CN1826059B - 含有产生雌马酚的乳酸菌的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种含有产生雌马酚的乳酸菌的组合物，其特征在于，该组合物含有乳球菌属的乳酸菌作为必须成分，所述乳酸菌具有代谢选自黄豆苷元的苷、黄豆苷元及二氢黄豆苷元组成的组中的至少1种黄豆苷元类产生雌马酚的能力，该组合物对于包括目前没有有效的预防方法或缓解手段的更年期障碍的中老年女性情绪起伏的预防或缓解是有效的。

Description

含有产生雌马酚的乳酸菌的组合物
技术领域
本发明涉及具有雌马酚(equol)产生能力的乳酸菌、含有该乳酸菌的组合物以及利用该乳酸菌制备雌马酚的方法。
背景技术
已知大豆中含有的异黄酮(大豆异黄酮)对乳腺癌、前列腺癌等具有预防作用(抗雌激素作用)，并且对更年期障碍、闭经后的骨质疏松症·高血脂症·高血压等具有改善效果(雌激素样作用)，以上内容主要在欧美被报道(参见H.Adlercreutz，et al.，(1992)Lancet，339，1233；H.Adlercreutz，et al.，(1992)Lancet，342，1209-1210；D.D.Baird，et al.，(1995)J.Clin.Endocrinol.Metab.，80，1685-1690；A.L.Murkies，et al.，(1995)Maturitas.，21，198-195；D.Agnusdei，et al.，(1995)Boneand Mineral.，19(Supple)，S43-S48等)。
最近，大豆异黄酮的临床效果遭到质疑，已有报道指出并非大豆异黄酮，而是大豆异黄酮的活性代谢产物雌马酚是临床应用有效性的关键。即，与大豆异黄酮比较，其代谢产物雌马酚对乳腺癌、前列腺癌、更年期障碍及闭经后的骨质疏松症更有效，对此公开了各种相关报道(参见D.Ingram，et al.，(1997)Lancet，350，990-994；A.M.Duncan，et al.，(2000)Cancer Epidemiology，Biomarkers & Prevention，9，581-586；C.Atkinson，et al.，(2002)J.Nutr.，32(3)，595S；H.Akaza，etal.，(2002)Jpn.J.Clin.Oncol.，32(8)，296-300；S.Uchiyama，.et al.，(2001)Ann.Nutr.Metab.，45，113(abs)等)。
在2001年召开的研讨会(第4届大豆预防和治疗慢性疾病国际研讨会(圣地亚哥，USA，2001))上已有多个关于雌马酚的讲演题目，2002年12月报道了关于雌马酚的总论，目前，关于雌马酚是大豆异黄酮有效性的真正原因已在学术上得到支持(K.D.R.Settchell，et al.，(2002)J.Nutr.，132，3577-3584)。
与大豆异黄酮比较，雌马酚对乳房组织、前列腺组织等组织的转移性非常高，由此证明了其生理意义(J.Maubach，et al.，(2003)J.Chromatography B.，784，137-144；T.E.Hedlund，et al.，(2003)TheProstate，154，68-78)。
另外，雌马酚由肠腔内细菌生成，并且其生成因人而异。据报道日本人中能生成雌马酚的比例大约为50％(S.Uchiyama.，et al.，(2001)Ann.Nutr.Metab.，45，113(abs))。推测不能产生雌马酚的人在肠腔中不存在雌马酚产生菌。认为这些人即使摄取大豆加工食品也不能获得所希望的抗雌激素作用、雌激素样作用。为了在这些人中实现所希望的效果，认为只要使其摄取雌马酚产生菌、或雌马酚本身即可。
本发明人根据以上的构思反复进行研究，结果首先作为用于发挥抗雌激素作用、雌激素样作用等的雌马酚产生菌，从人粪便中新分离并鉴定了拟杆菌E-23-15(FERM BP-6435号)、链球菌E-23-17(FERM BP-6436号)及链球菌A6G225(FERM BP-6437号)等3种新菌株，并申请了关于上述雌马酚产生菌及其作用的发明专利(国际公开：WO99/07392)。
发明内容
本发明人继续进行研究，结果成功分离并鉴定了本质上不同于先前分离、鉴定的微生物的新菌种乳球菌属的乳酸菌，该乳酸菌具有代谢黄豆苷元的苷、黄豆苷元或二氢黄豆苷元产生雌马酚的能力。本发明是基于上述乳酸菌的分离鉴定经进一步反复研究而完成的。
本发明提供下述1-13项所述要旨的发明。
第1项、一种含有产生雌马酚的乳酸菌的组合物，其特征在于，该组合物含有乳球菌属的乳酸菌作为必须成分，所述乳酸菌具有代谢选自黄豆苷元的苷、黄豆苷元及二氢黄豆苷元组成的组中的至少1种黄豆苷元类化合物产生雌马酚的能力。
第2项、如第1项所述的组合物，其中，所述乳球菌属的乳酸菌是格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)。
第3项、如第2项所述的组合物，其中，所述乳球菌属的乳酸菌是以FERM BP-10036号保藏的乳球菌20-92。
第4项、如第1项所述的组合物，所述组合物进一步含有选自黄豆苷元类及含有黄豆苷元类的物质组成的组中的至少1种物质。
第5项、如第4项所述的组合物，所述含有黄豆苷元类的物质是大豆粉或豆浆。
第6项、如第4项所述的组合物，所述组合物是饮料或乳制品形态。
第7项、如第4项所述的组合物，所述组合物进一步含有雌马酚。
第8项、如第7项所述的组合物，所述组合物是豆浆发酵物形态。
第9项、雌马酚的制备方法，其特征在于，该方法是通过使乳球菌属的乳酸菌作用于选自黄豆苷元类及含有黄豆苷元类的物质组成的组中的至少1种物质进行制备，所述乳酸菌具有代谢黄豆苷元类化合物产生雌马酚的能力。
第10项、如第9项所述的方法，其中，所述乳球菌属的乳酸菌是格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)。
第11项、如第10项所述的方法，其中，所述乳球菌属的乳酸菌是以FERM BP-10036号保藏的乳球菌20-92。
第12项、如第9项所述的方法，所述含有黄豆苷元类的物质是大豆粉或豆浆。
第13项、一种乳球菌属的乳酸菌，其作为FERM BP-10036号被保藏。
下面，详细说明本发明的含有产生雌马酚的乳酸菌的组合物。
(1)乳球菌属的乳酸菌
本发明的含有产生雌马酚的乳酸菌的组合物含有乳球菌属的乳酸菌作为必须成分，所述乳酸菌具有代谢选自黄豆苷元的苷、黄豆苷元及二氢黄豆苷元组成的组中的至少1种黄豆苷元类化合物产生雌马酚的能力(代谢活性)。
该乳酸菌的具体例子包括本发明人从人粪便中新分离鉴定的乳球菌20-92(FERM BP-10036号)。
下面详细说明该乳球菌的细菌学性质。
I.在培养基上的生长状况
使用EG(Eggerth-Gagnon)琼脂培养基、BL(Blood Liver)琼脂培养基或GAM(Gifu Anaerobic Medium)培养基并利用加盖钢棉的厌氧罐将本菌株在37℃厌氧培养48小时，或在37℃需氧培养48小时，显示良好的或普通的繁殖状况。其菌落性状呈正圆、凸圆状隆起，表面及边缘平滑，在EG琼脂培养基上呈灰白色，在BL琼脂培养基上呈茶褐色。细菌形态是革兰氏阳性双球菌。本菌株不形成芽孢。
