WO2005000042A1 - エクオール産生乳酸菌含有組成物 - Google Patents

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lactococcus
lactic acid
equol
composition
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Shigeto Uchiyama
Tomomi Ueno
Toshimi Suzuki
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Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Definitions

  • the present invention relates to a lactic acid bacterium capable of producing exo-ol, a composition 3 containing the lactic acid bacterium, and a method for producing equol using the lactic acid bacterium.
  • Isoflurane soybean isoflavone contained in soybean has a preventive effect (anti-estrogenic effect) on breast cancer, prostate cancer, etc., and menopause, osteoporosis after clot, hyperlipidemia, hypertension BE Have been reported to have an improvement effect (estrogen-like effect) mainly in Europe and the US (H. Adlercreutz, et a!., (1992) Lancet, 339, 1233; H. Adlercreutz, et al "(1992) Lancet, 342, 1209-1210; DD Baird, et al., (1995) J. Clin. Endocrinol.
  • soy isoflavone an active metabolite of soy isoflavone
  • equol an active metabolite of soy isoflavone
  • various reports have been found that equol, a metabolite of soy isoflavone, is more effective than breast cancer, prostate cancer, menopause and postmenopausal osteoporosis (D. Ingram, et al. ., (1997) Lancet, 350, 990-994; AM Duncan, et al., (2000) Cancer Epidemiology,
  • the present invention provides the inventions described in the following items 1-13.
  • Item 1 Contains lactic acid bacteria belonging to the genus Lactococcus having the ability to produce equol by conferring at least one tyzein selected from the group consisting of daidzein glycosides, daidzein and dihydrodaidzein An equol-producing lactic acid bacteria-containing composition that is awaited.
  • Lactic acid bacteria belonging to the genus Lactococcus are Lactococcus garbi:
  • Item 2 The composition according to Item 1, which is (Lactococcus garvieae).
  • Item 3 The composition according to Item 2, wherein the lactic acid bacterium belonging to the genus Lactococcus is Lactococcus 20-92 deposited as FERM BP-10036.
  • Item 4 The composition according to Item 1, further comprising at least one selected from the group consisting of daidzeins and daidzein-containing substances.
  • Item 5 The composition according to Item 4, wherein the substance containing daidzein is soy flour or soy milk.
  • Item 6 The composition according to Item 4, which is in the form of a beverage or candy product.
  • Item 7 The composition according to Item 4, further comprising equol.
  • Item 8 The composition according to Item 7, which is in the form of a fermented soymilk.
  • a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactococcus having the ability to assimilate daidzeins and produce equol is allowed to act on at least one selected from the group consisting of daidzeins and daizines-containing substances (All production methods.
  • Item 10 The method according to Item 9, which is (Lactococcus garvieae).
  • Item 11 The method according to Item 10, wherein the lactic acid bacterium belonging to the genus Lactococcus is Lactococcus 20-92 deposited as FERM BP-10036.
  • Item 12 The method according to Item 9, wherein the daidzein-containing substance is soy flour or soy milk.
  • Item 13 A lactic acid bacterium belonging to the genus Lactococcus deposited as FERM BP-1 0036. Hereinafter, the equol-producing lactic acid bacteria-containing composition of the present invention will be described in detail.
  • the equol-producing lactic acid bacterium-containing composition of the present invention has an ability (metabolic activity) to produce equol by assimilating at least one kind of daidzein selected from the group consisting of daidzein glycoside and daidzein or dihydrodaidizein. Contains lactobacilli belonging to the genus Lactococcus as an essential ingredient.
  • lactic acid bacteria examples include Lactococcus 20-92 (FERM BP-10036) newly isolated and identified by the present inventors from human feces.
  • This strain can be anaerobically cultured at 37 ° C for 48 hours in a steel wool anaerobic jar using EG (Eggerth-Gagnon) agar, BL (Blood Liver) agar or GAM (Gifu Anaerobic Medium). It shows good or normal growth during aerobic culture at 37 ° C for 48 hours.
  • the colony is raised in a round shape and convex shape, smooth on both the surface and the periphery, grayish white on the EG agar medium, and brown on the BL agar medium.
  • the fungal form is Gram-positive diuretic. This strain does not form spores.
  • n d indicates not detected.
  • this strain is classified as the gram-positive cocci Lactococcus garvieae (Lacrococcus garvieae), but its type strain (Schleifer, KH, Kraus, ⁇ , Dvorak, C., Kilpper-Balz, R., Collins, M, D. and Fischer, W. Transfer of Streptococcus lactis and related streptococci to the qenus Lactococcus gen. Nov. Syst. Appl. Microl, 6, 183-195 , 1985; ATCC43921 (JCM10343) and ATCC49156 (JCM8735)) differ in the utilization of starch.
  • this strain as Lactococcus 20-92, and on January 23, 2003, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Deposited as FERM P-19189 in Tsukuba Sakai Higashi 1-chome 1-3, Central 6 (zip code 305-8566)) in Ibaraki Prefecture.
  • AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
  • FERM P-19189 in Tsukuba Sakai Higashi 1-chome 1-3, Central 6 (zip code 305-8566)
  • Ibaraki Prefecture This strain has now been transferred to an international deposit and the deposit number is FERM BP-10036.
  • this strain produced lactic acid (L-type lactic acid), which confirmed that it was a homofermentative lactic acid bacterium.
  • Enterococcus ceriolicida was reclassified into Lactococcus garbier in 1996 because it approximated Lactococcus garbier as a result of DNA-DNA homology.
  • Lactococcus galbier JCM8753 and 10343 strains
  • Enterococcus seriolisida JCM8735
  • the original Lactococcus garvier JCM10343 strain
  • MK represents naquinone
  • Lactococcus 20-92 is milk lactic acid globules listed in GRAS (FDA (Food and Drug Administration), safety labeling of foods and food additives, generally Recognized As Safe) It is classified as a fungus and its safety as a food is considered high.
  • GRAS Food and Drug Administration
  • Lactococcus garbier there have been no reports on pathogenicity against scales, and it has been considered that it is highly safe without producing toxins such as toxins.
  • Lactococcus garbier is traditionally protected by mozzarella cheese, raw milk, processed meat food at low temperature, prazome (Thai fish fermented food), Toma Piedmont monzes (starting name) It is detected from Italian skilled cheese (PDO). In particular, there is a report that it is detected at a high order of 10 5 pieces Zg from Prasom and 10 8 pieces / g from Toma Piemontese cheese, which can ensure sufficient safety as a food experience and food history. Yes (PM.Christine, et al., (2002)
  • Lactococcus 20-92 is also a Lactococcus galeviae and is considered to be systematically related to Enterococcus seriolicida, and there is concern about ffe which may cause pathogenicity to farmed fish.
  • the electron micrograph of Lactococcus 20-92 was compared with the pathogenic strain (enterococcus' seriolisida-KG strain). Was confirmed not to exist. From this, it is considered that this strain has no pathogenicity and there is no problem of environmental pollution. This is supported by the following literature.
  • Yoshida et al. Regarding the pathogenicity of bacterial cells * in cultured fish, the presence of a capsule on the surface of the bacterial cells inhibits phagocytosis by macrophages, and as a result, the bacteria are not sterilized and contaminated with the bacteria. It has been described that induced cultured fish induces systemic sepsis (T. Yoshida, et al., (1996) Dis. Aquat. Org., 25, 81-86).
  • the present strain Lactococcus 20-92 maintains the desired exoyl-producing ability (activity) even when directly fermented with milk. For example, by fermenting soy milk as it is, it has a characteristic that it can produce equol with the aid of daidzeins in the soy milk.
  • the present invention also provides a new lactic acid bacterium having such an equol-producing ability.
  • the daidzeins utilized by this strain Lactococcus 20-92 include daidzein glycosides, daidzein and dihydrodaidzein.
  • daidzein glycosides include, for example, daidzin.
  • the daidzin is an isoflavone glycoside (daidzein glycoside) having daidzein as an aglycone.
  • dadin it is assimilated by the microorganism to release daidzein, which is further assimilated into dihydrodaidzein, and finally equol force S is produced.
  • the above daidzeins are used as a substrate.
  • the substrate is not limited to daidzein, and various substances containing it can be used.
  • soybean isoflavone can be exemplified. Soy isoflavone has already been marketed, and in the present invention, such a commercial product, for example, “Fujiflavone P10J (registered trademark)” manufactured by Fujikko Co., Ltd. can be used. Plants such as kudzu root, red clove, and alfa alpha, and isoflavone derivatives derived from them are also included in the daidzeins containing substances.
  • substances containing daidzein include, in addition to the above-described food ingredients such as soybean, kuzu, kuzukone, red glove, and alfa alpha, and their additives such as soybean flour, boiled soybeans, Examples include tofu, fried tofu, beans, soybean hypocotyl extracts, and fermented preparations thereof such as natto, soy sauce, miso, tempeh, and fermented soy beverages. These all contain daidzeins.
  • daidzeins include isoflavones that have estrogenic action, such as genistein and its glycosides (genistin, etc.); Daricityin and its glycosides (glycine, etc.); one of daidzein and genistein. Contains a methylated precursor and can be suitably used in the present invention.
  • the equol-producing lactic acid bacteria-containing composition of the present invention belongs to the genus Lactococcus having the ability to act on daidzeins or daidzein-containing substances as substrates, and to produce equol, starting with the aforementioned lactococcus 20-92.
  • the lactic acid bacterium as the essential component is generally a living bacterium itself, but is not particularly limited to this. For example, a nutrient solution, a crude product of a culture containing cells isolated from the culture solution, or the like. It may be a purified product or a purified product, or a freeze-dried product thereof.
  • the microorganism culture solution can be typically obtained by, for example, culturing the microorganism at 37 ° C. for about 48 hours using a culture medium suitable for culturing the microorganism, for example, MRS medium. be able to.
  • the cells can be obtained, for example, by centrifuging the culture solution after centrifugation for example by centrifuging the culture solution at 3000 rpm for 4 minutes at 4 ° C. These can be purified according to conventional methods.
  • the cells can be freeze-dried. The freeze-dried cells obtained in this way can also be used as an active ingredient of the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention only needs to contain a microorganism (such as a fungus body) as the active ingredient, and is not particularly required. However, if desired, the composition can maintain (or proliferate) the microorganism as the active ingredient. It can contain suitable nutritional ingredients. Specific examples of the nutrient component include a nutrient medium for culturing each microorganism as described above, such as BHI, EG,> 0 BL, and GAM medium.
  • Examples of other nutritional components include various oligosaccharides such as dairy oligosaccharide, soybean oligosaccharide, lactulose, lactitol, fructooligosaccharide, and garake oligosaccharide.
  • the blending amount of these oligosaccharides is not particularly limited, but it is preferably selected from an amount range which is usually about 1-3% by weight in the composition of the present invention.
  • composition of the present invention exerts a desired equol-producing ability in the body of ingestion spring when ingested.
  • Japanese people have a habit of eating foods containing daidzein, typically food materials such as soybeans, processed products thereof, fermented preparations thereof, and the like. According to this, equol is produced in vivo.
  • vitamins include vitamin B, vitamin D, vitamin vitamin E, vitamin K (especially MK derived from Bacillus natto)
  • trace metal elements include zinc, selenium, iron, and manganese.
  • the amount of microorganisms to be blended in the composition of the present invention can be appropriately determined according to the type of lactic acid bacteria used. For example, in the case of Lactococcus 20-92, it is preferable that the number of bacteria (viable count) is 10 8 to "! 0 9 ". Calculated by applying the diluted sample to an agar medium for nourishment, performing aerobic culture at 37 ° C, and measuring the number of grown colonies. The amount can be appropriately changed according to the form of the composition of the present invention to be prepared and the like.
  • composition of the present invention can further contain at least one selected from the group consisting of the aforementioned daidzeins and daidzein-containing substances, if desired.
  • daidzeins and daidzein-containing substances soybean hypocotyls and food materials prepared from these are preferred, and water-soluble or emulsified food materials are more preferred.
  • water-soluble or emulsified food materials are more preferred.
  • other preferable tyzein-containing substances include soy flour or soy milk.
  • This composition is based on the fact that a substrate is contained in the composition, and even if a person who does not have a habit of eating food ingredients such as soybeans ingests this, the microorganism in the living body does not absorb the substrate in the composition. By utilizing it, the desired equol can be produced.
  • daidzeins and sputum or daidzein-containing substances there are no particular restrictions on the amount of daidzeins and sputum or daidzein-containing substances in the composition, but it is appropriate that the amount normally consumed by Japanese per day is about 10-25 mg. It is.
  • composition of the present invention may further contain equol.
  • beans A composition containing exool, such as a fermented soymilk product, produced by causing microorganisms to act on daizines-containing substances such as milk to produce ecol by assimilating daizines in soymilk. provide.
  • the various daidzeins and daidzein-containing substances described above can be used as the substrate.
  • a solution or an emulsion prepared from soy milk, soybean powder or the like is preferable.
  • soybean isoflavone or a food material containing the same is added to an appropriate medium, and the microorganism of the present invention, preferably Lactococcus 20-92, is fermented in the medium.
  • the fermentation is more specifically, for example, after the substrate is sterilized in a solution state, the nutrient medium capable of growing the microorganism of the present invention, for example, 81 "11, £ 6,8 and 6 1/1 medium, Or add a certain amount of the microorganism of the present invention to milk, soy milk, vegetable juice, etc.
  • Fermentation pH adjuster, reducing substance (for example, yeast extract, vitamin, etc. can be added if necessary)
  • the basic mass is 0.01-
  • the dose can be selected from the range of about 1-5%.
  • the equol-containing composition of the present invention can be produced.
  • the composition can be made into a product suitable as a food, medicine, etc. in the form of the fermentation product itself.
  • equol is isolated and purified from the obtained culture according to a conventional method, and further, if necessary, other appropriate food ingredients are appropriately blended to prepare an appropriate food form or pharmaceutical form. You can also.
  • the isolation and purification can be carried out, for example, by a method in which the fermentation culture is adsorbed on an ion exchange resin (DIAION HP20, manufactured by Mitsubishi Kasei Co., Ltd.), eluted with methanol, and dried.
  • ion exchange resin DIAION HP20, manufactured by Mitsubishi Kasei Co., Ltd.
  • the amount of equol in the composition of the present invention is determined according to the food form and pharmaceutical form to be prepared, and is not particularly limited. Usually, the amount of equol contained in about 2-5 mg per 100 g of the total composition. It is preferable to be in the range.
