TW201118175A - Equol-producing lactic acid bacteria-containing composition - Google Patents

Description

201118175 六、發明說明： t發明戶斤屬之技術領域3 發明領域 本發明係有關具有雌馬酚(equal)產生能之乳酸菌、含 有該乳酸菌之組成物，以及利用該乳酸菌以製造雌馬酚的 方法。 r:先前技術3 發明背景 大豆中所含有的異黃酮（isoflavon)(大豆異黃酿I)對乳 癌、則列腺癌等具有預防效果（抗雌激素(estrogen)效果）， 以及對更年期障礙、停經後之骨質疏鬆症.高脂血症·高 血壓等具有改善效果(類雌激素效果）的情形，主要在歐美國 家已有報告（參見H. Adlercreutz，et al.，（1992) Lancet, 339, 1233; H. Adlercreutz, et al., Lancet, 342, 1209-1210; D. D. Baird, et al., (1995) J. Clin. Endocrinol, Metab., 80, 1685- 1690; A. L. Murkies, et al.，（1995) Maturitas” 21，198-195; D.

Agnusdei, et al., (1995) Bone and Mineral., 19 (Supple). S43-S48等）。 近來’大豆異黃酮的臨床效果被認為是有疑問的，而 有報告指出，大豆異黃酮之活性代謝物，亦即雌馬酚，取 代該大豆異黃酮掌握了臨床應用上的有效性關鍵。亦即， 有各種報告指出，比起大豆異黃酮’其代謝物雌馬酚對乳 癌、前列腺癌、更年期障礙，以及停經後之骨質疏鬆症等， 更為有效（參見D. Ingram，et al.，（1997) Lancet, 350, 990- 201118175 994; A. M. Duncan, et al., (2000) Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 9, 581-586; C. Atkinson, et al., (2002) J. Nutr., 32 ⑶,595S, H. Akaza, et al., (2002) Jpn. J. Clin. Oncol., 32 ⑻，296-300; S. Uchiyama., et al., (2001) Ann. Nutr. Metab., 45., 113 (abs)等）。 在2〇01年舉辦的討論會（第4次International Symposium on the Role of Soy in Preventing and Treating Chronic Disease (San Diego, USA, 2001))中，出現許多關於雌馬酚的 演講專題；到了2002年12月，關於雌馬酚的總說被報告出 來；目前，雌馬酚為大豆異黃酮之有效性的真實成分之論 點持續得到學術上的支持(K. D. R. Settchell，et al.，（2002) J. Nutr., 132, 3577-3584)。 和大豆異黃酮比起來，雌馬酚移行到乳房組織、前列 腺組織等組織的移行性非常高，根據這個事實，其生理上 的意義也獲得證實(J_ Maubach, et al., (2003) J. Chromatography B·， 784, 137-144; T. E_ Hedlund， et al_, (2003) The

Prostate, 154, 68-78)。 另外，雌馬酚可由腸内細菌生成，且其生成存在個人 的差異，這點已有報告指出。也有報告指出，日本人當中， 雌馬酚產生者的比例約為50%(S. Uchiyama.，et al., (2001) Arm· Nutr. Metab·，11，113 (abs))。無法產生雌馬酚的人，推 測是因為腸内不存在雌馬酚產生菌。這樣的人被認為即使 攝取大旦加工食品，依然無法期待有所需的抗雌激素效 果、類雌激素效果。對於這樣的人，為產生所需的效果， 201118175 可以考慮或許讓他們攝取雌馬酚產生菌，或者攝取雌馬酚。 本發明人等根據上述構想，經過不斷研究的結果，首 先從人類的糞便新單離.確認出類桿菌屬Bacter〇idesE-23- 15(FERM BP-6435號）、鏈球菌 Streptococcus E-23-17(FERM BP-6436號）及Streptococcus A6G225(FERM BP-6437號)3個 菌株，做為用以使柷雌激素效果、類雌激素效果能夠發揮 的雌馬酚產生菌，並將該等雌馬酚產生菌及其應用之相關 發明提出專利申請（國際公開：W0 99/07392)。 ❿ 【發明内容】 發明概要 本發明人等持續地反覆研究，結果成功地新單離·確 認出本質上和先前所單離.確認出之微生物不同的菌種， 其具有利用黃豆苷元(daidzein)配糖體、黃豆苷元或二氣黃 豆普元（dihydrodaidzein)為養分而產生雌馬酚的能力之屬 於乳酸球菌屬（Lactococcus)的乳酸菌。本發明即是以該乳酸 菌之單離.確認為基礎，完成更進一步反覆研究的結果。 • 本發明提供以下第1-13項所記載之要旨的發明。 第1項.一種含有產生雌馬酚之乳酸菌的組成物，特徵 在於其含有，具有利用選自黃豆苷元配糖體、黃豆苷元及 二氫化黃豆苷元所組成之族群的至少一種黃豆苷類為養分 而產生雄馬酚的能力之，屬於乳酸球菌屬的乳酸菌為必要 成分。 第2項.如第1項記載之組成物，其中屬於乳酸球菌屬 的乳酸產為格氏乳酸球菌似）〇 201118175 第3項.如第2項記載之組成物，其中屬於乳酸球菌屬 的乳酸菌係已寄存為BCRC910268號（國際寄存編號：ferm BP-10036號）之Lactococcus 20-92。 第4項.如第1項記載之組成物’其進—步包含從黃豆 苷元類及含有黃豆苷元類的物質所形成之族群選出的至少 1種。 第5項.如第4項記載之組成物’其中含有黃豆苷元類 的物質為大豆粉或豆乳。 第6項.如第4項記載之組成物，其為飲料或乳製品形 態。 第7項.如第4項記載之組成物’其進一步含有雌馬酚。 第8項.如第7項記載之組成物，其為豆乳發酵物形態。 第9項·一種雌馬酚之製造方法，特徵在於其係使具有 利用選自黃豆苷元配糖體、黃豆苷元及二氫化黃豆苷元所 組成之族群的至少一種黃豆苷類為養分而產生雌馬酴的能 力之’屬於乳酸球菌屬的乳酸菌產生作用。 第項.如第9項記載之方法’其中屬於乳酸球菌屬的 乳酸菌為格氏乳酸球菌garWecte) 〇 第11項.如第10項記載之方法，其中屬於乳酸球菌屬的 乳酸菌係已寄存為BCRC910268號（國際寄存編號FERM BP-10036)之Lactococcus 20-92。 第12項.如第9項記載之方法，其中含有黃豆苷元類的 物質為大豆粉或豆乳。 第13項·一種乳酸菌，其係已寄存為BCRC 910268號 201118175 (國際寄存編號FERM BP-10036)之屬於乳酸球菌屬的乳酸 菌。 以下將就本發明之含有產生雌馬酚的乳酸菌之組成物 詳加說明。 (1)乳酸魂嚴|乳酸菌 本發明之含有產生雌馬酚之乳酸菌的組成物，係含有 具有利用選自黃豆苷元配糖體、黃豆苷元及二氫化黃豆苷 元所組成之族群的至少一種黃豆苷類為養分而產生雌馬酚 的能力（代謝活性）之，屬於乳酸球菌屬的乳酸菌為必要成 分。 該乳酸菌之具體例包含本發明人等從人類糞便新單 離·確認出之Lactococcus 20-92(BCRC 910268號，國際寄 存編號：FERM BP-10036號）。 以下將就該乳酸菌之菌學性質詳為敘述。 I·在培養基上的發育狀態 本菌株用EG(Eggerth-Gagnon)瓊脂培養基、BL(Blood Liver)瓊脂培養基或 GAM (Gifu Anaerobic Medium)培養 基，藉加鋼絲棉（Steel Wool)厭氣瓶，進行37°C、48小時厭 氣培養，或37°C、48小時好氣培養時，會顯示良好或普通 的生育。其菌落性狀隆起成正圓、凸圓狀，表面·周緣都 平滑，在EG瓊脂培養基上呈灰白色，在BL瓊脂培養基上則 呈茶褐色。菌形態為革蘭氏陽性的雙球菌。本菌株不形成 芽胞。 Π.生化學性質 201118175