II.生化学性质
(1)最适生长温度：          37℃
(2)最宜生长pH：            7.0
(3)明胶的液化：            -
(4)由丙酮酸生成乙偶姻：    +
(5)马尿酸的水解：          -
(6)七叶苷的水解：          +
(7)吡咯烷基烯丙基酰胺酶：  +
(8)α-半乳糖苷酶：         -
(9)β-半乳糖苷酶：         -
(10)β-葡糖苷酸酶：        -
(11)碱性磷酸酯酶：         -
(12)亮氨酸烯丙基酰胺酶：   +
(13)精氨酸二氢酶：         +
(14)各碳源的同化性：
D-核糖                     +
L-阿拉伯糖                 -
D-甘露醇                   +
D-山梨糖醇                 -
乳糖                -
D-海藻糖            +
菊糖                -
D-棉子糖            -
淀粉                +
糖原                -
(15)胨或葡萄糖代谢后的有机酸组成：
使用作为糖代谢用培养基的PYF(胨·酵母膏培养基)培养液(约含有5％胨)以及向PYF培养液中添加葡萄糖使其终浓度为0.5％而配制的培养液，将本菌株在需氧条件下，37℃培养72小时，利用HPLC法测定所得培养物中的有机酸。结果(单位：mM)如下表1所示。
表1
有机酸 胨 葡萄糖
马来酸 nd  nd
琥珀酸 0.00  0.01
乳酸 3.33  27.35
甲酸 1.13  0.88
醋酸 3.32  0.57
焦谷氨酸 0.12  0.25
丙酸 nd  nd
异丁酸 nd  nd
正丁酸 nd  nd
异戊酸 nd  nd
正戊酸 nd  nd
nd表示未检出。
根据以上的生长性状及各种生化学性质，本菌株被归属于作为革兰氏阳性球菌的格氏乳球菌(Lacrococcus garvieae)，但与其模式菌株(Schleifer，K.H.，Kraus，J.，Dvorak，C.，，R.，Collins，M.D.and Fischer，W.Transfer of Streptococcus lactis and relatedstreptococci to the genus Lactococcus gen.nov.Syst.Appl.Microbiol.，6，183-195，1985；ATCC 43921(JCM10343))和ATCC49156(JCM8735)的不同点在于淀粉的代谢性。
所以，本发明将本菌株命名为乳球菌20-92(Lactococcus 20-92)，在平成15年1月23日以FERM P-19189号保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利微生物保藏中心(日本茨城县筑波市东1丁目1番3号中央6(邮政编码305-8566))。目前，该菌株被转交至国际保藏单位，其保藏编号为FERM BP-10036。
另外，本菌株代谢葡萄糖后，生成乳酸(L型乳酸)，由此确认该菌株是同型发酵的乳酸菌。
解析本菌株的16SrRNA的序列后发现该序列与作为模式菌株的格氏乳球菌(JCM10343)具有99.189％的同源性，与杀鱼肠球菌(Enterococcus seruikucuda，JCM8735)具有99.375％的同源性。
基于DNA-DNA同源的结果，上述杀鱼肠球菌与格氏乳球菌相近，所以在1996年又将其归属于格氏乳球菌。所以，如上所述，格氏乳球菌中存在2种(JCM8753株和10343株)来源不同的模式菌株。杀鱼肠球菌(JCM8735)来源于感染了的鰤肾脏，原来的格氏乳球菌(JCM10343株)来源于牛奶腺炎。
为了研究乳球菌20-92(Lactococcus 20-92)与哪一种模式菌株相近，比较了表现性状。其结果如下表2所示。
表2
  性状   本发明菌株   JCM10343株   JCM8735株
  脱氨基反应(Arg→NH3)   ±   ±   ±
  温度繁殖性10℃15℃30℃37℃40℃45℃ +++++- +++++- ++++--
  pH繁殖性pH4.5pH7.5pH9.6 ±++ ±++ ±++
  盐浓度(NaCl)6.5 + + +
  肽聚糖   Lys-Ala-Gly   Lys-Ala-Gly   Lys-Ala-Gly
  醌型   MK-8，9   MK-8，9   非醌型
MK表示甲基萘醌类。
由表2可知，本菌株乳球菌20-92的表现性状与格氏乳球菌的模式菌株(JMC10343)一致，而与杀鱼肠球菌(JCM8735)比较，在40℃时的繁殖性与不产生醌两方面不同。所以，判断本菌株与格氏乳球菌(JMC10343株)相似。
本菌株乳球菌20-92被分类于GRAS(美国FDA(食品药品管理局)的食品·食品添加剂的安全性认证；Generally Recognized As Safe)收载的乳性乳酸球菌，所以认为其作为食品等的安全性高。
而且，迄今为止，还没有关于格氏乳球菌对人体的致病性的报道，也无毒素产生，所以认为是安全性高的菌种。
目前，在莫兹阿勒奶酪(mozzarella cheese)、生奶、低温保存中的肉加工食品、原生质(plasome)(真鲷的鱼发酵食品)、TomaPiemontese奶酪(原产地保护的意大利熟练工奶酪(PDO))等中检出可格氏乳球菌。特别是在原生质中以105个/g、在Toma Piemontese奶酪中以108个/g的高含量检出该菌，作为饮食经验·饮食经历都能确保充分的安全性(P-M.Christine，et al.，(2002)Int.J.Food Microbiol.，73，61-70；M.G.Fortina，et al.，(2003)，Food Microbial.，20，379-404)。
另一方面，已知杀鱼肠球菌对人工养殖的鰤鱼等养殖鱼具有致病性。考虑到因为乳球菌20-92也是格氏乳球菌，整体上类似于杀鱼肠球菌，因此，推测乳球菌20-92也可能对养殖鱼具有致病性，但根据本发明人的研究，将乳球菌20-92的电显像与致病性菌株(杀鱼肠球菌-KG株)比较，结果发现该菌株与致病性菌株不同，在菌体表面不存在荚膜。因此认为该菌株没有致病性，也没有污染环境的问题。以上所述的内容也能够得到下述文献的支持。即，吉田等报道对于菌体对养殖鱼的致病性，如果菌体表面存在荚膜则阻碍巨噬细胞的吞噬，结果导致该菌不能被杀死，被该菌污染的养殖鱼会诱发全身性的败血症(T.Yoshida，et al.，(1996)Dis.Aquat.Org.，25，81-86)。
本菌株乳球菌20-92具有以下特征：即使在直接发酵牛奶的情况下，也能维持所希望的雌马酚产生能力(活性)，上述雌马酚产生能力的维持不需要特殊的培养基，例如，可以通过直接发酵豆浆，代谢该豆浆中的黄豆苷元类，生成雌马酚。
目前还没有报道上述具有雌马酚产生能力的乳球菌属的乳酸菌的例子。所以，本发明提供具有所述雌马酚产生能力的新型乳酸菌。
