Entre estas escolhas alternativas, é mais preferível usar hidrogeno carbona- to de sódio sozinho dentro da faixa de 20-25%. A quantidade do neutraliza- dor é selecionada da faixa de 20-70%, preferivelmente 30-40%. Em particu- lar, é mais preferível usar ácido L-tartárico dentro da faixa de 20-25% e ácido ascórbico dentro da faixa de 8-15%. O produto efervescente contém os microorganismos da invenção e os ingredientes efervescentes como componentes essenciais e pode op- cionalmente conter apropriadas quantidades de vários aditivos conhecidos tais como excipiente, aglutinante, desintegrador, lubrificante, reforçador de viscosidade, tensoativo, agente de modulação de osmolaridade, eletrólito, adoçante, aroma, corante, agente de controle de pH, e assim por diante. E- xemplos dos aditivos são amidos tais como amido de trigo, amido de batata, amido de milho, dextrina, etc.; sacarídeos tais como sacarose, glicose, fruto- se, maltose, xílose, lactose, etc.; álcoois de açúcar tais como sorbitol, mani- tol, maltitol, xiiitol, etc.; glicosídeos de rearranjo de açúcar como açúcar de acoplamento, palatinose, etc.; excipientes tais como fosfato de cálcio, sulfato de cálcio, etc; aglutinantes / espessantes tais como amidos, sacarídeos, ge- latina, goma arábica, dextrina, metil celulose, poli vinil pirrolidona, álcool po- lívinílíco, hidróxi propil celulose, goma xantana, pectina, goma tragacanto, caseína, ácido algínico, etc.; lubrificantes tais como leucina, isoleucina, L- valína, ésteres de açúcar, óleos hidrogenados, ácido esteárico, estearato de magnésio, talco, macrogols, etc.; desintegrantes tais como celulose cristalina (Avicel, Asahi Chemical Industry Co., Ltd.), carbóxi metil celulose (CMC), carbóxi metil celulose sódica (CMC-Na), carbóxi metil celulose cálcica (CMC- Ca), etc.; tensoativos tais como éster de ácido polioxietileno sorbitano graxo (polissorbato), íecitina, etc.; dipeptídeos tais como aspartame, alitame, etc., e adoçantes tais como stevia, sacarina, e assim por diante. Estes podem ser judiciosamente selecionados e usados em apropriadas quantidades levando em consideração a relação de cada para os componentes essenciais, a pro- porção da preparação, e processo de produção da preparação, entre outros fatores.
Além disso, na preparação efervescente da invenção, vitaminas, particularmente ciano cobalamina e ácido ascórbico (vitamina C), podem ser formulados em apropriadas quantidades. A quantidade não é particularmen- te restrita mas usualmente vitamina C, por exemplo, pode ser adicionada até 30% no máximo, preferivelmente dentro da faixa de cerca de 5-25%. O processo de produção de preparação efervescente da inven- ção pode ser fundamentalmente similar ao processo convencional para pro- dução de comprimidos efervescentes deste tipo. Assim, a preparação da invenção na forma de comprimido efervescente pode ser preparada através de pesagem de quantidades predeterminadas dos respectivos ingredientes, misturando os mesmos, e processando o todo através de processo de com- pressão de pulverizado direta ou o processo de compressão - granuiação seca ou úmida, por exemplo. A preparação da invenção, assim obtida, pode ser convertida a uma forma de bebida apropriada para administração oral através de mera colocação em água e ser administrada oralmente. A sua dosagem (quantidade de tomada) pode ser judiciosamen- te estabelecida de acordo com a idade, sexo, peso de corpo, seriedade de doença do receptor, entre outras variáveis, e não é particularmente restrita mas genericamente 1-2 comprimidos da forma de comprimido efervescente da invenção pesando cerca de 1,5-6,0 g por comprimido podem ser dissolvi- dos em 100-300 mL de água e ingeridos por dose.
As proporções de combinação particularmente preferidas do composto daidzeína substrato ou ingrediente contendo composto daidzeína, a particular cepa bacterial de ácido lático, e opcionalmente outros ingredien- tes formulados na composição da invenção, por 100 g da composição, são: o composto daidzeína ou ingrediente contendo composto daidzeína dentro da faixa de cerca de 10-50 mg calculado como daidzeína, o número da cepa bacterial de ácido lático dentro da faixa de 109-1010 células (contagem de células viáveis), e oligossacarídeos e outros dentro da faixa de cerca de 1-5 9· Uma vez que a composição contendo bactérias de ácido lático produzindo equol da invenção é designada para conter um microorganismo (primariamente bactérias vivas) como mencionado anteriormente, condições tais como a aplicação de calor e pressão não são recomendáveis no proces- samento da composição em produtos finais. Por isso, no processamento de composição da invenção em formas de produto tais como barras, grânulos, pós, e comprimidos, é preferível formular diretamente o microorganismo na forma de células liofilizadas ou usar células liofilizadas tratadas com um a- propriado agente de revestimento.