(1) 最合適的發育溫度： 37°C (2) 最適合發育的pH: 7.0 (3) 明膠的液化： 一 (4) 從丙酮酸(pyruvic acid)產生3-經基-2-丁酮(acetoin) : + (5) 馬尿酸之加水分解： 一 (6) 七葉苷（aesculin)之加水分解： + (7) °itD各咬嗣基芳醯胺酶(pyrrolidonyl arylamidase) + (8) α-半乳糖苦酶（a-Galactosidase): — (9) /3-半乳糖苷酶 一 (10) /5 -葡糖普酸酶（石-Glucuronidase) — (11) 驗性填酸酶（Alkaline Phosphatase) — (12) 白胺酸芳醯胺酶（Leucine arylamidase) + (13) 精胺酸二水解酶(Arginine Dihydrolase) + (14) 各碳源之同化性： D-核糖(D-ribose) + L-阿拉伯糖（L-arabinose) — D-甘露糖醇(D-mannitol) + D-山梨糖醇(D-sorbitol) — 乳糖 _ D-海藻糖(D-trehalose) + 旋復花粉(inulin) — D-棉子糖(D-raffinose) — 澱粉 + 糖元（glycogen) — 201118175 ⑽利用腺(peptone)或葡萄糖為養分後之有機酸組成： 用糖可利用性培養基PYF(Pept〇ne . Yeast e血ct fidd) 營養液（約含5%的鰊），及添加葡萄糖於pYF培養液中使其 數終度成為〇·5%之營養液，在好氣的條件下，對本菌株進 行37°C、72小時的培養，並對藉此而獲得之培養物中的有 機酸以HPLC法加以測定。結果如表丨所示（單位：mM卜

表1 有機酸 鰊 葡萄f 馬來酸 nd nd 琥珀酸 0.00 0.01 乳酸 3.33 27.35 甲酸 1.13 0.88 醋酸 3.32 0.57 焦谷胺酸 (pyroglutamic acid) 0.12 0.25 丙酸 nd nd 異丁酸 nd nd η-丁酸 nd nd 異戊酸 nd nd η-戊酸 nd nd nd表示未被檢測出來。 根據以上的發育性狀及生化學性質各點，本菌株雖然 被分類成革蘭氏陽性球菌之Lactococcus garvieae，惟與其 模式菌株(type strain)(Schleifer，K. H.，Kraus，J.，Dvorak, C.， Kilpper-Balz, R., Collins, M. D. and Fisher, W. Transfer of Streptococcus lactis and related streptococci to the genus Lactococcus gen. Nov. Syst. Aool. Microbiol., 6, 183-195, 1985; ATCC43921 (JCM10343) and ATCC49156 (JCM8735)) 在澱粉之可利用性的點上並不相同。 201118175 因此’本發明人等將本菌株命名為Lactococcus 20-92， 於平成15年1月23日寄存到獨立行政法人產業技術總合研 究所專利生物寄存中心（曰本國茨城縣筑波市東1丁目1番 3號中央6(郵政區號305-8566)，編號為FERMP-19189號。 該菌株目前已經移管為國際寄存，其寄存編號為FERM BP-10036。 另外’本菌株將葡萄糖當做養分利用後會生成乳酸(L 型乳酸），根據這個現象可以確認其為同質醱酵的乳酸菌。 此外，解析本菌株之16SrRNA序列的結果，可以確認 該序列與模式菌株之garvieae (JCM10343)有 99.189%，與EnieracoccMi wnWci也（JCM8735)有 99.375% 的相同性。 再者，上述fiVuerococcws 因 DNA-DNA同質性 的結果近似故於1996年已經被再分 類為Lflciococcwi· garvieae。因此，在LaciococeMs 中，係如上所述，存在著起源互異之2種類的模式菌株(JCM 8735 菌株及 JCM10343 菌株）。cc“j Mn’Wci’i/fl (JCM8735)起源於受到感染的獅（7、））之腎臟’原來的 LflciococcMi gameae (JCM10343菌株)則是起源於牛的乳房 炎。 為了檢討Lactococcus 20-92究竟近似於那一個模式菌 株，乃就其表現形質加以比較。其結果示於下表2。 201118175 表2 性狀 本發明菌株 JCM10343 菌株 JCM8735 菌株 脫氨反應 (Arg—NH3) 土 土 土 溫度生育性 10°C 15°C 30°C 37〇C 40°C 45〇C + + + + + + + + + + + + + + PH生育性 pH4.5 pH7.5 PH9.6 土 + + 土 + + 土 + + 鹽濃度(NaCl) 6.5 + + + 胜醣 (peptidoglycan) Lys-Ala-Gly Lys-Ala-Gly Lys-Ala-Gly 醌型 (牛/ >夕彳7°) MK-8,9 MK-8,9 無醌 MK表示曱基蔡酿(menaquinone)。

由表2可知，本菌株Lactococcus 20-92雖然表現形質與 garWeae模式菌株（JCM10343)—致，但是與 jEVzie/OCOccM·? 模式菌株(JCM8735)在40°C 的生育 性和不產生醌的點上是不相同的。因此，本菌株判斷為近 似於Lflciococcwi garWeae (JCM10343 菌株）。

本菌株Lactococcus 20-92被分類為GRAS(為美國FDA (食品藥物管理局）認可之食品食品添加物安全性表示； Generally Recognized As Safe)所收載之乳性乳酸球菌，其 做為食品等被認為有高安全性。 另外，有關Lacioc^ccwj garWeae，截至目前為止並無 對人體具有病原性的相關報告’也不會產生toxin等之毒 素，被認為是具有高安全性的菌種。 201118175 又，LaciococcMS g狀Weae過去已經從乇7 7 7 k予起 士、生乳、低溫保存中的肉類加工食品、—厶(泰國的 魚醱酵食品）、卜一Y Η工七^亍一七、起士（因起源的名稱而受 到保護之義大利的熟練工起士 (PDO)等）被檢測出來。尤 其，有報告指出從檢測出1〇5個/g，從卜一艾匕。工 乇 >于一七'起士檢測出108個/g之高標準量，就食用經驗.食 用歷史而言，可以擔保具有充分的安全性(P-M. Christine, et al., (2002) Int. J. Food Microbiol., 73, 61-70; M. G. Fortina, et al”（2003)，Food Microbial·，20, 379-404)。 另一方面，關於Enterococcus seriolicida，有報告指出 在飯（/、Y千）等的養殖魚類中有病原性。因此，既然Lactoco- ccus 20-92也是一，在系統上就被認 為和Enierococciu 形質相近，而有對養殖魚類具 有病原性的可能性之虞，但是，根據本發明人等的研究， 將Lactococcus 20-92的電顯像與病原性菌株(£>^rc>COCCM>y seHo/icMa-KG株)加以比較的結果，確認本菌株與病原性菌 株不同’菌體表面並無莢膜存在。根據此點可以認定本菌 株並不具有病原性，也沒有環境污染的問題。這點也可以 由以下的文獻得到支持。亦即，吉田等人針對養殖魚類的 菌體之病原性記載了，如果菌體表面有莢膜存在，則因巨 嗟細胞所造成的蠶食鯨吞現象會受到阻礙，其結果導致該 菌無法被殺死’從而在受到該菌所污染的養殖魚類誘發全 身性的敗血症（T. Yoshida，et al·，（1996) Dis. Aquat. Org.，21， 81-86)。 12 201118175 此外，本菌株Lactococcus 20-92在直接以牛奶來醱時， 也會維持所需之雌馬酚產生能（活性），且就該雌馬酚產生能 之維持並不需要特殊的培養基，具有例如讓豆乳原封不動 地醱酵’藉以利用該豆乳中的黃豆苷元為養分即可以產生 雌馬酚的特徵。

過去’並無具有這種雌馬酚產生能之屬於乳酸球菌屬 的乳酸菌被報導出來的例子。因此，本發明亦提供具有所 述雌馬酚產生能之新穎的乳酸菌Q

本菌株Lactococcus 20-92所利用做為養分之黃豆苷元 類當中包含了黃豆苷元配糖體、黃豆苷元及二氫黃豆苷 凡。黃丑苷兀配糖體之具體例可以例示如黃豆苷（daidzin)。 、一苦係/、有汽豆♦元做為活性異黃酮(吨1%〇11)之異黃 酮配糖體U 糖體）。該黃豆|的情形係被上述微生

