MX2011003021A - Producto fermentado que contiene un microorganismo productor de equol, por el cual se mantiene la capacidad productiva de equol, y procedimiento para la produccion del mismo. - Google Patents

Abstract

Un objeto de la presente invención reside en proporcionar un producto fermentado que contiene microorganismos productores de equol en estado de células vivas, por el cual se pueda mantener la capacidad productiva de equol; cuando se produce un material fermentado utilizando un microorganismo productor de equol, con soya en polvo o leche de soya como materias primas: (1) preparando un fermento madre por fermentación en condiciones anaeróbicas, utilizando un microorganismo productor de equol en presencia de una especie de daidzeína a un pH de 5.0 o mayor: (2) preparando un fermento industrial mediante la fermentación en condiciones anaeróbicas utilizando dicho fermento madre, en presencia de una especie de daidzeína, a un pH de 5.0 o mayor y (3) preparando un material fermentado mediante fermentación, empleando el citado fermento industrial en un medio que contenga soya en polvo o leche de soya, se logra la producción de un material fermentado que contiene microorganismos en estado de células vivas, en el cual se mantiene la capacidad productiva de equol.

Description

PRODUCTO FERMENTADO QUE CONTIENE UN MICROORGANISMO PRODUCTOR DE EQUOL. POR EL CUAL SE MANTIENE LA CAPACIDAD PRODUCTIVA DE EQUOL, Y PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DEL MISMO CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a un producto fermentado que contiene microorganismos productores de equol en estado de células vivas, por lo cual se mantiene la capacidad de producir equol, y a un procedimiento de preparación del mismo. La presente invención también se refiere a una composición que contiene un microorganismo productor de equol en estado de una célula viva, donde puede mantenerse de un modo estable la capacidad productiva de equol que presenta el microorganismo, aún después del almacenamiento.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las isoflavonas contenidas en el frijol de soya (por ejemplo, las isoflavonas del frijol de soya, tales como daidzeína, genisteína, y gliciteína) tienen estructuras similares al estradiol y una acción antiestrogénica y una acción del tipo estrogénica, relacionada con la unión a un receptor de estrógeno (en adelante, denominado ER [estrogen receptor]). Los estudios epidemiológicos y los estudios de intervención efectuados sobre las isoflavonas del frijol de soya hasta el momento sugieren que las isoflavonas del frijol de soya tienen un efecto preventivo, atribuible a la acción antiestrogénica, en ciertos tipos de cáncer dependientes de hormonas— tales como el cáncer de mama y cáncer prostático— y un efecto de mejoría, que puede atribuirse a la acción del tipo estrogénica, sobre trastornos menopáusicos, osteoporosis posmenopáusica e hiperlipidemia.

En los últimos años, se ha reportado que el principio activo de los efectos fisiológicos de estas isoflavonas del frijol de soya puede ser el equol, un metabolito de la daidzeína. Más específicamente, se ha reportado que el equol tiene una mayor capacidad de unión al ER (en especial, al ERp) que las isoflavonas del frijol de soya y que tiene una capacidad de transición notablemente superior a los órganos diana, tales como los tejidos mamarios y prostáticos (remítase a los documentos 1-4 que no son de patentes). Además, un estudio de control de casos reporta de que hay significativamente menos pacientes de cáncer de mama y de cáncer prostático capaces de producir equol. Los efectos sobre la mejoría en el metabolismo de los lípidos y la densidad de las isoflavonas del frijol de soya fueron examinados en mujeres posmenopáusicas categorizadas en dos grupos: las que podían producir equol y las que no. Se observó una mejoría significativa en las que podían producirlo.

El metabolismo de la daidzeína produce equol por las bacterias entéricas. La capacidad de producir equol varía de un individuo a otro, y el porcentaje de japoneses capaces de producir equol, según los informes, ronda el 50%. Es decir, aproximadamente el 50% de los japoneses no pueden producir equol (son no productores de equol). Estos individuos no pueden gozar de los beneficios fisiológicos útiles de la acción del equol, aunque ingieran frijoles de soya y alimentos procesados basados en frijoles de soya. Por lo tanto, para que un no productor de equol pueda gozar de los beneficios fisiológicos útiles que ofrece la acción de equol, se cree que es efectiva la ingesta del equol propiamente dicho.

Los microorganismos productores de equol ya son conocidos; por ejemplo, los presentes inventores han aislado el Bacteroides E-23-15 (FERM BP-6435), el Streptococcus E-23-17 (FERM BP-6436), el Streptococcus A6G225 (FERM BP-6437) y el Lactococcus 20-92 (FERM BP-10036) del interior del intestino humano (remítase a los documentos de patente 1 y 2).

En consecuencia, se cree que si pudiera proveerse un producto fermentado que contenga microorganismos productores de equol en estado de células vivas, podría posibilitarse la ingestión de un microorganismo productor de equol, lo cual permitiría a los individuos beneficiarse por los efectos útiles de los microorganismos productores de equol. Sin embargo, si se elabora un producto fermentado utilizando un microorganismo productor de equol de acuerdo con los métodos comunes, se pierde la capacidad de producir equol del microorganismo, lo cual constituye un problema y en consecuencia, no puede obtenerse un producto fermentado que contenga microorganismos productores de equol en estado de células vivas. Asimismo, como los microorganismos productores de equol tienen una marcada tendencia a perder su capacidad productora de equol debido a las condiciones de bajo pH o al almacenamiento aeróbico, aunque pudiera elaborarse un producto fermentado manteniendo al mismo tiempo la capacidad de producción de equol del microorganismo, esta capacidad de producción de equol se perdería al no poder tolerar el almacenamiento en la etapa de distribución.

Con la citada técnica anterior como antecedente, resulta deseable desarrollar un producto fermentado que contenga microorganismos en estado de células vivas mediante el cual se pueda mantener la capacidad de producción de equol.

Documento Previo Documento de patente 1 : WO99/007392.

Documento de patente 2: WO2005/000042.

Bibliografía que no consiste en un documento de patente 1 : Morito K, Hirose T, Kinjo J, Hirakawa T, Okawa M, Nohara T, Ogawa S, Inoue S, Muramatsu M, Masamune Y. Interaction of phytoestrogens with estrogen receptors a and ß [Interacción de fitoestrogenos con los receptores de estrógeno a y ß]. Biol Pharm Bull 24(4):351-356, 2001.

Bibliografía que no consiste en un documento de patente 2: Maubach J, Bracke ME, Heyerick A, Depypere HT, Serreyn RF, Mareel MM, Keukeleire DD. Quantitation of soy-derived phytoestrogens in human breast tissue and biological fluids by high-performance liquid chromatography [Cuantificación de fitoestrógenos derivados de la soya en el tejido mamario humano y fluidos biológicos, por cromatografía líquida de alta definición]. J Chromatography B 784:137-144, 2003.

Bibliografía que no consiste en un documento de patente 3: Morton MS, Chan PSF, Cheng C, Blacklock N, Matos-Ferreira A, Abranches-Monteiro L, Correia R, Lloyd S, Griffiths K. Lignans and isoflavonoids in plasma and prostatic fluid in men: Samples from Portugal, Hong Kong, and the United Kingdom [Lignanos e isoflavonoides en el plasma y el fluido prostético en hombres: muestras de Portugal, Hong Kong y el Reino Unido]. Prostate 32:122-128, 1997.

Bibliografía que no consiste en un documento de patente 4: Tammy EH, Paul DM, Paul GF, Robert D, Etapahen B, Kenneth J, Ray M, Lorraine GO, Kristiina W, Holly MS, Karen JG. Long-term dietary habits affect soy isoflavone metabolism and accumulation in prostatic fluid in Caucasian men [Los hábitos dietarios a largo plazo afectan el metabolismo de la isoflavona de la soya y la acumulación en el fluido prostético en hombres caucásicos]. J Nutr 135:1400-1406, 2005.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Problema Técnico En consecuencia, un objeto de la presente invención reside en proporcionar un producto fermentado que contiene un microorganismo productor de equol en estado de una célula viva, por lo cual se mantiene la capacidad de producir equol. Otro objeto de la presente invención radica en proveer una composición que contenga un microorganismo productor de equol, que contenga un microorganismo productor de equol en estado de una célula viva, por lo cual se mantiene la capacidad de producir equol, y que permita además, que se mantenga de un modo estable la capacidad de producción del equol aun después del almacenamiento.

Solución al Problema Los presentes inventores llevaron a cabo una intensiva investigación, con el propósito de alcanzar los objetos anteriores y para su asombro, hallaron que es posible obtener en una escala industrial aplicable, un material fermentado que contiene microorganismos productores de equol en estado de células vivas, por lo cual se mantiene la capacidad de producir equol, incorporando ideas inventivas en particular en la selección de la atmósfera de fermentación, el pH y similares, de acuerdo con las materias primas usadas en cada etapa, desde la preparación de un fermento madre hasta la fermentación principal utilizando un microorganismo productor de equol. Los presentes inventores también hallaron que mediante el agregado de ácido ascórbico y/o un derivado del mismo a la composición que contiene microorganismos productores de equol en estado de células vivas, podría mantenerse en forma estable la capacidad de producción de equol de los microorganismos productores de equol, permitiendo la obtención de una composición que contenga un microorganismo productor de equol, con una excelente estabilidad durante el almacenamiento. Específicamente, los presentes inventores descubrieron lo siguiente. (i) Primer método para preparar un material fermentado Al producir un material fermentado utilizando un microorganismo productor de equol con soya en polvo o leche de soya como materias primas, es posible preparar un material fermentado que contenga microorganismos en estado de células vivas, mediante el cual se mantenga la capacidad de producción de equol, de la siguiente manera: (1) realizando la fermentación en condiciones anaeróbicas, utilizando un microorganismo productor de equol en presencia de una especie de daidzeína- a un pH de 5.0 o mayor, para preparar un fermento madre; (2) realizando la fermentación en condiciones anaeróbicas, utilizando el fermento madre anterior, en presencia de una especie de daidzeína a un pH de 5.0 o mayor, para preparar un fermento industrial y (3) llevando a cabo la fermentación empleando el anterior fermento industrial, en un medio que contenga soya en polvo o leche de soya, a fin de preparar un material fermentado. (¡i) Segundo método para preparar un material fermentado Al preparar un material fermentado utilizando microorganismos productores de equol con leche como materia prima, es posible preparar un material fermentado que contenga microorganismos en estado de células vivas, mediante el cual se mantenga la capacidad de producción de equol, de la siguiente manera: preparando un fermento madre realizando la fermentación en presencia de una especie de daidzeína, en condiciones anaeróbicas y, cuando leche que se emplea como materia prima se fermenta usando el fermento madre, realizando la fermentación en presencia de una especie de daidzeína, en condiciones de pH 4.6 o mayor. El material fermentado puede retener la capacidad de producción de equol del microorganismo productor de equol por un largo período y denota una excelente estabilidad durante el almacenamiento. Además, al realizar todos los etapas de fermentación, es decir, desde la preparación del fermento madre hasta la fermentación de la leche que se emplea como materia prima, en presencia de un extracto de levadura, pueden mejorarse todavía más la capacidad de producción de equol del microorganismo productor de equol y la estabilidad durante el almacenamiento. (iii) Composición que contiene el microorganismo productor de equol Es posible obtener una composición mediante la cual no se pierda la capacidad de producción de equol del microorganismo productor de equol, aún después del almacenamiento, mediante la incorporación de ácido ascórbico y/o un derivado del mismo, al producto fermentado que contiene microorganismos productores de equol en estado de células vivas.

La presente invención se ha logrado sobre la base de estos hallazgos y otras mejoras sobre los citados hallazgos.

Específicamente, la presente invención provee las siguientes invenciones. ítem 1. Un procedimiento para la producción de un material fermentado, el cual comprende las siguientes etapas: (1) llevar a cabo la fermentación anaeróbica, en un medio que contenga al menos un tipo de una especie de daidzeina, seleccionada del grupo que consiste en glucósido de daidzeina, daidzeina y dihidrodaidzeína, utilizando un microorganismo productor de equol, en un estado en el cual el pH se mantiene en un valor de 5.0 o más, con el fin de preparar un fermento madre; (2) efectuar la fermentación empleando el fermento madre que se obtuvo en el etapa (1), en el medio que contiene la especie de daidzeina, en un estado en el cual el pH se mantiene en un valor de 5.0 o más, con el fin de preparar un fermento industrial y (3) efectuar la fermentación empleando el fermento industrial que se obtuvo en el etapa (2), en un medio que contenga soya en polvo y/o leche de soya, para obtener un material fermentado. ítem 2. El procedimiento de producción de acuerdo con el ítem 1 , en el cual el microorganismo productor de equol es una bacteria de ácido láctico. ítem 3. El procedimiento de producción de acuerdo con el ítem 1 , en el cual el microorganismo productor de equol es el Lactococcus garvieae. ítem 4. Un procedimiento para la producción de un material fermentado el cual comprende las siguientes etapas: (I) llevar a cabo la fermentación anaeróbica en un medio que contenga al menos un tipo de especie de daidzeina, seleccionada del grupo que consiste en glucósido de daidzeina, daidzeina y dihidrodaidzeína, utilizando un microorganismo productor de equol con el fin de preparar un fermento madre y (II) efectuar la fermentación empleando el fermento madre que se obtuvo en el etapa (I), en un medio que contenga la especie del compuesto de daidzeina y leche, en un estado en el cual se mantiene un pH de 4.6 o mayor para obtener un material fermentado. ítem 5. El procedimiento de producción de acuerdo con el ítem 4, en el cual se usa extracto del hipocótilo del frijol de soya como la especie de daidzeina. ítem 6. El procedimiento de producción de acuerdo con el ítem 4, en el cual el medio empleado en las etapas (I) y (II) contiene, además, extracto de levadura.

