WO2004035816A1 - 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬 - Google Patents

高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬 Download PDF

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WO2004035816A1
WO2004035816A1 PCT/JP2003/013258 JP0313258W WO2004035816A1 WO 2004035816 A1 WO2004035816 A1 WO 2004035816A1 JP 0313258 W JP0313258 W JP 0313258W WO 2004035816 A1 WO2004035816 A1 WO 2004035816A1
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cholesterol
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Yuki Katayama
Mayumi Fujinaka
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Kyowa Medex Co., Ltd.
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    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring cholesterol in high-density lipoprotein (hereinafter abbreviated as HDL) in a sample, a reagent for measurement, and a kit for measurement.
  • HDL high-density lipoprotein
  • LDL low-density lipoprotein
  • VLDL ultra-low-density lipoprotein
  • CM chiral micron
  • HDL cholesterol Conventional methods for measuring cholesterol in HDL (hereinafter abbreviated as HDL cholesterol) consist of two steps: fractionation by ultracentrifugation, immunochemical methods, electrophoresis, precipitation, etc., and cholesterol quantification.
  • fractionation operation is complicated, requires a long time, and has a problem in terms of safety. Therefore, the measurement methods involving these separation operations were extremely inefficient and were not suitable for practical use.
  • serum or plasma can be reacted with cholesterol esterase, cholesterol oxidase, and bile salts, bile acid derivatives or dioctyls ⁇ phosuccinate in a buffer containing the enzyme to produce cholesterol in VLDL and LDL.
  • Reacts with ilD L cholesterol in advance measures the generated hydrogen peroxide, and then adds a nonionic, polyoxyethylene oxide group-containing surfactant to the reaction mixture to convert HDL cholesterol with the enzyme.
  • a method of specifically fractionating and quantifying HDL cholesterol Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • Serum is buffered at specific pH and temperature, containing cholesterol esterase, cholesterol ⁇ / reoxidase, bile acid detergents and non-ionic detergents from the knee.
  • There is known a method for measuring HDL cholesterol by reacting the enzyme with the enzyme in a liquid Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-128498.
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-128498.
  • the reaction between LDL cholesterol and the enzyme proceeds, then the reaction between HDL cholesterol and the enzyme proceeds, and measurement of HDL cholesterol becomes possible.
  • these methods required a long time to measure, and were not necessarily specific to HDL cholesterol ⁇ /.
  • Methods for measuring HDL cholesterol by aggregating lipoproteins other than HDL include, for example, dextran sulfate and other reagents for aggregating lipoproteins other than HDL, divalent metal salts, and chemically modified lipoproteins.
  • dextran sulfate and other reagents for aggregating lipoproteins other than HDL divalent metal salts, and chemically modified lipoproteins.
  • JP-A-8-131197 a reagent that forms a complex with a lipoprotein other than HDL, such as polyadione, and polyoxyethylene-polyoxypropylene condensation Measurement method using a surfactant that does not dissolve lipoproteins
  • poly-ones such as dextran sulfate, divalent metal salts, and certain non- A measuring method using an ionic surfactant and an albumin different from the sample-derived albumin
  • a method using serum or plasma with a lipoprotein fractionating agent (dextran) Polyanion such as sulfuric acid and magnesium ion
  • the mixture is treated with a solution containing a divalent cation, and the resulting mixture is subjected to an aionic surfactant (alkylsulfonic acid or bile acid or a derivative thereof) without separation of solid and liquid.
  • an aionic surfactant alkylsulfonic acid or bile acid or a derivative thereof
  • a method for measuring HDL cholesterol in serum or plasma which comprises reacting cholesterol esterase and cholesterol oxidase in the presence of cholesterol and measuring the generated hydrogen peroxide (Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-116169). No. 96), a substance that forms a complex with a lipoprotein other than HDL, such as polyadione, and a specific surfactant that does not dissolve the lipoprotein are added to a biological sample and then enzymatically added.
  • a method for measuring HD L cholesterol Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei 8-210393
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei 8-210393 Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei 8-210393
  • the cholesterol measurement method for aggregating lipoproteins other than HDL, although there is good correlation with the conventional reference method, the cholesterol measurement method is not affected by turbidity due to aggregates generated in the reaction. There are problems such as accuracy and excessive load on the automatic analyzer due to the precipitation of metal hydroxide generated by the reaction with the metal salt in the reaction solution during the washing of the reaction cell.
  • a biological sample and cholesterol esterase and cholesterol oxidase derived from a viscera may be analyzed using bile acid or a salt thereof and albumin.
  • a method for measuring HD L cholesterol in a biological sample by measuring the compound produced or eliminated by the enzyme reaction International Patent Publication No.
  • the HDL fraction In the presence of a nonionic surfactant with an HLB value of 16 or more, which has a reaction selectivity for lipoproteins, lipopin tin lipase and Z or cholesterol esterase that preferentially act on the HDL fraction And cholesterol oxidase to react and measure HDL cholesterol in a sample (WO 00/52480 Panfle Are known.
  • a nonionic surfactant with an HLB value of 16 or more which has a reaction selectivity for lipoproteins, lipopin tin lipase and Z or cholesterol esterase that preferentially act on the HDL fraction
  • cholesterol oxidase to react and measure HDL cholesterol in a sample
  • WO 00/52480 Panfle are known.
  • cholesterol in lipoproteins other than I-IDL is preferentially converted to hydrogen peroxide by acyl polyoxyethylene sorbitan ester, and the generated hydrogen peroxide is eliminated.
  • a method of enzymatically measuring HDL cholesterol by addition JP
  • turbidity caused by water-insoluble proteins may have an optical effect in a sample derived from a patient such as M proteinemia or myeloma. It is a big problem.
  • the concentration of salts in the reaction solution is increased to eliminate turbidity caused by water-insoluble proteins.
  • the method is generally known.
  • the presence of a high concentration of salts causes a decrease in specificity for HDL cholesterol and inactivation of the contained enzyme. In some cases, measuring HDL cholesterol in the presence of high concentrations of salts is often extremely difficult.
  • An object of the present invention is to provide a method for measuring HDL cholesterol, a measuring reagent and a measuring kit, which can be simply and accurately measured.
  • the present invention relates to the following [1] to [37].
  • Specimen and i) cholesterol esterol hydrolase and cholesterol oxidase, or ⁇ ) cholesterol ester hydrolase, oxidized capture enzyme and cholesterol dehydrogenase are combined with non-ionic surfactant
  • a method for measuring cholesterol in a high-density lipoprotein in a sample comprising reacting in an aqueous medium containing union and albumin, and measuring the generated hydrogen peroxide or reduced coenzyme.
  • nonionic surfactants polyanion, albumin, cholesterol
  • a reagent for measuring cholesterol in high-density lipoprotein comprising a cholesterol dehydrogenase, a cholesterol dehydrogenase and an oxidized coenzyme.
  • a kit comprising the first reagent and the second reagent, wherein the polyanion, the nonionic surfactant, the albumin and the hydrogen peroxide measuring reagent are combined with one or both of the first reagent and the second reagent.
  • a kit for measuring cholesterol in high-density lipoprotein wherein the kit contains cholesterol oxidase in the second reagent.
  • a reagent for measuring cholesterol ester hydrolase, a nonionic surfactant, albumin and hydrogen peroxide comprising a first reagent containing polyaion and a second reagent containing cholesterol mono-oxidase.
  • a kit for measuring cholesterol in high-density lipoprotein characterized in that the kit comprises at least one of the first reagent and the second reagent.
  • a kit comprising a first reagent and a second reagent, comprising: cholesterol ester hydrolase, polyadione, a nonionic surfactant, albumin and an oxidized coenzyme, the first reagent and the second reagent
  • a kit for measuring cholesterol in high-density lipoprotein wherein the kit comprises cholesterol monophosphate dehydrogenase as a second reagent.
  • a cholesterol esterase comprising a first reagent containing polyanion and a second reagent having cholesterol dehydrogenase;
  • a kit for measuring cholesterol in high-density lipoproteins characterized by containing an ionic surfactant, albumin and an oxidized coenzyme in one or both of the first reagent and the second reagent.
  • kit according to any one of [13] to [17], further comprising a bile acid derivative in one or both of the first reagent and the second reagent.
  • polyoxyethylene alkenylamine and polyoxyethylene polycyclic phenyl ether sulfate or anionic bile acid derivative A method for measuring cholesterol in high-density lipoprotein in a sample, comprising measuring hydrogen peroxide or reduced coenzyme produced by reacting with the above.
  • polyoxyethylene alkylamine or polyoxyethylene alkenylamine, polyoxyethylene polycyclic phenyl ether sulfate or anionic bile acid derivative, cholesterol esterase, cholesterol oxidase and hydrogen peroxide A reagent for measuring cholesterol in high-density lipoprotein, which comprises a reagent for measurement.
  • polyoxyethylene alkylamines or polyoxyethylene alkeleamines, polyoxyethylene polycyclic ether ether sulfates or anionic bile acid derivatives, cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase and oxidized coenzyme A reagent for measuring cholesterol in high-density lipoprotein, comprising:
  • kits comprising a first reagent and a second reagent, wherein the kit comprises cholesterol ester hydrolase, polyoxyethylene alkylamine or polyoxyethylene alkyl-noramine, polyoxyethylene polycyclic phenyl ether sulfate.
  • each of the anionic bile acid derivative and the hydrogen peroxide measuring reagent is optionally contained in one or both of the first reagent and the second reagent, and cholesterol
  • a kit comprising the first reagent and the second reagent, comprising cholesterol ester hydrolase, polyoxyethylene alkylamine or polyoxyethylenealkenylamine, polyoxyethylene polycyclic ether. Sulfate ester or anionic bile acid derivative and acid ligase coenzyme are optionally contained in either or both of the first and second reagents, and cholesterol dehydrogenase is included in the second reagent.
  • a kit for measuring cholesterol in high-density lipoprotein comprising:
  • kit according to [34] further comprising one or both of the first reagent and the second reagent containing a reagent for measuring a reduced enzyme.
  • the method for measuring HDL cholesterol of the present invention is a method for specifically measuring HD L cholesterol without eliminating cholesterol in lipoproteins other than HDL.
  • Samples used in the measurement method of the present invention include, for example, whole blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, saliva, amniotic fluid, urine, sweat, knee fluid, etc., and plasma and serum are preferred.
  • the cholesterol esterol hydrolase used in the present invention is not particularly limited as long as it has the ability to hydrolyze cholesterol esters.
  • cholesterol esterase and lipoprotein lipase derived from animals, plants or microorganisms can be used.
  • cholesterol esterase, lipoprotein lipase, and the like produced by a genetic engineering technique can also be used.
  • cholesterol esterase hydrolase unmodified cholesterol Both steal hydrolases and chemically modified cholesterol ester hydrolases can be used.
  • a commercially available cholesterol esterase can also be used.
  • cholesterol esterases include, for example, cholesterol esterase “Amano” 2 (CHE 2; manufactured by Amano Enzym), cholesterol esterase “Amano” 3 (CHE 3; manufactured by Amano Enzym), lipoprotein lipase (LPL311; manufactured by Toyobo Co., Ltd.), lipoprotein lipase "Amano” 6 (LPL6; manufactured by Amano Enzym), cholesterol esterase [COE313 (chemically modified cholesterol esterase); Manufactured by Toyobo Co., Ltd.].
  • two or more cholesterol estenole hydrolases can be used in combination.
  • groups that modify the enzyme include, for example, a group mainly composed of polyethylene glycol, a group mainly composed of polypropylene glycol, and a group composed of polypropylene glycol and polyethylene glycol.
  • groups of the group include a group having a copolymer, a group containing a water-soluble polysaccharide, a sulfopropyl group, a sulfoptyl group, a polyurethane group, and a group having a chelating function.
  • a group mainly containing polyethylene dalicol is preferable.
  • the water-soluble polybranches include dextran, punorelane, and soluble starch.
  • a functional group or a structure capable of reacting with the above-mentioned chemical modifying group and an amino group, a sulfoxyl group, a sulfhydryl group or the like of the enzyme is used. And the like, which have both.
  • the functional group or structure capable of reacting with the amino group in the enzyme include a carboxyl group, an active ester group (eg, N-hydroxysuccinimide group), an acid anhydride, an acid chloride, an aldehyde, an epoxide group, and a 1,3. —Propane snoretone, 1,4-butane sultone and the like.
  • Examples of the functional group or structure capable of reacting with the carboxyl group in the enzyme 'in include an amino group.
  • groups or structures reactive with sulfhydryl groups in enzymes include maleimide groups, Sulfide, a-haloester (eg, monoester) and the like.
  • Commercial products can also be used as chemical modifiers.
  • Commercially available chemical modifiers include Samplite VFM-4101, Sambright MEAC-5 OHS and Sambright MEC-5 OHS (having a group mainly composed of polyethylene glycol and an N-hydroxysuccinimide group).
  • Dethylentriamine mono-N, N, N ', N', N ', mono-pentaacetic anhydride having an anhydride structure (DTP A anhy dride; Gakusha, Ltd.), and the like.
  • the method for chemically modifying cholesterol ester hydrolase is not particularly limited.
  • cholesterol esterol hydrolase is dissolved in a buffer having a pH of 8.0 or more (for example, HEPES buffer), and the cholesterol ester hydrolase is dissolved at 0 to 55. It can be carried out by adding a 0.01 to 500-fold molar amount of the chemical modifier and stirring for 5 minutes to 5 hours.
  • the chemically modified cholesterol ester hydrolase used in the present invention the reaction solution itself or, if necessary, an unreacted chemical modifying agent or the like removed by an ultrafiltration membrane or the like is also used. You can also.
  • the concentration of cholesterol ester hydrolase used in the reaction is not particularly limited as long as it allows the measurement of HDL cholesterol according to the present invention.
  • the concentration is preferably 20 OUZmL, more preferably 0.02 to 1 ° OU / mL.
  • the cholesterol oxidase of the present invention is not particularly limited as long as it has the ability to oxidize cholesterol to generate hydrogen peroxide.
  • cholesterol oxidase derived from animals, plants or microorganisms, and genetic engineering Cholesterol oxidase produced by a suitable method can also be used.
  • Use commercially available products such as cholesterol oxidase "Amano" 1 (CHOD 1; manufactured by Amano Enzym), cholesterol monoreoxidase (CO-PE; manufactured by Kikkoman), and cholesterol oxidase (C00321; manufactured by Toyobo Co., Ltd.). You can also.
  • two or more cholesterol oxidases can be used in combination.
  • Cholesterol oxidase may be an unmodified enzyme or a chemically modified enzyme.
  • a chemically modified cholesterol oxidase can be produced, for example, by the above-mentioned chemical modification method using the above-mentioned chemical modifying agent.
  • the concentration of cholesterol oxidase used in the method of the present reaction is not particularly limited as long as it enables measurement of HDL cholesterol of the present invention. Preferably, the concentration is 0.02 to 10 OU / mL, more preferably.
  • the cholesterol dehydrogenase in the present invention is not particularly limited as long as it has an ability to oxidize cholesterol in the presence of an oxidized capture enzyme to generate a reduced coenzyme.
  • cholesterol dehydrogenase produced by a genetic engineering technique can be used. It is also possible to use a commercially available product such as cholesterol dehydrogen “Amose” 5 (CHDH 5; manufactured by Amano Enzym), etc.
  • CHDH 5 cholesterol dehydrogen “Amose” 5
  • two or more cholesterol dehydrogenases are combined.
  • the cholesterol dehydrogenase may be an unmodified enzyme or a chemically modified enzyme.
  • the chemically modified cholesterol dehydrogenase is, for example, as described above. It can be produced by the above-mentioned chemical modification method using a chemical modifier.
  • the concentration of cholesterol dehydrogenase used in the reaction method is not particularly limited as long as it allows measurement of the HDL cholesterol of the present invention, but it is 0.01 to 20 OU / mL in the reaction solution. , And more preferably 0.02 to 10 OU / mL.
  • Element is used.
  • the oxidized coenzyme include NAD, NAD P, Chio NAD, Chio NADP, and the like.
  • the albumin used in the present invention is not particularly limited as long as it allows the measurement of HDL cholesterol of the present invention, and examples thereof include albumin, poma, hidge, and human-derived albumin.
  • Preferred is serum albumin (BSA).
  • BSA serum albumin
  • Albumin produced by a genetic engineering technique can also be used.
  • two or more albumins can be used in combination.
  • the concentration of albumin in the measurement of HDL cholesterol of the present invention is not particularly limited as long as the concentration enables measurement of HDL cholesterol of the present invention. It is preferably 10%, more preferably 0.01-1%.
  • the polyanion used in the present invention is not particularly limited as long as it is a polyanion capable of measuring the HDL cholesterol of the present invention.
  • Examples thereof include dextran sulfate or a salt thereof, heparin or a salt thereof, and phosphotungstic acid. Or a salt thereof, sulfated cyclodextrin or a salt thereof, a sulfated oligosaccharide or a salt thereof, carrageenan, etc., and dextran sulfate or a salt thereof is preferable.
  • dextran sulfate include dextran sulfate having a molecular weight of 40,000, 80,000, 200,000, 500,000, 100,000, and 200,000.
  • sulfated oligosaccharides examples include sulfated agarose, sulfated trehalose, and chondroitin sulfate.
  • the salt examples include sodium salt, potassium salt, lithium salt, ammonium salt, magnesium salt and the like. Further, in the present invention, two or more kinds of polyadiones may be used.
  • the concentration of polyadione in the measurement of HDL cholesterol of the present invention is not particularly limited as long as the concentration enables measurement of HDL cholesterol of the present invention. Preferably it is ⁇ 10%, more preferably 0.01-1%.
  • the nonionic surfactant used in the present invention is not particularly limited as long as it is a nonionic surfactant capable of measuring HDL cholesterol of the present invention.
  • polyoxyethylene alkylamine, polyoxyethylene alkenylamine, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene anolenyl ether, polyoxyethylene aryl ether derivative, ethylenediaminetetrapolyoxyalkylene and the like can be mentioned.
  • polyoxyethylene alkylamine and polyoxyethylene alkenylamine are preferred.
  • polyoxyethylene alkylamine or polyoxyethylene alkenylamine examples include, for example, those represented by the general formula (I)
  • R represents a linear or branched alkyl group or alkenyl group
  • X represents a hydrogen atom or (CH 2 CH 2 ⁇ ) n H
  • m and n are the same or different and are 1 to 1 Represents an integer of 00
  • ⁇ m + n is an integer of 2 to 200.
  • alkyl in the polyoxyethylene-anolequinoleamine, the compound (I) and the polyoxyethylene alkyl ether include a straight-chain or branched alkyl having 6 to 30 carbon atoms, for example, hexyl, heptyl, octyl, isooctyl, Noel, Decyl, pendecyl, dodecyl (lauryl), tridecyl, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecinole, octadecyl (stearinore), nonadecinore, icosyl, henicosyl, docosyl, etc. Rara.
  • the alkenyl in the polyoxyethylene alkenylamine, the compound (I) and the polyoxyethylene alkenyl ether is preferably a straight-chain or branched carbon atom having 6 to 30 carbon atoms, such as hexenyl, hepteninole, octeninole, nonenyl, decenyl.
  • Citronellil Citronellil, Pendecenyl, Dodecenyl, Tridecenyl, Tetradeceninole, Pentadecenyl, Hexadeseninole, Heptadeceninole, Oreinole, Nona Deseninole, Eicoseninole, Heinecoseninole, Docosenele Trachoseninole, pentacoseninole, hexacoseninole, heptacoseninole, octacocenyl, nonacocenyl, triacontenyl and the like.
  • polyoxyethylene alkylamine or polyoxyethylene alkenylamine include, for example, Nymein L 201 (oxyethylene dodecylamine; Ohon Yushi Co., Ltd.), Nymeen L 207 (polyoxyethylene Dodecylamine; Nippon Oil & Fat Co., Ltd.), Nymein S204, Nymin S210 (polyoxyethylene octadecylamine; Nippon Yushi Co., Ltd.), eucor OD420 (polyoxyethylene octadecylamine; Nippon Emulsifier Co., Ltd.), Pionin D3104 (polyoxyethylene laurylamine; manufactured by Takemoto Yushi Co., Ltd.), Pyonin D3110 (polyoxyethylene laurylamine; manufactured by Takemoto Yushi Co., Ltd.), Bionin D3665 [Polyoxyethylene alkyl (soybean) amine; Takemoto Yushi Co., Ltd.], Pyonin D3661T
  • polyoxyethylene alkyl ether or polyoxyethylene alkenyl ether examples include, for example, Emulmin L90S (polyoxyethylene lauryl ether; manufactured by Sanyo Chemical Industries, Ltd.), Newcol 1310 (polyoxyethylene tridecyl) Ether; Nippon Emulsifier Co., Ltd.), BL AU NON—EN 1520 (polyoxyethylene oleyl ether; Aoki Yushi Co., Ltd.) and the like.
  • polyoxyethylene aryl ether derivatives examples include polyoxyethylene styrenated phenyl ether, polyoxyalkylene styrenated phenyl ether, polyoxyethylene styrenated methynolepheninole ether, and polyoxyethylene styrene ether.
  • examples include heninole ether condensate, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, and polyoxyethylene anolequinolepheninoleate enolephoslemanolede condensate.
