WO2004060381A1 - Peau de lapin comprenant une substance bioactive et son utilisation - Google Patents

Peau de lapin comprenant une substance bioactive et son utilisation Download PDF

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Definitions

  • the invention relates to a rabbit skin containing a biologically active substance and use thereof. Background technique
  • the object of the present invention is to provide a rabbit skin containing an active substance with a high activity and a high yield, which can be used for preparing not only medicines but also health products.
  • the rabbit skin of the present invention is prepared by the following method: Vaccination of rabbits with a vaccinia virus strain
  • Vaccinia virus is a type of virus widely used in this century.
  • Various strains of vaccinia virus can be used to prepare the rabbit skin of the present invention.
  • the virus strains such as the vaccinia virus lister strain, Ikeda strain, Dairen strain, EM-63 strain, Temple of Heaven strain, LMC strain, Tashkent strain, Williamsport strain, New York City Board of Health strain.
  • Lister strain, Ikeda strain, Dairen strain, and EM-63 strain are preferable, and Lister strain is most preferable.
  • the virus used for vaccination can be purchased directly from the market, or it can be obtained by subculture of rabbits.
  • the above-mentioned inoculation is suitable for subcutaneous inoculation. It is injected at a rate of 100 to 250 per 1.5 to 3 kg of rabbits, and each injection is 0.1 to 0.4 ml of a solution containing 10 6 to 10 9 viruses per ml.
  • the rabbits used to prepare the rabbit skin of the present invention may be various rabbits, such as rabbits such as Japanese big-eared white rabbits, New Zealand white rabbits, Chinese local rabbits, blue purple rabbits, silver gray rabbits (Silver Fox) , Vienna rabbit, longhair rabbit, Himalayan albio rabbit, Pex rabbit, Belgian Hare, Lop, California Rabbit, Chekered
  • Giant Danish white rabbit, West German longhair rabbit.
  • Preferred are Japanese big-eared white rabbits, New Zealand white rabbits, Chinese native rabbits, and blue-violet rabbits, and most preferred are Japanese big-eared white rabbits.
  • Good skin tissue acne refers to the obvious acne on the skin tissue, the color changes from ruddy to purplish red, the skin is thickened, and the subcutaneous and buttocks are edema.
  • the method of sacrifice rabbit is cervical dislocation. Best practice
  • Dry vaccinia lister strain of vaccinia virus Lister strain with PBS (-) solution 80 g of sodium chloride, 2 g of potassium chloride, 11.5 g of sodium dihydrogen phosphate, 2 g of potassium dihydrogen dihydrate, and inject water to 10 L) Dissolve and shake well.
  • the needle was used to extract 0.4 liters and injected into the central inner layer of the testicles of known Japanese big-eared white rabbits.
  • the neck was strongly broken and the scrotum was cut open to remove testicular connective tissue. Put the testicles cut into a special container with ice cubes, and then store them in an ultra-low temperature refrigerator at -80 ° C.
  • EAGLE'S medium EAGLE's powder 9.4 g, 10% sodium bicarbonate 12.5-22.0 liters, glutamine 10 liters, injection Water (1 liter), mix, aliquot, freeze in an ultra-low temperature refrigerator at -80 ° C for 1 hour, and then take it out in a water box at 37 ° C to thaw. Then, perform low-temperature centrifugation (4 ° C, 3500rpm, 20 minutes). Divide into 10 ml each. This antigen secondary culture was stored in an ultra-low temperature refrigerator at -8 ° C.
  • the acne is good, the color changes from ruddy to purplish red, the skin is thickened, there is edema under the skin, and the hips are edema obvious.
  • Rabbits were sacrificed by cervical dislocation, and the crusts were completed within 15 minutes. Pack the rabbit skin in a plastic bag and save it immediately Store in a freezer at -18 ° C.
  • the obtained rabbit skin weight was 349 grams, and its SART activity was 0.85 iu / g.
  • the absorbance value in the angiotensin production inhibitory test is 0.07, and it has an angiotensin production inhibitory activity on the surface.
  • Example 2 A vaccinia virus Ikeda strain and a New Zealand white rabbit were used to prepare an antigen secondary culture according to the method of Example 1.
  • the acne is good, the color changes from ruddy to purplish red, the skin is thickened, there is edema under the skin, and the edema of the buttocks is obvious.
  • Rabbits were sacrificed by pushing the neck off the white method, and the skin was finished within 15 minutes. Pack the rabbit skin in a plastic bag and store it in a freezer at -18 ° C immediately. The weight of the obtained rabbit skin was 302 g, and its SART activity was 0.60 iu / g.
  • the absorbance value is 0.1, and it has an angiotensin production inhibitory activity on the surface.
  • the acne is good, the color changes from ruddy to purplish red, the skin is thickened, there is edema under the skin, and the hips are edema obvious.
  • Rabbits were sacrificed by pushing the neck off the white method, and skin harvesting was completed within 15 minutes. Pack the rabbit skin in a plastic bag and save it immediately Store in a freezer at -18 ° C. The obtained rabbit skin weight was 176 grams, and its SART activity was 0.50 iu / g. In the angiotensin production inhibitory test, the absorbance value is 0.15, and the surface has an angiotensin production inhibitory activity.
  • a vaccinia virus EM-63 strain and a blue-violet rabbit were used to prepare an antigen secondary culture according to the method of Example 1.
  • the injected rabbits were raised for 3 days.
  • the acne is good, the color changes from ruddy to purplish red, the skin is thickened, there are leeches under the skin, and the hips are edema obvious.
  • Rabbits were sacrificed by cervical dislocation, and the palate skin was completed within 15 minutes. Pack the rabbit skin in a plastic bag and store it in a freezer at -18 ° C for later use.
