WO2003102194A1 - Chondroitine synthetase et codage de l'adn pour l'enzyme - Google Patents

Chondroitine synthetase et codage de l'adn pour l'enzyme Download PDF

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WO2003102194A1
WO2003102194A1 PCT/JP2003/006881 JP0306881W WO03102194A1 WO 2003102194 A1 WO2003102194 A1 WO 2003102194A1 JP 0306881 W JP0306881 W JP 0306881W WO 03102194 A1 WO03102194 A1 WO 03102194A1
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glcua
galnac
residue
acetyl
galactosamine
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Application number
PCT/JP2003/006881
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hisashi Narimatsu
Koji Kimata
Toshikazu Yada
Takashi Sato
Masanori Goto
Original Assignee
Seikagaku Corporation
National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates

Definitions

  • the present invention relates to an enzyme for synthesizing a sugar chain skeleton of chondroitin / chondroitin sulfate (basic skeleton: also referred to as chondroitin skeleton) and a DNA encoding the same. More specifically, when an N-acetyl-D-galactosamine residue is present at the non-reducing end of the chondroitin skeleton, the D-dalc oxalic acid residue is transferred to the N-acetyl-D-dalcosamine residue.
  • Chondroitin sulfate and chondroitin are composed of a D-darc acid residue (hereinafter simply referred to as “glucuronic acid” or “GlcUA”) and an N-acetyl-D-galactosamine residue (hereinafter simply “N-acetylgalactosamine” or (Also referred to as “GalNAc”)) (that is, _ [GlcUA i3 (1,3) -GalNAc] 3 (l, 4)-] n : n is an integer of 2 or more). It is a kind of daricosaminodarican used as a skeleton.
  • the present invention relates to the following (1) to (14).
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence consisting of amino acids 97 to 755 represented by SEQ ID NO: 2, or a sugar chain-bound polypeptide having a sugar chain bonded thereto.
  • a chondroitin synthase characterized by the following.
  • An expression vector comprising the nucleic acid according to (4).
  • the expression vector is characterized in that it can be expressed in eukaryotic cells.
  • a transformant comprising the expression vector according to (5) or (6).
  • a process for producing chondroitin synthase comprising growing the transformant according to (7), producing or accumulating chondroitin synthase in the grown product, and isolating the chondroitin synthase from the grown product.
  • GalNAc- (GlcUA-GalNAc) n- (GlcUA) m indicates an N-acetyl-D-galactosamine residue, and “GlcUA” indicates D_dalcron.
  • N represents an acid residue, n represents an integer of 1 or more, m represents 1 or 0, and “1” represents a glycosidic bond.
  • the chondroitin synthase according to any one of (1) to (3) acts on a D-dalc oxalate receptor and a D-dalc oxalate donor having a structure represented by the following formula (3):
  • GlcUA- (GalNAc-GlcUA) n- (GalNAc) m indicates an N-acetyl-D-galactosamine residue
  • GlcUA indicates D-glucuron.
  • N represents an acid residue
  • n represents an integer of 1 or more
  • m represents 1 or 0, and “1” represents a glycosidic bond.
  • N-acetyl-D-galatatosamine Use of the chondroitin synthase according to any one of (1) to (3) for transferring a residue to synthesize a sugar chain having a structure represented by the following formula (2).
  • GalNAc- (GlcUA-GalNAc) n- (GlcUA) m indicates N-acetyl-D-galactosamine residue, and "GlcUA” indicates D-glucuronic acid. Represents a residue, n represents an integer of 1 or more, m represents 1 or 0, and “one” represents a glycosidic bond.
  • a D-glucuronic acid residue is Transfer to synthesize a sugar chain having a structure represented by the following formula (4),
  • GlcUA- (GalNAc-GlcUA) n- (GalNAc) m indicates an N-acetyl-D-galactosamine residue
  • GlcUA indicates D-glucuron.
  • N represents an acid residue
  • n represents an integer of 1 or more
  • m represents 1 or 0, and “1” represents a glycosidic bond.
  • FIG. 1 is a diagram showing a mouth chromatography chart showing the synthesis of an odd-numbered sugar by the GalNAc transfer activity of the enzyme of the present invention.