  • composition of the present invention contains exoirre is, for example, Test Example 1 described later. It can confirm by the method shown in.
  • the equol-containing composition of the present invention is excellent in safety because equol as an active ingredient is a natural product, and is prepared using lactic acid bacteria. There is no risk of contamination with chemicals derived from it, and there are further advantages such as high yield and low production cost, and excellent flavor as a food.
  • the equol-producing lactic acid bacterium-containing composition of the present invention is generally prepared in a food form containing the specific lactic acid bacterium as an essential component together with an appropriate edible carrier.
  • composition of the present invention in food form include beverage forms, dairy product forms other than beverage forms (including fermented milk), solid food forms, and bacteria-containing microcapsule forms.
  • the beverage composition of the present invention includes lactic acid bacteria drinks and drinks containing lactic acid bacteria.
  • the terms “fermented milk” and “lactic acid bacteria beverage” shall conform to the definitions of the former Ministry of Health and Welfare “Ministerial Ordinance on Components of Milk and Dairy Products”, Article 37 “Hatsu Fermented Milk” and 38 “Lactic Acid Beverage”. . That is, “fermented milk” refers to a paste or liquid obtained by fermenting milk or dairy products with lactic acid bacteria or yeast. Therefore, the fermented milk includes a yogurt form as well as a beverage form. “Lactic acid bacteria beverage” refers to a beverage obtained by diluting milk or dairy products with paste or liquid fermented with lactobacillus or yeast as a main ingredient.
  • Examples of drinks containing lactic acid bacteria include fermented vegetable drinks, fermented fruit drinks, and fermented soymilk drinks.
  • Non-beverage forms of dairy products include card-like forms such as yogurt.
  • Solid food forms include granules, powders (including fermented milk freeze-dried powders, etc.), tablets, effervescent preparations, gums, gummies, and puddings.
  • the carrier used for the preparation of each of these forms may be any edible carrier.
  • a carrier having a palatable taste improving effect is preferable.
  • Specific examples of the carrier having a pleasant taste-improving effect include artificial sweeteners, sorbitol, xylitol and the like. Can be illustrated.
  • Other preferable carriers include masking agents such as trehalose (Hayashibara), cyclodextrin, Benecoat BMI (Kao).
  • beverage forms include appropriate fermentation raw materials including nutrient sources for microorganisms such as vegetables, fruits, soy milk (soy emulsification In a liquid such as a liquid) by culturing microorganisms and fermenting the raw material.
  • Vegetables and fruits as raw materials for fermentation include various vegetable and fruit cuts, crushed materials, polishing products, juices, enzyme-treated products, dilutions and concentrates thereof.
  • Vegetables include capochia, carrot, tomato, pepper, celery, spinach, colored sweet potato, corn, beet, kale, parsley, cabbage, broccoli.
  • Fruits include apples, peaches, bananas, strawberries, grapes, watermelons, oranges and mandarin oranges.
  • Cut and chopped vegetables and fruits, crushed foods, etc. for example, after washing the above-mentioned vegetables and fruits and fruits, blanching them into hot water as necessary, etc. 1. It can be obtained by cutting, grinding, and grinding with a pulper, my colloider, etc.
  • the juice can be prepared using, for example, a filter press, a juicer mixer or the like.
  • the juice can also be prepared by filtering the ground product using a filter cloth or the like.
  • the enzyme-treated product can be prepared by allowing cellulase, pectinase, protopectin-degrading enzyme, etc. to act on the above-mentioned cut product, crushed product, polished product, and juice. Dilutions include those diluted 1-50 times with water.
  • Concentrates include, for example, those concentrated 1 to 100 times by means such as freeze concentration and vacuum concentration.
  • Soymilk which is another specific example of the raw material for fermentation, can be prepared from a soy raw material according to a conventional method.
  • the soymilk is prepared by, for example, immersing moistened soybeans in water, using a suitable milling machine such as a colloid mill, and then wet-grinding and then homogenizing in a conventional manner and dissolving water-soluble soybean protein in water.
  • the dissolved solution is also included.
  • Fermentation using microorganisms is performed by inoculating the raw material for fermentation with the microorganism of the present invention and culturing.
  • fermentation promoting substances for good growth of the microorganism of the present invention such as glucose, starch, sucrose, lactose, dex Carbon sources such as hydrogen, sorbitol and fragment, nitrogen sources such as yeast extract and peptone, vitamins and minerals can be added.
  • the amount of inoculated microorganism should be selected from the amount that contains approximately 1 X 10 6 cells or more, preferably around 1 X 10 7 ⁇ @ in 1 cc of the raw material containing fermentation material. is there.
  • the culture conditions are generally selected from a fermentation temperature of about 20-40 ° C, preferably about 25-37 ° C, more preferably 37 ° (: about 8-24 hours during fermentation.
  • a starter for example, typically, 90-121 ° C: a raw material for fermentation that has been subjected to normal sterilization treatment for 5-20 minutes, 10% nonfat dry milk added with yeast extract, etc. Examples include those inoculated with bacterial cells and cultured under the same conditions.
  • the starter obtained as described above usually contains about 10 7 -1O 9 / g culture of the microorganism of the present invention.
  • the lactic acid fermented product obtained as described above may have a card-like form (a form for yogurt or pudding), and this can be taken as a food as it is.
  • the lactic acid fermented product in the form of a card can be made into a desired beverage form (for example, fermented soymilk drink) by further homogenizing it.
  • This homogenization can be carried out using a general milking machine (homogenizer). Specifically, the homogenization is performed by, for example, high-pressure homogenization manufactured by GAULIN.
  • LAB40 using a conditioner of about 20O-1000kgf / cm 2 , preferably about 300-800kgf / cm 2 , or using a modernizer manufactured by Sanwa Kikai Kogyo Co., Ltd. (part number: HAX4571, H20-A2, etc.) 150 kg / cm 2 or more.
  • a blender of about 20O-1000kgf / cm 2 , preferably about 300-800kgf / cm 2 , or using a modernizer manufactured by Sanwa Kikai Kogyo Co., Ltd. (part number: HAX4571, H20-A2, etc.) 150 kg / cm 2 or more.
  • a beverage product having an excellent texture, particularly smoothness, particularly a fermented soymilk beverage product.
  • dilute appropriately as necessary add organic acids to adjust pH, and manufacture beverages such as sugars, fruit juices, thickeners, surfactants, and fragrances.
  • Various additives that are usually used can be added as appropriate.
  • preferable additives and the amount thereof added include, for example, glucose 8% (% by weight, the same applies hereinafter), sugar 8%, dextrin 8%, citrate 0.1%, Mention may be made of glycerin fatty acid esters 0.2% and fragrances 0.1%.
  • the lactic acid bacteria beverage of the present invention such as a fermented soymilk beverage thus obtained can be prepared by aseptically filling an appropriate container as usual.
  • the product has a smooth throat texture and flavor.
  • the amount of administration is appropriately determined depending on the age, sex, weight, degree of disease, etc. of the living body ingesting it, and is not particularly limited.
  • beverage products prepared with a microbial content of 10 8 -10 9 cells / mL should be taken about 100-300 mL per day.
  • composition of the present invention in the form of food include those in the form of foamed preparations.
  • This product is obtained by adding 0.01 to 50% (wt%, the same shall apply hereinafter) of the microorganism of the present invention (bacterial lyophilized product) to sodium carbonate and / or sodium bicarbonate 10-35% and neutralizer 20-70%. It can be prepared by blending as a foaming component.
  • the neutralizing agent used here is an acidic compound that can neutralize the above sodium carbonate and sodium hydrogen carbonate to generate a carbonic acid gas.
  • examples of the compound typically include organic acids such as L-tartaric acid, citrate, fumaric acid, and ascorbic acid.
  • the blending ratio of the above foaming component in the foamed preparation of the present invention is such that when the obtained preparation of the present invention is dissolved in water, the solution becomes acidic, particularly about pH 3.5-4.6. It is good to do. More specifically, the proportion is selected from the range of 10-35% sodium carbonate and / or sodium bicarbonate and 20-70% neutralizer.
  • sodium carbonate should be selected from the range of 11-31%, preferably 22-26%, and sodium bicarbonate 10-35%, preferably 20-30%. Of these, sodium hydrogen carbonate is most preferably used alone in the range of 20-25%.
  • the neutralizing agent is selected from the range of 20-70%, preferably 30-40%, and most preferably, the tartaric acid is used in the range of 20-25% and the ascorbic acid is used in the range of 8-15%.
  • the foamed preparation comprises the microorganism of the present invention and a foaming component as essential components, and other various additive components that are generally known, for example, excipients, binders, disintegrating agents, Hitoshi Luisawa !, thickeners.
  • a surfactant, an osmotic pressure regulator, an electrolyte, a sweetener, a fragrance, a pigment, a pH adjuster, and the like may be appropriately added and blended as necessary.
  • additives examples include starches such as wheat starch, potato starch, corn starch and dextrin; sugars such as sucrose, glucose, fructose, maltose, xylose and lactose; sorbitol, mannitol, maize Sugar alcohols such as rutile i ⁇ l and xylyl; sugar rearranged glycosides such as coupling sugar and palatinose; excipients such as calcium phosphate and calcium sulfate; starch, saccharides, gelatin, gum arabic, Binders or thickeners such as dextrin, methylthycellulose, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, hydroxypropylcellulose, xanthan gum, pectin, tragacanth gum, casein, alginic acid; leucine, isoleucine, levalin, sugar ester, hardened oil, stearic acid, Lubricants such as magnesium stearate, talc, and macro
  • CMC carboxymethylcellulose
  • CMC-Na sodium carboxymethylcellulose
  • CMC-Ca potassium carboxymethyl cellulose
  • surface active agents such as polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (polysolipate), lecithin; aspartame And dipeptides such as ariteme; and other sweeteners such as stevia and saccharin.
  • Appropriate amounts can be appropriately selected and used in consideration of the relationship with these essential ingredients, the properties of the preparation, the production method, and the like.
  • an appropriate amount such as vitamins, particularly cyanokoparamine-ascorbic acid (vitamin C) can be added and blended.
  • the blending ratio is not particularly limited, but it is usually selected from vitamin C up to 30%, preferably about 5-25%.
  • the production method of the effervescent preparation of the present invention can basically be the same as the production method of this ordinary effervescent tablet. That is, the preparation of the present invention in the form of an effervescent tablet can be prepared by mixing a predetermined amount of each component in a small amount, mixing, and directly using a powder compression method, a dry type or a wet granule compression method.
  • the preparation of the present invention thus obtained can be made into a beverage form suitable for oral administration by simply adding it to water, and it is administered orally.
  • the dose (ingestion) is appropriately determined according to the age, sex, weight, disease level, etc. of the organism to which this is to be applied, and is not particularly limited.
  • 1-2 tablets of the present effervescent tablet prepared in the above may be dissolved in 100-300 mL of water at a time.
  • Daidzein or daidzein-containing substance as a substrate in the composition of the present invention,
  • the particularly preferred mixing ratio of the specific lactic acid bacterium and other components added and blended as required is as follows: Daidzeins or daidzein-containing substances are in the range of about 10-50 mg in terms of daidzein, It is desirable that 10 9 to 10 1Q (as the number of viable bacteria) and oligosaccharide etc. be in the range of about 1-5 g.
  • the composition containing exo-producing lactic acid bacteria of the present invention including microorganisms (mainly viable bacteria)
  • conditions such as heating and pressurization are used.
  • the adoption of is not very preferable. Therefore, when preparing the composition of the present invention into product forms such as pars, granules, powders, tablets, etc., the microorganisms are directly formulated as freeze-dried cells, or the freeze-dried cells are processed with an appropriate coating agent. It is preferable to use it.
  • the equol-producing lactic acid bacterium-containing composition of the present invention does not necessarily contain live bacteria.
  • the composition of the present invention in which viable bacteria and daidzein which can be assimilated thereof are combined has already produced the desired equol, the composition is heat sterilized according to a conventional method, Bacteria present in the composition may be killed. According to the adoption of such heat sterilization treatment, in the case of the composition of the present invention in which viable bacteria and diazenes which can be assimilated are blended, the viable bacteria present in the composition are In some cases, the possibility of excessive fermentation during storage or in the distribution process can degrade the taste and flavor.
  • the equol-producing lactic acid bacterium-containing composition of the present invention is generally prepared in a pharmaceutical preparation form containing the specific lactic acid bacterium as an essential component and an appropriate pharmaceutically acceptable preparation carrier.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, moisturizers, disintegrants, surfactants, lubricants, etc., which are generally known in this field. Can be illustrated. These are appropriately selected and used depending on the dosage unit form of the resulting preparation.
  • Moisturizers such as glycerin and starch
  • Adsorbents such as starch, lactose, kaolin, bentonite and colloidal gay acid
  • lubricants such as purified talc, stearate, boric acid powder and polyethylene glycol can be used .
  • the key agent can be made into a tablet coated with a normal coating as necessary, for example, a sugar-coated tablet, a gelatin-encapsulated tablet, an enteric-coated tablet, a film-coated tablet, a double tablet, or a multilayer tablet.
  • excipients such as glucose, lactose, starch, cocoa butter, hydrogenated vegetable oil, kaolin, talc, etc .; combined homologues such as gum arabic powder, tragacanth powder, gelatin, ethanol, etc.
  • J Can use laminar, Kanten and other disintegrants.
  • Capsules are usually prepared by mixing the microorganisms of the present invention with the various pharmaceutical carriers exemplified above and filling them into hard capsules, soft capsules and the like.
  • the preparation of the present invention may contain a coloring agent, a preservative, a fragrance, a flavoring agent, a sweetening agent, and other medicines as required.
  • the amount of the microorganism of the present invention to be contained in the preparation of the present invention is not particularly limited and is appropriately selected from a wide range. Usually, it should be contained in pharmaceutical preparations at about 10 8 -10 1Q / g.
  • the administration method of the above pharmaceutical preparation is not particularly limited, and is determined according to various types of preparation, patient age, sex and other conditions, and the degree of disease. For example, tablets, pills, solutions, suspensions, emulsions, granules and capsules are administered orally, and suppositories are administered rectally.
  • the dosage of the above pharmaceutical preparation is appropriately selected according to the usage, age of the patient, other conditions according to 1 and the degree of disease, etc., but the amount of the microorganism of the present invention, which is usually an active ingredient, per 1 kg body weight per day
  • the dosage should be about 0.5-20 mg, and the preparation can be administered in 1 to 4 divided doses per day.
