TWI637056B - 含有維持雌馬酚（ｅｑｕｏｌ）產生能力之產生雌馬酚之微生物的發酵製品及其製造方法（三） - Google Patents

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Abstract

本發明之目的在於提供一種於活菌狀態下含有產生雌馬酚之微生物的發酵製品，且維持該產生雌馬酚之微生物的雌馬酚產生能力。使用產生雌馬酚之微生物並以大豆粉末或豆乳作為原料製造發酵物時，可藉由下述步驟來製造活菌狀態下含有維持雌馬酚產生能力之微生物的發酵物：(1)使用產生雌馬酚之微生物，在木質素黃酮(daidzein)類存在下，於pH5.0以上且厭氧條件下進行發酵以調製菌元(mother starter)；(2)使用前述菌元，在木質素黃酮類存在下，以pH5.0以上進行發酵，藉以調製大量菌元(bulk starter)；及(3)使用前述大量菌元，在含有大豆粉末或豆乳之培養基中進行發酵以調製發酵物。

Description

含有維持雌馬酚(EQUOL)產生能力之產生雌馬酚之微生物的發酵製品及其製造方法(三) 技術領域
本發明係關於一種於活菌狀態下含有產生雌馬酚之微生物的發酵製品及其製造方法，且維持該產生雌馬酚之微生物的雌馬酚產生能力。本發明更是關於一種組成物，其含有呈活菌狀態之產生雌馬酚之微生物，且即使於保存後亦可安定地維持該微生物之雌馬酚產生能力。
背景技術
大豆中所含異黃酮(大豆異黃酮；木質素黃酮(daidzein)、金雀素黃酮(genistein)、黃豆素黃酮(glycitein))與雌二醇結構類似，隨著與動情素受體(以下記為ER)之結合而具有抗動情素作用及類動情素作用。從迄今之大豆異黃酮之流行病學研究及介入研究的成果，暗示了其抗動情素作用而具有預防乳癌及前列腺癌等激素相關性癌症的效果，且因類動情素作用而具有改善更年期障害、停經後之骨質疏鬆症及高血脂症的效果。
近年來，已指出此等大豆異黃酮之生理作用活性的來源有可能是木質素黃酮之代謝物(雌馬酚)。即，已有報 告指出，雌馬酚與大豆異黃酮相較下，與ER之結合能(特別是與ERβ之結合)更強，朝乳房或前列腺組織等之目標臓器的移動性顯著較高(參照非專利文獻1-4)。此外，於患者對照研究中，已有報告指出，於乳癌、前列腺癌患者中，雌馬酚產生者明顯較少；且，亦有報告指出，若將大豆異黃酮對於停經後之骨密度及脂質代謝的改善效果區分成雌馬酚產生者與非產生者來加以解析，產生雌馬酚者有明顯之改善。
雌馬酚係從木質素黃酮經腸內細菌代謝而產生者，但雌馬酚產生能力有個體差異，報告指出日本人中雌馬酚產生者之比例為約50%。即，日本人中有約50%為無法產生雌馬酚的人(雌馬酚非產生者)，而此種人即使攝取大豆或大豆加工食品，亦無法享受到基於雌馬酚之作用的有用生理效果。因此，為了使雌馬酚非產生者表現出基於雌馬酚之作用的有用生理效果，可以想見，直接攝取活菌狀態之產生雌馬酚之微生物是有效的。
另一方面，產生雌馬酚之微生物已是習知，例如，本案發明者人從人類腸內所離析出之類桿菌E-23-15(FERM BP-6435號)、鏈球菌E-23-17(FERM BP-6436號)、鏈球菌A6G225(FERM BP-6437號)及乳球菌20-92(FERM BP-10036號)(參照專利文獻1及2)。
因此，可以想見的是，若能提供一種於活菌狀態下含有產生雌馬酚之微生物的發酵製品，則可攝取產生雌馬酚之微生物，進而可享受基於產生雌馬酚之微生物的有 用效果。然而，若循一般方法使用產生雌馬酚之微生物來製造發酵製品，該微生物之雌馬酚產生能力將喪失，而有無法製得於活菌狀態下含有產生雌馬酚之微生物之發酵製品的問題點。再者，產生雌馬酚之微生物在低pH條件或嗜氧保存等下，容易喪失雌馬酚產生能力的傾向甚強，因此即使可在維持該微生物之雌馬酚產生能力的狀態下製造發酵製品，亦無法耐得住保存，而有在流通階段中雌馬酚產生能力受損的問題點。
以此種習知技術為背景，現今正殷切期望開發出一種可於活菌狀態下含有維持雌馬酚產生能力之微生物的發酵製品。
先行技術文獻 專利文獻
專利文獻1：國際公開第99/007392號手冊
專利文獻2：國際公開第2005/000042號手冊
非專利文獻
非專利文獻1：Morito K, HiroseT, Kinjo J, Hirakawa T, Okawa M, Nohara T, Ogawa S, Inoue S, Muramatsu M, Masamune Y. Interaction of phytoestrogens with estrogen receptors α and β. Biol Pharm Bull 24(4):351-356, 2001
非專利文獻2：Maubach J, Bracke ME, Heyerick A, Depypere HT, Serreyn RF, Mareel MM, Keukeleire DD. Quantitation of soy-derived phytoestrogens in human breast tissue and biological fluids by high-performance liquid chromatography. J Chromatography B 784:137-144, 2003
非專利文獻3：Morton MS, Chan PSF, Cheng C, Blacklock N, Matos-Ferreira A, Abranches-Monteiro L, Correia R, Lloyd S, Griffiths K. Lignans and isoflavonoids in plasma and prostatic fluid in men : Samples from Portugal, Hong Kong, and the United Kingdom. Prostate 32:122-128, 1997
非專利文獻4：Tammy EH, Paul DM, Paul GF, Robert D, Stephen B, Kenneth J, Ray M, Lorraine GO, Kristiina W, Holly MS, Karen JG. Long-term dietary habits affect soy isoflavone metabolism and accumulation in prostatic fluid in caucasian men. J Nutr 135:1400-1406, 2005
發明概要
因此，本發明之目的在於提供一種發酵製品，其係於活菌狀態下含有維持雌馬酚產生能力之產生雌馬酚之微生物。此外，本發明之另一目的在於提供一種含有產生雌馬酚之微生物的組成物，其係於活菌狀態下含有維持雌馬酚產生能力之產生雌馬酚之微生物，且於保存後亦可安定地維持雌馬酚產生能力。
本案發明人為了解決上述課題而精心研討，結 果，驚奇地發現，於使用產生雌馬酚之微生物的發酵過程中，從調製菌元至正式發酵之各步驟中，因應所使用之原料，對發酵之氣體環境及pH等耗費特別之創意及功夫，藉此可採用可應用在工業規模上之方法，製得於活菌狀態下含有維持雌馬酚產生能力之產生雌馬酚之微生物的發酵物。本案發明人更發現，藉由對於活菌狀態下含有產生雌馬酚之微生物的組成物添加抗壞血酸及/或其衍生物，可安定地維持產生雌馬酚之微生物的雌馬酚產生能力，進而可製得保存安定性優異之含有產生雌馬酚之微生物的組成物。具體來說，本發明人等發現了下述見解。
(i)第1方法之發酵物製造方法