物*做養分彻’使黃豆_元_，該黃豆#元又進一步 、田代養刀#!用而變成二氫黃豆苦元，然後終於產生雌馬 ▲本發明中係將上述黃豆普元類當做基質來利用。而， 。亥基貝並不限於黃豆_元類，含有該基質的各種物質都可 以利用。含㈣黃料元㈣㈣（黃W元類含有物質) 代表例可以勤如大豆異黃_。大豆異黃酮在市面上已 販售’在本發明中可以使用此種市售商品 ，例如7夕7 7/77求>Ρ10」（登錄商標）等。另外，不限 如異黃_ ’如葛、葛根、紅首眷_ —紫花首 13 201118175 蓿（alfalfa)等植物本身’及以其等為起源之異黃酮衍生物也 包含在含有黃豆苷元類的物質中。 此外，含有黃豆苷元類之物質的其他具體例除了上述 之大豆、葛 '葛根 '紅苜蓿、紫花苜蓿等之食用材料本身 以外，尚可舉例如其等之加工品，例如大豆粉、煮大豆、 豆腐、油豆腐、豆乳、大豆胚軸萃取物等，以及其等之醱 酵調製物，例如納豆、醬油、味嗜、于叫丁师⑽、酸酵 大豆飲料等。這些物質每一種都含有黃豆苷元類。而且， 這些物質除黃豆苦元_外，另含具有類雌激素作用的異龙 酿i類，例如染料木黃酮（Genistein)和其配糖體（染料木二 (^enistin)等）；甘胺黃酮（Glydtein)和其配糖體 等）；黃丑*元及染料木黃酮的—部分被曱基化之前驅體n 黃素異黃酮Biochanin A、如麵他等，都可以 匕 用在本發明。 應、 ill本發明組命物 有產生雕馬酴义乳酸菌的細占脇 本發月之s有產生雌馬紛的乳酸菌之組成物含有，且 有以上述Lactococcus 20·92為主，作用於做為基質之t具 元類或含有黃豆㈣類的物質以產生料_能力 孔酸球菌屬的乳酸菌，做為必要成分。做為該 屬於 乳酸菌雖然通常為生菌，惟並不特別限定於此’例=之 =，含有由該培養液所單離出來之菌體的 叔： 製品乃至於精製品、其等之冷滚乾燥品等也都可以叔精 ，上述微生物之培養液代表性的可以藉由例如，用適合 201118175 於培養該微生物之培養基，例如MRS培養基等，在价培 養該微生物48小時左右來取得。另外，_可以在上述^ 養後，以例如’將培養液以3000次旋轉/分、4t離心分離 10分鐘再收集ϋ體的方式獲得。這些可以依照—般方法梦 製。且，上述菌體也可以冷;東乾燥。所獲得之冷;東乾燥茵 體色可以利用做為本發明组成物之有效成分。 本發明組成物只要含有做為上述有效成分之微生物 (菌體等）即可’並無其他特殊的需要，不聽可以依需要而 含有適合於轉（或增殖)做為上述有效成分之微生物的營 養成刀°亥s養成分之具體例係如前所述，可舉用以班養 各微生物之營養培養基為例，例如BHI、EG、、GAM谇 養基等。 σ 其它的營養成分可例示如乳果寡糖、大豆寡糖、萬苣 一糖(lactulose)、乳糖醇(lactit〇1)、果寡糖、乳寡糖等各種 寡糖。迫些寡糖的調配量並無特殊限制，惟通常以從本發 明組成物中占1-3重量％左右的量的範圍來做選擇為佳。 上述本發明組成物透過其攝取，會在攝取者的體内發 揮產生所需要的雌馬酚產生能。通常，日本人有習慣食用 含育丑苷類食品，代表性者係如前述之大豆等的食用材 料、其等之加工品、其等之醱酵調製物等，因此只要攝取 本發明組成物’就會在生體内產生雌馬紛。 再者，本發明組成物中亦可以依需要而適當地添加各 種維生素類、微量金屬元素等。該維他命類可例示如維生 素B、維生素D'維生素C、維生素E、維生素仄(尤其是來自 15 201118175 納豆菌的MK-7 (menaquinone-7))等。微量金屬元素可例示 如鋅、硒、鐵、猛等。 本發明組成物中所調配的微生物之量可依所使用的乳 酸菌之種類等來做適當的決定。例如以Lactococcus 20-92 調製成菌數（生菌數）為1〇8〜1〇9個/100g左右的組成物量為 佳。該菌數之測定係將稀釋到菌培養用的瓊脂培養基而成 之試料加以塗布，再於37°C下進行好氣培養，然後計測所 生育之菌落數，從而算出菌數。上述微生物之調配量係以 上述量為基準，並可依所調製成之本發明組成物的形態等 而做適當的變更。 (3-2)含有黃豆苷元類之本發明組成物 本發明組成物可依需要而進一步含有自前述之黃豆苷 元類及含有黃豆苷元類的物質所構成之族群選出的至少1 種成份。在該黃豆苷元類及含有黃豆苷元類的物質之内， 尤其以大豆胚軸及採用大豆胚軸為原料調製而成的食品材 料為佳，其中又以水溶性或者經過乳化的食品原料更佳。 其他合適的含有黃豆苷元類的物質之例有大豆粉或豆乳。 此組成物由於在組成物中含有基質，故即使是沒有習 慣食用大豆等食品材料的人，只要攝取這個組成物，依然 可以透過微生物在生體内將組成物中之基質當做養分利用 的機制而產生所需要的雌馬酚。 黃豆苷元類及/或含有黃豆苷元的物質調配到組成物 中的調配量雖無特殊限制，惟以一般日本人每日所攝取的 量為10-25mg左右者為合適。 201118175 (3-3)含有雌馬酚之本發明組成物 本發明組成物亦可進一步含有雌馬酚。 通常’食品的嗜好性可以透過例如使乳酸醱酵而择得 改善。而，本發明組成物中所例用的微生物之代表例為

Lactococcus20-92,具有優良的雌馬酚產生能（活性）。在本 發明中亦提供， 豆苷元類的物質 使上述微生物作用於例如豆乳等之含有黃 ，利用豆乳中之黃豆苷元類為養分使雌馬 紛產生而形成之豆乳醱酵物等之含有雌馬酚的組成物。