(2)黄豆苷元类及含有黄豆苷元类的物质
在本菌株乳球菌20-92代谢的黄豆苷元类中包括黄豆苷元的苷、黄豆苷元及二氢黄豆苷元。作为黄豆苷元的苷的具体例，可以举出例如黄豆苷。该黄豆苷是以黄豆苷元为苷元的异黄酮苷(黄豆苷元的苷)。该黄豆苷被上述微生物代谢，游离出黄豆苷元，该黄豆苷元进一步代谢生成二氢黄豆苷元，然后最终生成雌马酚。
本发明利用上述黄豆苷元类物质作为基质。该基质并不限于黄豆苷元类，也可以利用含有黄豆苷元类的各种物质。作为含有该黄豆苷元类的物质(含黄豆苷元类的物质)的代表例，可以举出大豆异黄酮。大豆异黄酮已经在市场上出售，在本发明中可以利用上述市售品，例如，FUJICCO社制“FUJIFLABONE P10”(注册商标)等。另外，并不限于大豆异黄酮，例如爬山虎、葛根、红丁香(red clove)、苜蓿(alfalfa)等植物本身及来源于上述植物的异黄酮衍生物都属于含有黄豆苷元类的物质。
作为含有黄豆苷元类的物质的其他具体例，除上述大豆、爬山虎、葛根、红丁香、苜蓿等食物原料本身以外，还可以举出上述原料的加工品，例如豆粉、煮大豆、豆腐、油炸豆腐、豆浆、大豆胚轴萃取物等，及上述物质的发酵制品，例如豆豉、酱油、豆酱、豆饼(tempe)、发酵大豆饮料等。上述物质中的任一种都含有黄豆苷元类。另外，上述物质除含有黄豆苷元类以外，还含有具有雌激素样作用的异黄酮类，例如染料木黄酮及其苷(染料木苷等)；黄豆黄素(glycitein)及其苷(黄豆黄苷等)；作为含有黄豆苷元及染料木黄酮的一部分被甲基化的前体的鹰嘴豆素甲(Biochanin A)及鹰嘴豆素乙(formononetin)等，也适用于本发明。
(3)本发明的组合物
(3-1)含有产生雌马酚的乳酸菌的组合物
本发明的含有产生雌马酚的乳酸菌的组合物含有以上述乳球菌20-92为代表的乳球菌属的乳酸菌作为必须成分，所述乳酸菌具有作用于作为基质的黄豆苷元类或含有黄豆苷元类的物质生成雌马酚的能力。作为该必须成分的乳酸菌通常是活菌，没有特别限定，例如，培养液、从该培养液分离得到的含有菌体的培养物的粗品或纯品、上述产品的冷冻干燥产品等。
上述微生物的培养液，可以通过例如使用适宜该微生物培养的培养基、例如MRS培养基等，将该微生物37℃培养约48小时而得到。另外，在上述培养后，通过例如在3000rpm、4℃、10分钟的条件下离心分离并收集菌株而得到上述菌体。可以按照通常使用的方法对其进行精制。另外，也可以冷冻干燥上述菌体。也可以利用由此得到的冷冻干燥菌体作为本发明组合物的有效成分。
本发明组合物只要含有作为上述有效成分的微生物(菌体等)即可，没有其他特别要求，根据需要还可以含有适宜维持(或增殖)作为上述有效成分的微生物的营养成分。作为该营养成分的具体例子，可以举出用于培养上述各微生物的营养培养基，例如BHI、EG、BL、GAM培养基等。
作为其他营养成分，例如包括牛乳寡糖、大豆寡糖、乳果糖、乳糖醇、果糖寡糖、半乳糖寡糖等各种寡糖。上述寡糖的配比量没有特别限定，但通常优选在本发明组合物中为1-3重量％的含量范围。
上述本发明组合物经摄取后，在摄取者的体内发挥所希望的雌马酚产生能力。通常日本人具有食用含有黄豆苷元类的食品、代表性食物是上述大豆等食品原料、其加工品、及其发酵制品等的习惯，所以，只要摄入本发明组合物，就能够在体内产生雌马酚。
在本发明组合物中，根据需要，还可以适当添加各种维生素类、微量金属元素等。作为上述维生素类，例如可以列举维生素B、维生素D、维生素C、维生素E、维生素K(特别是来源于纳豆菌的MK-7(甲基萘醌-7))等。作为微量金属元素，例如可以列举锌、硒、铁、锰等。
本发明组合物中配合的微生物的含量可以根据使用的乳酸菌的种类等适当决定。例如，乳球菌20-92的情况下，进行配制，使菌数(活菌数)达到108～109个/100g组合物左右的含量。该菌数的测定是通过在细菌培养用琼脂培养基上接种稀释过的试样，37℃下进行需氧培养，测定繁殖后的菌落数而计算的。上述微生物的配比量以上述含量为标准，可以根据本发明组合物的状态等适当变化。
(3-2)含有黄豆苷元类的本发明组合物
本发明组合物可以根据需要进一步含有选自上述黄豆苷元类及含有黄豆苷元类的物质组成的组中的至少1种物质。在上述黄豆苷元类及含有黄豆苷元类的物质中，特别优选大豆胚轴及以其作为原料调制的食品原料，其中进一步优选水溶性或乳化食品原料。作为含有黄豆苷类的物质的其他优选例，可以列举大豆粉或豆浆。
由于组合物中含有基质，所以当没有食用大豆等食品原料的习惯的人们摄入该组合物时，仍然能通过微生物在体内代谢组合物中的基质而生成所希望的雌马酚。
对于黄豆苷元类和/或含有黄豆苷元的物质在组合物中的配比量没有特别限定，通常相当于日本人每日摄入的量，即，10-25mg左右。
(3-3)含有雌马酚的本发明组合物
本发明组合物可以进一步含有雌马酚。
通常使食品原料例如进行乳酸发酵以改善食品的受欢迎性。作为本发明组合物中利用的微生物的代表例的乳球菌20-92具有优异的雌马酚产生能力(活性)。本发明还提供使上述微生物作用于例如豆浆等含有黄豆苷元类的物质，代谢豆浆中的黄豆苷元类生成雌马酚的豆浆发酵物等含有雌马酚的组合物。
作为基质，可以利用上述各种黄豆苷元类及含有黄豆苷元类的物质。其中优选由豆浆、大豆粉等配制的溶液或乳液。
作为含有雌马酚的本发明组合物的一个具体优选例，可以举出向适当的培养基中添加大豆异黄酮或含有大豆异黄酮的食品原料，使本发明微生物、优选乳球菌20-92在该培养基中发酵得到的发酵产物。更详细而言，发酵是通过以下方法进行的，例如使基质呈溶液状态并进行灭菌后，向能繁殖本发明微生物的营养培养基，例如BHI、EG、BL、GAM培养基等，或可用作食品的牛奶、豆浆、蔬菜汁等中添加规定量的本发明微生物，在37℃、厌氧状态或需氧静置状态下，发酵48-96小时左右(根据需要可以添加pH调节剂、还原物质(例如酵母提取物、维生素K1等))。在上述发酵中，基质含量为0.01-0.5mg/mL，微生物的接种量可以在1-5％的范围中进行选择。
由此制备含有雌马酚的本发明组合物。该组合物可以以上述发酵产物的状态制成食品、药品等适当的产品。另外，可以利用通常使用的方法由得到的培养物分离精制雌马酚，还可以根据需要，向其中进一步适当配合其他食品原料等，调制成适当的食品形态或药品形态。
上述分离精制可以如下进行，例如使发酵培养物吸附到离子交换树脂(DIAION HP20，三菱化成社制)上以后，用甲醇溶出，干燥固定。
本发明组合物中的雌马酚含量根据调制的食品形态及药品形态决定，没有特别限定，但通常在总量为100g的组合物中雌马酚含量优选在2-5mg范围内。
可以通过例如下述试验例1中所示的方法确认得到的本发明组合物中含有雌马酚。
含有雌马酚的本发明组合物具有以下优点：由于作为其有效成分的雌马酚是天然物质，所以安全性优异，另外，由于本发明组合物是使用乳酸菌配制而成的，所以不会混入来源于制备工序的化学药品等，而且高收率、低成本，作为食品味道佳等。
(3-4)食品形态
含有产生雌马酚的乳酸菌的本发明组合物，通常含有上述特定的乳酸菌作为必须成分，与适当的可食用载体一同调制成食品形态。
作为食品形态的本发明组合物的具体例，可以举出饮料形态、饮料形态以外的乳制品形态(包括发酵乳)、固体食品形态、含菌微囊形态等。饮料形态的本发明组合物包括乳酸菌饮料和加入乳酸菌的饮料。