  • the open circles show the GalNAc transfer activity for chondroitin sulfate, and the closed circles show GalNAc for chondroitin. It is a chart which shows metastatic activity.
  • the open triangle is a chart showing GalNAc transfer activity to chondroitin sulfate decasaccharide
  • the solid triangle is a chart showing GalNAc transfer activity to chondroitin decasaccharide.
  • FIG. 2 is a diagram showing a chromatographic chart of 11-saccharide prepared by the GalNAc transfer activity of the enzyme of the present invention and its chondroitinase ACII digest. Open circles show charts of 11 sugars that have not been digested with chondroitinase ACII, and black circles show charts of digested products after chondroitinase ACII digestion.
  • FIG. 3 is a diagram showing a chromatographic chart illustrating the synthesis of even-numbered sugars by the GlcUA transfer activity of the enzyme of the present invention.
  • Open circles are charts showing GlcUA transfer activity on chondroitin sulfate, and filled circles are charts showing GlcUA transfer activity on chondroitin.
  • the open triangle is a chart showing GlcUA transfer activity on chondroitin sulfate 11 sugar, and the open triangle is a chart showing GlcUA transfer activity on chondroitin 11 sugar.
  • FIG. 4 is a diagram showing a chromatographic chart of a dodecasaccharide prepared by the GlcUA transfer activity of the enzyme of the present invention and its chondroitinase ACII digest. Open circles show the charts of the 12-saccharide undigested chondroitinase ACII, and black circles show the charts of the digested products after chondroitinase ACII digestion.
  • FIG. 5 is a graph showing the optimum pH for the GlcUA transfer activity of the enzyme of the present invention. Open circles indicate acetate buffer, solid circles indicate MES buffer, open triangles indicate imidazole buffer, and solid triangles indicate Tris buffer.
  • FIG. 6 is a graph showing the optimum pH for GalNAc transfer activity of the enzyme of the present invention. Open circles indicate acetate buffer, solid circles indicate MES buffer, open triangles indicate imidazole buffer, and solid triangles indicate Tris buffer.
  • FIG. 7 is a view showing the effect of a divalent cation on the activity of the enzyme of the present invention.
  • the white bar indicates GlcUA transfer activity, and the black bar indicates GalNAc transfer activity.
  • FIG. 8 is a graph showing the effect of the concentration of manganese ions on the activity of the enzyme of the present invention. Open circles indicate the effect of the enzyme of the present invention on GlcUA transfer activity, and black circles indicate the effect of the present enzyme on GalNAc transfer activity.
  • FIG. 9 is a view showing a quantitative value of the expression level of the enzyme of the present invention in each tissue of a healthy subject.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and as a result, have found that there is another enzyme having an enzymatic activity similar to that of a known chondroitin synthase.
  • the present invention was completed by obtaining the DNA of the enzyme and preparing the enzyme.
  • the enzyme of the present invention comprises a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence consisting of amino acids 97 to 755 represented by SEQ ID NO: 2, or a sugar chain-bound polypeptide having a sugar chain bonded thereto.
  • a chondroitin synthase characterized by the following.
  • the enzyme of the present invention reacts with a sugar residue present at the non-reducing end of the chondroitin skeleton by transferring a GalNAc residue or a GlcUA residue (the activity of transferring a GalNAc residue is referred to as a “GalNAc transfer activity”).
  • the activity of transferring GlcUA residues is referred to as “GlcUA transfer activity”). That is, the enzyme of the present invention exhibits GalNAc transfer activity for the GlcUA residue when the GlcUA residue is present at the non-reducing end of the chondroitin skeleton, and exhibits the GalNAc transfer activity when the GLCUA residue is present at the non-reducing end. Shows GlcUA transfer activity for GalNAc residues.
  • Such an enzyme has the highest utility in the synthesis of the chondroitin skeleton.
  • the enzyme of the present invention can use both a GalNAc receptor having a GlcUA residue at the non-reducing end of the chondroitin skeleton and a GlcUA receptor having a GalNAc residue at the non-reducing end as sugar residue receptors. preferable.