使用產生雌馬酚之微生物，以大豆粉末或豆乳作為原料來製造發酵物時，藉由：(1)使用產生雌馬酚之微生物，於木質素黃酮類存在下，在pH5.0以上且厭氧條件下進行發酵以調製菌元；(2)使用前述菌元，於木質素黃酮類存在下，以pH5.0以上進行發酵，以調製大量菌元；及(3)使用前述大量菌元，在含有大豆粉末或豆乳之培養基中進行發酵以調製發酵物；如此將可製出於活菌狀態下含有維持雌馬酚產生能力之微生物的發酵物。
(ii)第2方法之發酵物製造方法
使用產生雌馬酚之微生物，以乳品為原料製造發酵物時，使菌元在木質素黃酮類存在下，於厭氧條件下發酵來進行調製，更於使用菌元使乳品原料發酵時，於木質素黃酮類存在下，於pH4.6以上之條件下進行，藉此可製造於活 菌狀態下含有維持雌馬酚產生能力之微生物的發酵物。再者，該發酵物中，產生雌馬酚之微生物的雌馬酚產生能力可長期維持，保存安定性亦優異。此外，可使調製菌元至乳品原料發酵所進行之所有發酵均在酵母萃取物存在下實施，藉此可使產生雌馬酚之微生物之雌馬酚產生能力的維持以及保存安定性更為提高。
(iii)含有產生雌馬酚之微生物的組成物
藉由對於活菌狀態下含有產生雌馬酚之微生物的發酵製品添加抗壞血酸及/或其衍生物，而可提供即使經保存後產生雌馬酚之微生物亦不致喪失雌馬酚產生能力之組成物。
本發明係基於該等見解，進一步反覆改良而終至完成者。
亦即，本發明提供下述態樣之發明。
第1項 一種發酵物之製造方法，包含以下步驟：(1)使用產生雌馬酚之微生物，在含有選自於由木質素黃酮配糖體、木質素黃酮及二氫木質素黃酮所構成群組中之至少1種木質素黃酮類的培養基中，於維持pH5.0以上之狀態下進行厭氧發酵以調製菌元(mother starter)；(2)使用前述步驟(1)所得菌元，在含有前述木質素黃酮類之培養基中，於維持pH5.0以上之狀態下進行發酵以調製大量菌元(bulk starter)；及(3)使用前述步驟(2)所獲得之大量菌元，在含有大豆粉末及/或豆乳之培養基中進行發酵以製得發酵物。
第2項 如第1項之製造方法，其中產生雌馬酚之微生物為乳酸菌。
第3項 如第1項之製造方法，其中產生雌馬酚之微生物為格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)。
第4項 一種發酵物之製造方法，包含下述步驟：(I)使用產生雌馬酚之微生物，在含有選自於由木質素黃酮配糖體、木質素黃酮及二氫木質素黃酮所構成群組中之至少1種木質素黃酮類的培養基中進行厭氧發酵以調製菌元；及(II)使用前述步驟(I)所得菌元，在含有前述木質素黃酮類及乳品之培養基中，於維持pH4.6以上之狀態下進行發酵以製得發酵物。
第5項 如第4項之製造方法，其使用大豆胚軸萃取物作為木質素黃酮類。
第6項 如第4項之製造方法，其中前述步驟(I)及(II)所使用之培養基更含有酵母萃取物。
第7項 如第4項之製造方法，其中產生雌馬酚之微生物為乳酸菌。
第8項 如第4項之製造方法，其中產生雌馬酚之微生物為格氏乳球菌。
第9項 一種發酵製品，含有如申請專利範圍第1至3項中任一項之製造方法所製得之發酵物。
第10項 一種發酵製品，含有如申請專利範圍第4至8項中任一項之製造方法所製得之發酵物。
第11項 如第10項之發酵製品，其pH為4.6以上。
第12項 一種含有產生雌馬酚之微生物的組成物，含有：(A)呈活菌狀態之產生雌馬酚之微生物；及，(B)選自於由抗壞血酸、其衍生物以及該等之鹽所構成群組中之至少1種。
第13項 如第12項之組成物，其係以0.05~5重量%之配入比例含有上述(B)成分。
第14項 如第12項之組成物，其pH為5.0以下。
第15項 如第12項之組成物，其含有使用產生雌馬酚之微生物進行發酵而得之發酵物，來作為呈活菌狀態之產生雌馬酚之微生物。
第16項 如第12項之組成物，其係發酵大豆飲料或發酵豆乳。
第17項 如第12項之組成物，其中產生雌馬酚之微生物為乳酸菌。
第18項 如第12項之組成物，其中產生雌馬酚之微生物為格氏乳球菌。
第19項 一種產生雌馬酚之微生物之雌馬酚產生能力的維持方法，係於含有呈活菌狀態之產生雌馬酚之微生物的組成物中，添加選自於由抗壞血酸、其衍生物以及該等之鹽所構成群組中之至少1種。
依據本發明之製造方法，可製造出一種發酵製品，其係於活菌狀態下含有維持雌馬酚產生能力之產生雌馬酚的微生物者，而可實現提供一種全世界所首見、於活 菌狀態下含有產生雌馬酚之微生物的飲食品。此外，本發明之製造方法即使於需大量生產之工業規模下實施，亦可維持產生雌馬酚之微生物的雌馬酚產生能力而進行發酵，於商業上具高實用性而極有用。
若可提供一種於活菌狀態下含有維持雌馬酚產生能力之產生雌馬酚之微生物的飲食品，對於無法雌馬酚之人(雌馬酚非產生者)，可使其獲得雌馬酚產生能力，因此藉由本發明，可使雌馬酚非產生者享受到依據雌馬酚之有效生理活性。
此外，依據本發明之含有產生雌馬酚之微生物的組成物，可使產生雌馬酚之微生物的雌馬酚產生能力長期且安定地維持，具有可充分耐受流通及販賣之保存安定性。特別是在本發明之含有產生雌馬酚之微生物的組成物為發酵大豆飲料或發酵豆乳之形態時，除了含有以木質素黃酮類為始之源自大豆的有用成分以外，亦含有活菌狀態之產生雌馬酚之微生物，而亦有產生雌馬酚之微生物容易在腸內生成雌馬酚的優點。
第1圖：為實施例4中測定各飲料所含格氏乳球菌之活菌數的結果。
第2圖：為實施例4中測定各飲料所含格氏乳球菌之雌馬酚產生能力的結果。
本發明之實施形態
於本發明中，所謂產生雌馬酚之微生物係指：具有將選自於由木質素黃酮配糖體、木質素黃酮及二氫木質素黃酮所構成群組中之至少1種木質素黃酮類予以資化而產生雌馬酚之能力(代謝活性)的微生物。於此，具體來說，木質素黃酮配糖體可列舉如大豆苷(daidzin)、丙二醯大豆苷(malonyl daidzin)及乙醯大豆苷(acetyl daidzin)等。本發明所使用之雌馬酚產生微生物僅需可允許作為食品攝取且具有雌馬酚產生能力即未特別受限。舉例而言，已知下述微生物中存在有具有上述能力之微生物：格氏乳球菌( Lactococcus garvieae)等之隸屬於乳球菌屬的微生物；中間鏈球菌(Streptococcus intermedius)及星狀鏈球菌(Streptococcus constellatus)等之隸屬於鏈球菌屬的微生物；黏液乳桿菌(Lacobacillus mucosae)等之隸屬於乳桿菌屬的微生物；卵形類桿菌(Bacteroides ovatus)等之隸屬於類桿菌屬的微生物；糞腸球菌(Enteroccus faecium)等之隸屬於腸球菌屬的微生物；大芬戈爾德菌(Finegoldia magna)等之隸屬於芬戈爾德菌屬的微生物；隸屬於範永氏球菌屬(Veillonella)之微生物；Adlercreutzia equolifaciens等之隸屬於Adlercreutzia屬之微生物；黏液真桿菌(Eubacterium limosum)等之隸屬於真桿菌屬之微生物；香港埃格特菌(Eggerthella hongkongenis)等之隸屬於埃格特菌屬(Eggerthella)的微生物；青春雙叉乳桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、短雙叉乳桿菌(Bifidobacterium breve)等之隸屬於雙叉乳桿菌屬的微生物；隸屬於斯洛伐克屬(Slackia) 之微生物；隸屬於不動菌屬(Acinetobacter)之微生物等。產生雌馬酚之微生物中，較宜為乳球菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬及雙叉乳桿菌屬等之乳酸菌，且更宜為隸屬於乳球菌屬之乳酸菌，而尤宜為格氏乳球菌。舉例而言，可以有無雌馬酚產生能力作為指標，從人類腸內中離析出產生雌馬酚之微生物。就上述產生雌馬酚之微生物而言，已寄存有本案發明人從人類腸內離析出並經鑑定之菌株，即乳球菌20-92(FERM BP-10036號)、鏈球菌E-23-17(FERM BP-6436號)、鏈球菌A6G225(FERM BP-6437號)及類桿菌E-23-15(FERM BP-6435號)，本發明中可使用該等已寄存菌株。此外，產生雌馬酚之微生物亦可使用黏液真桿菌(ATCC 8486)、Eggerthella sp.(KCC10490)、Adlercreutzia equolifaciens(JCM14793)、香港埃格特菌HKU10(JCM14552)、青春雙叉乳桿菌TM-1(FERM P-20325號)、短雙叉乳桿菌(JCM1273)、斯洛伐克屬菌TM30(FERM AP-20729號)、革蘭氏陽性菌do03(AHU-1763)(FERM AP-20905號)等。即使是該等已寄存菌株中，於本案發明中，可適用乳球菌20-92。