Item 7. El procedimiento de producción de acuerdo con el ítem 4, en el cual el microorganismo productor de equol es una bacteria de ácido láctico. ítem 8. El procedimiento de producción de acuerdo con el ítem 4, en el cual el microorganismo productor de equol es Lactococcus garvieae. ítem 9. Un producto fermentado que contiene un material fermentado obtenido mediante el procedimiento de producción de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 1 a 3. ítem 10. Un producto fermentado que contiene un material fermentado obtenido mediante el procedimiento de producción de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 4 a 8. ítem 11. El producto fermentado de acuerdo con el ítem 10, en el cual el pH del mismo es de 4.6 o mayor. ítem 12. Una composición que contiene un microorganismo productor de equol, que contiene: (A) un microorganismo productor de equol en estado de una célula viva y (B), al menos un miembro que se selecciona del grupo que consiste en ácido ascórbico, derivados del mismo y sales del mismo. ítem 13. La composición de acuerdo con el ítem 12, en la cual el componente (B) está contenido en una proporción de mezcla de 0.05 a 5% en peso. ítem 14. La composición de acuerdo con el ítem 12, en la cual el pH de la misma 5.0 o menor.

Item 15. La composición de acuerdo con el ítem 12, que comprende un material fermentado, que se fermentó utilizando un microorganismo productor de equol como el microorganismo productor de equol en estado de una célula viva. ítem 16. La composición de acuerdo con el ítem 12, que es una bebida de frijoles de soya fermentados o una leche de soya fermentada. ítem 17. La composición de acuerdo con el ítem 12, en la cual el microorganismo productor de equol es una bacteria de ácido láctico. ítem 18. La composición de acuerdo con el ítem 12, en la cual el microorganismo productor de equol es el Lactococcus garvieae. ítem 19. Un método para mantener la capacidad de producción de equol de un microorganismo productor de equol, método que comprende: agregar al menos un miembro que se selecciona del grupo que consiste en ácido ascórbico, derivados del mismo y sales del mismo a una composición que contiene un microorganismo productor de equol, en estado de una célula viva.

Efectos Ventajosos de la Invención De acuerdo con el procedimiento de producción de la presente invención, dado que puede prepararse un producto fermentado que contiene microorganismos productores de equol en estado de células vivas, por lo cual se mantiene la capacidad de producir equol, puede lograrse por primera vez la obtención de bebidas y comidas que contengan un microorganismo productor de equol en estado de una célula viva.

Además, el procedimiento de producción de la presente invención permite el procesamiento de la fermentación mientras se mantiene al mismo tiempo la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol, aún cuando se aplica en un procedimiento de producción masiva en escala industrial. Esto hace que la presente invención sea altamente práctica desde el punto de vista comercial y de extrema utilidad.

Cuando se proveen bebidas y comidas que contienen microorganismos productores de equol en estado de una célula viva, por lo cual se mantiene la capacidad de producir equol a los seres humanos imposibilitados de producir equol (es decir, individuos no productores de equol), estos individuos no productores de equol pueden adquirir la capacidad productiva de equol y por ende, beneficiarse de las actividades biológicas efectivas atribuibles al equol.

Asimismo, de acuerdo con la composición que contiene el microorganismo productor de equol de la presente invención, la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol puede mantenerse en forma estable, durante un período prolongado; es decir, se provee estabilidad durante el almacenamiento, lo cual puede permitir que el microorganismo productor de equol resista lo suficiente a la distribución y ventas. En particular, si la composición que contiene el microorganismo productor de equol de la presente invención se encuentra en forma de una bebida fermentada de soya o una leche de soya fermentada, corno el microorganismo productor de equol en estado de una célula viva está contenido junto con constituyentes útiles derivados de la soya, tales como una especie de daidzeína, es ventajosamente más sencillo para el microorganismo productor de equol generar equol en el intestino.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra los resultados de las mediciones del recuento de células viables de la cepa Lactococcus contenida en cada bebida del Ejemplo 4.

La figura 2 muestra los resultados de las mediciones de la capacidad productiva de equol de la cepa Lactococcus contenida en cada bebida en el Ejemplo 4.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la presente invención, un microorganismo productor de equol es un microorganismo que tiene la capacidad de utilizar al menos un tipo de especie de daidzeína, seleccionado del grupo que consiste en glucósido de daidzeína, daidzeína y dihidrodaidzeína, para producir equol (actividad metabólica). Los ejemplos específicos del glucósido de daidzeína incluyen daidzina, malonildaidzina, acetildaidzina y similares. No hay limitaciones particulares a los microorganismos productores de equol usados en la presente invención, toda vez que puedan ser ingeridos como comida y que se pueda mantener su capacidad productiva de equol. Los microorganismos conocidos que tienen las capacidades antes mencionadas son, por ejemplo, los microorganismos que pertenecen al género Lactococcus, tales como Lactococcus garvieae; los microorganismos que pertenecen al género Streptococcus, tales como Streptococcus intermedius y Streptococcus constellatus; los microorganismos que pertenecen al género Lactobacillus, tales como Lactobacillus mucosae; los microorganismos que pertenecen al género Bacteroides, tales como Bacteroides ovatus; los microorganismos que pertenecen al género Enterococcus, tales como Enterococcus faecium; los microorganismos que pertenecen al género Finegoldia, tales como Finegoldia magna; los microorganismos que pertenecen al género Veillonella; microorganismos que pertenecen al género Adlercreutzia, tales como Adlercreutzia equolifaciens; los microorganismos que pertenecen al género Eubacterium, tales como Eubacterium limnosus; los microorganismos que pertenecen al género Eggerthella, tales como Eggerthella hongkongensis; los microorganismos que pertenecen al género Bifidobacterium, tales como Bifidobacterium adolescentis y Bifidobacterium breve; los microorganismos que pertenecen al género Slacki; los microorganismos que pertenecen al género Acinetobacter y similares. Entre los microorganismos productores de equol, pueden usarse, con preferencia las bacterias del ácido láctico, tales como las pertenecientes al género Lactococcus, al género Streptococcus, al género Lactobacillus y al género Bifídobacteríum; con mayor preferencia, las bacterias del ácido láctico que pertenecen al género Lactococcus y con particular preferencia, los Lactococcus garvieae. Los microorganismos productores de equol pueden aislarse, por ejemplo, del interior de los intestinos humanos, con presencia y ausencia de capacidad productiva de equol como indicación. Con respecto a los microorganismos productores de equol antes citados, las bacterias aisladas de los intestinos humanos e identificadas por los presentes inventores y otros— es decir, Lactococcus 20-92 (FERM BP-10036), Streptococcus E-23-17 (FERM BP-6436), Streptococcus A6G225 (FERM BP-6437) y Bacteroides E-23-15 (FERM BP-6435)— se han depositado y estas bacterias depositadas se pueden emplear en la presente invención. Asimismo, como microorganismos productores de equol, también pueden emplearse los siguientes: Eubacteríum limnosus (ATCC 8486), Eggerthella sp. (KCC10490), Adlercreutzia equolifaciens (JCM14793), Eggerthella hongkongensis HKU10 (JCM14552), Bifídobacteríum adolescentis TM-1 (FERM P-20325), Bifídobacteríum breve (JCM1273), Slackia TM30 (FERM AP-20729). Gram-positive bacterium do03 (AHU-1763) (FERM AP-20905) y similares. En la presente invención, entre las bacterias depositadas, con preferencia se usa el Lactococcus 20-92.

En adelante se explicarán en forma detallada los procedimientos de producción (el primer método y el segundo método) para el material fermentado, el producto fermentado y la composición que contiene el microorganismo productor de equol de la presente invención. El primer método es un método para preparar el material fermentado con soya en polvo y/o leche de soya como materias primas, y el segundo método es un método para preparar el material fermentado con leche como materia prima.

En la presente memoria descriptiva, un fermento madre es un fermento (inoculo) preparado a partir de un cultivo madre, y un fermento industrial es un fermento (inoculo) preparado a partir de un fermento madre y usado en la fermentación principal cuando se prepara una gran cantidad de material fermentado. 1. Procedimiento de producción del material fermentado (primer método) El presente primer método para preparar un material fermentado comprende: un etapa (1), que consiste en preparar un fermento madre (al cual se lo puede denominar en la presente a continuación como "fermento madre 1"); un etapa (2), que consiste en utilizar el fermento madre 1 con el fin de preparar un fermento industrial (al cual se lo puede denominar en la presente a continuación como "fermento industrial 1") y un etapa (3), que consiste en utilizar el fermento industrial 1 , para preparar un material fermentado con soya en polvo o leche de soya como materia prima. En adelante, el presente primer método para preparar el material fermentado se explicará etapa a etapa de un modo detallado.

Etapa (1) En la presente invención, primero se fermenta un microorganismo productor de equol anaeróbicamente, en un medio que contiene una especie de daidzeína (al cual se lo puede denominar en la presente a continuación como "medio del fermento madre 1"), en un estado en el cual el pH se mantiene en un valor de 5.0 o más, con el fin de preparar un fermento madre (al cual se lo puede denominar en la presente a continuación como "fermento madre 1") (Etapa (1)).

No hay limitación en particular sobre el medio del fermento madre 1, en la medida que permita que un microorganismo productor de equol se desarrolle y sea aceptable como un constituyente de una comida y que la composición del mismo se establezca adecuadamente, de acuerdo con los tipos del material fermentado preparado en último término.

La especie de daidzeína usada para el medio del fermento madre 1 es una que jncluya un tipo o dos tipos o más tipos de especies de daidzeína de las siguientes: glucósido de daidzeína, daidzeína y dihidrodaidzeina. Los ejemplos específicos de glucósido de daidzeína incluyen daidzina, malonildaidzina, acetildaidzina y similares. En la presente invención, puede usarse cualquiera proveniente de un producto puro de una especie de daidzeína, un producto purificado en bruto de una especie de daidzeína y una sustancia que contenga una especie de daidzeína como la especie de daidzeína. Los ejemplos específicos de sustancias que contienen la especie de daidzeina incluyen frijoles de soya, leche de soya, frijoles de germen de soya, kudzu, raíz de kudzu, red grove, alfalfa y extractos de los mismos (extractos de solventes polares, tales como de agua y alcohol hídrico) y similares. Desde el punto de vista de mantener de un modo estable la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol, la especie de daidzeina usada en la presente invención, con preferencia es el frijol de soya, la leche de soya, el germen de frijol de soya o los extractos del mismo y, con mayor preferencia, el frijol de soya.

Aquí, el frijol de soya a emplear como la especie de daidzeina es, preferiblemente, el frijol de soya que se ha pulverizado, con mayor preferencia, el frijol de soya que se ha cocido al vapor o hervido y pulverizado y en particular, con preferencia, el frijol de soya que se ha cocido al vapor o hervido a una temperatura de 65 a 105 °C durante 30 segundos a 30 minutos y luego, pulverizado. Asimismo, si bien no hay limitación en particular sobre el diámetro de partícula promedio del frijol de soya pulverizado, desde el punto de vista de proveer al material fermentado preparado una textura satisfactoria, por lo general conviene que la mediana del diámetro se ubique en el orden de aproximadamente 50 µ?? o menos. Asimismo, conviene que haya 10% o menos partículas con diámetros de partícula de 150 µ?? o mayores. Obsérvese que el diámetro de partícula se mide usando un medidor de distribución del tamaño de partícula del tipo difracción por láser/difusión.