上述“发酵乳”及“乳酸菌饮料”等用语是根据原厚生省“关于乳及乳制品的成分等的省令”第二条37“发酵乳”及38“乳酸菌饮料”的定义。即，所谓“发酵乳”是指利用乳酸菌或酵母使乳及乳制品发酵制成的糊状或液体状物质。所以，该发酵乳中同时含有饮料形态和酸乳酪形态等。“乳酸菌饮料”是指以利用乳酸菌或酵母使乳及乳制品发酵制成的糊状或液体状物质为主要原料，用水稀释得到的饮料。
作为加入乳酸菌的饮料，可以列举发酵蔬菜饮料、发酵果实饮料及发酵豆浆饮料等。在饮料形态以外的乳制品形态中还包括片状形态，例如酸奶酪等。固体食品形态包括颗粒、粉末(包括发酵乳冻干粉等)、片剂、发泡制剂、口香糖、果冻、布丁等形态。
可以按照常规方法调整成上述各形态。在调制成上述各形态时使用的载体只要是可食用性载体中的任一个即可。特别优选口感良好、且具有味觉改善效果的载体。作为口感良好、且具有味觉改善效果的载体的具体例，例如，可以列举人造甜味剂、山梨糖醇、木糖醇等。作为其他优选载体，可以列举掩蔽剂，例如海藻糖(林原社制)、环糊精、Benecoat BMI(花王社制)等。
下面详细说明作为食品形态优选具体例子的加入乳酸菌的饮料，上述饮料形态的调制是利用以下方法进行的，在含有微生物营养源的适当发酵用原料物质、例如蔬菜类、果实类、豆浆(大豆乳液)等的液体中，培养微生物，使上述原料物质发酵。作为发酵用原料物质的蔬菜类和果实类包括各种蔬菜及果实的切断物、粉碎物、研磨物、榨汁、酶处理物、及其稀释物和浓缩物。蔬菜类包括南瓜、大蒜、马铃薯、圆辣椒、芹、菠菜、有色甘薯、玉米、甜菜、羽衣甘蓝、荷兰芹、甘蓝、椰菜等。果实类包括苹果、桃子、香蕉、草莓、葡萄、西瓜、橙子、蜜桔等。
蔬菜和果实的切断物、粉碎物及研磨物是通过例如洗净上述蔬菜或果实类后，根据需要实施放入开水中等支化处理后，使用粉碎机、搅拌机、食品加工机、碎浆机、微粒化机等切断、粉碎、研磨后即可得到。榨汁例如可以使用压滤机、榨汁机等进行调制。另外，可以使用滤布等对上述研磨物进行过滤来调制榨汁。酶处理物是利用纤维素酶、果胶酶、原果胶分解酶等作用于上述切断物、粉碎物、研磨物、榨汁等而进行调制的。稀释物中包括用水稀释1-50倍得到的物质。浓缩物包括利用例如冷冻浓缩、减压浓缩等方法浓缩1-100倍得到的物质。
作为发酵用原料物质的其他具体例子的豆浆是利用常规方法由大豆原料调制而成的。该豆浆中包括例如用水浸渍脱皮大豆后，用胶体磨等适当的粉碎机实施湿式粉碎处理后，根据常规方法进行均化处理得到的均质化液体；将水溶性大豆蛋白质溶解于水中得到的溶解液等。
利用微生物的发酵可以通过在发酵用原料物质中接种本发明微生物，进行静置培养来实施。可以根据需要向培养基中加入以下用于使本发明微生物的繁殖良好的物质，所述物质包括例如葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、山梨糖醇、果糖等碳源，酵母提取物、胨等氮源，维生素类、矿物质等。
微生物的接种量通常从能够使1cc含有发酵用原料物质的溶液中菌体量大于或等于1×106个、优选为1×107个左右的量中选择。培养条件通常如下选择：发酵温度20-40℃，优选25-37℃，较优选37℃，发酵时间为8-24小时。
为了进行稳定的发酵，推荐下述方法：预先准备发酵引子，并将其接种到发酵用原料物质上，进行发酵。作为发酵引子，例如，可以代表性地列举在添加有预先进行了90-121℃、5-20分钟的普通杀菌处理的发酵用原料物质、酵母提取物的10％脱脂奶粉等中接种本发明菌体，然后在相同的条件下培养所得到的物质。由此得到的发酵引子中本发明微生物的含量通常为107-109个/g培养物。
如上所述得到的乳酸发酵物有时具有片状形态(酸奶酪状或布丁状形态)，可以将其直接作为食品摄取。将该片状形态的乳酸发酵物进一步均质化，能制成所希望的饮料形态(例如发酵豆浆饮料等)。上述均质化可以使用通常的乳化机(均化机)实现。具体而言，该均质化是使用例如GAULIN社制高压均化机(LAB40)，在约200-1000kgf/cm2、优选约300-800kgf/cm2的条件下，或使用三和机械工业社制均化机(产品型号：HA×4571，H20-A2等)在大于或等于150kgf/cm2的条件下实施。利用上述均质化，能得到口感优异、特别是具有爽滑感的饮料制品，特别是能得到发酵豆浆饮料制品。另外，在上述均质化中，根据需要适当进行稀释，或添加用于调节pH的有机酸类，或添加糖类、果汁、增稠剂、表面活性剂、香料等在饮料的制备中通常使用的各种添加剂。作为优选的添加剂与其添加量(相对片状发酵物重量的重量％)的一个具体例子，例如可以举出葡萄糖为8％(重量％，下同)，砂糖为8％，糊精为8％，柠檬酸为0.1％，甘油脂肪酸酯为0.2％及香料为0.1％。
可以利用常规方法将上述得到的发酵豆浆饮料等本发明乳酸菌饮料无菌罐装到适当的容器中制成产品。该产品具有爽滑的口感和味道。
其给与(摄取)量根据摄取上述产品的个体的年龄、性别、体重、疾病的程度等适当决定，没有特别限定。通常每天服用100-300mL微生物含量为108-109个/mL的饮料产品。
作为本发明组合物的食品形态的其他具体例子，可以举出发泡制剂形态的本发明组合物。其配制方法是在0.01-50％(重量％、下同)本发明微生物(菌体冷冻干燥物)中配合10-35％碳酸钠和(或)碳酸氢钠、以及20-70％中和剂作为发泡成分，进行调制。使用的中和剂是能使上述碳酸钠和碳酸氢钠中和生成二氧化碳的酸性化合物。该化合物例如包括具有代表性的L-酒石酸、柠檬酸、富马酸、抗坏血酸等有机酸。
对于上述发泡成分在本发明发泡制剂中的配比，当使得到的本发明制剂溶于水时，其配比是能使溶液呈酸性、特别是pH约为3.5-4.6的酸性程度的比例。更具体而言，上述比例可以在碳酸钠和(或)碳酸氢钠为10-35％、中和剂为20-70％的范围内选择。特别是碳酸钠可以在11-31％的范围、优选22-26％的范围内选择，碳酸氢钠可以在10-35％的范围、优选20-30％的范围内选择。其中最优选单独使用20-25％范围内的碳酸氢钠。另外，中和剂在20-70％的范围、优选30-40％的范围内选择，最优选使用20-25％的L-酒石酸、8-15％的抗坏血酸。
本发泡制剂以本发明微生物及发泡成分作为必须成分，除此之外，可以根据需要适当添加通常已知的各种添加剂成分，例如赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、渗透压调节剂、电解质、甜味剂、香料、色素、pH调节剂等。作为上述添加剂，例如可以适当选择使用小麦淀粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉、糊精等淀粉类；蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、乳糖等糖类；山梨糖醇、甘露醇、麦芽糖醇、木糖醇等糖醇类；双糖(coupling sugar)、帕拉金糖等糖转移苷；磷酸钙、硫酸钙等赋形剂；淀粉、糖类、明胶、阿拉伯胶、糊精、甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、羟丙基纤维素、黄原胶、果胶、胺黄树胶、明胶、海藻酸等粘合剂或增稠剂；亮氨酸、异亮氨酸、L-缬氨酸、糖酯、固化油、硬脂酸、硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇等润滑剂；结晶纤维素(旭化成社制“avicel”)、羧甲基纤维素(CMC)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、羧甲基纤维素钙(CMC-Ca)等崩解剂；聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯(polysorbate)、卵磷脂等表面活性剂；天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、阿力甜等二肽；甜菊、糖精等甜味剂等。可以根据上述成分与必须成分的关系或制剂的性质、制备方法等，适当选择其使用量。