  • polyoxyethylene aryl ether derivatives include, for example, Newcol 264, Newcol 710 (both polyoxyethylene Polynuclear phenyl ether; Nippon Emulsifier Co., Ltd.), Newcol 260F (polyoxyalkylene polycyclic phenyl ether; Nippon Emulsifier Co., Ltd.), Bionin D6310, Bionin D6320 ( In each case, polyoxyethylene stylinolepheninolete monoter condensate; Takemoto Yushi Co., Ltd., Nikkor R102 (polyoxyethylene nonylphenyl ether formaldehyde condensate; Nikko Chemicals Co., Ltd.) and the like are listed. Can be
  • ethylenediaminetetrapolyoxyalkylene examples include ethylenediaminepolyoxyethylene-polyoxypropylene condensate, ethylenediaminetetrapolyoxyethylene, ethylenediaminetetrapolyoxypropylene, and the like. '
  • ethylenediaminetetrapolyoxyalkylene are, for example, Adekipur pull nick TR 704, Aderipuru mouth nick TR 701, Adecapuru mouth nick TR 913 R (all Minpolyoxyethylene-polyoxypropylene condensate; manufactured by Asahi Denka Co., Ltd .; and Loop 32 TY-65 BI (ethylenediaminetetrapolyoxyalkylene; manufactured by NOF Corporation).
  • the number of polymerizations of the alkylene chain is preferably from 1 to 100, more preferably from 1 to 60.
  • polyoxyethylene polycyclic phenyl ether sulfate examples include, for example, polyoxyethylene styrenated phenyl ether sulfate, and polyoxyethylene pentinolephenyl ether sulfate.
  • polyoxyethylene polycyclic phenyl ether sulphate examples include, for example, Newcol 707 SF, 707 SN, 714 SF, 723 SF, 740 SF (any Also manufactured by Nippon Emulsifier Co., Ltd.).
  • Polyoxyet The number of the oxechylene chains in the polycyclic phenyl ether sulfate is preferably 1 to 100, more preferably 5 to 40.
  • nonionic surfactants may be used.
  • concentration of the nonionic surfactant in the method for measuring HD L cholesterol of the present invention is not particularly limited as long as it allows the measurement of the HDL cholesterol of the present invention. Is preferably 0.001 to 10%, more preferably 0.001 to 1%.
  • Examples of the bile acid derivative in the present invention include an anionic bile acid derivative, an amphoteric bile acid derivative, a nonionic bile acid derivative, and the like, and an anionic bile acid derivative is preferable. '
  • anionic bile acid derivatives include, for example, chololic acid or a salt thereof, taurocholic acid or a salt thereof, ku, lycocholic acid or a salt thereof, lithocholic acid or a salt thereof, dexocholic acid or a salt thereof.
  • Kenodeoxycholic acid or a salt thereof ursodeoxycholic acid or a salt thereof, 7-oxolithocholic acid or a salt thereof, 12-oxolithocholic acid or a salt thereof, 12-oxokenoxycholic acid or a salt thereof, 7-oxodoxycholic acid or a salt thereof, hyocholic acid or a salt thereof, hydoxycholic acid or a salt thereof, dehydrocholic acid or a salt thereof, and the like.
  • the salt include an ammonium salt, a lithium salt, a sodium salt, a potassium salt, a magnesium salt, a calcium salt and the like.
  • amphoteric bile acid derivatives include, for example, those represented by general formula (II)
  • R 1 is 3- (3-cholamidopropyl) dimethyl ammonium - a O group
  • R 2 is hydrogen Which is an atom or a hydroxyl group] [hereinafter, referred to as compound (II)].
  • compound (II) the compound (II) in which R 2 is a hydrogen atom is referred to as CH APS
  • CHAP SO the compound (I) in which R 2 is a hydroxyl group
  • Nonionic bile acid derivatives include, for example, those represented by the general formula (III) ( ⁇ )
  • X represents a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • R 3 and R 4 are the same or different and each represents a substituted or unsubstituted alkyl or a substituted or unsubstituted alkanol. (III)].
  • alkyl in the alkyl or alkanol examples include straight-chain or branched alkyl having 1 to 10 carbon atoms, such as methyl, ethinole, propinole, isopropinole, butynole, isoptinole, sec-petitinole, tert-pentinole, pentinole, neopentinole, and Xyl, heptyl, octyl, Noel, decyl and the like.
  • substituent in the substituted alkyl and the substituted alkanoyl include a hydroxyl group and a halogen atom.
  • Halogen atom means each atom of fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • R 3 and R 4 are both
  • substituent A a compound in which X, R 3 and R 4 are each a hydrogen atom, a substituent A and a substituent A is referred to as deo X y—
  • the concentration of the bile acid derivative is not particularly limited as long as the concentration of the HDL cholesterol of the present invention can be measured, but the concentration in the reaction solution is 0.001 to 10%. Is preferable, and 0.01 to 1% is more preferable.
  • Examples of the aqueous medium used in the method for measuring HD L cholesterol of the present invention include, for example, deionized water, distilled water, and a buffer, but a buffer is preferable.
  • Examples of the buffer used in the buffer include tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, borate buffer, and Good's buffer.
  • Good buffers include, for example, 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), bis (2-hydroxyxethyl) imino tris (hydroxymethyl) methane
  • TEP SO piperazine-N, N'-bis (2-hydroxypropanesulfonic acid)
  • POPSO 3- (4- (2-hydroxyxethyl) -1-piperazinyl) 12- Hydroxypropanesulfonic acid
  • HEPPSO 3- [4- (2-hydroxyxethyl) -1-piperazinyl] propanesulfonic acid [(H) EPPS], N- [tris (hydroxymethyl) methyl] glycine (T ricine), N, N-bis (2-hydric quichetyl) Glycine (Bicine), N-tris (hydroxymethylinole) Methyl-13-aminopropanesulfonic acid (TAPS), N-cyclohexyl
  • the concentration of the buffer is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for measurement, but is preferably 0.001 to 2.
  • OmolZL more preferably 0.005 to 1.
  • Examples of the method for measuring HD L cholesterol of the present invention include the following methods.
  • Specimen and i) cholesterol esterase and cholesterol oxidase, or ⁇ ) cholesterol esterase, oxidized coenzyme and cholesterol dehydrogenase are combined with nonionic surfactant, The reaction is carried out in an aqueous medium containing dione and albumin and, if necessary, stabilizers, preservatives, quencher of affected substances, reaction accelerators, etc.
  • HDL cholesterol in the sample can be measured by calculating the HDL cholesterol concentration in the sample from the value measured in (2) and the calibration curve prepared in advance. '' Measurement method 2 ''
  • HDL cholesterol in the sample can be measured by calculating the HDL cholesterol concentration in the sample from the value measured in (2) and the calibration curve prepared in advance.
  • Sample and i) cholesterol esterol hydrolase and cholesterol oxidase, or) cholesterol ester hydrolase, oxidized complement Enzymes and cholesterol dehydrogenase are combined with polyoxyethylene alkylamines or polyoxyethylene alkenylamines and polyoxystyrene polycyclic phenyl ether sulfates or anionic bile acid derivatives. Reaction in an aqueous medium containing, if necessary, polyaion, albumin, a stabilizer, a preservative, an influence substance erasing agent, a reaction accelerator, etc.
  • the HDL cholesterol in the sample can be measured by calculating the HDL cholesterol concentration in the sample from the value measured in (2) and a calibration curve prepared in advance.
  • the HDL cholesterol in the sample can be measured by calculating the HDL cholesterol concentration in the sample from the value measured in (2) and a calibration curve prepared in advance. .
  • Examples of the aqueous medium include the aforementioned aqueous medium.
  • Examples of the stabilizer include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), sucrose, calcium chloride and the like.
  • Examples of preservatives include sodium azide, antibiotics and the like.
  • Examples of the influence substance elimination agent include ascorbic acid oxidase for eliminating the influence of ascorbic acid.
  • Examples of 8 include enzymes such as colipase and phospholipase, and salts such as sodium sulfate and sodium chloride.
  • the reactions (1) and (2) are carried out simultaneously or sequentially under the same or different conditions, respectively, for example, at 10 to 50 ° C, preferably at 20 to 40 ° C. For 1 to 60 minutes, preferably for 2 to 30 minutes.
  • the amount of generated hydrogen peroxide can be measured, for example, with a reagent for measuring hydrogen peroxide.
  • the reagent for measuring hydrogen peroxide is a reagent for converting the generated hydrogen peroxide into a detectable substance.
  • the detectable substance include a dye and luminescence, but a dye is preferable.
  • the reagent for measuring hydrogen peroxide contains a peroxidative substance such as an oxidized chromogen and a peroxidase.
  • the oxidative coloring chromogen include the oxidative coloring chromogen described below.
  • the reagent for measuring hydrogen peroxide contains a chemiluminescent substance. Examples of the chemiluminescent substance include luminol, disorminol, lucigenin, ataridinium ester and the like.
  • the hydrogen peroxide is oxidatively chromogenic in the presence of the active peroxide.
  • Hydrogen peroxide can be quantified by reacting with the drug substance to generate a dye and quantifying the generated dye.
  • a reagent for measuring hydrogen peroxide containing a chemiluminescent substance hydrogen peroxide reacts with a chemical luminescent substance to form photons, and the generated photons are quantified to determine the excess. Oxygen and hydrogen can be determined.
  • oxidative coloring type chromogen examples include a leuco type chromogen and an oxidative coupling coloring type chromogen.
  • 'A leuco-type chromogen is a substance that is converted into a dye alone in the presence of a peroxide active substance such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • leuco chromogen examples include 10-N-carboxymethylcarbamoyl-13,7-bis (dimethylamino) -1; L0H-phenothiazine (CCAP), 10-N-methylcarbamoyl-3,7-bis (Dimethinoleamino) 1 10 H—Phenothiazine (MC DP), N— (Carboxymethylaminocarbonyl) 4,4,1-bis (dimethylamino) diphenamine sodium salt (£) A— 6
  • An oxidative coupling coloring chromogen is a substance in which two compounds are oxidatively coupled to form a dye in the presence of a peroxide active substance such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • a peroxide active substance such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • the combination of the two compounds include a combination of a coupler and an aniline, a combination of a coupler and a phenol, and the like.
  • the coupler include 4-aminoantipyrine (4-AA), 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazine, and the like.
  • anilines examples include N— (3-snolephopropyl) aniline, N—ethynole-N— (2-hydroxy-13-sulfopropyl) —3-methinorea diline (TOOS), N—ethizoleate N— (2— Hydroxy-3-sulfopropyl-1,3-dimethylaline (MA).
  • phenols examples include phenol, 4-chlorophenol, 3-methylphenol, and 3-hydroxy-2,4,6-triodebenzoic acid (HTIB).
  • the concentration of the peroxide active substance is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for the measurement. However, when peroxidase is used as the peroxide active substance, the concentration is preferably 1 to 100 kU / L.
  • the concentration of the oxidative coloring type chromogen is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for measurement, but is preferably 0.01 to 10 gZL.
  • Examples of the method for measuring reduced coenzyme include a method for measuring the absorbance of the generated reduced coenzyme, a method using a reagent for measuring reduced coenzyme, and the like.
  • the absorbance in the method for measuring the absorbance of reduced coenzyme is preferably from 300 to 500 nm, more preferably from 330 to 400 nm, and particularly preferably around 340 nm.
  • the reagent for measuring reduced coenzyme is a reagent for converting the produced reduced coenzyme into a detectable substance.
  • the detectable substance include a dye and the like.
  • the detectable substance is a dye
  • examples of the reagent for measuring a reduced-type capture enzyme include reagents containing diaphorase, an electron carrier, and a reduced-color-forming chromogen.
  • the electron carrier include 1-methoxy-15-methylphenazine methyl sulfate and the like.
  • reduced chromogenic chromogens include, for example, 3- (4,5-dimethinole 21-thiazolyl) -1,2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT), 2- (4-odofenolinole) -3 -(4-12 trofenanol)-5-(2,4-disulfophenyl) 1 2H-tetrazolium mononatrium salt (WST-1), 2-1 (4-1 fenodhenol) 13- (2,4 -Trofeninole-1-5- (2,4-disulfophenyl) -1-tetrazolium mononatridium salt (WST-3) and the like. (Reagent for measuring HD L cholesterol)
  • Examples of the reagent for measuring HDL cholesterol of the present invention include the following reagents.
  • Reagent containing cholesterol estenole hydrolase, cholesterol oxidase, nonionic surfactant, polyanion, albumin and a reagent for measuring hydrogen peroxide Reagent containing cholesterol estenole hydrolase, cholesterol oxidase, nonionic surfactant, polyanion, albumin and a reagent for measuring hydrogen peroxide.
  • a reagent containing cholesterol esterase, cholesterol oxidase, nonionic surfactant, polyanion, albumin, bile acid derivative, and a reagent for measuring hydrogen peroxide '' Reagents containing cholesterol esterase, cholesterol / dehydrogenase, nonionic surfactants, polyadiones, albumin and oxidized coenzymes 4
  • a reagent containing cholesterol esternole hydrolase, cholesterol monol dehydrogenase, a nonionic surfactant, polyanion, albumin, a bile acid derivative, and an oxidized coenzyme is provided.
  • a reagent containing cholesterol esterase, cholesterol monolase dehydrogenase, nonionic surfactant, polyanion, albumin, oxidized coenzyme, and reduced coenzyme measurement reagent is provided.
  • a reagent containing cholesterol monolester hydrolase, cholesterol dehydrogenase, nonionic surfactant, polyadione, albumin, bile acid derivatives, oxidized coenzyme, and reagents for reducing capsulase measurement is a reagent containing cholesterol monolester hydrolase, cholesterol dehydrogenase, nonionic surfactant, polyadione, albumin, bile acid derivatives, oxidized coenzyme, and reagents for reducing capsulase measurement.
  • a reagent containing cholesterol esteranol hydrolase, cholesterol oxidase, polyoxyethylene alkylamine or polyoxyethylene alkenylamine, polyoxyethylene polycyclic phenyl ether sulfate, and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing cholesterol esterase, cholesterol oxidase, polyoxyethylene alkylamine or polyoxyethylene alkenylamine, anionic bile acid derivatives, and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent comprising cholesterol esterase, cholesterol oxidase, polyoxyethylene alkylamine or polyoxyethylene alkenylamine, polyoxyethylene polycyclic phenyl ether sulfate, anionic bile acid derivative, and a reagent for measuring hydrogen peroxide.
  • a reagent comprising cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase, polyoxyethylene alkylamine or polyoxyethylenealkenylamine, polyoxyethylene polycyclic phenyl ether sulfate, and oxidized coenzyme.
  • a reagent containing cholesterol esteranol hydrolase, cholesterol dehydrogenase, polyoxyethylene alkylamine or polyoxyethylene alkenylamine, anionic bile acid derivative, and oxidized capture enzyme is provided.
  • Cholesterol esterase cholesterol monol dehydrogenase, polyoxyethylene alkylamine or polyoxyethylene alkenyleamine, polyoxyethylene polycyclic phenylene monoester sulfate, anionic bile acid derivative, oxidized capture enzyme and A reagent containing a reagent for measuring reduced type enzyme.
  • the cholesterol esterase, cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase, nonionic surfactant, polyaniline which are mentioned in the method for measuring HDL cholesterol of the present invention described above.
  • ON, albumin, fl tannic acid derivatives, reagents for measuring hydrogen peroxide, reagents for measuring oxidized coenzyme and reduced coenzyme can be used.
  • the reagent for measuring HD L cholesterol of the present invention may be stored, distributed and used in the form of a kit.
  • the form of the kit is not particularly limited, and may be any of a two-reagent system and a three-reagent system, but a two-reagent system is preferred.
  • cholesterol esternole hydrolase and cholesterol oxidase or cholesterol monolase dehydrogenase include the first reagent. May be contained separately in the first and second reagents, or separately in the second reagent.
  • cholesterol esterase is contained in the first reagent
  • cholesterol oxidase or cholesterol dehydrogenase is contained in the second reagent.
  • Polyadione may be contained in either or both of the first reagent and the second reagent, but is preferably contained in the first reagent.
  • the nonionic surfactant and albumin may be contained in either or both of the first and second reagents.
  • the oxidized coenzyme used in the assay using cholesterol dehydrogenase may be contained in either or both of the first reagent and the second reagent.
  • the reagent for measuring hydrogen peroxide may be contained in either or both of the first reagent and the second reagent, but when the reagent contains an oxidized coupling type chromogen, an oxidized coupling type It is preferable that each compound of the chromogen is contained in a separate reagent.
  • the reagent for measuring reduced coenzyme may be contained in one or both of the first reagent and the second reagent.
  • the bile acid derivative may be contained in either or both of the first reagent and the second reagent.
  • the kit of the present invention includes, for example, those of the following embodiments.
  • kits consisting of the first and second reagents, cholesterol esterase, poly-one, nonionic surfactant, albumin and hydrogen peroxide measuring reagents, bile acid derivatives as required, stabilization A high-density liposome, wherein the first reagent, the second reagent, and / or the second reagent optionally contain each of a preservative, a preservative, and a pesticide for affecting substances; and cholesterol oxidase is contained in the second reagent. Kit for measuring cholesterol in proteins.
  • a first reagent containing polyanion and a second reagent containing cholesterol oxidase, cholesterol esterase, nonionic surfactant, albumin and hydrogen peroxide measurement reagent, and bile if necessary Kit for measuring cholesterol in high-density lipoprotein characterized by optionally containing each of an acid derivative, a stabilizing agent, a preservative, and an eradicating agent in one or both of a first reagent and a second reagent.
  • a kit comprising a first reagent and a second reagent, wherein the cholesterol ester Hydrolytic enzymes, poly-ones, non-ionic surfactants, albumin and oxidized capture enzymes, if necessary, reagents for the measurement of reduced capture enzymes, bile acid derivatives, stabilizers, preservatives, and eradication agents for affected substances
  • a kit for measuring cholesterol in high-density lipoprotein wherein each of the first and second reagents contains any of them, and cholesterol dehydrogenase is contained in the second reagent.
  • a reagent for measuring reduced coenzyme, a bile acid derivative, a stabilizing agent, a preservative, and an eliminator for affecting substances are optionally contained in either or both of the first reagent and the second reagent.
  • a kit comprising the first reagent and the second reagent, wherein the cholesterol ester hydrolase, polyoxyethylene alkylamine or polyoxyethylene alkenylamine, polyoxyethylene polycyclic phenyl ether sulfate or anionic Bile acid derivatives and reagents for measuring hydrogen peroxide, and if necessary, polyadione, albumin, stabilizing agents, preservatives, and eliminators, and either or both of the first and second reagents
  • a kit comprising the first reagent and the second reagent, wherein the cholesterol ester hydrolase, polyoxyethylene alkylamine or polyoxyethylene alkenylamine, polyoxyethylene polycyclic phenyl / ether ether sulfate Alternatively, an anionic bile acid derivative and an oxidized coenzyme, if necessary, a reagent for measuring a reduced coenzyme, polyayon, albumin, a stabilizing agent, a preservative and an influence substance erasing agent, optionally a first reagent, A kit for measuring cholesterol in high-density lipoprotein, wherein the kit contains cholesterol dehydrogenase in one or both of the second reagents.
  • kits of the following embodiments are mentioned. It does not limit the range of Ming at all.
  • a reagent containing cholesterol esterase, polyanion, albumin, a nonionic surfactant and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • Kit 2 A reagent containing cholesterol oxidase and a reagent for measuring hydrogen peroxide. Kit 2
  • a reagent containing cholesterol esterase, polyanion, albumin, a nonionic surfactant, a bile acid derivative, and a reagent for measuring hydrogen peroxide is a medicine that uses cholesterol to raise cholesterol to a predefined level.
  • Kit 3 A reagent containing cholesterol oxidase and a reagent for measuring hydrogen peroxide. Kit 3
  • a reagent containing cholesterol esteranol hydrolase, polyadione, albumin, a nonionic surfactant, and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing cholesteryl nitrate enzyme, a bile acid derivative and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing polyanion, albumin, a nonionic surfactant, and a reagent for measuring hydrogen peroxide is a reagent containing polyanion, albumin, a nonionic surfactant, and a reagent for measuring hydrogen peroxide.
  • Kit 5 A reagent containing cholesterol esterase, cholesterol oxidase, and a reagent for measuring hydrogen peroxide. Kit 5
  • a reagent containing polyanion, albumin, a nonionic surfactant, a bile acid derivative, and a reagent for measuring hydrogen peroxide A reagent containing cholesterol esterase, cholesterol oxidase, and a reagent for measuring hydrogen peroxide.
  • Reagent containing polyaion, albumin, nonionic surfactant and reagent for measuring hydrogen peroxide Reagent containing polyaion, albumin, nonionic surfactant and reagent for measuring hydrogen peroxide.
  • a reagent containing cholesterol esterase, cholesterol oxidase, bile acid derivative, and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing cholesterol esterase, poly-one, albumin and a nonionic surfactant is provided.
  • a reagent containing cholesterol dehydrogenase and oxidized coenzyme is provided.
  • a reagent containing cholesterol esterase, polyadione, albumin, a nonionic surfactant and a bile acid derivative is provided.
  • a reagent containing cholesterol dehydrogenase and oxidized capture enzyme is provided.
  • First reagent A reagent containing cholesterol esterase, polyadione, albumin, and a nonionic surfactant.
  • Reagent containing cholesterol dehydrogenase, bile acid derivative and oxidized coenzyme Reagent containing cholesterol dehydrogenase, bile acid derivative and oxidized coenzyme.
  • a reagent containing cholesterol estenole hydrolase, polyadione, albumin and a nonionic surfactant is provided.
  • a reagent containing reagents for measuring cholesterol dehydrogenase, oxidized capture enzyme, and reduced coenzyme is provided.