Los ejemplos de las proporciones de mezcla de la sustancia que contiene la especie de daidzeina en el medio del fermento madre 1 son proporciones tales que la cantidad total de la especie de daidzeina se ubique en el 0.002 al 0.04% en peso, con preferencia del 0.004 al 0.02% en peso y, con mayor preferencia, del 0.008 al 0.012% en peso. Más específicamente, cuando se usa soya en polvo como la especie de daidzeína, las proporciones son tales que la soya en polvo convertida en peso seco representa un porcentaje del 3 al 28% en peso en el medio del fermento madre 1 , con preferencia del 5 al 28% en peso y con mayor preferencia, del 7 al 17% en peso. Asimismo, cuando se usa extracto de germen de frijol de soya como la especie de daidzeína, las proporciones son tales que el extracto de germen de frijol de soya convertido en peso seco representa un porcentaje del 0.005 al 0.1% en peso en el medio del fermento madre 1 , con preferencia, del 0.01 al 0.05% en peso y, con mayor preferencia, del 0.02 al 0.03% en peso. Al incluir la especie de daidzeína en estas proporciones de mezcla, puede desarrollarse un microorganismo productor de equol sin perder la capacidad productiva de equol, permitiendo la obtención del fermento madre 1.

Asimismo, para promover el desarrollo del microorganismo productor de equol, un aminoácido tal como la arginina, vitaminas, tales como el ácido ascórbico o un metal traza, tal como el pirofosfato de hierro pueden estar contenidos en el medio del fermento madre 1. El agregado de arginina en el medio del fermento madre 1 es conveniente para que sea satisfactorio el desarrollo del microorganismo productor de equol; los ejemplos de las proporciones de mezcla de arginina en el medio del fermento madre 1 son del 0.01 al 1% en peso, con preferencia, del 0.05 a 0.3% en peso.

Por otra parte, además de los constituyentes anteriores, pueden agregarse nutrientes tales como una fuente de nitrógeno y una fuente de carbono al medio del fermento madre 1 , según sea necesario.

Como el medio del fermento madre 1 a veces afecta el sabor del material fermentado, los medios de cultivo que no afectan de un modo negativo el sabor del material fermentado se dan como ejemplos preferidos.

El medio del fermento madre 1 se prepara mezclando, emulsionando según sea necesario y luego esterilizando cantidades dadas de los constituyentes aditivos.

En el presente etapa (1), la fermentación anaeróbica del microorganismo productor de equol puede realizarse mediante métodos convencionales bien conocidos que emplean sistemas empacados de combustibles gaseosos.

Asimismo, en el presente etapa (1), la fermentación anaeróbica se lleva a cabo manteniendo el pH en un valor de 5.0 o más, con preferencia, un valor de 5.5 a 8.0 y, con mayor preferencia, de 6.0 a 8.0. Al mantener el pH de esta manera, puede prepararse el fermento madre 1 , en el cual se ha desarrollado un microorganismo productor de equol, sin perder la capacidad productiva de equol, permitiendo mantener en forma estable la capacidad productiva de equol del microorganismo, en el material fermentado que se obtiene en último término mediante el presente primer método del procedimiento de producción. El control del pH durante dicha fermentación anaeróbica puede llevarse a cabo mediante métodos ampliamente conocidos.

Por ejemplo, en el medio usado, si la proporción de mezcla del carbohidrato (por ejemplo, glucosa o similares) utilizada por el microorganismo productor de equol se establece en 0.5% en peso o menos, con preferencia 0.4% en peso o menos y con mayor preferencia, en 0.3% en peso o menos, el pH no cae aún si la fermentación continúa, permitiendo que el pH durante la fermentación anaeróbica se mantenga en los intervalos antes mencionados. Además, el control de pH durante la fermentación anaeróbica también se puede llevar a cabo agregando convenientemente, un regulador del pH.

La fermentación anaeróbica en el presente etapa (1) se lleva a cabo inoculando el medio del fermento madre 1 con el inoculo de un microorganismo productor de equol, y se deja que fermente anaeróbicamente en una región de temperaturas que permita el desarrollo del microorganismo, con preferencia, en una región óptima de temperaturas para el microorganismo durante 20 a 96 horas, con mayor preferencia, de 72 a 96 horas. Más específicamente, cuando se usa una bacteria de ácido láctico como microorganismo productor de equol, es suficiente fermentar anaeróbicamente, por ejemplo, a 35 a 39 °C durante 72 a 96 horas.

El fermento madre 1 obtenido de esta manera contiene un microorganismo productor de equol que se ha desarrollado y que se encuentra en un estado en el cual se mantiene la capacidad productiva de equol.

El fermento madre obtenido de este modo se puede incluir directamente en el etapa (2). De un modo alternativo, también es posible usar el fermento madre como inoculo, para producir un fermento madre adicional, de ser necesario, de la misma manera que se describió antes, y luego proveer el fermento madre adicional en el procedimiento de producción subsiguiente. El procedimiento de producción que vuelve a utilizar el fermento madre producido de la misma manera que se describió antes puede repetirse una vez o más; por ejemplo, el procedimiento de producción se puede repetir de 1 a 10 veces. Aún si la fermentación se repite reutilizando el fermento madre, siempre y cuando se puedan satisfacer las condiciones anteriores, los microorganismos productores de equol pueden quedar contenidos en el fermento madre 1 mientras se mantiene la capacidad de producción de equol.

Etapa (2) Luego, usando el fermento madre 1 que se obtuvo en el anterior etapa (1), la fermentación se lleva a cabo con un medio que contiene la especie de daidzeína (que en adelante se puede denominar en la presente como "medio de fermento industrial 1"), en un estado en el cual el pH se mantiene en un valor de 5.0 o más, para preparar el fermento industrial 1 (que en adelante se puede denominar en la presente como "fermento industrial 1") (Etapa (2)).

No hay limitación en particular sobre el medio de fermento industrial 1 , en la medida que sea uno que contenga la especie de daidzeína, que permita que se desarrolle un microorganismo productor de equol y que sea aceptado como un constituyente de una comida; y el medio de fermento industrial 1 se establece convenientemente de acuerdo con el tipo de material fermentado.

Al contener la especie de daidzeína, el medio de fermento industrial 1 permite el desarrollo en un estado en el cual se mantiene la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol. Los tipos y proporciones de mezcla de la especie de daidzeína mezclados en el medio de fermento industrial 1 son los mismos que en el medio de fermentación principal 1 que se describe más adelante.

Asimismo, los tipos y las proporciones de mezcla de los constituyentes aditivos que pueden mezclarse— además de la especie de daidzeína en el medio de fermento industrial 1— son los mismos que en el medio del fermento madre 1 que se describió antes. Además, dado que el medio de fermento industrial 1 a veces afecta el sabor del material fermentado, los ejemplos incluyen, con preferencia, los medios de cultivo que no afectan de un modo negativo el sabor del material fermentado y, con mayor preferencia, incluyen los que tienen la misma composición que el medio del fermento madre 1 anteriormente descrito.

El medio de fermento industrial 1 se prepara mezclando, emulsionando según sea necesario y luego esterilizando cantidades dadas de los constituyentes aditivos.

En el presente etapa (2), la fermentación anaeróbica se lleva a cabo manteniendo el pH en un valor de 5.0 o más, con preferencia entre 5.5 y 8.0 y, con mayor preferencia, entre 6.0 y 8.0. Al mantener el pH de esta manera, puede prepararse el fermento industrial 1 en el cual se ha desarrollado un microorganismo productor de equol sin perder la capacidad productiva de equol, permitiendo mantener en forma estable la capacidad productiva de equol del microorganismo en el material fermentado que se obtiene en último término mediante el presente primer método del procedimiento de producción. El control del pH durante dicha fermentación puede llevarse a cabo por métodos iguales a los explicados en el anterior etapa (1).

Asimismo, en el presente etapa (2), si bien la fermentación puede efectuarse ya sea en una atmósfera aeróbica o anaeróbica, desde el punto de vista de reducir el costo de fabricación, por cuestiones de conveniencia operativa y motivos similares, resulta conveniente llevar a cabo la fermentación en una atmósfera aeróbica. Aunque los microorganismos productores de equol tienden a perder la capacidad productiva de equol en una atmósfera aeróbica, esta capacidad productiva del equol puede mantenerse si se controla la condición de pH dentro de un intervalo especifico durante el cultivo, aún en una atmósfera aeróbica.

La fermentación en el presente etapa (2) se realiza agregando el fermento madre 1 obtenido en el anterior etapa (1) al medio de fermento industrial 1 — por ejemplo, en el orden del 0.5 al 10% en volumen, con preferencia, en el orden del 1 al 5% en volumen y se deja fermentar en una región de temperaturas que permita el desarrollo del microorganismo, con preferencia, en una región de temperaturas óptimas del microorganismo durante 10 a 28 horas, con preferencia, durante 14 a 24 horas. Más concretamente, cuando se usa una bacteria de ácido láctico como microorganismo productor de equol, basta con que fermente anaeróbicamente, por ejemplo, a una temperatura de 35 a 39 °C, durante 14 a 24 horas.

El fermento industrial 1 obtenido de esta manera contiene un microorganismo productor de equol que se ha desarrollado y se encuentra en un estado en el cual se mantiene la capacidad productiva del equol.

Si bien el fermento industrial 1 puede estar sujeto en su estado actual al siguiente etapa (3), el fermento industrial 1 , según sea necesario, puede usarse como un fermento (fermento industrial primario); el presente etapa (2) puede repetirse para preparar un fermento industrial secundario y este fermento industrial secundario se puede someter al siguiente etapa (3).

Etapa (3) Luego, utilizando el fermento industrial 1 que se obtuvo en el anterior etapa (2), se lleva a cabo la fermentación con un medio que contiene una soya en polvo y/o leche de soya (que en adelante se puede denominar en la presente como "el medio de fermentación principal 1"), para preparar un material fermentado (Etapa (3)).

No hay limitación en particular al medio de fermentación principal 1 , en la medida que contenga soya en polvo o leche de soya— al menos uno de ellos— , que permita que se desarrolle un microorganismo productor de equol y que sea aceptable como un constituyente de una comida.

Un ejemplo específico del medio que contiene soya en polvo usado como el medio de fermentación principal 1 es una solución acuosa que contiene soya en polvo. Desde el punto de vista de lograr satisfacción en cuanto al sabor y a la textura y además, suprimir el olor del frijol de soya, es conveniente usar soya en polvo que se haya sometido a un tratamiento por calor, ya sea cociendo al vapor o hirviendo la soya en polvo empleada en el medio de fermentación principal 1. Un ejemplo específico de soya en polvo que se ha sometido a un tratamiento por calor de esa manera es el frijol de soya que se cocinó al vapor o se hirvió a una temperatura de 65 a 105 °C durante 30 segundos a 30 minutos y se pulverizó. Asimismo, si bien no hay limitación en particular sobre el diámetro de partícula promedio de la soya en polvo, desde el punto de vista de brindar al material fermentado preparado una textura satisfactoria generalmente conviene que la mediana del diámetro se ubique en el orden de aproximadamente 50 µ?? o en un valor inferior. Asimismo, es conveniente que haya 10% o menos partículas con diámetros de partícula de 150 µ?? o mayores. Obsérvese que el diámetro de partícula se mide usando un medidor de distribución del tamaño de partícula del tipo difracción por láser/difusión. Cuando se usa una solución acuosa que contiene soya en polvo como el medio de fermentación principal 1 , la soya en polvo se agrega convenientemente al agua y se somete a un tratamiento de homogenizacion, empleando un homogenizador o similares. Al llevar a cabo un tratamiento de homogenización de esta manera, puede conferirse una excelente textura — en particular, suavidad— al material fermentado preparado. Además, cuando se utiliza una solución acuosa que contiene soya en polvo como el medio de fermentación principal 1 , si bien no existe un límite en particular sobre la proporción de mezcla de la soya en polvo en la solución acuosa, la soya en polvo, por ejemplo, se convierte en peso seco a una proporción del 3 al 28% en peso, con preferencia, del 5 al 28% en peso y, con mayor preferencia, del 7 al 17% en peso.

Cuando se usa un medio que contiene leche de soya como el medio de fermentación principal 1 , la leche de soya en su estado actual se puede emplear como el medio de fermentación principal 1. Los procedimientos de producción para la leche de soya son ampliamente conocidos en el campo técnico correspondiente. Específicamente, la leche de soya puede prepararse moliendo el frijol de soya desvainado, que constituye la materia prima, agregando el frijol de soya desvainado al agua para molerlo mientras está mojado, para crear una suspensión (frijol crudo; jugo de frijol), tratando por calor esta suspensión según sea necesario, y luego removiendo el contenido sólido (okara) mediante un tratamiento de separación de sólido-líquido.