在本发明发泡制剂中，可以适量添加维生素类、特别是维生素B12、抗坏血酸(维生素C)等。其配比没有特别限定，但通常维生素C的用量从小于或等于30％、优选5-25％的范围内选择。
本发明发泡制剂的制备方法基本上与通常的该类发泡片剂的制备方法相同。即，发泡片剂形态的本发明制剂是通过称量、混合规定量的各成分，经直接粉末压缩法、干式或湿式颗粒压缩法等调制而成的。
只需将上述得到的本发明制剂投入水中，即可制成适合经口给药的饮料形态，然后将其经口给药。
其给药(摄取)量可以依据应该使用该制剂的患者的年龄、性别、体重、疾病的程度等适当选择，没有特别限定，通常每次可以将1-2片、每片1.5-6.0g的本发明发泡片剂溶解于100-300mL水中服用。
作为本发明组合物中的基质的黄豆苷元类或含有黄豆苷元类的物质、特定乳酸菌及根据需要添加的其他成分的特别优选的混合比例，优选相对100g本发明组合物，黄豆苷元类或含有黄豆苷元类的物质以黄豆苷元计算约在10-50mg的范围内，乳酸菌在109-1010个(以活菌数计)的范围内，寡糖等约在1-5g的范围内。
如上所述，本发明含有产生雌马酚的乳酸菌的组合物由于含有微生物(主要是活菌)，因此在用该组合物调制产品时，基本不优选采用加热、加压等条件。所以，在将本发明组合物调制成例如棒状、颗粒、粉末、片剂等产品形态时，优选将微生物制成冷冻干燥菌体直接用于处方，或利用适当的包衣剂加工冷冻干燥菌体进行使用。
但是，本发明的含有产生雌马酚的乳酸菌的组合物不必特别含有活菌。配合活菌和该活菌能代谢的黄豆苷元类等的本发明组合物在已经产生所希望的雌马酚的情况下，可以利用常规方法对该组合物进行加热灭菌处理，杀灭该组合物中存在的菌体。如果采用上述加热灭菌处理，则在配合活菌和该活菌能代谢的黄豆苷元类等的本发明组合物的情况下，可以避免该组合物中存在的活菌在该组合物的保存过程中或流通过程中过度发酵，使味道、气味等恶化。
(3-5)药品形态
本发明的含有产生雌马酚的乳酸菌的组合物通常以上述特定的乳酸菌作为必须成分，并与适当的药学上可接受的制剂载体调制成药物制剂形态。
作为制剂载体，通常可以列举已知在该领域使用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂等稀释剂或赋形剂。可以根据得到的制剂的给药单位形态适当选择使用上述制剂载体。
作为药物制剂的给药单位形态可以选择各种形态。作为其代表例可以列举片剂、丸剂、散剂、液体制剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、胶囊剂、栓剂等。
制成片剂形态时，作为上述制剂载体，例如可以使用乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素、硅酸、磷酸钾等赋形剂；水、乙醇、丙醇、单糖浆、葡萄糖液、淀粉液、明胶溶液、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等粘合剂；羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、低取代羟丙基纤维素、干燥淀粉、海藻酸钠、琼脂粉末、海带淀粉粉末、碳酸氢钠、碳酸钙等崩解剂；聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯类、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯等表面活性剂；白糖、硬脂精、可可黄油、加氢油等崩解抑制剂；季铵盐、十二烷基硫酸钠等吸收促进剂；甘油、淀粉等保湿剂；淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、胶状硅酸等吸附剂；精制滑石、硬脂酸盐、硼酸粉末、聚乙二醇等润滑剂等。
片剂可以根据需要制成进行了普通包衣的片剂，例如糖衣片、明胶包衣片、肠溶包衣片、包膜片或双层片、多层片。
制成丸剂形态时，作为制剂载体，例如可以使用葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、固化植物油、高岭土、滑石等赋形剂；阿拉伯胶粉末、胺黄树胶粉末、明胶、乙醇等粘合剂；海带淀粉、琼脂等崩解剂等。
制成栓剂形态时，作为制剂载体，例如可以使用聚乙二醇、可可脂、高级醇、高级醇酯类、明胶、半合成甘油酯等。胶剂可以利用常规方法将本发明微生物与上述列举的各种制剂载体混合，填充到硬胶、软胶等中调制而成。
另外，根据需要，本发明制剂中还可以含有着色剂、保存剂、香料、调味剂、甜味剂等或其他药品。
本发明中应该含有的本发明微生物的量没有特别限定，可以在大范围内进行选择。通常，可以使其在药品制剂中含有108-1010个/g。
对于上述药物制剂的给药方法没有特别限定，根据各种制剂形态、患者的年龄、性别等其他条件、疾病的程度等决定。例如，片剂、丸剂、液体制剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂及胶剂选择经口给药，栓剂选择直肠内给药。
上述药物制剂的给药量依据其用法、患者的年龄、性别等其他条件、疾病的程度等适当选择，但通常每日每1kg体重给与约0.5-20mg作为有效成分的本发明微生物，该制剂可以每日分1-4次进行给药。
通过摄取(给予)本发明组合物，本发明组合物中的微生物可以以活菌的状态到达消化道下部，或作为常驻菌寄居下来，从而发挥所期待的效果。特别优选的制剂是肠溶性片剂形态，由此能不受胃酸破坏地使微生物到达肠腔。
如上所述地得到的本发明的含有产生雌马酚的乳酸菌的组合物对中老年女性的情绪起伏或伴随闭经出现的例如骨质疏松、更年期障碍等症状的预防及治疗是有用的。所述预防及治疗是通过对需要服药的中老年女性给予有效量的上述本发明组合物或使其摄取有效量的上述本发明组合物而进行的。该有效量只要通过给予本发明组合物能预防和治疗中老年女性的情绪起伏或伴随闭经出现的例如骨质疏松、更年期障碍等症状即可，没有特别限定，通常，以能使在摄取本发明组合物的人的尿液中的雌马酚排泄量大于或等于5μmole(约1.2mg)/日的量为目标。
附图说明
图1是表示利用试验例1中所示的方法求得的培养时间与活菌数的关系的曲线图。