  • the weight of the obtained rabbit skin was 230 g, and its SART activity was 0.55 iu / g.
  • the absorbance value in the angiotensin production inhibitory test is 0.12, and it has an angiotensin production inhibitory activity on the surface.
  • a vaccinia virus Lister strain and a New Zealand white rabbit were used to prepare an antigen secondary culture according to the method of Example 1.
  • the acne is good, the color changes from ruddy to purplish red, the skin is thickened, there is edema under the skin, and the edema of the buttocks is obvious.
  • Rabbits were sacrificed by cervical dislocation, and the crusts were completed within 15 minutes. Pack rabbit skins in plastic bags, Store immediately in a freezer at -18 ° C. The obtained rabbit skin weight was 310 g, and its SART activity was 0.79 iu / g.
  • the absorbance value in the angiotensin production inhibitory test is 0.09, and it has an angiotensin production inhibitory activity on the surface.
  • the acne is good, the color changes from ruddy to purplish red, the skin is thickened, there is edema under the skin, and the edema of the buttocks is obvious.
  • Rabbits were sacrificed by pushing the neck off the white method, and skin harvesting was completed within 15 minutes. Pack the rabbit skin in a plastic bag and store it in a freezer at -18 ° C for later use. The weight of the obtained rabbit skin was 185 g, and its SART activity was 0.71iu / g. The absorbance value was 0.11 in the angiotensin production inhibitory test, and it has an angiotensin production inhibitory activity on the surface.
  • an antigen secondary culture was prepared according to the method of Example 1.
  • the acne is good, the color changes from ruddy to purplish red, the skin is thickened, there is edema under the skin, and the edema of the buttocks is obvious.
  • Rabbits were sacrificed by cervical push-off, and the skin was finished within 15 minutes. Pack rabbit skins in plastic bags and store immediately Store in a freezer at -18 ° C. The obtained rabbit skin weight was 235 grams, and its SART activity was 0.74 iu / g.
  • the absorbance value in the angiotensin production inhibition test is 0.13, and it has an angiotensin production inhibitory activity on the surface.
  • Example 8 Preparation of rabbit skin ⁇ Vaccinia virus Ikeda strain and Japanese white-eared rabbit were used to prepare an anti-primary secondary culture according to the method of Example 1.
  • the acne is good, the color changes from ruddy to purplish red, the skin is thickened, there is edema under the skin, and the edema of the buttocks is obvious.
  • Rabbits were sacrificed by pushing the neck off the white method, and the skin was finished within 15 minutes. Pack the rabbit skin in a plastic bag and store it in a freezer at -18 ° C for later use.
  • the obtained rabbit skin weight was 335 g, and its SART activity was 0.70 iu / g.
  • the absorbance value in the angiotensin production inhibitory test is 0.12, and it has an angiotensin production inhibitory activity on the surface.
  • an anti-primary secondary culture was prepared according to the method of Example 1.
  • the acne is good, the color changes from ruddy to purplish red, the skin is thickened, there is edema under the skin, and the edema of the buttocks is obvious.
  • Rabbits were sacrificed by cervical dislocation, and the crusts were completed within 15 minutes. Pack the rabbit skin in a plastic bag and save it immediately Store in a freezer at -18 ° C.
  • the obtained rabbit skin weight was 336 g, and its SART activity was 0.61 iu / g.
  • the absorbance value in the angiotensin production inhibitory test is 0.14, and it has an angiotensin production inhibitory activity on the surface.
  • a vaccinia virus EM-63 strain and Japanese big-eared white rabbits were used to prepare an antigen secondary culture according to the method of Example 1.
  • the acne is good, the color changes from ruddy to purplish red, the skin is thickened, there are leeches under the skin, and the hips are edema obvious.
  • Rabbits were sacrificed by cervical dislocation, and skin harvesting was completed within 15 minutes. Pack the rabbit skin in a plastic bag and store it in a freezer at -18 ° C immediately. The obtained rabbit skin weight was 335 grams, and its SART activity was 0.66 iu / g.
  • the absorbance value in the angiotensin production inhibitory test is 0.12, and it has an angiotensin production inhibitory activity on the surface.
  • the rabbit skins (200 g each) of Examples 1 to 10 were cut into small pieces of about 1 square centimeter, and 4 times the weight of a 3% aqueous phenol solution was added thereto. Place it in an environment at 4 ° C for 72 hours. After the liquid becomes an emulsion, centrifuge it, remove the supernatant, and filter to obtain a brown solution A. Adjust the pH of the solution to 5.0 with 1M hydrochloric acid, and boil in water for 40 minutes. The temperature was immediately lowered to 28 ° C, followed by centrifugation, and then the supernatant was filtered to obtain solution B. The pH value of the filtrate was adjusted to 9.2 with 1M sodium hydroxide, and boiled in a water bath for 40 minutes.
  • Example 1 Glutamic acid 1.64 0.85 0.70 0.80 1.54 1.20 1.40 1.12 0.98 1.03 Glycine 0.92 0.51 0.33 0.49 0.86 0.73 0.80 0.70 0.55 0.61 Alanine 0.96 0.64 0.59 0.60 0.92 0.77 0.83 0.76 0.66 0.70 Valine 0.66 0.34 0.23 0.29 0.62 0.57 0.61 0.51 0.39 0.45 Isoleucine 0.42 0.17 0.10 0.14 0.40 0.32 0.38 0.30 0.26 0.28 Leucine 0.67 0.22 0.11 0.16 0.66 0.53 0.60 0.46 '0.35 0.41 Tyrosine 0.83 0.30 0.25 0.20 0.77 0.61 0.69 0.52 0.36 0.44 Phenylalanine 0.55 0.26 0.24 0.25 0.53 0.42 0.48 0.34 0.30 0.33 Lysine 0.47 0.1 1 0.09 0.10 0.45 0.39 0.34 0.34 0.19 0.26 Histidine 0.64 0.24 0.18 0.21 0.57 0.43 0.53 0.41 0.31 0.