Entretanto, a composição contendo bactérias de ácido lático produzindo equol da invenção não precisa essencialmente conter bactérias viáveis. Quando a dita composição compreendendo bactérias viáveis e o dito composto daidzeína ou similar cujas ditas bactérias podem utilizar equol produzido por bactérias, ela pode ser submetida a uma esterilização térmica de rotina para matar as bactérias. Uma tal esterilização térmica dada à com- posição inibe deteriorações de sabor e aroma causadas por excessiva fer- mentação das bactérias viáveis formuladas na composição durante estoca- gem ou distribuição para o mercado. (3-5) Formas de produto farmacêutico A composição contendo bactérias de ácido lático produzindo e- quol da invenção pode ser processada em preparações farmacêuticas gene- ricamente contendo a dita cepa bacterial de ácido lático definida como um componente essencial junto com um veículo farmaceuticamente aceitável apropriado. O veículo inclui vários diluentes e excipientes, como materiais de enchimento, reforçadores de volume, aglutinantes, umectantes, desintegran- tes, tensoativos, lubrificantes, etc. que são conhecidos para serem usados na técnica. Estes podem ser usados seletivamente de acordo com a forma de dosagem unitária da preparação.
Como a forma de dosagem unitária da preparação farmacêutica, uma variedade de formas pode ser seletivamente usada. As formas repre- sentativas são comprimidos, pílulas, pós, soluções, suspensões, emulsões, grânulos, cápsulas, e supositórios. O veículo que pode ser usado no processamento na forma de comprimido inclui vários excipientes como lactose, sacarose, cloreto de só- dio, glicose, uréia, amido, carbonato de cálcio, caulim, celulose cristalina, ácido silícico, fosfato de potássio, etc.; aglutinantes tais como água, etanol, propanol, xarope simples, solução de glicose, solução de amido, solução de gelatina, carbóxi metil celulose, hidróxi propil celulose, metil celulose, poli vinil pirrolidona, etc; desintegrantes tais como carboxi metil celulose sódica, carboxi metil celulose cálcica, hidroxi propil celulose substituída - inferior, amido seco, alginato de sódio, ágar pulverizado, laminaran pulverizado, hi- drogenocarbonato de sódio, carbonato de cálcio, etc.; tensoativos tais como ésteres de ácido polioxietiieno sorbitano graxo, lauril sulfato de sódio, mono- glicerídeo de ácido esteárico, etc.; inibidores de desintegração como sacaro- se, estearina, manteiga de cacau hidrogenada, óleos hidrogenados, etc.; promotores de absorção como bases de amônio quaternário, lauril sulfato de sódio, etc.; umectantes como glicerol, amido, etc.; adsorventes como amido, lactose, caulim, bentonita, sílica coloidal, etc.; e lubrificantes tais como talco purificado, estearatos, ácido bórico pulverizado, polietileno glicol, e assim por diante.
Além disso, onde necessário, comprimidos podem ser prepara- dos nas formas tendo os revestimentos convencionais como comprimidos revestidos com açúcar, comprimidos revestidos com gelatina, comprimidos revestidos entéricos, comprimidos revestidos com filme, etc., ou na forma de comprimidos de camada dupla ou comprimidos muiticamadas. O veículo que pode ser usado na formação de pílulas incluem vários excipientes como glicose, lactose, amido, manteiga de cacau, óleos vegetais hidrogenados, caulim, talco, etc.; aglutinantes tais como goma ará- bica pulverizada, goma tragacanto pulverizada, gelatina, etanol, etc.; e de- sintegrantes como laminaran, ágar e assim por diante. O veículo que pode ser usado na formação de supositórios inclui polietileno glicol, manteiga de cacau, álcoois superiores, ésteres de álcool superior, gelatina, e glicerídeos semi - sintéticos, etc. O produto encapsulado pode ser genericamente fabricado através de combinação de bactérias da invenção com vários tipos de veículos farmacêuticos tais como aqueles mencionados acima e enchendo a mistura em invólucros de cápsula dura ou invólucros de cápsula elástica macia na maneira convencional.
Além disso, onde necessário, corante, conservatne, flavorizante, corretor, adoçante, e outras drogas podem ser incorporadas no produto far- macêutico da invenção. A quantidade do microorganismo da invenção a ser incorporada na preparação da invenção não é particularmente restrita mas pode ser crite- riosamente selecionada a partir de uma ampla faixa. A proporção generica- mente recomendada é cerca de 108-101° células/g da preparação farmacêu- tica. O processo de administração da preparação farmacêutica acima não é particularmente restrito mas pode ser estabelecido de acordo com as formas de preparação, vários fatores de paciente tais como idade, sexo, etc. e a seriedade de doença. Por exemplo, os comprimidos, pílulas, soluções, suspensões, emulsões, grânulos, e cápsulas são administrados oralmente e os supositórios são administrados retalmente. A dosagem da dita preparação farmacêutica pode ser criterio- samente estabelecida de acordo com o processo de administração, a idade de paciente, sexo e outros fatores, e a seriedade de doença mas é preferi- velmente cerca de 0,5 - 20 mg/dia em termos do microorganismo da inven- ção, isto é, ingrediente ativo, por kg de peso de corpo. Esta preparação pode ser administrada em 1-4 doses divididas por dia.