图2是表示利用试验例1中所示的方法求得的培养时间与雌马酚产生能力(得分)的关系的曲线图。
图3是表示利用试验例1中所示的方法求得的培养时间与雌马酚产生量的关系的曲线图。
图4是表示利用试验例2中所示的方法求得的培养物中的黄豆苷元类及雌马酚的经时变化的曲线图。
图5是表示利用试验例3中所示的方法求得的保存时间与雌马酚产生能力(得分)的关系的曲线图。
图6是表示由试验例1-3所示的试验求得的雌马酚产生菌随培养时间的变化状态(增殖性、雌马酚产生能力及雌马酚产生量的变化)的曲线图。
图7是表示利用试验例4中所示的方法求得的培养时间与活菌数的关系的曲线图。
具体实施方式
下面为了更详细地说明本发明，列举本发明的含有产生雌马酚的乳酸菌的组合物的调制例作为实施例，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例1
(1)发酵豆浆饮料的调制
称量、混合下列处方的各成分，调制发酵豆浆饮料形态的本发明组合物。
水溶性大豆蛋白的发酵培养物            100mL
维生素·矿物质                        适量
香料                                  适量
水                                    适量
总量                                  150mL
上述水溶性大豆蛋白的发酵培养物通过下述方法调制，将13g水溶性大豆蛋白溶解在100mL水中，向其中添加108-109个乳球菌20-92(FERM BP-10036)，在37℃使其发酵24-48小时即得。另外，在1g所使用的水溶性大豆蛋白中含有以黄豆苷元换算为1-2mg的黄豆苷元类物质。
(2)发酵乳的调制
称量、混合下列处方的各成分，调制发酵乳形态的本发明组合物。
乳球菌20-92发酵乳                 100mL
维生素·矿物质                    适量
香料                              适量
水                                适量
总量                              150mL
乳球菌20-92发酵乳通过下述方法调制，向1L牛奶(脱脂奶固体成分大于或等于8.5％、奶脂成分大于或等于3.8％)中加入108-109个乳球菌20-92(FERM BP-10036)，在37℃使其发酵24-48小时即得。
(3)发酵豆浆冻干粉末的调制
使用大约109个乳球菌20-92(FERM BP-10036)，使100g豆浆(大豆固体成分含量为10％，黄豆苷元含量：换算成黄豆苷元为10-15mg)在37℃乳酸发酵72-96小时，生成雌马酚。将其冷冻干燥得到粉末。利用HPLC测定粉末中的雌马酚含量，结果为0.1-0.3重量％。
使用上述粉末，称量、混合下列处方的各成分，调制粉末形态的本发明组合物(食品形态及药品形态)。
发酵豆浆冻干粉末                2.2g
(雌马酚含量                 0.005g)
赋形剂(玉米淀粉)            17g
维生素·矿物质              适量
香料                        适量
总量                        20g
(4)粉末的调制
称量、混合下列处方的各成分，调制粉末形态(食品形态及药品形态)的本发明组合物。
乳球菌20-92冻干粉末         4.1g
赋形剂(乳糖)                1.0g
维生素·矿物质              适量
香料                        适量
总量                        20g
乳球菌20-92冻干粉末通过下述方法调制，使用能增殖的适当液体培养基(MRS)培养(37℃、24-48小时)乳球菌20-92(FERM BP-10036)后，将收集的细菌混悬在10％脱脂奶中后，经冷冻干燥后即得，其中菌体含量为109-1010个/g。
也可以在上述粉末中进一步配合4.1g粗制大豆异黄酮粉末，制成含有黄豆苷元的粉末。
摄取上述得到的含有黄豆苷元的粉末，可以观察到雌马酚每日在尿中的排泄量约有5μmole(约1.2mg)，所以，能确定与该排泄量相对应的体内产生的雌马酚。
(5)颗粒的调制
称量、混合下列处方的各成分，调制颗粒形态(食品形态及药品形态)的本发明组合物。
粗制大豆异黄酮粉末                 4.1g
乳球菌20-92冻干粉末                1.0g
蔗糖酸酯                           适量
维生素·矿物质                     适量
香料                    适量
总量                    20g
作为乳球菌20-92冻干粉末使用与上述(1)相同的物质。
通过摄取该制剂，能使黄豆苷元与产生雌马酚的菌一起到达大肠内，由此在大肠内产生雌马酚。
下面列举对本发明的产生雌马酚的乳酸菌进行的试验例。
试验例1
增殖性与雌马酚产生能力(活性)及生成量试验
(1)试验方法
将乳球菌20-92菌株(107-109个/g)在5mL BHI培养液(增殖用液体培养基(基础培养基))中，37℃厌氧培养24小时，然后用基础培养基稀释至102及104，调制稀释液。
分别取0.2mL培养结束后的培养液及各种稀释液，与含有黄豆苷元的基础培养基(向BHI培养液中添加黄豆苷元至其含量达到10μg/mL)、牛奶及豆浆各5mL分别混合，在37℃厌氧培养。在含有10μg/mL黄豆苷元的基础培养基及豆浆中培养时的培养时间为8小时、24小时、48小时、72小时和96小时，在牛奶中培养时的培养时间为24小时和48小时。
在培养开始前和各次培养结束后，取0.1mL及0.2mL培养液作为样品，分别用于菌数测定和雌马酚产生能力(活性)的测定。另外，对于含有10μg/mL黄豆苷元的基础培养基及豆浆，在培养开始前和各次培养结束时，取0.5mL培养液作为样品，测定该培养液中的雌马酚产生量。
菌数的测定如下进行。即，将0.1mL的各样品用PBS(-)溶液(NISSUI社制)稀释，制成104、105、106及107稀释液，将0.1mL的上述各稀释液接种在GAM琼脂培养基上，37℃下需氧培养24小时，测定培养基上生成的菌落数，将其作为菌数。
雌马酚产生能力(活性)的测定如下进行。即，取0.2mL各样品与5mL含有黄豆苷元的基础培养基(各3管)混合，37℃厌氧培养96小时，培养结束后，取各培养液0.5mL作为样品，用5mL乙酸乙酯萃取2次，利用HPLC测定萃取液中的黄豆苷元、二氢黄豆苷元(中间体)及雌马酚的含量，并计算雌马酚在上述化合物总量中所占的比例。将得到的结果以下面5个阶段进行评分，以3个样品的平均分数作为雌马酚产生能力(活性)的指标。
4：雌马酚比例大于或等于90％、
3：产生雌马酚，黄豆苷元减少至小于50％(有中间体)、
2：产生雌马酚，黄豆苷元残留量大于或等于50％(有中间体)、
1：产生中间体，未产生雌马酚、
0：未产生中间体和雌马酚，黄豆苷元未减少。