Asimismo, el medio de fermentación principal 1 puede incluir, además, otros constituyentes aditivos en la composición anterior. Como la composición del medio de fermentación principal 1 influye sobre el sabor y la textura del material fermentado preparado, los otros constituyentes aditivos que han de mezclarse se determinan convenientemente de acuerdo con el tipo de material fermentado que es el objetivo de la preparación. Los constituyentes aditivos mezclados en el medio de fermentación principal 1 incluyen, por ejemplo: edulcorantes, tales como sacarosa, sucralosa y estevia; saborizantes, tales como extracto de café y extracto de té negro; aroma; constituyentes derivados de plantas, tales como jugo de frutas, fragmentos de frutas, jugo de verduras y fragmentos de verduras; acidulantes, tales como ácido glucónico; metales, tales como sodio, potasio, calcio, zinc y hierro; vitaminas, tales como ácido ascórbico y similares. Como no tiene que suprimirse una caída en el pH en la fermentación del presente etapa (3), puede haber constituyentes derivados de plantas que contengan edulcorantes que incluyan sacáridos (sacarosa, glucosa y similares) y otros por el estilo utilizados por el microorganismo productor de equol en el medio de fermentación principal 1.

El medio de fermentación principal 1 se prepara mezclando cantidades dadas de constituyentes, que se emulsionan según sea necesario y luego se esterilizan.

Para la fermentación en el presente etapa (3), el fermento industrial 1 obtenido en el anterior etapa (2) se agrega en una cantidad suficiente al medio de fermentación principal 1 , por ejemplo, en el orden de 0.5 a 10% en volumen, y con preferencia, en el orden de 1 a 5% en volumen; y luego agitando o dejando reposar la mezcla en una región de temperaturas que permitan el desarrollo del microorganismo, con preferencia, en una región óptima de temperaturas del microorganismo durante 10 a 28 horas, con mayor preferencia, 14 a 24 horas. Específicamente, cuando se usa una bacteria de ácido láctico como un microorganismo productor de equol, basta con fermentar, por ejemplo, a una temperatura de 35 a 39 °C durante 14 a 24 horas.

Si bien la fermentación principal en el presente etapa (3) puede llevarse a cabo en una atmósfera aeróbica o bien, en una atmósfera anaeróbica, desde el punto de vista de reducir el costo de fabricación, por cuestiones de conveniencia operativa y razones similares, es preferible realizarla en una atmósfera aeróbica.

Asimismo, en la fermentación en el presente etapa (3), el pH durante la fermentación no tiene que controlarse de un modo en particular. En general, a medida que se produce la fermentación en el presente etapa (3), el pH en el material fermentado tiende a caer en el orden de 5.0 o menos.

Aunque normalmente en un microorganismo productor de equol se observa una fuerte tendencia a perder capacidad productiva de equol, en una atmósfera aeróbica y en el orden de un pH de 5.0 o menor, de acuerdo con el presente primer método del procedimiento de producción, el hecho de usar el fermento industrial 1 preparado con los etapas (1) y (2) anteriores para llevar a cabo la fermentación de la etapa final permite la producción de un material fermentado que contiene microorganismos productores de equol en estado de células vivas, por lo cual se mantiene la capacidad de producir equol.

Cuando se usa un medio que contiene soya en polvo como el medio de fermentación principal 1 , se obtiene en último término frijol de soya fermentado que ha de usarse como una bebida o producto comestible, como material fermentado. Asimismo, cuando se emplea un medio que contiene leche de soya como el medio de fermentación principal 1 , la leche de soya fermentada a utilizar como bebida o producto alimenticio se obtiene en último término como un material fermentado. El presente primer método del procedimiento de producción es adecuado para preparar una bebida o productos comestibles de frijol de soya fermentado, es decir, para la preparación de un material fermentado en el cual se ha fermentado un medio que contiene soya en polvo.

El material fermentado obtenido de esta manera contiene un microorganismo productor de equol como una célula viva, en la cual aún se mantiene la capacidad productiva de equol. 2. Procedimiento de producción del material fermentado (segundo método) El presente segundo método para preparar un material fermentado comprende el etapa (I) de preparar un fermento madre (al cual se lo puede denominar en la presente a continuación como "fermento madre 2") y el etapa (II) de llevar a cabo la fermentación, usando el fermento madre 2 con leche como materia prima. En adelante, se describirá el procedimiento de producción de la presente invención etapa a etapa, de un modo detallado.

Etapa (I) En la presente invención, primero se fermenta un microorganismo productor de equol anaeróbicamente, en un medio que contiene una especie de daidzeina (en adelante denominado en la presente como "medio del fermento madre 2"), con el fin de preparar un fermento madre (Etapa (I)).

En la medida que el medio del fermento madre 2 permita que se desarrolle un microorganismo productor de equol y que sea aceptable como un constituyente de una comida, no hay limitación en particular sobre la composición del mismo, lo cual puede establecerse convenientemente de acuerdo con el tipo de material fermentado.

Con referencia a la especie de daidzeina utilizada en el medio del fermento madre 2, si bien se trata de las mismas que se emplean en el medio del fermento madre 1 del primer método anterior, en el presente segundo método del procedimiento de producción, desde el punto de vista de mantener en forma estable la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol, es conveniente un hipocótilo del frijol de soya o un extracto del mismo, y se prefiere particularmente un extracto del hipocótilo del frijol de soya.

La proporción de mezcla de la especie de daidzeina a mezclar en medio del fermento madre 2 es la misma que la del medio del fermento madre 1 usada en el primer método anterior.

También, además de los constituyentes anteriores, el medio del fermento madre 2 puede contener, asimismo, constituyentes aditivos. Los tipos y proporciones de mezcla de otros constituyente aditivos que se pueden mezclar en el medio del fermento madre 2 son los mismos que los que se encuentran en el medio del fermento madre 1 usado en el primer método anterior.

En particular, el medio del fermento madre 2 contiene, convenientemente, constituyentes derivados de la levadura, tales como extracto de levadura e hidrolizado de levadura y agentes promotores de la fermentación,, tales como hidrolizado de suero e hidrolizado de caseína. En el presente segundo método del procedimiento de producción, un constituyente derivado de la levadura, en particular, extracto de levadura, puede mantener de un modo estable la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol. El extracto de levadura generalmente puede agregarse al medio del fermento madre 2 en proporciones de mezcla de, por ejemplo, 0.0125% en peso o más, con preferencia, de 0.05 a 1% en peso y, con mayor preferencia, de 0.1 a 0.2% en peso. Si la concentración del extracto de levadura satisface el intervalo antes mencionado, la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol también puede mantenerse de un modo estable durante un largo periodo en el material fermentado preparado en último término.

Dado que el medio del fermento madre 2 a veces afecta el sabor del material fermentado preparado en último término, los medios de cultivo incluyen, por ejemplo, medios que no afectan negativamente el sabor del material fermentado; los ejemplos incluyen los medios que contienen leche y, según sea necesario, un constituyente lácteo que contenga grasa, además de los constituyentes anteriores. Los tipos y proporciones de mezcla de la leche y de los constituyentes lácteos que contienen grasa mezclados en el medio del fermento madre 2 son los mismos que en el medio de fermentación 2 que se describirá a continuación. Un ejemplo deseable de un medio del fermento madre 2 es aquel que tenga la misma composición que el medio de fermentación principal 2 usado en el etapa (II).

El medio del fermento madre 2 se prepara mezclando, emulsionando según sea necesario y luego esterilizando cantidades dadas de constituyentes aditivos.

En el presente etapa (1), la fermentación anaeróbica de un microorganismo productor de equol puede llevarse a cabo mediante métodos convencionalmente conocidos utilizando sistemas empacados de combustibles gaseosos y tarros anaeróbicos.

Además, en la presente etapa (I) resulta conveniente mantener el pH durante la fermentación anaeróbica en un valor de 4.6 o mayor, con preferencia, de 5.0 a 7.0 y, con mayor preferencia, de 5.5 a 6.5. Al mantener el pH de esta manera, pueden potenciarse los efectos de la presente invención de desarrollar un microorganismo productor de equol sin perder la capacidad productiva de equol y también mantener de un modo estable la capacidad productiva de equol del microorganismo después de la preparación.

El control del pH durante dicha fermentación anaeróbica puede realizarse mediante métodos que son iguales a los empleados en el etapa (1) del primer método anterior.

La fermentación anaeróbica en el presente etapa (I) se lleva a cabo inoculando el medio del fermento madre 2 con el inoculo de un microorganismo productor de equol, y dejando que la mezcla fermente anaeróbicamente en una región de temperaturas que permita el desarrollo del microorganismo, con preferencia, en una región de temperaturas óptimas del microorganismo durante 20 a 28 horas, con mayor preferencia, durante 22 a 26 horas. Específicamente, cuando se usa una bacteria de ácido láctico como el microorganismo productor de equol, basta con fermentar anaeróbicamente a una temperatura de, por ejemplo, 35 a 39 °C durante un lapso de 22 a 26 horas.

El fermento madre 2 obtenido de esta manera contiene un microorganismo productor de equol que se ha desarrollado y que se encuentra en un estado en el cual se mantiene la capacidad productiva de equol.

Etapa (II) A continuación, usando el fermento madre 2 que se obtuvo en el anterior etapa (I), se fermenta un medio que contiene la especie de daidzeina (en adelante denominado en la presente "el medio de fermentación principal 2") en un estado en el cual se mantiene un pH de 4.6 o mayor (que en adelante se puede denominar en la presente como "la fermentación principal") (Etapa (II)).

En el presente etapa (II), mientras que el fermento madre 2 obtenido en el anterior etapa (I) puede agregarse al medio de fermentación principal 2 para llevar a cabo la fermentación principal, cuando se prepara una gran cantidad de producto lácteo fermentado, el fermento madre 2 puede usarse para preparar también un fermento industrial (que en adelante se puede denominar en la presente como "fermento industrial 2"), y el fermento industrial 2 puede agregarse al medio de fermentación principal para realizar la fermentación principal.

Para el medio usado en la preparación del fermento industrial 2 (en adelante denominado "medio de fermento industrial 2"), se emplea un medio que contiene la especie de daidzeína. Al mezclar la especie de daidzeína de esta manera, es posible el desarrollo en un estado que mantiene la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol. Los tipos y proporciones de mezcla de la especie de daidzeína a mezclar en el medio de fermento industrial 2 son los mismos que los empleados en el medio del fermento madre 2 anterior.

No. hay limitación en particular sobre el medio de fermento industrial 2, en la medida que contenga la especie de daidzeína, que permita que se desarrolle un microorganismo productor de equol y que sea aceptable como un constituyente de una comida; y el medio de fermento industrial 2 se establece convenientemente de acuerdo con el tipo de material fermentado.

Los tipos y proporciones de mezcla de los constituyentes aditivos que pueden incorporarse por mezcla además de la especie de daidzeína en el medio de fermento industrial 2 son los mismos que aquellos presentes en el medio del fermento madre 2 anteriormente descritos. Obsérvese que, para poder mantener de un modo estable la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol, resulta conveniente que el medio de fermento industrial 2 también contenga un constituyente derivado de la levadura, en particular, un extracto de levadura. Asimismo, dado que el medio de fermento industrial 2 a veces afecta el sabor del material fermentado, el medio de fermento industrial 2 convenientemente contiene leche y, según sea necesario, un constituyente lácteo que contiene grasa.

Los ejemplos del medio de fermento industrial 2 incluyen, con preferencia, un medio que no influya negativamente en el sabor del material fermentado y, con mayor preferencia, es uno que tiene la misma composición que el medio de fermentación principal 2.

El medio de fermento industrial 2 se prepara mezclando, emulsionando según sea necesario y luego esterilizando cantidades dadas de constituyentes de mezcla.

Para preparar el fermento industrial 2, el fermento madre 2 obtenido en el anterior etapa (I) se incorpora al medio de fermento industrial 2, por ejemplo, en el orden de 1 a 10% en volumen, con preferencia, en el orden de 1 a 5% en volumen; y se deja fermentar en un región de temperaturas que permite el desarrollo del microorganismo, con preferencia en una región óptima de temperaturas del microorganismo durante 20 a 28 horas, con mayor preferencia, durante 22 a 26 horas. Específicamente, cuando se usa una bacteria de ácido láctico como microorganismo productor de equol, basta con fermentar por ejemplo, a 35 a 39°C durante 22 a 26 horas.

En la preparación del fermento industrial 2, si bien la fermentación puede llevarse a cabo en una atmósfera aeróbica o bien, en una atmósfera anaeróbica, desde el punto de vista de bajar los costos de fabricación, por cuestiones de conveniencia operativa y razones similares, es preferible que la ejecución tenga lugar en una atmósfera aeróbica.

Asimismo, en la preparación del fermento industrial 2, si bien no hay limitación en particular con respecto al pH durante la fermentación, conviene mantener un pH de 4.6 o mayor, con preferencia 5.0 a 7.0, y con mayor preferencia, de 5.5 a 6.5. Al mantener el pH de esta manera, el microorganismo productor de equol puede desarrollarse sin perder la capacidad productiva de equol. Dicho control del pH durante fermentación puede llevarse a cabo mediante los mismos métodos que se emplearon en la anterior etapa (I).