  • the GalNAc receptor of the enzyme of the present invention includes, for example, a structure represented by the following formula (1).
  • n represents an integer of 1 or more
  • m represents 1 or 0, and "-" represents a glycosidic bond.
  • n is 2 or more And more preferably 4 or more. This is because in such a range, the chondroitin skeleton can be more efficiently extended.
  • Examples of the GalNAc receptor having such a structure of the formula (1) include, but are not limited to, chondroitin, chondroitin sulfate, or low-molecular-weight chondroitin or chondroitin sulfate obtained by cleaving them. .
  • the enzyme of the present invention transfers a GalNAc residue from a GalNAc donor substrate to a GalNAc receptor having a structure represented by the formula (1). Since the enzyme of the present invention is useful for synthesizing a chondroitin skeleton, it is preferable that the GalNAc residue be transferred to a GlcUA residue at the non-reducing end via a] 3,4 dalicoside bond.
  • the GalNAc donor is preferably a sugar nucleotide having a GalNAc residue.
  • examples of such substances include adenosine diphosphate mono-N-acetylgalactosamine (ADP-GalNAc), peridine diphosphate mono-N-acetylgalatatosamine (UDP-GalNAc), and guanosine diphosphate mono-N-acetylgalactosamine (GDP-GalNAc).
  • ADP-GalNAc adenosine diphosphate mono-N-acetylgalactosamine
  • UDP-GalNAc peridine diphosphate mono-N-acetylgalatatosamine
  • GDP-GalNAc guanosine diphosphate mono-N-acetylgalactosamine
  • CDP-GalNAc Cytidine diphosphate mono-N-acetylgalactosamine
  • UDP-GalNAc is most preferred.
  • the synthesis of the chondroitin skeleton in vivo is because UDP-GalNAc mainly works as a GalNAc donor substrate.
  • the GalNAc transfer activity of the enzyme of the present invention is a GalNAc donor that can supply a GalNAc residue.
  • GalNAc- (GlcUA-GalNAc) n- (GlcUA) m GalNAc- (GlcUA-GalNAc) n- (GlcUA) m (2)
  • GlcUA GlcUA
  • GalNAc GlcUA
  • n, m and “one” are the same as in the formula (1).
  • the GalNAc receptor has a structure represented by the above (1), and a substance having a structure in which a sugar chain, a protein, a lipid, a synthetic polymer compound, or the like is further bound to its reducing end is also a GalNAc receptor.
  • a GalNAc residue is transferred to such a GalNAc receptor, it has a structure represented by the above (2), and further has a sugar chain at its reducing end.
  • the GalNAc transfer activity of the enzyme of the present invention can be easily detected and measured by, for example, using a method of labeling GalNAc with a radioisotope as in the method described in Example 2 (1) of the present specification. be able to.
  • the GlcUA receptor of the enzyme of the present invention includes, for example, a structure represented by the following formula (3).
  • GalNAc-GlcUA n- (GalNAc) B (3)
  • GlcUA indicates a D-glucuronic acid residue
  • GalNAc indicates an N-acetyl-D-galactosamine residue.
  • N represents an integer of 1 or more
  • m represents 1 or 0,
  • n is preferably 2 or more, and more preferably 4 or more. This is because in such a range, the chondroitin skeleton can be more efficiently extended.
  • the enzyme of the present invention transfers GlcUA from a GlcUA donor to a GlcUA receptor having a structure represented by the formula (3). Since the enzyme of the present invention is useful for synthesizing a chondroitin skeleton, it is preferable that the GlcUA residue be transferred to a GalNAc residue by a ⁇ 1,3 glycosidic bond.
  • the GlcUA donor is preferably a sugar nucleotide having a GlcUA residue.
  • Such substances include, for example, adenosine diphosphate mono-D-dalc valerate (ADP-GlcUA), peridine diphosphate mono-D-glucuronic acid (UDP-GlcUA), guanosine diphosphate mono-D-darc valerate (GDP -GlcUA), cytidine diphosphoric acid_D_darconic acid (CDP-GlcUA) and the like, and UDP_GlcUA is most preferred.