  • a reagent containing cholesterol esternole hydrolase, polyadione, albumin, a nonionic surfactant and a bile acid derivative is provided.
  • a reagent containing reagents for measuring cholesterol dehydrogenase, oxidized capture enzyme, and reduced coenzyme is provided.
  • a reagent containing cholesterol esteranol hydrolase, polyanion, a / pamine and a nonionic surfactant is provided.
  • Kit 1 3 A reagent containing cholesterol dehydrogenase, oxidized coenzyme, bile acid derivative and reduced coenzyme measurement reagent. Kit 1 3
  • a reagent containing polyanion, anolebumin and a nonionic surfactant 5) 4 drugs
  • a reagent containing cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase, and oxidized coenzyme is a reagent containing cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase, and oxidized coenzyme.
  • Reagent containing polyaion, albumin, and nonionic surfactant containing polyaion, albumin, and nonionic surfactant.
  • a reagent containing cholesterol esternole hydrolase, cholesterol dehydrogenase, oxidized coenzyme, and bile acid derivatives is provided.
  • a reagent containing polyanion, albumin, a nonionic surfactant and a bile acid derivative is provided.
  • a reagent containing cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase and oxidized coenzyme is provided.
  • a reagent containing polyanion, albumin and a nonionic surfactant A reagent containing polyanion, albumin and a nonionic surfactant. ⁇ B type
  • a reagent containing a reagent for measuring cholesterol ester hydrolase, cholesterol dehydrogenase, oxidized coenzyme, and reduced coenzyme is provided.
  • Second reagent containing polyanion, albumin, and nonionic surfactant.
  • a reagent containing a cholesterol esterase, a cholesterol dehydrogenase, an oxidized coenzyme, a reagent for measuring reduced coenzyme, and a bile acid derivative is provided.
  • a reagent containing polyanion, albumin, a nonionic surfactant and a bile acid derivative is provided.
  • a reagent containing a cholesterol esternole hydrolase, a cholesterol denase enzyme, an oxidizing coenzyme, and a reagent for measuring a reduced enzymatic enzyme is provided.
  • a reagent containing polyanion, albumin and a reagent for measuring hydrogen peroxide is a reagent containing polyanion, albumin and a reagent for measuring hydrogen peroxide.
  • a reagent containing cholesterol esterase, cholesterol oxidase, a nonionic surfactant and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing polyanion, albumin, a bile acid derivative, and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing cholesterol esterol hydrolase, cholesterol oxidase, a nonionic surfactant, and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing a reagent for measuring polyanion, albumin and hydrogen peroxide is a reagent for measuring polyanion, albumin and hydrogen peroxide.
  • Kit 2 2 Cholesterol esterase, cholesterol oxidase, non-ionic A reagent containing a surfactant, a bile acid derivative, and a reagent for measuring hydrogen peroxide.
  • a reagent containing polyanion and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing cholesterol esterase hydrolase, cholesterol oxidase, albumin, a nonionic surfactant, and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing polyanion, a bile acid derivative, and a reagent for measuring hydrogen peroxide A reagent containing cholesterol esterase, cholesterol oxidase, albumin, a nonionic surfactant, and a reagent for measuring hydrogen peroxide.
  • a reagent having a chapter containing polyaeon and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing cholesterol esterase hydrolase, cholesterol oxidase, albumin, a nonionic surfactant, a bile acid derivative, and a measuring reagent for hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent comprising an anionic bile acid derivative and a reagent for measuring hydrogen peroxide.
  • Kit 2 6 A reagent containing cholesterol esterase, cholesterol oxidase, polyoxyethylene alkylamine or polyoxyethylene alkenylamine, and a reagent for measuring hydrogen peroxide. Kit 2 6
  • a reagent containing a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing cholesterol esteranol hydrolase, cholesterol oxidase, anionic bile acid derivative, polyoxyethylene alkylamine or polyoxetylenealkenylamine and a reagent for measuring hydrogen peroxide is a reagent for measuring hydrogen peroxide.
  • Reagent containing polyoxyethylene polycyclic phenyl ether sulfate and a reagent for measuring hydrogen peroxide Reagent containing polyoxyethylene polycyclic phenyl ether sulfate and a reagent for measuring hydrogen peroxide.
  • a reagent containing cholesterol esteranol hydrolase, cholesterol oxidized drone, polyoxyethylene alkylamine or polyoxyethylenealkamine, and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxidase, polyoxyethylene polycyclic phenyl ether sulfate, polyoxyethylene alkylamine or polyoxyethylene alkenylamine, and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • the kit for measuring HD L cholesterol in the present invention the cholesterol ester caro hydrolase, cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase, non-ionic Surfactants, polyadiones, albumin, bile acid derivatives, reagents for measuring hydrogen peroxide, reagents for measuring oxidized coenzyme and reduced coenzyme can be used.
  • the reagent for measuring HDL cholesterol and the kit for measuring HDL cholesterol of the present invention may contain the above-mentioned aqueous medium, stabilizer, preservative, influencing substance eliminator, reaction accelerator and the like, if necessary.
  • the reagent and the kit for measuring HDL cholesterol of the present invention may be in a lyophilized state or in a state of being dissolved in an aqueous medium.
  • the reagent is used after dissolving in an aqueous medium.
  • the content of cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxidase, and cholesterol dehydrogenase in the HDL cholesterol measuring reagent and the measuring kit of the present invention is 0.01 to 0.1% in a state of being dissolved in an aqueous medium.
  • the content is preferably 80 OUZmL, more preferably 0.02 to 40 OUZmL.
  • the content of the non-ionic surfactant in the reagent for measuring HDL cholesterol and the kit for measurement of the present invention is preferably such that the concentration in a state of being dissolved in an aqueous medium is 0.0001 to 10%, A content of 0.001 to 5% is more preferable.
  • the content of polyadione in the HDL cholesterol measuring reagent and the measuring kit ′ of the present invention is preferably such that the concentration in a state of being dissolved in an aqueous medium is 0.001 to 10%, and 0.01 to 10%. A content of 5% is more preferable.
  • the content of albumin in the reagent for measuring HDL cholesterol concentration and the kit for measurement of the present invention is preferably such that the concentration in a state of being dissolved in an aqueous medium is 0.001 to 10%, and 0.01 to 10%. A content of 5% is more preferable.
  • the content of the bile acid derivative in the reagent and the kit for measuring HD L cholesterol of the present invention is preferably such that the concentration in a state of being dissolved in an aqueous medium is 0.001 to 10%, and 0.01 to 5%. % Is more preferable.
  • a kit for measuring HDL cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • An HDL cholesterol measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • An HD L cholesterol measurement kit comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HDL cholesterol comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • An HD L cholesterol measurement kit comprising the following first and second reagents was prepared.
  • An HD L cholesterol measurement kit comprising the following first and second reagents was prepared.
  • An HD L cholesterol measurement kit comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HDL cholesterol comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • a kit for measuring HDL cholesterol comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • Physiological saline (HD L cholesterol concentration: 0. Omg / dL) and serum (HD L cholesterol concentration: 60. Omg / dL) were used as standard solutions, and the kit of Example 1 was used as a kit.
  • “absorbance” represents a value obtained by subtracting E1 from E2 based on two absorbances (E1 and E2) measured in the following reaction.
  • the standard solution (3 ZL) and the first reagent (0.24 mL) were added to the reaction cell, and the mixture was heated at 37 ° C for 5 minutes, and the absorbance (E 1) of the reaction solution was measured at the main wavelength of 600 nm and the sub wavelength. Measure at 700 nm, then add the second reagent (0.08 mL) to the reaction mixture, heat at 37 ° C for 5 minutes, and measure the absorbance (E 2) of the reaction mixture at the main wavelength. The measurement was performed at 600 nm and a side wavelength of 700 nm.
  • the HDL cholesterol in 40 human serum samples was determined using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Example 2 was used instead of the kit of Example 1. It was measured.
  • Example 5 The measurement of Example 5 was repeated except that the kit of Comparative Example 4 was used instead of the kit of Example 1. In the same manner as in the standard method, the Hitachi 71
  • Example 5 In the same manner as in Example 5, except that the kit of Comparative Example 5 was used in place of the kit of Example 1, the human blood and HDL cholesterol in the ⁇ 40 sample were analyzed using a Hitachi 7170 automatic analyzer. Was measured.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Comparative Example 6 was used instead of the kit of Example 1. did.
  • Example 5 From the comparison between Example 5 and Comparative Examples 7 to 12, the DCM method was used only for the measurement using a kit containing all of BSA, dextran sulfate sodium and polyoxyethylene alkylamine in addition to the cholesterol measurement enzyme. It was found that a good correlation coefficient was obtained with the measurement. Comparison between Example 5 and Example 6 reveals that a good correlation coefficient can be obtained with the DCM method even in the measurement using chemically modified cholesterol esterase. did. In addition, from the comparison between Example 5 and Example 7, and from the comparison between Example 6 and Example 8, in addition to bile for cholesterol measurement, BSA, dextran sodium sulfate, and polyoxetylene alkylamine, bile was also used. A good correlation with the measurement by the DCM method was also observed in the measurement using the kit to which sodium cholate, one of the acid derivatives, was added.
  • An HD L cholesterol measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • An HDL cholesterol measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • HD L cholesterol measurement kit consisting of the following first and second reagents was prepared.
  • Lithium heparin 0.5 g / L
  • a kit for measuring HDL cholesterol comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured by a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Example 9 was used instead of the kit of Example 1.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5 except that the kit of Example 10 was used instead of the kit of Example 1.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured by a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5 except that the kit of Example 11 was used instead of the kit of Example 1.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5 except that the kit of Example 12 was used instead of the kit of Example 1.
  • Table 2 shows the correlation coefficients between the measurement methods of Examples 13 to 16 and the measurement method by the DCM method.
  • Example 5 shows that a good correlation coefficient can be obtained for the DCM method even when a polyanion other than dextran sulfate sodium (molecular weight 500,000) is used. found.
  • a kit for measuring HDL cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • An HDL cholesterol measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • An HD L cholesterol measurement kit comprising the following first and second reagents was prepared.
  • An HDL cholesterol measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • An HDL cholesterol measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Example 17 was used instead of the kit of Example 1. '' Example 25 Measurement of HDL Cholesterol
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Example 18 was used instead of the kit of Example 1. ⁇
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Example 19 was used instead of the kit of Example 1.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5 except that the kit of Example 20 was used instead of the kit of Example 1.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Example 21 was used instead of the kit of Example 1.
  • Example 30 Measurement of HDL cholesterol HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Example 23 was used instead of the kit of Example 1.
  • Table 3 shows the correlation coefficients between the measurement methods of Examples 24 to 30 and the measurement method by the DCM method.
  • Example 5 it was found that even when a nonionic surfactant other than Nimeen L 207 (polyoxyethylene dodecylamine) was used, a good correlation coefficient was obtained for the measurement by the DCM method. . Also, from a comparison between Example 29 and Example 30, it was found that a good correlation coefficient was obtained with the measurement by the DCM method also in the measurement using the chemically modified cholesterol esterase. did
  • An HDL cholesterol measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • Second reagent (reagent e) HEPE S (pH 7.0) 0 mm o 1 / L
  • a kit for measuring HDL cholesterol comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • Nimeen S 204 0.05 g / L peroxidase 20 kU / L
  • a kit for measuring HJD L / ester comprising the following first and second reagents, was prepared.
  • An HD L cholesterol measurement kit comprising the following first and second reagents was prepared.
  • An HD L cholesterol measurement kit comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HDL cholesterol comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • An HD L cholesterol measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • Reagent F First Reagent
  • An HDL cholesterol measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • An HDL cholesterol measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • An HDL cholesterol measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • An HDL cholesterol measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • a kit for measuring HDL cholesterol comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • a kit for measuring HDL cholesterol comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • An HDL cholesterol measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5 except that the kit of Example 31 was used instead of the kit of Example 1.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Example 32 was used instead of the kit of Example 1.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Example 33 was used instead of the kit of Example 1.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Example 34 was used instead of the kit of Example 1.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured by a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Example 35 was used instead of the kit of Example 1.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5 except that the kit of Example 36 was used instead of the kit of Example 1.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Example 37 was used instead of the kit of Example 1.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured by a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Example 38 was used instead of the kit of Example 1.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Comparative Example 13 was used instead of the kit of Example 1.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5 except that the kit of Comparative Example 14 was used instead of the kit of Example 1. Comparative Example 21 Measurement of HDL Cholesterol
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Comparative Example 15 was used instead of the kit of Example 1.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured by a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5 except that the kit of Comparative Example 16 was used instead of the kit of Example 1.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5 except that the kit of Comparative Example 17 was used instead of the kit of Example 1.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Comparative Example 18 was used instead of the kit of Example 1.
  • Table 4 shows the correlation coefficients between the measurement methods of Examples 39 to 46 and Comparative Examples 19 to 24 and the measurement method by the DCM method.
  • Example 4 A kit for measuring HD L cholesterol, a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • An HD L cholesterol measurement kit comprising the following first and second reagents was prepared.
  • An HD L cholesterol measurement kit comprising the following first and second reagents was prepared.
  • An HDL cholesterol measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • An HDL cholesterol measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • An HDL cholesterol measurement kit comprising the following first and second reagents was prepared.
  • An HDL cholesterol measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • Newcol 740 S F 0.5 g / L
  • An HDL cholesterol measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • HDL cholesterol measurement kit consisting of the following first and second reagents Was prepared.
  • HDL cholesterol was measured in 40 human serum samples using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5 except that the kit of Example 47 was used instead of the kit of Example 1.
  • HDL cholesterol / re in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Example 48 was used instead of the chrysanthemum of Example 1. did.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured with an S-7170 type automatic analyzer in the same manner as in Example 5 except that the kit of Example 49 was used instead of the kit of Example 1.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Example 50 was used instead of the kit of Example 1.
  • Example 57 Measurement of HDL cholesterol HDL cholesterol in 40 human serum samples was analyzed using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5 except that the kit of Example 51 was used instead of the kit of Example 1. Was measured.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was analyzed using a Hitachi 710 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Example 5 was used instead of the kit of Example 1. Was measured.
  • Example 5 In the same manner as in Example 5, except that the kit of Comparative Example 25 was used instead of the kit of Example 1, the HDL in 40 human serum samples was analyzed using a Hitachi 7170 automatic analyzer. The cholesterol was measured.
  • Example 5 In the same manner as in Example 5 except that the kit of Comparative Example 26 was used instead of the kit of Example 1, the HDL of 40 samples of human serum was analyzed using a Hitachi 710 automatic analyzer. The cholesterol was measured.
  • HDL cholesterol in 40 human serum samples was analyzed using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 5, except that the kit of Comparative Example 27 was used instead of the kit of Example 1. Was measured.
  • Table 5 shows the correlation coefficients between the measurement methods of Examples 53 to 58 and Comparative Examples 28 to 30 and the measurement method by the DCM method.
  • Example 5 9 Measurement of HD L Cholesterol in Serum Derived from M Proteinemia
  • Serum obtained from an M proteinemia patient was used as a sample, and the kit of Example 1 was used as a measurement kit.
  • HD L cholesterol was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as described above.
  • the absorbance after adding the first reagent to the sample and reacting for 5 minutes, that is, the absorbance (E 1) of the reaction solution before the addition of the second reagent is shown in Table 6, and the measured value of HDL cholesterol is shown in Table 7. Show.
  • Table 7 also shows measured values obtained by measuring the serum from the M proteinemia patient by the DCM method.
  • Comparative Example 3 1 Measurement of HD L cholesterol in serum from M proteinemia patient Serum obtained from M proteinemia patient was used as a sample, and the measurement was performed using the kit of Comparative Example 5 HDL cholesterol was measured using a Hitachi Model 710 automatic analyzer in the same manner as in Example 5.
  • the absorbance after adding the first reagent to the sample and reacting for 5 minutes, that is, the absorbance (E 1) of the reaction solution before the addition of the second reagent is shown in Table 6, and the measured value of HDL cholesterol is shown in Table 7. Show.
  • a method for determining HD L cholesterol, a reagent for measurement, and a kit for measurement which can be simply and accurately measured are provided.