此處’可以利用前述之各種黃豆苷類及含有黃豆苷類 的物質做為基質。在這些物質當中又以從豆乳 '大豆粉等 調製成之溶液乃至於乳化液為佳。 含有雕馬盼之本發明組成物的一個合適的具體例可汽 例如，將大豆異黃酮或含有大豆異黃酮之食用材料添加到 合適的培養基，使本發明微生物，合適者為Lact〇c〇ccus 92在該培養基中醱酵而獲得之醱酵產物。在此，更詳細地 說，醱酵可以透過例如，將基質做成溶液狀態並加以滅菌 後，把預定量之本發明微生物添加到本發明微生物可以生 育的營養培養基，例如BHI、EG、BL、GAM培養基等，或 "T以利用做為食品之牛乳、立乳、蔬菜汁等之中於 下’在厭氣狀態或好氣的靜置狀態使其醱酵48-96小時左 右（可依需要添加pH調節劑、還原物質（例如酵母提取物、 維生素Kl等))的方式來實施。上述實施方式中，基質量可以 調整在〇.〇l-〇.5mg/mL左右，微生物之接種量可以從1-5%的 範圍選出。 17 201118175 藉此，可以製造含有雌馬紛之本發明組成物。該組成 物可依據上述潑酵產物的形態，當做食品、醫藥品做成合 適的製品。另外，也可以從所獲得之培養物，依照常法將 雌馬紛加以單離精t，再依需要於其中適當地調配其他合 適的食用材料’調製成適當的食品形態乃至於醫藥品形態。 上述單離精製可以透過例如’使醱酵培養物吸附於離 子父換樹脂(DIAION HP20 ’二菱化成公司製）後用甲醇使 之溶出再令其乾固的方法來實施。 本發明組成物中之雌馬紛量係依所調製成之食品形態 及醫藥品形態來決定，並無特殊限制，惟通常以組成物總 flOOg中含有雕馬酌^2-5g左右的量之範圍為佳。 所獲得之本發明組成物含有雌馬酚的情形可以用，例 如後述之試驗例1所示的方法來確認。 含有雌馬酚之本發明組成物由於其有效成分雌馬酚為 天然物，所以安全性優良；而且因為是用乳酸菌調製而成， 所以沒有混入來自其製造步驟的化學藥品等之疑慮；此外 更有高收率、低生產成本，同時做為食品時在風味香味上 也都很優質的優點。 (3-4)食品形复| 本發明含有產生雌馬酚之乳酸菌的組成物，通常係以 前述特定的乳酸菌為必要成分調製成同時含有適當的可食 性載體之食品形態。 本發明組成物之食品形態的具體例可舉例如飲料形 態、飲料形態以外之乳製品形態（包含撥酵乳）、固形食品形 201118175 態:含茵之微膠囊形料。飲料形態之本發明組成物中包 含礼酸菌飲料及添加乳酸菌的飲料。 此處有關「醋酵乳」及「乳酸菌飲料」的用語係依從 舊厚生省所頒礼及乳製品成分等之相關省令」第二條η 「醋酵乳」及38「乳酸菌飲料」的定義。亦即，「醱酵乳」 是指用乳酸g或酵母使乳或乳製品發_彡成錄或液狀^ 成者。因此’該_乳中包含了飲料形態及優路乳形態。 而「乳酸菌飲料」是指用乳酸菌或酵母使乳或乳製品發酵 形成糊狀或液狀，再以之為主原料並兒水弄淡而成的飲料。 添加乳酸菌的飲料可以例示如酸酵蔬菜飲料、酸酵水 果飲料及醱酵豆乳飲料等。飲料形態以外的乳製品形態包 含凝乳狀形態，例如優赂乳等。固形食品形態包含顆粒、 粉末（包含醱酵乳冷凍乾燥粉末等）、錠劑、發泡製劑、膠、 橡皮糖、布丁等形態。 可以根據常法調製成各該等形態。且任一種可食性載 體都可以在調製成各該等形態時用做為載體。尤其，以入 口感覺良好之具有味覺改善效果的載體為宜。該入口感覺 良好之具有味覺改善效果的載體之具體例可以例示如人工 甘味料、山梨糖醇、木糖醇等。其他合適的載體可例示如 遮蔽劑，例如海藻糖(trehalose)(林原公司製）、環狀糊精 (cyclodextrin)、BenecoatBMI(花王公司製）等。 關於食品形態之合適具體例，即添加乳酸菌的飲料， 詳細地說，於調製成該等飲料形態時，可以透過在含有微 生物的營養源之適當的醱酵用原料物質，例如蔬菜類、水 201118175 果類、豆乳(大豆乳化液）等的液體中，培養微生物以使該原 料醱酵的方式來進行。做為醱酵用原料物質的蔬菜類及k 果類中’包含各種政桌及水果的切斷物、破碎物、磨碎^勿 搾汁、酵素處理物、其等之稀釋物及濃縮物。蔬菜類中包 含南瓜、紅蘿蔔、蕃茄、青椒、芹菜、菠菜、有色蕃薯、 玉米、甜菜、芥藍、荷蘭芽、高麗菜、花椰菜等。水果類 中包頻果、水蜜桃、香蕉、草莓、葡萄、西瓜、橙、蜜松 等。 蔬菜及水果的切斷物、破碎物及磨碎類可以在將例如 上述蔬菜類或水果類洗淨後’依需要而放到熱水中等做八 枝(branching)處理後，再用壓碎機、混合器、食物調理機 碎漿機、Mycolloider等予以切斷、破碎、磨碎而择彳曰摔 汁可以用例如壓濾式脫水機(filter press)、果汁機等^製 酵素處理係使纖維素酶（cellulase) '果膠解聚酶 nase)、原果膠(pr〇topectin)分解酵素等作用於上述切斷物 破碎物、磨碎物、搾汁等來調製。稀釋物中包含以水稀釋 成1-50倍的產物。濃縮物中包含以例如冷來濃縮、減麈* 縮等手段濃縮成1-100倍的產物。 醱酵用原料物質之其他具體例為豆乳，可以依照常 法，從大豆原料調製而成。該豆乳中包含例如，將脫皮大 豆浸在水中後，用膠體磨（colloid min)等適當的粉碎機進疒 濕式粉碎處理後，依照常法進行均質處理而得之岣質化 液，或將水溶性大豆蛋白質溶解於水_而成之溶解液等 利用微生物的醱酵可以透過將本發明微生物接種到醱 201118175 酵用原料物質属_、& v 可依需要以 靜置培養的方式來實施。培養基當中 質，例如本發明微生物良好發育的騎促進物 果糖等之碳源，酵乳糖、環糊精、山梨糖醇、 物質類等。酵母提取物，料之氮源，維生素類、礦 微生物之接絲旦 里財以從_縣料物質含有液Ice 3體Ixio6個以上，較佳為1χ1〇7個左右的量選出者

為0適培養條件通常是從醱酵溫度2〇-4〇°C左右’較佳為 25 37c左右，更佳為抓’辦時間μ4*時左右的條件 中來做選擇。 ' 為了進仃安定的醱酵，建議採用預先準備引酵物 (starter) ’將之接種到醱酵用原料物質再使之醱酵的方法。 此處之引酵物可舉例如，代表性的是將本發明菌體接種到 預先於90-121 C進行過5-20分鐘之一般殺菌處理的醱酵用 原料物質、添加酵母提取物之1〇%脫脂粉乳等，再以相同 的條件進行培養而得之物。如此處理而獲得之引酵物通常 含有本發明微生物約1〇7_1〇9個/g培養物。 另外，如上所述而獲得之乳酸醱酵物有具有凝乳狀形 態（類似優酪乳乃至布丁用形態）的情形，這樣的醱酵物可以 就這樣當做食品來食用。該凝乳狀形態的乳酸可以藉由將 之進一步均質化而做成所需要的飲料形態（例如醱酵豆乳 飲料等）。該均質化可以用一般的乳化機（均化器）來實施。 具體而言，該均質化可以採用例如高林(GAULIN)公司製高 壓均化器（1^^40)，以大約200-100(^§价1112，較佳為大約 21 201118175 300-800kgf/cm2的條件，或者採用三和機械工業公司製均化 器（商品號碼：HAx4571，H20-A2等），以150kg/cm2或以上 的條件來實施。由於該均質化，可以獲得具有優良的口感， 尤其是具有滑順感的飲料製品，特別是醋酵豆乳飲料製 品。另外’在該均質化時可一方面依需要適當地予以稀釋， 一方面添加用以調整pH的有機酸類；又，可以在飲料的製 造上適當地添加通常所使用的糖類、果汁、增粘劑、界面 活性劑、香料等各種添加劑。合適的添加劑和其添加量(相 對於凝乳狀醱酵物重量的重量％)之一具體例可舉例如，葡 萄糖8%(重量％，以下同）、砂糖8%、環糊精8%、檸檬酸 〇·1%、甘油脂肪酸酯0.2%及香料0.1%。 藉此所獲得之醋酵豆乳飲料等的本發明乳酸菌飲料可 以依照常法無菌地填充到適當的容器中做成製品。該製品 具有滑順的吞°燕口感及風味。 其投與(攝取）量係依攝取該物的生物體之年齡、性別、 體重、疾病的程度等來決定，並無特殊限制。通常，每天 服用調製成微生物含量108_109個/mL的飲料食品ioo-3〇〇mL左右即可。 本發明組成物之食品形態的其他具體例可舉例如發泡 製劑形態。此製劑可以用碳酸鈉及（或）碳酸氫鈉1〇_35%， 與中和劑20-70%為發泡成分，調配到本發明微生物（菌體冷 凍乾燥物)0.01-50%(重量％，以下同）中而製成。此處所使 用之中和劑係使上述碳酸鈉及碳酸氫鈉中和並產生二氧化 碳而得到之酸性化合物。該化合物中包含例如，代表性的 22 201118175 L /酉石西夂、；f宁樣g义、昌馬酸、抗壞血酸(狀⑶作化acid)等有 機酸。 上述發泡成分調配到本發明發泡製劑中的比例係以所 獲得之本發明製劑溶解於水中時，溶液呈現酸性，特別是 pH約3.5-4.6左右的酸性之比例為佳。更具體而言，上述比 例以選自碳酸鈉及（或）碳酸氫鈉1〇_35%及中和劑20—70%的 範圍者為佳。尤以從碳酸鈉11·31%，較佳為22-26%，碳酸 氫鈉10-35%，較佳為20-35%的範圍選出者為佳。其中又以 單獨使用20-25%範圍的碳酸氫鈉者最佳。而中和劑係選自 20-70%，較佳為30-40%的範圍，尤以使用L_酒石酸2〇_25 % 及抗壞血酸8-15%的範圍者最佳。 本發泡製劑係以本發明微生物及發泡成分為必要成分 ’另外亦可依需要而適當地添加配合以周知的各種添加劑 成分，例如賦形劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、增粘劑、 表面活性劑、滲透壓調節劑、電解質' 甘味劑、香料、色 素、pH調節劑等。上述添加劑可例示如小麥澱粉、馬铃薯 澱粉、玉米澱粉、環糊精等之澱粉類；蔗糖、葡萄糖、果 糖、麥芽糖、木糖、乳糖等之糖類；山梨糖醇、甘露糖醇 、麥芽糖醇(Maltitol)、木糖醇(xylitol)等之糖醇類；偶聯糖 (coupling sugar)、paratinose等之糖轉位配糖體；填酸妈、 硫酸鈣等之賦形劑；澱粉、糖類、明膠、阿拉伯膠、環糊 精、曱基纖維素、聚乙二稀0比°各烧酿1 (polyvinyl pyirolidone) 、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、羥丙基纖維素(hydr〇xypr〇pyl cellulose)、黃原膠(xanthan gum)、果膠、西黃蓍膝(tr〇gacanth