Na ingestão (administração) da composição da invenção, o mi- croorganismo na composição encontra seu caminho vivo no trato digestivo inferior ou deposita ali como parte da flora intestinal, pelo que a esperada eficácia é expressa. Neste sentido, a forma de preparação particularmente preferida é o comprimido revestido - entérico, com o qual o microorganismo pode ser transportado para os intestinos sem ser atacado por ácido gástrico. A composição contendo bactérias de ácido lático produzindo e- quoi da invenção como obtida da maneira acima é útil para a profilaxia sin- tomática e tratamento de indisposição e/ou osteoporose pós-menopausa e distúrbios climatéricos em mulheres de média idade e idosas. Tal profilaxia e tratamento podem ser realizados através de administração de uma quanti- dade efetiva da dita composição da invenção à mulher de média idade ou idosa para a qual é requerida ou fazendo-a ingerir a mesma. A quantidade efetiva mencionada justo acima não é particularmente restrita tanto quanto seja suficiente para prevenir e controlar as várias manifestações de osteopo- rose e distúrbios climatéricos acompanhando indisposição e/ou menopausa em mulheres de média idade e idosas. Como uma regra, entretanto, a dosa- gem pode ser genericamente selecionada de modo que a quantidade de e- quol excretada na urina da pessoa que tomou a composição da invenção atinja pelo menos 5 pmoles (cerca de 1,2 mg)/dia.
Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 é uma representação diagramática mostrando a rela- ção de tempo de incubação para contagem de células viáveis como determi- nada pelo protocolo de teste descrito no Exemplo de Teste 1. A Figura 2 é uma representação diagramática mostrando a rela- ção de tempo de incubação para habilidade de produção de equol (escore) como determinada pelo protocolo de teste descrito no Exemplo de Teste 1. A Figura 3 é uma representação diagramática mostrando a rela- ção de tempo de incubação para produção de equol como determinada pelo protocolo de teste descrito no Exemplo de Teste 1. A Figura 4 é uma representação diagramática mostrando o curso de tempo de concentração de cada um de compostos daidzeína e equol na cultura como monitorada de acordo com o protocolo descrito no Exemplo de Teste 2. A Figura 5 é uma representação diagramática mostrando a rela- ção de período de estocagem para habilidade de produção de equol (escore) como determinada de acordo com o protocolo de teste descrito no Exemplo de Teste 3. A Figura 6 é uma representação diagramática mostrando os comportamentos dependentes de tempo de incubação da cepa produzindo equol (mudanças em performance de crescimento, habilidade de produção de equol, e produção de equol) como determinados pelo experimento descri- to no Exemplo de Teste 1-3. A Figura 7 é uma representação diagramática mostrando a rela- ção de tempo de incubação para contagem de células viáveis como determi- nada pelo protocolo de teste descrito no Exemplo de Teste 4.
Melhor Modo Para Realização da Invenção Os exemplos que se seguem de produção da composição con- tendo bactérias de ácido lático produzindo equol da invenção são pretendi- dos descreverem a presente invenção ainda em detalhes e não devem ser construídos como definindo a invenção.
Exemplo 1 (1) Produção de uma bebida de leite de soja fermentado Os seguintes ingredientes foram tomados de acordo com a fór- mula e combinados para preparação da composição da invenção na forma de uma bebida de leite de soja fermentado.
Cultura de fermentação de proteína de soja Solúvel em água 100 mL
Vitaminas & minerais q.s.
Aromatizante q.s. Água q.s.
Total 150 mL A cultura fermentativa acima de proteína de soja solúvel em á- gua foi obtida pela dissolução de 13 g de proteína de soja solúvel em água em 100 mL de água, adição de 108-109 células de Lactococcus 20-92 (FERM BP-10036), e realizando fermentação a 37°C por 24-48 horas. A pro- teína de soja solúvel em água usada conteve cerca de 1-2 mg, calculado como daidzeína, de compostos daidzeína em cada um grama. (2) Produção de um leite fermentado Os seguintes ingredientes foram tomados de acordo com a fór- mula e combinados para preparação de composição da invenção em uma forma de leite fermentado.
Leite fermentado Lactococcus 20-92 100 mL
Vitaminas & minerais q.s.
Aromatizante q.s. Água q.s.
Total 150 mL O leite fermentado Lacotococcus 20-92 foi obtido pela adição de 108-109 células de Lactococcus 20-92 (FERM BP-10036) a 1 L de leite de vaca (tendo um teor de sólidos de leite não-gordura de 8,5% ou maior e um teor de gordura de leite de 3,8% ou maior) e realizando fermentação a 37°C por 24-48 horas. (3) Produção de um pulverizado secado - congelado de leite de soja fermen- tado Usando cerca de 109 células de Lactococcus 20-92 (FERM BP- 10036) e 100 g de leite de soja (10% de sólidos de soja, teor de composto daidzeína 10-15 mg calculado como daidzeína), fermentação de ácido lático foi realizada a 37°C por 72-96 horas para a produção de equol. Este produto de fermentação foi secado congelado para preparar um pulverizado. O teor de equol do pulverizado como determinado por HPLC foi 0,1-0,3 % em peso. O pulverizado obtido acima e vários outros ingredientes foram pesados de acordo com a seguinte fórmula e combinados para preparação de composição da invenção na forma pulverizada (forma de alimento e for- ma de produto farmacêutico).
Pulverizado secado - congelado de leite de soja fermentado (teor de equol 0,005 g) 2,2 g excipiente (amido de milho) 17 g vitaminas e minerais q.s. aromatizante q.s. total 20 g (4) Produção de um pulverizado Os seguintes ingredientes foram pesados de acordo com a fór- mula e combinados para preparação de composição da invenção em uma forma pulverizada (forma de alimento e forma de produto farmacêutico).
Pulverizado secado - congelado de Lactococcus 20-92 4,1 g Excipiente (lactose) 1,0 g Vitaminas & minerais q.s.
Aromatizante q.s.