以下，就本發明之發酵物製造方法(第1方法與第2方法)、發酵製品及含有產生雌馬酚之微生物的組成物加以詳述。第1方法係以大豆粉末及/或豆乳作為原料來製造發酵物之方法，第2方法則是以乳品作為原料來製造發酵物之方法。
於本發明說明書中，菌元(mother starter)係指從 保存菌種(stock culture)調製出之種菌(starter)；大量菌元係指使用菌元調製出之種菌(starter)，藉正式發酵以大量生產發酵物時，作為種菌而被使用者。
1. 發酵物之製造方法(第1方法)
本第1方法之發酵物製造方法包含：調製菌元(以下，有時記為「菌元-1」)之步驟(1)；使用菌元-1調製大量菌元(以下，有時記為「大量菌元-1」)之步驟(2)；及，以大豆粉末或豆乳作為原料，使用大量菌元-1調製發酵物之步驟(3)。以下，就本第1方法之發酵物製造方法依步驟別予以詳述。
步驟(1)
於本發明中，首先將產生雌馬酚之微生物置於含有木質素黃酮類之培養基(以下，有時記為「菌元培養基-1」)中，於維持pH5.0以上之狀態下進行厭氧發酵，藉此調製菌元(以下，有時記為「菌元-1」)(步驟(1))。
菌元培養基-1只要是可育成產生雌馬酚之微生物且允許作為食品成分者即不受特別限制，僅需因應最終製造之發酵物種類來適宜設定其組成即可。
使用在菌元培養基-1之木質素黃酮類含有木質素黃酮配糖體、木質素黃酮及二氫木質素黃酮中之1種或2種以上的木質素黃酮類。具體來說，木質素黃酮配糖體可列舉如大豆苷、丙二醯大豆苷及乙醯大豆苷等。於本發明中，前述木質素黃酮類可使用純質木質素黃酮類、木質素黃酮類之粗純化物及含有木質素黃酮類之物質中的任一者。含有木質素黃酮類之物質可列舉如大豆、豆乳、大豆 胚軸、葛藤、葛根、Red Grove、苜蓿及該等之萃取物(水、含水醇類等之極性溶劑萃取物)等。從安定地維持產生雌馬酚之微生物的雌馬酚產生能力的觀點來看，使用於本發明之木質素黃酮類宜為大豆、豆乳、大豆胚軸或其萃取物，且尤宜為大豆。
於此，木質素黃酮類使用大豆時，可列舉如經粉末化之大豆，且更宜為經蒸煮或煮沸後予以粉末化之大豆，尤宜為在65~105℃下經蒸煮或煮沸30秒~30分鐘後予以粉末化之大豆。此外，經粉末化之大豆的平均粒徑並未特別受限，但一般而言，從使所製造之發酵物具有良好食感的觀點來看，宜令中徑(median size)為約50μm程度以下。此外，宜令粒徑150μm以上之粒子佔10%以下。此外，上述粒徑可用雷射解析/散射式粒度分布測定裝置測定。
就菌元培養基-1中之木質素黃酮類含有物的配入比例而言，舉例來說，可列舉如下述比例：木質素黃酮類總量佔0.002~0.04重量%，且宜佔0.004~0.02重量%，更宜佔0.008~0.012重量%。更具體而言，使用大豆粉末作為木質素黃酮類時，可列舉如下述比例：於菌元培養基-1中，將大豆粉末換算成乾燥重量，計3~28重量%，且宜5~28重量%，而更宜7~17重量%。此外，若使用大豆胚軸萃取物作為木質素黃酮類時，可列舉如下述比例：於菌元培養基-1中，將大豆胚軸萃取物換算成乾燥重量，計0.005~0.1重量%，且宜0.01~0.05重量%，更宜0.02~0.03重量%。藉由以此等配入比例含有木質素黃酮類，可於無損雌馬酚產生能力 之情況下，使產生雌馬酚之微生物增殖而製得菌元-1。
此外，為了促進產生雌馬酚之微生物育成，菌元培養基-1中亦可含有精胺酸等之胺基酸、抗壞血酸等之維生素類及焦磷酸鐵等之微量金屬。於菌元培養基-1中，為了使產生雌馬酚之微生物育成良好而適宜添加精胺酸，舉例來說，菌元培養基-1中之精胺酸配入比例可例示如0.01~1重量%，且宜為0.05~0.3重量%。
此外，菌元培養基-1中，除了上述成分以外，亦可依需要而添加氮源及碳源等之營養素。
菌元培養基-1將會影響發酵物之風味，因此宜例示如不對發酵物之風味造成不良影響之培養基。
藉由混合預定量之添加成分並依需要使其乳化後進行殺菌處理，可調製出菌元培養基-1。
於本步驟(1)中，產生雌馬酚之微生物的厭氧發酵可藉使用充氣包裝或厭氧罐之習用公知方法來實施。
此外，於本步驟(1)中，厭氧發酵係於使pH維持5.0以上(宜5.5~8.0，更宜6.0~8.0)的狀態下進行。藉由如此維持pH，可於無損雌馬酚產生能力之狀態下，使產生雌馬酚之微生物增殖進而調製出菌元-1，於藉由本第1方法之製造方法而最終獲得的發酵物中，可安定地維持該微生物之雌馬酚產生能力。此種厭氧發酵中之pH控制可以習知方法實施。舉例來說，於所使用之培養基中，若將欲藉產生雌馬酚之微生物予以資化之糖質(例如葡萄糖等)之配入比例設定在0.5重量%以下(宜0.4重量%以下，更宜0.3重量%以 下)，則即使進行發酵pH亦不會降低，因此可將厭氧發酵中之pH維持在上述範圍內。此外，厭氧發酵中之pH控制亦可藉適當添加pH調整劑來進行。
將雌馬酚產生微生物之種菌接種至菌元培養基-1，並於該微生物可生育之溫度領域(宜為該微生物之最適溫度領域)下使其厭氧發酵20~96小時(宜72~96小時)，即可實施本步驟(1)中之厭氧發酵。更具體來說，使用乳酸菌作為產生雌馬酚之微生物時，舉例而言，僅需於35~39℃下進行72~96小時之厭氧發酵即可。
如此製得之菌元-1所含產生雌馬酚之微生物係處於可增殖且維持雌馬酚產生能力之狀態下。
如此製得之菌元除了直接供予後續步驟(2)之外，亦可依需要而將該菌元作為種菌使用，並於與上述者相同條件下進一步製作菌元而用於後續生產。使用製出之菌元並於與上述者相同之條件下再次調製菌元的步驟可反覆實施1次或多數次(例如1~10次左右)。即使如上述般反覆實施發酵，只要滿足上述條件，即可使菌元-1於維持雌馬酚產生能力的狀態下含有產生雌馬酚之微生物。
步驟(2)
接著，使用前述步驟(1)所得菌元-1，在前述含有木質素黃酮類之培養基(以下，有時記為「大量菌元培養基-1」)中，於維持pH5.0以上之狀態下進行發酵，藉此調製出大量菌元-1(以下有時記為「大量菌元-1」)(步驟(2))。
大量菌元培養基-1只要在含有前述木質素黃酮 類、可育成產生雌馬酚之微生物且允許作為食品成分的限度下，即不受特別限制，依發酵物之種類加以適當設定即可。
大量菌元培養基-1係藉由含有木質素黃酮類而可在維持雌馬酚產生能力的狀態下使產生雌馬酚之微生物增殖。配入在大量菌元培養基-1之前述木質素黃酮類之種類及配入比例則與後述之正式發酵用培養基-1相同。
此外，於大量菌元培養基-1中，前述木質素黃酮類以外可配入之添加成分的種類及配入比例與上述菌元培養基-1相同。又，大量菌元培養基-1將會影響發酵物之風味，可例示如不對發酵物之風味造成不良影響之培養基，更宜為與上述菌元培養基-1相同組成者。
將預定量之配入成分混合，並依需要使其乳化後，進行殺菌處理，可藉此調製出大量菌元培養基-1。
於本步驟(2)中，厭氧發酵係於使pH維持在5.0以上(宜5.5~8.0，更宜6.0~8.0)之狀態下進行。藉由如此維持pH，可於不損及雌馬酚產生能力之狀態下使產生雌馬酚之微生物增殖而調製出大量菌元-1，於本第1方法之製造方法最終製得之發酵物中，可安定地維持該微生物之雌馬酚產生能力。此種發酵中之pH控制可採與前述步驟(1)相同之方法進行。