  • ADP-GlcUA adenosine diphosphate mono-D-dalc valerate
  • UDP-GlcUA peridine diphosphate mono-D-glucuronic acid
  • GDP -GlcUA guanosine diphosphate mono-D-darc valerate
  • CDP-GlcUA cytidine diphosphoric acid_D_darconic
  • the GlcUA receptor has a structure represented by the above (3), and a substance having a structure in which a sugar chain, a protein, a lipid, a synthetic polymer compound, or the like is further bound to the reducing end thereof is also a GlcUA receptor.
  • a GlcUA residue is transferred to such a GlcUA receptor, it has the structure represented by (4) above, and further has a sugar at its reducing end. Compounds having chains, proteins, lipids, synthetic high molecular compounds, etc. can be obtained.
  • Such GlcUA transfer activity of the enzyme of the present invention can be easily measured by using a technique of labeling GlcUA with a radioisotope, for example, as described in Example 2 (2) of the present specification. it can.
  • the enzyme of the present invention preferably contains a polypeptide having an amino acid sequence consisting of amino acids 97 to 755 of SEQ ID NO: 2. This is because a polypeptide containing an amino acid sequence in such a range has both the GalNAc transfer activity and the GlcUA transfer activity described above (see Example 2 in the present specification).
  • an enzyme may have some number of amino acid substitutions, deletions, insertions, additions and Zs or transpositions (hereinafter collectively referred to as “amino acid mutations”) even if the protein comprises Enzymes that maintain their activity and have such amino acid mutations are called variants.
  • amino acid mutations are about 20% of the total number of amino acids, the enzyme activity is sufficiently maintained unless the mutation is related to the active center. Therefore, as long as it has the above-mentioned GalNAc transfer activity and GlcUA transfer activity, the enzyme of the present invention also has a slight number of amino acid mutations in the amino acid sequence consisting of amino acids 97 to 755 of SEQ ID NO: 2.
  • the presence or absence of enzyme activity can be assayed in accordance with Example 2 of the present specification as described above).
  • the “slight number” mentioned above is 20% or less of the total number of amino acids constituting the enzyme (131 or less in the polypeptide consisting of amino acid numbers 97 to 755 of SEQ ID NO: 2; ie, homology of 80% or more) Preferably 15% or less (98 or less in a polypeptide consisting of amino acid numbers 97 to 755 of SEQ ID NO: 2; that is, 85% or more homology), and most preferably 10% or less (amino acid of SEQ ID NO: 2). In the polypeptide consisting of 97 to 755, the number is 65 or less (that is, 90% or more homology).
  • the enzyme composed of the polypeptide consisting of the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is also an enzyme obtained by causing a slight mutation in the polypeptide consisting of amino acids 97 to 755. It can be said that the enzyme is composed of peptides, and it can be said that it is within the range of polypeptides preferable as the enzyme of the present invention.
  • the enzymes of the present invention include both enzymes consisting of polypeptides alone and enzymes having sugar chains attached to polypeptides.
  • the enzyme of the present invention preferably has the following properties.
  • Enhancement of activity The activity is enhanced by the presence of 10 mol / l of a divalent metal cation (preferably manganese ion, cobalt ion) in the reaction system.
  • a divalent metal cation preferably manganese ion, cobalt ion
  • a halide eg, chloride
  • Enzymatic activity is substantially lost by the presence of ethylenediaminetetraacetic acid at a concentration of 10 ol in the reaction system.
  • GlcUA transferase activity is pH5 with 2-morpholino ethanesulfonic acid (MES) buffer solution in 7-6 7 (.. Preferably P H6 0 ⁇ 6 5), GalNAc transferase activity is MES slow PH 5.7-6.7 (preferably pH 6.0-6.4) in the buffer
  • a substance having a function of promoting or inhibiting the activity of the enzyme can be obtained by screening.
  • a substance can be used as an active ingredient of the activity regulator of the enzyme of the present invention.
  • an activity regulator can be used as an agent for treating a disease caused by a change in the activity of the enzyme of the present invention.
  • the nucleic acid of the present invention encodes the enzyme of the present invention.