Total 20 g Um pulverizado secado - congelado de Lactococcus 20-92 foi obtido através de cultura de Lactococcus 20-92 (FERM BP-10036) em um meio de crescimento líquido apropriado (MRS)(37°C, 24-48 horas), colheita e suspensão de células crescidas em leite desnatado 10%, e liofilizando a suspensão. O teor de células do pulverizado foi 109-101° células/g. O pulverizado acima foi feito em um pulverizado contendo daid- zeína através de combinação do mesmo com ainda 4,1 g de pulverizado de isoflavona de soja semipurificada.
Tomada do pulverizado contendo daidzeína assim obtido resulta nas excreções de equol urinárias de cerca de 5 pmoles (cerca de 1,2 mg) por dia, indicando claramente que a quantidade de equol correspondendo às excreções acima podem ser produzidas in vivo. (5) Produção de grânulos Os seguintes ingredientes foram pesados de acordo com a fór- mula e combinados para preparação de composição da invenção em uma forma granular (forma de alimento e forma de produto farmacêutico).
Pulverizado de isoflavona de soja semipurificada 4,1 g Pulverizado secado - congelado de Lactococcus 20-92 1,0 g Ester de ácido de sacarose q.s.
Vitaminas & minerais q.s.
Aromatizante q.s.
Total 20 g O pulverizado secado - congelado de Lactococcus 20-92 usado foi o mesmo como aquele usado acima em (1).
Tomada da composição acima resulta na simultânea liberação de daidzeína e bactérias produzindo equol para o intestino grosso, assim permitindo produção de equol no intestino grosso.
Exemplos de Teste com relação à cepa bacterial de ácido tático produzindo equol da invenção são apresentados abaixo.
Exemplo de Teste 1 Teste para performance de crescimento, habilidade (atividade) de produção de equol, e produção de equol (1) Protocolo de Teste Lactococcus 20-92 (107-109 células / g) foi incubado em 5 mL de caldo BHI [um meio líquido para crescimento (meio basal)] anaerobicamente a 37°C por 24 horas e a cultura foi diluída para 102 e 104 células com o meio basal. A cultura obtida no término de incubação e suas diluições prepa- radas acima foram respectivamente tomadas, 0,2 mL cada, e combinadas com 5 mL cada de meio basal suplementado com daidzeína (daidzeína adi- cionada a caldo BHI em uma concentração final de 10 pg/mL), leite de vaca e leite de soja, respectivamente, e cultivado anaerobicamente a 37°C. O tempo de incubação foi fixado para 8, 24, 48, 72, e 96 horas no caso de 10 pg/mL de meio basal suplementado com daidzeína e leite de soja, e 8, 24 e 48 horas no caso de leite de vaca.
Antes de início de incubação e no fim de cada período de incu- bação, porções de 0,1 mL e 0,2 mL da cultura foram amostrados e respecti- vamente submetidos à contagem de células e ensaio de habilidade (ativida- de) de produção de equol. Além disso, para 10 pg/mL de meio basal conten- do daidzeína e leite de soja, 0,5 mL de cada cultura foi amostrado antes de início de incubação e no fim de cada período de incubação e a quantidade de equol produzida em cada amostra foi determinada. O número de bactérias foi determinado da seguinte maneira.
Cada amostra de 0,1 mL foi diluída com PBS(-)(produto de Nissui Co.) para preparar diluições de 104,105,10® e 107 vezes e 0,1 mL de cada uma destas diluições foi respectivamente revestido sobre meio ágar GAM e incubado aerobicamente a 37°C por 24 horas. As colônias formadas sobre o meio fo- ram contadas para uso como o número de bactérias. A habilidade (atividade) de produção de equol foi ensaiada como se segue. Cada amostra de 0,2 mL foi combinada com 5 ml_ de meio basal suplementado com daidzeína (cada um em triplicata) e incubada anaerobi- camente a 37°C por 96 horas. No término de incubação, amostras de 0,5 mL das respectivas culturas foram tomadas e respectivamente extraídas duas vezes com porções de 5 mL de acetato de etila e a daidzeína, diidrodaidzeí- na (intermediário), e equol no extrato foram quantificados por HPLC. Além disso, na quantidade total, a porcentagem de equol foi calculada. Os resulta- dos foram feitos escore sobre a seguinte escala de 5-pontos e o escore mé- dio de 3 amostras foi usado como um índice de habilidade (atividade) de produção de equol. 4: Equol (90% ou maior) 3: Equol produzido, com daidzeína diminuindo para menos que 50% (formação de intermediário) 2: Equol produzido, daidzeína residual (50% ou maior) (formação de intermediário) 1: Intermediário formado, equol não produzido 0: Nem intermediário nem equol produzido, com daidzeína não di- minuindo A quantidade de equol produzida foi determinada como se se- gue. Cada amostra de 0,5 mL foi extraída duas vezes com porções de 5 mL de acetato de etila e as quantidades de daidzeína, diidrodaidzeína (interme- diário) e equol no extrato foram quantificadas por HPLC. Então, as respecti- vas concnetrações foram usadas para calcular a quantidade de equol produ- zida. (2) Resultados de Teste (2-1) Os resultados de contagem das células (performance de crescimento) são apresentados na Figura 1.
Na representação diagramática, (1) representa o resultado obti- do no caso onde o meio basal suplementado com daidzeína foi usado, (2) representa o resultado obtido no caso onde leite de soja foi usado, e (3) re- presenta o resultado obtido quando leite de vaca foi usado. Em cada dia- grama, o eixo horizontal representa tempo de incubação (h) e o eixo vertical representa contagem de células viáveis (Log CFU/mL).