Si bien el fermento industrial 2 puede someterse en su estado actual a la siguiente fermentación principal, el fermento industrial 2, según sea necesario, puede usarse como un fermento (como el fermento industrial primario), llevándose a cabo la fermentación una vez más en las mismas condiciones que las empleadas para el fermento industrial 2, a fin de preparar un fermento industrial secundario, y luego, el fermento industrial secundario puede someterse a la siguiente fermentación principal.

No hay limitación en particular con respecto al medio de fermentación principal 2 usado en la presente etapa (II), en la medida que el medio de fermentación principal 2 contenga la especie de daidzeína y leche, permita que se desarrolle un microorganismo productor de equol, y que sea aceptable como un constituyente de una comida.

La especie de daidzeína usada en el medio de fermentación principal 2 es la misma que aquella empleada en el medio del fermento madre 1 del primer método anterior. No obstante, desde el punto de vista de mantener en forma estable la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol, en el presente segundo método del procedimiento de producción, resulta conveniente un hipocótilo del frijol de soya o un extracto del mismo, y conviene particularmente el extracto del hipocótilo del frijol de soya.

Las proporciones de mezcla de la especie de daidzeína a incorporar en el medio de fermentación principal 2 son las mismas que las empleadas en el medio del fermento madre 2 anterior.

Asimismo, como leche empleada en el medio de fermentación principal 2, basta que se trate de una leche aceptable como producto alimenticio. Los ejemplos de dicha leche incluyen las leches de origen animal, tales como la leche de vaca, la leche de cabra y la leche de oveja; la leche descremada; la leche reconstituida obtenida por disolución de leche en polvo sin contenido graso o leche en polvo entera y similares.

Además, en el medio de fermentación principal 2, con el propósito de mejorar el sabor del material fermentado preparado, el medio de fermentación principal 2 puede contener un constituyente lácteo que contenga grasas, como por ejemplo crema fresca y manteca. Los ejemplos generales de las proporciones de mezcla de estos constituyentes lácteos que contienen grasas convertidos en la cantidad de grasa de leche son 0.1 a 4.5% en peso, con preferencia, 0.5 a 4.2% en peso y, con mayor preferencia, 1.0 a 3.5% en peso.

También, los tipos y proporciones de mezcla de los constituyentes aditivos que pueden mezclarse en el medio de fermentación principal 2, además de los constituyentes anteriores, son los mismos que aquellos usados en el medio del fermento madre 2 antes citado. Obsérvese que, para mantener de un modo estable la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol, resulta conveniente que el medio de fermentación principal 2 también contenga un constituyente derivado de la levadura, en particular extracto de levadura.

El medio de fermentación principal 2 se prepara mezclando, emulsionando según sea necesario y luego esterilizando, respectivamente, una cantidad dada de leche, la especie de daidzeína y de acuerdo con las necesidades del caso, otros aditivos constituyentes.

Para la fermentación principal en el presente etapa (II), basta con agregar el fermento madre 2 obtenido en el anterior etapa (I) o el fermento industrial 2 mencionado con anterioridad al medio de fermentación principal 2, por ejemplo, en el orden de 1 a 10% en volumen, con preferencia, de 1 a 5% en volumen y agitar o dejar en reposo la mezcla en una región de temperaturas que permita el desarrollo del microorganismo, con preferencia en una región óptima de temperaturas del microorganismo durante 20 a 28 horas, con mayor preferencia, durante 22 a 26 horas. Específicamente, cuando se usa una bacteria de ácido láctico como microorganismo productor de equol, es suficiente fermentar por ejemplo, a 35 a 39 °C durante 22 a 26 horas.

Si bien la fermentación principal en el presente etapa (II) puede llevarse a cabo en una atmósfera aeróbica o bien, en una atmósfera anaeróbica, desde el punto de vista de bajar los costos de fabricación, por cuestiones de conveniencia operativa y razones similares, es preferible realizarla en una atmósfera aeróbica.

Asimismo, en la fermentación principal en la presente etapa (II), el pH durante la fermentación se mantiene en un valor de 4.6 o más, con preferencia, en un valor de 5.0 a 7.0 y, con mayor preferencia, de 5.5 a 6.5. Al mantener el pH de esta manera, un microorganismo productor de equol puede desarrollarse sin perder la capacidad productiva de equol, y la capacidad productiva de equol del microorganismo puede mantenerse de un modo estable aun después de la preparación. El control del pH durante dicha fermentación anaeróbica puede efectuarse mediante métodos iguales a los de la etapa (I).

En el presente segundo método del procedimiento de producción, se prepara leche fermentada como el material fermentado. El material fermentado contiene un microorganismo productor de equol en estado de una célula viva sin perder la capacidad productiva de equol. 3. Producto fermentado Además, la presente invención provee un producto fermentado que contiene el material fermentado obtenido en el primer método y el segundo método anteriores. Es decir, los materiales fermentados obtenidos en el primer método y en el segundo método anteriores pueden proporcionarse como productos fermentados en su estado actual o, según sea necesario, mezclando constituyentes aditivos tales como, por ejemplo, edulcorantes tales como sacarosa, sucralosa y estevia; saboreantes, tales como extracto de café y extracto de té negro; aroma; constituyentes derivados de vegetales tales como soya en polvo, fragmentos de frijol de soya, jugo de frutas, fragmentos de frutas, jugo de verduras y fragmentos de verduras; metales, tales como sodio, potasio, calcio, zinc y hierro; vitaminas, tales como ácido ascórbico; agentes gelificantes; estabilizantes, tales como ácido glucónico y diluyentes tales como agua. Por sobre todas las cosas, el material fermentado obtenido mediante el primer método antes descrito se provee, convenientemente, como un producto fermentado mezclado con una solución acuosa que contiene soya en polvo.

En el presente producto fermentado, no hay límite en particular con respecto a las proporciones de mézcla de los materiales fermentados obtenidos en el primer método y en el segundo método anteriores; por ejemplo, las proporciones de mezcla pueden ser del 5 al 100% en peso, con preferencia, del 10 al 100% en peso.

No hay límite en particular con respecto al pH del presente producto fermentado. Por ejemplo, si el enfoque está en mantener de un modo estable la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol dentro del producto fermentado durante un período prolongado, resulta conveniente que el pH se ajuste a un valor de 4.6 o mayor, con preferencia, en un valor de 5.0 a 7.0 y, con mayor preferencia, del 5.5 al 6.5. Por otra parte, siendo que la proliferación de las bacterias contaminantes en la región neutral es una preocupación, si el enfoque se centra en suprimir la proliferación de bacterias contaminantes, resulta conveniente que el pH se ajuste a un valor de 5.0 o menor, con preferencia, de 4.0 a 4.8 y, con mayor preferencia, de 4.2 a 4.6.

La morfología del presente producto fermentado se determina por el tipo de medio de fermentación principal empleado en el momento de la preparación, el tipo del material fermentado obtenido en el primer método o el segundo método anteriores, el tipo de aditivo constituyente mezclado en el material fermentado y similares; y puede adoptar cualquiera de las siguientes formas: liquida, semisólida, sólida o en gel. Los ejemplos deseables de morfología del presente producto fermentado incluyen bebidas y comidas de frijol de soya fermentado, bebidas y comidas de leche de frijol de soya fermentada, leche fermentada y productos similares. Aquí, la leche fermentada incluye el yogur (del tipo firme, del tipo blando y del tipo bebible), bebidas con bacterias de ácido láctico y similares.

Dado que el presente producto fermentado contiene un microorganismo productor de equol en estado de una célula viva, la distribución y las ventas a bajas temperaturas resultan convenientes.

Como el presente producto fermentado contiene un microorganismo productor de equol que mantiene la capacidad productiva de equol aún en estado de una célula viva, pueden expresarse diversas actividades biológicas y farmacológicas, según el microorganismo. En consecuencia, el presente producto fermentado puede utilizarse específicamente en bebidas y comidas saludables, bebidas y comidas como suplementos dietarios, bebidas y comidas funcionales, bebidas y comidas para personas enfermas y similares, además de las bebidas y comidas en general.

Por ejemplo, como el presente producto fermentado, cuando se consume, permite que se genere el equol por la acción del microorganismo productor de equol en los intestinos, y permite que las actividades biológicas de equol se reciban efectivamente, el presente producto fermentado es de utilidad en aplicaciones tales como, por ejemplo: la prevención o tratamiento de enfermedades y síntomas tales como trastornos menopáusicos, osteoporosis, hipertrofia prostética y síndrome metabólico; reducción de los valores sanguíneos de colesterol; blanqueo de la piel; mejora del acné; regulación intestinal; mejora de la obesidad y diuresis. Entre ellos, el presente producto fermentado resulta de particular utilidad en la prevención o mejora de afecciones indefinidas o en síntomas asociados con la menopausia (por ejemplo, osteoporosis, trastornos menopáusicos y similares) en mujeres de mediana edad y mayores.

Si bien la ingesta diaria del presente producto lácteo fermentado varía de acuerdo con el recuento celular del microorganismo productor de equol en el presente producto lácteo fermentado, la edad y el peso corporal del consumidor, el número de ingestas y similares, la ingesta diaria del adulto puede ser, por ejemplo, una cantidad que corresponda a 10 a 500 g del presente producto fermentado. 4. Composición que contiene el microorganismo productor de equol Mediante el agregado de al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en ácido ascórbico, derivados del mismo y sales del mismo a la composición que contiene un microorganismo productor de equol en estado de una célula viva, es posible mantener la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol de un modo estable, incluso a bajo pH o en condiciones de almacenamiento aeróbico; por otra parte, puede suprimirse la pérdida de la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol en la composición, incluso si se conserva durante un período prolongado. De este modo, la presente invención provee, asimismo, una composición que contiene un microorganismo productor de equol (que en adelante se puede denominar simplemente "la presente composición"), que contiene un microorganismo productor de equol en estado de una célula viva (que en adelante se puede denominar en la presente, simplemente el "constituyente (A)"), así como también, al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en ácido ascórbico, derivados del mismo y sales del mismo (que en adelante se puede denominar simplemente "constituyente (B)").

En la presente composición, pueden usarse células vivas aisladas o purificadas en bruto de un microorganismo productor de equol, como el microorganismo productor de equol; asimismo, también se puede utilizar un material fermentado, que se ha fermentado empleando un microorganismo productor de equol.

Si bien no hay limitación en particular con respecto a la concentración del microorganismo productor de equol contenido en la presente composición, los ejemplos de la concentración incluyen 1x105 a 1010 cfu/g, con preferencia, 1x106 a 100 cfu/g y, con mayor preferencia, 1x107 a 1010 cfu/g.

En la presente composición, el constituyente (B) se mezcla para mantener de un modo estable la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol. Entre los constituyentes (B), no hay limitación en particular con respecto a los derivados de ácido ascórbico, siempre y cuando tengan un sustituyente unido al ácido ascórbico mediante una unión éster o una unión éter y estén permitidos como constituyentes de una comidas; los ejemplos específicos incluyen: 2,6-dipalmitato de ascorbilo, 6-estearato de ascorbilo, 2-fosfato de ascorbilo, 2-sulfato de ascorbilo, 2-glucósido de ascorbilo, glucosamina de ascorbilo, 6-palmitato de ascorbilo, tetra-isopalmitato de L-ascorbilo, tetra-2-hexil-decanoato de ascorbilo y similares. Asimismo, los ejemplos de las sales de ácido ascórbico y derivados del mismo, aunque no tienen limitaciones particulares, siempre y cuando sean aceptables como constituyentes de una comida, incluyen las sales de metales alcalinos, tales como las sales de metales alcalinos de sodio. Los ejemplos convenientes entre los constituyentes (B) incluyen el ácido ascórbico y las sales del mismo. En la presente composición, los constituyentes (B) pueden usarse solos o en combinación.

Los ejemplos generales de las proporciones de mezcla de los constituyentes (B) anteriores en la presente composición incluyen 0.05 a 5% en peso, con preferencia, 0.05 a 2% en peso, y, con mayor preferencia, 0.1 a 2.0% en peso. Al satisfacer dichas proporciones de mezcla, la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol puede retenerse de un modo estable.

Tampoco hay limitaciones particulares respecto del pH de la presente composición, que se establece convenientemente de acuerdo con el tipo de la presente composición. Desde el punto de vista de suprimir la proliferación de bacterias contaminantes en la presente composición, resulta conveniente que el pH se ajuste en 5.0 o menos, con preferencia, en un valor de 4.0 a 4.8 y, con mayor preferencia, de 4.2 a 4.6. Aunque la tendencia de un microorganismo productor de equol de perder su capacidad productiva de equol generalmente se fortalece en un ambiente de pH de 5.0 o menor, después de lo cual la capacidad productiva de equol ya no puede mantenerse de un modo estable, de acuerdo con la presente composición, la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol puede mantenerse de un modo estable aun en condiciones en las cuales el pH es de 5.0 o menor, debido a la acción del ácido ascórbico y/o derivado del mismo.