此外，於本步驟(2)中，發酵無論是於嗜氧或厭氧之氣體環境下進行均可，但從減低製造成本及操作簡便性等觀點來看，宜於嗜氧之氣體環境下進行。雖然產生雌 馬酚之微生物在嗜氧之氣體環境下容易喪失雌馬酚產生能力，但藉由將培養中之pH條件控制在特定範圍內，即使是在嗜氧氣體環境亦可維持雌馬酚產生能力。
舉例來說，於大量菌元培養基-1中，添加0.5~10容量%程度(宜1~5容量%程度)上述步驟(1)所得菌元-1，並於該微生物可生育之溫度領域(宜該微生物之最適溫度領域)下使其發酵10~28小時(宜14~24小時)，即可實施本步驟(2)中之發酵。更具體來說，使用乳酸菌作為產生雌馬酚之微生物時，舉例而言，於35~39℃下發酵14~24小時即可。
如此製得之大量菌元-1係在可增殖且維持雌馬酚產生能力之狀態下含有產生雌馬酚之微生物。
大量菌元-1可直接供予後續步驟(3)，但亦可依需要，將大量菌元-1作為種菌(starter)(1次大量菌元)使用，再次實施本步驟(2)製作2次大量菌元，將該2次大量菌元供予後續步驟(3)。
步驟(3)
接著，使用前述步驟(2)所得大量菌元-1，於含有大豆粉末及/或豆乳之培養基(以下，有時記為「正式發酵用培養基-1」)中進行發酵以調製發酵物(步驟(3))。
正式發酵用培養基-1只要在含有大豆粉末及豆乳中之至少一者、可育成產生雌馬酚之微生物且允許作為食品成分的限度下，即不受特別限制。
作為正式發酵用培養基-1使用之含有大豆粉末的培養基可具體列舉如含有大豆粉末之水溶液。正式發酵 用培養基-1中所使用之大豆粉末從使風味及食感良好且更抑制大豆味之觀點來看，宜使用業已施加蒸煮或煮沸之加熱處理的大豆粉末。具體來說，前述業已施行加熱處理之大豆粉末可例示如：使已於65~105℃下蒸煮或煮沸30秒~30分鐘之大豆經粉末化者。大豆粉末之平均粒徑並未特別受限，但一般而言，從使製造之發酵物具有良好食感之觀點來看，宜令中徑在約50μm程度以下。再者，宜使粒徑150μm以上之粒子在10%以下。此外，上述粒徑係使用雷射解析/散射式粒度分布測定裝置來測定。正式發酵用培養基-1使用含大豆粉末之水溶液時，宜於水中添加大豆粉末並事先使用均質機等供予均質化處理。藉由進行此種均質化處理，可賦予所製造之發酵物優異之食感(特別是滑順度)。此外，正式發酵培養基-1使用含大豆粉末之水溶液時，該水溶液中大豆粉末之配入比例並未特別受限，但舉例來說，大豆粉末換算為乾燥重量可例示如3~28重量%，且宜為5~28重量%，更宜為7~17重量%。
正式發酵用培養基-1使用含豆乳之培養基時，可將豆乳直接用作正式發酵用培養基-1。豆乳之製造方法於所屬技術領域中為習用公知。具體來說，將已去皮之原料大豆磨碎，於其中加入水並進行濕式粉碎，藉此製作懸濁液(生漿；豆汁)，將該懸濁液依需要加熱處理後，以固液分離處理去除固體成分(豆渣)即可製得豆乳。
此外，正式發酵用培養基-1亦可於前述組成中進一步含有其他添加成分。正式發酵用培養基-1之組成會對 所製造之發酵物的風味及食感造成影響，因此，欲配入之其他添加成分可因應製造目的之發酵物種類來適當決定。舉例而言，正式發酵用培養基-1所配入之添加成分可列舉如蔗糖、蔗糖素及甜菊等之甜味劑；咖啡萃取物及紅茶萃取物等之風味劑；香料；果汁、水果片、蔬菜汁及蔬菜片等之源自植物的成分；葡萄糖酸等之酸味劑；鈉、鉀、鈣、鋅及鐵等之金屬；抗壞血酸等之維生素類等。本步驟(3)中之發酵不需控制pH之降低，因此將被產生雌馬酚之微生物資化之糖類(蔗糖、葡萄糖等)等所含之甜味劑及源自植物之成分亦可包含在正式發酵用培養基-1中。
將預定量之成分混合，並依需要使其乳化後，進行殺菌處理以調製正式發酵用培養基-1。
舉例來說，本步驟(3)中之發酵可於正式發酵用培養基-1中添加0.5~10容量%程度(宜1~5容量%程度)之上述步驟(2)所得大量菌元-1，並於該微生物可生育之溫度領域(宜為該微生物之最適溫度領域)下攪拌或靜置10~28小時(宜14~24小時)即可。更具體來說，產生雌馬酚之微生物使用乳酸菌時，於35~39℃下發酵14~24小時即可。
本步驟(3)中之正式發酵可於嗜氧或厭氧之氣體環境下進行，但從減低製造成本及操作簡便性等觀點來看，宜於嗜氧氣體環境下進行。
此外，本步驟(3)之發酵中，發酵中之pH毋須特別控制。通常隨著本步驟(3)之發酵進行，發酵物中之pH會有降低至5.0程度以下之傾向。
一般而言，在嗜氧氣體環境及pH5.0程度以下之條件下，產生雌馬酚之微生物喪失雌馬酚產生能力之傾向會增強，但依據本第1方法之製造方法，使用經上述步驟(1)及(2)而調製出之大量菌元-1來進行最終段階之發酵，藉此可製得於活菌狀態下含有維持雌馬酚產生能力之雌馬酚產生微生物的發酵物。
正式發酵用培養基-1使用含大豆粉末之培養基時，就最終發酵物而言，可獲得用作飲食品之發酵大豆。此外，正式發酵用培養基-1使用含豆乳之培養基時，就最終發酵物而言，可獲得用作飲食品之發酵豆乳。本第1方法之製造方法適宜用於製造發酵大豆飲食品，即，適宜用於製造使含大豆粉末之培養基發酵的發酵物。
如此製得之發酵物係以活菌狀態含有維持雌馬酚產生能力之產生雌馬酚之微生物。
2.發酵物之製造方法(第2方法)
本第2方法之發酵物製造方法包含調製菌元(以下，有時記為「菌元-2」)之步驟(I)及使用菌元-2並以乳品為原料進行發酵之步驟(II)。以下，依步驟別來詳述本發明之製造方法。
步驟(I)
於本發明中，先將產生雌馬酚之微生物置於含有木質素黃酮類之培養基(以下，記為「菌元培養基-2」)中進行厭氧發酵，藉此調製出菌元(步驟(I))。
菌元培養基-2在含有木質素黃酮類、可育成產生 雌馬酚之微生物並允許作為食品成分之限度下，其組成不受特別限制，僅需因應發酵物種類來適宜設定即可。
菌元培養基-2所使用之木質素黃酮類與上述第1方法之菌元培養基-1所使用者相同，但於本第2方法之製造方法中，從使產生雌馬酚之微生物維持安定的雌馬酚產生能力之觀點來看，宜為大豆胚軸或其萃取物，且尤宜為大豆胚軸之萃取物。
菌元培養基-2所配入之前述木質素黃酮類的配入比例與上述第1方法所使用之菌元培養基-1相同。
此外，菌元培養基-2除了前述成分以外更可含有其他添加成分。菌元培養基-2中可配入之其他添加成分的種類及配入比例與上述第1方法所使用之菌元培養基-1相同。
菌元培養基-2中，尤宜含有酵母萃取物、酵母水解物等源自酵母之成分、乳清水解物、酪蛋白水解物等之發酵促進劑。本第2方法之製造方法中，源自酵母之成分(特別是酵母萃取物)可有效發揮使產生雌馬酚之微生物安定維持雌馬酚產生能力的作用。於菌元培養基-2添加酵母萃取物時，其配入比例通常為0.0125重量%以上，且宜為0.05~1重量%，更宜為0.1~0.2重量%。酵母萃取物之濃度滿足上述範圍時，於最終製造之發酵物中，亦可長期安定地維持產生雌馬酚之微生物的雌馬酚產生能力。
菌元培養基-2將會對最終所製造之發酵物風味造成影響，因此，可列舉如不會對發酵物之風味造成不良 影響之培養基，舉例來說，可例示如除上述成分之外更含有乳品及依需要而定之含乳脂肪成分的培養基。菌元培養基-2所配入之乳品及含乳脂肪成分的種類及配入比例與後述之發酵用培養基-2相同。菌元培養基-2之較佳例可例示如與步驟(II)所使用之正式發酵用培養基-2相同組成者。
藉由混合預定量之添加成分並依需要使其乳化後進行殺菌處理，可調製出菌元培養基-2。
於本步驟(1)中，產生雌馬酚之微生物的厭氧發酵可藉使用充氣包裝或厭氧罐之習用公知方法來實施。
此外，於本步驟(I)中，厭氧發酵中之pH宜維持4.6以上，且更宜為5.0~7.0，尤宜為5.5~6.5。藉由如此維持pH，可增強本發明之效果，即，於不損及雌馬酚產生能力的前提下使產生雌馬酚之微生物增殖，且製造後亦可安定維持該微生物之雌馬酚產生能力。此種厭氧發酵中之pH控制可藉與上述第1方法之步驟(1)相同的方法進行。