  • composition of the present invention can have the desired effect by ingesting (administration) the microorganisms in the composition reaching the lower extinguisher alive or colonizing as a resident bacterium.
  • a particularly preferred preparation is in the form of an enteric-coated tablet, whereby microorganisms can reach the intestine without being invaded by gastric acid.
  • the equol-producing lactic acid bacterium-containing composition of the present invention thus obtained is useful for the prevention and treatment of symptoms such as osteoporosis and menopause associated with indefinite complaints or menopause in middle-aged and elderly women.
  • Such prevention and treatment is carried out by administering or taking an effective amount of the above-described composition of the present invention, which is required for this middle-aged female.
  • the effective amount is particularly limited as long as the prevention and treatment of symptoms such as osteoporosis and menopausal disorders are feasible by administration of the composition of the present invention, associated with indefinite complaints or menopause in middle-aged women.
  • the amount of urinary excretion in humans who have taken the composition of the present invention is 5 moles (about 1.2 mg) Z days or more.
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between the culture time determined according to the method shown in Test Example 1 and the number of viable bacteria.
  • FIG. 2 is a graph showing the relationship between the culture time determined according to the method shown in Test Example 1 and equol production ability (score).
  • Fig. 3 shows the relationship between the incubation time determined according to the method shown in Test Example 1 and It is a graph which shows a relationship.
  • FIG. 4 is a graph showing the changes over time of daidzeins and inks in this culture obtained according to the method shown in Test Example 2.
  • FIG. 5 is a graph showing the relationship between the cocoon storage period and the exool production ability (score) obtained according to the method shown in Test Example 3.
  • Fig. 6 is a graph showing the state of equol-producing bacteria (proliferation, equol production ability, and change in equol production amount) associated with the culture time determined from the test shown in Test Example 1-3.
  • FIG. 7 is a graph showing the relationship between the silkworm culture time and the number of viable bacteria determined according to the method shown in Test Example 4.
  • Example 1 preparation examples of the composition containing the equol-producing lactic acid bacteria will be described as examples, but the present invention is not limited thereto.
  • Example 1
  • Each component of the following formulation was weighed and mixed, and fermented soy was studied to prepare the present composition in the form of a beverage.
  • the above-mentioned fermented culture of water-soluble soy protein is obtained by adding 10 8 -10 9 Lactococcus 20-92 (FERM BP-1 O036) to a solution obtained by dissolving 13 g of water-soluble soy protein in 10 OmL of water. -Fermented for 48 hours.
  • the water-soluble soy protein used contains about 1-2 mg of daidzein in 1 g in terms of daidzein.
  • composition of the present invention was weighed and mixed to prepare the composition of the present invention in a fermented milk state.
  • Lactococcus 20-92 fermented milk consists of 10 8 -10 9 lactococcus 20-92 (FERM BP-10036) to 1 L of milk (non-fat milk solid content 8.5% or more, milk fat content 3.8% or more) And fermented at 37 ° C for 24-48 hours.
  • Lactococcus 20-92 (FERM BP-10036) About 10 9 soy milk (soybean solid content 10%, daidzein content: 10-15 mg as daidzein equivalent) 100 g of lactic acid at 37 ° C for 72-96 hours Fermented to produce equol; fe. This was freeze-dried to obtain a powder. The equol content in the powder was 0.1 to 0.3% by weight as determined by HPLC.
  • composition of the present invention (food form and pharmaceutical form) in powder form.
  • composition of the present invention in powder form (food form and pharmaceutical form).
  • Lactococcus 20-92 freeze-dried powder can be obtained from Lactococcus 20-92 (FERM BP- 10036) was cultured in an appropriate liquid medium (MRS) capable of growth (37 ° C, 24-48 hours), and the collected cells were suspended in 10% skim milk and then freeze-dried.
  • the cell content is 10 9 -10 10 g.
  • the above powder can be made into a daidzein-containing powder by further blending 4.1 g of a crudely purified soybean isoflavone powder.
  • composition of the present invention in a granular form was prepared by mixing a small amount of each component of the following formulation.
  • Lactococcus 20-92 freeze-dried koji the same as the above (1) was used. By ingesting this, Daizen and equol-producing bacteria can reach the large intestine together, thus producing equol within the moon.
  • Lactococcus 20-92 strain (10 7 -10 9 / g) was cultured in 5 ml of BHI broth (Liquid medium for growth (basic medium)) under anaerobic condition at 37 ° C for 24 hours. Dilutions were prepared by diluting to 10 2 and 10 4 .
  • Daizenin-containing basic medium BHI broth added with daidzein in an amount of 10 g / mL
  • the culture time was 8 hours, 24 hours, 48 hours, 72 hours and 96 hours for basal medium containing 10 g / mL daidzein and soy milk, and 8 hours, 24 hours and 48 hours for milk.
  • 0.1 mL and 0.2 mL of the culture broth were sampled and used for measurement of the number of bacteria and measurement of equol production ability (activity), respectively. Furthermore, for W fig / mL daidzein-containing basal medium and soybean milk, 0.5 mL of the culture solution was sampled before the start of culture and at the end of each culture, and the amount of equol produced in the solution was measured. The number of bacteria was measured as follows. That is, dilute each sample Ol mL with PBS (-) solution (Nice Rice) to make 10 4 , 10 5 , 10 6 and 10 7 solutions.
  • O.l mL was applied to a GAM agar medium, cultured at 37 ° C for 24 hours under aerobic conditions, and the number of colonies growing on the medium was counted to determine the number of bacteria.
  • the equol production ability was measured as follows. Specifically, 0.2 mL of each sample was mixed with 5 mL of daidzein-containing basal medium (3 each), incubated at 37 ° C for 96 hours under anaerobic conditions, and 0.5 mL of each culture solution was sampled after completion of the culture. After extraction twice with 5 mL of ethyl, daidzein, dihydrodaidzein (intermediate) and equol in the extract were measured by HPLC, and the total amount of equol was calculated. The obtained results were scored in the following five levels, and the average score of the three samples was used as an indicator of ekol production ability (activity).
  • the equol production was measured as follows. That is, 0.5 mL of each sample was extracted twice with 5 mL of ethyl acetate, and daidzein, dihydrodaidzein (intermediate) and equol in the extract were measured by HPLC. Each concentration was calculated as the yield of equol.
  • (1) is the result when basal medium containing daidzein is used
  • (2) is soymilk (3) is the result when milk is used.
  • ⁇ In the figure, the horizontal axis indicates the culture time (hr), and the vertical axis indicates the viable cell count (Log cfu / ml).
  • Figure 3 shows the results of measuring the amount of equol produced in daidzein-containing basal medium and soy milk (approximately SO g / mL in terms of daidzein equivalent).
  • (1) is the result when using a basal medium containing daidzein
  • (2) is the result when using soymilk.
  • the horizontal axis represents the culture time (hr)
  • the vertical axis represents the equol concentration ( ⁇ g / ml).
  • Lactococcus 20-92 (10 7 cells / g) is cultured in 5 ml of BHI broth (liquid medium for growth, basic medium) under anaerobic conditions at 37 ° C for 24 hours. The mixture was mixed with 5 mL of basal medium containing glucose and cultured at 37 ° C under anaerobic conditions. The culture duration was 8 hours, 24 hours, 30 hours, 36 hours, 48 hours, 51 hours, 54 hours, 60 hours, 84 hours and 96 hours.
  • Samples of 0.5 mL were sampled before the start of culture and at the end of each culture, and the concentrations of daidzein, dihydrodaidzein (intermediate) and engineered qual in the sample were measured.
  • Figure 4 shows daidzein (left), dihydrodaidzein (middle) and :! : Shows the change in concentration of each qual (right figure) over time.
  • the horizontal axis indicates the culture time (hr)
  • the vertical axis indicates the concentration (g / ml) of each substance.
  • Lactococcus 20-92 strain grown in 5 mL liquid medium (basic medium) under anaerobic conditions at 37 ° C for 24 hours, then 1 milk, 2 L, and commercially available skim milk (10% solids) 1 4 Inoculated and incubated at 37 ° C for 48 hours under aerobic conditions. After incubation, it was stored at 4 ° C.
  • equol productivity activity was measured weekly at the end of the culture and for 4 weeks after low-temperature storage at 4 ° C. Furthermore, only two of them were stored until the 42nd and 51st days, and the activity was measured.
  • the activity was measured at the end of the culture and 4 weeks after storage at low temperature on the 1st and 34th days.
  • the activity before the start of culture and at the time of each storage was inoculated with 4% (0.2 mL) of 5 mL of 3 ml basal medium containing lO g / ml daidzein according to the method described above, under anaerobic conditions for 96 hours. After culturing at ° C, it was judged (scored) from the concentrations of daidzein, dihydrodaidzein (intermediate) and equol in the medium.
  • FIG. 5 The results are shown in FIG. In Fig. 5, the horizontal axis indicates the storage period (days), and the vertical axis indicates the score.
  • fermented milk prepared using Lactococcus 20-92 strain can maintain its activity even under low temperature storage, and it is considered that it can be handled as a food from the viewpoint of distribution.
  • Test Example 1-3 the relationship between the growth of Lactococcus 20-92 strain, equol production (activity), and equol production is summarized as shown in FIG.
  • the eccle production ability (activity) can be maintained in both the growth phase and the stationary phase.
  • the enzyme is expressed or activated to produce equol.
  • Lactococcus 20-92 strain anaerobic growth liquid medium (BHI broth, basal medium) anaerobically in 5 mL, After 24 hours at 37 ° C, culture (10 9 / g) Milk 1 L was mixed with 4% inoculum, and incubated at 37 ° C for 48 hours under aerobic conditions. After culturing, they were stored at 4 ° C and used as fermented milk for the following tests.
  • quoll-producing ability is measured by inoculating 5 mL (3 tubes) of daidzein-containing basic medium with 0.2 mL (4%) of sample. 96 hours After culturing at 37 ° C under anaerobic conditions, it was judged (scored) from the concentrations of daidzein, dihydrodaidzein (interstitial) and equol in the medium.
  • the horizontal axis is the culture time (hr), and the vertical axis is the viable cell count (Log cfu / ml in milk).
  • the horizontal axis is the culture time (hr), and the vertical axis is the equol activity (score).
  • the results shown in 07-A and 7-B show the following. That is, the number of viable bacteria was maintained at 10 8 cells / mL for 3 hours in the pH 6.0 buffer solution. The activity was also maintained. pH 3.0 persons;!: In gastric juice, viable cell count can be maintained for up to 3 hours of culture, in which case the activity is also maintained. On the other hand, in the artificial gastric fluid of ⁇ 2.5, a significant decrease in the number of viable bacteria was observed from the 2nd hour of culture, and the activity disappeared.
  • probiotics microorganisms that live in the intestine and have physiological effects
  • the viable cell count does not change at ⁇ 3.0, but ⁇ 2 .5 is reported to be significantly reduced. Therefore, it can be considered that if ⁇ ⁇ 3.0 has gastric juice resistance, it can be passed alive, so the fermented milk prepared using Lactococcus 20-92 strain reaches the intestine alive, and in the lower or large intestine. It is thought that the activity can be maintained.
  • the bile resistance test was performed using Vitec GPI card (Nihon Piomelie Co., Ltd.) as an indicator of the viability of this strain in 10% and 40% bile.
  • the Lactococcus 20-92 strain was smeared (10 8 to 9 ) on 5% sheep blood-added Trypticase agar medium and cultured aerobically at 37 ° C for 24 hours. Colonies that grew on the cultured medium were picked and a homogeneous suspension was prepared using 0.5% sterilized saline. This was put into Vitec GPI force, and after culturing at 35 ° C for 15 hours, the viability of this strain in the presence of bile was determined using a dye (pH indicator). The bile was poured into the card after dissolving a predetermined amount of bile powder in sterile distilled water.
  • the Lactococcus 20-92 strain showed viability in 10% and 40% bile. From this, the tolerance to 40% bile was confirmed.
  • lactic acid bacteria When ingested lactic acid bacteria enter the living body, host-side factors may be a decrease in the defense function of the tubule membrane or damage to the membrane itself. Enzyme activity that binds lipids and proteins as a factor on the bacteria side and degrades proteodarican that forms the intestinal membrane
  • Cell invasive enzyme Cell invasive enzyme
  • Colonies that grew on the cultured medium were picked and suspended in sterile distilled water to prepare a homogeneous suspension. About the obtained suspension, the presence or absence of collagenase (gelatinase) activity was determined with an Aapikenki (Nippon Piomelie Co., Ltd.) identification kit using gelatin degradation as an index.
  • Lactococcus 20-92 has hyaluronidase and sialidase (neuraminidase) activity was tested in Tris-HCl buffer (PH7.0) using hyaluronic acid and sialic acid as substrates, respectively. Lactococcus 20-92 is incubated (37 ° C, aerobic conditions for 15 minutes for sialidase activity and 24 hours for hyaluronidase activity) to determine whether to reduce each substrate concentration. This was done by measuring.
  • Lactococcus 20-92 strain Lactococcus 20-92 strain, collagenase (gelatinase), hyaluronida Neither activity nor sialidase (neuraminidase) was shown.
  • this strain is highly safe in terms of infectivity because it lacks the cell invasive enzyme which is one factor of infectivity of this strain.
  • Sensitivity test for vancomycin was performed using Sensi disc (Enomoto Becton, Dickinson). That is, smeared Lactococcus 20-92 strain GAM agar medium (coating amount: 10 8 - 9), a disk which contains vancomycin 30 g placed media on [this, 24 hours aerobically at 37 "C After culturing, the diameter of the inhibition circle formed around the disc was measured and judged from the judgment table.
  • Example 2 The inhibition circle diameter of the Lactococcus 20-92 strain was 11.9 ⁇ 0.2 mm, and it was judged as sensibility from the judgment table (10 mm or more was judged as sensibility). From this result, it was confirmed that this strain is not a vancomycin-resistant bacterium and is therefore highly safe in this respect.
  • Example 2 An example of producing equol from daidzein using the lactic acid bacterium of the present invention will be described as Example 2.
  • Example 2 An example of producing equol from daidzein using the lactic acid bacterium of the present invention will be described as Example 2.