La presente composición puede contener, según sea necesario, constituyentes aditivos tales como, por ejemplo, edulcorantes, tales como sacarosa, sucralosa y estevia; saborizantes tales como extracto de café y extracto de té negro; aroma; constituyentes derivados de vegetales tales como jugo de frutas, fragmentos de frutas, jugo de verduras y fragmentos de verduras; metales, tales como sodio, potasio, calcio, zinc y hierro; vitaminas, tales como ß-caroteno; agentes gelificantes; estabilizantes, tales como ácido glucónico y diluyentes, tales como agua. Aquí, los constituyentes aditivos a mezclar en la presente composición con preferencia son los que no son utilizados por el microorganismo productor de equol para no perder estabilidad durante el almacenamiento.

Tampoco hay una limitación en particular con respecto a la morfología de la presente composición, la cual puede estar en forma líquida, en forma semisólida, en forma sólida o en gel.

Un ejemplo de una morfología deseable de la presente composición reside en un producto fermentado obtenido mediante la incorporación de ácido ascórbico y/o un derivado del mismo y, de ser necesario, otros constituyentes aditivos a un material fermentado que se fermentó utilizando un microorganismo productor de equol. Aquí, los ejemplos del material fermentado, que se fermentó utilizando un microorganismo productor de equol incluyen, con preferencia, los materiales fermentados preparados mediante el primer método y el segundo método anteriores. Asimismo, los ejemplos específicos del producto fermentado incluyen bebidas y comidas de frijol de soya fermentado, bebidas y comidas de leche de soya fermentada, leche fermentada y similares. Aquí, la leche fermentada incluye yogur (del tipo firme, del tipo blando y del tipo bebible), bacterias de ácido; láctico bebida y similares. Entre estos, los productos fermentados preferidos son una bebida y una comida de frijoles de soya fermentados y una bebida y una comida de leche de soya fermentada y, con mayor preferencia, una bebida y una comida de frijoles de soya fermentados.

Asimismo, otro ejemplo preferido de la morfología de la presente composición está representado por una composición que contiene células vivas aisladas o purificadas en bruto de un microorganismo productor de equol, ácido ascórbico y/o un derivado del mismo, portadores comestibles, así como también, otros constituyentes aditivos, según sea necesario. Los ejemplos de portadores comestibles incluyen una solución acuosa que contiene soya en polvo, leche de soya, agua, gel comestible, leche, diversas soluciones de sal y similares.

Dado que el presente producto fermentado contiene un microorganismo productor de equol en estado de una célula viva, resulta conveniente que la distribución y las ventas se realicen a baja temperatura.

Como la presente composición contiene un microorganismo productor de equol en un estado que mantiene la capacidad productiva de equol incluso como una célula viva, pueden expresarse diversas actividades biológicas y actividades farmacológicas, según el microorganismo. En consecuencia, la presente composición puede usarse en los campos de la medicina o de las bebidas y comidas.

Cuando la presente composición se emplea en el campo de las bebidas y las comidas, la presente composición se provee como bebidas y comidas específicas para la salud, bebidas y comidas como suplementos dietarios, bebidas y comidas funcionales, bebidas y comidas para personas enfermas y similares, además de cómo bebidas y comidas generales.

Por ejemplo, como la presente composición, cuando se consume, permite la generación de equol mediante la acción del microorganismo productor de equol en los intestinos y permite que los individuos se beneficien efectivamente a partir de las actividades biológicas y de las actividades farmacológicas del equol, la presente composición con preferencia, es empleada por personas que buscan el beneficio de la acción del equol en los campos de la medicina o de las bebidas y comidas. Específicamente, la presente composición es de utilidad en aplicaciones tales como, por ejemplo, la prevención o el tratamiento de enfermedades y síntomas tales como trastornos menopáusicos, osteoporosis, hipertrofia prostética y síndrome metabólico; reducción de los valores sanguíneos de colesterol; blanqueo de la piel; mejora del acné; regulación intestinal; mejora de la obesidad; y diuresis. Entre ellas, la presente composición es de particular utilidad en la prevención o en la mejora de afecciones indefinidas o síntomas vinculados con la menopausia (por ejemplo, osteoporosis, trastornos menopáusicos y similares) en mujeres de mediana edad y mayores.

Si bien la ingesta diaria de la presente composición varía según el recuento celular del microorganismo productor de equol en el presente producto lácteo fermentado, según la edad y el peso corporal del consumidor, según la cantidad de ingestas y similares, un ejemplo de una ingesta diaria para un adulto es una cantidad correspondiente a 10 a 500 g de la presente composición.

Asimismo, como se ha descrito anteriormente, mediante el agregado del constituyente (B) anterior a la composición que contiene un microorganismo productor de equol en estado de una célula viva, puede retenerse la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol de un modo estable y puede suprimirse la pérdida de la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol, aún si se almacena durante un período prolongado. En consecuencia, la presente invención provee, asimismo, un método para mantener la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol que comprende agregar al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en ácido ascórbico, derivados del mismo y sales del mismo a la composición que contiene un microorganismo productor de equol en estado de una célula viva. La capacidad productiva de equol se mide de acuerdo con el método que se describe en los siguientes ejemplos. Como formas de modalidad específicas del método de estabilización durante el almacenamiento, se adoptan los contenidos de la descripción de la composición que contiene el microorganismo productor de equol antes mencionada.

EJEMPLOS En adelante la presente invención se describirá de un modo detallado, basándose en ejemplos; sin embargo, la presente invención no se limita a estos ejemplos.

La soya en polvo usada en los siguientes ejemplos y ejemplos comparativos se preparó empleando el método explicado a continuación.

Preparación de la solución de soya en polvo Unos frijoles de soya desvainados se pelaron, se dividieron en mitades y se sometieron a un tratamiento con vapor. El tratamiento con vapor siguió enviando vapor contra los frijoles de soya desvainados hasta que se alcanzó una temperatura de 100 °C, después de lo cual la temperatura se mantuvo a 00 °C durante 140 segundos. Después del tratamiento con vapor, los frijoles de soya se convirtieron en laminillas después de pasar entre los rodillos de un molino de rodillos. Con posterioridad, los frijoles de soya en forma de laminillas se secaron con aire caliente, a una temperatura de 80 °C, hasta que el contenido de humedad quedó en el orden de 3 al 6%; y las laminillas se molieron con una trituradora por aire, para obtener soya en polvo. La molienda con la trituradora por aire se realizó de manera tal que el porcentaje de partículas molidas con un diámetro de 150 µ?t? o mayor fuera del 10% o menos.

Luego, se agregó una cantidad predeterminada de soya en polvo obtenida como se describió anteriormente a cantidades adecuadas de carbonato de hidrógeno sódico y citrato trisódico, se disolvió en agua, se dispersó y se disolvió y se permitió que se expandiera durante 15 minutos o más tiempo. A continuación, la solución obtenida se calentó a 95 °C durante 10 minutos, para extraer constituyentes hidrosolubles en la soya en polvo, así como también, para inactivar las enzimas tales como LOX y el inhibidor de la tripsina contenido en la soya en polvo. Después de calentar, mientras se mantuvo una temperatura de 80 °C o mayor, se agregó una cantidad adecuada de ácido cítrico para revertir el pH a neutro. Posteriormente, se llevó a cabo el tratamiento de homogenización usando un homogenizador (LAB40 fabricado por GAULIN), en condiciones variables en el intervalo de 200-1 ,000 kgf/cm2, para preparar una solución de soya en polvo (que contenía 14% en peso de soya en polvo en peso seco).

EJEMPL0 1 Preparación de una comida de frijoles de soya fermentados mediante el primer método y evaluación de la comida de frijoles de soya fermentados 1. Preparación de la comida de frijoles de soya fermentados Se usó el Lactococcus garvieae (cepa Lactococcus 20-92, FERM BP-10036), que tiene capacidad productiva de equol, para llevar a cabo la preparación del fermento madre, la preparación del fermento industrial, la fermentación principal, y el llenado del envase, en las siguientes condiciones.

Preparación del fermento madre Se preparó un medio de fermento madre mediante la esterilización en autoclave (121 °C, 15 minutos) de 100 mi de una solución (pH 7.48) que contenía: 80% en peso de una solución de soya en polvo (la cual contenía 14% soya en polvo en peso seco); 0.1% en peso de glucosa; 0.1 % en peso de L-arginina y el resto de agua purificada. Este medio de fermento se inoculó con un inoculo de la cepa Lactococcus 20-92 y se llevó a cabo un cultivo anaeróbico con un sistema empacado de combustibles gaseosos a 37 °C, durante 96 horas, para obtener un fermento madre (pH 6.64).

Preparación del fermento industrial Se preparó un medio de fermento industrial mediante esterilización en autoclave (121 °C, 15 minutos), de 5 L de una solución (pH 7.48) que contenía: 80% en peso de solución de soya en polvo (que contenía 14% soya en polvo en peso seco); 0.1% en peso de glucosa; 0.1% en peso de L-arginina y el resto de agua purificada. Este medio de fermento se inoculó con el fermento madre obtenido antes a un volumen del 1% y se llevó a cabo un cultivo estacionario a 37 °C, durante 15 horas, en condiciones aeróbicas, para obtener un fermento industrial (pH 6.72).

Fermentación principal El medio de fermentación principal se preparó esterilizando 200 L de una solución (pH 6.78) que contenía: 50% en peso de solución de soya en polvo (la cual contenía 14% soya en polvo en peso seco); 6% en peso de jugo de zanahorias (Miyazaki Nokyokaju); 6% en peso de pasta de zapallo (Nagano Sanyo Foods) y el resto de agua purificada, con un esterilizador de doble tubo, a 95 °C, durante 30 segundos. El medio de fermentación principal recuperado después de la esterilización se inoculó con 4 L del fermento industrial obtenido antes, y se llevó a cabo un cultivo estacionario a 37 °C, durante 15 horas, en condiciones aeróbicas para obtener una solución de frijol de soya fermentado (pH 4.56).

Mezcla de materias primas secundarias y llenado del envase Se obtuvo una solución de materias primas secundarias esterilizando 800 L de una solución que contenía: 65% en peso de solución de soya en polvo (la cual contenía 14% soya en polvo en peso seco); 7.4% en peso de azúcar; 1.0% en peso de la formulación FG2524 de agente gelificante (fabricado por Nitta Gelatin); 0.8% en peso de ácido glucónico; 0.4% en peso de aroma; 0.1 % en peso de ácido L-ascórbico y el resto de agua purificada, con un esterilizador de doble tubo, a 95 °C, durante 30 segundos. Se obtuvieron 80 partes en peso de la solución de materias primas secundarias, y 20 partes en peso de la solución de frijol de soya fermentado antes obtenida se mezclaron a una temperatura de 37 a 40 °C. Mientras se mantenía la temperatura de la solución mezclada, un vaso de polietileno (capacidad total de 130 mi, diámetro de la boca 71 mm) se llenó con 100 g de la solución en forma estéril y se selló con una tapa de aluminio. El material se colocó dentro de un refrigerador a 5 °C y se solidificó por enfriamiento para obtener una comida de frijoles de soya fermentados que contenía células vivas de la cepa Lactococcus garvieae 20-92. 2. Diversas evaluaciones La comida de frijoles de soya fermentados sellada antes obtenida se almacenó a 10 °C, durante 3 semanas. El pH de la comida de frijoles de soya fermentados se midió inmediatamente después de la preparación, 1 semana después de la preparación, 2 semanas después de la preparación y 3 semanas después de la preparación; además, el recuento celular del Lactococcus garvieae contenido en la comida de frijoles de soya fermentados, y la presencia o ausencia de la capacidad productiva de equol del Lactococcus garvieae contenido en la comida de frijoles de soya fermentados fueron evaluados por los siguientes métodos. Además, el recuento celular del Lactococcus garvieae y la capacidad productiva de equol del Lactococcus garvieae de cada del fermento madre y del fermento industrial que se preparó con anterioridad y el producto fermentado después de la fermentación principal se midieron de la misma manera.

Medición del recuento celular del Lactococcus garvieae Se determinó la medición del recuento de células viables del Lactococcus garvieae efectuando un cultivo por vertido usando un medio de agar con recuento de placas con agregado de BCP (fabricado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), a 37 °C, durante 72 horas y midiendo el número de colonias desarrolladas.