  • the nucleic acid of the present invention is not particularly limited as long as it can produce the enzyme of the present invention in a transformant transformed with the expression vector or a nucleic acid having a nucleotide sequence complementary thereto.
  • the nucleic acid of the present invention may be DNA or RNA, but is preferably DNA because it is extremely excellent in stability.
  • Preferred embodiments of the nucleic acid of the present invention include, for example, a DNA consisting of base numbers 289 to 2328 and a DNA consisting of the entire base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the genetic code (triplet) and amino acid are not always one-to-one, and the same amino acid may correspond to a different triplet (degeneracy of the genetic code). Therefore, a nucleic acid containing other triplets other than the specific base sequence exemplified, which corresponds to the same amino acid sequence due to the degeneracy of the genetic code as described above, can be used to obtain the same enzyme of the present invention. This fact is easily understood by those skilled in the art, and it goes without saying that it is included in the nucleic acid of the present invention.
  • nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a DNA consisting of nucleotides 289 to 2328 or a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary thereto is, for example, in vivo of the nucleic acid of the present invention. It can be used as a probe for examining the expression status in DNA, and is extremely useful as a reagent. If the molecular weight of such a probe is too large, it will be difficult to handle it. For example, 500 bp to 10 kbp, more preferably 600 bp to 9 kbp, and most preferably 700 bp to 8 kbp.
  • the stringent conditions include conditions generally used in a method using hybridization (eg, Northern blot hybridization, Southern blot hybridization) and the like, and preferably 37.
  • hybridization eg, Northern blot hybridization, Southern blot hybridization
  • 5X SSPE sodium chloride / sodium phosphate EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) buffer
  • 5X Denhardt's solution 0.5% SDS (sodium dodecyl sulfate)
  • the conditions are exemplified at 42 ° C.
  • the expression vector of the present invention is an expression vector containing the nucleic acid of the present invention.
  • regions involved in gene expression are appropriately arranged so that the nucleic acid of the present invention can be expressed in a target host cell. It is constructed so that the nucleic acid is appropriately expressed. Therefore, a transformant can be obtained by introducing the expression vector of the present invention into a suitable host cell.
  • Basic vector of the expression vector of the present invention (the present invention The vector before the introduction of the gene is appropriately selected in relation to the host cell into which the expression vector is to be introduced.
  • a vector for eukaryotic cells is selected as a basic vector
  • prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis
  • a prokaryotic cell vector is selected as a basic vector.
  • a eukaryotic cell particularly a mammalian cell
  • a vector for a eukaryotic cell particularly, a mammalian cell as the basic vector of the expression vector of the present invention.
  • the expression vector of the present invention is preferably constructed so as to facilitate the isolation, purification and detection of the enzyme of the present invention.
  • discriminating peptides include secretion of the target protein from a grown product of the transformant by preparing the target protein by genetic recombination and expressing it as a fusion protein in which the peptide and the target protein are bound.
  • discriminating peptides include, for example, signal peptides (15-30 amino acid residues that are present at the N-terminus of many proteins and function in cells for the purpose of selecting proteins in the intracellular membrane permeation mechanism) Peptide consisting of: 0mpA, OmpT, Dsb, etc.), protein kinase, protein A (a component of the cell wall of S.
  • aureus having a molecular weight of about 42,000
  • daltathione S-transferase His tag (histidine residue of 6 ⁇ 10 sequences arranged), myc tag (13 amino acid sequence derived from cMyc protein), FLAG peptide (analytical marker consisting of 8 amino acid residues), T7 tag (first 11 amino acid residues of genelO protein) ), S tag (consisting of 15 amino acid residues from knee RNaseA), HSV tag, pelB (22 amino acid sequence of pelB, outer membrane protein of E.