將產生雌馬酚之微生物的種菌接種至菌元培養基-2，於該微生物可生育之溫度領域(宜為該微生物之最適溫度領域)下使其厭氧發酵20~28小時(宜22~26小時)，藉此實施本步驟(I)中之厭氧發酵。更具體來說，產生雌馬酚之微生物使用乳酸菌時，舉例來說，僅需於35~39℃下進行22~26小時之厭氧發酵即可。
如此製得之菌元-2所含產生雌馬酚之微生物係處於可增殖且維持雌馬酚產生能力之狀態下。
步驟(II)
接著，使用前述步驟(I)所得菌元-2，使含有前述木質素黃酮類之培養基(以下記為「正式發酵用培養基-2」)於維持pH4.6以上之狀態下發酵(以下，有時記為「正式發酵」)(步驟(II))。
於本步驟(II)中，亦可將上述步驟(I)所得菌元-2添加至正式發酵用培養基-2來進行正式發酵，但大量生產發酵乳製品時，亦可使用該菌元-2進一步調製大量菌元(以下，有時記為「大量菌元-2」)，將大量菌元-2添加於正式發酵用培養基來進行正式發酵。
調製大量菌元-2所使用之培養基(以下記為「大量菌元培養基-2」)可使用含有前述木質素黃酮類者。如此，藉由配入木質素黃酮類，可在產生雌馬酚之微生物維持雌馬酚產生能力之狀態下使其增殖。大量菌元培養基-2所配入之前述木質素黃酮類的種類及配入比例則與上述菌元培養基-2相同。
此外，大量菌元培養基-2在含有前述木質素黃酮類、可育成產生雌馬酚之微生物且允許作為食品成分的限度下，並未特別受限，因應發酵物種類來加以適當設定即可。大量菌元培養基-2中，前述木質素黃酮類以外，可配入之添加成分的種類及配入比例則與上述菌元培養基-2相同。另，為了使產生雌馬酚之微生物的雌馬酚產生能力安定維持，大量菌元培養基-2亦宜含有源自酵母之成分(特別是酵母萃取物)。此外，大量菌元培養基-2將對發酵物之風味造成影響，故而宜含乳品以及依需要而定之含乳脂肪成 分。
大量菌元培養基-2宜例示如不會對發酵物之風味造成不良影響之培養基，且與正式發酵用培養基-2相同組成者更佳。
藉由混合預定量之添加成分並依需要使其乳化後進行殺菌處理，可調製出大量菌元培養基-2。
調製大量菌元-2時，舉例而言，於大量菌元培養基-2添加1~10容量%程度(宜1~5容量%程度)之上述步驟(I)所得菌元-2，並於該微生物可生育之溫度領域(宜該微生物之最適溫度領域)下使其發酵20~28小時(宜22~26小時)即可。更具體來說，產生雌馬酚之微生物使用乳酸菌時，舉例而言，於35~39℃下發酵22~26小時即可。
於調製大量菌元-2之過程中，發酵可於嗜氧或厭氧之氣體環境下進行，但從減低製造成本及操作簡便性等觀點來看，宜於嗜氧氣體環境下進行。
此外，大量菌元-2之調製過程中，發酵中之pH並未受特別限制，但舉例來說，宜維持pH4.6以上，且較宜為5.0~7.0，而更宜為5.5~6.5。藉由如此維持pH，可於不損及雌馬酚產生能力的前提下使產生雌馬酚之微生物增殖。此種發酵中之pH控制可以與前述步驟(I)相同之方法進行。
大量菌元-2可直接供予後續之正式發酵，亦可依需要而將大量菌元-2用作種菌(1次大量菌元)，再次於與調製大量菌元-2相同之條件下實施發酵而作成2次大量菌元，並將該2次大量菌元供予後續之正式發酵。
本步驟(II)所使用之正式發酵用培養基-2在含有前述木質素黃酮類及乳品、產生雌馬酚之微生物可成育且作為食品成分可被接受的限度下，不受特別限制。
正式發酵用培養基-2所使用之木質素黃酮類與上述第1方法之菌元用培養基-1所使用者相同，但於本第2方法之製造方法中，從使產生雌馬酚之微生物安定地維持雌馬酚產生能力的觀點來看，宜為大豆胚軸或其萃取物，特別是宜為大豆胚軸萃取物。
正式發酵用培養基-2所配入之前述木質素黃酮類的配入比例與上述菌元培養基-2相同。
此外，正式發酵用培養基-2所使用之乳品僅需是作為食品可被接受之乳品即可，舉例來說，可列舉如牛乳、山羊乳、羊乳等之獸乳；脫脂乳；溶有脫脂奶粉或全脂奶粉之還原乳等。
此外，於正式發酵用培養基-2中，為了使所製造之發酵物風味提高，正式發酵用培養基-2亦可含有生奶油或奶油等之含乳脂肪成分。該等含乳脂肪成分之配入比例換算為乳脂肪量通常為0.1~4.5重量%，且宜為0.5~4.2重量%，更宜為1.0~3.5重量%。
此外，於正式發酵用培養基-2中，除上述成分以外，可配入之添加成分的種類及配入比例則與上述菌元培養基-2相同。另，為了使產生雌馬酚之微生物安定地維持雌馬酚產生能力，正式發酵用培養基-2亦宜含有源自酵母之成分，特別是酵母萃取物。
分別將乳品、前述木質素黃酮類及依需要而定之其他添加成分混合預定量，依需要使其乳化後，進行殺菌處理，藉此調製出正式發酵用培養基-2。
舉例來說，本步驟(II)中之正式發酵係於正式發酵用培養基-2中添加1~10容量%程度(宜1~5容量%程度)之上述步驟(I)所得菌元-2或上述大量菌元-2，並於該微生物可生育之溫度領域(宜為該微生物之最適溫度領域)下攪拌或靜置20~28小時(宜22~26小時)即可。更具體來說，產生雌馬酚之微生物使用乳酸菌時，於35~39℃下發酵22~26小時即可。
本步驟(II)中之正式發酵於嗜氧及厭氧中之任一氣體環境下進行皆可，但從減低製造成本及操作簡便性等觀點來看，宜於嗜氧氣體環境下進行。
又，於本步驟(II)中之正式發酵中，發酵中之pH維持在4.6以上，且宜為5.0~7.0，更宜為5.5~6.5。藉由如此維持pH，可不損及雌馬酚產生能力而使產生雌馬酚之微生物增殖，且製造後亦可安定地維持該微生物之雌馬酚產生能力。此種發酵中之pH控制可與前述步驟(I)相同之方法進行。
本第2方法之製造方法中，可製造發酵乳作為發酵物。該發酵物中所含產生雌馬酚之微生物不會喪失雌馬酚產生能力且呈活菌狀態。
3.發酵製品
本發明更提供一種含有上述第1方法及第2方法所獲得 之發酵物的發酵製品。即，上述第1方法及第2方法所得發酵物可直接作為發酵製品提供，或是依需要配入下述添加成分而作為發酵製品提供：蔗糖、蔗糖素及甜菊等之甜味劑；咖啡萃取物及紅茶萃取物等之風味劑；香料；大豆粉末、大豆片、果汁、水果片、蔬菜汁及蔬菜片等之源自植物成分；鈉、鉀、鈣、鋅、鐵等之金屬；抗壞血酸等之維生素；凝膠化劑；葡萄糖酸等之安定化劑；水等之稀釋劑等。總之，上述第1方法所得發酵物適合作為與含大豆粉末之水溶液混合而成之發酵製品來提供。
本發酵製品中，上述第1方法及第2方法所得發酵物之配入比例並未特別受限，但舉例來說，可例示如5~100重量%，且宜為10~100重量%。
本發酵製品之pH並未特別受限。舉例來說，較重視長期且安定地維持發酵製品中之產生雌馬酚之微生物的雌馬酚產生能力時，pH宜調整為4.6以上(較宜5.0~7.0、更宜5.5~6.5)。另一方面，於中性區域中，由於擔憂雜菌繁殖而較重視抑制雜菌繁殖時，宜將pH調整至5.0以下(宜為4.0~4.8，更宜為4.2~4.6)。
本發酵製品之形態係依製造時所使用之正式發酵培養基的種類、上述第1方法或第2方法所得發酵物之種類以及配入至發酵物之添加成分種類等而定，可為液態、半固態、固態及膠狀中任一者。本發酵製品之形態的較佳例可例示如發酵大豆飲食品、發酵豆乳飲食品及發酵乳等。於此，發酵乳包含乳果(yogurt)(硬型、軟型、飲料型) 及乳酸菌飲料等。
本發酵製品係以活菌狀態含有產生雌馬酚之微生物，因此，宜於低溫下流通及販賣。
本發酵製品因所含產生雌馬酚之微生物係以維持有雌馬酚產生能力的狀態下呈活菌，而可表現出基於該微生物之各種生理活性及藥理活性。因此，除了一般之飲食品之外，本發酵製品可用作特定保健用飲食品、營養輔助飲食品、機能性飲食品及病患用飲食品等。