[S I 23 201118175 gUm)、酪蛋白、褐藻酸(alginicacid)等之結合劑乃至增粘劑 ，白氨酸、異白氨酸、L-绳氨酸、糖醋（sugar ester)、硬化 油硬知酸、硬脂酸鎮、滑石、聚乙二醇(macrogol)等之潤 滑劑；結晶纖維素(旭化成公司製「7匕.七小」）、羧曱基纖 維素(CMC)、羧甲基纖維素鈉(CMC_Na)、羧甲基纖維素鈣 (CMC-Ca)等之崩解劑；聚環氧乙烷山梨醇酐脂肪酸酯（聚山 梨醇酐脂肪酸酯，p〇lysorbate)、卵磷脂等之表面活性劑、 阿斯巴甜(Asparatame)、阿力甜(Alitame)等之二肽(dipeptide) ，其他像Sutevia、糖精(saccharin)等之甘味料等。這些成分 可以在考慮其與必要成分之關係和製劑的性質、製造方法 等之下’適當地選擇其合適量而使用。 此外’本發明發泡製劑中，可以添加配合適當量的維 生素類，特別是維生素B12和抗壞血酸(維生素〇等。其調配 比例雖無特殊限制，惟通常以選自維生素C至30%為止的量 ’較佳約為5-25%的範圍者為宜。 本發明發泡製劑的製造方法基本上可以用同於―般所 使用的這種發泡錠劑的製造方法來進行。亦即，本發明製 劑之發泡錠劑形態可以秤取預定量之各成分，經過混合， 依照直接粉末壓縮法、乾式或濕式顆粒壓法等來調製。 如此所製得之本發明製劑只需投入水中就可以變成適 合於經口投與的飲料形態，然後被經口投與。 其投與(攝取）量係依應適用此製劑之生體的年齡、性別 、體重、疾病程度等來做適當決定，雖無特殊限制，惟一 般以每次將調製成1錠約1.5-6_0g之本發明發泡錠劑i _2鍵溶 201118175 於100-300mL的水中來服用為佳。 做為本發明組成物中之基質的黃豆苷元類或含有黃豆 苦元類的物質、乳酸菌’及依需要而添加配合之其他成分 ，其等之特別合適的混合比例以，相對於本發明組成物1〇〇g ，黃互發元類或含有黃豆普元_的物質換算成黃豆普元約 為l〇-5〇mg的範圍，乳酸菌為1〇、1〇1〇個（生菌數)及寡糖等 約l-5g的範圍者為合適。 另，如上所述，本發明含有產生雌馬齡之乳酸菌的組 成物為使其巾能含有微生物（主要為生㈤，在該組成物之製 品化過程中並不適合採用加熱、加壓等條件。因此，在將 本發明組成物調製成例如棒狀、顆粒、粉末、錠劑等之製 品形態時，或雜生物直接處方料綠_體，或以適 當的被復劑加小冷凍乾燥菌體為宜。 但是’本發明含有產生雌馬盼之乳酸菌的組成物並不 一定要在其中含有生菌。當調配有生菌和生菌利用養分而 獲得之黃豆發元類等之本發明組成物，已經產生所需要的 雌馬_，則肋成物亦可鋪常法對其施以加熱滅菌處 理以殺死存在該組成物中之_。若採用這種加熱滅菌處 理’則在調配有生菌和生㈣料分而獲得之黃豆苦元類 等之本發·成物崎料，㈣候也可㈣免存在於該 、且成物巾之生g在該組成物祕存巾或流通過程巾發生剩 餘醱酵而使味道、風味劣化的疑慮。 醫藥品彬能 本發明含有產生離馬紛之乳酸菌的組成物通常係以前 25 201118175 述特定之乳酸菌為必要成分’並且被調製成同時含有該組 成物和適當的藥學上可容許製劑載體之醫藥製劑形態。 製劑載體可以例示如，一般在這個領域被使用之周知 的填充劑、增量劑、結合劑、付濕劑、崩解劑、表面活性 劑、潤滑劑等之稀釋劑或賦形劑。這些載體可依所製得之 製劑的投與單位形態而做適當的選擇使用。

醫藥製劑的投與單位形態可以選擇各種形態。其代表 性形態可舉例如錠劑、丸劑、散劑、液劑、懸浮劑、乳劑 、顆粒劑、膠囊劑、坐劑等。

在成形為錠劑形態時，上述製劑載體可以使用例如， 乳糖、白糖、氣化鈉、葡萄糖、尿素、澱粉、碳酸鈣、高 嶺土、結晶纖維素、矽酸、磷酸鈣等之賦形劑；水、乙醇 、丙醇、單㈣、葡萄糖液、澱粉液、明膠溶液、叛甲基 纖維素' _基纖料、f基_素1W料烧嗣等 之結合劑；m甲基纖維素鈉、㈣基纖維_、低取代度 羥丙基纖維素、乾燥澱粉、海藻酸鈉、瓊脂酚末、、嫌 糖(Laminaran)粉末、碳酸氫鈉、碳酸鈣等之崩 海贡多 氧乙烷山梨醇酐脂肪酸酯類、十 齊丨，I環 丁一烷基硫酸鈉

Lauryl Sulfate)、硬脂酸單甘油酯等之界面活性劑 硬脂⑽adne)、可可油、氫添加_白糖、 鹽基、十二烷基硫酸鈉等之吸收促進劑；甘油、/ 4級錢 保濕劑；澱粉、乳糖、高嶺土、膨潤土、膠體狀，粉等之 吸附劑；精製滑石、硬脂酸鹽、硼醆粉末Y 矽醆等之 潤滑劑等。 A乙一醇等之 26 201118175 此外，錠劑可依需要而做成被覆一般的劑皮之錠劑， 例如糖衣錠劑、明膠被包錠、腸溶被錠、薄膜被覆錠或雙 層键、多層鍵。 在成形成丸劑的形態時，可以使用例如葡萄糖、乳糖 、殺粉、可可油、硬化植物油、高嶺土、滑石等之賊形劑 ;阿拉伯膠粉末、西黃蓍膠粉末、明膠、乙醇等之結合劑 、海藻多糖、瓊脂等之崩解劑等做為製劑載體。 成形為坐劑形態時可以使用例如聚乙二醇、可可油、 高級醇、高級醇之酯類、明膠、半合成甘油酯等使為製劑 載體。膠囊劑係依照常法，將本發明微生物和上述所例示 的各種製劑載體混合後，再填充到硬質膠囊、軟質膠囊等 而調製成。 此外，本發明製劑中亦可依需要而含有著色劑、保存 劑、香料、風味劑、甘味劑等或其他醫藥品。 本發明製劑中應含有之本發明微生物的量並無特殊限 制，可以從廣範圍中做適當選擇。通常，醫藥製劑中含有 約108-101G個/g左右為佳。 上述醫藥製劑之投與方法並無特殊限制，係依各種製 劑形態、患者年齡、性別，其他條件、疾病程度等來決定 。例如敍:劑、丸劑、液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑及膠囊 劑可經口投與，坐劑則是直腸内投與。 上述醫藥製劑的投與量可根據其用法、患者年齡、性 別和其他條件、疾病程度等做適當選擇，惟通常以有效成 分，即本發明微生物之量為每日每lkg體重約0.5-20mg左右 27 201118175 為佳，且該製劑可以分成1日1-4回來投盘。 =本發明組成物因其攝取(投與），該组成物中之微生 發揮Γ 達下部消化管，或定著成常在菌，進而 =期的效果。特別合適的製劑是腸溶性錠劑形態， 生物:::::劑形態…下把微 物^所獲得之本發明含有產生雄馬_乳酸菌之組成 ’在中而齡女性之無法確定病因的身體不順乃至於伴 隨者停經而發生之例如骨質疏鬆、更年期障礙等症狀的預 防及處置上都是有用的。相關的預防及處理係，藉由對有 此要求之中高齡如J生，或投與或使其攝取有效量之上述本 發明組成物的方式來實施。該有效量只要是可以藉本發明 組成物之投與，而射高齡女性之無料定關的身體不 順，乃至於伴隨著停經而發生之例如骨質疏鬆、更年期障 礙等症狀加以預防及處置者都可以，並無特殊限制惟， 通常可以用攝取本發明組成物的人，其尿中雌馬盼排泄量 在5μπκ^(約日以上的量做為標準。 【實方包方式j 實施發明之最佳態樣 以下為更詳細說明本發明將舉出本發明含有產生雌馬 齡之乳酸菌的組成物之調製例做為實施例，惟本發明並不 限於該等實施例所示之範圍。 會施例1 Π) 酵豆乳軟料之調製 28 201118175 量秤並混合下列處方之各成分，調製成醱酵豆乳飲料 形態之本發明組成物。