  • coli HA (consisting of 10 amino acid residues from Madaruchun to) tag, Trx tag (Chioredokishin sequence), CBP-tag (calmodulin binding Peptide), CBD tag (cellulose binding domain), CBR tag (collagen binding domain), j3-lac / blu (] 3 lactamase),] 3-gal (j3 galactosidase), luc (luciferase), HP-Thio (His-patch thioredoxin), HSP (thermal shock peptide), ⁇ (laminin ⁇ peptide), Fn (fibronectin partial peptide), GFP (green fluorescent peptide), YFP (yellow fluorescent peptide), CFP (cyan) Peptides such as fluorescent peptide), BFP (blue fluorescent peptide), DsRed, DsRed2 (red fluorescent peptide), MBP (maltose binding peptide), LacZ (lactose operator), IgG (immunoglobulin G), avid
  • the signal peptide, protein kinase, protein A, daltathione S-transferase, His tag, myc tag, FLAG peptide, T7 tag, S tag, HSV tag, pelB or HA tag are the present invention by genetic engineering techniques. It is preferable because expression and purification of the substance become easier, and it is particularly preferable to obtain the enzyme of the present invention as a fusion protein with the FLAG peptide because the handling is extremely excellent.
  • Examples of basic vectors that can be expressed in mammalian cells and that can obtain the enzyme of the present invention as a fusion protein with the FLAG peptide described above include, for example, pFLAG-CMV-1 (Sigma). Those skilled in the art can select an appropriate basic vector based on the host cells, restriction enzymes, identification peptides, and the like used for expression of the enzyme of the present invention.
  • nucleotide sequence of the nucleic acid of the present invention was disclosed by the present invention, those skilled in the art can appropriately prepare a primer based on the nucleotide sequences at both ends of the target nucleic acid of the present invention or the region of the nucleic acid to be prepared, and use it. It is possible to amplify and prepare the target region by PCR method. Preparation of DNA consisting of base numbers 289 to 2328 of SEQ ID NO: 1, which is a preferred embodiment of the nucleic acid of the present invention, can be performed as follows.
  • a BLAST search can be performed using the amino acid sequence of CSGlcA-T (amino acid sequence encoded by GenBank accession No. AB037823) as a query to obtain a partial sequence of the nucleic acid of the present invention.
  • a genome sequence can be searched from a genome database based on an EST (GenBank accession No. MN_018590 or the like) obtained thereby.
  • GenScan (Stanford University, USA) It can be performed using such as.
  • GenScan (Stanford University, USA) It can be performed using such as.
  • a DNA consisting of base numbers 289 to 2328 can be prepared by preparing a primer from the base sequence thus obtained.
  • the DNA is preferably prepared, for example, by the polymerase chain reaction method (hereinafter referred to as “PCR method”).
  • PCR method it is preferable to include a restriction enzyme region appropriate for the vector in the primer in advance, since the nucleic acid of the present invention can be easily introduced into the vector.
  • primers include, for example, the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 3 (including the EcoRI region) as the 5 ′ primer, and the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 4 (including the BamHI region) as the 3 ′ primer. Is exemplified.
  • the nucleic acid (DNA) of the present invention is generated as an amplification product of about 2 kb.
  • the amplification product can be isolated by a conventional method such as agarose gel electrophoresis or other DNA separation method based on molecular weight, excising the gel, and extracting the nucleic acid of the present invention.
  • the primers exemplified above contain an EcoRI region and a BamHI region
  • treatment with these restriction enzymes enables insertion of a vector having EcoRI and BamHI regions by a conventional method.
  • the basic vector pFLAG-CMV-1 exemplified above contains EcoRI and BamHI regions
  • this basic vector is digested with EcoRI and BamHI, and ligated with the nucleic acid of the present invention.
  • An invention vector can be obtained.
  • the vector of the present invention into a host cell can be performed according to a conventional method.
  • the transformant is introduced into mammalian cells such as C0S1 cells and C0S7 cells, which function as host cells for pFLAG_CMV_1, using standard methods such as electroporation. Obtainable.
  • the method for preparing the enzyme of the present invention is characterized by growing the recombinant of the present invention, accumulating the enzyme of the present invention in a grown product, and isolating the enzyme of the present invention from the grown product.
  • the enzyme of the present invention can be prepared by growing a transformant under conditions suitable for its growth, expressing the nucleic acid of the present invention, and preparing from the grown product.
  • growing a host cell is a concept that includes not only culturing the host cell but also growing the host cell in the living body by administering the host cell to the living body or the like.