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Description

明 細 書
ェクオール産生乳酸菌含有組成物
技 術 分 野
本発明は、 ェクオ一ル産生能を有する乳酸菌、 該乳酸菌を含有する組成物^ 3よ び該乳酸菌を利用してェクオールを製造する方法に関する。
背 景 技 術
大豆中に含まれるイソフラ ン (大豆イソフラボン)が、 乳癌、 前立腺癌などに 対して予防効果 (抗エストロゲン効果）を有すること、 および更年期障害、 閉凝後 の骨粗鬆症 ·高脂血症 ·高血 BEなどに対して改善効果 (エストロゲン様効果）を有 することは、 主として欧米において、 既に報告されてきている（H. Adlercreutz, et a!., (1992) Lancet, 339, 1233; H. Adlercreutz, et al" (1992) Lancet, 342, 1209- 1210; D. D. Baird, et al., (1995) J. Clin. Endocrinol. Metab., 80, 1685- 690: A. L. Murkies, et al., (1995) Maturitas.. 21. 198- 95: D. Agnusdei, et al., (1995) Bone and Mineral., 19 (Supple) . S43-S48等参照）。
最近になって、 大豆イソフラボンの臨床効果が疑問視され、 該大豆イソフラポ ンに代って、 大豆イソフラボンの活性代謝物であるェクオールが、 臨床応用にお ける有効性の鍵を握ると報告されている。 即ち、 乳癌、 前立腺癌、 更年期障害お よび閉経後の骨粗鬆症に対して、 大豆イソフラボンよりもその代謝物であるェク オールのほうが有効である旨の報告が種々見出される（D. Ingram, et al., (1997) Lancet, 350, 990-994; A. M. Duncan, et al., (2000) Cancer Epidemiology,
Biomarkers & Prevention, 9, 581-586; C. Atkinson, et al" (2002) J.Nutr., 32 (3) ' 595S; H. Akaza, et aに，（2002) Jpn. J. Clin. Oncol., 32 (8) , 296-300; S. Uchiyama,. et al., (2001) Ann. Nutr. Metab., 45, 113 (abs)等参照）。
2001年に開催されたシンポジウム（第 4回 International Symposium on the Role of Soy in Preventing and Treating Chronic Disease (San Diego, USA, 2001))では、 ェクオールに関する演題が数多く見られ、 2002年 12月には、 ェクオールに圏する 総説が報告され、 現在では、 ： クオールが大豆イソフラボンの有効性の本体であ ることが、 学術的に支持されつつある（K. D. R. Settchell, et al., (2002) J. Nutr., 132, 3577-3584)。 ェクオールは乳房組織、 前立腺組織などの組織への移行性が、 大豆イソフラポ ンと比較して非常に高く、 このことからも、 その生理的意義が裏付けられている
(J. Maubach, et al., (2003) J. Chromatography B.， 784, 137-144; T. E. Hedlund, et al., (2003) The Prostate, 154, 68-78)。
また、 ェクオールは、 S昜内細菌によって生成され、 その生成には個人差の存在 することが報告されている。 日本人のェクオール産生者の割合は約 50%であるこ とも報告されている（S. Uchiyama., et al., (2001) Ann. Nutに Metab.， 45,
113 (abs) ) o ェクオ一リレを産生できないヒトは、 ェクオール産生菌が腸 F¾に存 在しないと推察される。 このようなヒトの場合、 大豆加工食品を摂取して 所望 の抗エストロゲン効果、 ェストロゲン様効果は期待できないと考えられる。 この ようなヒトにおいて所望の効果を発現させるためには、 ェクオ一ル産生菌を摂取 させるか、 ェクオール自体を摂取させればよいと考えられる。
本発明者らは、 上記の着想から研究を重ねた結果、 先に、 抗エストロゲン効果、 エストロゲン様効果などを発揮させるためのェクオール産生菌として、 ヒ卜の糞 便からパクテロイデス E-23-15 (FERM BP-6435号）、 ストレプトコッカス E-23- 17 (FERM BP-6436号)およびストレプトコッカス A6G225 (FERM BP-6437号）の
3菌株を新たに単離 ·同定し、 これらのェクオ一ル産生菌およびその利用に係る 発明を特許出願した（国際公開： WO99/07392) o
発 明 の 開 示
本発明者らは、 引き続き研究を重ねた結果、 先に単離 ·同定した微生物とは本 質的に異なる新しい菌として、 ダイゼイン配糖体、 ダイゼインあるいはジヒドロ ダイゼインを資化してェクオールを産生する能力を有するラクトコッカス属に属 する乳酸菌を単離 ·同定するに成功した。 本発明はこの乳酸菌の単離 ·同定を基 礎として更に研究を重ね; 結果、 完成されたものである。
本発明は、 下記項 1-13に記載の要旨の発明を提供する。
項 1. ダイゼイン配糖体、 ダイゼインおよびジヒドロダイゼインからなる群から 選ばれる少なくとも 1種のタイゼィン類を資ィ匕してェクオ一ルを産生する能力を 有するラクトコッカス属に属する乳酸菌を必須成分として含有することを待徵と するェクオール産生乳酸菌含有組成物。 項 2. ラクトコッカス属に属する乳酸菌が、 ラクトコッカス ·ガルビ:
(Lactococcus garvieae)である項 1に記載の組成物。
項 3. ラクトコッカス属に属する乳酸菌が、 FERM BP-10036号として寄託され たラクトコッカス 20-92である項 2に記載の組成物。
項 4. 更に、 ダイゼイン類およびダイゼイン類含有物質からなる群から選ばれる 少なくとも 1種を含む項 1に記載の組成物。
項 5. ダイゼィン鎮含有物質が大豆粉または豆乳である項 4に記載の組成物。
項 6.飲料または钆製品形態である項 4に記載の組成物。
項 7. 更に、 ェクオールを含む項 4に記載の組成物。
項 8. 豆乳発酵物形態である項 7に記載の組成物。
項 9. ダイゼィン顏ぉよびダイゼィン類含有物質からなる群から選ばれる少なく とも 1種に、 ダイゼイン類を資化してェクオールを産生する能力を有するラクト コッカス属に属する乳酸菌を作用させることを特徴とするェクオール ( 製造方法。 項 10. ラクトコッカス属に属する乳酸菌が、 ラクトコッカス 'ガルビエ
(Lactococcus garvieae)である項 9に記載の方法。
項 11. ラクトコッカス属に属する乳酸菌が、 FERM BP-10036号として寄託さ れたラクトコッカス 20-92である項 10に記載の方法。
項 12. ダイゼィン類含有物質が大豆粉または豆乳である項 9に記載の方法。
項 13. FERM BP-1 0036号として寄託されたラクトコッカス属に属する乳酸菌。 以下、 本発明ェクオール産生乳酸菌含有組成物につき詳述する。
(1) ラクトコッカス属乳酸菌
本発明ェクオール産生乳酸菌含有組成物は、 ダイゼイン配糖体、 ダイゼインお よぴジヒドロダイゼィンからなる群から選ばれる少なくとも 1種のダイゼィン類 を資化してェクオールを産生する能力（代謝活性)を有するラクトコッカス属の乳 酸菌を必須成分として含有する。
該乳酸菌の具体例には、 本発明者らがヒト糞便中より新たに単離 ·同定したラ クトコッカス 20-92 (FERM BP-10036号）が包含される。
以下、 この乳酸菌の菌学的性質につき詳述する。
I. 培地上での発育^ 本菌株は、 EG (Eggerth-Gagnon)寒天培地、 BL (Blood Liver)寒天培 ¾もしくは GAM (Gifu Anaerobic Medium)培地を用いてスチールウール加嫌気ジャーにより 37°C、 48時間、 嫌気培養するかあるいは 37°C、 48時間、 好気培養する際に、 良 好もしくは普通の生育を示す。 その集落性状は、 正円、 凸円状に隆起レ、 表面 - 周縁とも平滑で、 EG寒天培地上では灰白色、 BL寒天培地上では茶褐色を呈する。 菌形態は、 グラム陽性の双球菌である。 本菌株は芽胞を形成しない。
II. 生化学的性質
(1 ) 至適発育温度 ： 37°C
(2) 発育至適 pH： 7.0
(3) ゼラチンの液 f匕： 一
(4) ピルビン酸からのァセトイン産生： +
(5) 馬尿酸の加水分解： 一
(6) エスクリンの加水分解： +
(7) ピロ二ドルァリルアミダーゼ： +
(8) CK -ガラクトシタ一ゼ：
(9) )3 -ガラクトシダ一ゼ：
(10) )3 -グルクロニダーゼ：
(1 1 ) アルカリフォスファタ一
(12) ロイシンァリ レアミダ一
(13) アルギニンジヒドラーゼ
(14) 各炭素源の同ィ匕性：
D-リポース
しァラビノース
D-マンニトーリレ
D-ソルビトーレ
ラクト一ス
D-トレハロース
ィヌリン
D-ラフィノース スターチ +
グリコーゲン ―
(15) ペプトンまたはグルコース資化後の有機酸組成：
糖資化性用培地である PYF (ペプトン ·イーストェクス卜ラクトフィールド）養 液 (約 5%ぺプ卜ン含有）および PYF培養液にグルコースを最終濃度 0.5%となるよ うに添加したものを用いて、 本菌株を好気的条件下で、 37°C、 72時間培養を行う ことによって得られた培養物中の有機酸を HPLC法によって測定した。 結果 (単位 ： mM)を次の表 1に示す。
表 1
Figure imgf000007_0001
n dは検出されずを示す。
以上の発育性状および生化学的性質の各点から、 本菌株はグラム陽性球菌であ るラクトコッカス 'ガルビエ（Lacrococcus garvieae)に分類されるが、 そのタイ プストレイン (Schleifer, K. H.， Kraus,丄， Dvorak, C.， Kilpper-Balz, R.， Collins, M, D. and Fischer, W. Transfer of Streptococcus lactis and related streptococci to the qenus Lactococcus gen. nov. Syst. Appl. Microbioに， 6， 183-195, 1985; ATCC43921 (JCM10343) and ATCC49156 (JCM8735) )とは、 スターチの資化性 の点で異なっている。
従って、 本発明者は本菌株をラクトコッカ 20-92 (Lactococcus 20-92)と命 名し、 平成 15年 1月 23日に、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン 夕一（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号 中央 6 (郵便番号 305-8566) )に、 FERM P-19189号として寄託した。 この菌株は、 現在、 国際寄託に移管されてお り、 その寄託番号は、 FERM BP-10036である。
また、 本菌株はグルコースを資化した後、 乳酸 (L型乳酸）を生成し、 このこと から、 ホモ発酵の乳酸菌であることが確認された。
更に、 本菌株の 16SrRNAのシークェンスを解析した結果、 該シークェンスは夕
Figure imgf000008_0001
•ガルビエ（JCM10343)と 99.189%、 ェン テロコッカス -セリオリシダ（Enterococcus seriolicida，JCIVl8735)と 99.375%の 相同性が確認された。
尚、 上記ェンテロコッカス .セリオリシダは、 DNA-DNAホモロジ一の結果、 ラクトコッカス ·ガルビエに近似することから 1996年にラクトコッカス ·ガルビ ェに再分類されている。 従って、 ラクトコッカス 'ガルビエには、 上述したよう にその起源が異なるタイプストレインが 2種類 (JCM8753枨および 10343株)存在 する。 ェンテロコッカス ·セリオリシダ (JCM8735)は、 感染したプリの腎臓を起 源とし、 本来のラクトコッカス ·ガルビエ (JCM10343株)は牛乳房炎を起源とす
Figure imgf000008_0002
するのかを検討するため、 表現形質を比較した。 その結果を次表 2に示す。 表 2
Figure imgf000009_0001
MKは ナキノンを示す。
表 2から明らかなように、 本菌株ラクトコッカス 20-92は、 表現形質がラクトコ ッカス ·ガルビエのタイプストレイン (JMC10343)と一致したが、 ェンテロコッ カス ·セリオリシダのタイブストレイン (JMC8735)とは、 40°Cにおける生育性 とキノンを産生しない点で異なった。 従って、 本菌拔は、 ラクトコッカス ·ガル ビエ (JCM10343株）に近似すると判断した。
本菌株ラクトコッカス 20-92は、 GRAS (米国 FDA (食品医薬品局）による食品 · 食品添加物の安全性表示認可； Generally Recognized As Safe)収載の乳性乳酸球 菌に分類されるものであり、 その食品などとしての安全性は高いと考えられる。 尚、 ラクトコッカス ·ガルビエについてはこれまで尺体に対する病原性につい ての報告【まなく、 トキシンなどの毒素産生もなく、 安全性の高い菌種と考えられ ている。
また、 ラクトコッカス ·ガルビエは、 従来、 モッツァレラチーズ、 生乳、 低温 保存中の肉加工食品、 プラソ一ム（タイの魚発酵食品）、 トーマピエモンテ一ゼチ —ズ (起澱の名称によって保護されたイタリアの熟練工チーズ (PDO))などから検 出されてレ る。 特に、 プラーソムからは 105個 Zg、 トーマピエモンテ一ゼチーズ からは 108個 /gという高いオーダ一で検出される旨の報告もあり、 食経験 ·食歴 として十分な安全性を担保できるものである （P-M.Christine， et al.， （2002)