水溶性大豆蛋白之醱酵培養物 lOOmL 維生素·礦物質 適量 香料 適量 適量

總量 150mL

上述水溶性大豆蛋白的醱酵培養物係將水溶性大豆蛋 白 13g溶解於水i〇〇mL ’ 其中加入Lactococcus 20-92 (Bcrc 910268號（國際寄存編號：FERM BP-10036))108-109個，在 37 C使之醱酵24-48小時而得者。而，所利用之水溶性大豆 蛋白於lg中含有黃豆苷元類的量換算成黃豆苷元為 左右。 £2)醱酵乳之調贺 量科並混合下列處方之各成分，調製成醱酵乳形態之 本發明組成物。

Lactococcus 20-92酸酵乳 lOOmL 維生素·礦物質 適量 香料 適量 水 適量 總量 150mL 上述―弧20-92潑酵乳係於牛IUL(無脂乳固形 分8.5%以上，乳脂肪3.8%以上、φ 士 ^ 丫加入Lactococcus 20-92 (BCRC91〇268號（國際寄存編號 :pERM BP-10036))108-109 29 201118175 個，在37°C使之醱酵24-48小時而得者。 η、醱醏豆轧冷凌乾燥粉末之調製 使用約 1〇9個Lactococcus 20-92(BCRC 910268號（國際 寄存編號：FERM BP-10036))，在37°C讓豆乳(大豆固形分 含量10%，黃豆苷元含量：黃豆苷元換算量l〇-15mg)100g 進行乳酸醱酵72-96小時，使其生成雌馬酚。將其冷凍乾燥 後再做成粉末。粉末中之雌馬酚含量以HPLC測定的結果為 0.1-0.3 重量 ％。 用上述粉末’並量秤混合下列處方之各成分，調製成 粉末形態之本發明組成物(食品形態及醫藥品形態）。 醱酵豆乳冷凍乾燥粉末 2.2g (雌馬酚 含有 0.005g) 賦形劑（玉米澱粉） 17g 維生素·礦物質 適量 香料 適量 總量 (4)粉柬之調絮 2〇g 篁秤並混合下列處方之各成分調製成粉末形態（食品 形態及醫藥品形態）之本發明組成物 4.1g l.〇g 適量 適量 2〇g

Lactococcus 20-92冷凍乾燥粉末 賦形劑（乳糖） 維生素.礦物質 香料 總量 30 201118175

Lactococcus 20-92冷來乾燥粉末係以可增殖之適當的 液體培養基(MTS)培養(37°C，24-48小時)Lactococcus 20-92 (BCRC 910268號（國際寄存編號：FERM BP-10036))後’經 過集菌處理，使之懸浮於10%的Skim Milk後，再藉冷冰乾 燥處理而獲得者，其菌體含量為l〇9-l〇1G個/g。 另外，上述粉末亦可進一步配合以粗精製大豆異黃酮 粉末4.1g而製成含有黃豆苷元的粉末。

若攝取所獲得之含有黃豆苷元的粉末，則可以觀察到 每天約有5pmole(約1.2mg)的尿中雌馬酚排泄量；因此，在 體内可以產生和該排泄量相稱的雌馬酚之事實獲得確認。 【5)顆粒之調贺 量秤並混合下列處方之各成分，調製成顆粒形態（食品 形態及醫藥品形態）之本發明組成物。

粗精製大豆異黃酮粉末 Lactococcus 20-92冷凍乾燥粉末 蔗糖酸酯 維生素.礦物質 香料 總量 4.1g l.〇g l.〇g 適量 適量 又’用和前述（1)相同 )東乾餘粉末β 20g 的材料做為Lactococcus 20-92冷 =攝取此產物’則可以讓黃豆苦元與雌馬盼產生菌 達大腸内，從而可以在大腸内產生雌馬紛。 下將例舉就本發明產生雌㈣之乳酸㈣進行的試 E S 3 31 201118175 驗例。 武驗例Ί 羞jj座轉馬盼產生能（活峰成詈謐龄 (1)試驗方法 將Lactoc〇ccus 20-92株（107-109/g)在腦心浸出培養液 BHI Broth(增殖用液體培養基(基礎培養基))5mL中，於厭氣 的條件下，在37。(：培養24小時後，用基礎培養基稀釋成1〇2 及1〇4以調製稀釋液。 將培養結束後之培養液及其各稀釋分別各取0.2mL，和 ·

含有黃丑苷7C基礎培養基（在bhi Br〇tht以成為lOpg/mL 的量添加黃豆苷元而成者）、牛乳及豆乳各5mL相混合，厭

氣的條件下，在37 C進行培養。培養時間在含有lOgg/mL 黃丑苷兀的基礎培養基及豆乳的情形中為8小時、24小時、 48 J時72小時及96小時；在牛乳的情开）中為8小時、24小 時及48小時。 在培養開始前和各培養結束的時點，進行〇lmL& 0.2mL培養液的取樣，分別供用於菌數測定及雌馬紛產生能 φ (活性)測定。此外’針對含有啊就黃立苦元的基礎培養 基及旦乳’在培養開始前和各培養結束的時點進行〇 15机 培養液的取樣，並測定該液中之雌馬酚產生量。 菌數測定係如下所述般地進行。亦即，將各試樣〇就 以PBS(-)溶液（二'y；w公司製）稀釋作成1〇4、ι〇5、⑽及 ίο稀釋液，將各該稀釋液0此塗布於GMA壤脂培養基， 於好氣的條件下，在37t培養24小時，計測在縣上财

J 32 201118175 育出來的菌落數以做為菌數。 雌馬朌產生能（活性）之収係如下収般地進行。亦 即，將各試樣〇.尬和含有黃豆苦元的基礎培養基就(各3 支)混合，厭氣的條件下，在3rc培養96小時；培養終了後 對各培養液進行〇.5mL的取樣，用乙酸乙自旨就萃取技 後，以HPLC測定萃取液中之黃豆苦元、二氣黃豆苦元（中 間體)及雌馬盼；另外’料等之總4算_馬賴占的比 修 ^所獲得之結果以下述5階段料積分化，以3檢體的平 均積分做為雌馬酚產生能（活性）的指標。 4 : 90%以上的雌馬酚； 3 ·雖馬紛生成，黃豆苦元減少到不滿50%(有中間體）； 雌馬盼生成，黃豆苦元殘餘50%以上（有中間體）·， 1 ·有中間體生成，未生成雌馬酚； 〇中間體及_馬盼都未生成，黃豆脊元沒有減少。 雌馬酚產生量測定如下所述地進行。亦即，將各試樣 • 〇*5mL用乙酸乙酯5mL萃取2次，以HPLC測定萃取液中之黃 互苷兀、二氫黃豆苷元（中間體)及雌馬酚。算出各濃度以做 為雌馬紛產生量。 (2)試驗結果 (21)菌數(増殖性）的調查結果示於第1圖。 圖中’（1)為利用含有黃豆苷元基礎培養基的結果；（2) 為利用且孔的結果；（3)為利用牛乳的結果。在各圖中，橫 袖表示培養時間(hr)，縱軸表示生菌數(Log cfu/ml)。 根據各圖所示的結果，本菌株之增殖性良好，無論是 33 201118175

根據該圖所示之結果可以確認在含有黃㈣元之基礎 含有黃立普元的基礎培養基 論接種量如何’在培丨、@ ’中，雌馬酚產生能（活性）都有 在利用牛及豆乳的情形中，也 培養基、豆乳及牛乳的任一者中，

可以碟認本菌株之雌馬紛產生能(活性）可以被維持。 (2-3)雌馬紛產生量測定結果 測定在含有黃W元的基礎培養基及越（黃豆普元 換算量約為8(WmL)中難生之雌馬盼量，結果如第3圖所 在第3圖中’⑴為利用含有黃豆苦元之基礎培養基的結 果；（2)為利用豆乳的結果。在各圖中，橫軸表示培養時間 (hr) ’縱軸表示雌馬紛濃度(pg/mL)。 兩種培養基都是從培養開始後第48小時起確認到雌馬 酚的產生。在利用豆乳的情形令，觀察到因接種量的變化 所造成之雌馬紛生成量的差異’尤其是以4⑽％接種培養％ 小時，可看到有57.Opg/ mL之顯著量的雌馬酚生成。 雖然豆乳中構成雌馬酚之基質的黃豆苷元90%以上以 201118175 配糖體（葡萄糖形成結合的狀態)存在，但是在所測定的色層 分析譜上’該配糖體的波峰卻消失了，因此可以認定是本 菌株將配糖體分解(β_葡萄糖甘酶(P_glucosidase)活性）而生 成黃豆苷元後，將該黃豆苷元代謝成雌馬酚。 試驗例2 由Lactococcus 20-92枝所造成之雌馬酚+点技;^ (1) 試驗方法