舉例來說，本發酵製品經攝取後可在腸內藉由產生雌馬酚之微生物的作用而生成雌馬酚，進而可有效享受基於雌馬酚之生理活性，因此，舉例來說，在預防甚至改善更年期障礙、骨質疏鬆症、前列腺肥大及代謝症候群等疾病或症狀、減低血中膽固醇值、美白、改善面皰、整腸、改善肥胖以及利尿等之用途上甚為有用。其中，本發酵製品特別是在預防甚至改善中高年女性之不明原因不適感或伴隨停經而起之症狀(如骨質疏鬆症、更年期障礙等)上甚有用。
本發酵乳製品之每日攝取量依本發酵乳製品中之產生雌馬酚之微生物的菌數、攝取者之年齡及體重、攝取次數等而不同，但舉例來說，作為成人之每日攝取量，可列舉如相當於本發酵製品10~500g之量。
4.含有產生雌馬酚之微生物的組成物
於活菌狀態下含有產生雌馬酚之微生物的組成物中，可藉由添加選自於由抗壞血酸、其衍生物以及其等之鹽所 構成群組中的至少1種，即使在低pH條件或嗜氧保存條件下，亦可安定地維持產生雌馬酚之微生物的雌馬酚產生能力，且即使長期保存亦可抑制該組成物中產生雌馬酚之微生物喪失雌馬酚產生能力。於此，本發明更提供一種含有產生雌馬酚之微生物的組成物(以下，有時僅記為「本組成物」)，其含有活菌狀態之產生雌馬酚之微生物(以下，有時僅記為「(A)成分」)以及選自於由抗壞血酸、其衍生物以及該等之鹽所構成群組中之至少1種(以下，有時僅記為「(B)成分」)。
於本組成物中，作為產生雌馬酚之微生物，可使用經離析或粗純化之產生雌馬酚之微生物的活菌，亦可使用利用產生雌馬酚之微生物並使其發酵的發酵物。
本組成物所含產生雌馬酚之微生物的濃度並未受到特別限制，但舉個例來說，可例示如1×105~1010CFU/g，且較宜為1×106~1010CFU/g，更宜為1×107~1010CFU/g。
本組成物中，為了使產生雌馬酚之微生物的雌馬酚產生能力安定地維持而配入(B)成分。(B)成分之中，就抗壞血酸之衍生物而言，其係藉由酯鍵結或醚鍵結而使取代基對抗壞血酸結合，只要是作為食品成分可被接受者即可，並未特別受限，但具體例可例示如抗壞血酸2，6-二棕櫚酸酯、抗壞血酸6-硬脂酸酯、抗壞血酸2-磷酸、抗壞血酸2-硫酸、抗壞血酸2-葡萄糖苷、抗壞血酸葡萄糖胺、抗壞血酸6-棕櫚酸酯、四異軟酯酸L-抗壞血酸、四2-十六烷酸抗壞 血酸等。此外，抗壞血酸及其衍生物之鹽僅需是作為食品成分可被接受者即無特別限制，但可例示如鈉等鹼金屬鹽。即使在(B)成分之中，較適宜者仍可例示如抗壞血酸及其鹽。於本組成物中，(B)成分可單獨使用1種，亦可組合2種以上使用。
本組成物中之上述(B)成分的配入比例可例示如：通常為0.05~5重量%，且宜為0.05~2重量%，更宜為0.1~2.0重量%。可藉由滿足此種配入比例而使產生雌馬酚之微生物的雌馬酚產生能力安定地維持住。
本組成物之pH亦未特別受到限制，可因應本組成物之種類等加以適宜設定。本組成物中，從抑制雜菌繁殖之觀點來看，pH宜調整為5.0以下，且較宜為4.0~4.8，更宜為4.2~4.6。一般而言，產生雌馬酚之微生物在pH5.0以下之環境下中喪失雌馬酚產生能力的傾向增強，而會無法安定維持雌馬酚產生能力，但依據本組成物，藉由抗壞血酸及/或其衍生物之作用，即使在pH為5.0以下之條件下，亦可安定地維持住產生雌馬酚之微生物的雌馬酚產生能力。
本組成物中，亦可依需要而含有：蔗糖、蔗糖素、甜菊等之甜味劑；咖啡萃取物、紅茶萃取物等之風味劑；香料；果汁、水果片、蔬菜汁、蔬菜片等之源自植物成分；鈉、鉀、鈣、鋅、鐵等之金屬；β胡蘿蔔素等之維生素；凝膠化劑；葡萄糖酸等之安定化劑；水等之稀釋劑等之添加成分。於此，本組成物所配入之添加成分為了不損及保存安定性，宜為不被產生雌馬酚之微生物資化者。
本組成物之形態亦未特別受限，可為液態、半固態、固態及膠狀中任一者。
本組成物之較佳形態可列舉如：於利用產生雌馬酚之微生物並使其發酵之發酵物中，配入抗壞血酸及/或其衍生物以及依需要而定之其他添加成分的發酵製品。於此，利用產生雌馬酚之微生物並使其發酵的發酵物可列舉如上述第1方法及第2方法所製造之發酵物。此外，該發酵製品具體來說可例示如發酵大豆飲食品、發酵豆乳飲食品及發酵乳等。於此，發酵乳包含乳果(yogurt)(硬型、軟型、飲料型)及乳酸菌飲料等。該等發酵製品之中，仍以發酵大豆飲食品及發酵豆乳飲食品為佳，且更宜為發酵大豆飲食品。
此外，本組成物之其他適宜形態可列舉如：含有經離析或粗純化之產生雌馬酚之微生物活菌、抗壞血酸及/或其衍生物、可食性載體以及依需要而定之其他添加成分的組成。於此，可食性載體可例示如：含大豆粉末之水溶液、豆乳、水、可食性凝膠、乳品以及各種鹽溶液等。
於本組成物中，因係於活菌狀態下含有產生雌馬酚之微生物，而宜於低溫下流通及販賣。
本組成物係於產生雌馬酚之微生物維持有雌馬酚產生能力之狀態下直接含有活菌，因此可表現出基於該微生物之各種生理活性及藥理活性。因此，本組成物可使用在醫藥或飲食品之領域中。
將本組成物使用在飲食品之領域中時，本組成物 除了供作一般飲食品之外，可供作特定保健用飲食品、營養輔助飲食品、機能性飲食品及病患用飲食品等。
舉例來說，本組成物經攝取後，藉由產生雌馬酚之微生物的作用，可於腸內生成雌馬酚，進而有效享受基於雌馬酚之生理活性及藥理活性，因此，於醫藥或飲食品領域中，適合對追求享受雌馬酚作用之人使用。具體而言，本組成物舉例來說在在預防甚至改善更年期障礙、骨質疏鬆症、前列腺肥大及代謝症候群等疾病或症狀、減低血中膽固醇值、美白、改善面皰、整腸、改善肥胖以及利尿等之用途上甚為有用。其中，本組成物特別是在預防甚至改善中高年女性之不明原因不適感或伴隨停經而起之症狀(如骨質疏鬆症、更年期障礙等)上甚有用。
本組成物之每日攝取量雖依本組成物中之產生雌馬酚之微生物的菌數、攝取者之年齡及體重、攝取次數等而異，但舉例來說，成人每日攝取量可列舉如相當於本組成物10~500g之量。
此外，如前所述，於活菌狀態下含有產生雌馬酚之微生物的組成物中，可藉由添加上述(B)而使產生雌馬酚之微生物的雌馬酚產生能力維持安定，即使長期保存，亦可抑制產生雌馬酚之微生物喪失雌馬酚產生能力。因此，本發明亦提供一種產生雌馬酚之微生物的雌馬酚產生能力維持方法，其特徵在於：在含有活菌狀態之產生雌馬酚之微生物的組成物中，更添加選自抗壞血酸、其衍生物以及該等之鹽所構成群組中之至少1種。雌馬酚產生能力係依後 述實施例所記載之方法來測定。至於該保存安定化方法之具體實施態樣，則援用與上述含有產生雌馬酚之微生物之組成物相關的記載內容。
實施例
以下，基於實施例等來詳細說明本發明，但本發明並不受其等之侷限。
下述實施例及比較例所使用之大豆粉末係使用下述方法調製而得者。
大豆粉末溶液之調製
將剝皮並分成兩半之脫皮大豆供予蒸煮處理。蒸煮處理係對脫皮大豆持續送出蒸氣至到達100℃之溫度，從到達100℃之時間點起維持100℃至140秒。接著，使蒸煮處理後之大豆通過輥壓機之輥子間而製成薄片狀。之後，於80℃下將薄片狀之大豆進行熱風乾燥，乾燥至水分含量達3~6%程度，將其以氣動研磨機(air grinder)粉碎而製得大豆粉末。氣動研磨機之粉碎進行至粉碎粒徑150μm以上者達10%以下。
接著，於溶解有適量碳酸氫鈉及檸檬酸三鈉之水中添加預定量之上述製得之大豆粉末並使其分散溶解，使其浸潤膨脹15分鐘。接著，使所得溶液於95℃下加熱10分鐘，萃取大豆粉末中之水溶性成分，更使大豆粉末中所含之LOX、胰蛋白酶抑制因子等之酵素失活。加熱後，維持80℃以上之溫度並直接添加適量之檸檬酸，使pH回復中性。之後，使用均質機(GAULIN社製LAB40)，於 200-1000kgf/cm2範圍之條件下進行均質化處理，藉此調製出大豆粉末溶液(換算為乾燥重量，含大豆粉末14重量%)。
實施例1：以第1方法製造發酵大豆食品及發酵大豆食品之評估
1.發酵大豆食品之製造
使用具有雌馬酚產生能力之格氏乳球菌(乳球菌20-92菌株，FERM BP-10036號)，以下述條件進行菌元之調製、大量菌元之調製、正式發酵及容器之充填。
<菌元之調製>
