JP7433215B2 - エコール産生菌の培養方法 - Google Patents
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Description
1)アルギニンを含有する培地でコリオバクテリア科に属するエコール産生菌を培養する方法であって、以下のa)又はb)のいずれか一方又は両方を行う、エコール産生菌の培養方法。
a)初発pHを弱酸性に調整して培養する
b)乳酸菌を混合して培養する
2)培地中のアルギニン含有量が0.4~2.5w/v%である、1)の方法。
3)初発pHがpH5.5~6.5である、1)又は2)の方法。
4)乳酸菌がラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトコッカス・ラクチス及びストレプトコッカス・サーモフィルスから選ばれる1種以上である、1)~3)のいずれかの方法。
5)エコール産生菌がスラッキア属細菌である、1)~4)のいずれかの方法。
6)エコール産生菌がSlackia sp.YIT 11861(FERM BP-11231)株である、1)~5)のいずれかの方法。
7)乳酸菌がラクトバチルス・カゼイ YIT 9029株(FERM BP-1366)、ラクトバチルス・アシドフィルス YIT 0198(JCM1028)、ラクトコッカス・ラクチス YIT 2027(FERM BP-6224)及びストレプトコッカス・サーモフィルス YIT 2001(FERM BP-7538)から選ばれる1種以上である、1)~6)のいずれかの方法。
培地中のアルギニン含有量は、下限が0.4w/v%、0.8w/v%又は1.2w/v%のいずれか一つから選択され、上限が10.0w/v%、5.0w/v%、2.5w/v%、2.1w/v%又は1.7w/v%のいずれか一つから選択される、当該下限と上限との任意の組合せによって規定される含有量を指し、0.4~2.5w/v%、好ましくは0.8~2.1w/v%、より好ましくは1.2~1.7w/v%である。尚、アルギニンの塩を使用した場合、アルギニンの含有量とは、遊離体のアルギニンに換算した量である。
本発明で用いられる培地には、例えば、水溶性の有機物を炭素源として加えることができる。水溶性の有機物としては、グルコース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、キシロース、マンノース、ラムノース、リボース、ソルボース、トレハロース、セロビオース、ラクトース、マルトース、シュクロース、ラフィノース、メリビオース、メレジトース、ラクチュロース、グリコーゲン、エリスリトール、ソルビトール、アドニトール、マンニトール、イノシトール、ラクチトール、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、イヌリン、可溶性でんぷん等の糖類の他、ピルビン酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、吉草酸、イソ吉草酸、イソ酪酸、酪酸、プロピオン酸及び酢酸など有機酸類等の化合物を挙げることができる。
また、ビタミン類としては、例えば、ビオチン、葉酸、ピリドキシン、チアミン、リボフラビン、ニコチン酸、パントテン酸、ビタミンB12、チオオクト酸、p-アミノ安息香酸が挙げられる。
また、ポルフィリン化合物であるヘミンを添加することも可能である。
ここで、「弱酸性」とは、下限がpH5.5、5.7又は6のいずれか一つから選択され、上限がpH6.5、6.3又は6のいずれか一つから選択される、当該下限と上限との任意の組合せによって規定されるpH条件を指し、pH5.5~6.5、より好ましくはpH5.5~6の条件を指す。
pH調整は、塩酸、硫酸等の酸を添加することにより行われる。
また、培養時間は、5~96時間とするのが好ましく、10~72時間がより好ましく、12~48時間がより好ましい。
ここで用いられる乳酸菌としては、例えばラクトバチルス・カゼイ(L.casei)、ラクトバチルス・アシドフィルス(L.acidophilus)、ラクトバチルス・プランタラム(L.plantarum)、ラクトバチルス・ブヒネリ(L.buchneri)、ラクトバチルス・ガリナラム(L.gallinarum)、ラクトバチルス・アミロボラス(L.amylovorus)、ラクトバチルス・ブレビス(L.brevis)、ラクトバチルス・ラムノーザス(L.rhamnosus)、ラクトバチルス・ケフィア(L.kefir)、ラクトバチルス・クルバタス(L.curvatus)、ラクトバチルス・ゼアエ(L.zeae)、ラクトバチルス・ヘルベティカス(L.helveticus)、ラクトバチルス・サリバリウス(L.salivalius)、ラクトバチルス・ガセリ(L.gasseri)、ラクトバチルス・ファーメンタム(L.fermentum)、ラクトバチルス・ロイテリ(L.reuteri)、ラクトバチルス・クリスパータス(L.crispatus)、ラクトバチルス・デルブルッキィ サブスピーシーズ.ブルガリカス(L.delbrueckii subsp.bulgaricus)、ラクトバチルス・デルブルッキィ サブスピーシーズ.デルブルッキィ(L.delbrueckii subsp.delbrueckii)、ラクトバチルス・ジョンソニー(L.johnsonii)等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ.ラクチス(Lactococcus lactis subsp.lactis)、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ.クレモリス(Lactococcus lactis subsp.cremoris)等のラクトコッカス属細菌等が挙げられ、このうちラクトバチルス・カゼイ(L.casei)、ラクトバチルス・アシドフィルス(L.acidophilus)、ラクトコッカス・ラクチス(Lac.lactis)、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)が好ましい。また、ラクトバチルス・カゼイとしては、好ましくは、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9018(FERM BP-665)、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029(FERM BP-1366)、ラクトバチルス・カゼイ YIT 10003(FERM BP-7707)が挙げられ、このうちラクトバチルス・カゼイ YIT 9029(FERM BP-1366)がより好ましい。ラクトコッカス・ラクチスとしては、好ましくは、ラクトコッカス・ラクチス YIT 2027(FERM BP-6224)が挙げられる。ストレプトコッカス・サーモフィルスとしては、好ましくは、ストレプトコッカス・サーモフィルス YIT 2001(FERM BP-7538)が挙げられる。これらの菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(現在は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター)に寄託されている。ラクトバチルス・アシドフィルスとしては、好ましくは、ラクトバチルス・アシドフィルス YIT 0198(JCM1028)が挙げられる。この菌株は、微生物材料開発室(JCM)に寄託されている。斯かる乳酸菌は、単独で用いてもよく、2種以上を混合して用いても良い。
乳酸菌の播種量は、例えば0.01~50v/v%、好ましくは0.05~5v/v%、より好ましくは0.5v/v%程度とすればよい。
また、培養時間は、5~96時間とするのが好ましく、10~72時間がより好ましく、12~48時間がより好ましい。
また、培養は静置培養でも良いが、50~650rpm程度の撹拌速度で行っても良い。
嫌気グローブボックス内で1.0w/v%グルコース添加変法GAM(Gifu anaerobic medium)平板培地(日水製薬)にSlackia sp.YIT 11861株(以下「NATTS株」とも称する)の凍結菌株(分散媒 20%グリセロール溶液)を200μL接種し、37℃で24時間培養した。生育したコロニーを平板1枚あたり1.0w/v%グルコース添加変法GAM培地(日水製薬)2mLに懸濁し、接種菌液とした。
培養開始0時間、24時間後のOD600を測定し、0時間からのΔOD600を求めて増殖の指標とした。
培養液200μLを400μLのRNAlaterTM(Ambion)と混合し、10分間室温で静置した。その後、4℃のもと12,000rpmで5分間遠心して上清をデカンテーションで除去した後、RNA抽出まで-80℃で保存した。凍結保存したペレットは融解後、定法[1)Tsuji, H. et al. Isolation and characterization of the equol-producing bacterium Slackia sp. strain NATTS. Arch Microbiol. 192, 279-87 (2010)、2)Matsuda, K et al. Establishment of an analytical system for the human fecal microbiota, based on reverse transcription-quantitative PCR targeting of multicopy rRNA molecules. Appl Environ Microbiol. 75:1961-1969 (2009)]に従ってRNA抽出を行い、RT-qPCR法によりNATTS株の菌数を測定した。使用したプライマーは表1のとおりである。
乳酸菌の菌数は、上記のRNAを鋳型に用い、定法[2)Matsuda, K. et al. Establishment of an analytical system for the human fecal microbiota, based on reverse transcription-quantitative PCR targeting of multicopy rRNA molecules. Appl Environ Microbiol. 75, 1961-1969 (2009)、3)Kubota, H. et al. Detection of human intestinal catalase-negative, gram-positive cocci by rRNA-targeted reverse transcription-PCR. Appl Environ Microbiol. 76, 5440-5451 (2010)]に従って測定した。使用したプライマーは表2のとおりである。
(1)アルギニン塩酸塩を最終濃度が1.0w/v%(遊離体のアルギニン量に換算すると、0.8w/v%)となるように変法GAM培地に添加し、115℃で15分間オートクレーブした後、嫌気グローブボックス(COY LABORATORY PRODUCTS)内において予め2日以上嫌気置換し、試験培地を調製した。嫌気ガスは窒素、炭酸ガス及び水素の3種混合ガス(窒素:炭酸ガス:水素=88%:5%:7%)を使用した。