  • the rabbit skin of the present invention has a SART activity greater than or equal to 0.5 iu / g, and has an angiotensin production inhibitory activity.
  • an active preparation containing a variety of amino acids and nucleic acids can be prepared from the rabbit skin, wherein the amino acids include glutamic acid, glycine, and alanine. , Valine, isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanine, lysine, histidine, aspartic acid, threonine, serine; nucleic acids including uric acid , Uracil, hypoxanthine, xanthine, thymine.
  • excipients can be distilled water for injection, physiological saline, vegetable oil for injection, glucose injection, propylene glycol, polyethylene glycol, etc., and various stabilizers, emulsifiers, etc .; in tablets, capsules, and granules
  • excipients may be excipients such as starch, lactose, mannitol, crystalline cellulose, acacia, corn starch, gelatin, polyethylene, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, and other binding agents, carboxymethyl cellulose, polymer Ethylene glycol, potato starch disintegrant, lubricants such as talc and magnesium stearate, wetting agents such as glycerin, etc.
  • the excipients can be distilled water for injection, physiological saline, vegetable oil for injection, glucose injection, propylene glycol, polyethylene glycol, etc., and various stabilizers, emulsifiers, etc .; in tablets, capsules
  • the medicine prepared from the rabbit skin of the present invention can effectively promote macrophage activation, significantly inhibit the 48-hour homologous PCA response caused by the IgE antibody of a mouse that is a type I allergy reaction model, and can inhibit The model anti-complement activity of type II allergies is linear with its dose. From this, it can be seen that the medicine prepared from the rabbit skin of the present invention has the effect of suppressing inflammation related to the immune function, and can improve the immune function.
  • the medicine prepared from the rabbit skin of the present invention also has anti-allergic, anti-ulcer, and sedative effects.
  • the medicine prepared from the rabbit skin of the present invention was administered intraperitoneally to rats for 28 consecutive days, and no death occurred in any group.
  • Urine test, ophthalmological test, blood chemistry test, histopathological examination, and anatomy all showed no existence. Changes due to administration of analgesics of the invention. These indicate that the analgesics of the present invention are very toxic.