  • growth is a concept that includes not only cultured host cells and culture supernatants, but also excretions and secretions of the host cells when the host cells are grown in vivo.
  • the transformant when COS-7 cells are selected as host cells, the transformant can be cultured in vitro, and the substance of the present invention can be purified from the culture (the transformed transformant and culture supernatant). It is.
  • an appropriate method can be routinely selected depending on the identification peptide.
  • the enzyme of the present invention when the above pFLAG-CMV-1 beta is used, the enzyme of the present invention can be obtained as a fusion protein with FLAG peptide, and thus the substance of the present invention can be obtained by using an anti-FLAG antibody (for example, Ml).
  • the enzyme of the present invention can be isolated and purified by a method such as affinity purification.
  • a resin to which an anti-FLAG antibody has been bound makes it possible to easily isolate and purify proteins from host cell cultures (culture supernatants, host cell extracts, etc.) It can be used as an enzyme suspension by suspending it in a buffer or the like as it is.
  • the enzyme of the present invention is acted on a GalNAc receptor and a GalNAc donor having a structure represented by the following formula (1) to thereby add a GalNAc residue to the GalNAc receptor.
  • GalNAc- (GlcUA— GalNAc) n — (GlcUA) m
  • GlcJ represents an N-acetyl-D-galactosamine residue
  • GlcUA represents a D-glucuronic acid residue
  • n represents an integer of 1 or more
  • m represents It represents 1 or 0 and "1" represents a glycosidic bond.
  • the GalNAc receptor is not particularly limited as long as it contains a sugar chain of the above formula (1) to which a GalNAc residue is transferred.
  • Mette 1 According, a compound sugar, proteins, lipids, synthetic polymer compounds are coupled.
  • a compound having the structure represented by the above formula (2) is obtained.
  • the chondroitin skeleton has a structure in which a disaccharide in which a GlcUA residue and a GalNAc residue are linked by a] 3,3 glycosidic bond is linked by a 31,4 glycosidic bond.
  • a GalNAc residue can be bound to the sugar chain. That is, the GalNAc receptor having the structure of the above formula (1) more preferably has the structure of the following formula ().
  • a GalNAc residue is transferred to the formula () by the enzyme of the present invention to obtain a product having the structure of the following formula (2 ′). This is because the activity of binding the GalNAc residue to the GlcUA residue via a ⁇ 1,4 glycosidic bond is required for the synthesis of the chondroitin skeleton.
  • “GlcUA”, “GalNAc” and “—” are the same as in the above formula (2). It is. ⁇ indicates a] 3 bond, and the number indicates the bonding position (glycosidic bond existing position) with an adjacent sugar residue.
  • a GalNAc residue is transferred from a GalNAc donor to a GalNAc acceptor.
  • the enzyme of the present invention used in the synthesis method 1 of the present invention It is preferable that the GalNAc residue be transferred from the GalNAc donor to the body by a ⁇ 1,4 glycosidic bond. This is because the binding of the GalNAc residue to the chondroitin skeleton is made by] 3,4 glycosidic bonds.
  • the transfer reaction of a GalNAc residue from a GalNAc donor to a GalNAc acceptor is preferably performed within the range of the optimum reaction pH and the optimum reaction temperature of the enzyme of the present invention.
  • the pH is preferably 5.0 to 9.0, more preferably 5.5 to 8.0, and most preferably 6.0 to 7.5.
  • the transfer reaction is preferably performed in a buffer.
  • the buffer include an acetate buffer, a MES buffer, a hydroxymethylaminoamino-hydrochloric acid buffer (hereinafter, also simply referred to as “Tris-HC1 buffer”), and a sodium phosphate buffer. Can also be used.
  • Tris-HC1 buffer a hydroxymethylaminoamino-hydrochloric acid buffer
  • MES is the most preferable because strong action to maintain a stable pH throughout.
  • concentration of the buffer in the buffer is not particularly limited, but is preferably 10 to 200 mmol / l, and more preferably 20 to 100 mmol / l.
  • the buffer preferably contains a divalent metal cation, more preferably a manganese ion, a cobalt ion and the like, particularly a manganese ion, for promoting the enzyme activity.