Pode ser visto a partir de respectivos diagramas, a performance de crescimento da cepa da invenção é boa e, independente do tamanho de inóculo usado, a fase estacionária de crescimento foi invariavelmente obtida em 8 horas de incubação em todos os meios basais suplementados com daidzeína, leite de soja e leite de vaca. A contagem de células viáveis foi verificada ser estável em 109,1'9,4 CFU/mL no meio basal suplementado com daidzeína, 108,5'8,7 CFU/mL em leite de soja e 108,0'8,4 CFU/mL em leite de vaca. (2-2) Os valores de habilidade (atividade) de produção de equol encontrados são apresentados na Figura 2.
Na Figura 2, (1) representa o resultado obtido no caso onde o meio basal suplementado com daidzeína foi usado, (2) representa o resulta- do obtido no caso onde leite de soja foi usado, e (3) representa o resultado obtido no caso onde leite de vaca foi usado. Em cada diagrama, o eixo hori- zontal representa tempo de incubação (h) e o eixo vertical representa escore de atividade. É óbvio a partir de resultados apresentados na Figura 2 que a habilidade (atividade) de produção de equol tende a aumentar com o tempo em qualquer um do meio basal suplementado com daidzeína, leite de soja, e leite de vaca. Também pode ser confirmado que mesmo nos casos onde leite de vaca e leite de soja foram usados, a habilidade de produção de e- quol da cepa da invenção é sustentada. (2-3) Resultados da determinação de quantidade de equol produzida As quantidades de equol produzidas no meio basal suplementa- do com daidzeína e leite de soja (cerca de 80 pg/mL calculada como daidze- ína) foram como mostradas na Figura 3.
Referindo-se à Figura 3, (1) representa o resultado obtido no caso onde o meio basal suplementado com daidzeína foi usado e (2) repre- senta o resultado obtido no caso onde leite de soja foi usado. Em cada dia- grama, o eixo horizontal representa tempo de incubação (h) e o eixo vertical representa concentração de equol (pg/mL).
Em ambos os meios, a produção de equol começou a ser notada em 48 horas seguindo o início de incubação. No caso onde foi usado leite de soja, a quantidade de equol produzida variou com tamanho de inóculo e par- ticularmente no nível de inoculação de 4,00%, a produção de equol foi tão grande como 57,0 pg/mL em 96 horas de incubação.
Embora, em leite de soja, não menos que 90% de daidzeína servindo como o precursor de equol estejam presentes na forma de glicosí- deo {na forma de glicose ligada), o pico correspondendo ao glicosídeo não foi mais observado sobre o cromatograma pós-incubação e este fato sugere que a cepa da invenção decomponha o glicosídeo (atividade beta- glucosidase) para render daidzeína e ainda metaboliza esta daidzeína a e- quol.
Exemplo de Teste 2 Caminho de produção de equol em Lactococcus 20-92 (1) Protocolo de Teste Lactococcus 20-92 (107 células/mL) foi cultivado aerobicamente em 5 mL de caldo BHI (um meio líquido para crescimento, meio basal) a 37°C por 24 horas e 0,2 mL da resultante cultura foi combinado com 5 mL de meio basal suplementado com daidzeína e a mistura foi incubada anaerobi- camente a 37°C. O tempo de incubação foi fixado para 8 h, 24 h, 30 h, 36 h, 48 h, 51 h, 54 h, 60 h, 84he96h.
Antes do início de incubação e no fim de cada período de incu- bação, amostras de 0,5 mL foram tomadas e as concentrações de daidzeína, diidrodaidzeína (intermediário) e equol em cada amostra foram determina- das. (2) Resultados Os resultados obtidos são apresentados na Figura 4. A Figura 4 é uma representação diagramática das mudanças com o tempo nas concentrações de daidzeína (esquerda), diidrodaidzeína (centro), e equol (direita). Em cada diagrama, o eixo horizontal representa tempo de incubação (h) e o eixo vertical representa a concentração (pg/mL) da correspondente substância.
Será visível a partir dos dados apresentados na Figura 4 que a concentração de daidzeína comece a declinar em 48 horas de incubação, o composto intermediário diidrodaidzeína foi formado durante o período de 48 horas a 60 horas, e a produção de equol comece em 48 horas. Também po- de ser confirmado que o metabolismo de daidzeína para equol seguiu subs- tancialmente para término em 60 horas, Embora os resultados acima tenham indicado que o metabolis- mo de daidzeína para equol ocorreu através do dito composto intermediário diidrodaidzeína, os resultados também sugeriram que a formação de diidro- daidzeína e seu metabolismo para equol ocorreram em paralelo.
Exemplo de Teste 3 Estabilidade em baixa temperatura de leites fermentados contendo cepa Lactococcus 20-92 fT) Protocolo de Teste Lactococcus 20-92 foram cultivados em 5 ml_ de um meio líquido para crescimento (meio basal) anaerobicamente a 37°C por 24 horas, a re- sultante cultura foi usada para inocular 1 L e 2 L de leite de vaca e 1 L de leite desnatado comercial (10% de sólidos), respectivamente, no nível de 4% e cultivados aerobicamente sob condições estacionárias a 37°C por 48 ho- ras. As culturas foram estocadas a 4°C. No caso de leite de vaca, a habilida- de (atividade) de produção de equol foi monitorada em uma base semanal seguindo término de cultura através de 4 semanas de estocagem em baixa temperatura a 4°C. Além disso, dois dos tubos foram reservados e estoca- dos até dia 42 e dia 51, respectivamente, e a atividade foi determinada em cada caso.