  • the active preparation can be combined with food additives and nutrients to make a health product.
  • the food additives and nutrients include various vitamins and various flavoring agents. From this
  • the health product prepared by the rabbit skin has the functions of enhancing immune function, alleviating pain, anti-allergic and anti-nervous.
  • the angiotensin production inhibitory activity referred to herein is determined by the following method: Rabbit skin is cut into small pieces of about 1 square centimeter, and 4 times the weight of a 3% aqueous phenol solution is added thereto. It was placed in a 4 ⁇ environment for 72 hours. The liquid became an emulsion and centrifuged. The supernatant was taken out and filtered to obtain a brown solution A. The pH of the solution was adjusted to 5.0 with 1M hydrochloric acid, and the solution was boiled in a water bath for 40 minutes. The temperature was immediately reduced.
  • the SART activity of the above solution was adjusted to 1.2 iu / ml by evaporation and dilution with distilled water, 10 ml of the solution was taken, desalted under the condition of a final conductivity of 10 s / cm, and dried under reduced pressure, and 0.25 M sodium chloride was added. 1.5 ml of the solution to obtain the test solution.
  • 0.2 ml of a 0.25 M sodium chloride solution as a control solution, the following treatment was performed in parallel with 0.2 ml of the test solution. Inject 0.5ml of the diluted human plasma into the test solution and the control solution, and leave them at the freezing point for 5 minutes, add 0.25ml of white clay suspension, and leave them at the freezing point for 20 minutes.

Description

含生物活性物质的兔皮和其用途
技术领域
本发明涉及一种含生物活性物质的兔皮和其用途。 背景技术
曾经有人报道，从感染了痘病毒的家兔皮肤获得的提取物对过敏性疾 病有治疗效果， 并且具有镇痛作用。 然而， 目前还没有一种制备含有活性 强收率高之活性物质的兔皮的方法。 发明内容
本发明的目的是提供一种含有活性强收率高之活性物质， 既可以用于 制备药品， 又可以用于制备保健品的兔皮。
本发明发明人经过多年的潜心研究， 终于达到了上述目的。
本发明的兔皮是由以下方法制备的： 用牛痘病毒株接种家兔
{Oryctolagus cuniculus) , 将接种过的家兔进行饲养， 待其皮肤组织发痘良 好时处死， 然后釆皮。
牛痘病毒是本世纪广泛使用的一类病毒，各种牛痘病毒 (vaccinia virus) 株都可以用来制备本发明的兔皮，所说的病毒株例如牛痘病毒株 Lister株、 Ikeda株、 Dairen株、 EM-63株、天坛 (Temple of Heaven)株、 LMC株、 Tashkent 株、 Williamsport株、 纽约巿健康委员会 (New York City Board o f Health) 株。 其中优选的是 Lister株、 Ikeda株、 Dairen株、 EM-63株， 最优选的 是 Lister株。 这些病毒株都可以从巿场上购得。 用于接种的病毒可以是直 接从巿场上购得的， 也可以是用家兔继代培养获得的。
以上所说的接种以皮下接种为宜，按每只 1.5 - 3千克的家兔注射 100 到 250处， 每处注射每毫升含 106-109个病毒的溶液 0.1 - 0.4毫升进行。
用于制备本发明的兔皮的家兔可以是各种家兔，所说的家兔例如曰本 大耳白兔、 新西兰白兔、 中国本兔、 青紫兰兔、 银灰色兔 (Silver Fox)、 维 也纳兔、长毛兔、喜马拉雅白化兔 (Himalayan albio rabbit)、力克施兔 (Pex)、 比利时兔 (Belgian Hare)、 公羊兔 (Lop)、 加利福尼亚兔、 花巨兔 (Chekered