將含有大豆粉末溶液(以乾燥重量計，含有14%大豆粉末)80重量%、葡萄糖0.1重量%、L-精胺酸0.1重量%且剩餘部分為純水之溶液(pH 7.48)100ml進行熱壓釜殺菌(121℃，15分鐘)，調製菌元培養基。於該菌元培養基中接種乳球菌20-92菌株之種菌，以Gas Pack於37℃下進行96小時厭氧培養，而製得菌元(pH6.64)。
<大量菌元之調製>
將含有大豆粉末溶液(以乾燥重量計，含有14%大豆粉末)80重量%、葡萄糖0.1重量%、L-精胺酸0.1重量%且剩餘部分為純水之溶液(pH 7.48)5L進行熱壓釜殺菌(121℃，15分鐘)，調製大量菌元培養基。於該大量菌元培養基中接種上述所得菌元至1容量%，並於37℃且嗜氧條件下進行15小時間靜置培養，藉此製得大量菌元(pH6.72)。
<正式發酵>
將含有大豆粉末溶液(以乾燥重量計，含有14%大豆粉 末)50重量%、紅蘿蔔汁(宮崎農協果汁)6重量%、南瓜糊(Nagano Sanyo Foods)6重量%且剩餘部分為純水之溶液(pH 6.78)200L以雙管式殺菌機於95℃下殺菌30秒，調製正式發酵用培養基。於經殺菌後回收之正式發酵用培養基中接種上述製得之大量菌元4L，於37℃且嗜氧條件下進行15小時靜置培養，藉此製得發酵大豆液(pH4.56)。
<混合副原料、充填至容器>
將含有大豆粉末溶液(以乾燥重量計，含有14%大豆粉末)65重量%、砂糖7.4重量%、凝膠化劑製劑FG2524(新田明膠製)1.0重量%、葡萄糖酸0.8重量%、香料0.4重量%、L-抗壞血酸0.1重量%且剩餘部份為純水之溶液800L以雙管式殺菌機於95℃下殺菌30秒，製得副原料溶液。將該副原料溶液80重量份與上述製得之發酵大豆液20重量份於37~40℃下混合。於維持混合液之溫度的狀態下，講求衛生地充填100g至聚乙烯杯(注滿容量130ml，口徑71mm)，並以鋁蓋密封。充填物放入5℃之冰箱中，使其冷卻固化，製得含有格氏乳球菌活菌之發酵大豆食品。
2.各種評估
將上述製得之裝入容器的發酵大豆食品於10℃下保存3週。並於調製瞬後、1週後、2週後及3週後測定發酵大豆食品之pH，再以下述方法評估發酵大豆食品所含之格氏乳球菌數及發酵大豆食品所含格氏乳球菌有無雌馬酚產生能力。此外，就上述調製之菌元、大量菌元及正式發酵後之發酵物，亦同樣地測定格氏乳球菌數及各自所含之格氏乳 球菌的雌馬酚產生能力。
<格氏乳球菌數之測定>
格氏乳球菌之活菌數測定係使用BCP平板計數洋菜培養基(Plate Count Agar with BCP)(日水製藥股份有限公司製)，於37℃下進行72小時傾注培養(pour culture)，計測已生育之菌落數藉此求出菌數。
<格氏乳球菌有無雌馬酚產生能力之測定>
於含有濃度10μg/ml之木質素黃酮之Modified GAM Broth(日水製藥股份有限公司製)5ml中添加發酵大豆食品200μl，於37℃下以gas pack進行厭氧培養96小時。接著，將所得培養液供予HPLC，定量出培養液中之雌馬酚量。HPLC分析係實施如下。首先，將培養液0.5ml加入乙酸乙酯5.0ml並進行滲透萃取，將所得萃取液以3000rpm離心10分鐘，再使上清液藉離心蒸發器使溶劑減壓乾涸。接著，將所得固形物以1.0ml溶劑(移動相A/移動相B=50/50)再次溶解，供作HPLC之檢體。HPLC分析係使用D7000系列(日立製作所製)，管柱則使用Capcell Pack UGL205μm4.6Φ×250mm(資生堂製)。於移動相中，移動相A係使用以8：2之比例混合0.05%磷酸緩衝液(含EDTA)與乙酸乙酯-甲醇(1：10)的溶液，移動相B則為含有2%乙酸乙酯之甲醇。以梯度法令流速為1.0ml/分。檢測係使用SPD-10AVP UV-VIS檢測器，令検測波長為254nm與280nm。
<格氏乳球菌數及雌馬酚產生能力之測定結果>
茲將結果示於表1。從此種結果可確知，若菌元、大量 菌元之pH為5以上，即使正式發酵後之發酵物、發酵大豆食品之pH為4.6以下，亦可製出含有維持雌馬酚產生能力之格氏乳球菌的發酵大豆食品。此外，亦已確認發酵大豆食品之格氏乳球菌數本身不太受pH或有無雌馬酚產生能力之影響，且長期維持一定。
<呈味之評估>
調製瞬後之發酵大豆食品及保存3週後之發酵大豆食品均具良好大豆風味，且無異味異臭而適宜作為食品。
比較例1：發酵大豆食品之製造及發酵大豆食品之評估
於菌元之調製過程中，除了將葡萄糖添加量從0.1重量%變更為1.0重量%以外，於與實施例1相同之條件下，進行菌元之調製、大量菌元之調製及正式發酵，製出發酵大豆食品(比較例1-1)。
此外，於大量菌元之調製過程中，除了將葡萄糖添加量從0.1重量%變更為1.0重量%以外，於與實施例1相同 之條件下，進行菌元之調製、大量菌元之調製及正式發酵，製出發酵大豆食品(比較例1-2)。
以與實施例1相同之方法評估比較例1-1及1-2之發酵大豆食品的pH、格氏乳球菌數及有無雌馬酚產生能力。此外，針對菌元、大量菌元及正式發酵液，亦同樣地就格氏乳球菌數及有無雌馬酚產生能力進行測定。
茲將結果示於表2。於菌元調製過程中，使用pH降低之培養基的比較例1-1中，雖在格氏乳球菌數上未發現有差異，但卻已喪失雌馬酚產生能力。於後續之調製大量菌元、正式發酵液以及製造發酵大豆食品之過程中，菌數、pH及官能面均與實施例1未有太大差異，但雌馬酚產生能力並未恢復。又，於大量菌元調製過程中，即使是使用pH降低之培養基的比較例1-1，雖未在格氏乳球菌數上有差異，但雌馬酚產生能力已喪失。於後續之正式發酵及發酵大豆食品製造過程中，菌數、pH及官能面上均無太大差異，但雌馬酚產生能力並未恢復。
不具雌馬酚產生能力時則判定為×。
實施例2：以第2方法製造發酵乳及發酵乳之評估
1.發酵乳之製造
使用具有雌馬酚產生能力之格氏乳球菌(乳球菌20-92菌株，FERM BP-10036號)，於下述條件下進行菌元之調製、大量菌元之調製、正式發酵及充填至容器。
<菌元之調製>
將含有脫脂奶粉10重量%、生奶油6.67重量%、酵母萃取物(「SK酵母萃取物Hi-K」、日本製紙化學股份有限公司)0.1重量%、大豆胚軸萃取物(「大豆黃酮HG」、不二製油股份有限公司；大豆胚軸萃取物中之木質素黃酮類含有率約37重量%)0.025重量%且剩餘部份為純水之溶液(pH 6.14)500mL進行熱壓釜殺菌(115℃，15分鐘)，調製菌元培養基。於該菌元培養基中接種乳球菌20-92菌株之種菌，於37℃下以Gas Pack進行24小時厭氧培養而獲得菌元。
<大量菌元之調製>
將含有脫脂奶粉10重量%、生奶油6.67重量%、酵母萃取物(「SK酵母萃取物Hi-K」、日本製紙化學股份有限公司)0.1重量%、大豆胚軸萃取物(「大豆黃酮HG」、不二製油股份有限公司)0.025重量%且剩餘部份為純水之溶液10L進行UHT(Ultra High Temperature)殺菌(140℃，4秒分鐘)，調製大量菌元培養基。於UHT殺菌後所回收之大量菌元培養基中接種上述製得之菌元至1v/v%，於37℃下進行24小時嗜氧培養，而製得大量菌元。
<正式發酵>
將含有脫脂奶粉10重量%、生奶油6.67重量%、酵母萃取物(「SK酵母萃取物Hi-K」、日本製紙化學股份有限公司)0.1重量%、大豆胚軸萃取物(「大豆黃酮HG」，不二製油股份有限公司)0.025重量%且剩餘部份為純水之溶液10L進行UHT(Ultra High Temperature)殺菌(140℃，4秒分鐘)，調製出正式發酵用培養基。於UHT殺菌後所回收之正式發酵用培養基中接種上述製得之大量菌元培養基至1v/v%，於37℃下進行24小時嗜氧培養，而製得發酵乳。
<充填至容器>
將上述正式發酵所製得之發酵乳無菌地裝入已滅菌完成之容積600mL的容器中，更將預定量之乳酸無菌地添加至容器內並予以混合後，將容器密閉。