No caso de leite desnatado, a atividade foi determinada no tér- mino de cultura e em semana-1 e dia-34 de estocagem em baixa temperatu- ra a 4°C.
Os escores de atividade antes de estocagem e no fim de cada período de estocagem foram gerados através do processo descrito acima compreendendo inoculação de 5 mL de 10 pg/mL de meio basal suplemen- tado com daidzeína no nível de 4% (0,2 mL) em triplicata, cultivando o mi- croorganismo anaerobicamente a 37°C por 96 horas, e determinando as concentrações de daidzeína, diidrodaidzeína (intermediário), e equol para escore de atividade. (2) Resultados Os resultados são apresentados na Figura 5. Na Figura 5, o eixo horizontal representa período de estocagem (dias) e o eixo vertical represen- ta escore de atividade. É aparente a partir desta representação diagramática de resulta- dos que, tanto quanto leite de vaca está relacionado, a habilidade (atividade) de produção de equol é sustentada por 4 semanas de estocagem em baixa temperatura a 4°C após término de cultura em ambos os casos de 1 L e 2 L.
Além disso, no caso de 2 L de leite de vaca, a atividade foi verificada ser sustentada para dia 51, que foi o último dia de monitoração da estabilidade de estocagem a 4°C. No caso de 1 L de leite desnatado comercial, também, a habilidade (atividade) de produção de equol foi aparentemente sustentada para dia 34, o último dia de monitoramento da estabilidade de estocagem em baixa temperatura a 4°C após término de cultura.
Os resultados anteriores indicam que o leite fermentado prepa- rado através de uso de Lactococcus 20-92 é capaz de reter a atividade mesmo sob condições de estocagem em baixa temperatura e, por isso, é também apropriado para distribuição de alimento. A relação da performance de crescimento de Lactococcus 20-92 para sua habilidade (atividade) de produção de equol e a quantidade de e- quol produzida como deduzível a partir dos resultados obtidos nos Exemplos Testes 1-3 acima pode ser diagramaticamente representada como mostrado na Figura 6.
Assim, embora condições de cultura tenham variado com dife- rentes meios de cultura, a habilidade (atividade) de produção de equol pode ser mantida em ambas, a fase de crescimento e a fase estacionária. Por ou- tro lado, com relação à produção de equol, parece que a enzima começa a ser expressa ou ativada para produzir equol após um certo retardo de tempo na fase estacionária.
Exemplo de Teste 4 Teste de tolerância de suco gástrico do leite fermentado preparado através do uso de Lactococcus 20-92 (1) Protocolo de Teste Lactococcus 20-92 foram cultivados anaerobicamente em 5 mL de um meio líquido para crescimento anaeróbico (caldo BHI, meio basal) a 37°C por 24 horas. A resultante cultura (109 células/g) foi usada para inocu- lar 1 L de leite de vaca no nível de 4% e incubada aerobicamente sob condi- ções estacionárias a 37°C por 48 horas. Após término de cultura, o leite foi estocado a 4°C e, olhando o mesmo como leite fermentado, foi submetido ao seguinte teste.
Como sucos gástricos artificiais, 0,045% de tampões glicina-HCI 50 mM suplementados com pepsina (pH 2,5 e pH 3,0) foram preparados.
Como controle, tampão glicina-HCI 50 mM (pH 6,0) foi preparado. A 9 mL de cada suco gástrico artificial, 1 mL do leite fermentado estocado em baixa temperatura foi adicionado e a mistura foi incubada (cul- tivada) aerobicamente sob condições estacionárias em uma incubadora a 37°C. O tempo de incubação foi fixado em 1 h, 2 h e 3 h, e alíquotas de 0,1 mL e 0,2 mL de cada cultura foram respectivamente amostradas an- tes de início de incubação e no fim de cada período de incubação e subme- tidas à determinação de contagem de células viáveis (no caso de 0,1 mL) e habilidade (atividade) de produção de equol (no caso de 0,2 mL). A determinação de contagem de células viáveis foi realizada de acordo com o procedimento descrito acima no Exemplo de Teste 1-(1), que compreende amostragem de 0,1 mL de cada cultura, diluição de amostra 104,105,106 e107 vezes com PBS(-) de Nissui, revestindo 0,1 mL de cada diluição sobre meio ágar GAM, incubando o meio inoculado aerobicamente a 37°C por 24 horas, e contando as colônias formadas sobre o ágar GAM. A determinação de habilidade (atividade) de produção de equol foi realizada de acordo com o procedimento descrito acima no Exemplo de Teste 1-(1), que compreende inoculação de 5 mL de meio basal suplemen- tado com daidzeína com 0,2 mL(4%) da amostra (em triplicata), incubação de meio inoculado anaerobicamente a 37°C por 96 horas, e medição de con- centrações de daidzeína, diidrodaidzeína (intermediário), e equol no meio para escore de atividade. (2) Resultados Os resultados obtidos são apresentados na Figura 7-A (conta- gem de células viáveis) e B (concentração de equol).