Giant), 丹麦白兔、 西德长毛兔。 优选的是日本大耳白兔、 新西兰白兔、 中国本兔、 青紫兰兔， 最优选的是曰本大耳白兔。
皮肤组织发痘良好是指皮肤组织明显出痘， 颜色由红润转为紫红， 皮 肤增厚， 皮下和臀部水肿。 处死兔的方法以颈椎脱臼法为宜。 最佳实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明：
实施例 1 制备兔皮
将牛痘病毒 Lister株的干燥痘疮疫苗用 PBS (-)溶液 （氯化钠 80克， 氯化钾 2克， 磷酸二氢钠 11.5克， 二水磷酸二氢钾 2克， 加注射水至 10 升） 溶解， 摇匀。 用针管抽取 0.4亳升向已知日本大耳白兔睾丸的中央内 层注射， 第 4天用力拉断颈推， 剪开阴囊， 去除睾丸结缔组织。 将巳剪釆 的睾丸放入装有冰块的专用容器内， 再放入 -80°C的超低温冰箱中保存。 将睾丸组织拿出冰箱软化 1小时， 4°C下磨碎， 以 1 : 1与 EAGLE'S培养基 ( Eagle's粉末 9.4克， 10%碳酸氢钠 12.5-22.0亳升， 谷氨酰胺 10亳升， 注射水 1升） 混合， 分装后， 放入 -80°C的超低温冰箱中冻结 1小时， 再 取出在 37 °C的水洛箱中解冻。 然后， 进行低温离心 （4°C , 3500rpm, 20 分钟） 。 分装为 10毫升一只。 将此抗原继代培养物放入 -8(TC的超低温冰 箱中保存。
从 -80°C的超低温冰箱中取出抗原继代培养物病毒溶液， 放入 30°C的 温箱中使其慢慢溶化。 用一支 10亳升的针管抽取 5 亳升， 注入 500亳升 的 PBS (-)溶液中， 摇匀， 得到每亳升含 109个病毒的注射溶液。 将一只健 康的成熟大耳白兔 （3千克） 背上的毛剪去， 用 75%酒精棉球擦拭巳剪去 毛的部位。 用以上制得的注射溶液皮内注射该兔， 共注射 200处， 每次注 射 0.4毫升， 注意不漏水、 不空打， 不注穿皮肤。 将注射过的兔饲养 4天。 发痘良好， 颜色由红润转为紫红， 皮肤增厚，皮下有水肿，臀部水肿明显。 用颈推脱臼法处死兔， 15 分钟内完成釆皮。 用塑料袋包装兔皮， 立即存 放在 -18 °C的冰柜中备用。获得的兔皮重量为 349克，其 SART活性为 0.85 iu/g。 血管舒缓素生成抑制试验中吸光度值为 0.07, 表面其具有血管舒缓 素生成抑制活性。
实施例 2 制备兔皮
釆用牛痘病毒 Ikeda株和新西兰白兔， 按照实施例 1的方法制备抗原 继代培养物。
从 -80°C的超低温冰箱中取出抗原继代培养物病毒溶液， 放入 30°C的 温箱中使其慢慢溶化。 用一支 10亳升的针管抽取 5 亳升， 注入 500亳升 的 PBS (-)溶液中， 摇匀， 得到每亳升含 109个病毒注射溶液。 将一只健康 的成熟新西兰白兔（2.75千克）背上的毛剪去， 用 75%酒精棉球擦拭已剪 去毛的部位。 用以上制得的注射溶液皮内注射该兔， 共注射 250处， 每次 · 注射 0.3亳升， 注意不漏水、 不空打， 不注穿皮肤。 将注射过的兔饲养 3 天。 发痘良好， 颜色由红润转为紫红， 皮肤增厚， 皮下有水肿， 臀部水肿 明显。 用颈推脱白法处死兔， 15 分钟内完成釆皮。 用塑料袋包装兔皮， 立即存放在 -18°C的冰柜中备用。 获得的兔皮重量为 302克， 其 SART活 性为 0.60 iu/g。 血管舒缓素生成抑制试验中吸光度值为 0.1， 表面其具有 血管舒缓素生成抑制活性。
实施例 3 制备兔皮
釆用牛痘病毒 Dairen株和中国本兔，按照实施例 1的方法制备抗原继 代培养物。
从 -80°C的超低温冰箱中取出抗原继代培养物病毒溶液， 放入 30°C的 温箱中使其慢慢溶化。 用一支 10亳升的针管抽取 5 亳升， 注入 500亳升 的 PBS (-)溶液中， 摇匀， 得到每亳升含 106个病毒的注射溶液。 将一只健 康的中国本兔 （1.5千克） 背上的毛剪去， 用 75%酒精棉球擦拭已剪去毛 的部位。 用以上制得的注射溶液皮内注射该兔， 共注射 250处， 每次注射 0.1亳升， 注意不漏水、 不空打， 不注穿皮肤。 将注射过的兔饲养 3天。 发痘良好，颜色由红润转为紫红， 皮肤增厚， 皮下有水肿， 臀部水肿明显。 用颈推脱白法处死兔， 15 分钟内完成采皮。 用塑料袋包装兔皮， 立即存 放在 -18 °C的冰柜中备用。获得的兔皮重量为 176克，其 SART活性为 0.50 iu/g。 血管舒缓素生成抑制试验中吸光度值为 0.15 , 表面其具有血管舒缓 素生成抑制活性。
实施例 4 制备兔皮
采用牛痘病毒 EM-63株和青紫兰兔， 按照实施例 1 的方法制备抗原 继代培养物。
从- 80°C的超低温冰箱中取出抗原继代培养物病毒溶液， 放入 30°C的 温箱中使其慢慢溶化。 用一支 10亳升的针管抽取 5 亳升， 注入 500亳升 的 PBS (-)溶液中， 摇匀， 得到每亳升含 107个病毒的注射溶液。 将一只健 康青紫兰兔 （2千克） 背上的毛剪去， 用 75%酒精棉球擦拭巳剪去毛的部 位。 用以上制得的注射溶液皮内注射该兔， 共注射 100处， 每次注射 0.2 亳升， 注意不漏水、 不空打， 不注穿皮肤。 将注射过的兔饲养 3天。 发痘 良好， 颜色由红润转为紫红， 皮肤增厚， 皮下有水胂， 臀部水肿明显。 用 颈椎脱臼法处死兔， 15 分钟内完成釆皮。 用塑料袋包装兔皮， 立即存放 在 -18 °C的冰柜中备用。 获得的兔皮重量为 230克， 其 SART活性为 0.55 iu/g。 血管舒缓素生成抑制试验中吸光度值为 0.12, 表面其具有血管舒缓 素生成抑制活性。
实施例 5 制备兔皮
采用牛痘病毒 Lister株和新西兰白兔， 按照实施例 1的方法制备抗原 继代培养物。