2.發酵乳所含格氏乳球菌之雌馬酚產生能力的評估
將上述製得之裝入容器的發酵乳分別於10℃保存74週。於製造瞬後、2週後、6週後及74週後測定發酵乳之pH後，更以與實施例1相同的方法評估發酵乳所含格氏乳球菌數、及發酵乳所含格氏乳球菌有無雌馬酚產生能力。此外，同樣地針對上述調製之菌元及大量菌元測定格氏乳球菌數及發酵乳所含格氏乳球菌之雌馬酚產生能力。
茲將結果示於表3。從此一結果確知，只要發酵乳之pH在4.6以上，可製得含有維持雌馬酚產生能力之格氏乳球菌的發酵乳。再者，亦確認格氏乳球菌之雌馬酚產生能力在發酵乳之pH為5.28以上時可安定維持2週，發酵乳之 pH為5.79以上時可安定維持6週，發酵乳之pH為5.92以上時可維持74週。另一方面，得知發酵乳之pH為4.09及3.53時，即使是調製瞬後，格氏乳球菌亦會喪失雌馬酚產生能力。另外，已確認發酵乳中之格氏乳球菌數本身不太受發酵乳之pH或有無雌馬酚產生能力影響，可長期維持一定。
<呈味之評估>
無論是製造瞬後之發酵乳(未添加乳酸)或是保存74週後之發酵乳(未添加乳酸)，均少酸味且易於飲用，而適宜作為食品。
實施例3：以第2方法製造發酵乳及發酵乳之評估
除了菌元培養基、大量菌元培養基及正式發酵用培養 基係於以下述組成作為基底之培養基中添加表4所示預定量之發酵促進劑來調製者之外，於與上述實施例2相同之條件下進行菌元之調製、大量菌元之調製及正式發酵。
<培養基組成>
將如此製得之發酵乳500g以無菌方式裝入已完成滅菌之容積600mL容器並予以密封，於10℃下保存10週。
於製造瞬後、2週後、4週後及10週後測定發酵乳之pH，更以與實施例1相同的方法評估發酵乳所含格氏乳球菌數、及發酵乳所含格氏乳球菌有無雌馬酚產生能力。此外，同樣地針對上述菌元及大量菌元測定格氏乳球菌數及發酵乳所含格氏乳球菌之雌馬酚產生能力。
茲將所得結果示於表5。從此一結果，確認可藉 由在培養基中添加酵母萃取物、乳清水解物或酪蛋白/酵母水解物而保持格氏乳球菌之雌馬酚產生能力。特別是，已確知只要是含有酵母萃取物0.1重量%以上或酪蛋白/酵母水解物0.1重量%以上時，則可使發酵乳中之格氏乳球菌的雌馬酚產生能力維持高達10週以上之長期間。
比較例2：發酵乳之製造及發酵乳之評估
於菌元調製過程中，除了進行嗜氧培養以外，於與實施例2相同之條件下，進行菌元之調製、大量菌元之調製及正式發酵。
測定如此製得之發酵乳的pH，再以與實施例2相同之方法評估發酵乳所含格氏乳球菌數及發酵乳所含格氏乳球菌有無雌馬酚產生能力。此外，針對菌元、大量菌元，亦同樣地就格氏乳球菌數及發酵乳所含格氏乳球菌有無雌馬酚產生能力進行測定。
結果，若於嗜氧條件下使菌元作嗜氧發酵以進行製造，雖然菌元中之格氏乳球菌維持有雌馬酚產生能力，但在最終製得之發酵乳製品中，格氏乳球菌之雌馬酚產生能力卻已喪失。此外，即使以嗜氧發酵方式調製菌元，發酵乳中之pH與格氏乳球菌數與以厭氧發酵方式調製菌元的情況為相同程度。
實施例4：產生雌馬酚之微生物的雌馬酚產生能力維持效果之評估
1.含有產生雌馬酚之微生物之組成物的製造
於Modified GAM Broth(日水製藥股份有限公司)5ml中接種格氏乳球菌(乳球菌20-92菌株，FERM BP-10036號)之種菌，於37℃下以Gas Pack進行24小時厭氧培養。接著，將所得培養物2mL接種於Modified GAM Broth(日水製藥股份有限公司)50mL，於37℃下以Gas Pack進行24小時厭氧培養。更將所得培養物8mL接種於Modified GAM Broth(日水製藥股份有限公司)200mL中，於37℃下以Gas Pack進行24小時厭氧培養。
將所得培養物施行離心分離(4500rpm×15分)並回收菌體，將所得菌添加於表6所示組成之各飲料中至菌濃 度大概為1×108cfu/mL，以製造含有產生雌馬酚之微生物的組成物，並將其以每10mL分注至容積15mL之聚丙烯軟管(IWAKI製)中。
1.保存後之雌馬酚產生能力之評估
將上述所得含有產生雌馬酚之微生物的各組成物於10℃下保存21天。於保存期間，針對含有產生雌馬酚之微生物的各組成物進行pH、菌數及雌馬酚產生能力之評估。菌數之測定方法與上述實施例1相同。此外，雌馬酚產生能力係以與上述實施例1相同之方法進行HPLC分析，並依下式算出雌馬酚轉換率。
[數1]雌馬酚轉換率(%)={(雌馬酚之尖峰面積)/(木質素黃酮、二氫木質素黃酮及雌馬酚之尖峰面積的總計)}×100
茲將pH之測定結果示於表7。此外，將菌數之測定結果示於第1圖，將雌馬酚產生能力之測定結果示於第2圖。從表7可明瞭，無論任一飲料，即使經保存亦維持製造瞬後之pH，飲料中保持雜菌無法繁殖之環境。此外，從第1圖可明瞭，含有產生雌馬酚之微生物的各組成物於保存期間之活菌數幾乎未有差異。另一方面，如第2圖所示，未添 加抗壞血酸之含有產生雌馬酚之微生物的組成物於保存14天後已喪失雌馬酚產生能力，但添加有抗壞血酸之含有產生雌馬酚之微生物的組成物則於保存21天後亦維持雌馬酚產生能力。特別是，已確認添加有抗壞血酸1重量%或2重量%之含有產生雌馬酚之微生物的組成物其雌馬酚產生能力維持得極為安定。
實施例5：產生雌馬酚之微生物的雌馬酚產生能力保持效果之評估
1.含有產生雌馬酚之微生物之組成物的製造
於與實施例1所使用之菌元培養基相同組成的培養基5ml中接種乳球菌20-92菌株之種菌，於37℃下以Gas Pack進行96小時厭氧培養而製得菌元。
接著，於與實施例1所使用之大量菌元培養基相同組成的培養基10ml中接種上述製得之菌元0.2ml，於37℃下使用Gas Pack進行15小時厭氧培養，獲得1次大量菌元。更於與實施例1所使用之大量菌元培養基相同組成的培養基300ml中接種上述所得菌元6ml，於37℃下使用Gas Pack 進行15小時厭氧培養，獲得2次大量菌元。
接著，於與實施例1所使用之正式發酵用培養基相同組成之培養基2000ml中接種上述所得2次大量菌元40mL，於37℃、嗜氧條件下進行15小時靜置培養而獲得發酵大豆液。
於所得發酵大豆液中，如表8所示般添加6種抗氧化劑而調製出發酵製品後，以毎130g分別充填於紙杯中，並以鋁蓋密封。使其於10℃下保存，於0及7天後開封，再以與實施例4相同之方法測定產生雌馬酚之微生物的菌數及其雌馬酚產生能力。
2.評估結果
茲將產生雌馬酚之微生物的菌數測定結果示於表9，將測定雌馬酚產生能力之結果示於表10。保存開始時，無論是配入任一抗氧化劑，均識別有雌馬酚產生能力。然而，保存7天後除了添加抗壞血酸之發酵製品以外，雌馬酚產生能力均已消失。
[表9]

Claims (3)

  1. 一種產生雌馬酚之微生物之維持雌馬酚產生能力的方法，包含以下步驟：(1)使用產生雌馬酚之微生物，在含有選自於由木質素黃酮配糖體、木質素黃酮及二氫木質素黃酮所構成群組中之至少1種木質素黃酮類的培養基中，於維持pH5.0以上之狀態下進行厭氧發酵以調製菌元(mother starter)；(2)使用前述步驟(1)所得菌元，在含有前述木質素黃酮類之培養基中，於維持pH5.0以上之狀態下進行發酵以調製大量菌元(bulk starter)；及(3)使用前述步驟(2)所獲得之大量菌元，在含有大豆粉末及/或豆乳之培養基中進行發酵以製得發酵物。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中產生雌馬酚之微生物為乳酸菌。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中產生雌馬酚之微生物為格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)。
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