Int.J.Food Microbiol., 73, 61-70; M.G. Fortina, et al., (2003) , Food Microbial., 20, 379-404) 。
一方、 ェンテロコッカス ·セリオリシダにはハマチなどの養殖魚において病原 性があることが報告されている。 このため、 ラクトコヅカス 20-92もラクトコッ カス ·ガ レビエであることから系統的にはェンテロコゾカス ·セリオリシダに類 縁するものと考えられ、 養殖魚に対する病原性の可能 ffeが懸念されたが、 本発明 者の研究によれば、 ラクトコッカス 20-92の電顕像を病原性の菌株（ェンテロコッ カス 'セリオリシダ -KG株）と比較した結果、 本菌株は病原性菌株とは異なって菌 体表面に爽膜が存在しないことが確認された。 このことから、 本菌株は病原性を 有しておらず、 環境汚染の問題もないと考えられる。 このことは、 以下の文献の 記載からも支持される。 即ち、 ヨシダらは、 養殖魚に *する菌体の病原性につい て、 菌体表面に莢膜が存在するとマクロファージによる貪食が阻害され、 その結 果、 該菌は殺菌されず、 該菌に汚染された養殖魚では全身性の敗血症を誘発する 旨記載している（T. Yoshida, et al., (1996) Dis. Aquat. Org., 25, 81 -86) 。
更に、 本菌株ラクトコッカス 20-92は、 直接牛乳で発酵させる場合でも、 所望 のェクオ一ル産生能 (活性）を維持しており、 このェク; ル産生能の維持に、 特 殊な培地を必要とせず、 例えば豆乳をそのまま発酵させることによって、 該豆乳 中のダイゼィン類を資ィ匕してェクオ一ルを産生できる^徴を有している。
従来、 このようなェクオール産生能を有するラクトコッカス属に属する乳酸菌 報告された例がない。 従って、 本発明はかかるェクオール産生能を有する新し レ 乳酸菌をも提供するものである。
(2) ダイゼィン類およびダイゼィン類含有物質
本菌株ラクトコッカス 20-92が資化するダイゼィン類には、 ダイゼイン配糖体、 ダイゼインおよびジヒドロダイゼインが含まれる。 ダイゼイン配糖体の具体例と しては、 例えばダイジンを例示することができる。 該ダイジンは、 ァグリコンと してダイゼインを有するイソフラボン配糖体 （ダイゼイン配糖体） である。 該ダ ジンの場合は、 上記微生物により資化されて、 ダイゼインを遊離し、 該ダイゼ ィンが更に資化されてジヒドロダイゼインとなり、 それから最終的にェクオール 力 S産生される。
本発明においては上記ダイゼイン類を基質として利用する。 また、 該基質とし てはダイゼイン類に限らず、 これを含有する各種の物質を利用することができる。 該ダイゼイン類を含有する物質 （ダイゼイン類含有物質） の代表例としては、 大 豆イソフラボンを例示することができる。 大豆ィゾフラボンは、 既に市販されて おり、 本発明ではこのような市販品、 例えばフジッコ社製 「フジフラボン P10J (登録商標)などを利用することもできる。 また、 大豆イソフラボンに限らず、 例 えば葛、 葛根、 レッドクロ一ブ、 アルフアルファなどの植物自体およびこれらを 起源とするイソフラボン誘導体もまた、 ダイゼィン類含有物質に含まれる。
更に、 ダイゼイン類を含有する物質の他の具体例としては、 上述した大豆、 葛、 葛根、 レッドグローブ、 アルフアルファなどの食素材自体に加えて、 それらの加 品、 例えば大豆粉、 煮大豆、 豆腐、 油揚げ、 豆し、 大豆胚軸抽出物など、 およ びそれらの発酵調製物、 例えば納豆、 醤油、 味噌、 テンペ、 発酵大豆飲料などを 挙げることができる。 これらはいずれもダイゼイン類を含有している。 また、 こ れらは、 ダイゼイン類の他に、 エストロゲン様作用を有するイソフラボン類、 例 えばゲニスティンとその配糖体 (ゲニスチンなど）； ダリシティンとその配糖体 (グリシチンなど） ；ダイゼインおよびゲニスティンの一部がメチル化された前駆 を含有しており、 本発明に好適に利用できる
(3) _本発明組成物 (3-1 )ェクオ一ル産生乳酸菌含有組成物
本発明ェクオ一ル産生乳酸菌含有組成物は、 述したラクトコッカス 20-92を 初めとして、 基質とするダイゼイン類またはダイゼイン類含有物質に作用してェ クオールを産生する能力を有するラクトコッカス属に属する乳酸菌を、 必須成分 5 として含有する。 該必須成分としての乳酸菌は、 生菌そのものであるのが一般的 であるが、 特にこれに限定されず、 例えばその轻養液、 該培養液から単離された 菌体を含む培養物の粗精製品乃至精製品、 それらの凍結乾燥品などであってもよ い。
上記微生物の培養液は、 例えば代表的には、 該微生物を、 該微生物の培養に適 10 した培埤、 例えば MRS培地などを用いて、 37°Cで 48時間程度培養することによ り得ることができる。 また菌体は上記培養後に、 例えば培養液を 3000回転/分、 4 °C、 10分間遠心分離して集菌することによって得ることができる。 これらは常法 に従い精製することができる。 また、 上記菌体【ま凍結乾燥することもできる。 か くして得られる凍結乾燥菌体も本発明組成物の存効成分として利用することがで 15 きる。
本発明組成物は、 上記有効成分としての微生物 (菌体など）を含んでいればよく、 他に特に必要ではないが、 所望により、 上記有効成分としての微生物の維持（も しくは増殖）に適した栄養成分を含有させることあできる。 該栄養成分の具体例 としては、 前述したように各微生物の培養のための栄養培地、 例えば BHI，EG, >0 BL, GAM培地などを挙げることができる。
その他の栄養成分としては、 例えば乳果オリゴ糖、 大豆オリゴ糖、 ラクチュロ ース、 ラクチトール、 フラクトオリゴ糖、 ガラケトオリゴ糖などの各種オリゴ糖 を例示できる。 これらのオリゴ糖の配合量は、 特に限定されるものではないが、 通常本発明組成物中に 1 -3重量％程度となる量範囲から選ばれるのが好ましい。
5 上記本発明組成物はその摂取によって、 摂取春の体内で所望のェクオール産生 能を発揮する。 一般に日本人はダイゼイン類を含む食品、 代表的には前述した大 豆などの食素材、 それらの加工品、 それらの発酵調製物などを食する習慣があり、 従って、 本発明組成物の摂取によれば、 生体内でェクオールが産生される。
また、 本発明組成物中には、 必要に応じて、 各種ビタミン類、 微量金属元素な どを適宜添加配合することもできる。 該ビタミン類としては、 例えばビタミン B、 ビタミン D、 ビタミン ビタミン E、 ビタミン K (特に納豆菌由来の MK—
7 (menaquinone-7) )などを例示できる。 微量金属元素としては、 例えば亜鉛、 セ レン、 鉄、 マンガンなどを例示できる。
本発明組成物中に配合される微生物の量は、 用いる乳酸菌の種類などに応じて 適宜決定できる。 例えばラクトコッカス 20-92では、 菌数 (生菌数)が 108〜"！ 09個 ZlOOg組成物前後となる量に調製されるのが好適である。 該菌数の測定は、 菌培 養用の寒天培地に希釈した試料を塗布して 37°C下、 好気培養を行い、 生育したコ ロニ一数を計測することにより算出したものである。 上記微生物の配合量は、 上 記量を目安として、 調製される本発明組成物の形態などに応じて適宜変更するこ とができる。
(3-2) ダイゼィン類を含有する本発明組成物
本発明組成物は、 所望により、 前述したダイゼイン類およびダイゼイン類含有 物質からなる群から選ばれる少なくとち 1種を更に含むことができる。 このダイ ゼイン類およびダイゼイン類含有物質の内では、 特に大豆胚軸およびこれを原料 として調製される食品素材が好ましく、 その内でも水溶性もしくは乳化された食 品素材はより好ましい。 他の好ましいタイゼイン類含有物質の例としては、 大豆 粉または豆乳を挙げることができる。
この組成物は、 組成物中に基質を含 ¾ίことに基づいて、 大豆など食素材を食す る習慣のない人々にこれを摂取させる場合でも、 生体内で組成物中の基質を微生 物が資化することによって、 所望のェクオールを産生することができる。
ダイゼィン類および Ζまたはダイゼィン含有物質の組成物中への配合量は、 特 に制限はないが、 通常日本人が一日'当たりに摂取している量である 10-25mg程度 とするのが適当である。
(3-3) ェクオ一ル含有本発明組成物
本発明組成物は、 更にェクオールを含むこともできる。
一般に、 食品の嗜好性は、 食品素材を例えば乳酸発酵させることによって改善 される。 また、 本発明組成物に利用する微生物の代表例であるラクトコッカス
20-92は、 優れたェクオール産生能 (活'性）を有している。 本発明では、 例えば豆 乳などのダイゼィン類含有物質に上言己微生物を作用させて、 豆乳中のダイゼィン 類を資化させてェクオ一ルを産生させてなる豆乳発酵物などのェクオ一ルを含有 する組成物をも提供する。
ここで、 基質としては、 前述した各種のダイゼイン類およびダイゼイン類含有 物質を利用することができる。 これらの内でも、 豆乳、 大豆粉などから調製され る溶液乃至乳化液は好ましい。
ェクオ一ル含有本発明組成物の好ましい一具体例としては、 大豆イソフラボン またはこれを含有する食素材を適当な培地に添加し、 該培地中で本発明微生物、 好ましくはラクトコッカス 20-92を発酵させて得られる発酵産物を挙げることが できる。 ここで、 発酵は、 より詳しくは、 例えば基質を溶液状態にして滅菌した 後、 本発明微生物の生育可能な栄養培地、 例ぇば81"11，£6，8し6 1/1培地など、 も しくは食品として利用可能な牛乳、 豆乳、 野菜ジュースなどに所定量の本発明微 生物を添加して、 37°C下に、 嫌気状態あるいは好気的静置状態で、 48-96時間程 度発酵 (必要に応じて pH調節剤、 還元物質 (例えば酵母エキス、 ビタミン など） を添加できる）させることにより実施できる。 上記において基質量は 0.01 -
0.5mg/mL程度とすることができ、 微生物の接種量は約 1 -5%の範囲から選択する ことができる。
かくして、 ェクオール含有本発明組成物を製造できる。 該組成物は、 上述した 発酵産物そのものの形態で、 食品、 医薬品などとして好適な製品とすることがで きる。 また、 得られる培養物からェクオールを常法に従い単離精製し、 これに更 に必要に応じて適当な他の食素材などを適宜配合して、 適当な食品形態乃至医薬 品形態に調製することもできる。
上記単離精製は、 例えば、 発酵培養物をイオン交換樹脂 (DIAION HP20, 三菱 化成社製）に吸着させた後、 メタノールで溶出させ、 乾固する方法により実施で きる。
本発明組成物中のェクオール量は、 調製される食品形態及び医薬品形態に応じ て決定され、 特に限定されるものではないが、 通常組成物全 100g中にェクオール が 2-5mg程度含有される量の範囲とするのが好ましい。
得られる本発明組成物がェクオ一リレを含むことは、 例えば、 後述する試験例 1 に示す方法により確認することができる。
ェクオール含有本発明組成物は、 その有効成分とするェクオールが天然物であ ることから、 安全性に優れており、 また乳酸菌を用いて調製されたものであるこ とに基づいて、 その製造工程に由来する化学薬品などの混入のおそれもなく、 更 に高収率で且つ低生産コストであり、 しかも食品としての風香味においても優れ たものである利点がある。
(3-4) 食品形態
本発明ェクオ一ル産生乳酸菌含有組成物は、 一般には、 前記特定の乳酸菌を必 須成分として、 適当な可食性担体と共に含む食品形態に調製される。
食品形態の本発明組成物の具体例としては、 飲料形態、 飲料形態以外の乳製品 形態 （発酵乳を含む） 、 固形食品形態、 菌含有マイクロカプセル形態などを挙げ ることができる。 飲料形態の本発明組成物には、 乳酸菌飲料および乳酸菌入り飲 料が包含される。
ここで 「発酵乳」 および 「乳酸菌飲料」 なる用語は、 旧厚生省 「乳及び乳製品 の成分等に関する省令」 第二条 37 「はつ酵乳」 および 38 「乳酸菌飲料」 の定義に 従うものとする。 即ち、 「発酵乳」 とは、 乳または乳製品を乳酸菌または酵母で 発酵させた糊状または液状にしたものをいう。 従って該発酵乳には飲料形態と共 にヨーグルト形態が包含される。 また 「乳酸菌飲料」 とは、 乳または乳製品を乳 酸菌または酵母で発酵させた糊状または液状にしたものを主原料としてこれを水 に薄めた飲料をいう。
乳酸菌入り飲料としては、 発酵野菜飲料、 発酵果実飲料および発酵豆乳飲料な どを例示することができる。 飲料形態以外の乳製品形態には、 カード状形態、 例 えばヨーグルトなどが含まれる。 固形食品形態には、 顆粒、 粉末 (発酵乳凍結乾 燥粉末などを含む)、 錠剤、 発泡製剤、 ガム、 グミ、 プディングなどの形態が含 まれる。
これら各形態への調製は、 常法に従うことができる。 またこれら各形態への調 製に当たって用いられる担体は、 可食性担体のいずれでもよい。 特に、 口当たり のよい味覚改善効果のある担体が好ましい。 該口当たりのよい味覚改善効果のあ る担体の具体例としては、 例えば人工甘味料、 ソルビトール、 キシリトールなど を例示することができる。 他の好ましい担体としては、 マスキング剤、 例えばト レハロース（林原社製)、 サイクロデキストリン、 ベネコート BMI (花王社製) ど を例示することができる。