Na Figura 7-A, o eixo horizontal representa tempo de incubação (h) e o eixo vertical representa contagem de células viáveis (Log CFU/mL em leite).
Na Figura 7-B, o eixo horizontal representa tempo de incubação (h) e o eixo vertical representa atividade (escore) de equol. O seguinte pode ser deduzido dos resultados apresentados nas Figuras 7-A e 7-B. Assim, na solução tampão em pH 6,0, a contagem de cé- lulas viáveis foi sustentada no nível de 108 células/ml até hora-3, e, aqui, a habilidade (atividade) de produção de equol também foi sustentada. No suco gástrico artificial em pH 3,0, a contagem de células viáveis foi sustentada até hora-3 de incubação e, aqui, a atividade também foi sustentada. Por outro lado, no suco gástrico artificial em pH 2,5, uma acentuada diminuição em contagem de células viáveis começou a ocorrer em hora-2 de incubação e a atividade também desapareceu, Quando estudados no mesmo sistema de teste como acima, os probióticos (microorganismos que encontram seu caminho vivos no canal intestinal e ali exibem atividade fisiológica) no mercado são reportadamente inalterados em contagem de células viáveis em pH 3,0 mas diminuíram sig- nificantemente em pH 2,5. Isto significa que a tolerância a suco gástrico em pH 3,0 permite que estes microorganismos passem vivos através do estô- mago. Por isso, o leite fermentado preparado através do uso de Lactococcus 20-92 é razoavelmente esperado liberar os organismos vivos para os intesti- nos para deixa-los exibirem atividade sustentada na parte inferior do intesti- no delgado e no intestino grosso.
Exemplo de Teste 5 Teste de tolerância à bile de Lactococcus 20-92 A tolerância à bile foi determinada com VITEK GPI Card (Nippon Biomérieux Co., Ltd) e avaliada através do uso de performances de cresci- mento da cepa da invenção em biles 10% e 40% como indicadores. (1) Protocolo de Teste Lactococcus 20-92 (108-9 células) foram distribuídos sobre ágar soja - tripticase suplementado com sangue de ovelha 5% e cultivados aero- bicamente a 37°C por 24 horas. As colônias sobre o meio no término de cul- tura foram apanhadas com um laço de platina e uma sua suspensão homo- gênea em solução salina estéril 0,5% foi preparada. Esta suspensão foi co- locada em VITEK GPI Card e, após 15 horas de incubação a 35°C, a per- formance de crescimento da cepa na presença de bile foi avaliada através do uso de corante (indicador de pH). A bile foi preparada por dissolução de uma quantidade predeterminada de pulverizado de bile em água destilada estéril e colocada no Card em avanço. (2) Resultados Os resultados do teste acima indicam que Lactococcus 20-92 crescem em biles 10% e 40%, mostrando tolerância à bile 40%.
Exemplo de Teste 6 Teste de hemólise de Lactococcus 20-92 (1) Protocolo de Teste Lactococcus 20-92 (108'9 células) foram distribuídos sobre ágar soja tripticase suplementado com sangue de ovelha 5% e cultivados anaero- bicamente (N2:C02:H2 = 8:1:1) a 37°C por 24-48 horas. A porção ao redor de colônia formada sobre o meio após término de cultura foi observada, e o po- tencial hemolítico foi avaliado de acordo com a extensão de decomposição de componentes de sangue (despigmentação ou descoloração). (2) Resultados Como o resultado do teste acima, despigmentação (aparecimen- to de uma zona transparente, incolor) não foi observada ao redor da colônia, indicando que Lactococcus 20-92 não causa beta-hemólise e, neste sentido, é um microorganismo seguro.
Exemplo de Teste 7 Teste de atividade de enzima infiltrando - célula de Lactococcus 20-92 Com relação à invasão sistêmica de bactérias de ácido lático ingeridas, uma depressão na função defensiva do mesentério ou prejuízo do próprio mesentério pode ser considerada como o fator sobre o lado hospe- deiro. Como o fator sobre o lado de bactérias, sua atividade enzimática (en- zimas infiltrando-célula) decompondo os proteoglicanos complexos lipídio - proteína constituindo o mesentério pode ser mencionada.
Este teste foi pretendido investigar se Lactococcus 20-92 tem atividade de enzima de infiltração em célula, por exemplo, atividades cola- genase (gelatinase), hialuronidase e sialidase (neuraminidase), ou não e foi realizado na seguinte maneira. (1) Protocolo de Teste Lactococcus 20-92 foi distribuído (tamanho de mancha: 108'9 células) sobre meio ágar suplementado com sangue e cultivadas anaerobi- camente (N2:C02:H2 = 8:1:1) a 37°C por 24-48 horas.
As colônias sobre o meio após cultura foram apanhadas com um laço de platina e suspensas em água destilada estéril para preparação de uma suspensão homogênea. Usando esta suspensão, a presença ou au- sência de colagenase (gelatinase) foi investigada com Api® (Níppon Biomé- rieux Co., Ltd.) usando a degradação de gelatina como o indicador.
Além disso, o teste de se Lactococcus 20-92 tem atividades hia- luronidase e sialidase (neuraminidase) ou não foi realizado através do pro- cedimento compreendendo incubação de Lactococcus 20-92 em solução tampão Tris-HCI (pH 7,0) contendo ácido hialurônico ou ácido siálico como o substrato (37°C, aeróbica, 15 minutos para atividade sialidase e 24 horas para atividade hialuronidase) e medindo os graus de diminuição nas concen- trações dos respectivos substratos. (2) Resultados Lactococcus 20-92 não mostrou nenhuma das atividades cola- genase (gelatinase), hialuronidase, e sialidase (neuraminidase).