从 -80°C的超低温冰箱中取出抗原继代培养物病毒溶液， 放入 30°C的 温箱中使其慢慢溶化。 用一支 10亳升的针管抽取 5 毫升， 注入 500亳升 的 PBS (-)溶液中， 摇匀， 得到每毫升含 109个病毒注射溶液。 将一只健康 的成熟新西兰白兔（2.75千克）背上的毛剪去， 用 75%酒精棉球擦拭已剪 去毛的部位。 用以上制得的注射溶液皮内注射该兔， 共注射 200处， 每次 注射 0.3亳升， 注意不漏水、 不空打， 不注穿皮肤。 将注射过的兔饲养 3 天。 发痘良好， 颜色由红润转为紫红， 皮肤增厚， 皮下有水肿， 臀部水肿 明显。 用颈推脱臼法处死兔， 15 分钟内完成釆皮。 用塑料袋包装兔皮， 立即存放在 -18 °C的冰柜中备用。 获得的兔皮重量为 310克， 其 SART活 性为 0.79 iu/g。 血管舒缓素生成抑制试验中吸光度值为 0.09, 表面其具有 血管舒缓素生成抑制活性。
实施例 6 制备兔皮
釆用牛痘病毒 Lister株和中国本兔， 按照实施例 1的方法制备抗原继 代培养物。
从 -80°C的超低温冰箱中取出抗原继代培养物病毒溶液， 放入 30°C的 温箱中使其慢慢溶化。 用一支 10亳升的针管抽取 5 亳升， 注入 500亳升 的 PBS (-)溶液中， 摇匀， 得到每亳升含 106个病毒的注射溶液。 将一只健 康的中国本兔 （ 1.5千克） 背上的毛剪去， 用 75%酒精棉球擦拭巳剪去毛 的部位。 用以上制得的注射溶液皮内注射该兔， 共注射 250处， 每次注射 0.1亳升， 注意不漏水、 不空打， 不注穿皮肤。 将注射过的兔饲养 3天。 发痘良好， 颜色由红润转为紫红， 皮肤增厚， 皮下有水肿，臀部水肿明显。 用颈推脱白法处死兔， 15 分钟内完成采皮。 用塑料袋包装兔皮， 立即存 放在 -18 °C的冰柜中备用。 获得的兔皮重量为 185 克， 其 SART 活性为 0.71iu/g。 血管舒缓素生成抑制试验中吸光度值为 0.11 , 表面其具有血管 舒缓素生成抑制活性。
实施例 7 制备兔皮
釆用牛痘病毒 Lister株和青紫兰兔， 按照实施例 1的方法制备抗原继 代培养物。
从 -80°C的超低温冰箱中取出抗原继代培养物病毒溶液， 放入 30°C的 温箱中使其慢慢溶化。 用一支 10亳升的针管抽取 5 亳升， 注入 500亳升 的 PBS (-)溶液中， 摇匀， 得到每亳升含 107个病毒的注射溶液。 将一只健 康青紫兰兔 （2千克）背上的毛剪去， 用 75%酒精棉球擦拭巳剪去毛的部 位。 用以上制得的注射溶液皮内注射该兔， 共注射 100处， 每次注射 0.2 毫升， 注意不漏水、 不空打， 不注穿皮肤。 将注射过的兔饲养 3天。 发痘 良好， 颜色由红润转为紫红， 皮肤增厚， 皮下有水肿， 臀部水肿明显。 用 颈推脱曰法处死兔， 15 分钟内完成釆皮。 用塑料袋包装兔皮， 立即存放 在 -18 °C的冰柜中备用。 获得的兔皮重量为 235克， 其 SART活性为 0.74 iu/g。 血管舒缓素生成抑制试验中吸光度值为 0.13 , 表面其具有血管舒缓 素生成抑制活性。
实施例 8 制备兔皮 · 釆用牛痘病毒 Ikeda株和日本大耳白兔， 按照实施例 1的方法制备抗 原继代培养物。
从 -80°C的超低温冰箱中取出抗原继代培养物病毒溶液， 放入 30°C的 温箱中使其慢慢溶化。 用一支 10亳升的针管抽取 5 亳升， 注入 500亳升 的 PBS (-)溶液中， 摇匀， 得到每亳升含 109个病毒注射溶液。 将一只健康 的成熟日本大耳白兔 （3千克）背上的毛剪去， 用 75%酒精棉球擦拭已剪 去毛的部位。 用以上制得的注射溶液皮内注射该兔， 共注射 200处， 每次 注射 0.3毫升， 注意不漏水、 不空打， 不注穿皮肤。 将注射过的兔饲养 3 天。 发痘良好， 颜色由红润转为紫红， 皮肤增厚， 皮下有水肿， 臀部水肿 明显。 用颈推脱白法处死兔， 15 分钟内完成釆皮。 用塑料袋包装兔皮， 立即存放在 -18 °C的冰柜中备用。 获得的兔皮重量为 335克， 其 SART活 性为 0.70 iu/g。 血管舒缓素生成抑制试验中吸光度值为 0.12, 表面其具有 血管舒缓素生成抑制活性。
实施例 9 制备兔皮
釆用牛痘病毒 Dairen株和日本大耳白兔，按照实施例 1的方法制备抗 原继代培养物。
从 -80Ό的超低温冰箱中取出抗原继代培养物病毒溶液， 放入 30°C的 温箱中使其慢慢溶化。 用一支 10亳升的针管抽取 5 亳升， 注入 500亳升 的 PBS (-)溶液中， 摇匀， 得到每亳升含 106个病毒的注射溶液。 将一只健 康的日本大耳白兔 （3千克）背上的毛剪去， 用 75%酒精棉球擦拭已剪去 毛的部位。 用以上制得的注射溶液皮内注射该兔， 共注射 200处， 每次注 射 0.1亳升， 注意不漏水、 不空打， 不注穿皮肤。 将注射过的兔饲养 3天。 发痘良好， 颜色由红润转为紫红，皮肤增厚， 皮下有水肿， 臀部水肿明显。 用颈推脱臼法处死兔， 15 分钟内完成釆皮。 用塑料袋包装兔皮， 立即存 放在 -18 °C的冰柜中备用。获得的兔皮重量为 336克，其 SART活性为 0.61 iu/g。 血管舒缓素生成抑制试验中吸光度值为 0.14, 表面其具有血管舒缓 素生成抑制活性。
实施例 10 制备兔皮
采用牛痘病毒 EM-63株和日本大耳白兔， 按照实施例 1 的方法制备 抗原继代培养物。
从 -80Ό的超低温冰箱中取出抗原继代培养物病毒溶液， 放入 30°C的 温箱中使其慢慢溶化。 用一支 10亳升的针管抽取 5 亳升， 注入 500亳升 的 PBS (-)溶液中， 摇匀， 得到每亳升含 107个病毒的注射溶液。 将一只健 康日本大耳白兔 （3千克） 背上的毛剪去， 用 75%酒精棉球擦拭已剪去毛 的部位。 用以上制得的注射溶液皮内注射该兔， 共注射 200处， 每次注射 0.2亳升， 注意不漏水、 不空打， 不注穿皮肤。 将注射过的兔饲养 3天。 发痘良好， 颜色由红润转为紫红，皮肤增厚， 皮下有水胂， 臀部水肿明显。 用颈推脱臼法处死兔， 15 分钟内完成采皮。 用塑料袋包装兔皮， 立即存 放在 -18°C的冰柜中备用。获得的兔皮重量为 335克，其 SART活性为 0.66 iu/g。 血管舒缓素生成抑制试验中吸光度值为 0.12, 表面其具有血管舒缓 素生成抑制活性。