食品形態の好ましい具体例である乳酸菌入り飲料につき詳述すれば、 これらの 飲料形態への調製は、 微生物の栄養源を含む適当な発酵用原料物質、 例えば野菜 類、 果実類、 豆乳 (大豆乳化液)などの液中で、 微生物を培養して該原料物質を発 酵させることによって行う ことができる。 発酵用原料物質としての野菜類および 果実類には、 各種野菜および果実の切断物、 破砕物、 磨碎物、 搾汁、 酵素処理物、 それらの希釈物および濃縮物が含まれる。 野菜類には、 カポチヤ、 ニンジン、 ト マト、 ピーマン、 セロリ、 ホウレンソゥ、 有色サツマィモ、 コーン、 ビート、 ケ ール、 パセリ、 キャベツ、 ブロッコリ一などが含まれる。 果実類にはリンゴ、 モ モ、 バナナ、 イチゴ、 ブドウ、 スイカ、 オレンジ、 ミカンなどが含まれる。
野菜および果実の切断物、 破砕物および磨砕類は、 例えば上記野菜類まだは果 実類を洗浄後、 必要に応じて熱湯に入れるなどのブランチング処理した後、 クラ ッシヤー、 ミキサー、 フードプロセッサ一、 パルパ一フィッシャー、 マイコロイ ダーなどを用いて切断、 彼砕、 磨砕することによって得ることができる。 汁は、 例えばフィルタープレス、 ジューサーミキサーなどを用いて調製することができ る。 また上記磨砕物を濾布などを用いて濾過することによつても搾汁を調製する ことができる。 酵素処理物は、 上記切断物、 破砕物、 磨碎物、 搾汁などにセルラ ーゼ、 ぺクチナーゼ、 プロ トぺクチン分解酵素などを作用させることによって調 製できる。 希釈物には水で 1 -50倍に希釈したものが含まれる。 濃縮物には、 例え ば凍結濃縮、 減圧濃縮などの手段によって 1 -100倍に濃縮したものが含まれる。 発酵用原料物質の他の具体例である豆乳は、 常法に従い、 大豆原料から調製す ることができる。 該豆乳には、 例えば、 脱皮大豆を水に浸漬後、 コロイドミルな どの適当な粉碎機を用いて湿式粉碎処理後、 常法に従いホモジナイズ処理した均 質化液、 水溶性大豆蛋白質を水中に溶解した溶解液なども包含される。
微生物を利用した発酵は、 発酵用原料物質に本発明微生物を接種して、 置培 養を行うことにより実施でさる。 培地には、 必要に応じて本発明微生物の良好な 生育のための発酵促進物質、 例えばグルコース、 澱粉、 蔗糖、 乳糖、 デキス 卜リ ン、 ソルビトール、 フラグ ト一スなどの炭素源、 酵母エキス、 ペプトンなどの窒 素源、 ビタミン類、 ミネラル類などを加えることができる。
微生物の接種量は、 一般には発酵用原料物質含有液 1cc中に菌体が約 1 X1 06個 以上、 好ましくは 1 X 107ί@前後含まれるものとなる量から選ばれるのが適当であ る。 培養条件は、 一般に、 発酵温度 20-40°C程度、 好ましくは 25-37°C程度、 より 好ましくは 37° (：、 発酵時 8-24時間程度から選ばれる。
安定した発酵を行わせるために、 予めス夕一夕一を用意し、 これを発酵厢原料 物質に接種して発酵させる方法が推奨される。 ここでスターターとしては、 例え ば代表的には予め 90-121°C：、 5-20分間通常の殺菌処理を行った発酵用原料 質、 酵母エキスを添加した 10%脱脂粉乳などに、 本発明菌体を接種して同様の条件で 培養したものを挙げることができる。 このようにして得られるスターター ¾：、 通 常、 本発明微生物を 107-1O9個/ g培養物程度含んでいる。
尚、 上記の如くして得られる乳酸発酵物は、 カード状形態 （ヨーグルト 乃至 プディング用形態） を有している場合があり、 このものはそのまま食品として摂 取することもできる。 該カード状形態の乳酸発酵物は、 これを更に均質化するこ とにより、 所望の飲料形態 （例えば発酵豆乳飲料など） とすることができる。 こ の均質化は、 一般的な乳ィ匕機 (ホモジナイザ一）を用いて実施することがでぎる。 具体的には、 該均質化は、 例えばガウリン (GAULIN)社製高圧ホモジナイ 一
(LAB40)を用いて、 約 20O-1000kgf/cm2、 好ましくは約 300-800kgf/cm2の条件で、 或いは三和機械工業社製おモジナイザー （品番： HAX4571 , H20-A2など） を用 いて、 150kg/cm2またはそれ以上の条件で実施することができる。 この均質化に よって、 優れた食感、 とくに滑らかさを有する飲料製品、 特に発酵豆乳飲料製品 を得ることができる。 尚、 この均質化にあたっては、 必要に応じて適当に希釈し たり、 pH調整のための有機酸類を添加したり、 また、 糖類、 果汁、 増粘剤、 界面 活性剤、 香料などの飲料の製造に通常用いられる各種の添加剤を適宜添加するこ ともできる。 好ましい添加剤とその添加量 (カード状発酵物重量に対する重量％) の一具体例としては、 例えばグルコース 8% (重量％、 以下同じ）、 砂糖 8%、 デキ ストリン 8%、 クェン酸 0.1 %、 グリセリン脂肪酸エステル 0.2%および香料 0.1 % を挙げることができる。 かくして得られる発酵豆乳飲料などの本発明乳酸菌飲料は、 常法^:従い適当な 容器に無菌的に充填して製品とすることができる。 該製品は、 滑らかな喉ごしの 食感および風味を有している。
その投与 (摂取）量は、 これを摂取する生体の年齢、 性別、 体重、 疾患の程度な どに応じて適宜決定され、 特に限定されるものではない。 一般には、 微生物含量 を 108-109個/ mLに調製した飲料製品を、 一日当たり 100-300mL程度服用させれば よい。
食品形態の本発明組成物の他の具体例としては、 発泡製剤形態のそれを挙げる ことができる。 このものは、 本発明微生物 (菌体凍結乾燥物) 0.01 -50% (重量％、 以下同じ）に、 炭酸ナトリウムおよび （または） 炭酸水素ナトリウム 10-35%と中 和剤 20-70%とを発泡成分として配合することによつて調製できる。 ここで用い られる中和剤は、 上記炭酸ナトリゥムおよび炭酸水素ナトリゥムを中和させて炭 酸ガスを発生させ得る酸性化合物である。 該化合物には、 例えば代表的には L-酒 石酸、 クェン酸、 フマル酸、 ァスコルビン酸などの有機酸が包含される。
上記発泡成分の本発明発泡製剤中への配合割合は、 得られる本発明製剤を水に 溶解させた場合に、 溶液が酸性、 特に pH約 3.5-4.6程度の酸性を呈するものとな る割合とするのがよい。 より具体的には上記割合は炭酸ナトリウムおよび （また は） 炭酸水素ナトリウム 10-35%および中和剤 20-70%の範囲から選択されるのが よい。 特に炭酸ナトリウムは 11 -31%、 好ましくは 22-26%、 炭酸水素ナトリウム は 10-35%、 好ましくは 20-30%の範囲から選ばれるのがよい。 その内でも炭酸水 素ナトリウムを単独で 20-25%の範囲で用いるのが最も好ましい。 また中和剤は、 20-70%、 好ましくは 30-40%の範囲から選択され、 特にレ酒石酸を 20-25%および ァスコルビン酸を 8-15%の範囲内で使用するのが最も好ましい。
本発泡製剤は、 本発明微生物および発泡成分を必須成分として、 他に通常知ら れている各種の添加剤成分、 例えば賦形剤、 結合剤、 崩壌剤、 滑沢斉 ί!、 増粘剤、 表面活性剤、 浸透压調節剤、 電解質、 甘味料、 香料、 色素、 pH調節斉 jなどを必要 に応じて適宜添加配合されていてもよい。 上記添加剤としては、 例えば小麦澱粉、 馬鈴薯澱粉、 コーンスターチ、 デキストリンなどの澱粉類；ショ糖、 ブドウ糖、 果糖、 麦芽糖、 キシロース、 乳糖などの糖類；ソルビトール、 マンニトール、 マ ルチ i ^一ル、 キシリ I ルなどの糖アルコール類；カップリングシュガー、 パラ チノ一スなどの糖転位配糖体； リン酸カルシウム、 硫酸カルシウムなどの賦形剤 ；澱粉、 糖類、 ゼラチン、 アラビアガム、 デキストリン、 メチルチセルロース、 ポリビニルピロリドン、 ポリビニルアルコール、 ヒドロキシプロピルセルロース、 キサンタンガム、 ぺクチン、 トラガントガム、 カゼイン、 アルギン酸などの結合 剤乃至増粘剤；ロイシン、 イソロイシン、 レバリン、 シュガーエステル、 硬化油、 ステアリン酸、 ステアリン酸マグネシウム、 タルク、 マクロゴ一リレなどの滑沢剤 ；結晶セルロース（旭化成社製 「アビセル」 ）、 カルボキシメチルセルロース
(CMC) , カルポキシメチルセルロースナトリウム（CMC-Na)、 カルポキシメチル セルロースカリウム（CMC-Ca)などの崩壌剤；ポリオキシエチレンソルビタン脂 肪酸エステル（ポリソリレペート）、 レシチンなどの表面活性剤；ァスパラテーム、 ァリテームなどのジぺプチド；その他ステビア、 サッカリンなどの甘味料などを 例示できる。 これら【ま必須成分との関係や製剤の性質、 製造法などを考慮してそ の適当量を適宜選択して用いることができる。
更に、 本発明発泡製剤中には、 ビタミン類、 特にシァノコパラミンゃァスコル ビン酸（ビタミン C)などの適当量を添加配合することができる。 その配合割合は、 特に限定はないが、 通常ビタミン Cでは 30%までの量、 好ましくは約 5-25%の範 囲から選ばれるのが好ましい。
本発明発泡製剤の製造法は、 基本的には通常のこの種発泡錠剤の製造法と同様 とすることができる。 即ち、 発泡錠剤形態の本発明製剤は、 所定量の各成分を枰 量、 混合し、 直接粉末圧縮法、 乾式または湿式顆粒圧縮法などに從つて調製する ことができる。
かくして得られる本発明製剤は、 これを水中に投入するだけで、 経口投与に適 した飲料形態となり、 これは経口投与される。
その投与 (摂取)量は、 これを適用すべき生体の年齢、 性別、 体重、 疾患の程度 などに応じて適宜決定され、 特に限定されるものではないが、 一般には 1錠約 1.5- 6.0gに調製された本発明発泡錠剤の 1 -2錠を 1回に水 100-300mLに溶かして服用さ せればよい。
本発明組成物における基質としてのダイゼイン類またはダイゼィン類含有物質、 特定乳酸菌および必要に応じて添加配合されるその他の成分の特に好ましい混合 比率は、 本発明組成物 100gに対して、 ダイゼイン類またはダイゼイン類含有物質 が、 ダイゼィン換算で約 10-50mgの範囲、 乳酸菌が 109〜101Q個（生菌数として）お よびオリゴ糖などが約 1-5gの範囲とするのが望ましい。
尚、 上記の通り、 本発明ェクオ一ル産生乳酸菌含有組成物【ま、 微生物 (主に生 菌）を含有させるものであるため、 該組成物の製品化に当たっては、 加熱、 加圧 などの条件の採用はあまり好ましくない。 従って、 本発明組成物を例えばパー、 顆粒、 粉末、 錠剤などの製品形態に調製するに当たっては、 微生物を凍結乾燥菌 体として直接処方するか、 凍結乾燥菌体を適当なコーティング剤で加工して用い るのが好ましい。
だたし、 本発明ェクオール産生乳酸菌含有組成物は、 特に生菌を含有させるこ とを必須とするものではない。 生菌とこれが資化し得るダイゼイン類などとを配 合した本発明組成物が、 所望のェクオールを既に産生している場合には、 該組成 物はこれを常法に従って加熱滅菌処理して、 該組成物中に存在する菌を死滅させ てもよい。 このような加熱滅菌処理の採用によれば、 生菌とこれが資化し得るダ ィゼィン類などとを配合した本発明組成物の場合に、 該組成物中に存在する生菌 が、 該組成物の保存中或いは流通過程で過剰発酵して、 味、 風味などを劣化させ るおそれを回避できる場合もある。
(3-5) 医薬品形態
本発明ェクオ一ル産生乳酸菌含有組成物は、 一般には、 前記特定の乳酸菌を必 須成分として、 これを適当な薬学的に許容される製剤担体と共に含む医薬製剤形 態に調製される。
製剤担体としては、 通常、 この分野で使用されることの知られている充填剤、 増量剤、 結合剤、 付湿剤、 崩壊剤、 表面活性剤、 滑沢剤などの希釈剤あるいは賦 形剤を例示できる。 これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用 される。
医薬製剤の投与単位形態としては、 各種の形態が選択できる。 その代表的なも のとしては能剤、 丸剤、 散剤、 液剤、 懸濁剤、 乳剤、 顆粒剤、 カプセル剤、 座剤 などが挙げられる。 錠剤の形態に成形するに際しては、 上記製剤担体として例えば乳糖、 白糖、 塩 化ナトリウム、 ブドウ糖、 尿素、 デンプン、 炭酸カルシウム、 カオリン、 結晶セ ルロース、 ゲイ酸、 リン酸カリウムなどの賦形剤；水、 エタノール、 プロパノ一 ル、 単シロップ、 ブドウ糖液、 デンプン液、 ゼラチン溶液、 カルポキシメチルセ ルロース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 メチルセリレロース、 ポリビニルピロ リドンなどの結合剤；カルポキシメチルセルロースナトリウム、 カルポキシメチ ルセルロースカルシウム、 低置換度ヒドロキシプロピリレセルロース、 乾燥デンプ ン、 ァフレギン酸ナトリウム、 カンテン末、 ラミナラン末、 炭酸水素ナトリウム、 炭酸カ レシゥムなどの崩壊剤；ポリオキシエチレンゾルビタン脂肪酸エステル類、 ラウリ レ硫酸ナトリウム、 ステアリン酸モノダリセリ ドなどの界面活性剤；白糖、 ステアリン、 カカオバター、 水素添加油などの崩壊抑讳 I』剤；第 4級アンモニゥム 塩基、 ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤；グリセリン、 デンプンなどの 保湿剤；デンプン、 乳糖、 カオリン、 ベントナイト、 コロイド状ゲイ酸などの吸 着剤；精製タルク、 ステアリン酸塩、 ホウ酸末、 ポリエチレングリコールなどの 滑沢剤などを使用できる。
更に鍵剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、 例えば糖衣錠、 ゼラチン被包 錠、 腸溶被錠、 フィルムコーティング錠あるいは二重錠、 多層錠とすることがで さる。
丸剤の形態に成形するに際しては、 製剤担体として例えばブドウ糖、 乳糖、 デ ンプン、 カカオ脂、 硬化植物油、 カオリン、 タルクなどの賦形剤；アラビアゴム 末、 トラガント末、 ゼラチン、 エタノールなどの結合斉 J；ラミナラン、 カンテン などの崩壌剤などを使用できる。
座剤の形態に成形するに際しては、 製剤担体として例えばポリエチレングリコ —ル、 カカオ脂、 高級アルコール、 高級アルコールのエステル類、 ゼラチン、 半 合成グリセライドなどを使用できる。 カプセル剤は常祛に従い通常本発明微生物 を上記で例示した各種の製剤担体と混合して硬質カプセル、 軟質カプセルなどに 充填して調製される。