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Abstract

検体と、i)コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、i)非イオン性界面活性剤、ポリアニオンおよびアルブミン、または、ii)ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレンアルケニルアミンおよびポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬。

Description

明 細 書
高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬
技術分野
本発明は、 検体中の高密度リポ蛋白 （以下、 HDLと略記する） 中のコレス テロールの測定方法、 測定用試薬および測定用キットに関する。
背景技術
生体中リポ蛋白は、その比重により高密度リポ蛋白、低密度リポ蛋白 （以下、 LDLと略記する） 、 超低密度リポ蛋白 （以下、 VLDLと略記する） 、 カイ 口ミクロン （CM) に分類されており、 それぞれ主にアポ蛋白の種類の違いに よって生体中での働きが大きく異なっており、 脂質組成もさまざまである。 そ の中で、 HDLは、 動脈壁を含めた各組織からコレステロールを受け取るため に細胞内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、 冠動脈硬化症をはじ めとする各種動脈硬化症の危険予防因子であり、 その血中レベルは動脈硬化性 疾患の発症予知の有用な指針となることが知られている。
従来の HDL中のコレステロール （以下、 HDLコレステロールと略記する ) の測定法は、 超遠心法、 免疫化学的方法、 電気泳動法、 沈殿法等による分画 操作とコレステロール定量操作の 2段階からなる。 しかしながら、分画操作は、 操作が煩雑であり、 長時間を要するものであり、 また、 安全性の点でも問題が あった。 従って、 これらの分離操作を伴う測定法は極めて効率が悪く、 実用化 に適さない方法であった。
近年、 上記の問題を解決するために、 種々の測定法が報告されている。 例え ば、 血清または血漿を、 コレステロールエステラーゼ、 コレステロールォキシ ダーゼ、 および、 胆汁酸塩、 胆汁酸誘導体またはジォクチルス ^ホサクシネー トを含有する緩衝液中で当該酵素と反応させ、 VLDLおよび LDL中のコレ ステロールを ilD Lコレステロールに先駆けて反応させ、 生成した過酸化水素 を測定した後、 非イオン,系のポリォキシエチレンォキシド基含有界面活性剤を 反応液に添加し、 HDLコレステロールと当該酵素とを反^させ、 HDLコレ ステロールを特異的に分別定量する方法 （特開昭 6 2-6 9 9 9 9号公報） 、 血清を、 特定の p Hおよび特定の温度の下、 膝臓由来のコレステロールエステ ラーゼ、 コレステロー^/レオキシダーゼ、 胆汁酸群の界面活性剤、 および、 非ィ オン系界面活性剤を含有する緩衝液中で当該酵素と反応させることにより HD Lコレステロールを測定する方法 （特開昭 6 3 - 1 2 6 4 9 8号公報） が知ら れている。 特許文献 2に記載の測定法では、 まず、 L D Lコレステロールと当 該酵素との反応が進行し、 次いで、 HD Lコレステロールと当該酵素との反応 が進行し、 HD Lコレステロールの測定が可能となる。 し力、しながら、 これら の測定法は、 測定に長時間を要し、 また、 必ずしも、 HD Lコレステロー^/に 特異的な測定法でほなかった。
HD L以外のリポ蛋白を凝集させて HD Lコレステロールを測定する方法と しては、 例えばデキストラン硫酸等の HD L以外のリポ蛋白 凝集させる試薬、 2価の金属塩、 および、 化学的に修飾された酵素を用いる測定法 （特開平 8— 1 3 1 1 9 7号公報） 、 ポリア二オン等の HD L以外のリポ蛋白と複合体を形 成する試薬と、 ポリオキシエチレン一ポリオキシプロピレン縮合物等の.リポ蛋 白を溶解しない界面活性剤とを用いる測定法 （特開平 8— 2 0 1 3 9 3号公報 ) 、 デキストラン硫酸等のポリア-オン、 2価の金属塩、 特定の非イオン性界 面活性剤および試料由来のアルブミンとは別異のアルブミンとを用いる測定法 (特開平 9 _ 2 8 5 2 9 8号公報） 、 血清または血漿を、 リポ蛋白分画剤 （デ キストラン硫酸等のポリア二オンとマグネシウムィオン等の 2価陽イオンとの 組み合わせ） を含む溶液で処理し、 得られた混合液を固体および液体の分離処 理することなく、 ァユオン性界面活性剤 （アルキルスルホン酸または胆汁酸も しくはその誘導体) の存在下に、 コレステロールエステラーゼおよびコレステ ロールォキシダーゼと反応させ、 生成した過酸化水素を測定することを特徴と する血清または血漿中の HD Lコレステロールを測定する方法 （特開平 8— 1 1 6 9 9 6号公報） 、 生体試料に、 ポリア二オン等の HD L以外のリポ蛋白質 と複合体を形成する物質と、 リポ蛋白質を溶解しない特定の界面活性剤とを添 加した後、 酵素的に HD Lコレステロールを測定する方法 （特開平 8— 2 0 1 3 9 3号 報） 等が知られている。 し力 しながら、 これらの HD L以外のリポ蛋白を凝集させる HD Lコレステ ロール測定法においては、 従来の基準法と良好な相関性があるものの、 反応で 生成する凝集物による濁りに起因する不正確性、 反応セルのアル力リ洗浄の際 に、 反応液中の金属塩との反応で生成する金属水酸化物の析出による自動分析 装置への過度の負荷等の問題がある。
HD L以外のリポ蛋白を凝集させずに HD Lコレステロールを測定する方法 としては、 例えば、 生体試料と、 勝臓由来のコレステロールエステラーゼおよ びコレステロールォキシダーゼとを、 胆汁酸もしくはその塩およびアルブミン 存在下に反応させ、 当該酵素反応により消寳または生成する化合物を測定する ことによる生体試料中の HD Lコレステロールの測定方法 （国際公開第 9 7 / 4 0 3 7 6号パンフレツト） 、 HD L画分に対して反応選択性をもつ H L B値 が 1 6以上の非イオン性界面活性剤の存在下に、 検体と、 HD L画分に優先的 に作用するリポプ口ティンリパーゼおよび Zまたはコレステロールエステラー ゼならびにコレステロール酸化酵素とを反応させて、 検体中の HD Lコレステ ロールを測定する方法 （国際公開第 0 0 / 5 2 4 8 0号パンフレツト） 等が知 られている。 また、 ァシルポリオキシエチレンソルビタンエステルにより I- ID L以外のリポ蛋白中のコレステロールを優先的に過酸化水素へ変換し、 生成し た過酸化水素を消去した後、 ポリォキシエチレンアルキルエーテルの添加によ り、 HD Lコレステロールを酵素的に測定する方法 （特開平 9一 2 9 9号公報 ) も知られている。
し力 しながら、 これらの HD L以外のリポ蛋白を凝集させない HD Lコレス テ口ールの測定法においては、 HD L以外のリポ蛋白中コレステロールの不完 全な消去や、 HD L以外のリポ蛋白中のコレステロールに対する非特異反応に 起因する測定値の不正確性が問題となる場合がある。
また、 光学的手法により検体中の特定物質の測定を行う場合、 M蛋白血症や 骨髄腫等の患者由来の検体では、 水不溶性の蛋白に起因する濁りが光学的な影 響を与えることが大きな問題となっている。 この光学的な影響を回避するため に、 反応液中の塩類を高濃度とし、 水不溶性蛋白に起因する濁りを解消させる 方法が一般的に知られている。 し力 しな力 ら、 HDLコレステロールの測定に おいては、 高濃度の塩類を存在させることにより、 HDLコレステロールに対- する特異性の低下や、 さらには含有されている酵素の失活を招く場合があるこ と力、ら、 高濃度の塩類の存在下での HDLコレステロールの測定は、 極めて困 難である場合が多い。
発明の開示
本発明の目的は、 簡便で、 かつ、 正確な測定ができる HDLコレステロール の測定方法、 測定用試薬および測定用キットを提供するこ にある。
本発明は、 下記 [1]〜 [37] に関する。
[1] 検体と、 i) コレステロールエステノレ加水分解酵素およびコレステ ロール酸化酵素、 または、 ϋ) コレステロールエステル加水分解酵素、 酸化型 捕酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、 非イオン性界面活性剤、 ポリア ユオンおよびアルブミンを含有する水性媒体中で反応させ、 生成した過酸化水 素または還元型補酵素を測定することを特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中 のコレステロールの測定方法。
[2] 水性媒体が、 さらに、 胆汁酸誘導体を含有する [1] 記載の測定方 法。
[3], 胆汁酸誘導体が、 陰イオン性胆汁酸誘導体である [2] 記載の測定 方法。
[4] 非イオン性界面活性剤が、 ポリオキシエチレンアルキルアミンまた はポリオキシエチレンアルケュルァミンである [1] 〜 [3] のいずれかに記 載の測定方法。 '
['5] ポリア二オンが、 デキストラン硫酸またはその塩である [1] 〜 [ 4] のいずれかに記載の測定方法。
[6] 非イオン性界面活性剤、 ポリア二オン、 アルブミン、 コレステロ一 ルエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試 薬を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
[7] 非イオン性界面活性剤、 ポリア二オン、 アルブミン、 コレステロ一 ルエステル加水分解酵素、 コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含 有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
[8] さらに、 還元型補酵素測定用試薬を含有する [7] 記載の試薬。
[9] さらに、 胆汁酸誘導体を含有する [6] 〜 [8] のいずれかに記載 の試薬。
[10] 胆汁酸誘導体が、 陰イオン性胆汁酸誘導体である [9] 記載の試 薬。
[11] 非イオン性界面活性剤が、 ポリォキシエチレンアルキルァミンま たはポリオキシエチレンアルケニルァミンである [6] 〜 [10〕 のいずれか に記載の試薬。
[12] ポリア-オンが、 デキストラン硫酸またはその塩である [6] 〜 [ 11 ] のいずれかに記載の試薬。
[13] 第一試薬および第二試薬からなるキットであって、ポリア二オン、 非イオン性界面活性剤、 アルブミンおよび過酸化水素測定試薬を、 第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは両方 ίこ含有し、 コレステロール酸化酵素を第二試薬 に含有することを特徵とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
[14] ポリアユオンを含有する第一試薬と、 コレステロ一ノレ酸化酵素を 含有する第二試薬とを含有し、 コレステロールエステル加水分解酵素、 非ィォ ン性界面活性剤、 アルブミンおよび過酸化水素測定試薬を、 第一試薬、 第二試 薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレ ステロール測定用キット。
[15] 第一試薬および第二試薬からなるキットであって、 コレステロ一 ルエステル加水分解酵素、 ポリア二オン、 非イオン性界面活性剤、 アルブミン および酸化型補酵素を、 第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、 コレステロ一ノレ脱水素酵素を第二試薬に含有することを特徴とする高密度リポ 蛋白中のコレステロール測定用キット。
[16] ポリア二オンを含有する第一試薬と、 コレステロール脱水素酵素 を 有する第二試薬とを含有し、 コレステロールエステル加水分解酵素、 非ィ オン性界面活性剤、 アルブミンおよび酸化型補酵素を、 第一試薬、 第二試薬の 'いずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステ ロール測定用キット。
[17] さらに、 還元型補酵素測定用試薬を、 第一試薬、 第二試薬のいず れかまたは両方に含有する [1 5] または [16] に記載のキット。
[18] さらに、 胆汁酸誘導体を、 第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは 両方に含有する [1 3] 〜 [17] のいずれかに記載のキット。
[19] 胆汁酸誘導体が、 陰イオン性胆汁酸誘導体である [18] 記載の キット。 . ， ，
[20] 非ィオン性界面活性剤が、 ポリォキシエチレンアルキルァミンま たはポリオキシエチレンアルケニルァミンである [1 3] 〜 [1 9] のいずれ かに記載のキット。
[21] ポリア-オンが、 デキストラン硫酸またはその塩である [13] 〜 [20] のいずれかに記載のキット。
[22] 検体と、 i) コレステロールエステノレ加水分解酵素およびコレス テロール酸化酵素、 またほ、 ii) コレステロールエステノレ加水分解酵素、 酸化 型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、 i ) 非ィオン性界面活性剤、 ポリアェオンおよびアルブミン、 または、 ϋ) ポリオキシエチレンアルキルァ. ミンもしくはポリオキシエチレンアルケニルァミンおよびポリオキシエチレン 多環フエニルエーテル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体を含有す る水性媒体中で反応させ、 生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定する ことを特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
[23] 検体と、 i) コレステロールエステノレ加水分解酵素およびコレス テロール酸化酵素、 または、 ii) コレステロールエステル加水分解酵素、 酸ィ匕 型補酵素おょぴコレステロール脱水素酵素とを、 ポリオキシエチレンアルキル ァミンもしくはポリオキシエチレンアルケニルァミンお びポリオキシェチレ ン多環フエニルエーテノレ硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体を含有 する水性媒体中で反応させ、 生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定す ることを特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
[24] さらにポリア-オンを含有する [23] 記載の方法。
[25] ポリアユオンが、 デキストラン硫酸またはその塩である [23] または [24] 記載の方法。
[26]' さらにアルブミンを含有する [23] 〜 [25] のいずれかに記 載の方法。
[27] ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレン アルケニルァミン、 ポリオキシエチレン多環フエニルエーテル硫酸エステルも しくは陰イオン性胆汁酸誘導体、 コレステロールエステル加水分解酵素、 コレ ステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有することを特徴とする 高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
[28] ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレン アルケエルァミン、 ポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテル硫酸エステルも しくは陰ィオン性胆汁酸誘導体、 コレステロールエステル加水分解酵素、 コレ ステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有することを特徴とする高密度 リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
[29] さらに、還元型補酵素測定用試薬を含有する [28]記載の試薬。
[30] さらにポリアユオンを含有する [27] 〜 [29] のいずれかに 記載の試薬。 ·
[31] ポリア二オンが、 デキストラン硫酸またはその塩である [30] に記載の試薬。
[32] さらにアルブミンを含有する [27]〜 [31] のいずれかに記 載の試薬。
[33] 第一試薬および第二試薬からなるキットであって、 コレステロ一 ルエステル加水分解酵素、 ポリオキシエチレンアルキルァミンもしくはポリオ キシエチレンァルケ-ノレァミン、 ポリオキシエチレン多環フエニルエーテル硫 酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体および過酸化水素測定試薬の各々 を任意に第一試薬、.第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、 コレステロール 酸化酵素を第二試薬に含有するとことを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレス テロール測定用キット。
[34] 第一試薬おょぴ第二試薬からなるキットであって、 コレステロ一 ルエステル加水分解酵素、 ポリオキシエチレンアルキルァミンもしくはポリオ キシエチレンァルケニルァミン、 ポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテル硫 酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体および酸ィヒ型補酵素の各々を任意 に第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、 コレステロール脱水素 酵素を第二試薬に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロ一 ル測定用キット。
[35] さらに、 第一試薬と第二試薬のいずれかまたは両方に、 還元型捕 酵素測定用試薬を含有する [34] 記載のキット。
[36] さらに、 第一試薬と第二試薬のいずれかまたは両方に、 ポリア二 オンを含有する [33] 〜 [35] のいずれかに記載のキット。
[37] 'さらに、 第一試薬と第二試薬のいずれかまたは両方に、 アルブミ ンを含有する [33] 〜 [37] のいずれかに記載のキット。 本発明の HDLコレステロールの測定方法は、 HDL以外のリポ蛋白中のコ レステロールを消去することなく、 HD Lコレステロールを特異的に測定する 方法である。
本発明の測定方法において用いられる検体としては、 例えば全血、 血漿、 血 清、 髄液、 唾液、 羊水、 尿、 汗、 膝液等が挙げられるが、 血漿および血清が好 ましい。
本努明におけるコレステロールエステノレカ卩水分解酵素としては、 コレステロ ールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に限定はなく、 例え ば動物、 植物または微生物由来のコレステロールエステラーゼ、 リポプロ.ティ ンリパーゼの他、 遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールエステ ラーゼ、 リポプロティンリパーゼ等も用いることができる。
コレステロールエステルカ卩水分解酵素としては、 無修飾のコレステロールェ ステル加水分解酵素も、 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解 酵素も使用することができる。 また、 コレステロールエステル加水分解酵素と しては市販品を使用することもできる。，
市販されているコレステロールエステル加水分解酵素としては、 例えばコレ ステロールエステラーゼ "Amano" 2 (C H E 2 ；天野ェンザィム社製） 、 コレ ステロールエステラーゼ "Amano" 3 ( C H E 3 ；天野ェンザィム社製) 、 リポ プロテインリパーゼ （L P L 3 1 1 ；東洋紡製社製） 、 リポプロテインリパー ゼ "Amano" 6 ( L P L 6 ；天野ェンザィム社製） 、 コレステロールエステラー ゼ [ C O E 3 1 3 (化学的に修飾されたコレステロールエステラーゼ） ；東洋 紡績社製] 等が挙げられる。 また、 本発明においては、 2種類以上のコレステ ロールエステノレ加水分解酵素を組み合わせて用いることもできる。 - コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾において当該酵素を修飾す る基 （化学修飾基） としては、 例えばポリエチレングリコールを主成分とする 基、 ポリプロピレングリコールを主成分とする基、 ポリプロピレングリコール とポリエチレングリコールの共重合体を有する基、 水溶性多糖類を含有する基、 スルホプロピル基、 スルホプチル基、 ポリウレタン基、 キレート機能を有する 基等が挙げられるが、 ポリエチレンダリコールを主成分とする基が好ましい。 水溶性多糠類としては、 例えばデキストラン、 プノレラン、 可溶性デンプン等が 挙げられる。
コレステロールエステル加水分解酵素を化学的に修飾するための試薬 （化学 修飾剤） としては、 上記の化学修飾基と、 酵素のアミノ基、 力ルポキシル基、 スルフヒドリル基等と反応し得る官能基または構造'とを併せ持つ化合物等が挙 げられる。 酵素中のアミノ基と反応し得る官能基または構造としては、 例えば カルボキシル基、 活性エステル基 （N—ヒドロキシサクシンイミ ド基等） 、 酸 無水物、 酸塩化物、 アルデヒド、 エポキシド基、 1， 3—プロパンスノレトン、 1 , 4—ブタンスルトン等が挙げられる。 酵素'中のカルボキシル基と反応し得 る官能基または構造としては、 例えばアミノ基等が挙げられる。 酵素中のスル フヒ ドリル基と反応性がある基または構造としては、 例えばマレイミド基、 ジ スルフイ ド、 aーハロエステル (ひ一ョードエステル等） 等が挙げられる。 化学修飾剤として、 市販品を使用することもできる。 市販されている化学修 飾剤としては、 ポリエチレングリコールを主成分とする基と N—ヒドロキシサ クシンィミド基とを有するサンプライト VFM— 4101、 サンブライト ME AC— 5 OHSおよびサンブライト MEC— 5 OHS (いずれも日本油脂社製 ) 、 ポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水物構造とを有するサ ンブライト A KMシリーズ (例えば、 サンブライト A KM— 1510等) 、 サ ンブライト ADMシリーズおよびサンブライト ACMシリーズ （いずれも日本 油脂社製） 、 ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有 する EPOX— 3400および M— EPOX— 5000 (いずれも Sheawater Polymers社製） 、 キレート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジェチレ ントリアミン一N， N， N' , N' ， ， N' ， 一ペンタ無水酢酸 （DTP A a nhy d r i d e ；同仁化学社製） 等が挙げられる。
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾方法は特に制限はなく、 例 えば、 コレステロールエステノレ加水分解酵素を pH8. 0以上の緩衝液 （例え ば H E PE S緩衝液） に溶解し、 0〜55でで0. 01〜 500倍モル量の化 学修飾剤を添加し、 5分間〜 5時間攪拌することにより行うことができる。 本 '発明に使用する化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素とし ては、 この反応液そのもの、 必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修 飾剤等を除去したものも使用することもできる。
本反応の方法に用いられるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度とし ては、 本楽明の HD Lコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制 限はないが、 反応液中で 0. 01〜20 OUZmLの濃度であることが好まし く、 0. 02~1◦ OU/mLであることがより好ましい。
本発明におけるコレステロール酸化酵素としては、 コレステロールを酸化し て過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく.、 例えば動 物、 植物または微生物由来のコレステロールォキシダーゼの他、 遺伝子工学的 な手法により製造されるコレステロールォキシダ一ゼ等も用いることができ、 コレステロールォキシダーゼ "Amano" 1 (CHOD 1 ；天野ェンザィム社製） 、 コレステロ一ノレォキシダーゼ (CO-PE ； キッコ一マン社製) 、 コレステ ロールォキシダーゼ (C00321 ；東洋紡績社製） 等の市販品を用いること もできる。 また、 本発明においては、 2種類以上のコレステロール酸化酵素を 組み合わせて用レ、ることもできる。
コレステロール酸化酵素は、 無修飾の酵素であっても、 化学的に修飾された 酵素であってもよい。 化学的に修飾されたコレステロール酸化酵素は、 例えば 前述の化学修飾剤を用いて、 前述の化学修飾方法により作製することができる。 本反応の方法に用いられるコレステロール酸化酵素の濃度としては、 本発明 の HD Lコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、 反応液中で◦. 01〜20 OUZmLの濃度であることが好ましく、 0. 02 〜10 OU/mLの濃度であることがより好ましい。
本発明におけるコレステロール脱水素酵素としては、 酸化型捕酵素の存在下 にコレステロールを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれ ば特に制限はなく、 例えば動物、 植物または微生物由来のコレステロ一ルデヒ ドロゲナーゼの他、 遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールデヒ ドロゲナーゼ等も用いることができる。 コレステロールデヒドロゲ^ "一ゼ " Amano" 5 (CHDH 5 ；天野ェンザィム社製） 等の市販品を用いることもで きる。 また、 本発明においては、 2種類以上のコレステロール脱水素酵素を組 み合わせて用いることもできる。 コレステロール脱水素酵素は、 無修飾の酵素 であっても、 化学的に修飾された酵素であってもよい。 化学的に修飾されたコ レステロール脱水素酵素は、 例えば前述の化学修飾剤を用いて、 前述の化学修 飾方法により作製することができる。
本反応の方法に用いられるコレステロール脱水素酵素の濃度としては、 本発 明の HDLコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、 反応液中で 0. 01〜20 OU/mLの濃度であることが好ましく、 0. 02 〜10 OU/mLの濃度であることがより好ましい。
本発明のコレステロール脱水素酵素を用いた測定法においては、 酸化型補酵 素が使用される。 酸化型補酵素としては、 例えば NAD、 NAD P、 チォ一 N AD、 チォー NAD P等が挙げられる。
本発明において用いられるアルブミンとしては、 本発明の HD Lコレステロ ールの測定を可能とするアルブミンであれば特に限定はなく、 例えばゥシ、 ゥ マ、 ヒッジ、 ヒト由来のアルブミン等が挙げられるが、 ゥシ血清アルブミン （ B S A) が好ましい。 また、 遺伝子工学的な手法により製造されたアルブミン も用いることができる。 本発明においては、 2種類以上のアルブミンを組み合 わせて使用することもできる。 本発明の HD Lコレステロールの測定における アルブミンの濃度としては、 本発明の HD Lコレステロールの測定を可能とす る濃度であれば特に制限はないが、 反応液中の濃度が 0 . 0 0 1〜1 0 %であ ることが好ましく、 0 . 0 1〜1 %がより好ましい。
本発明において用いられるポリア二オンとしては、 本発明の HD Lコレステ ロールの測定を可能とするポリァニオンであれば特に制限はなく、 例えばデキ ストラン硫酸もしくはその塩、 へパリンもしくはその塩、 リンタングステン酸 またはその塩、 硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、 硫酸化オリゴ糖また はその塩、 カラギーナン等が挙げられるが、 デキストラン硫酸もしくはその塩 が好ましい。デキストラン硫酸としては、例えば分子量が 4万、 8万、 2 0万、 5 0万、 1 0 0万、 2 0 0万等のデキストラン硫酸が挙げられる。 硫酸ィ匕オリ ゴ糖としては、 例えば硫酸化ァガロース、 硫酸化トレハロース、 コンドロイチ ン硫酸等が挙げられる。 塩としては、 例えばナトリゥム塩、 力リゥム塩、 リチ ゥム塩、 アンモユウム塩、 マグネシウム塩等が挙げられる。 また、 本 明にお いては、 ポリア二オンを 2種以上用いてもよい。
本発明の HD Lコレステロールの測定におけるポリア二オンの濃度としては 本発明の HD Lコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はな いが、 反応液中の濃度が 0 . 0 0 1 ~ 1 0 %であることが好ましく、 0 . 0 1 〜1 %がより好ましい。
本宪明において用いられる非イオン性界面活性剤としては、 本発明の HD L コレステロールの測定を可能とする非ィオン性界面活性剤であれば特に制限は なく、 例えばポリオキシエチレンアルキルァミン、 ポリオキシエチレンァルケ ニルァミン、 ポリオキシエチレンアルキルエーテル、 ポリオキシエチレンァノレ ケニルエーテル、 ポリオキシエチレンァリールエーテル誘導体、 エチレンジァ ミンテトラポリオキシアルキレン等が挙げられる。
非イオン性界面活性剤としては、 ポリオキシエチレンアルキルァミンおよび ポリオキシエチレンアルケニルァミンが好ましい。
ポリオキシエチレンアルキルァミンまたはポリオキシエチレンアルケニルァ ミンとしては、 例えば一般式 （ I )
(CH2CH20)mH
R-N ( I )
X .