雌马酚含量的测定如下进行。即，取各样品0.5mL，用5mL乙酸乙酯萃取2次，利用HPLC测定萃取液中的黄豆苷元、二氢黄豆苷元(中间体)及雌马酚。计算各浓度作为雌马酚产生量。
(2)试验结果
(2-1)测定菌数(增殖性)的结果如图1所示。
图中，(1)是利用含有黄豆苷元的基础培养基培养的结果，(2)是利用豆浆培养的结果，(3)是利用牛奶培养的结果。在各图中，横轴表示培养时间(hr)，纵轴表示活菌数(Log cfu/ml)。
由各图所示的结果可知，本菌株的增殖性良好，在含有黄豆苷元的基础培养基、豆浆及牛奶的任一种中，不管接种量如何，培养8小时后都达到稳定状态。关于菌数，在含有黄豆苷元的基础培养基中维持109.1-9.4个/mL，在豆浆中维持108.5-8.7个/mL，在牛奶中维持108.0-8.4个/mL。
(2-2)雌马酚产生能力(活性)的计算结果如图2所示。
图2中，(1)是利用含有黄豆苷元的基础培养基培养的结果，(2)是利用豆浆培养的结果，(3)是利用牛奶培养的结果。在各图中，横轴表示培养时间(hr)，纵轴表示分数。
由该图所示的结果可知，在含有黄豆苷元的基础培养基、豆浆及牛奶任一种中，雌马酚产生能力(活性)具有经时增加的倾向。而且即使在利用牛奶和豆浆培养时，也能保持该菌株的雌马酚产生能力(活性)。
(2-3)雌马酚产生量测定结果
测定含有黄豆苷元的培养基及豆浆(换算成黄豆苷元约为80μg/mL)中产生的雌马酚量，其结果如图3所示。
图3中，(1)是利用含有黄豆苷元的基础培养基培养的结果，(2)是利用豆浆培养的结果。在各图中，横轴表示培养时间(hr)，纵轴表示雌马酚浓度(μg/mL)。
两种培养基中，都发现从培养开始48小时后产生雌马酚。利用豆浆培养时，可观察到接种量不同导致的雌马酚的生成量差异，特别是接种4.00％时，培养96小时后，雌马酚生成量达到57.0μg/mL的显著量。
在豆浆中，作为雌马酚的基质的黄豆苷元90％或90％以上以苷(与葡萄糖结合的状态)的形式存在，由于在测定的色谱中，该苷的峰消失，所以认为该菌株是在分解苷(β-糖苷酶活性)生成黄豆苷元后，将该黄豆苷元代谢成雌马酚。
试验例2
乳球菌20-92菌株的雌马酚生成路径
(1)试验方法
将乳球菌20-92菌株(107个/g)在5mL BHI培养液(增殖用液体培养基(基础培养基))中，37℃厌氧培养24小时后，取0.2mL培养液，与5mL含有黄豆苷元的基础培养基混合，在37℃厌氧培养。培养时间为8小时、24小时、30小时、36小时、48小时、51小时、54小时、60小时、84小时和96小时。
在培养开始前和各次培养结束时，取0.5mL培养液作为样品，测定样品中的黄豆苷元、二氢黄豆苷元(中间体)及雌马酚的浓度。
(2)结果
结果如图4所示。
图4表示黄豆苷元(左图)、二氢黄豆苷元(中间图)及雌马酚(右图)各自的经时浓度变化。图中，横轴表示培养时间(hr)，纵轴表示各物质的浓度(μg/mL)。
由图4所示的结果可知，培养后，在第48小时，黄豆苷元浓度开始减少，作为中间体的二氢黄豆苷元在第48-60小时出现，从第48小时开始生成雌马酚。另外，在第60小时由黄豆苷元向雌马酚的代谢基本结束。
可以确定由黄豆苷元向雌马酚的代谢是以经过中间体二氢黄豆苷元的形式进行的，但推测二氢黄豆苷元的生成和由其向雌马酚的代谢是一同进行的。
试验例3
含有乳球菌20-92菌株的发酵乳的低温稳定性
(1)试验方法
将乳球菌20-92菌株在5mL增殖用液体培养基(基础培养基)中，37℃厌氧培养24小时后，分别在1L、2L牛奶及市售的脱脂奶(固体成分为10％)中接种4％，然后在需氧条件下，37℃静置培养48小时。培养后，于4℃下保存。
在牛奶中培养时，测定培养结束时及4℃低温保存后每周测定雌马酚产生能力(活性)，直至第4周。而且，只将其中2管分别保存至第42天、51天，测定活性。
在脱脂奶中培养时，测定培养结束时及4℃低温保存后第1周和第34天的活性。
培养开始前和各保存时的活性如下判断，基于上述方法，分别在3管5mL含有10μg/mL黄豆苷元的基础培养基中分别接种4％(0.2mL)，在37℃厌氧培养96小时，然后测定培养基中的黄豆苷元、二氢黄豆苷元(中间体)及雌马酚的浓度，由此进行判断。
(2)结果
结果如图5所示。图5中，横轴表示保存时间(日)，纵轴表示分数。
由图中所示结果可知，在牛奶培养中，1L和2L两者在培养结束后4℃下低温保存直至第4周都能保持雌马酚产生能力(活性)。另外，在2L牛奶中培养时，在研究4℃保存稳定性时发现至第51天活性仍然保持。在1L市售的脱脂奶中培养时，培养结束后在4℃低温保存时，发现直至第34天雌马酚产生能力(活性)仍然保持。
由以上结果可知，使用乳球菌20-92菌株调制的发酵乳即使在低温保存时也能保持活性，所以从流通面方面考虑，作为食品也是可能的。
由上述试验例1-3的结果可知，如果归纳乳球菌20-92菌株的增殖与雌马酚产生能力(活性)及雌马酚产生量的关系，则如图6所示。
即，虽然使用的培养基不同，培养条件不同，但是雌马酚产生能力(活性)在增殖期和稳定期都能保持。关于产生雌马酚，认为是在稳定状态以后经过一定时间，表达或激活酶，生成雌马酚。
试验例4
使用乳球菌20-92菌株调制的发酵乳的胃液耐受性试验
(1)试验方法
将乳球菌20-92菌株在5mL厌氧菌增殖用液体培养基(BHI培养液、基础培养基)中，37℃厌氧培养24小时后，在1L牛奶中接种混合4％培养物(109个/g)，然后在需氧条件下，37℃静置培养48小时。培养后，于4℃下保存，即得发酵乳，供以下试验所用。
调制含有0.045％胃蛋白酶的50mM甘氨酸盐酸缓冲液(pH2.5及pH3.0)作为人工胃液。调制50mM甘氨酸盐酸缓冲液(pH6.0)作为对照。
向9mL调制的人工胃液中添加低温保存的发酵乳，在37℃的恒温槽中，在需氧条件下，以静置状态培养(incubation)该混合物。
培养时间分别为1小时、2小时和3小时，在培养开始前和各培养结束时，分别取0.1mL及0.2mL培养液作为样品，供给各样品的菌数测定(0.1mL的情形)及雌马酚产生能力(活性)的测定(0.2mL的情形)。
菌数测定如下进行，基于上述试验例1-(1)所述的方法，分别取0.1mL培养后的培养物，用NISSUI社制的PBS(-)溶液稀释104、105、106及107倍后，将0.1mL各稀释液接种到GAM琼脂培养基上，37℃需氧培养24小时，测定该GAM琼脂培养基上生成的菌落数，求得菌数。
雌马酚产生能力(活性)的测定如下进行，基于上述试验例1-(1)中所述的方法，将0.2mL(0.4％)样品接种到5mL含有黄豆苷元的基础培养基(3管)中，37℃厌氧培养96小时后，测定培养基中的黄豆苷元、二氢黄豆苷元(中间体)及雌马酚的浓度，由此判断活性(评分)。
(2)结果
结果如图7的A(活菌数测定结果)及B(雌马酚浓度)。
图7-A中，横轴表示培养时间(hr)，纵轴表示活菌数(Log cfu/mlin milk)。
图7-B中，横轴表示培养时间(hr)，纵轴表示雌马酚活性(分数)。
由图7-A和7-B所示的结果可得到以下的判断。即，在pH6.0的缓冲液中，直至3小时，活菌数能保持108个/mL，此种情况下，雌马酚产生能力(活性)也得以保持。pH3.0的人工胃液中，培养3小时后，能保持活菌数，此种情况下，活性也被保持。在pH2.5的人工胃液中，从培养第2小时开始，观察到活菌数显著下降，活性消失。