Lactococcus 20-92株（1〇7個/g)以BHI Broth(增殖用液體 培養基，基礎培養基)5mL，厭氣條件下，在37。(：進行培養。 培養時間為8小時、24小時、30小時、36小時、48小時' 51 小時、54小時、60小時、84小時及96小時。 在培養開始前和各培養終了的時點進行〇.5mL的取 樣，測定試樣中之黃豆苷元、二氫黃豆苷元（中間體)及雌馬 酚濃度》 (2) 結果 所獲得之結果示於第4圖。 第4圖顯示黃豆苷元(左圖）、二氫黃豆苷元（中央圖）及 雌馬酚(右圖）之各別的經時濃度變化。圖中，橫轴表示培養 時間（hr)，縱軸表示各物質的濃度(pg/mL)。 根據第4圖所示的結果’培養後，在第48小時黃豆苷元 濃度開始減少，中間體二氫黃豆苷元在第48-60小時出現， 從第48小時起可以確認到雌馬酚之生成。另外，在第60小 時從黃豆苷元變成雌馬酚的代謝幾乎已經結束。 從黃豆苷元變成雌馬盼的代謝雖然可以確認是經由中 35 201118175 間體二氫黃豆苷元的形態，但是推估二氫黃豆苷元之生成 和’由二氫黃豆苷元變成雌馬酚的代謝是同時並進的。 試驗例3 含有Lactococcus 20-92换之醱醏乳的低溫安定枓 (1) 試驗方法 將Lactococcus 20-92株以增殖用液體培養基(基礎培養 基)5mL’厭氣的條件下，在37°C培養24小時後，對牛i1L、 2L以及市售的SkimMilk(l〇%固形分）1L進行4%接種，好氣 條件下，在37°C靜置培養48小時。培養後，保存於4°c。 對牛乳，在培養終了時，以及4°C低溫保存後4週的期 間為止’每週都測定雌馬酚產生能（活性）。進一步從其中僅 取2支保存到第42日和第51日為止，並測定活性。 對Skim Milk，在培養終了時及低溫保存後第丨週與 第34日，測定其活性。 培養開始前和在各保存時點的活性係準據前述方法， 將含有1 〇pg/ mL黃且苷元的培養基5mL分別接種4%(〇 2mL) 到3支試樣中，於厭氣條件下在37它培養％小時後，根據培 養基令之黃豆苷元、二氫黃豆苷元（中間體)及雌馬酚濃度進 行判定（積分化）。 (2) 結果 結果示於第5圖。第5圖中橫軸所示為保存期間⑻，縱 軸表示積分。 根據圖中所7F結果可知，有關牛乳無論比及儿之任一 者於培養終了後，在低溫保存下到第4週為止雌馬酚產生能 36 201118175 (活性)都可以獲得維持。另外，在2L的牛乳巾確認了檢討* C保存安定性到第51天為止，活性都獲得轉^關於市隹 的Skim Milk 1L也於培養終了後，在低溫保存下加以二 測，發現到第34天為止雌馬酚產生能（活性)都獲得維持。 根據以上結果，因為用Lactococcus 20-92株所調製之醋 酵乳即使在低溫保存下依然可轉持活性，所以從流通面 看也可以考慮對應做為食品。 根據上述試驗例丨_4所獲得的結果，將Lact〇c〇ccus 21 92株之增殖與雌馬紛產生能（活性)及雌馬紛產生量的關係 做一彙整，結果如第6圖所示。 亦即，依所使用的培養基而改變培養條件，雌馬酚產 生能（活性）無論在增殖期及恆定期都可以維持。另一方面， 有關雌馬_產生可以考慮是在蚊狀態以後經過某種程 度的時間，酵素出現或活性化而生成雌馬酚。 試驗例4

(1)試驗方法 將Lactococcus 20-92株在厭氣性菌增殖用液體培養基 (BHI Broth，基礎培養基)5瓜^中，於厭氣條件下，在37芄 培養24小時後’把培養物（1〇9個仏)4%接種混合到牛乳化， 好氣條件下，在37°C靜置培養48小時。培養後，用保存於4 C的培養物做為醱酵乳，供進行以下試驗。

人工月液係以含有0-045%胃蛋白（pepsin)之50mM甘胺 酸.鹽酸緩衝溶液ΦΗ2.5及pH3.0)調製成。對照組則用50mM 37 201118175 甘胺酸.鹽酸緩衝溶液(pH6.0)調製成。 在所調製成之人工胃液9mL中添加保存在低溫的醱酵 乳lmL’將混合物在37°C的恆溫槽，好氣條件下，以靜置 狀態進行培養。 培養時間定為1小時、2小時及3小時，在培養開始前與 各培養終了時分別做培養物O.lmL及0.2mL的取樣，測定各 試樣的菌數(〇. 1 m L的情形)並供測定雌馬酚產生能（活性)之 用（〇.2mL的情形）。 菌數測定係，依照前述試驗例1 -(1)所記載的方法，對 培養後的培養物分別取O.lmL，用二74公司製的PBS㈠ 溶液稀釋成104、1〇5、1〇6及1〇7倍之後，把各稀釋液塗布在 gam瓊脂騎基’好氣條件下在37t培養24小時，藉計測 在該gam瓊脂培養基上所生育的菌落數來求得。 i雌馬紛產生能(活性）的測定係，依照前述試驗例卜⑴ 所記載的方法，將試樣〇.2mL(4%)接種到含有弋-苷-的美 礎培養基5mL(3支)’職條件下在3rc培養二:二=基 由培養基中之黃Μ元、二氫黃豆衫（t間體)及雌馬齡濃 度來進行判斷(積分化）。 (2)結果 所獲得的結果示於第7圖之A(生菌數剛定結果)及聊 馬酚濃度）。 第7-A圖中’橫軸為培養時間(hr)，縱輪為生菌數(L〇g cfu/ml in milk)。 第7-B圖中，橫轴為培養時間⑽，縱細為雕馬紛活性 38 201118175 (積分）。 根據第7-A圖及第7-B圖所示的結果，判知以下情形。 亦即，在PH6.0的緩衝溶液中，生菌數到3小時為止都維持 在10個/mL，這個情形下，雌馬酚產生能（活性)也維持著。 在PH3.0的人工胃液中，生茵數直到培養3小時為止都可以 維持，這個情形下，活性也獲得維持。另一方面，在ρΗ2 5 的人工胃液中觀察到，從培養的第2小時開始，生菌數明顯 降低，活性也消失。 • 一 t出現在市場上的益生菌（Probiotics)(活著到達腸内 且具有生理作用之微生物），已有報告指出，當以相同的試 驗系統進行檢討時，生菌數在ρΗ3·〇沒有變化，但是在pH 2.5 則會顯著下降。因此，可以認定如果有pH3 〇的胃液耐受 性，就可以活著通過，所以用Lact〇coccus 20-92株調製成的 醱酵乳被認為可以活著到達腸内，並且在小腸下部或大腸 内維持活性。 試驗例5 籲 Lagjococcus 20-92株之贍汁耐辱枓詁舲 膽汁耐受性試驗係採用7，GPI凝乳（日本匕才〆 4二一股份公司），以在10%及4〇%膽汁中之本菌株生育性做 指標來進行判定。 (1)試驗方法 將Lactococcus 20-92株塗抹於加了 5%率也液之Tryp· case soy環脂培養基（1〇8一 1〇9個），在37〇c進行好氣培養 小時。對培養後之生育在培養基上的菌落進行釣菌’用〇·5% [S1 39 201118175 滅菌食鹽水調製均質的懸浮液。將之加入7，GPI凝 乳’在35°C培養15小時後，用色素(pH指示劑）來判定本菌 株在膽汁存在下的生育性。另外，膽汁係將預定量之膽汁 粉末溶解於滅菌蒸餾水後，注入凝乳中備用。 (2)結果 上述試驗之結果顯示Lactococcus 20-92株在10%及 40%膽汁中有生育性❶由這個結果確認了對4〇%的膽汁都有 财受性。 試驗例6