Medición de la presencia o ausencia de la capacidad productiva de equol del Lactococcus garvieae Se agregaron 200 µ? de comida de frijoles de soya fermentados a 5 mi de caldo de GAM modificado, que contenía daidzeína en una concentración de 10 µg/ml (fabricada por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), para llevar a cabo un cultivo anaeróbico a 37 °C, durante 96 horas con un sistema empacado de combustibles gaseosos. Luego, la solución del cultivo obtenida se sometió a un análisis por HPLC, para determinar la cantidad de equol presente en la solución del cultivo. El análisis por HPLC se efectuó de la siguiente manera. Primero se agregaron 0.5 mi de la solución del cultivo a 5.0 mi de acetato de etilo para llevar a cabo la extracción osmótica; el extracto obtenido se centrifugó a 3000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se sometió a evaporación para solidificar el solvente por secado, a presión reducida. Luego, el sólido obtenido se volvió a disolver en 1 .0 mi de solvente (fase móvil A/ fase móvil B = 50/50) a utilizar como un espécimen de HPLC. Se usó la serie D7000 (fabricada por Hitachi) para el análisis por HPLC y Capcéll Pack UGL, 205 µp? 4.6 F ? 250 mm (fabricada por Shiseido) como columna. Para la fase móvil, se empleó una solución que comprendía una solución de tampón de fosfato al 0.05% (que contenía EDTA) y acetato de etilo-metanol (1 : 10) mezclado en una relación de 8:2 como la fase móvil A, y metanol con contenido de acetato de etilo al 2% como la fase móvil B. La velocidad de flujo era de 1 .0 ml/minuto por el método de gradientes. Se usó un detector SPD-10AVP UV-VIS para la detección y las longitudes de onda de detección fueron de 254 nm y 280 nm.

Resultados de la medición de recuento celular y de la capacidad productiva de equol del Lactococcus gan/ieae Los resultados de la medición se muestran en el Cuadro 1. Los resultados revelan que si el pH del fermento madre y del fermento industrial era de 5 o mayor, aún si el pH del producto fermentado después de la fermentación principal y de la comida de frijoles de soya fermentados era de 4.6 o menor, era posible preparar una comida de frijoles de soya fermentados que contuviera Lactococcus gan/ieae, reteniendo la capacidad productiva de equol. Cabe destacar que, según se observó, el recuento celular por sí mismo del Lactococcus gan/ieae en la comida de frijoles de soya fermentados, se mantenía constante durante un período prolongado, viéndose escasamente afectado por el pH o la presencia o ausencia de la capacidad productiva de equol.

CUADRO 1 Evaluación del sabor La comida de frijoles de soya fermentados inmediatamente después de la preparación y la comida de frijoles de soya fermentados después de 3 semanas de almacenamiento fueron satisfactorias como comidas, con un buen sabor del frijol de soya y sin gustos ni olores extraños.

EJEMPLO COMPARATIVO 1 Preparación de una comida de frijoles de soya fermentados y evaluación de la comida de frijoles de soya fermentados La preparación del fermento madre, la preparación del fermento industrial y la fermentación principal para preparar una comida de frijoles de soya fermentados (Ejemplo comparativo 1-1) se llevaron a cabo en las mismas condiciones que en el Ejemplo 1 , salvo que la cantidad de glucosa agregada se modificó de 0.1 % en peso a 1.0% en peso, en la preparación del fermento madre.

Además, la preparación del fermento madre, la preparación del fermento industrial y la fermentación principal para preparar una comida de frijoles de soya fermentados (Ejemplo comparativo 1-2) se llevaron a cabo en las mismas condiciones que en el Ejemplo 1 , salvo que la cantidad de glucosa agregada se modificó de 0.1 % en peso a 1.0% en peso en la preparación del fermento industrial.

El pH, el recuento celular de la cepa Lactococcus garvieae 20-92 y la presencia o ausencia de la capacidad productiva de equol de la comida de frijoles de soya fermentados de los Ejemplos comparativos 1-1 y 1-2 se evaluaron igual que en el Ejemplo 1. Asimismo, el recuento celular de la cepa Lactococcus garvieae 20-92 y la presencia o ausencia de capacidad productiva de equol también se midieron del mismo modo que para el fermento madre, el fermento industrial y la fermentación principal solución.

Los resultados se muestran en el Cuadro 2. En el Ejemplo comparativo 1-1 , que empleó un medio en el cual el pH se reduce en la preparación del fermento madre, aunque no se observaron diferencias en el recuento celular de la cepa del Lactococcus garvieae 20-92, la capacidad productiva de equol se perdió. De un modo similar, en el posterior fermento industrial, la preparación de la solución de fermentación principal y la preparación de la comida de frijoles de soya fermentados, aunque no se observaron grandes diferencias respecto del Ejemplo 1 en el recuento celular, en el pH y en los aspectos sensoriales, la capacidad productiva de equol no mejoró. Asimismo, al igual que con el Ejemplo comparativo 1-1 , que empleó un medio en el cual el pH se reduce durante la preparación del fermento industrial, aunque no observaron diferencias en el recuento celular de la cepa del Lactococcus garvieae 20-92, la capacidad productiva de equol se perdió. De un modo similar, en la posterior fermentación principal y preparación de la comida de frijoles de soya fermentados, aunque no se observaron grandes diferencias en el recuento celular, en el pH y en los aspectos sensoriales, la capacidad productiva de equol no mejoró.

CUADRO 2 Recuento celular del Capacidad Eva|uación PH productiva sensorial garvieae de equol*1 (CFU/ml) Fermento madre 4.51 6.8x10° Fermento 6.73 7.2x10" industrial Producto Ejemplo fermentado comparativo después de la 4.55 6.2x1 ?' 1-1 fermentación Comida de frijoles de soya 4.56 1.3?108 Satisfactoria fermentados Fermento madre 6.72 8.2x108 0 - Fermento 4.52 7.9x108 - industrial Producto Ejemplo fermentado comparativo después de la 4.54 5.8x101 1-2 fermentación principal Comida de frijoles de soya 4.55 1.8x10' Satisfactoria fermentados *1 La capacidad productiva del equol se midió con n = 2, y la determinación fue ? cuando sólo se observó una instancia de la capacidad productiva de equol, O cuando la capacidad productiva de equol se observó en ambos casos y ? cuando no se observó capacidad productiva de equol.

EJEMPLO 2 Preparación de leche fermentada mediante el segundo método y evaluación de la leche fermentada 1. Preparación de leche fermentada Se usó la cepa del Lactococcus garvieae {Lactococcus 20-92, FERM BP-10036), que tiene capacidad productiva de equol, para llevar a cabo la preparación del fermento madre, la preparación del fermento industrial, la fermentación principal y el llenado del envase en las siguientes condiciones.

Preparación del fermento madre Se preparó un medio del fermento madre mediante esterilización en autoclave (1 15 °C, 15 minutos) de 500 mL de una solución (pH 6.14) que contenía: 10% en peso de leche deshidratada descremada; 6.67% en peso de crema fresca; 0.1 % en peso de extracto de levadura ("SK Yeast Extract Hi-K", Nippon Paper Chemicals Co., Ltd.); 0.025% en peso de extracto del hipocótilo del frijol de soya ("Soya Flavone HG", Fuji Oil Co., Ltd.. El contenido de la especie de daidzeina en el extracto del hipocótilo del frijol de soya es de aproximadamente 37% en peso) y el resto de agua purificada. Este medio del fermento se inoculó con un inoculo de la cepa Lactococcus 20-92, y se llevó a cabo un cultivo anaeróbico con un sistema empacado de combustibles gaseosos at 37 °C, durante 24 horas, para obtener un fermento madre.

Preparación del fermento industrial Se preparó un medio del fermento industrial por esterilización UHT {Ultra High Temperature, a temperatura ultra alta) (140 °C, 4 segundos) de 10 L de una solución que contenía: 10% en peso de leche deshidratada descremada; 6.67% en peso de crema fresca; 0.1% en peso de extracto de levadura ("SK Yeast Extract Hi-K", Nippon Paper Chemicals Co., Ltd.), 0.025% en peso de extracto del hipocótilo del frijol de soya ("Soya Flavone HG", Fuji Oil Co., Ltd.) y el resto de agua purificada. El medio del fermento industrial recuperado después de la esterilización UHT se inoculó con el fermento madre antes obtenido, a una cantidad de 1% v/v, y se llevó a cabo un cultivo aeróbico, a 37 °C, durante 24 horas para obtener un fermento industrial.

Fermentación principal El medio de fermentación principal se preparó por esterilización UHT {Ultra High Temperature, a temperatura ultra alta) (140 °C, 4 segundos) de 10 L de una solución que contenía: 10% en peso de leche deshidratada descremada; 6.67% en peso de crema fresca, 0.1% en peso de extracto de levadura ("SK Yeast Extract Hi-K", Nippon Paper Chemicals Co., Ltd.), 0.025% en peso de extracto del hipocótilo del frijol de soya ("Soya Flavone HG", Fuji Oil Co., Ltd.) y el resto de agua purificada. El medio de fermentación principal recuperado después de la esterilización UHT se inoculó con el fermento industrial antes obtenido, a una cantidad de 1 % v/v, y se llevó a cabo un cultivo aeróbico a 37 °C, durante 24 horas, para obtener un leche fermentada.

Llenado del envase La leche fermentada obtenida mediante la fermentación principal anterior se introdujo en un recipiente esterilizado, que tenía una capacidad de 600 mL, en forma estéril, y luego se introdujo una cantidad dada de ácido láctico en el recipiente de un modo estéril; después de mezclar, el envase se selló. 2. Evaluación de la capacidad productiva de equol del Lactococcus garvieae contenido en la leche fermentada Cada una de las leches fermentadas selladas antes obtenidas se almacenó a 10 °C, durante 74 semanas. El pH de la leche fermentada se midió inmediatamente después de la preparación, 2 semanas después de la preparación, 6 semanas después de la preparación, y 74 semanas después de la preparación; además, el recuento celular del Lactococcus garvieae contenido en la leche fermentada y la presencia o ausencia de la capacidad productiva de equol del Lactococcus garvieae contenido en la leche fermentada se evaluaron por métodos ¡guales a los empleados n el Ejemplo 1. Asimismo, el recuento celular del Lactococcus garvieae y la capacidad productiva de equol del Lactococcus garvieae contenido en la leche fermentada también se midieron para el fermento madre y para el fermento industrial que se prepararon con anterioridad.

Los resultados se presentan en el Cuadro 3. Estos resultados revelan que cuando el pH de la leche fermentada era de 4.6 o mayor, podía prepararse una leche fermentada con contenido del Lactococcus garvieae capaz de retener la capacidad productiva de equol. Asimismo, se observó que se retenía de un modo estable la capacidad productiva de equol del Lactococcus garvieae durante 2 semanas si el pH de la leche fermentada era de 5.28 o mayor, durante 6 semanas si el pH de la leche fermentada era de 5.79 o mayor y por 74 semanas, si el pH de la leche fermentada era de 5.92 o mayor. Por otro lado, se reveló que la capacidad productiva de equol del Lactococcus garvieae se perdía cuando el pH de la leche fermentada era de 4.09 y 3.53, incluso inmediatamente después de la preparación. Obsérvese que el recuento celular propiamente dicho del Lactococcus garvieae en la leche fermentada se mantuvo constante durante un período prolongado, viéndose escasamente afectado por el pH o la presencia o ausencia de la capacidad productiva de equol.

CUADRO 3 #1 La capacidad productiva del equol se midió con n = 3, y la determinación fue ? cuando la capacidad productiva de equol no se observó en la totalidad de los tres casos, y O cuando la capacidad productiva de equol se observó en los tres casos.

Evaluación del gusto La fermentación leche (sin agregados de ácido láctico) inmediatamente después de la preparación y la fermentación leche (sin agregados de ácido láctico) después de 74 semanas de almacenamiento fueron satisfactorias como comidas, sin acidez y además, presentando facilidad para bebería.

EJEMPLO 3 Preparación de leche fermentada mediante el segundo método y evaluación de la leche fermentada La preparación del fermento madre, la preparación del fermento industrial y la fermentación principal se llevaron a cabo en las mismas condiciones que en el anterior Ejemplo 2, salvo que se usaron el medio del fermento madre, el medio del fermento industrial y el medio de fermentación principal, aquellos preparados agregando cantidades dadas de los agentes promotores de la fermentación que se muestran en el Cuadro 4 a un medio basado en la composición descrita a continuación.

Composición del medio Leche deshidratada descremada: 10% en peso. Crema fresca: 6.67% en peso.

Extracto del hipocótilo del frijol de soya ("Soya Flavone HG", Fuji Oil Co., Ltd.): 0.025% en peso.

Agente promotor de la fermentación mostrado en el Cuadro 2. Concentración que se muestra en el Cuadro 2.

Agua purificada: resto.

Total: 100% en peso.

CUADRO 4 El producto con el nombre "SK yeast extract Hi-K" (fabricado por Nippon Paper Chemicals Co., Ltd.) se usó para el extracto de levadura.

"FE135" (fabricado por DMV Japón) se usó para el hidrolizado de suero.

"FE150" y "FE135" (fabricado por DMV Japón) se usaron para el hidrolizado de caseína/levadura.