将通常市售的益生菌(probiotics)(以活菌状态到达肠腔内发挥生理作用的微生物)以相同的试验进行研究，结果发现活菌数在pH3.0时没有变化，但在pH2.5时显著降低。由此认为，只要对pH3.0的胃液具有耐受性，就能以活菌状态通过，所以使用乳球菌20-92菌株调制的发酵乳能以活菌状态到达肠腔内，在小肠下部或大肠腔内保持活性。
试验例5
乳球菌20-92菌株的胆汁耐受性试验
胆汁耐受性试验是使用VITEK GPI试卡(日本BIOMERIEUX株式会社)、以在10％和40％胆汁中的本菌株的繁殖性为指标进行判断。
(1)试验方法
将乳球菌20-92菌株(108-109个)接种到添加了5％羊血的胰酶大豆琼脂培养基上，37℃需氧培养24小时。挑取在培养后的培养基上生长的菌落，用0.5％无菌食盐水调制成均质混悬液。将该混悬液放入VITEKGPI试卡中，35℃培养15分钟，然后使用色素(pH指示剂)判断该菌株在胆汁存在下的繁殖性。胆汁是通过将规定量的胆汁粉末溶解于无菌蒸馏水中后注入试卡中。
(2)结果
上述试验的结果显示了乳球菌20-92菌株在10％和40％胆汁中的繁殖性。由该结果可确认该菌株对达到40％胆汁的耐受性。
试验例6
乳球菌20-92菌株的溶血性试验
(1)试验方法
将乳球菌20-92菌株(108-109个)接种到加入了5％羊血的胰酶大豆琼脂培养基上，37℃厌氧条件下(N2∶CO2∶H2＝8∶1∶1)培养24-48小时。观察培养后培养基上繁殖的菌落的周围，通过血液成分的分解(脱色或变色)判断溶血性。
(2)结果
由于上述试验结果未观察到繁殖菌落周围的血液成分的脱色(出现透明无色区域)，所以认为乳球菌20-92菌株没有β溶血性，在此方面是安全的。
试验例7
乳球菌20-92菌株的细胞浸润性酶的活性试验
对于摄取的乳酸菌入侵人体内部的情形，从宿主方面考虑，主要原因是肠管膜的防御功能下降或膜自身的损伤。从菌株方面考虑，主要原因是结合脂质、蛋白后具有分解构成肠管膜的蛋白多糖的酶活性(细胞浸润性酶)。
该试验讨论乳球菌20-92菌株是否具有作为细胞浸润性酶的胶原酶(明胶酶)、透明质酸酶及唾液酸酶(唾液酸苷酶)活性，并如下所示进行试验。
(1)试验方法
将乳球菌20-92菌株接种到添加了血液的琼脂培养基上(接种量108-9个)，37℃厌氧条件下(N2∶CO2∶H2＝8∶1∶1)培养24-48小时。
挑取在培养后的培养基上生长的菌落，用无菌蒸馏水使其悬浮，调制均质混悬液。对于得到的混悬液，使用API厌氧鉴定试剂盒(日本BIOMERIEUX株式会社)，以明胶的分解为指标，判断有无胶原酶(明胶酶)活性。
乳球菌20-92菌株是否具有透明质酸酶及唾液酸酶(唾液酸苷酶)活性的试验如下进行，在分别以透明质酸和唾液酸为基质的tris-盐酸缓冲液(pH7.0)中培养乳球菌20-92菌株(对于唾液酸酶活性的判断，37℃需氧条件下培养15分钟；对于透明质酸酶活性的判断，37℃需氧条件下培养24小时)，检测各基质浓度是否降低，从而判断菌株的酶活性。
(2)结果
乳球菌20-92菌株没有显示胶原酶(明胶酶)、透明质酸酶及唾液酸酶(唾液酸苷酶)中任一种酶的活性。
所以，由于该菌株不具备作为感染性的一个主要原因的细胞浸润性酶，从而确认其在感染性方面安全性很高。
试验例8
万古霉素耐药性试验
近年来出现细菌对抗生素药物产生耐药性(变异)的问题。被对抗生素药物产生耐药性的细菌感染的患者往往出现由于抗生素不能发挥抗菌效果而导致死亡的情形。目前，特别是针对抗生素万古霉素的耐药性(VRE)的出现给医学界带来深刻的问题。另外，摄入体内的微生物具有万古霉素耐药性遗传因子的情况下，该微生物到达并寄居在肠腔内，如果接触到毒性或感染性菌(病原菌)，则可能造成万古霉素耐药性遗传因子转移到该病原菌，病原菌由此获得万古霉素耐药性的后果。因此，可作为益生菌使用的活菌至少要求该菌株本身不是万古霉素耐药性菌。
该试验是研究乳球菌20-92菌株对万古霉素的敏感性，如下所述地进行操作。
(1)试验方法
对万古霉素的敏感性试验是使用药敏盘(sensi disc)(日本BD(BECTON DICKINSON)株式会社制)进行的。即，将乳球菌20-92菌株接种到GAM琼脂培养基上(接种量108-9个)，并将含有30μg万古霉素的盘放置在培养基上，37℃需氧培养24小时。培养后，测定盘周围形成的抑制圈直径，并依据判断表进行判定。
(2)结果
乳球菌20-92菌株的抑制圈直径为11.9±0.2mm，依据判断表判定为敏感性(大于或等于10mm为敏感)。由该结果可知，该菌株不是万古霉素耐药性菌株，所以，在该方面安全性高。
下面作为实施例2列举利用本发明乳酸菌将黄豆苷元代谢成雌马酚的制造例。
实施例2
雌马酚的制备
调制1ml以厌氧菌培养用GAM培养基混悬107-109个乳球菌20-92菌株(FERM BP-10036)得到的液体，将该液体加入到100g(固体成分浓度约为2.2％)豆浆中，37℃厌氧培养72-96小时，利用HPLC法测定培养液中产生的雌马酚量。上述豆浆中的黄豆苷元类含量换算成黄豆苷元为95μg/mL。
由该结果确认得到的豆浆培养物中生成10.7±6.3μg/mL(3次的平均值±标准偏差)。
由此可知，利用本发明微生物能有效并且廉价地由食品原料中的黄豆苷元类物质制备雌马酚。

Claims (9)

1.一种含有产生雌马酚的乳酸菌的组合物，其特征在于，该组合物含有格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)作为必须成分，所述格氏乳球菌具有代谢选自黄豆苷元的苷、黄豆苷元及二氢黄豆苷元组成的组中的至少1种黄豆苷元类而产生雌马酚的能力，所述格氏乳球菌来自人粪便，所述格氏乳球菌是以FERM BP-10036号保藏的乳球菌20-92。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物进一步含有选自黄豆苷元类及含有黄豆苷元类的物质组成的组中的至少1种物质。
3.如权利要求2所述的组合物，其中，所述含有黄豆苷元类的物质是大豆粉或豆浆。
4.如权利要求2所述的组合物，其中，所述组合物是饮料或乳制品形态。
5.如权利要求2所述的组合物，其中，所述组合物进一步含有雌马酚。
6.如权利要求5所述的组合物，其中，所述组合物是豆浆发酵物形态。
7.雌马酚的制备方法，其特征在于，该方法是通过使格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)作用于选自黄豆苷元类及含有黄豆苷元类的物质组成的组中的至少1种物质制备雌马酚，所述格氏乳球菌具有代谢黄豆苷元类产生雌马酚的能力，所述格氏乳球菌是以FERM BP-10036号保藏的乳球菌20-92。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述含有黄豆苷元类的物质是大豆粉或豆浆。
9.一种乳球菌属的乳酸菌，其以FERM BP-10036号被保藏。
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