实施例 11 提取活性物质
分别将实施例 1 - 10的兔皮（各 200克）切成 1平方厘米左右的小块， 向其中加入 4倍量（重量） 的 3%苯酚水溶液。 将其置于 4°C环境下 72小 时， 液体成为乳液后离心， 取出上清液， 过滤， 得到褐色溶液 A; 用 1M 盐酸将该溶液的 pH值调至 5.0, 于水洛中煮沸 40分钟， 立即降温至 28 °C , 接着离心， 然后过滤上清液， 得到溶液 B; 用 1M氢氧化钠将滤液的 pH值调至 9.2, 于水浴中煮沸 40分钟， 立即降温至 28 °C , 然后过滤， 得 到溶液 C; 用 1M盐酸将滤液的 pH值调至 4.5 , 向其中加入 50克活性炭， 于 30Ό和不断搅拌下浸泡 4小时， 停止搅拌， 使其静置 30分钟， 抽掉上 层清液， 在氮气环境下过滤， 然后以注射水浸泡及洗净活性炭， 过滤， 弃 去滤液收集和贮存活性炭， 把载有活性炭的器皿加进 400亳升注射水中， 用 1M氢氧化钠将 pH调至 11.0,连续搅拌 4小时。在氮气环境下用 0.45μπι 滤膜过滤， 再以 40毫升注射水洗净活性炭， 得到溶液 D; 用 1M盐酸将 pH调至 6.0， 密封容器， 加热至 121 °C , 保持 20分钟， 然后冷却至 40°C 以下， 得到溶液 E; 将溶液 E抽入减压蒸馏器， 使减压蒸馏器内的空气更 换成氮气， 在 60°C下减压蒸馏至体积为 5亳升， 过滤， 得到 5亳升制剂。 测定以下氨基酸和核酸的含量 （ g/ml ) ：
(表格见下页）
物质 实施例 1 实施例 2 实施例 3 实施例 4 实施例 5 实施例 6 实施例 实施例 8 实施例 9 实施例 1 谷氨酸 1.64 0.85 0.70 0.80 1.54 1.20 1.40 1.12 0.98 1.03 甘氨酸 0.92 0.51 0.33 0.49 0.86 0.73 0.80 0.70 0.55 0.61 丙氨酸 0.96 0.64 0.59 0.60 0.92 0.77 0.83 0.76 0.66 0.70 缬氨酸 0.66 0.34 0.23 0.29 0.62 0.57 0.61 0.51 0.39 0.45 异亮氨酸 0.42 0.17 0.10 0.14 0.40 0.32 0.38 0.30 0.26 0.28 亮氨酸 0.67 0.22 0.11 0.16 0.66 0.53 0.60 0.46 ' 0.35 0.41 酪氨酸 0.83 0.30 0.25 0.20 0.77 0.61 0.69 0.52 0.36 0.44 苯基丙氨酸 0.55 0.26 0.24 0.25 0.53 0.42 0.48 0.34 0.30 0.33 赖氨酸 0.47 0.1 1 0.09 0.10 0.45 0.39 0.34 0.34 0.19 0.26 组氨酸 0.64 0.24 0.18 0.21 0.57 0.43 0.53 0.41 0.31 0.35 天冬氨酸 0.68 0.44 0.39 0.40 0.61 0.57 0.58 0.49 0.45 0.46 苏氨酸 0.51 0.24 0.11 0.16 0.50 0.42 0.46 0.38 0.30 0.34 丝氨酸 1.01 0.69 0.66 0.67 0.98 0.79 0.88 0.75 0.70 0.71 尿刊酸 25.00 13.24 12.52 13.00 24.75 22..39 24.00 20.01 16..55 17.6 尿嘧啶 16.12 6.66 5.51 6.16 14..31 10.46 13.19 10.00 7.12 8.54 次黄嘌呤 1.71 0.85 0.80 0.81 1.65 1.1 1 1.34 1.01 0.89 0.99 黄嘌呤 12.44 6.13 5.21 5.79 12.00 9.98 11.67 9.62 6.39 8.13 胸腺嘧啶 3.38 1.99 1.15 1.54 3.30 2.77 3.19 2.49 2.04 2.44
实施例 12 制备药品
釆用以下配方， 按照常规方法制备用于镇痛的针剂：
从实施例 2的兔皮获得的制剂 5亳升
氯化钠 2.6克
注射用蒸馏水 300亳升。
实施例 13 制备片剂
采用以下配方， 按照常规方法制备用于镇痛的片剂：
实施例 1所获得的活性制剂 50亳升
乳糖 125亳克
结晶纤维素 20克
硬脂酸镁 5亳克。
实施例 14 制备保健品
釆用以下配方， 按照常规制备方法制备营养保健品：
从实施例 1的兔皮获得的制剂 50亳升
蔗糖 125亳克
柠檬酸 20亳克
维生素 C 5亳克
水 1000亳升 工业应用性
本发明的兔皮具有大于或等于 0.5 iu/g的 SART活性，并具有血管 舒缓素生成抑制活性。
经溶剂抽提、 酸处理、 碱处理、 吸附和洗脱以及浓缩等步骤可以 从所说的兔皮制备含有多种氨基酸和核酸的活性制剂， 其中的氨基酸 包括谷氨酸、 甘氨酸、 丙氨酸、 缬氨酸、 异亮氨酸、 亮氨酸、 酪氨酸、 苯基丙氨酸、 赖氨酸、 组氨酸、 天冬氨酸、 苏氨酸、 丝氨酸； 其中的 核酸包括尿刊酸、 尿嘧啶、 次黄嘌呤、 黄嘌呤、 胸腺嘧啶。 将上述活性制剂与药用辅料组合可制成药品， 这种药品可以是各 种适于临床使用的剂型， 包括针剂、 片剂等， 优选的是针剂。 在针剂 中， 辅料可以是注射用蒸馏水， 生理盐水、 注射用植物油、 葡萄糖注 射液、 丙二醇、 聚乙二醇等， 还可以是各种稳定剂、 乳化剂等； 在片 剂、 胶囊剂和颗粒剂中， 辅料可以是淀粉、 乳糖、 甘露醇等赋形剂， 结晶纤维素、 阿拉伯胶、 玉米淀粉、 明胶、 聚乙烯、 聚乙烯醇、 聚乙 烯吡咯烷酮等结合剂， 羧甲基纤维素、 聚乙二醇、 马铃薯淀粉定崩解 剂， 滑石粉、 硬脂酸镁等润滑剂， 甘油等润湿剂等。 在软膏剂中， 辅 料可以是脂肪油、 石蜡、 羊毛脂、 凡士林、 乙二醇、 甘油等基质等。