Se introdujeron 500 g de leche fermentada obtenida de esta manera en un recipiente esterilizado con capacidad para 600 mL de un modo estéril y se almacenaron a 10 °C, durante 10 semanas.

Inmediatamente después de la preparación, 2 semanas después de la preparación, 4 semanas después de la preparación, y 10 semanas después de la preparación, se midió el pH de la leche fermentada; además, el recuento celular del Lactococcus garvieae contenido en la leche fermentada y la presencia o ausencia de la capacidad productiva de equol del Lactococcus garvieae contenido en la leche fermentada se evaluaron por métodos iguales a los del Ejemplo . Asimismo, también se midieron para el fermento madre y el fermento industrial, el recuento celular del Lactococcus garvieae y la capacidad productiva de equol del Lactococcus garvieae contenido en leche fermentada, de la misma manera.

Los resultados obtenidos se presentan en el Cuadro 5. Estos resultados revelan que la capacidad productiva de equol del Lactococcus garvieae pudo retenerse mediante el agregado de extracto de levadura, hidrolizado de suero o hidrolizado de levadura/caseína al medio. En particular, se descubrió que si el medio contenía 0.1 % en peso o más de extracto de levadura o 0.1 % en peso o más hidrolizado de caseína/levadura, la capacidad productiva de equol del Lactococcus garvieae en la leche fermentada podía retenerse de un modo estable durante un período tan prolongado como de 10 semanas o más.

CUADRO 5 #1 La capacidad productiva de equol se midió con n = 3, y la determinación fue ? cuando no se observó capacidad productiva de equol y O, cuando la capacidad productiva de equol se observó en los tres casos.

EJEMPLO COMPARATIVO 2 Preparación de leche fermentada y evaluación de la leche fermentada La preparación del fermento madre, la preparación del fermento industrial y la fermentación principal se llevaron a cabo en las mismas condiciones que en el Ejemplo 2, salvo que se hicieron cultivos aeróbicos en la preparación del fermento madre.

Se midió el pH de la leche fermentada obtenida de esta manera; además, el recuento celular del Lactococcus garvieae contenido en la leche fermentada y la presencia o ausencia de la capacidad productiva de equol del Lactococcus garvieae contenido en la leche fermentada se evaluaron por métodos iguales a los del Ejemplo 2. Asimismo, para el fermento madre y el fermento industrial, también se midieron el recuento celular del Lactococcus garvieae y la capacidad productiva de equol del Lactococcus garvieae contenido en leche fermentada, de la misma manera.

Como resultado de ello, cuando el fermento madre se preparó mediante fermentación aeróbica en condiciones aeróbicas, aunque se mantuvo la capacidad productiva de equol del Lactococcus garvieae en el fermento madre, la capacidad productiva de equol del Lactococcus garvieae en el producto lácteo fermentado en último término se perdió. Obsérvese que, a pesar de que el fermento madre se preparó por fermentación aeróbica, el pH y el recuento celular del Lactococcus garvieae en la leche fermentada estuvieron en el mismo orden cuando el fermento madre se preparó por fermentación anaeróbica.

EJEMPLO 4 Evaluación del efecto de retención de la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol 1. Preparación de la composición que contenía el microorganismo productor de equol Se colocó un inóculo del Lactococcus garvieae (cepa del Lactococcus 20-92, FERM BP-10036) en 5 mL de medio de GAM modificado (fabricado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), y se llevó a cabo un cultivo anaeróbico con un sistema empacado de combustibles gaseosos a 37 °C, durante 24 horas. Luego, se inocularon 50 mL de medio de GAM modificado (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) con 2 mL del cultivo obtenido y el cultivo anaeróbico se llevó a cabo con un sistema empacado de combustibles gaseosos a 37 °C, durante 24 horas. Además, 200 mL de medio de GAM modificado (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) se inocularon con 8 mL del cultivo obtenido, y el cultivo anaeróbico se llevó a cabo con un sistema empacado de combustibles gaseosos a 37 °C, durante 24 horas.

El cultivo obtenido se centrifugó (4500 rpm x 15 minutos) para recuperar los cuerpos celulares y las células obtenidas se agregaron a cada bebida de las composiciones que se muestran en el Cuadro 6 de manera que la concentración celular fuera cercana a alrededor de 1x108 cfu/mL, para preparar una composición que contuviera un microorganismo productor de equol; la composición se dividió en tubos de polipropileno 15 mL de capacidad (fabricados por IWAKI), en alícuotas de 10 mL.

CUADRO 6 1. Evaluación de la capacidad productiva de equol después del almacenamiento Cada una de las composiciones que contenían el microorganismo productor de equol obtenidas con anterioridad se almacenó a 10 °C, durante 21 días. Durante el período de almacenamiento, se llevaron a cabo las evaluaciones de pH, el recuento celular y la capacidad productiva de equol para cada composición que contenía el microorganismo productor de equol. El método para medir el recuento celular fue el mismo que en el Ejemplo 1 anterior. Asimismo, la capacidad productiva de equol se analizó por 7¾ HPLC de la misma manera que en el anterior Ejemplo 1 y la tasa de conversión de equol se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula.

Cálculo 1 Tasa de conversión de equol (%) = {(área pico de equol)/(área pico total de daidzeína, dihidrodaidzeína y equol)}x100 Los resultados de medición de pH se muestran en el Cuadro 7. Además, los resultados de la medición del recuento celular se muestran en la figura 1 , y los resultados de la medición de la capacidad productiva de equol se representan en la figura 2. Según resulta evidente del Cuadro 7, en todas las bebidas, se mantuvo el pH inmediatamente después de la preparación aún cuando se almacenó, y también se mantuvo un ambiente en el cual las bacterias contaminantes no podían proliferarse dentro de las bebidas. También, según se evidencia por la figura 1 , con cada composición que contenía el microorganismo productor de equol, se observaron escasas diferencias en el recuento de células viables durante el período de almacenamiento. Por otra parte, tal como se muestra en la figura 2, aunque la capacidad productiva de equol se perdió 14 días después del almacenamiento en la composición que contenía el microorganismo productor de equol sin agregado de ácido ascórbico, en las composiciones que contenían el microorganismo productor de equol en las cuales se había agregado ácido ascórbico, la capacidad productiva de equol se mantuvo incluso después de 21 días de almacenamiento. En particular, en las composiciones que contenían el microorganismo productor de equol con 1% en peso o 2% en peso de ácido ascórbico, se halló que la capacidad productiva de equol se mantenía de un modo extremadamente estable.

CUADRO 7 EJEMPLO 5 Evaluación del efecto de retención de la capacidad productiva de equol del microorganismo productor de equol 1. Preparación de la composición que contiene el microorganismo productor de equol Se obtuvo un fermento madre inoculando 5 mi de un medio que tenía la misma composición que el medio del fermento madre usado en el Ejemplo , con un inoculo de la cepa del Lactococcus 20-92 y realizando un cultivo anaeróbico con un sistema empacado de combustibles gaseosos a 37 °C, durante 96 horas.

Luego, se inocularon 10 mi de un medio que tenía la misma composición que el medio del fermento industrial usado en el Ejemplo 1 , con 0.2 mi del fermento madre antes obtenido, y se llevó a cabo un cultivo anaeróbico durante 15 horas, usando un sistema empacado de combustibles gaseosos a 37 °C para obtener un fermento industrial primario. Asimismo, se inocularon 300 mi de un medio que tenía la misma composición que el medio del fermento industrial usado en el Ejemplo 1 , con 6 mi del fermento madre antes obtenido, y se llevó a cabo un cultivo anaeróbico durante 15 horas, usando un sistema empacado de combustibles gaseosos a 37 °C, para obtener un fermento industrial secundario.

Luego, 2000 mi de un medio que tenía la misma composición que el medio de fermentación principal empleado en el Ejemplo 1 se inocularon con 40 mL del fermento industrial secundario antes obtenido, y se llevó a cabo un cultivo estacionario a 37 °C, durante 15 horas en condiciones aeróbicas, para obtener un solución de frijol de soya fermentado.

Se agregaron seis tipos de antioxidantes a la solución de frijol de soya fermentado obtenida, conforme se muestra en el Cuadro 8, para preparar un producto fermentado; después, se llenaron por separado unos vasos de papel con 130 g de solución y se los selló con tapas de aluminio. Estos vasos se almacenaron a 10 °C, se abrieron 7 días después para medir el recuento celular de los microorganismos productores de equol, y la capacidad productiva de equol del mismo se midió por métodos iguales a los empleados en el Ejemplo 4.

CUADRO 8 2. Resultado de la evaluación El resultado de la medición del recuento celular del microorganismo productor de equol se muestra en el Cuadro 9, y el resultado de la medición de la capacidad productiva de equol se muestra en el Cuadro 10. Al comienzo del almacenamiento, se observó capacidad productiva de equol en todos los casos en los cuales se había mezclado un inhibidor de la oxidación. Sin embargo, 7 días después del almacenamiento, además del producto fermentado al cual se había agregado ácido ascórbico, las capacidades de producción de equol desaparecieron en todos los casos.

CUADRO 9 CUADRO 10 Tasa de conversión de equol (%) A 0 día del A los 7 días del almacenamiento almacenamiento Ejemplo 5 98.5 100.0 Ejemplo comparativo 5-1 98.8 0.0 Ejemplo comparativo 5-2 98.6 0.0 Ejemplo comparativo 5-3 98.2 0.0 Ejemplo comparativo 5-4 97.8 0.0 Ejemplo comparativo 5-5 98.9 0.0

Claims (19)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un procedimiento para la producción de un material fermentado, el cual comprende las etapas de: (1) efectuar la fermentación anaeróbica, en un medio que contenga al menos un tipo de una especie de daidzeína seleccionada del grupo que consiste en glucósido de daidzeína, daidzeína y dihidrodaidzeína, utilizando un microorganismo productor de equol, en un estado en el cual el pH se mantiene en un valor de 5.0 o más, con el fin de preparar un fermento madre; (2) efectuar la fermentación empleando el fermento madre que se obtuvo en el etapa (1) en el medio que contiene la especie de daidzeína, en un estado en el cual el pH se mantiene en un valor de 5.0 o más, con el fin de preparar un fermento industrial y (3) efectuar la fermentación empleando el fermento industrial que se obtuvo en el etapa (2), en un medio que contenga soya en polvo y/o leche de soya para obtener un material fermentado.

2. - El procedimiento de producción de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el microorganismo productor de equol es una bacteria de ácido láctico.

3. - El procedimiento de producción de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el microorganismo productor de equol es el Lactococcus garvieae.

4.- Un procedimiento para la producción de un material fermentado, el cual comprende las etapas de: (I) efectuar la fermentación anaeróbica en un medio que contenga al menos un tipo de especie de daidzeína seleccionada del grupo que consiste en glucósido de daidzeína, daidzeína y dihidrodaidzeína utilizando un microorganismo productor de equol con el fin de preparar un fermento madre y (II) efectuar la fermentación empleando el fermento madre que se obtuvo en el etapa (I) en un medio que contenga la especie de daidzeína y leche, en un estado en el cual se mantenga un pH de 4.6 o mayor, para obtener un material fermentado.

5.- El procedimiento de producción de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque se usa extracto del hipocótilo del frijol de soya como especie de daidzeína.

6. - El procedimiento de producción de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el medio empleado en las etapas (I) y (II) contiene, además, extracto de levadura.

7. - El procedimiento de producción de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el microorganismo productor de equol es una bacteria de ácido láctico.

8. - El procedimiento de producción de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el microorganismo productor de equol es el Lactococcus garvieae.

9. - Un producto fermentado que contiene un material fermentado obtenido mediante el procedimiento de producción de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

10. - Un producto fermentado que contiene un material fermentado obtenido mediante el procedimiento de producción de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8.

11. - El producto fermentado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el pH del mismo es 4.6 o mayor.

12. - Una composición que contiene un microorganismo productor de equol, que contiene (A) un microorganismo productor de equol, en un estado de una célula viva, y (B), al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en ácido ascórbico, derivados del mismo y sales del mismo.

13. - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque el componente (B) está contenido en una proporción de mezcla de 0.05 a 5% en peso.

14. - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque el pH de la misma es de 5.0 o menor.

15. - La composición dé conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque comprende un material fermentado que se fermentó utilizando un microorganismo productor de equol como el microorganismo productor de equol en estado de una célula viva.

16. - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque es una bebida fermentada de soya o una leche de soya fermentada.

17. - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque el microorganismo productor de equol es una bacteria de ácido láctico.

18. - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque el microorganismo productor de equol es el Lactococcus garvieae.

19.- Un método para mantener la capacidad productiva de equol de un microorganismo productor de equol, método que comprende: agregar al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en ácido ascórbico, derivados del mismo y sales del mismo a una composición que contiene un microorganismo productor de equol, en estado de una célula viva.