[式中、 Rは直鎖または分岐状のアルキル基またはアルケニル基を表し、 X は水素原子または （C H 2 C H2〇） n Hを表し、 mおよび nは同一または異なつ て、 1〜1 0 0の整数を表し、■ m+ nは 2〜2 0 0の整数である] で表される 化合物 [以下、 化合物 ( I ) という]が挙げられる。
ポリオキシエチレンァノレキノレアミン、 化合物 （I ) およびポリオキシェチレ ンアルキルエーテルにおけるアルキルとしては、 直鎮または分枝状の炭素数 6 〜3 0の、 例えばへキシル、 ヘプチル、 ォクチル、 イソォクチル、 ノエル、 デ シル、 ゥンデシル、 ドデシル （ラウリル） 、 トリデシル、 テトラデシル （ミリ スチル） 、 ペンタデシル、 へキサデシル (セチル) 、 ヘプタデシノレ、 ォクタデ シル （ステアリノレ） 、 ノナデシノレ、 ィコシル、 へネィコシル、 ドコシル （ベへ ニル） 等が挙げらる。
ポリオキシエチレンアルケニルァミン、 化合物 （I ) およびポリオキシェチ レンァルケ-ルエーテルにおけるアルケニルとしては、 直鎖または分枝上の炭 素数 6〜3 0の、 例えばへキセニル、 ヘプテニノレ、 ォクテ二ノレ、 ノネニル、 デ セニル、 シトロネリル、 ゥンデセニル、 ドデセニル、 トリデセニル、 テトラデ セニノレ、 ペンタデセニル、 へキサデセニノレ、 ヘプタデセ二ノレ、 ォレイノレ、 ノナ デセニノレ、 エイコセニノレ、 ヘンエイコセニノレ、 ドコセ工ノレ、 トリコセニノレ、 テ トラコセニノレ、 ペンタコセニノレ、 へキサコセ二ノレ、 へプタコセニノレ、 ォクタコ セニル、 ノナコセニル、 トリアコンテニル等が挙げられる。
ポリォキシエチレンアルキルァミンまたはポリォキシエチレンアルケニルァ ミンの具体例 (製品) としては、 例えばナイミーン L 2 0 1 (ォキシエチレン ドデシルァミン； 0本油脂社製) 、 ナイミーン L 2 0 7 (ポリオキシエチレン ドデシルァミン； 本油脂社製） 、 ナイミーン S 2 0 4、 ナイミーン S 2 1 0 (ポリオキシエチレンォクタデシルァミン； 日本油脂社製） 、 ェユーコール O D 4 2 0 (ポリオキシエチレンォクタデシルァミン； 日本乳化剤社製） 、 パイ ォニン D 3 1 0 4 (ポリオキシエチレンラウリルァミン；竹本油脂社製） 、 パ ィォニン D 3 1 1 0 (ポリォキシエチレンラゥリルァミン；竹本油脂社製) 、 バイオニン D 3 6 0 5 [ポリオキシエチレンアルキル (大豆) ァミン；竹本油 脂社製] 、 パイォニン D 3 6 1 5 T [ポリオキシエチレンアルキル （牛脂） 了 ミン；竹本油脂社製] , B L AU N O N O 2 0 9 (ポリオキシエチレンォレイ ルァミノエーテル；青木油脂社製） 等が挙げられる。
ポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはポリオキシエチレンアルケニル エーテルの具体例 （製品） としては、 例えばエマルミン L 9 0 S (ポリオキシ エチレンラウリルエーテル；三洋化成社製） 、 ニューコール 1 3 1 0 (ポリオ キシエチレントリデシルエーテル； 日本乳化剤社製） 、 B L AU N O N— E N 1 5 2 0 (ポリオキシエチレンォレイルエーテル；青木油脂社製） 等が挙げら れる。
ポリオキシエチレンァリールエーテル誘導体としては、 例えばポリオキシェ チレンスチレン化フエニルエーテノレ、 ポリオキシアルキレンスチレン化フエ二 ノレエーテル、 ポリオキシエチレンスチレン化メチノレフェニノレエーテノレ、 ポリオ
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ェニノレエーテル縮合物、 ポリォキシエチレンアルキル フエニルエーテル、 ポリオキシエチレンァノレキノレフェニノレエーテノレホスレムァノレ デヒド縮合物等が挙げられる。
ポリオキシエチレンァリールエーテル誘導体の具体例 （製品） としては、 例 えばニューコール 2 6 0 4、 ニューコール 7 1 0 (いずれもポリオキシェチレ ン多環フエニルエーテル； 日本乳化剤社製）、 ニューコール 2 6 0 8 F (ポリオ キシアルキレン多環フエニルエーテル； 日本乳化剤社製）、 バイオニン D 6 3 1 0、 バイオニン D 6 3 2 0 (いずれもポリオキシエチレンスチリノレフヱニノレエ 一テル縮合物；竹本油脂社製）、 ニッコール R 1 0 2 0 (ポリオキシエチレンノ ニルフエニルエーテルホルムアルデヒ ド縮合物； 日光ケミカルズ社製） などが 挙げられる。
エチレンジアミンテトラポリォキシアルキレンとしては、 例えばエチレンジ ァミンポリオキシエチレン一ポリオキシプロピレン縮合物、 エチレンジァミン テトラポリオキシエチレン、 エチレンジアミンテトラポリオキシプロピレン等 が挙げられる。 '
エチレンジアミンテトラポリオキシアルキレンの具体例 （製品） としては、 例えばアデ力プル口ニック T R 7 0 4、 アデ力プル口ニック T R 7 0 1、 アデ カプル口ニック T R 9 1 3 R (いずれもエチレンジァミンポリオキシエチレン ーポリォキシプロピレン縮合物；旭電化社製） 、 ュ-ループ 3 2 T Y— 6 5 B I (エチレンジアミンテトラポリオキシアルキレン； 日本油脂社製） 等が挙げ られる。
ポリォキシエチレンアルキルァミン、 ポリォキシエチレンアルケニルァミン、 ポリオキシエチレンアルキルエーテル、 ポリォキシエチレンアルケニルエーテ ル、 ポリオキシエチレンァリールエーテル誘導体おょぴエチレンジアミンテト ラポリォキシアルキレンにおけるォキシアルキレン鎖 （ォキシェチレン鎖また はォキシプロピレン鎖） の重合数は、 好ましくは 1〜 1 0 0、 より好ましくは 1〜6 0である。
ポリオキシエチレン多環フエニルエーテル硫酸エステルとしては、 例えばポ リォキシエチレンスチレン化フエニルエーテル硫酸エステル、 ポリォキシェチ レンペンジノレフェニルエーテル硫酸エステル等が挙げられる。
ポリオキシエチレン多環フヱニルヱ一テル硫酸エステルの具体例 （製品） と しては、 例えばニューコール 7 0 7 S F、 7 0 7 S Nヽ 7 1 4 S F、 7 2 3 S F、 7 4 0 S F (いずれも日本乳化剤社製） 等が挙げられる。 ポリオキシェチ レン多環フェニルエーテル硫酸エステルにおけるォキシェチレン鎖の重合数と しては、 1〜 100が好ましく、 5〜40がより好ましい。
本発明においては、 非イオン性界面活性剤を 2種類以上用いてもよい。 本発 明の HD Lコレステロールの測定方法における非イオン性界面活性剤の濃度と しては、 本発明の HDLコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に 制限はないが、反応液中の濃度が 0. 00◦ 1〜10%であることが好ましく、 0. 001〜1 %がより好ましい。
本努明における胆汁酸誘導体としては、 例えば陰イオン性胆汁酸誘導体、 両 性胆汁酸誘導体、 非イオン性胆汁酸誘導体等が挙げられるが、 陰イオン性胆汁 酸誘導体が好ましい。 '
陰ィォン性胆汁酸誘導体としては、 例えばコ.ール酸もしくはその塩、 タウロ コール酸もしくはその塩、 ク、'リココール酸もしくはその塩、 リ トコール酸もし, くはその塩、 デォキシコール酸もしくはその塩、 ケノデォキシコール酸もしく はその塩、 ウルソデォキシコール酸もしくはその塩、 7—ォキソリ トコール酸 もしくはその塩、 12—ォキソリ トコール酸もしくはその塩、 12—ォキソケ ノデォキシコール酸もしくはその塩、 7—ォキソデォキシコール酸もしくはそ の塩、 ヒォコール酸もしくはその塩、 ヒォデォキシコール酸もしくはその塩、 デヒドロコール酸もしくはその塩等が挙げられる。 塩としては、 例えばアンモ' ニゥム塩、 リチウム塩、 ナトリウム塩、 カリウム塩、 マグネシウム塩、 カルシ ゥム塩等が挙げられる。
両性胆汁酸誘導体としては、 例えば一般式 （I I)
R1 -CH2-CH( 2) -CH2- S03~ (Π) [式中、 R1は、 3— （3—コラミドプロピル） ジメチルアンモ-ォ基であり、 R2は、 水素原子または水酸基である] で表される化合物 [以下、 化合物 （I I ) という] 等が挙げられる。 以下、 R 2が水素原子である化合物 (I I) を CH APSと、 R2が水酸基である化合物 （I) を CHAP SOとよぶ。
非イオン性胆汁酸誘導体としては、 例えば一般式 （I I I) (ΠΙ)
(Xは、水素原子または水酸基を表し、 R3および R4は、同一または異なって、 置換もしくは非置換のアルキル、 または、 置換もしくは非置換のアルカノィル を表す） で表される化合物 [以下、 化合物 （I I I) という]等が挙げられる。 アルキル、 アルカノィルにおけるアルキルとしては、 直鎖または分岐状の炭素 数 1〜 1 0の、 例えばメチル、 ェチノレ、 プロピノレ、 イソプロピノレ、 ブチノレ、 ィ ソプチノレ、 s e c一プチノレ、 t e r t—プチノレ、 ペンチノレ、 ネオペンチノレ、 へ キシル、 ヘプチル、 ォクチル、 ノエル、 デシル等が挙げられる。 置換アルキル および置換アルカノィルにおける置換基としては、 例えば水酸基、 ハロゲン原 子等が挙げられる。 ハロゲン原子は、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素の各原子を 意味する。 化合物 （I I I) のうち、 R 3および R 4が共に、
COCH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH2OH
(以下、 置換基 Aという） である化合物が好ましい。 以下、 X、 R3および R4 がそれぞれ、 水素原子、 置換基 Aおよび置換基 Aである化合物を d e o X y—
B I GCHAP、 水酸基、 置換基 Aおよび置換基 Aである化合物を B I GCH
APとよぶ。
胆汁酸誘導体の濃度としては、'本発明の HD Lコレステロールの測定を可能 とする濃度であれば特に制限はなレ、が、 反応液中の濃度が 0. 00 1〜1 0% であることが好ましく、 0. 0 1〜1 %がより好ましい。
本発明の HD Lコレステロール測定方法において使用される水性媒体として は、 例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられるが、緩衝液が好ましい。 緩衝液に用いる緩衝剤としては、 例えばトリス （ヒドロキシメチル） ァミノ メタン緩衝剤、 リン酸緩衝剤、 ホウ酸緩衝剤、 グッドの緩衝剤等が挙げられる。 グッドの緩衝剤としては、 例えば 2—モルホリノエタンスルホン酸 （MES ) 、 ビス （ 2—ヒ ドロキシェチル） イミノ トリス （ヒ ドロキシメチル） メタン
(B i s— T r i s) 、 N— （2—ァセトアミ ド） ィミノ二酢酸 （ADA) 、 ピぺラジン一 N, N' —ビス （2—エタンスノレホン酸） (P I PES) 、 N—
(2—ァセトアミ ド） 一 2 _アミノエタンスルホン酸 （ACES) 、 3—モル ホリノー 2—ヒ ドロキシプロパンスルホン酸 （MOP SO) 、 N， N—ビス （ 2—ヒ ドロキシェチル) 一 2—アミノエタンスルホン酸 （BES) 、 3—モル ホリノプロパンスルホン酸 （MOPS) 、 N— 〔トリス （ヒ ドロキシメチル） メチル〕 一 2—了ミノエタンスルホン酸 (TE S) 、 2 - 〔4一 （2—ヒ ドロ キシェチノレ） 一 1ーピぺラジュル〕 エタンスノレホン酸 （HE PES) 、 3一— 〔 N， N—ビス （2—ヒ ドロキシェチノレ） ァミノ〕 一 2—ヒ ドロキシプロパンス ルホン酸 （D I P SO) 、 N- 〔トリス （ヒ ドロキシメチル） メチル〕 一2— ヒ ドロキシー 3—アミノプロハ。ンスルホン酸（TAP SO) 、 ピぺラジン一 N， N' —ビス （2—ヒ ドロキシプロパンスルホン酸） （POPSO) 、 3 - 〔4 一 （2—ヒ ドロキシェチル） ー1—ピペラジニル〕 一2—ヒ ドロキシプロパン スルホン酸 （HEPPSO) 、 3- 〔4一 （2—ヒ ドロキシェチル） 一 1ーピ ペラジニル〕 プロパンスルホン酸 〔 （H) EPP S〕 、 N— 〔トリス （ヒ ドロ キシメチル） メチル〕 グリシン (T r i c i n e) 、 N， N—ビス （2—ヒ ド 口キシェチル） グリシン （B i c i n e) 、 N—トリス （ヒ ドロキシメチノレ） メチル一 3—ァミノプロパンスルホン酸 (TAPS) 、 N—シク口へキシルー
2—アミノエタンスノレホン酸 (CHE S) 、 N—シクロへキシノレ一 3—ァミノ 一 2—ヒ ドロキシプロパンスルホン酸 （CAPSO) 、 N—シクロへキシル一
3—ァミノプロパンスルホン酸 （CAPS) 等が挙げられる。
緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、 0. 00 1~2. Omo lZLが好ましく、 0. 005〜1. Omo l^Lがより好ま しい。
以下に、 本発明の HDLコレステロールの測定方法、 浪 (I定用試薬および測定 用キットを具体的に説明する。 13258
(HDLコレステロールの測定方法）
本発明の HD Lコレステロールの測定方法としては、 例えば以下の態様の方 法が挙げられる。
測定方法 1 ,
(1) 検体と、 i) コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロ ール酸化酵素、 または、 ϋ) コレステロールエステル加水分解酵素、 酸化型補 酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、 非ィオン性界面活性剤、 ポリア二 オンおよびアルブミンを含有し、 必要に応じ安定化剤、 防腐剤、 影響物質消去 剤、 反応促進剤等を含有する水性媒体中で反応させ、
( 2 ) 必要に応じて過酸化水素測定用試薬または還元型捕酵素測定試薬の存 在下に、 生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定し、
(3) (2) で測定した値と、 予め作成した検量線とから、 検体中の HDL コレステロール濃度を算出することにより、 検体中の HDLコレステロールを 測定することができる。 ' 測定方法 2 '
(1) 検体と、 i) コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロ ール酸化酵素、 または、 a) コレステロールエステルカ卩水分解酵素、 酸化型補 酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、 非イオン性界面活性剤、 ポリア二 オン、アルブミンおよび胆汁酸誘導体を含有し、必要に応じ安定化剤、防腐剤、 影響物質消去剤、 反応促進剤等を含有する水性媒体中で反応させ、
( 2 ) 必要に応じて過酸化水素測定用試薬または還元型補酵素測定試薬の存 在下に、 生成した過酸化水素または還元型捕酵素を測定し、
(3) (2) で測定した値と、 予め作成した検量線とから、 検体中の HDL コレステロール濃度を算出することにより、 検体中の HDLコレステロールを 測定することができる。
測定方法 3
(1) 検体と、 i) コレステロールエステノレ加水分解酵素およびコレステロ ール酸化酵素、 または、 ϋ) コレステロールエステル加水分解酵素、 酸化型補 酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、 ポリォキシエチレンアルキルァミ ンもしくはポリオキシェチレンァルケニルァミンぉよぴポリォキシェチレン多 環フエニルエーテル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体を含有し、 必要に応じポリアユオン、 アルブミン、 安定化剤、 防腐剤、 影響物質消去剤、 反応促進剤等を含有する水性媒体中で反応させ、
( 2 ) 必要に応じて過酸化水素測定用試薬または還元型補酵素測定試薬の存 在下に、 生成した過酸ィヒ水素または還元型捕酵素を測定し、
( 3 ) ( 2 ) で測定した値と、 予め作成した検量線とから、 検体中の HD L コレステロール濃度を算出することにより、 検体中の HD Lコレステロールを 測定することができる。
測定方法 4
( 1 ) 検体と、 i ) コレステロールエステノレ加水分解酵素およびコレステロ ール酸化酵素、 または、 ii ) コレステロールエステノレ加水分解酵素、 酸化型補 酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、 ポリォキシエチレンアルキルァミ ンもしくはポリオキシエチレンアルケニルァミン、 ポリオキシエチレン多環フ ェニルエーテル硫酸エステノレおよび陰ィオン性胆汁酸誘導体を含有し、 必要に 応じポリア二オン、 アルブミン、 安定化剤、 防腐剤、 影響物質消去剤、 反応促 進剤等を含有するする水性媒体中で反応させ、
( 2 ) 必要に応じて過酸化水素測定用試薬または還元型補酵素測定試薬の存 在下に、 生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定し、
( 3 ) ( 2 ) で測定した値と、 予め作成した検量線とから、 検体中の HD L コレステロール濃度を算出することにより、 検体中の HD Lコレステロールを 測定することができる。 .
水性媒体としては、 例えば前述の水性媒体等が挙げられる。 安定化剤として は、 例えばエチレンジァミン四酢酸 （E D T A) 、 シユークロース、 塩化カル シゥム等が挙げられる。 防腐剤としては、 例えばアジ化ナトリウム、 抗生物質 等が挙げられる。 影響物質消去剤としては、 例えばァスコルビン酸の影響を消 去するためのァスコルビン酸ォキシダーゼ等が挙げられる。 反応促進剤として 8 は、 例えばコリパーゼ、 ホスホリパーゼ等の酵素、 硫酸ナトリウム、 塩化ナト リゥム等の塩類等が挙げられる。
本測定法においては、 （1 ) および （2 ) の反応は、 同一または異なる条件 下、 同時または順次に、 それぞれ、 例えば 1 0〜 5 0 °Cで、 好ましくは 2 0〜 4 0 °Cで、 1 〜 6 0分間、 好ましくは 2〜 3 0分間行う。
生成した過酸化水素の量は、 例えば過酸化水素測定用試薬により測定するこ とができる。 過酸化水素測定用試薬は、 生成した過酸化水素を検出可能な物質 へ変換するための試薬である。 検出可能な物質としては、 例えば色素、 発光等 が挙げられるが、 色素が好ましい。 検出可能な物質が色素の場合には、 過酸ィ匕 水素測定用試薬は、 酸化発色型色原体およびペルォキシダーゼ等の過酸化活性 物質を含有する。 酸化発色型色原体としては、 例えば後述の酸化発色型色原体 が挙げられる。 検出可能な物質が発光の場合には、 過酸化水素測定用試薬は、 化学発光物質を含有する。 化学発光物質としては、 例えばルミノール、 ィソル ミノール、 ルシゲニン、 アタリジニゥムエステル等が挙げられる。
過酸化水素測定用試薬として、 酸化発色型色原体およびペルォキシダーゼ等 の過酸化活性物質を含有する試薬を用いる場合には、 過酸化水素は、 過酸化活 性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応して色素を生成し、 生成した色素を 定量することにより、 過酸化水素を定量することができる。 また、 化学発光物 質を含有する過酸ィヒ水素測定用試薬を用いる場合には、 過酸化水素は、 化学発 光物質と反応してフオトンを生じ、 生じたフオトンを定量することにより、 過 酸^水素を定量することができる。
酸化発色型色原体としては、 例えばロイコ型色原体、 酸化カップリング発色 型色原体等が挙げられる。'ロイコ型色原体は、 過酸化水素およびペルォキシダ ーゼ等の過酸化活性物質の存在下、 単独で色素へ変換される物質である。
ロイコ型色原体としては、 例えば 1 0— N—カルボキシメチルカルバモイル 一 3 ， 7—ビス （ジメチルァミノ） 一 ; L 0 H—フエノチアジン （C C A P ) 、 1 0— N—メチルカルバモイルー 3 , 7—ビス (ジメチノレアミノ） 一 1 0 H— フエノチアジン （MC D P ) 、 N— （カルボキシメチルァミノカルボニル） 一 4， 4， 一ビス （ジメチルァミノ） ジフエ-ルァミン ナトリウム塩 （£)A— 6
4) 、 4， 4 ' 一ビス （ジメチノレアミノ） ジフエニルァミン、 ビス 〔3—ビス (4一クロ口フエニル） メチノレー 4ージメチノレアミノフエ二ノレ〕 ァミン （BC
MA) 等が挙げられる。
酸化カツプリング発色型色原体は、 過酸化水素およびペルォキシダーゼ等の 過酸化活性物質の存在下、 2つの化合物が酸化的力ップリングして色素を生成 する物質である。 2つの化合物の組み合わせとしては、 カプラーとァニリン類 との組み合わせ、 カプラーとフエノール類との組み合わせ等が挙げられる。 カプラーとしては、 例えば 4—ァミノアンチピリン (4-AA) 、 3—メチ ルー 2—べンゾチアゾリノンヒ ドラジン等が挙げられる。 ァニリン類としては、 N— (3—スノレホプロピル） ァニリン、 N—ェチノレ一 N— (2—ヒ ドロキシ一 3一スルホプロピル) —3—メチノレア二リン (TOO S) 、 N—ェチゾレー N— (2—ヒ ドロキシー 3—スルホプロピル） 一 3， 5—ジメチルァ リン （MA
05) 、 N—ェチルー N— (2—ヒ ドロキシー 3—スルホプロピノレ） 一3, 5 —ジメ トキシァニリン （DAOS) 、 N—ェチルー N— (3—スルホプロピル ) 一 3—メチルァ-リン （TOP S) 、 N- (2—ヒ ドロキシ一 3—スルホプ 口ピル） -3, 5—ジメ トキシァニリン （HDAOS) 、 N， N—ジメチルー 3—メチルァニリン、 N， N—ジ （3—スルホプロピル） 一 3, 5—ジメ トキ シァニリン、 N—ェチル _N_ (3—スルホプロピル) —3—メ トキシァニリ ン、 N—ェチルー N— (3—スルホプロピル) ァニリン、 N—ェチルー N— ( 3—スルホプロピル） _3， 5—ジメ トキシァニリン、 N— （3—スルホプロ ピル） 一 3， 5ージメ トキシァニリン、 N—ェチル一N— (3—スルホプロピ ノレ） 一 3, 5—ジメチノレア二リン、 N—ェチノレー N— （2—ヒ ドロキシー 3— スノレホプロピノレ） ー3—メ トキシァニリン、 N—ェチルー N— （2—ヒ ドロキ シ一 3—スノレホプロピノレ） ァ-リン、 N—ェチノレー N— （3—メチノレフエ二ノレ ) 一 N， ーサクシニルエチレンジァミン (EMSE) 、 N—ェチルー N— (3 ーメチノレフエ二ノレ） 一 N' —ァセチノレエチレンジァミン、 N—ェチノレー N— ( 2—ヒ ドロキシー 3—スノレホプロピノレ） 一 4ーフノレオロー 3， 5—ジメ トキシ ァニリン （F— DAOS) 等が挙げられる。
フエノール類としては、 フエノール、 4—クロロフエノール、 3—メチルフ ェノール、 3—ヒドロキシー 2, 4， 6—トリョード安息香酸 （HT I B) 等 が挙げられる。
過酸化水素の測定において、 過酸化活性物質の濃度は、 測定に適した濃度で あれば特に制限はないが、 過酸化活性物質としてペルォキシダーゼを用いる場 合は、 1〜100 kU/Lが好ましい。 また、 酸化発色型色原体の濃度は、 測 定に適した濃度であれば特に制限はないが、 0. 01〜10 gZLが好ましい。 還元型補酵素の測定方法としては、 例えば生成した還元型補酵素の吸光度を 測定する方法、 還元型補酵素測定用試薬を用いる方法等が挙げられる。 還元型 補酵素の吸光度を測定する方法における吸光度としては、 300〜500 nm が好ましく、 330〜400 nmがより好ましく、 340 nm付近が特に好ま しい。 還元型補酵素測定用試薬は、 生成した還元型補酵素を検出可'能な物質へ 変換するための試薬である。 検出可能な物質としては、 例えば色素等が挙げら れる。 検出可能な物質が色素の場合の還元型捕酵素測定用試薬としては、 例え ばジァホラーゼ、 電子キヤリァーおよび還元発色型色原体を含有する試薬が挙 げられる。 電子キャリア一としては、 例えば 1—メトキシ一 5—メチルフエナ ジゥムメチルサルフェート等が挙げられる。 還元型捕酵素測定用試薬として、 ジァホラーゼ、 電子キヤリァーおよび還元発色型色原体を含有する試薬を用い る場合には、 還元発色型色原体が変換されて生成した色素を定量することによ り、 還元型補酵素を定量することができる。
還元発色型色原体としては、 例えば 3— （ 4， 5ージメチノレー 2一チアゾリ ル） 一 2, 5—ジフエ二ルー 2 H—テトラゾリゥム ブロミド （MTT) 、 2— (4—ョードフエ二ノレ） - 3 - (4一二トロフエ二ノレ） - 5 - (2, 4—ジス ルホフエニル) 一 2H—テトラゾリゥム モノナトリゥム塩 （WST— 1) 、 2 一 （4一ョードフエ二ノレ） 一3— （2， 4ージ-トロフエ二ノレ） 一 5— （2, 4一ジスルホフエニル） 一 —テトラゾリゥム モノナトリゥム塩 （WST— 3) 等が挙げられる。 (HD Lコレステロール測定用試薬）
本発明の HD Lコレステロール測定用試薬としては、 例えば以下の態様の試 薬が挙げられる。
5 薬丄
コレステロールエステノレ加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 非イオン 性界面活性剤、 ポリア二オン、 アルブミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有 する試薬。
試薬 2
コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 非イオン 性界面活性剤、 ポリア二オン、 アルブミン、 胆汁酸誘導体および過酸化水素測 定用試薬を含有する試薬。 ' コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロ一/レ脱水素酵素、 非ィォ ン性界面活性剤、 ポリア二オン、 アルブミンぉよび酸化型補酵素を含有する試 試薬 4
コレステロールエステノレ加水分解酵素、 コレステロ一ノレ脱水素酵素、 非ィォ ン性界面活性剤、 ポリア二オン、 アルブミン、 胆汁酸誘導体および酸化型補酵 素を含有する試薬。
試薬 5
コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロ一ノレ脱水素酵素、 非ィォ ン性界面活性剤、 ポリア二オン、 アルブミン、 酸化型補酵素および還元型補酵 素測定用試薬を含有する試薬。
試薬 6
コレステロ一ノレエステル加水分解酵素、 コレステロール脱水素酵素、 非ィォ ン性界面活性剤、 ポリア二オン、 アルブミン、 胆汁酸誘導体、 酸化型補酵素お よび還元型捕酵素測定用試薬を含有する試薬。 試 ,
コレステロールエステノレ加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 ポリォキ シエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルァミン、 ポリ ォキシェチレン多環フエニルエーテル硫酸エステルおよぴ過酸化水素測定用試 薬を含有する試薬。
試薬 8
コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 ポリォキ シエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルァミン、 陰ィ オン性胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬 9
コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 ポリオキ シエチレンアルキルァミンまたはポリオキシエチレンアルケニルァミン、 ポリ ォキシエチレン多環フエュルエーテル硫酸エステル、 陰ィオン性胆汁酸誘導体 および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。 .