更に、 本発明製剤中には、 必要に応じて着色剤、 保存剤、 香料、 風味剤、 甘味 剤などや他の医薬品を含有させることもできる。 本発明製剤中に含有されるべき本発明微生物の量は、 特に限定されず広範囲よ り適宜選択される。 通常、 医薬製剤中に約 108-101Q個/ g程度含有されるものとす るのがよい。
上記医薬製剤の投与方法は特に制限がなく、 各種製斉 j形態、 患者の年齢、 性別 その他の条件、 疾患の程度などに応じて決定される。 例えば錠剤、 丸剤、 液剤、 懸濁 、 乳剤、 顆粒剤及びカプセル剤は経口投与され、 坐剤は直腸内投与される。 上記医薬製剤の投与量は、 その用法、 患者の年齢、 1 別その他の条件、 疾患の 程度などにより適宜選択されるが、 通常有効成分である本発明微生物の量が 1日 当り体重 1 kg当り約 0.5-20mg程度とするのがよく、 該製剤は 1日に 1-4回に分けて 投与することができる。
尚、 本発明組成物はその摂取 （投与） によって、 該組成物中の微生物が下部消 化管に生きたまま到達、 あるいは常在菌として定着でき、 かくして所期の効果を 奏し得る。 特に好ましい製剤は、 腸溶性錠剤形態であり、 これによれば胃酸によ る侵襲を受けることなく微生物を腸に到達させることができる。
かくして得られる本発明ェクオール産生乳酸菌含有組成物は、 中高年女性にお ける不定愁訴乃至閉経に伴われる、 例えば骨粗鬆症、 更年期障害などの症状の予 防及び処置に有用である。 かかる、 予防及び処置は、 これを要求される中高年女 性 ίこ、 上記本発明組成物の有効量を投与するか又は摂: ¾させることにより実施さ れる。 該有効量は、 本発明組成物の投与によって、 中 ΐ¾年女性における不定愁訴 乃至閉経に伴われる、 例えば骨粗鬆症、 更年期障害などの症状の予防及び処置が 可會 である限り、 特に限定されるものではないが、 一殿には、 本発明組成物を摂 取したヒトにおける尿中のェクオール排泄量が 5 mole (約 1.2mg) Z日以上とな る量を目安とすることができる。
図面の簡単な説明
図 1は、 試験例 1に示す方法に従い求められた培養時間と生菌数との関連を示す グラフである。
図 2は、 試験例 1に示す方法に従い求められた培養時間とェクオール産生能 （ス コア） との関連を示すグラフである。
図 3は、 試験例 1に示す方法に従い求められた培養時間とェクオ一ル産生量との 関連を示すグラフである。
図 4は、 試験例 2に示す方法に従い求められ fこ培養物中のダイゼィン類およびェ ク才一ルの経時変化を示すグラフである。
図 5は、 試験例 3に示す方法に従い求められ广こ保存期間とェクオ一ル産生能 （ス コア） との関連を示すグラフである。
図 6は、 試験例 1 -3に示す試験から求められた培養時間に伴われるェクオール産 生菌の状態 （増殖性、 ェクオール産生能およびェクオ一ル産生量変化） を示すグ ラフである。
図 7は、 試験例 4に示す方法に従い求められ广こ培養時間と生菌数との関連を示す グラフである。
発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を更に詳しく説明するため本 明ェクオール産生乳酸菌含有組成 物の調製例を実施例として挙げるが、 本発明 ίまこれらに限定されるものではない。 実施例 1
(1 ) 発酵豆乳飲料の調製
下記処方の各成分を秤量混合して、 発酵豆学し飲料形態の本発明組成物を調製し た。
水溶性大豆蛋白の発酵培養物 100mL
ビタミン ·ミネラル 適量
香料
水 、商
全量 150mL
上記水溶性大豆蛋白の発酵培養物は、 水溶 大豆蛋白 13gを水 10OmLに溶解し たものに、 ラクトコッカス 20-92 (FERM BP-1 O036)を 108-109個加えて、 37 で 24-48時間発酵させたものである。 尚、 利用した水溶性大豆蛋白はその 1 g中にダ ィゼィン類をダイゼィン換算量で 1 -2mg程度含んでいる。
(2) 発酵乳の調製
下記処方の各成分を秤量混合して、 発酵乳开$態の本発明組成物を調製した。
ラクトコッカス 20-92発酵乳 100mL ビタミン ·ミネラル 適量
香料 適量
水 適量
全量 150mL
尚、 ラクトコッカス 20-92発酵乳は、 牛乳 1 L (無脂乳固形分 8.5%以上、 乳脂肪 分 3.8%以上）にラクトコッカス 20-92 (FERM BP-10036)を 108-109個を加えて、 37°Cで 24-48時間発酵させたものである。
(3) 発酵豆乳凍結乾燥粉末の調製
ラクトコッカス 20-92 (FERM BP-10036)約 109個を用いて、 豆乳 （大豆固形分 含量 10%、 ダイゼイン含量:ダイゼイン換算量として 10-15mg) 100gを 37°Cで 72- 96時間乳酸発酵させて、 ェクオールを生成させ; fe。 これを凍結乾燥して粉末とし た。 粉末中のェクオール含量は、 HPLC測定の結 0.1 -0.3重量％であった。
上記粉末を用いて、 下記処方の各成分を枰量昆合して、 粉末形態の本発明組成 物 (食品形態および医薬品形態）を調製した。
発酵豆乳凍結乾燥粉末 2.2g
(ェクオール 0.O05g含有)
賦形剤（コーンス夕一チ） 17g
ビタミン ·ミネラル 適量
香料 適量
全量 20g
(4) 粉末の調製
下記処方の各成分を秤量混合して、 粉末形態 (食品形態および医薬品形態)の本 発明組成物を調製した。
ラクトコッカス 20-92凍結乾燥末 4.1 g
賦形剤 (乳糖） 1 -Og
ビタミン ·ミネラル
香料
20g
ラクトコッカス 20-92凍結乾燥粉末は、 ラクトコッカス 20-92 (FERM BP- 10036)を増殖可能な適当な液体培地 (MRS)で培養 (37°C、 24-48時間）した後、 集 菌したものを 10%スキムミルクに懸濁させた後、 凍結乾燥することによって得ら れたものであり、 その菌体含量は 109-1010個ノ gである。
尚、 上記粉末はこれに更に粗精製大豆イソフラボン末 4.1gを配合することによ つてダイゼィン含有粉末とすることもできる。
かくして得られるダイゼイン含有粉末の摂取によれば、 1日当たり約
mole (約 1.2mg)の尿中ェクオ一ル排泄量を観察することができ、 従って、 該排泄 量に見合うェクオールを体内で産生できることが確認される。
(5) 顆粒の調製
下記処方の各成分を抨量混合して、 顆粒形態 (食品形態および医薬品形態）の本 発明組成物を調製した。
粗精製大豆イソフラボン末 4.1 g
ラクトコッカス 20-92凍結乾燥末 1.Og
蔗糖酸エステル 適量
ビタミン 'ミネラル 適量
香料 適量
全量 20α
尚、 ラクトコッカス 20-92凍結乾燥沬としては、 前記（1)と同一のものを用いた。 このものの摂取によれば、 ダイゼィンとェクオール産生菌とを一緒に大腸内に 到達させることができ、 かくして大月 内でェクオールを産生できる。
以下、 本発明ェクオール産生乳酸茵にっき行われた試験例を挙げる。
試験例 1
増殖性とェクオール産生能 (活性)および生成量試験
(1) 試験方法
ラクトコッカス 20-92株 (107-109/g)を BHIブロス（増殖用液体培地 (基礎培 地)） 5mL中で嫌気的条件下、 37°Cで 24時間培養した後、 基礎培地で 102および 104 に希釈して希釈液を調製した。
培養終了後の培養液およびその各^釈液のそれぞれ 0.2mLずつを、 ダイゼィン 含有基礎培地 （BHIブロスにダイゼインを 10 g/mLとなる量で添加したもの） 、 牛乳および豆乳の各 5mLと混合し、 嫌気的条件下、 37°Cで培養した。 培養時間は 10 g/mLダイゼイン含有基礎培地および豆乳では、 8時間、 24時間、 48時間、 72 時間および 96時間とし、 牛乳では 8時間、 24時間および 48時間とした。
培養開始前と各培養終了時点で、 培養液 0.1 mLおよび 0.2mLをサンプリングし、 それぞれ菌数測定およびェクオール産生能 （活性） 測定に供した。 更に、 W fi g/mLダイゼィン含有基礎培地および豆乳 ίこついては、 培養開始前と各培養終了時 点で培養液 0.5mLをサンプリングして、 該液中のェクオール産生量を測定した。 菌数測定は次の通り行った。 即ち、 各サンプル O.l mLを PBS (-) 溶液 (二ッス イネ土製)で希釈して 104、 105、 106および 107 釈液を作成し、 これら各希釈液の
O.l mLを GAM寒天培地に塗布して、 好気的条件下に 37°Cで 24時間培養し、 培地上 に生育してくるコロニー数を計測して菌数とした。
ェクオール産生能 （活性） の測定は次の通り行った。 即ち、 各サンプル 0.2mL をダイゼイン含有基礎培地 5mL (各 3本)と混合し、 96時間、 嫌気的条件下、 37°C で培養し、 培養終了後に各培養液 0.5mLをサンプリングして、 酢酸ェチル 5mLで 2 回抽出後、 抽出液中のダイゼイン、 ジヒドロダイゼイン（中間体）およびェクオ一 ルを HPLCで測定し、 また、 それらの総量カゝらェクオールの占める割合を算出し た。 得られた結果を下記 5段階でスコア化し、 3検体の平均スコアをェクオール産 生能 （活性） の指標とした。
4： 90%以上ェクオール、
3 :ェクオール生成、 ダイゼインが 50%未満に減少 （中間体あり） 、
2：ェクオール生成、 ダイゼイン 50%以上^^残存 （中間体あり） 、
1 ：中間体生成あり、 ェクオール生成なし
0 :中間体およびェクオールの生成なし、 ダイゼインの減少なし。
ェクオール産生量測定は、 次の通り行った。 即ち各サンプル 0.5mLを酢酸ェチ ル 5mLで 2回抽出し、 抽出液中のダイゼイン、 ジヒドロダイゼイン（中間体)およ びェクオールを HPLCで測定した。 各濃度を算出してェクオ一ル産生量とした。
(2) 試験結果
(2-1 ) 菌数 (増殖性）を調べた結果を図 1に示す。
図中、 （1 )はダイゼイン含有基礎培地を^ ϋ用した場合の結果であり、 （2)は豆乳 を利用した場合の結果であり、 （3)は牛乳を利用した場合の結果である。 ^図に おいて横軸は培養時間（hr)を示し、 縦軸は生菌数 (Log cfu/ml)を示す。
各図に示す結果より、 本菌株の増殖性は良好であり、 ダイゼイン含有基礎培地、 豆乳および牛乳のいずれでも接種量の如何に関わらず培養 8時間で定常状態に達 した。 菌数は、 ダイゼイン含有基礎培地で 109·1·9·4個/ mLを維持し、 豆乳でま108-5- 8·7個/ mし 牛乳では 10aD_8'4個/ mLを維持することが判つた。
(2-2) ェクオ一ル産生 （活性） を求めた結果を図 2に示す。
図 2において、 （1 )はダイゼィン含有基礎培地を利用した場合の結果であり、
(2)は豆乳を利用した場合の結果であり、 （3)は牛乳を利用した場合の結果である。 各図において横軸は培養時間 (hr)を示し、 縦軸はスコアを示す。
該図に示される結果から、 ダイゼイン含有基礎培地、 豆乳および牛乳のレ ずれ においてもェクオール産生能 (活性）は経時的に増加する傾向が確認された。 しか も、 牛乳および豆乳を利用した場合でも、 本菌株のェクオール産生能 (活' fe)は維 持されることが確認された。
(2-3) ェクオール産生量測定結果
ダイゼイン含有基礎培地および豆乳 （ダイゼイン換算量として約 SO g/mL) 中 に産生されるェクオール量を測定した結果は、 図 3に示すとおりである。
図 3において（1 )はダイゼィン含有基礎培地を利用した場合の結果であり、 （2) は豆乳を利用した場合の結果である。 各図において横軸は培養時間 (hr)を示し、 縦軸はェクオール濃度（〃g/ml)を示す。
両培地とも、 培養開始後 48時間目以降からェクオール産生を認めた。 豆乳を利 用した場合では、 接種量の変化によるェクオール生成量の違いが観察され、 特に 4.00%接種によつて培養 96時間で 57.0 n g/mLの著量のェクオ一ル生成が認められ た。
豆乳中にはェクオールの基質となるダイゼインが 90%以上配糖体 （グルコース が結合した状態） で存在しているが、 測定したクロマトグラム上には該配糖体の ピークは消失していることから、 本菌株は配糖体を分解し （jS -ダルコシダーゼ活 性） てダイゼインを生成した後、 該ダイゼインをェクオールに代謝するものと考 えられる。 試験例 2
ラクトコッカス 20-92株によるェクオ一ル生成経路
(1)試験方法
ラクトコッカス 20-92株 (107個/ g)を BHIブロス（増殖用液体培地、 基礎培 地) 5mLで嫌気的条仵下、 37°Cで 24時間培養したのち、 培養液 0.2mLをダイゼィ ン含有基礎培地 5mLと混合し、 嫌気的条件下、 37°Cで培養した。 培養降間は 8時 間、 24時間、 30時間、 36時間、 48時間、 51時間、 54時間、 60時間、 84畤間およ び 96時間とした。
培養開始前と各培養終了時点で 0.5mLサンプリングして、 サンプル中 ダイゼ イン、 ジヒドロダイゼイン（中間体)およぴ工クオール濃度を測定した。
(2)結果
得られた結果を図 4に示す。
図 4は、 ダイゼイン （左図） 、 ジヒドロダイゼイン （中央図） および:！:クオ一 ル （右図） のそれぞれの経時的濃度変化を示すものである。 図中、 横軸は培養時 間 (hr)を示し、 縦軸は各物質の濃度（ g/ml)を示す。
図 4に示される結果から、 培養後、 48時間目にダイゼイン濃度が減少し始め、 中間体であるジヒドロダイゼィンが 48-60時間で出現し、 48時間目から ！:クオ一 ルが生成することが確認される。 また、 60時間目でダイゼインからェクオールへ の代謝がほぼ終了することも判る。
ダイゼィンからェクオールへの代謝は中間体としてジヒドロダイゼィンを経由 した形で起こっていることを確認できたが、 ジヒドロダイゼイン生成とこれから ェクオールへの代謝は並行して起こっていることが推察された。