Assim, em vista do fato de que a cepa da invenção carece de enzimas de infiltração em célula que constituem um fator em infectividade, a cepa foi confirmada ser um microorganismo altamente seguro a partir tam- bém de pontos de vista de infectividade.
Exemplo de Teste 8 Teste de resistência à vancomicina A aquisição de resistência a antibióticos (mutação) por bactérias tem sido uma questão de sério conceito em anos recentes. Não é raro que pacientes infectados com bactérias que adquiriram ta! resistência a antibióti- cos sucumbam à morte porque não respondem aos antibióticos. Particular- mente, a emergência de bactérias resistentes à vancomicina (VRE) é uma questão de sério conceito no campo de medicina clínica hoje, Além disso, existe a apreensão de que se os organismos ingeridos abrigando o gene de resistência à vancomicina alcancem e depositem nos intestinos onde eles entram em contato com microorganismos virulentos ou infecciosos (bactérias patogênicas), o gene de resistência à vancomicina pode ser transferido para as bactérias patogênicas, com o resultado de que estas bactérias também adquirem resistência à vancomicina. Por isso, é necessário, pelo menos, que microorganismo que são usados como probióticos não devam ser organis- mos resistentes à vancomicina.
Este teste foi pretendido para investigar a susceptibilidade de Lactococcus 20-92 para vancomicina e foi realizado como se segue. (1) Protocolo de Teste O teste de susceptibilidade à vancomicina foi realizado usando Sensi-Disk (produto de Nippon Becton-Dickinson Company, Ltd.). Lactococ- cus 20-92 foi distribuído (tamanho de mancha: 108'9 células) sobre meio ágar GAM, um disco contendo 30 pg de vancomicina foi colocado sobre o meio, e uma cultura aeróbica foi realizada a 37°C por 24 horas. Após o tempo de incubação acima, o diâmetro da zona de inibição formada ao redor do disco foi medida e avaliada de acordo com a tabela de avaliação. (2) Resultados O diâmetro da zona de inibição para Ladococcus 20-92 foi 11+0,2 mm e a avaliação de susceptibilidade de acordo com a tabela de avaliação foi positiva (susceptível = 10 mm). Este resultado indicou que a cepa da invenção não é uma cepa resistente à vancomicina e, por isso, é considerada segura. É apresentado no Exemplo 2 abaixo um exemplo da produção de equol a partir de daidzeína através de uso de cepa bacterial de ácido láti- co da invenção.
Exemplo 2 Produção de equol Um mL de suspensão contendo 107-109 células de Ladococcus 20-92 (FERM BP-10036) em meio GAM para cultura de bactérias anaeróbi- cas foi preparado e esta suspensão foi adiei onada a 100 g de leite de soja (concentração de sólidos: aproximadamente 2,2%). A mistura foi incubada anaerobicamente a 37°C por 72-96 horas e o equol produzido na cultura foi monitorado por HPLC. O teor de composto daidzeína do dito leite de soja foi 95 pg/mL calculado como daidzeína. O resultado indicou a formação de 10,7±6,3 pg/mL (média +/- desvio padrão de 3 experimentos) de equol na cultura de leite de soja acima.
As verificações acima mostram claramente que através de ex- ploração de microorganismo da invenção, equol pode ser produzido a partir de compostos daidzeína contidos em materiais alimentícios com boa eficiên- cia e em baixo custo.

Claims (10)

1. Composição contendo bactérias de ácido lático produzindo e- quol, caracterizada pelo fato de que compreende, como um componente es- sencial, uma cepa bacteriana de ácido lático pertencendo ao gênero Lactococ- cus garvieae tendo uma habilidade para utilizar pelo menos um composto daid- zeína selecionado do grupo consistindo em glicosídeos de daidzeína, daidzeína, e diidro daidzeína para produzir equol, e pelo menos uma isoflavona ou equol.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita cepa bacteriana de ácido lático pertencendo ao gêne- ro Lactococcus é Lactococcus 20-92 depositado sob FERM BP-10036.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a isoflavona é selecionada do grupo consistindo em com- postos daidzeína, e ingredientes contendo composto daidzeína.
4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a isoflavona é farinha de soja ou leite de soja.
5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que está na forma de uma bebida ou um produto de leite.
6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma isoflavona e equol.
7. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pe- lo fato de que está na forma de um produto de fermentação de leite de soja.
8. Processo de produção de equol, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de deixar uma cepa bacteriana de ácido lático, co- mo definida na reivindicação 1, atuar sobre pelo menos um membro selecio- nado do grupo consistindo em compostos daidzeína e ingredientes contendo composto daidzeína.
9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a dita cepa bacteriana de ácido lático pertencendo ao gênero Lactococcus é Lactococcus 20-92 depositado sob FERM BP-10036.
10. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o ingrediente contendo composto daidzeína é farinha de soja ou leite de soja.
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Free format text: PROCEDIMENTO AUTOMATICO DE RECLASSIFICACAO. AS CLASSIFICACOES IPC ANTERIORES ERAM: A23L 1/30; A23L 1/20; C12N 1/20; C12P 17/06; A61K 35/74; A61K 35/78; A61P 15/12; A61P 19/10; A61P 35/00.

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