試薬 1 0
コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール脱水素酵素、 ポリオ キシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンァルケニルァミン、 ポ リオキシエチレン多環フエニルエーテル硫酸エステルおよび酸化型補酵素を含 有する試薬。
試薬 1 1
コレステロールエステノレ加水分解酵素、 コレステロール脱水素酵素、 ポリォ キシエチレンアルキルァミンまたはポリオキシエチレンアルケニルァミン、 陰 ィォン性胆汁酸誘導体および酸化型捕酵素を含有する試薬。
試薬 1 2
コレステロールエステノレ加水分解酵素、 コレステロール脱水素酵素、 ポリオ キシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンァルケニルァミン、 ポ リォキシエチレン多環フエニルエーテル硫酸エステル、 陰イオン性胆汁酸誘導 体およぴ酸化型補酵素を含有する試薬。 試薬 1 3
コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール脱水素酵素、 ポリオ キシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンァノレケニノレアミン、 ポ リォキシエチレン多環フエニルエーテル硫酸エステル、 酸化型補酵素および還 元型捕酵素測定用試薬を含有する試薬。
試薬 1 4 '
コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール脱水素酵素、 ポリオ キシエチレンアルキルァミンまたはポリォキシエチレンアルケニルァミン、 陰 ィオン性胆汁酸誘導体、 酸化型補酵素およぴ還元型補酵素測定用試薬を含有す る試薬。
試薬 1 5
コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロ一ノレ脱水素酵素、 ポリオ キシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニゾレアミン、 ポ リォキシエチレン多環フエニノレエ一テル硫酸エステル、 陰イオン性胆汁酸誘導 体、 酸化型捕酵素および還元型捕酵素測定用試薬を含有する試薬。
本発明の HD Lコレステロール測定用試薬においては、 前述の本発明の H D Lコレステロールの測定方法において挙げられたコレステロールエステル加水 分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 コレステロール脱水素酵素、 非イオン性 界面活性剤、 ポリア二オン、 アルブミン、 fl旦汁酸誘導体、 過酸化水素測定用試 薬、 酸化型補酵素、 還元型補酵素測定用試薬を用いるこ^ができる。
(HD Lコレステロール測定用キット）
本発明の HD Lコレステロール測定用試薬は、 キットの形態で保存、 流通お よび使用されてもよい。 キットの形態としては、 特に制限はなく、 2試薬系、 3試薬系等のいずれであってもよいが、 2試薬系が好ましい。
第一試薬と第二試薬とからなる 2試薬系の HD Lコレステロ一ノレ測定用キッ トにおいては、 コレステロールエステノレ加水分解酵素と、 コレステロール酸化 酵素またはコレステロ一ノレ脱水素酵素とは、 第一試薬と第二試薬に別々に含有 されても、 第二試薬に一緒に含有されてもよいが、 第一試薬と第二試薬に別々 に含有される場合には、 コレステロールエステル加水分解酵素が第一試薬に、 コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素が第二試薬に含有さ れる態様が好ましい。 ポリア二オンは、 第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは 両方に含有されてもよいが、 第一試薬に含有されることが好ましい。 非イオン 性界面活性剤およびアルブミンは、 第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは両方 に含有されてもよい。 コレステロール脱水素酵素を用いた測定法において使用 される酸化型補酵素は、 第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは両方に含有され てもよい。
過酸化水素測定用試薬は、 第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは両方に含有 されてもよいが、 当該試薬が酸化カツプリング型色原体を含有する場合には、 酸ィ匕カップリング型色原体のそれぞれの化合物は別々の試薬に含有される態様 が好ましい。 還元型補酵素測定用試薬は、 第一試薬、 第二試薬のいずれかまた は両方に含有されてもよい。 また、 胆汁酸誘導体は、 第一試薬、 第二試薬のい ずれかまたは両方に含有されてもよい。
本発明のキットは例えば下記の態様のものが挙げられる。
第一試薬および第二試薬からなるキットであって、 コレステロールエステル 加水分解酵素、 ポリア-オン、 非イオン性界面活性剤、 アルブミンおよび過酸 化水素測定試薬、 必要に応じて胆汁酸誘導体、 安定化剤、 防腐剤、 影響物質消 去剤の各々を任意に第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、 コレ ステロール酸化酵素を第二試薬に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中 のコレステロール測定用キット。
ポリァニオンを含有する第一試薬と、 コレステロール酸化酵素を含有する第 二試薬とを含有し、 コレステロールエステル加水分解酵素、 非ィオン性界面活 性剤、 アルブミンおよび過酸化水素測定試薬、 必要に応じて胆汁酸誘導体、 安 定化剤、 防腐剤、 影響物質消去剤の各々を任意に第一試薬、 第二試薬のいずれ かまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール 測定用キット。
第一試薬および第二試薬からなるキットであって、 コレステロールエステル 加水分解酵素、 ポリア-オン、 非イオン性界面活性剤、 アルブミンおよび酸化 型捕酵素、 必要に応じて還元型捕酵素測定用試薬、 胆汁酸誘導体、 安定化剤、 防腐剤、 影響物質消去剤の各々を任意に第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは 両方に含有し、 コレステロール脱水素酵素を第二試薬に含有することを特徴と する高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
ポリア-オンを含有する第一試薬と、 コレステロール脱水素酵素を含有する 第二試薬とを含有し、 コレステロ一ノレエステル加水分解酵素、 非ィオン性界面 活性剤、 アルブミンおよび酸化型補酵素、 必要に応じて還元型補酵素測定用試 薬、 胆汁酸誘導体、 安定化剤、 防腐剤、 影響物質消去剤の各々を任意に第一試 薬、 第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋 白中のコレステロール測定用キット。
第一試薬および第二試薬からなるキッ トであって、 コレステロールエステル 加水分解酵素、 ポリォキシエチレンアルキルァミンもしくはポリォキシェチレ ンァルケニルァミン、 ポリオキシエチレン多環フエニルエーテル硫酸エステル もしくは陰ィオン性胆汁酸誘導体および過酸化水素測定試薬、 必要に応じてポ リア二オン、 アルブミン、 安定化剤、 防腐剤および影響物質消去剤の各々を任 意に第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、 コレステロール酸ィ匕 酵素を第二試薬に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロ一 ル測定用キット。
第一試薬おょぴ第二試薬からなるキットであって、 コレステロールエステル 加水分解酵素、 ポリォキシエチレンアルキルァミンもしくはポリォキシェチレ ンァルケニルァミン、 ポリオキシエチレン多環フエ二/レエ一テル硫酸エステル もしくは陰イオン性胆汁酸誘導体および酸化型補酵素、 必要に応じて、 還元型 補酵素測定用試薬、 ポリアユオン、 アルブミン、 安定化剤、 防腐剤および影響 物質消去剤の各々を任意に第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、 コレステロール脱水素酵素を第二試薬に含有することを特徴とする高密度リポ 蛋白中のコレステロール測定用キット。
より具体的には、 例えば以下の態様のキットが挙げられるが、 これらは本発 明の範囲を何ら限定するものではなレ、。
キット 1
ー 5
コレステロールエステル加水分解酵素、 ポリア二オン、 アルブミン、 非ィォ ン性界面活性剤および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。 キット 2
第一 薬
コレステロールエステル加水分解酵素、 ポリア二オン、 アルブミン、 非ィォ ン性界面活性剤、 胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。 一 薬
コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。 キット 3
第一 薬
コレステロールエステノレ加水分解酵素、 ポリア二オン、 アルブミン、 非ィォ ン性界面活性剤および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロ一ル酸ィ匕酵素、 胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有 する試薬。
キット 4
第一試薬
ポリア二オン、 アルブミン、 非イオン性界面活性剤および過酸化水素測定用 試薬を含有する試薬。 ,
第二試薬 . コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素および過酸 化水素測定用試薬を含有する試薬。 キット 5
第一試薬
ポリア二オン、 アルブミン、 非イオン性界面活性剤、 胆汁酸誘導体および過 酸化水素測定用試薬を含有する試薬。 コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素および過酸 化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット 6 '
第一試薬 '
ポリアユオン、 アルブミン、 非イオン性界面活性剤および過酸化水素測定用 試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 胆汁酸誘 導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット 7
薬
コレステロールエステル加水分解酵素、 ポリア-オン、 アルブミン よび非 イオン性界面活性剤を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット 8 '
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、 ポリア二オン、 アルブミン、 非ィォ ン性界面活性剤および胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素および酸化型捕酵素を含有する試薬。
キット 9
第一試薬 コレステロールエステル加水分解酵素、 ポリア二オン、 アルプミンおよび非 ィォン性界面活性剤を含有する試薬。
ー 桑
コレステロール脱水素酵素、 胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を含有する試 薬。
キット 1 0
第一試薬 '
コレステロ ルエステノレ加水分解酵素、 ポリア二オン、 アルブミンおよび非 ィオン性界面活性剤を含有する試薬。
第二試薬
コレス ロール脱水素酵素、 酸化型捕酵素および還元型補酵素測定用試薬を 含有する試薬。
キット 1 1
第一試薬
コレステロールエステノレ加水分解酵素、 ポリア二オン、 アルブミン、 非ィォ ン性界面活性剤および胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、 酸化型捕酵素および還元型補酵素測定用試薬を 含有する試薬。
キット 1 2
第一試薬
コレステロールエステノレ加水分解酵素、 ポリァニオン、ア^/プミンおよび非 ィオン性界面活性剤を含有する試薬。
第二試薬 .
コレステロール脱水素酵素、 酸化型補酵素、 胆汁酸誘導体および還元型補酵 素測定用試薬を含有する試薬。 キット 1 3
第一試薬
ポリア二オン、 ァノレブミンおよび非イオン性界面活性剤を含有する試薬。 5)4一 薬
コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール脱水素酵素および酸 化型補酵素を含有する試薬。
キット 1 4
iff一
ポリアユオン、 アルブミン、 非イオン性界面活性剤を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステノレ加水分解酵素、 コレステロール脱水素酵素、 酸化型 補酵素およぴ胆汁酸誘導体を含有する試薬。
キット 1 5
第一試薬
ポリア二オン、 アルブミン、 非イオン性界面活性剤および胆汁酸誘導体を含 有する試薬。
iff一 条
コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール脱水素酵素およぴ酸 化型補酵素を含有する試薬。
キット 1 6
第一試薬
ポリァニオン、 アルプミンおよび非イオン性界面活性剤を含有する試薬。 ー B式
コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール脱水素酵素、 酸化型 補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット 1 7
第一試薬
ポリア二オン、 アルブミン、 非イオン性界面活性剤を含有する試薬。 第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール脱水素酵素、 酸化型 補酵素、 還元型補酵素測定用試薬および胆汁酸誘導体を含有する試薬。
キット 1 8
一 薬
ポリア二オン、 アルブミン、 非イオン性界面活性剤および胆汁酸誘導体を含 有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステノレ加水分解酵素、 コレステロ一ル脱永素酵素、 酸ィ匕型 補酵素および還元型捕酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット 1 9
第一試薬
ポリア二オン、 アルブミンおよび過酸ィ匕水素測定用試薬を含有する試薬。 ^― si
コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 非イオン 性界面活性剤および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット 2 0
第一 B ^薬
ポリア二オン、 アルブミン、 胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含 有する試薬。
^一 5^¾¾
コレステロールエステノレ加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 非ィオン 性界面活性剤および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット 2 1
第一試薬
ポリア二オン、 アルブミンおよび過酸ィヒ水素測定用試薬を含有する試薬。 第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 非イオン 性界面活性剤、 胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。 . キット 2 2
第一試薬
ポリァニオンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステルカ卩水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 アルブミ ン、 非ィォン性界面活性剤および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット 2 3
第一試薬
ポリア二オン、 胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。 コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 アルブミ ン、 非ィォン性界面活性剤および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット 2 4
第一試薬
ポリアェオンおよび過酸化水素測定用試薬を章有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステルカ卩水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 アルブミ ン、 非イオン性界面活性剤、 胆汁酸誘導体および過酸化水素用測定試薬を含有 する試薬。
キット 2 5
第一試薬
陰ィオン性胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬 '
コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 ポリォキ シエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルァミンおよび 過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。 キット 2 6
第一試薬
過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
— 楽
コレステロールエステノレ加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 ァニオン 性胆汁酸誘導体、 ポリォキシエチレンアルキルァミンまたはポリォキシェチレ ンァルケニルァミンおよび過酸ィ匕水素測定用試薬を含有する試薬。
キット 2 7 .