Lactococcus 20-92妷之溶血性諕鹼 (1)試驗方法 將Lactococcus 20-92株塗抹於加了 5%羊血液之Tryp-case soy瓊脂培養基（1〇8—1〇9個）’在37^厭氣的條件下 (N2 : C02 : H2=8 : 1 : 1)培養24〜48小時。觀察培養後之生 育在培養基上的菌落周圍’從血液成分的分解(脫色或變色） 判定溶血性。 (2)結果 上述試驗的結果，因為在所生育的菌落周圍沒有觀察 到血液成分的脫色（透明且無色的區域之出現），所以可以判 定Lactococcus 20-92株沒有β溶血性，在這點上是安全的。 試驗例7

Lactococcus 20-92株之細胞浸潤处酵辛法忖試驗 所攝取的乳酸菌侵入生體内的情形中，腸管膜防禦機 能下降或膜本身的損傷被認為是在宿主側的要因。細菌側 201118175 的要因則為具有結合脂質、蛋白，將構成腸管膜的蛋白多 糖(Proteoglycan)分解之酵素活性（細胞浸潤性酵素）。 此試驗係用來檢討Lactococcus 20-92株是否具有做為 細胞浸满性酵素之膠原蛋白酶（Collagenase)(動物膠酶 (gelatinase))、玻尿酸酶（Hyaiuronidase)及唾液酸酶（siaH_ dase)(神經胺基酸酶(neuraininidase))活性，實施方法如下所 述。 (1)試驗方法 將Lactococcus 20-92株塗抹於加了血液之瓊脂培養基 (塗抹量：1〇8_9個），在37。(：厭氣的條件下（N2 : C02 : H2=8 : 1 : 1)培養24〜48小時。 對培養後之生育在培養基上的菌落進行釣菌，使之懸 浮於滅菌蒸顧水以調製成均質的懸浮液。就所獲得之懸浮 液，以7匕°亇> 牛（日本匕才/ 一股份公司）同定套組，把 動物膠之勿解當做指標，判定有無膠原蛋白酶(動物膠酶) 活性。 另，Lactococcus 20-92株是否有玻尿酸酶及唾液酸酶 (神經胺基酸Θ#)活性的試驗係透過在分別以玻尿酸及唾液 酸(Sialic Acid)做為基質之丁咖七^緩衝溶液(pH7 〇)中培養 Lactococcus 20-92株(37°C，在好氣條件下就唾液酸酶活性 為15分鐘，就玻尿酸酶活性為24小時），並測定是否使各基 質濃度下降的方式來實施。 (2)結果

Lactococcus 20-92株未顯示膠原蛋白酶(動物膠酶）、玻 201118175 尿酸酶及唾液酸酶(神經胺基酸酶）中之任一種活性。 因此，本菌株由於缺乏成為感染性之丨要因的細胞浸潤 性酵素，所以從感染性的面來看可以確認是安全性高的菌 種。 試驗例8 葸古撒素（vancomycin)而f性試驗 近年來細菌對於抗生物質會獲得耐受性（變異）已成為 問題。這種獲得和充生物質之耐受性的細菌所感染的患 者，被認為就是因為無法得到抗生物質所造成之抗菌效 馨 果’故每#發生死亡的情形。；t其，針對抗生物質萬古黴 素的耐性菌之出現，目前更是在醫療現場形成深刻的問 題。而，當被攝取到體内的微生物具有萬古黴素耐性遺傳 基因時，該微生物如果到達腸内並定著，一旦和毒性或感 染性菌種(病原菌）接觸’就會把萬古黴素耐性遺傳基因移轉 給該病原®，結造成病原、菌獲得萬讀素耐性的疑慮。 為此之故’可以被利用做為益生菌的生菌，至少該菌本身 必需不是萬古黴素耐性菌。 鲁 此試驗係用以檢討Lactococcus 20-92株之對於萬古黴 素的感受性，實施方式如下所述。 (1)試驗方法 對萬古徽素之感受性（敏感）試驗係使用Sensi_Disc(日 本Becton，Dickinson股份公司製）來實施。亦即，將 cus 20-92株塗抹於GAM瓊脂培養基（塗抹量1〇8_9個），將含 有萬古黴素3(^g之紙錠(disc)置於培養基上，在37(>c進行好 42 201118175 氣培養24小時。培養後，測定形成於紙 徑，依判定表做判定。 ' 周邊的抑制圈直 (2)結果

Lactococcus 20-92株之抑制圈直徑為a 9 定表被判樹敏細1 據追個結果可以確認’本菌株並非萬麵素耐㈣，因此< 在這一點上安全性是高的。 ’

以下將舉實施例2說明利用本發明乳酸菌從黃豆脊元 製造雌馬酚的製造例。 & 實施例2 雌馬酚之製造 使Lactococcus 20-92株(BCRC 91〇268號（國際寄存編 號：FERM 3?-10036))107〜109個懸浮於厭氣性菌培養用的 GAM培養基’調製成液體imL ’將該液體加入豆乳1〇〇g(固 形分濃度約2.2%)，厭氣條件下在37°c培養72〜96小時，以 HPLC法測疋培養液中產生之雕馬紛量。另，上述豆乳中之 貫豆苦元類含量換鼻成黃豆苦元量為95pg/mL。 其結果’可以確認所獲得之豆乳培養物中，雌馬紛之 生成量為10.7±6.3pg/mL(3次的平均值土標準偏差）。 由以上說明可知，若利用本發明微生物，可以從食品 素材中之黃豆苷元類更有效率且價廉地製造雌馬酚。

C圖式簡明]J 第1圖係依照試驗例1所示之方法求得的培養時間與生 菌數之關連性示意圖。 43 201118175 第2圖係依照試驗例1所示之方法求得的培養時間與雌 馬酚產生能（積分)之關連性示意圖。 第3圖係依照試驗例1所示之方法求得的培養時間與雌 馬紛產生能之關連性示意圖β 第4圖係依照試驗例2所示之方法求得的培養物中之黃 豆苷元類及雌馬酚的經時變化示意圖。 第5圖係依照試驗例3所示之方法求得的保存期間與雌 馬紛產生能（積分)之關連性示意圖。 第6圖係從試驗例1 - 3所示試驗求得之伴隨培養時間變 化的雌馬酚產生菌之狀態（增殖性、雌馬酚產生能及馬酚產 生量變化）的示意圖。 第7圖係依照試驗例4所示之方法求得的培養時間與生 菌數之關連性示意圖。 【主要元件代表符號表】 (無）

44

Claims (1)

1. 201118175 七、申請專利範圍： 1. 一種含有產生雌馬酚之乳酸菌的組成物，其特徵在於： 含有格氏乳酸球菌garWeae)為必要成分， 該格氏乳酸球菌具有以黃豆苷元類為養分來產生雌馬 酚的能力，且該黃豆苷元類係選自於由黃豆苷元配糖 體、黃豆苷元及二氫黃豆苷元所構成群組中之至少1種 物質。 2. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中格氏乳酸球菌 ® 似）源自人類糞便。 3. 如申請專利範圍第1項之組成物，其更含有選自於由黃 豆苷元類及含有黃豆苷元類的物質所構成群組中之至 少1種物質。 4. 如申請專利範圍第3項之組成物，其中含有黃豆苷元類 的物質為大豆粉或豆乳。 5. 如申請專利範圍第3項之組成物，其形態為飲料或乳製 品 6. 如申請專利範圍第3項之組成物，其更含有雌馬酚。 7. 如申請專利範圍第6項之組成物，其形態為豆乳醱酵物。 8. —種雌馬酚之製造方法，其特徵在於：使具有以黃豆苷 元類為養分來產生雌馬酚之能力的格氏乳酸球菌 garWeae)發揮作用，且該黃豆苦元類係選 自於由黃豆苷元類及含有黃豆苷元類的物質所構成群 組中之至少1種物質。 9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中格氏乳酸球菌 45 201118175 (LaciococcMJ 係源自人類糞便。 10. 如申請專利範圍第8項之方法，其中含有黃豆苷元類的 物質為大豆粉或豆乳。 11. 一種格氏乳酸球菌（LaciococcM*? garWeae)，其特徵在 於：具有以黃豆苷元類為養分來產生雌馬酚的能力，且 該黃豆苷元類係選自於由黃豆苷元配糖體、黃豆苷元及 二氫黃豆苷元所構成群組中之至少1種物質。 12. 如申請專利範圍第11項之格氏乳酸球菌 尽izrWeae)，其係源自人類糞便。

   46