药理和临床试验表明， 从本发明的兔皮制备的药品对多种疾病具 有镇痛作用。 这些疾病包括各种神经痛、 腰痛、 胆绞痛、 心绞痛、 动 脉栓塞性疼痛、 创伤烧伤烫伤等的剧烈疼痛、 手术期间和手术后的疼 痛、 消化性溃疡病疼痛、 痛经、 分娩后的宫缩痛、 头痛、 各种肿瘤引 起的疼痛等。
研究显示， 从本发明的兔皮制备的药品可以有效地促进巨噬细胞 活化作用， 明显抑制作为 I型变态反应模型的小鼠的 IgE抗体而引起 的 48小时同源 PCA反应， 并且可以抑制作为 II型变态反应的模型抗 补体活性， 其作用与用量成线性关系。 由此可知， 从本发明的兔皮制 备的药品具有抑制与免疫机能有关的炎症的作用，可以改善免疫功能。
此外， 从本发明的兔皮制备的药品还具有抗过敏、 抗溃疡、 镇静 等作用。
将从本发明的兔皮制备的药品连续 28天向大鼠腹腔给药，在任意 一组中都没有出现死亡， 尿检、 眼科检査、 血液化学检查、 病理组织 学检查和解剖均说明不存在由于本发明的镇痛药的给药引起的变化。 这些说明本发明的镇痛药毒性很小。
将上述活性制剂与食品添加剂和营养物质组合可以制成保健品。 所说的食品添加剂和营养物质包括各种维生素和各种调味剂等。 从本 发明的兔皮制备的保健品具有增强免疫功能、 缓和疼痛、 抗过敏和抗 神经紧张等功能。
SART 活性的试验方法是本领域公知的 （参见喜多富太郎等， 曰 药理志（Folia Pharmacol, japon.) 71 :211-220 (1975) ) 。
本文所称的血管舒缓素生成抑制活性是由以下方法测定的： 将兔皮切成 1平方厘米左右的小块， 向其中加入 4倍量 （重量） 的 3%苯酚水溶液。 将其置于 4Ό环境下 72小时， 液体成为乳液后离 心， 取出上清液， 过滤， 得到褐色溶液 A; 用 1M盐酸将该溶液的 pH 值调至 5.0, 于水浴中煮沸 40分钟， 立即降温至 28 °C , 接着离心， 然 后过滤上清液， 得到溶液 B; 用 1M氢氧化钠将滤液的 pH值调至 9.2， 于水浴中煮沸 40分钟， 立即降温至 28°C , 然后过滤， 得到溶液 C; 用 1M盐酸将滤液的 pH值调至 4.5 , 向其中加入活性炭， 于 30°C和不 断搅拌下浸泡 4小时， 停止搅拌， 使其静置 30分钟， 抽掉上层清液， 在氮气环境下过滤， 然后以注射水浸泡及洗净活性炭， 过滤， 弃去滤 液收集和贮存活性炭， 把载有活性炭的器皿加进注射水中， 用 1M氢 氧化钠将 pH调至 11.0, 连续搅拌 4小时。 在氮气环境下用 0.45μηι滤 膜过滤， 再以注射水洗净活性炭， 得到溶液 D; 用 1M盐酸将 pH调至 6.0, 密封容器， 加热至 121 °C , 保持 20分钟， 然后冷却至 40°C以下， 得到溶液 E; 将溶液 E抽入减压蒸馏器， 使减压蒸馏器内的空气更换 成氮气， 在 60°C下减压蒸馏， 过滤， 得到含生物活性物质的溶液， 测 定其 SART活性。 经蒸发浓缩和加蒸馏水稀释将上述溶液的 SART活 性调节至 1.2 iu/ml, 取该溶液 10ml， 在最终电导度为 10 s/cm的条件 下脱盐， 减压干燥后， 加入 0.25M氯化钠溶液 1.5ml, 得到试验溶液。 将 0.25M氯化钠溶液 0.2ml作'为对照溶液， 与 0.2ml试验溶液平行进 行以下处理。 将 0.5ml稀释的人血浆分别注入试验溶液和对照溶液中， 在冰点下放置 5分钟， 加入白陶土悬浊液 0.25ml, 再在冰点下放置 20 分钟。 经隔膜过滤， 取 0.1ml滤液与 0.1M三羟甲基氨基甲垸盐酸缓冲 液 0.2ml及基质溶液 0.1ml混合， 在 30°C的条件下反应 20分钟， 在反 应溶液中加入 1 %的柠檬酸 0.8ml使反应停止， 测定 405nm下的吸光 度， 将对照溶液的吸光度设定为 0.4, 测定试验溶液的吸光度值 A, 如 果 A小于 0.4, 则试验溶液所对应的兔皮具有血管舒缓素生成抑制活 性。

Claims

1. 一种含生物活性物质的兔皮， 其特征在于该兔皮是由以下方法制备 的： 用牛痘病毒株接种家兔， 将接种过的家兔进行饲养， 待其皮肤组织发 痘良好时处死， 然后釆皮。
2. 如权利要求 1 的兔皮， 其中所说的牛痘病毒株是 Lister株。
3. 如权利要求 i 的兔皮， 其中所说的牛痘病毒株是 Ikeda株。
4. 如权利要求 1 的兔皮， 其中所说的牛痘病毒株是 Dairen株。
5. 如权利要求 1 的兔皮， 其中所说的牛痘病毒株是 EM-63株。
6. 如权利要求 1 的兔皮， 其中所说的接种是皮下接种， 按每只 1.5 - 3 千克的家兔注射 100到 250处， 每处注射每毫升含 10ό- 109个病毒的溶液 0.1一 0.4毫升进行。
7. 如权利要求 1 的兔皮， 其中所说的家兔是曰本大耳白兔。
8. 如权利要求 1 的兔皮， 其中所说的家兔是新西兰白兔。
9. 如权利要求 1 的兔皮， 其中所说的家兔是中国本兔。
10. 如权利要求 1 的兔皮， 其中所说的家免是青紫兰兔。
1 1 . 如权利要求 1 的免皮， 其中所说的皮肤组织发痘良好是指皮肤组 织明显出痘， 颜色由红润转为紫红， 皮肤增厚， 皮下和臀部水肿。
12. 如权利要求 1 - I I 之任一的兔皮， 其具有大于或等于 0.5 iu/g 的 SART活性。
13. 如权利要求 1 - 1 1 之任一的兔皮， 其具有血管舒缓素生成抑制活 性。
14. 权利要求 1 - 13 之任一的兔皮的用途， 其特征在于将所说的兔皮 用于制备药品。
1 5. 权利要求 1 - 13 之任一的兔皮的用途； 其特征在于将所说的兔皮 用于制备保健品。
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