―
ポリオキシエチレン多環フエニルエーテル硫酸ェステルぉよび過酸化水素測 定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステノレ加水分解酵素、 コレステロール酸化醉素、 ポリオキ シエチレンアルキルァミンまたはポリォキシエチレンァルケ-ルァミンおよび 過酸ィヒ水素測定用試薬を含有する試薬。
キット 2 8
第一試薬
過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
— B ¾¾
コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 ポリオキ シエチレン多環フエニルエーテル硫酸エステル、 ポリオキシエチレンアルキル ァミンまたはポリォキシエチレンアルケニルァミンおよび過酸化水素測定用試 薬を含有する試薬。
^ 本発明の HD Lコレステロ一ノレ測定用キットにおいては、 前述の本発明の H' D Lコレステロールの測定方法において挙げられたコレステロールエステルカロ 水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 コレステロール脱水素酵素、 非イオン 性界面活性剤、 ポリア二オン、 アルブミン、 胆汁酸誘導体、 過酸化水素測定用 試薬、 酸化型補酵素、 還元型補酵素測定用試薬を用いることができる。 本発明の HDLコレステロール測定用試薬および測定用キットには、 必要に 応じて前述の、 水性媒体、 安定化剤、 防腐剤、 影響物質消去剤、 反応促進剤等 が含有されてもよい。
本発明の HDLコレステロール測定用試薬および測定用キットは、 凍結乾燥 された状態でも、 水性媒体に溶解された状態でもよレ、。 凍結乾燥された状態の 試薬を用いて検体中の HD Lコレステロールを測定する場合には、 当該試薬は 水性媒体に溶解して使用される。
本発明の HDLコレステロール測定用試薬および測定用キットにおけるコレ ステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 コレステロール 脱水素酵素の含量としては、 水性媒体で溶角军された状態での濃度が 0. 01〜 80 OUZmLとなる含量が好ましく、 0. 02~40 OUZmLとなる含量 がより好ましい。 本発明の H D Lコレステロール測定用試薬および測定用キッ トにおける非ィ,オン性界面活性剤の含量としては、 水性媒体で溶解された状態 での濃度が 0. 0001〜10%となる含量が好ましく、 0. 001〜5%と なる含量がより好ましい。 本発明の H D Lコレステロール測定用試薬および測 定用キット'におけるポリア二オンの含量としては、 水性媒体で溶解された状態 での濃度が 0. 001〜 10%となる含量が好ましく、 0. 01〜5%となる 含量がより好ましい。
本発明の HD Lコレステロ一ノレ測定用試薬および測定用キットにおけるアルプ ミンの含量としては、 水性媒体で溶解された状態での濃度が 0. 001〜 10 %となる含量が好ましく、 0. 01〜 5%となる含量がより好ましい。 本 明 の HD Lコレステロール測定用試薬および測定用キットにおける胆汁酸誘導体 の含量としては、 水性媒体で溶解された状態での濃度が 0. 001〜 10 %と なる含量が好ましく、 0. 01~5%となる含量がより好ましい。
以下、 実施例により本発明をより詳細に説明するが、 これらは本 明の範囲 を何ら限定するものではない。 尚、 本実施例においては、 下記メーカーの試薬 および酵素を使用した。
HE PES (BDH L a b o r a t o r y社製） 、 EMS E (ダイトーケ ミックス社製） 、 デキストラン硫酸ナトリウム (分子量 5 0万) (フアルマシ ァ社製） 、 デキス トラン硫酸ナトリウム （分子量 8万） （I CN社製） 、 に カラギナン (純正化学社製) 、 へパリンリチウム (和光純薬社製) 、 リンタン グステン酸ナトリウム （関東化学社製） 、 ゥシ血清アルブミン （B S A；オリ ェンタル社製) 、 4ーァミノアンチピリン (埼京化成社製) 、 ペルォキシダー ゼ （東洋紡績社製） 、 L P L 3 1 1 (コレステロールエステル加水分解酵素； 東洋紡績社製） 、 C003 2 1 (コレステロールォキシダーゼ；東洋紡績社製 ) 、 LP L 6 (コレステロールエステル加水分解酵素；天野ェンザィム社製） 、 ナイミーン L 20 7 (ポリオキシエチレンドデシルァミン； 日本油脂社製） 、 ナイミーン S 204 (ポリオキシエチレンォクタデシルァミン； 日本油脂社製 ) 、 ナイミーン S 2 1 0 (ポリオキシエチレンォクタデシルァミン； 0本油脂 社製） 、 ニューコール OD420 (ポリオキシエチレンォクタデシルァミン； 日本乳化剤社製） 、 パイォェン D 3 1 04 (ポリオキシエチレンラウリルアミ ン；竹本油脂社製） 、 パイォニン D 3 1 1 0 (ポリオキシエチレンラウリルァ ミン；竹本油脂社製） 、 パイォニン D 360 5 [ポリオキシエチレンアルキル
(大豆） ァミン；竹本油脂社製] 、 二ユーコ一ノレ 2608 F (ポリオキシアル キレン多環フエニルエーテル； 日本乳化剤社製） 、 ニッコール R 1 020 (ポ リオキシエチレンノエルフエニルエーテルホルムアルデヒド縮合物； 日光ケミ カルズ社製） 、 アデカプル口ニック TR 704 (エチレンジァミンポリオキシ エチレン一ポリオキシプロピレン縮合物；旭電化社製） 、 エマルミン L 9 O S
(ポリォキシエチレンラゥリルエーテル,；三洋化成社製） 、 コール酸ナトリウ ム （ACROS社製） 、 タウロコール酸ナトリウム （東京化成社製） 、 グリコ コール酸ナトリウム （東京化成社製） 、 ニューコール 740_S F、 二ユーコ ール 707— S F (いずれもポリオキシエチレン多環フエニルエーテル硫酸ェ ステル塩； 13本乳化剤社製） 。
発明を実施するための最良の形態 · 参考例 1 化学修飾 L P L 3 1 1 (化学的に修飾された L P L 3 1 1) の調製 HE PE S緩衝液 （pi- 18. 5， 0. 1 5 m o 1 /L) に、 L P L 3 1 1 を 33 g/Lとなるように加え 5 °Cに冷却した後、 サンブライト VFM— 4 101 (日本油脂社製） を 330 g/Lとなるよう加え、 さらに 3時間反応 させた。 得られた修飾酵素溶液を精製分離せずそのまま化学修飾 LP L 31 1 として使用した。
実施例 1 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロ一ノレ測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 A)
HEPES (pH7. 5) 10 mm o 1 / L
EMS E 0. 3 g/L
'デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） 1. 0 g/L
Figure imgf000039_0001
ナイミーン L 207 0. 07 g/L 第二試薬 （試薬 a)
HEPES (p H 7. 0) 10 mm o 1 / JL
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレォキシダーゼ 20 kU/L
L P L 6 0. 05 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 実施例 2 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 A)
HEPES (ρ H 7. 5) 10 mm o 1 / L
EMS E 0. 3 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） 1. 0 g/L
B S A 2. 0
ナイミーン L 207 0. 07 第二試薬 （試薬 b)
HEPES (pH7. 0) 10 mm o 1 / L
4一ァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレオキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 LP L 31 1 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 実施例 3 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 A)
HEPES (pH7. 5) 10 mm o 1 / L
EMS E 0. 3 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） 1. 0 g/L
Figure imgf000040_0001
ナイミーン L 207 0. 07 g/L 第二試薬 （試薬 c)
HEPES (pH7. 0) 0 mm o 1 L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
コール酸ナトリウム 6. 0 g/L
ペルォキシダーゼ 20 kU/L
L P L 6 0. 05 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 実施例 4 HDLコレステロ一ノレ測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる H D Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 A)
HEPES (pH7. 5) 10 mm o 1 / L
Figure imgf000040_0002
デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） 1. 0 g/L
B S A 2. 0 g/L
ナイミーン L 207 0. 07 g/L 第二試薬 （試薬 d)
HEPE S (pH7. 0) 0 mm o 1 / L
4ーァミノアンチピリン 3 g/L
コール酸ナトリウム 0 g/L
ペルォキシダ一ゼ kU/L
化学修飾 LP L 31 1 2 kU/L
COO 321 0 kU/L 比較例 1 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 B)
HEPES (p H 7. 5) 10 mm o 1 / L
Figure imgf000041_0001
B S A 2. 0 g/L
第二試薬 （試薬 a)
HEPES (p H 7. 0) 10 mm o 1 Z L
'4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ペルォキシダーゼ 20 kU/L
L P L 6 0. 05 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 比較例 2 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 C)
HEPES (pH7. 5) 0 mm o 1 / L
Figure imgf000042_0001
デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 5 0万） 1. 0
第二試薬 （試薬 a)
HE PE S (p H 7. 0) 1 0 mm o 1 / L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレ才キシダーゼ 2 0 kU/L
L P L 6 0. 0 5 kU/L
COO 3 2 1 3. 0 kU/L 比較例 3 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 D)
HE PE S (p H 7. 5) 1 0 mm o \ / L· EMS E 0. 3 g/L
ナイミーン L 2 0 7 0. 0 7 g/L 第二試薬 （試薬 a)
HE P E S (p H 7. 0) 1 0 mm \ / L·
4—ァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレォキシダーゼ 2 0 kU/L
L P L 6 0. 0 5 kU/L
COO 3 2 1 3. 0 kU/L 比較例 4 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キット を調製した。 ：' ' 第一試薬 （試薬 E)
HE P E S (p H 7. 5) 1 0 mmo l /L
Figure imgf000042_0002
' デキス トラン硫酸ナトリウム （分子量 5 0万） 1. 0 g/L
Figure imgf000043_0001
第二試薬 （試薬 a)
HEPES (pH7. 0) 10 mm o 1 L
4一ァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレォキシダーゼ 20 kU/L
L P L 6 0. 05 ' kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 比較例 5 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる H D Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 F)
HEPES (pH7. 5) 10 mm o I / L
EMS E 0. 3 g/L
Figure imgf000043_0002
ナイミーン L 207 0. 07 g/L 第二試薬 （試薬 a)
HEPES (pH7. 0) 10 mm o 1 / L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ペルォキシダーゼ · 20 kUZL
L P L 6 0. 05 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 比較例 6 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる H D Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 G)
HEPES (pH7. 5) 10 mm o 1 / L
EMS E 0. 3 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） 1. 0 g/L ナイミーン L 2 0 7 0. 0 7
第二試薬 （試薬 a)
HE PE S ( H 7. 0) 1 0 mm o 1 /L
4—ァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ペルォキシダーゼ 2 0 kU/L
L P L 6 0. 0 5 kU/L
COO 3 2 1 , 3. 0 kU/L 実施例 5 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットを用いて、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒト血清 4
0検体中の HDLコレステロールを測定した。
(1) 検量線の作成
標準液として、 生理食塩水 （HD Lコレステロール濃度： 0. Omg/d L ) および血清 （HD Lコレステロール濃度： 6 0. Omg/d L) を、 キット として実施例 1のキットを用いて、 日立 7 1 70型自動分析装置により、 HD Lコレステロール濃度と 「吸光度」 との間の関係を示す検量線を作成した。 ここでの 「吸光度」 とは、 以下の反応で測定された 2つの吸光度 （E 1およ び E 2) を基に、 E 2から E 1を差し引くことにより得られた値を表す。 反応セルへ標準液 （3 Z L) と第一試薬 （0. 24mL) とを添加し 3 7°C で 5分間加温し、 反応液の吸光度 （E 1) を主波長 6 00 nm、 副波長 700 nmで測定し、 次いで、 この反応液に第二試薬 (0. 0 8mL) を添カ卩しさら に 3 7 °Cで 5分間加温し、 反応液の吸光度 （E 2) を主波長 6 0 0 nm, 副波 長 700 nmで測定した。
(2) ヒト血清検体と実施例 1のキットとの反応による当該検体における 「吸 光度」 の算出 '
( 1) の検量線の作成において用いた標準液の代わりにヒト血清検体を用い る以外は、 （1) の 「吸光度」 の算出方法と同様の方法により、 当該検体にお ける 「吸光度」 を算出した。 '
(3) ヒ ト血清検体中の HD Lコレステロール濃度の測定 ( 2 ) で算出した 「吸光度」 と、 （1 ) で作成した検量線とから、 各検体中 の HD Lコレステロール濃度を測定した。
実施例 6 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 2のキットを用いる以外は実施例 5の測 定法と同様にして、 日立 7 1 7 0形自動分析装置によりヒ ト血清 4 0検体中の HD Lコレステロールを測定した。
実施例 7 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 3のキットを用いる以外は実施例 5の測 定法と同様にして、 日立 7 1 7 0形自動分析装置によりヒ ト血清 4 0検体中の HD Lコレステロールを測定した。
実施例 8 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 4のキットを用いる以外は実施例 5の測 定法と同様にして、 日立 7 1 7 0形自動分析装置によりヒ ト血清 4 0検体中の HD Lコレステロールを測定した。
比較例 7 HD Lコレステロ一ノレの測定
実施例 1のキットの代わりに比較例 1のキットを用いる以外は実施例 5の測 定法と同様にして、 S立 7 1 7 0形自動分析装置によりヒ ト血清 4 0検体中の HD Lコレステロ一ノレを測定した。
比較例 8 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに比較例 2のキットを用いる以外は実施例 5の M 定法と同様にして、 日立 7 1 7 0形自動分析装置によりヒ ト血清 4 0検体中の HD Lコレステロールを測定した。 - 比較例 9 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに比較例 3のキットを用いる以外は実施例 5の測 定法と同様にして、 日立 7 1 7 0形自動分析装置によりヒト血清 4 0検体中の HD Lコレステロールを測定した。 ， 比較例 1 0 HD Lコレステロールの 定
実施例 1のキットの代わりに比較例 4のキットを用いる以外は実施例 5の測 定法と同様にして、 日立 7 1 7 0形自動分析装置によりヒト血清 4 0検体中の
HD Lコレステロールを測定した。
比較例 1 1 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに比較例 5のキットを用いる以外は実施例 5の測 定法と同様にして、 日立 7 1 7 0形自動分析装置によりヒト血、凊 4 0検体中の HD Lコレステロールを測定した。
比較例 1 2 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに比較例 6のキットを用いる以外は実施例 5の測 定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒト血清 4 0検体中の HD Lコレステロールを測定した。
次に、 実施例 5〜8および比較例 7〜1 2の測定において用いたヒト血清 4 .0検体を用いて、 クリニ力ルケミストリー第 4 5卷、 1 0号 （1 9 9 9年） に 記载された D CM法 （Designated Comparison Method) により当該検体中の H D Lコレステロールを測定し、 各実施例および比較例での値と比較した。 実施例 5〜 8および比較例 7〜 1 2それぞれの測定法と、 D C M法による測 定法との相関係数を表 1に示す。
表 1
Figure imgf000047_0001
実施例 5と、 比較例 7〜 1 2との比較から、 コレステロール測定用酵素以外 に、 B S A、 デキストラン硫酸ナトリゥムおよびポリオキシエチレンアルキル アミンをすべて含有するキットを用いた測定においてのみ、 D CM法による測 定と良い相関係数が得られることが判明した。 実施例 5と実施例 6との比較か ら、 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素を用いた測定に おいても、 D CM法による測定と良好な相関係数が得られることが判明した。 また、 実施例 5と実施例 7の比較、 実施例 6と実施例 8との比較から、 コレス テ口ール測定用酵奪、 B S A、 デキストラン硫酸ナトリウム、 ポリォキシェチ レンアルキルァミンの他に、 胆汁酸誘導体の 1つであるコール酸ナトリウムを 加えたキットを用いた測定においても、 D CM法による測定と良い相関が認め られた。
実施例 9 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬およぴ第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 H) HEPE S (pH7. 5) 10 mm o 1 L
Figure imgf000048_0001
デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 8万） 0. 5 g/L
Figure imgf000048_0002
ナイミーン L 207 0. 07 g/L 第二試薬 （試薬 a)
HEPE S (pH7. 0) 10 mm o 1 / L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ペル才キシダーゼ 20 kU/L
L P L 6 0. 05 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 実施例 10 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 I)
HEPE S (pH7. 5) 10 mm o 1 / L
Figure imgf000048_0003
i 一力ラギナン 0 5 g/L
Figure imgf000048_0004
ナイミーン L 207 0 07 g/L 第二試薬 （試薬 a)
HE P E S (p H 7. 0) 10 mm o 1
4—ァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレ才キシダーゼ 20 kU/L
L P L 6 0. 05 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 実施例 1 1 HDLコレステロ一ノレ測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬
HEPES (pH7. 5) 10 mm o 1/L EMS E 0. 3 g/L
へパリンリチウム 0. 5 g/L
Figure imgf000049_0001
ナイミーン L 207 0. 07 g/L 第二試薬 （試薬 a)
HEPES (pH7. 0) 10 mm o 1 /L
4—ァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ペルォキシダーゼ 20 kU/L
L P L 6 0. 05 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 実施例 12 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる H D Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 K)
HEPES (pH7. 5) 10 mm o 1 / L
EMS E 0. 3 g/L
リンタングステン酸ナトリウム 0. 5 g/L
B S A 2. 0 g/L
ナイミーン L 207 0. 07 g/L 第二試薬 （試薬 a)
HEPE S (pH7. 0) 10 mm o 1/L
4—ァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレォキシダーゼ 20 kU/L
L P L 6 0. 05 kU/L
COO 32 3. 0 kU/L 実施例 13 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 9のキットを用いる以外は実施例 5の測 定法と同様にして、 日立 71 70形自動分析装置によりヒ ト血清 40検体中の HDLコレステロールを測定した。
実施例 14 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 10のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 71 70形自動分析装置によりヒ ト血清 40検体中 の HDLコレステロールを測定した。
実施例 15 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 1 1のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 71 70形自動分析装置によりヒ ト血清 40検体中 の HDLコレステロールを測定した。
実施例 16 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 12のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 71 70形自動分析装置によりヒト血清 40検体中 の HDLコレステロールを測定した。
実施例 1 3〜16それぞれの測定法と、 D CM法による測定法との相関係数 を表 2に示す。
表 2
Figure imgf000051_0001
実施例 5と実施例 13〜 16との比較より、 デキストラン硫酸ナトリウム （ 分子量 50万） 以外のポリア二オンを用いた場合においても D CM法の測定に 対し良好な相関係数が得られることが判明した。
実施例 17 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロ一ノレ測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬し）
HEPES (pH7. 5) 10 mm o 1 / L
EMSE 0 3 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） 1 0 g/L
B S A 2 0 g/L
ニューコール OD 420 0 05 g/L 第二試薬 （試薬 a)
HEPES (ρ H 7. 0) 10 mm o 1 '/
4ーァミノアンチピリン 0. 3
ペルォキシダーゼ 20 kU/L
L P L 6. 0. 05 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 実施例 18 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロール測定用キット を調製した。 第一試薬 （試薬 M)
HE PES ( H 7. 5) 10 mm o \ h
Figure imgf000052_0001
デキス トラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） 1. 0 g/L
Figure imgf000052_0002
パイォニン D 3605 0. 01 g.
第二試薬 （試薬 a)
HEPES (pH7. 0) mm o 1 / L
4ーァミノアンチピリン 3 g/L
ぺノレオキシダ一で kU/L
L P L 6 05 kU/L
COO 321 0 kU/L 実施例 19 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 N)
HEPES (pH7. 5) 1 0 mm o 1 / L
Figure imgf000052_0003
デキストラン硫酸ナドリゥム （分子量 50万） 1 • 0 g/L
Figure imgf000052_0004
エマルミン L 90 S 0 • 05 g/L
:—試薬 (試薬 a )
HEPES (pH7. 0) 1 0 mm o 1 /L
4ーァミノアンチピリン 0 • 3 g/L
ペルォキシダーゼ 2 0 kU/L
L P L 6 0 - 05 kU/L
COO 321 3 0 kU/L 実施例 20 HDLコレステロ一ノレ測定用キット 以下の第一試薬および第二試薬からなる H D Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬〇） ,
HEPE S (pH7. 5) 1 0 mm o 1 / L
Figure imgf000053_0001
デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） 1. 0 g/L
Figure imgf000053_0002
ニューコール 2608 F 0. 2 g/L
第二試薬 （試薬 a)
HEPE S (pH7. 0) 10 mm o 1 / L
4—ァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ペルォキシダーゼ 20 kU/L
L P L 6 0. 05 kU/L
COO 3 2 1 3. 0 kU/L 実施例 2 1 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 P)
HEP E S (pH7. 5) 0 mm o 1 / L EMSE 0. 3 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） 1. 0 g/L
B S A ' 2. 0 g/L
ニッコール R 1 020 0. 2 g/L
第二試薬 （試薬 a)
HEPE S (pH7. 0) 10 mm o 1 Z L 4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L ぺノレオキシダーゼ 20 kU/L
L P L 6 0. 05 kU/L COO 32 3 · 0 kU/L 実施例 22 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 Q) '
HEPES (pH7. 5) 1 0 mm o 1 / L
EMS E 0 • 3 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） 1 - 0 g/L
B S A 2 • 0 g/L
アデカプノレ口ニック TR 704 1 • 5 g/L
二試薬 （試薬 a)
HEPES (pH7. 0) 1 0 mm o 1 / L
4—ァミノアンチピリン 0 • 3 g/L
ぺノレオキシタ"' tr 2 0 kU/L
L P L 6 0 • 05 kU/L
COO 321 3 0 kU/L 実施例 23 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 Q)
HEPES ( p H 7. 5) 10 雇 ιο ΐ/L
EMS E 0. 3 g
デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） 1. 0 g
B S A 2. 0 g
アデ力プルロニック T R 704 1. 5 g
第二試薬 （試薬 b)
HEPES (p H 7. 0) 10 mm o I /L 4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L ベルォキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 L P L 31 1 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 実施例 24 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 17のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 7170形自動分析装置によりヒト血清 40検体中 の HDLコレステロールを測定した。 ' 実施例 25 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 18のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 7170形自動分析装置によりヒ ト血清 40検体中 の HDLコレステロールを測定した。 』
実施例 26 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 1 9のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 7170形自動分析装置によりヒト血清 40検体中 の HD Lコレステロールを測定した。
実施例 27 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 20のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 7170形自動分析装置によりヒ ト血清 40検体中 の HDLコレステロールを測定した。
実施例 28 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 21のキットを用いる以外は実施例 ,5の測 定法と同様にして、 日立 7170形自動分析装置によりヒト血清 40検体中の HD Lコレステロールを測定した。
実施例 29 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 22のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 717◦形自動分析装置によりヒト血清 40検体中 の HDLコレステロ一 ·_；レを測定した。
実施例 30 HDLコレステロ一ノレの測定 実施例 1のキットの代わりに実施例 23のキットを用いる以外は実施例 5の測 定法と同様にして、 日立 71 70形自動分析装置によりヒト血清 40検体中の HD Lコレステロールを測定した。 実施例 24〜 30それぞれの測定法と、 D CM法による測定法との相関係数を表 3に示す。
表 3
Figure imgf000056_0001
実施例 5と同様、 ナイミーン L 207 (ポリオキシエチレンドデシルァミン ) 以外の非ィォン性界面活性剤を用レヽた場合においても D C M法の測定に対し 良好な相関係数が得られることが判明した。 また、 実施例 29と実施例 30と の比較から、 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素を用い た測定においても、 D CM法による測定と良好な相関係数が得られることが判 明した
実施例 31 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬おょぴ第二試薬からなる HDLコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 R)
HEPES (pH7. 5) 10 mm o 1 /L
EMS E 0. 3 g/L
タウロコール酸ナトリウム 2. 7 g/L
第二試薬 （試薬 e) HEPE S (p H 7. 0) 0 mm o 1 / L
4一アミノアンチピリン
パイォニン D 3104 0. 05 g/L ペルォキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 L P L 31 1 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 実施例 32 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる H D Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 R)
HEPES (p H 7. 5) 10 mm o I / L·
Figure imgf000057_0001
タウロコール酸ナトリウム 2. 7 g/L
第二試薬 （試薬 f )
HEPES (pH7. 0) 10 mm o 1 L
4—ァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ナイミーン S 204 0. 05 g/L ペルォキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 LP L 31 1 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 実施例 33 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HJD Lコ,レステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 mR)
HEPES (pH7. 5) 10 mm o 1 /L EMSE 0. 3 g/L
タウロコール酸ナトリウム 2. 7 g.