試験例 3
ラクトコッカス 20-92株含有発酵乳の低温安定性
(1)試験方法
ラクトコッカス 20-92株を増殖用液体培地 （基礎培地） 5mLで嫌気的条件下、 37°Cで 24時間培養したのち、 牛乳 1し、 2Lおよび市販のスキムミルク （10%固形 分） 1 こ 4%接種し、 好気的条件下、 37°Cで 48時間静置培養した。 培養後、 4°C に保存した。 牛乳については、 培養終了時および 4°C低温保存後 4週間まで毎週ェクオール産 生能 （活性） を測定した。 さらにその中から 2本だけ 42日目と 51 日目まで保存し て活性を測定した。
スキムミルクについては、 培養終了時および 4 低温保存後 1週目と 34日目に活 性を測定した。
培養開始前と各保存時での活性は、 前述の方法に準じて lO gノ mlダイゼィン含 有基礎培地 5mL、 3本にそれぞれ 4% (0.2mL) 接種し、 96時間嫌気的条件下、 37°Cで培養したのち、 培地中のダイゼイン、 ジヒドロダイゼイン （中間体） およ びェクオール濃度から判断 （スコア化） した。
(2) 結果
結果を図 5に示す。 図 5において横軸は保存期間（日）を示し、 縦軸はスコアを示 す。
図に される結果から、 牛乳については、 1 Lおよび 2Lいずれにおいても培養終 了後 4 低温保存下で 4週間目までェクオール産生能 （活性） が維持されることが 明らかである。 また、 牛乳 2Lでは 4 保存安定性を検討した 51日 目まで活性が維 持されることが確認された。 市販のスキムミルク 1 Lについても、 培養終了後 4°C 低温保存下で検討した 34日目まではェクオール産生能 （活性） 力3維持されること が明らかである。
以上のことから、 ラクトコッカス 20-92株を用いて調製した発酵乳は低温保存 下でも活性を維持できるため、 食品として流通面からも対応可能と考えられる。 上記試験例 1-3で得られた結果から、 ラクトコッカス 20-92株の増殖とェクオ一 ル産生倉 （活性)およびェクオール産生量との関係をまとめると、 図 6に示す通り である。
即ち、 使用する培地によって培養条件は異なるものの、 ェク 一ル産生能 （活 性） は増殖期および定常期のいずれでも維持できる。 一方、 ェグオール産生につ いては定常状態以降ある程度時間が経過してから酵素が発現あるいは活性化して ェクオ一ルを生成するものと考えられる。
試験例 4
ラクトコッカス 20-92株を用いて調製した発酵乳の胃液耐性試験 (1 )試験方法
ラクトコッカス 20-92株を嫌気性菌増殖用液体培地（BHIブロス、 基礎培地) 5mL 中で嫌気的条件下、 37°Cで 24時間培養したのち、 培養物（109個/ g)を牛乳 1 Lに 4% 接種混合し、 好気的条件下、 37°Cで 48時間静置培養した。 培養後、 4°Cに保存し たちのを発酵乳として、 以下の試験に供した。
人工胃液として、 0.045%ペプシンを含有する 50mMダリシン ·塩酸緩衝液
(pH2.5および pH3.0)を調製した。 対照として 50mMダリシン ·塩酸緩衝液
(pH6.0)を調製した。
調製された人工胃液 9mLに、 低温保存していた発酵乳を 1 mL添加し、 混合物を 37°Cの恒温槽で好気的条件下、 静置状態でインキュベーション （培養） した。 培養時間は 1時間、 2時間および 3時間とし、 培養開始前と各培養終了時点でそ れぞれ培養物 0.1 mLおよび 0.2mLをサンプリングし、 各サンプルを菌数測定
(0.1 mLの場合)およびェクオール産生能 （活' [fe) 測定 (0.2mLの場合）に供した。 菌数測定は、 前記試験例 1 - (1)に記載の方法に準じて培養後の培養物をそれぞ れ 0- 1 mL採取し、 二ッスィ社製の PBS (-) 溶液で 104、 105、 106および 107倍に希釈 後、 各希釈液 0.1 mLを GAM寒天培地に塗布して、 好気的条件下 37°Cで 24時間培養 し、 該 GAM寒天培地上に生育したコロニー数を計測することにより求めた。
クオール産生能 （活性） の測定は、 前記試験例 1 - (1 )に記載の方法に準じて、 ダイゼイン含有基礎培地 5mL (3本）に、 サンプリレ 0.2mL (4%) を接種し、 96時間 嫌気的条件下、 37°Cで培養したのち、 培地中のダイゼイン、 ジヒドロダイゼイン ( 間体） およびェクオール濃度から判断 （スコア化） した。
(2)結果
得られた結果を、 図 7の A (生菌数測定結果)および B (ェクオール濃度）に示す。
EI7-Aにおいて、 横軸は培養時間（hr)であり、 縦軸は生菌数（Log cfu/ml in milk) である。
面 7-Bにおいて、 横軸は培養時間 (hr)であり、 縦軸はェクオール活性 (スコア） である。
07-Aおよび 7-Bに示される結果より、 次のことが判る。 即ち、 生菌数は pH6.0 の鑀衝液では、 3時間まで 108個/ mLを維持しており、 この場合、 ェクオール産生 能 （活性） も維持していた。 pH3.0の人；!:胃液中では生菌数は 3時間培養まで維持 でき、 この場合、 活性も維持される。 一方、 ρΗ2.5の人工胃液では培養 2時間目か ら生菌数の顕著な低下が観察され、 活性ち消失する。
一般に市場に出ているプロバイオテイクス （生きて腸内に到達して生理作用を 有する微生物） は、 同様の試験系で検討した場合、 生菌数は ρΗ3.0では変化がな いが、 ρΗ2.5では著しく低下することが報告されている。 したがって、 ρΗ3.0の胃 液耐性があれば、 生きて通過できると考えられるため、 ラクトコッカス 20-92株 を用いて調製した発酵乳は生きて腸内に到達し、 小腸下部あるいは大腸内で活性 を維持できると考えられる。
試験例 5
ラクトコッカス 20-92株の胆汁耐性試験
胆汁耐性試験は、 バイテック GPIカード（日本ピオメリュー株式会社） を用いて、 10%および 40%胆汁中での本菌株の生育性を指標として判定した。
(1)試験方法
ラクトコッカス 20-92株を 5%羊血液加トリプケースソィ寒天培地に塗抹し（108- 9個）、 37°Cで 24時間好気培養した。 培養後の培地上に生育したコロニーを釣菌し て、 0.5%滅菌食塩水を用いて均質な懸濁液を調製した。 これをバイテック GPI力 ードに入れ、 35°Cで 15時間培養後に、 本菌株の胆汁存在下における生育性を色素 (pH指示薬） を用いて判定した。 尚、 胆汁は、 所定量の胆汁粉末を滅菌蒸留水に 溶解後、 カードに注入しておいた。
(2)結果
上記試験の結果、 ラクトコッカス 20-92株は、 10%および 40%胆汁中で生育性 を示した。 このことから、 40%胆汁までの耐性を確認した。
試験例 6
ラクトコッカス 20-92株の溶血性試験
(1)試験方法
ラクトコッカス 20-92株を 5%羊血液加トリプケ一スソィ寒天培地に塗抹し（108- 9個）、 37°Cで 24〜48時間嫌気的条件下 (N2:C02:H2=8:1 :1)で培養した。 培養後の 培地上に生育したコロニーの周囲を観察し、 血液成分の分解 （脱色あるいは変 色） により溶血性を判定しこ。
(2)結果
上記試験の結果、 生育し广こコロニーの周囲で血液成分の脱色 （透明で無 なゾ ーンの出現） は観察されなかったため、 ラクトコッカス 20-92株は ;8溶血性がな く、 この点で安全であると半 U定された。
試験例 7
ラクトコッカス 20-92株の細胞浸潤性酵素活性試験
摂取した乳酸菌が生体内へ侵入する場合としては、 宿主側の要因として賜管膜 の防御機能の低下あるいは膜自体の損傷が考えられる。 細菌側の要因として脂質、 蛋白を結合して、 腸管膜を溝成しているプロテオダリカンを分解する酵素活性
(細胞浸潤性酵素） を有することが挙げられる。
' この試験は、 ラクトコッカス 20-92株が細胞浸潤性酵素としてのコラゲナ一ゼ (ゼラチナーゼ） 、 ヒアルロニダーゼおよびシァリダ一ゼ （ノイラミニダーゼ） 活性を有するか否かを検討するものであり、 以下の通り実施した。
(1 )試験方法
ラクトコッカス 20-92株を血液加寒天培地に塗抹し（塗抹量： 108·9個)、 37°Cで 24〜48時間嫌気的条件下（N2:C02:H2=8:1 :1 )で培養した。
培養後の培地上に生育したコロニーを釣菌し、 滅菌蒸留水に懸濁させて均質な 懸濁液を調製した。 得られた懸濁液について、 ァピケンキ （日本ピオメリュー株 式会社） 同定キットでゼラチンの分解を指標として、 コラゲナーゼ （ゼラチナー ゼ） 活性の有無を判定した。
また、 ラクトコッカス 20-92株がヒアルロニダーゼおよびシァリダーゼ （ノィ ラミニダーゼ） 活性を有するか否かの試験は、 ヒアルロン酸およびシアル酸をそ れぞれ基質とするトリス塩酸緩衝液 (PH7.0)中でラクトコッカス 20-92株をインキ ュベーシヨン (37°C、 好気的条件下でシァリダーゼ活性については 15分間、 ヒア ルロニダ一ゼ活性については 24時間）して、 各基質濃度を低下させるか否かを測 定することにより実施した。
(2)結果
ラクトコッカス 20-92株は、 コラゲナーゼ （ゼラチナ一ゼ） 、 ヒアルロニダ一 ゼおよびシァリダ一ゼ （ノイラミニダ一ゼ） のいずれの活性も示さなかった。
したがって、 本菌株 感染性の 1要因である細胞浸潤性酵素を欠いているため、 感染性の面からも安全性の高い菌であることが確認された。
試験例 8
バンコマイシン耐性試験
細菌の抗生物質に耐 f生獲得 （変異） が近年問題になってきている。 このような 抗生物質に対する耐性を獲得した細菌が感染した患者は、 抗生物質による抗菌効 果が得られないために死亡する場合が往々にして認められる。 特に、 抗生物質パ ンコマイシンに対する耐性菌 （VRE) の出現が、 現在、 医療現場で深刻な問題と なっている。 また、 体內に摂取される微生物がバンコマイシン 生遺伝子を有す る場合、 該微生物が腸內に到達して定着し、 毒性あるいは感染性の菌 （病原菌） に接触すると、 バンコマイシン耐性遺伝子が該病原菌に移り、 かくして、 病原菌 がバンコマイシン耐性を獲得することが懸念される。 このため、 プロバイオティ クスとして利用され得る生菌は、 少なくとも該菌自体がバンコマイシン耐性菌で はないことが必要である。
この試験は、 ラクトコッカス 20-92株のバンコマイシンに対する感受性を検討 したものであり、 以下の通り実施された。
(1)試験方法
バンコマイシンに対する感受性の試験は、 センシ 'ディスク （曰本べクトン ' ディッキンソン株式会社製） を使用して実施した。 即ち、 ラクトコッカス 20-92 株を GAM寒天培地に塗抹し （塗抹量： 108-9個） 、 バンコマイシン 30 gを含有さ せたディスクを培地上【こ置き、 37"Cで 24時間好気培養した。 培養後、 ディスク周 辺に形成された阻止円直径を測定し、 判定表より判定した。
(2)結果
ラクトコッカス 20-92株の阻止円直径は 11.9±0.2mmであり、 判定表より感性 と判定された （10mm以上を感性と判定する） 。 この結果から、 本菌株はバンコ マイシン耐性菌ではなく、 したがって、 この点で安全性の高いことが確認された。 以下、 本発明乳酸菌を利用してダイゼインからのェクオールの製造例を実施例 2として挙げる。 実施例 2
ェクオ一ルの製造
ラクトコッカス 20-92株 (FER BP-10036)の 107〜109個を嫌気性菌培養用の GAM培地に懸濁させた液 1 mlを調製し、 該液を豆乳 1 OOg (固形分濃度約 2.2%)に 加え、 嫌気的に、 37°C下で 72〜96時間培養し、 培養液中に産生するェクオール量 を HPLC法により測定した。 尚、 上記豆乳中のダイゼイン類含量は、 ダイゼイン 換算量として 95 g/mLである。
その結果、 得られた豆乳培養物中には、 ェクオール 10.7±6.3 g/mL(3回の平 均値土標準偏差）の生成が確認された。
このことから、 本発明微生物の利用によれば、 食品素材中のダイゼイン類から ェクオールを効率よく且つ安価に製造できることが明らかである。

Claims

請 求 の 範 囲
1. ダイゼイン配糖体、 ダイゼインおよびジヒドロダイゼインからなる群から選ば れる少なくとも 1種のダイゼィン類を資ィ匕してェクオ一ルを産生する能力を有す るラクトコッカス属に属する乳酸菌を必須成分として含有することを特徴とする ェクオ一ル産生乳酸菌含有組成物。
2. ラクトコッカス属に属する乳酸菌が、 ラクトコッカス ·ガルビエ
(Lactococcus garvieae)である請求項 1に記載の組成物。
3. ラクトコッカス属に属する乳酸菌が、 FERM BP-10036号として寄託されたラ クトコッカス 20-92である請求項 2に記載の組成物。
4. 更に、 ダイゼイン類およびダイゼイン類含有物質からなる群から選ばれる少な くとも 1種を含む請求項 1に記載の組成物。
5. ダイゼィン類含有物質が大豆粉または豆乳である請求項 4に記載の組成物。
6. 飲料または乳製品形態である請求項 4に記載の組成物。
7. 更に、 ェクオ一ルを含む請求項 4に記載の組成物。
8. 豆乳発酵物形態である請求項 7に記載の組成物。
9. ダイゼイン類およびダイゼイン類含有物質からなる群から選ばれる少なくとも
1種に、 ダイゼイン類を資化してェクオールを産生する能力を有するラクトコッ カス属に属する乳酸菌を作用させることを特徴とするェクオールの製造方法。
10. ラクトコッカス属に属する乳酸菌が、 ラクトコッカス ·ガルビエ
(Lactococcus aarvieae)でめる sf求項 9ίこ §3載の方法。
1 1 . ラクトコッカス属に属する季 L酸菌が、 FERM BP-10036号として寄託ざれた ラクトコッカス 20-92である請求項 10に記載の方法。
12. ダイゼイン類含有物質が大豆粉または豆乳である請求項 9に記載の方 fe。
13. FERM BP-10036号として寄託されたラクトコッカス属に属する乳酸菌。
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