アルミキャップ付き試験管に分注した試験培地4mLに上記(A)に従い調製した菌液を1/200量接種し、嫌気グローブボックス内で37℃、24時間培養した。その際、対照として、アルギニン塩酸塩を添加しない変法GAM培地(0.1%アルギニンを含む)を使用した。菌体の増殖性を上記(B)に記載の方法に従って評価した。
1.0w/v%アルギニン塩酸塩を変法GAM培地に添加した結果、非添加と比べてΔOD600値が約2.6倍増加した(図1)。
(1)初発pHの影響
アルギニン塩酸塩を1.0w/v%(遊離体のアルギニン量に換算すると、0.8%w/v%)添加した変法GAM培地(0.1%アルギニンを含む)、又はアルギニン塩酸塩を添加しない変法GAM培地について、塩酸を用いて初発pHを5.0、5.5、6.0及び6.5に調整し、115℃で15分間オートクレーブした後、嫌気グローブボックス(COY LABORATORY PRODUCTS)内において予め2日以上嫌気置換し、試験培地を調製した。嫌気ガスは窒素、炭酸ガス及び水素の3種混合ガス(窒素:炭酸ガス:水素=88%:5%:7%)を使用した。その際、対照としてアルギニン塩酸塩を添加しないpH未調整の変法GAM培地を使用した。
アルミキャップ付き試験管に分注した試験培地4mLに、上記(A)に従い調製した菌液を1/200量接種し、嫌気グローブボックス内で37℃、24時間培養した。菌体の増殖性は上記(B)に記載の方法に従って評価した。
アルギニン塩酸塩を最終濃度が0.5、1.0、1.5、2.0、2.5及び3.0w/v%(遊離体のアルギニンに換算すると、0.4、0.8、1.2、1.7、2.1及び2.5w/v%)となるように変法GAM培地に添加し、塩酸で初発pHを5.5もしくは6.0に調整した後、115℃で15分間オートクレーブした後、嫌気グローブボックス(COY LABORATORY PRODUCTS)内において予め2日以上嫌気置換し、試験培地を調製した。嫌気ガスは窒素、炭酸ガス及び水素の3種混合ガス(窒素:炭酸ガス:水素=88%:5%:7%)を使用した。
アルミキャップ付き試験管に分注した試験培地4mLに、上記(A)に従い調製した菌液を1/200量接種し、嫌気グローブボックス内で37℃、24時間培養した。菌体の増殖性は上記(B)に記載の方法に従って評価した。
アルギニン塩酸塩を2.0w/v%(遊離体のアルギニン量に換算すると、1.7w/v%)添加した変法GAM培地(初発pH5.5もしくは6.0)200mL(500mlコルベンを使用)を115℃で15分間オートクレーブした後、嫌気グローブボックス(COY LABORATORY PRODUCTS)内において予め2日以上嫌気置換し、試験培地を調製した。嫌気ガスは窒素、炭酸ガス及び水素の3種混合ガス(窒素:炭酸ガス:水素=88%:5%:7%)を使用した。
試験培地に上記(A)に従い調製した菌液を1/200量接種し、750rpmの攪拌速度で攪拌子を回転させながら、嫌気グローブボックス内で37℃、24時間培養した。
また、上記と同じ組成の培地で回転を加えずに静置培養したものを対照とした。なお、攪拌培養の回転速度は、気相のガスを培地全体に拡散させることができ、かつ24時間安定して回転させることができる速度に設定した。菌体の増殖性は上記(B)に記載の方法に従って評価した。
(1)乳酸菌株
・L.acidophilus YIT0198、L. casei YIT9029(LcS)
・Lac.lactis ss.lactis YIT2027、
・St.thermophilus YIT2001
培養24時間後に培養液について、前記(C)に記載の方法によりNATTS株及び各乳酸菌の菌数を測定した。
L.acidophilus YIT0198、Lac.lactis YIT2027、St.thermophilus YIT 2001及びLcSを混合培養した際、培養24時間後のNATTS株の菌数がNATTS株単独培養と比べて高くなり、特にL.acidophilus YIT0198及びLcSを混合培養した際、有意に高くなった(表2,p<0.05)。特にLcSと混合培養した際のNATTS株の菌数は最も高く、これまでに確立した至適培地で培養した際の菌数とほぼ同等であった(表3)。また、LcSの菌数についても単独培養と比較してNATTS株と混合培養した場合に有意に高かった(表3,p<0.05)。
Claims (4)
- アルギニンを1.2~2.5w/v%含有する培地でスラッキア属に属するエコール産生菌を増殖させる方法であって、以下のa)又はb)のいずれか一方又は両方を行う、エコール産生菌の増殖方法。
a)初発pHを5.5~6.5に調整して培養する
b)乳酸菌を混合して培養する - 乳酸菌がラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトコッカス・ラクチス及びストレプトコッカス・サーモフィルスから選ばれる1種以上である、請求項1記載の方法。
- エコール産生菌がSlackia sp.YIT 11861株(FERM BP-11231)である、請求項1又は2記載の方法。
- 乳酸菌がラクトバチルス・カゼイ YIT 9029株(FERMBP-1366)、ラクトバチルス・アシドフィルス YIT 0198(JCM1028)、ラクトコッカス・ラクチス YIT 2027(FERM BP-6224)及びストレプトコッカス・サーモフィルス YIT 2001(FERM BP-7538)から選ばれる1種以上である、請求項1~3のいずれか1項記載の方法。
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