第二試薬 （試薬 g) HEPES ( H 7. 0) 10 mm o 丄ノ L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
'ナイミーン S 210 0. 05 g/L ぺノレオキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 LPL 31 1 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 実施例 34 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 S)
HEPES (pH 7. 5) 10 mm o i ZL
Figure imgf000058_0001
コール酸ナトリゥム 2. 0 g/L
第二試薬 （試薬 g)
HEPES (pH7. 0) 10 mm o 1 ZL
'4一ァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ナイミーン S 210 0. 05 g/L ぺノレォキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 LP L 31 1 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L- 実施例 35 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 T)
HEPES (pH7. 5) 10 mm o 1 ZL
EMS E 0. 3 g/L
グリココール酸ナトリウム 2. 4 g/L
第二試薬 （試薬 g) HEPES ( H 7. 0) 10 mm o 1 / L
4—ァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ナイミーン S 210 0. 05 g/L ペルォキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 LPL 3 1 1 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 実施例 36 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる H D Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 D)
HEPE S (pH7. 5) 0 mm o 1 /L
Figure imgf000059_0001
ナイミーン L 207 0. 07 g/L 第二試薬 （試薬 d)
HEPES (pH7. 0) 10 mm o 1 L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
コール酸ナトリゥム 6. 0 g/L
ぺノレォキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 LPL 31 1 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 実施例 37 HDLコレステロ一ノレ測定用キット
以下の第一試薬およぴ第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 F) '
HEPE S (pH7. 5) 10 mm o 1 / L
Figure imgf000059_0002
ナイミーン L 207 0. 07 g/L 第二試薬 （試薬 d)
HEPES (pH7. 0) 10 mm o 1 Z L
4一ァミノアンチピリン 0. 3 g/L
コール酸ナトリウム 6. 0 g/L
ペルォキシダ一ゼ 20 kU/L
化学修飾 LP L 31 1 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 実施例 38 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 G)
HEPES (pH7. 5) 10 mm o 1 / L
Figure imgf000060_0001
デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） . 0 g/L
ナイミーン L 207 0. 07
第二試薬 （試薬 d)
HEPES (pH7. 0) 10 mm o 1 / L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
コーノレ酸ナトリウム 6. 0 g/L
ぺゾレオキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 LP L 31 1 0. 2 k U/L
COO 321 3. 0 kU/L 比較例 13 HDLコレステロ一ノレ測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 R)
HEPES (pH7. 5) 10 mmo l/L
Figure imgf000060_0002
タウロコール酸ナトリウム 2. 7 g/L
第二試薬 （試薬 b)
HEPES (p H 7. 0) 10 mm o 1 / し
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレォキシダーゼ 20 kU/L ' 化学修飾 L P L 31 1 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 比較例 14 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 S)
HEPES (pH7. 5) 10 mm o 1ノ し EMS E 0. 3 g/L
コール酸ナトリウム 2. 0 g/L
第二試薬 mmh)
HEPES (pH7. 0) 10 mm o I / ~L
4—ァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレォキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 L P L 31 1 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 比較例 1 5 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 T)
HEPES ( H 7. 5) 10 mmo l/L
Figure imgf000061_0001
グリココール酸ナトリウム 2. 4 g/L · 第二試薬 （試薬 b) ' HEPES (p H 7. 0) 10 mm o 1 / L
4—ァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレオキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 LP L 31 1 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 比較例 16 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる H D Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 U)
HEPE S (pH7. 5) 10 mm o 1 / L
Figure imgf000062_0001
第二試薬 （試薬
HEPE S (pH7. 0) 10 mm o 1 / L
4ーァミノアンチピリン'
パイォニン D 3104 0. 05 g/L ぺノレォキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 L P L 31 1 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 比較例 17 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる H D Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 U)
HEPE S (pH7. 5) 10 mm o 1
Figure imgf000062_0002
第二試薬 （試薬 ί)
HEPES (pH7. 0) 10 mm o 1
4一ァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ナイミーン S 204 0. 05 g/L ペルォキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 LPL 31 1 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 比較例 18 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 U)
HEPES (pH7. 5) 0 mm o 1 / L
EMS E 0. 3 ί
第二試薬 （試薬 g)
HEPES (pH7. 0) 10 mm o 1 / し
4—ァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ナイミーン S 210 0. 05 g/L ぺノレオキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 LP L 31 1 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 実施例 39 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 31のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 7170形自動分析装置によりヒト血清 40検体中 の HDLコレステロールを測定した。
実施例 40 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 32のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 7170形自動分析装置によりヒト血清 40検体中 の HDLコレステロールを測定した。
実施例 41 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 33のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 7170形自動分析装置によりヒト血清 40検体中 の HDLコレステロールを測定した。 実施例 42 HDLコレステロ ^ルの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 34のキットを用いる以外は実施例 5の測 定法と同様にして、 日立 71 70形自動分析装置によりヒ ト血清 40検体中の HDLコレステロールを測定した。
実施例 43 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 35のキットを用いる以外は実施例 5の測 定法と同様にして、 日立 71 70形自動分析装置によりヒ ト血清 40検体中の HDLコレステロールを測定した。
実施例 44 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 36のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 7170形自動分析装置によりヒ ト血清 40検体中 の HDLコレステロールを測定した。
実施例 45 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 37のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 7170形自動分析装置によりヒ ト血清 40検体中 の HDLコレステロールを測定した。
実施例 46 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 38のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 71 70形自動分析装置によりヒト血清 40検体中 の HDLコレステロールを測定した。
比較例 19 HDLコレステロールの測定 ，
実施例 1のキットの代わりに比較例 13のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 7170形自動分析装置によりヒト血清 40検体中 の HDLコレステロールを測定した。
比較例 20 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに比較例 14のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 7170形自動分析装置によりヒ ト血清 40検体中 の HDLコレステロールを測定した。 比較例 21 HDLコレステロ一ノレの測定
実施例 1のキットの代わりに比較例 15のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 71 70形自動分析装置によりヒト血清 40検体中 の HDLコレステロールを測定した。
比較例 22 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに比較例 16のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 71 70形自動分析装置によりヒト血清 40検体中 の HDLコレステロールを測定した。
比較例 23 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに比較例 17のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 71 70形自動分析装置によりヒト血清 40検体中 の HD Lコレステロールを測定した。
比較例 24 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに比較例 18のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 71 70型自動分析装置によりヒト血清 40検体中 の HD Lコレステロールを測定した。
実施例 39〜 46および比較例 19〜 24それぞれの測定法と、 D C M法に よる測定法との相関係数を表 4に示す。
表 4
Figure imgf000066_0001
実施例 3 9〜 4 3と比較例 1 9〜 2 4との比較から、 ァニオン性胆汁酸誘導 体もしくはポリオキシエチレンアルキルァミンのみを含有したキットの測定よ りも ·、 両化合物を含有したキットの測定の方が D C M法による相関係数が良好 であることが判明した。 また、 実施例 4 4と実施例 4 5〜 4 6との比較から、 コレステロール測定用酵素、 ァユオン性胆汁酸誘導体、 ポリォキシェチレンァ ルキルァミンの他に、 デキストラン硫酸またはアルブミンを加えたキットを用 いた測定においても、 D CM法による測定と良い相関が認められた。
実施例 4 7 HD Lコレステロ一ノレ測定用キット , 以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロ一ノレ測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 V) HEPE S (pH7. 5) 10 mm o 1 /L
Figure imgf000067_0001
二ユーコ一ル 740 S F 0. 5 g/L
第二試薬 （試薬 h)
HEPE S (pH7. 0) 10 mm o 1 / L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パイォェン D 31 10 0. 3 g/L
ペルォキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 L P L 31 1 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 実施例 48 HDLコレステロ一ノレ測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 W)
HEPE S (pH7. 5) 10 mm o 1 / し
Figure imgf000067_0002
ニューコール 707 S F 0. 5 g/L
第二試薬 （試薬 i ) '
HE P E S (p H 7. 0) 10 mm o 1 / し
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ナイミーン L207 0. 1 g/L
ぺノレォキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 LPL 311 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 実施例 49 HDLコレステロ一ノレ測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 W) HEPES (pH7. 5)
Figure imgf000068_0001
第二試薬 （試薬 h)
HEPE S (pH7. 0) 10 mm o 1 / L
4一ァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パイォニン D 3110 0. 3 g/L
ぺノレォキシターセ 20 kU/L
化学修飾 L P L 31 1 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 実施例 50 HDLコレステロ一ノレ測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 X)
HEPES (pH7. 5) 10 mm o 1 / L
Figure imgf000068_0002
デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） 1. 0 g/L
ニューコール 707 S F 0. 5
第二試薬 （試薬 h)
HEPES (pH7. 0) 10 mm o 1 し
4ーァミノアンチピリン 0. 3 ；
パイォニン D 3110 0. 3 ；
ぺノレオキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 LP L 311 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 実施例 51 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロール測定用キット を調製した。 第一試薬 （試薬 Y)
HEPES ( H 7. 5) 10 mm o 1 /L
Figure imgf000069_0001
ニュ一コール 707 S F 0. 5· g/L
第二試薬 （試薬 h)
HEPES (pH7. 0) 0 mm o 1 / L
4—ァミノアンチピリン
バイオニン D 31 10 0. 3 g/L
ぺノレオキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 LPL 311 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 実施例 52 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロ "ル測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 Z)
HEP E S (p H 7. 5) 1 0 mm o 1 / L
Figure imgf000069_0002
デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） 1 • 0 g/L
Figure imgf000069_0003
ニュ一コ一ル 707 S F 0 • 5 g/L
二試薬 （試薬 h)
HEPES (pH7. 0) 1 0 mm o 丄 / L
4ーァミノアンチピリン 0 • 3 g/L
バイオニン D 31 10 0 • 3 g/L
ぺノレォキシダーゼ 2 0 kU/L
化学修飾 LPL 311 0 2 kU/L
COO 321 3 0 kU/L 比較例 25 HDLコレステロール測定用キット .'
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 V)
HEPES (pH7. 5) 10 mm o 1 / L
Figure imgf000070_0001
ニューコール 740 S F 0. 5 g/L
第二試薬 （試薬 b)
HEPES (pH7. 0) 10 mm o 1 / L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレォキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 LP L 31 1 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 比較例 26 HDLコレステロ一ノレ測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 W)
HE PES (pH7. 5) 10 mm o 1 /し EMS E 0. 3
ニューコール 707 S F 0. 5
第二試薬 （試薬 b)
HEPES (p H 7. 0) 10 mm o 1 /L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレオキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 L P L 31 1 0. 2 kU/L
COO 321 3. 0 kU/L 比較例 27 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロール測定用キット を調製した。
第一試薬 （試薬 U)
HE P E S (pH7. 5) 0 mm o 1 Z L
EMS E 0. 3
第二試薬 （試薬 h)
HE P E S (p H 7. 0) mm o 1 / L
4—ァミノアンチピリン 3
パイォニン D 3 1 10 3 g/L
ぺゾレオキシダーゼ kU/L
化学修飾 LP L 31 1 2 kU/L
COO 32 1 0 kU/L 実施例 53 HDLコレステロ一ノレの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 47のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 7170形自動分析装置によりヒト血清 40検体中 ( HDLコレステロールを測定した。
実施例 54 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキク小の代わりに実施例 48のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 7170形自動分析装置によりヒト血清 40検体中 の HD Lコレステロ一/レを測定した。
実施例 55 HDLコレステロ一ノレの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 49のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、. S立 7170形自動分析装置によりヒ ト血清 40検体中 の HDLコレステロールを測定した。
実施例 56 Ht) Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 50のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 7170形自動分析装置によりヒ ト血清 40検体中 の HDLコレステロールを測定した。
実施例 57 HDLコレステロールの測定 実施例 1のキットの代わりに実施例 5 1のキットを用いる以外は実施例' 5の 測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0形自動分析装置によりヒト血清 4 0検体中 の HD Lコレステロールを測定した。
実施例 5 8 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 5 2のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0形自動分析装置によりヒ ト血清 4 0検体中 の HD Lコレステロールを測定した。
比較例 2 8 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに比較例 2 5のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立' 7 1 7 0形自動分析装置によりヒ ト血清 4 0検体中 の HD Lコレステロ一ノレを測定した。
比較例 2 9 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに比較例 2 6のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0形自動分析装置によりヒ ト血清 4 0検体中 . の HD Lコレステロ一ノレを測定した。
比較例 3 0 HD Lコレステロ一ノレの測定
実施例 1のキットの代わりに比較例 2 7のキットを用いる以外は実施例 5の 測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0形自動分析装置によりヒト血清 4 0検体中 の HD Lコレステロ ルを測定した。
実施例 5 3〜 5 8および比較例 2 8〜 3 0それぞれの測定法と、 D C M法に よる測定法との相関係数を表 5に示す。
表 5
Figure imgf000073_0001
実施例 5 3〜 5 5と比較例 2 8〜 3 0との比較から、 ポリオキシェチレン多 環フエ二ノレ硫酸エステルもしくはポリオキシエチレンアルキルァミンのみを含 有したキットの測定よりも、 両化合物を含有したキットの測定の方が D CM法 による相関係数が良好であることが判明した。 また、 実施例 5 5と実施例 5 6 〜5 8との比較から、 コレステロール測定用酵素、 ポリオキシエチレン多環フ ェエル硫酸エステル、 ポリオキシエチレンアルキルァミンの他に、 デキストラ ン硫酸及び/またはアルブミンを加えたキットを用いた測定においても、 D C
M法による測定と良い相関が認められた。 '
実施例 5 9 M蛋白血症患者由来の血清中の HD Lコレステロールの測定 検体として M蛋白血症患者より得られた血清を用い、 測定用キットとして実 施例 1のキットを用いて実施例 5の測定法と同様にして日立 7 1 7 0型自動分 祈装置により HD Lコレステロールの測定を行った。 試料に第一試薬を添カロし 5分間反応させた後の吸光度、 即ち第二試薬添加前の反応液の吸光度 （E 1 ) の値を表 6に、 HD Lコレステロールの測定値を表 7に示す。 また、 比較とし て、 当該 M蛋白血症患者由来の血清を D CM法により測定した際の測定値も表 7に示す。 比較例 3 1 M蛋白血症患者由来の血清中の HD Lコレステロールの測定 検体として M蛋白血症患者より得られた血清を用レ、、 測定用キットとして比 較例 5のキットを用いて実施例 5の測定法と同様にして日立 7 1 7 0型自動分 析装置により HD Lコレステロールの測定を行った。 試料に第一試薬を添カロし 5分間反応させた後の吸光度、 即ち第二試薬添加前の反応液の吸光度 （E 1 ) の値を表 6に、 HD Lコレステロールの測定値を表 7に示す。
表 6
Figure imgf000074_0001
表 6に示すように比較例 5の測定キットを用いた場合には、 第二試薬が添カロ される前においても水不溶性の蛋白に起因する濁りが解消されていないが、 デ キストラン硫酸ナトリゥムを含有する実施例 1の測定キットを用いた場合には、 第二試薬が添加される前には水不溶性の蛋白に起因する濁りが解消されている ことが判明した。
表 7
Figure imgf000074_0002
表 7に示した通り、 実施例 1のキットを用いた測定 （実施例 5 9 ) での測定 値は、 D CM法での測定値とほぼ一致したが、 比較例 5のキットを用いた測定 (比較例 3 1 ) での測定値は、 実施例 5 9の方法や D CM法での測定値とは大 きく異なっており、 正確な測定を反映するものではなかった。 このように、 本 発明のキットを用いることにより、 M蛋白血症患者検体中の HD Lコレステロ 一ルをも正確に測定できることが明らかとなつた。
産業上の利用可能性
本発明により、 簡便、 かつ、 正確な測定ができる HD Lコレステロールの定 方法、 測定用試薬および測定用キットが提供される。

Claims

請求の範囲
1. 検体と、 i ) コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロ ^"ル酸化酵素、 または、 ϋ ) コレステロールエステル加水分解酵素、 酸化型補 酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、 非イオン性界面活性剤、 ポリア二 オンおよびアルプミンを含有する水性媒体中で反応させ、 生成した過酸化水素 または還元型補酵素を測定することを特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中の コレステロ一ノレの測定方法。
2. 水性媒体が、 胆汁酸誘導体を含有する請求項 1記載の方法。
3. 胆汁酸誘導体が、 陰イオン性胆汁酸誘導体である請求項 2記載の測定 方法。
4. 非イオン性界面活性剤が、 ポリオキシエチレンアルキルアミンまたは ポリ'ォキシエチレンアルケニルァミンである請求項 1〜 3のいずれかに記載の 測定方法。
5. ポリア二オンが、 デキストラン硫酸またはその塩である請求項 1〜4 のいずれかに記載の測定方法。
6. 非イオン性界面活性剤、 ポリア二オン、 アルブミン、 コレステロール エステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬 を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
7. 非イオン性界面活性剤、 ポリア二オン、 ァノレブミン、 コレステロール エステル加水分解酵素、 コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有 することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
8. さらに、 還元型補酵素測定用試薬を含有する請求項 7記載の試薬。
9. さらに、 胆汁酸誘導体を含有する請求項 6〜 8のいずれかに記載の試 薬。
10. 胆汁酸誘導体が、 陰イオン性胆汁酸誘導体である請求項 9記載の'試 薬。
11. 非イオン性界面活性剤が、 ポリオキシエチレンアルキルアミンまた はポリォキシエチレンアルケニルァミンである請求項 6〜 1 0のいずれかに記 載の試薬。 '
12. ポリア二オンが、 デキストラン硫酸またはその塩である請求項 6〜 1 1のいずれかに記載の試薬。
13. 第一試薬および第二試薬からなるキットであって、 コレステロール エステル加水分解酵素、 ポリア二オン、 非イオン性界面活性剤、 アルブミンお よび過酸化水素測定試薬を、 第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは両方に含有 し、 コレステロール酸化酵素を第二試薬に含有することを特徴とする高密度リ ポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
14. ポリア二オンを含有する第一試薬と、 コレステロール酸化酵素を含 有する第二試薬とを含有し、 コレステロールエステル加水分解酵素、 非イオン 性界面活性剤、 アルブミンおよび過酸化水素測定試薬を、 第一試薬、 第二試薬 のいずれかまたは両方に含有することを特徵とする高密度リポ蛋白中のコレス テロール測定用キット。
15. コレステロール脱水素酵素を含有する第二試薬と、 ポリア二オン、 非イオン性界面活性剤、 アルブミンおよび酸ィヒ型捕酵素を、 第一試薬、 第二試 薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレ ステロール測定用キット。
16. ポリア二オンを含有する第一試薬と、 コレステロール脱水素酵素を 含有する第二試薬とを含有し、 コレステロールエステル加水分解酵素、 非ィォ ン性界面活性剤、 アルブミンおよび酸ィヒ型補酵素を、 第一試薬、 第二試薬のい ずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロ ール測定用キット。 '
17. さらに、 還元型補酵素測定用試薬を、 第一試薬、 第二試薬のいずれ かまたは両方に含有する請求項 1 5または 1 6記載のキット。
18. さらに、 胆汁酸誘導体を、 第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは両 方に含有する請求項 1 3〜1 7のいずれかに記載のキット。
19. 胆汁酸誘導体が、 陰イオン性胆汁酸誘導体である請求項 1 8記載の キット。
20. 非イオン性界面活性剤が、 ポリオキシエチレンアルキルァミンまた はポリオキシエチレンアルケニルァミンである請求項 1 3〜1 9のいずれかに 記載のキット。
21. ポリアェオンが、 デキストラン硫酸またはその塩である請求項 1 3 〜2 0のいずれかに記載のキット。
22. 検体と、 i ) コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロ ール酸化酵素、 または、 ii ) コレステロールエステル加水分解酵素、 酸化型捕 酵素おょぴコレステロール脱水素酵素とを、 i ) 非イオン性界面活性剤、 ポリ ァニオンおよびアルブミン、 または ii ) ポリオキシエチレンアルキルアミンも しくはポリオキシエチレンアルケニルァミンおよびポリオキシエチレン多環フ ェニルエーテル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体を含有する水性 媒体中で反応させ、 生成した過酸ィヒ水素または還元型補酵素を測定することを 特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
23. 検体と、 i ) コレステロールエステルカ卩水分解酵素およびコレステロ ール酸化酵素、 または、 ii ) コレステロールエステル加水分解酵素、 酸化型捕 酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、 ポリオキシエチレンアルキルァミ ンもしくはポリォキシエチレンァルケニルァミンおよびポリォキシエチレン多 環フエュルエーテル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体を含有する 水性媒体中で反応させ、 生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定するこ とを特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
24. さらにポリア-オンを含有する請求項 2 3記載の方法。
25. ポリア二オンが、 デキストラン硫酸またはその塩である請求項 2 3ま たは 2 4記載の方法。
26. さらにアルブミンを含有する請求項 2 3〜2 5のいずれかに記載の 方法。
27. ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレンア- ルケニルァミンぉよびポリオキシェチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル もしくは陰ィオン性胆汁酸誘導体、 コレステロールエステル加水分解酵素、 コ レステロール酸化酵素およぴ過酸化水素測定用試薬を含有することを特徴とす る高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
28. ポリオキシエチレンアルキルアミンもしぐはポリオキシエチレンァ ルケニルァミンおよびポリオキシエチレン多環フエニルエーテノレ硫酸エステル もしくは陰イオン性胆汁酸誘導体、 コレステロールエステル加水分解酵素、 コ
.レステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有することを特徴とする高密 度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
29. さらに、 還元型補酵素測定用試薬を含有する請求項 ·2 8記載の試薬。
30. さらにポリアユオンを含有する請求項 2 7〜2 9のいずれかに記載 の試薬。
31. ポリア二オンが、 デキストラン硫酸またはその塩である請求項 3 0記 載の試薬。
' 32. さらにアルブミンを含有する請求項 2 7〜3 1のいずれかに記載の δ式
33. 第一試薬および第二試薬からなるキットであって、 コレステロールェ ステル加水分解酵素、 ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシ エチレンアルケニルァミン、 ポリオキシエチレン多環フエニルエーテル硫酸ェ ステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体および過酸化水素測定試薬の各々を任 意に第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、 コレステロール酸化 酵素を第二試薬に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロ一 ル測定用キット。
34. 第一試薬および第二試薬からなるキットであって、 コレステロールェ ステル加水分解酵素、 ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシ エチレンァノレケ二/レアミン、 ポリォキシエチレンエーテル多環フエニル硫酸ェ ステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体および酸化型補酵素の各々を任意に第 —試薬、 第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、 コレステロール脱水素酵素 を第二試薬に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測 定用キット。
35. さらに、 還元型補酵素測定用試薬を含有する請求項 3 4記載のキット
36. さらにポリア-オンを含有する請求項 3 3〜3 5のいずれかに記載 のキッ ト。
37. さらにアルブミンを含有する請求項 3 3〜3 6のいずれかに記載の キット。
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