  • a metal cation may be added to the buffer in the form of a salt.
  • the salt include halides of the above metal cations such as manganese chloride.
  • Temperature conditions at the time of action are exemplified by 20 to 45 ° C, preferably 24 to 40 ° C, most preferably 36 to 37 ° C.
  • the enzyme of the present invention can be used for synthesizing the sugar chains described in the above formulas (2) and (2 ′), and the non-reducing terminal of the sugar chain having the structure of the formula (2) or the formula (2 ′)
  • the use for transferring the GalNAc residue present in the present invention is the use of the present invention.
  • the enzyme of the present invention acts on a GlcUA receptor and a GlcUA donor having a structure represented by the following formula (3), so that a GlcUA residue is added to the GlcUA receptor.
  • GlcUA- (GalNAc-GlcUA) n- (GalNAc) ra indicates an N-acetyl-D-galactosamine residue
  • GlcUA indicates D-galactosamine. It represents a glucuronic acid residue
  • n represents an integer of 1 or more
  • ra represents 1 or 0, and "-" represents a glycosidic bond.
  • the GlcUA receptor is not particularly limited as long as it contains a sugar chain of the above formula (3) to which a GlcUA residue is transferred. It may be a compound having a structure in which sugar chains, proteins, lipids, synthetic high molecular compounds, and the like are bonded.
  • the chondroitin skeleton has a structure in which a disaccharide in which a GlcUA residue and a GalNAc residue are linked by a 1,3 glycosidic bond is linked by a] 31,4 glycosidic bond.
  • a GlcUA residue can be bound to such a sugar chain. That is, the GlcUA receptor having the structure of the above formula (3) more preferably has the structure of the following formula (3 ′).
  • a GlcUA residue is transferred to the formula (3 ′) using the enzyme of the present invention to obtain a product containing the structure of the following formula (4 ′). This is because the activity of binding the GlcUA residue to the GalNAc residue via a ⁇ 1,3 glycosidic bond is required for the synthesis of the chondroitin skeleton.
  • / 3]] indicates a 3 bond, and the number indicates a bonding position (position of a glycoside bond) with an adjacent sugar residue.
  • a GlcUA residue is transferred from a GlcUA donor to a GlcUA acceptor.
  • the enzyme of the present invention used in the synthesis method 2 of the present invention is preferably an enzyme that transfers a GlcUA residue from the GlcUA donor to the GlcUA acceptor by a] 31,3-daricoside bond. This is because the binding of the GlcUA residue to the chondroitin skeleton is achieved by ⁇ 1,3 bonds.
  • the transfer reaction of a GlcUA residue from a GlcUA donor to a GlcUA acceptor is preferably carried out at an optimum reaction pH and an optimum reaction temperature of the enzyme of the present invention.
  • the pH is preferably 4.0 to 8.0, more preferably 4.5 to 7.0, more preferably 5.7 to 6.7, and particularly preferably 6.0 to 6.5. preferable.
  • the transfer reaction is preferably performed in a buffer.
  • the buffer include acetate buffer, MES, Tris-HC1 buffer, sodium phosphate buffer and the like, and any of them can be used.
  • the present invention most preferred pH range in the synthetic method (P H6. 0 ⁇ 6.
  • Stable pH Shi MES is preferred because strong action to keep the record in the whole. This is because ⁇ 6.0-6.5 is the central region of the buffer region, so that the pH can be kept more stable.
  • concentration of the buffer in the buffer is not particularly limited, but 10 to 200 mol / l, preferably 20 to 100 mmol / l.
  • the buffer preferably contains a divalent metal cation, more preferably a manganese ion, a cobalt ion and the like, particularly a manganese ion, for promoting the enzyme activity.
  • a metal cation can be added to the buffer in the form of a salt.
  • the salt include halides of the above metal cations such as manganese chloride.
  • the temperature condition during the operation is exemplified by 20 to 45 ° C, preferably 24 to 40 ° (most preferably 36 to 37 ° C).
  • the enzyme of the present invention can be used for the synthesis of the sugar chains described in the above formulas (4) and (4 ′), and the non-reducing terminal of the sugar chain having the structure of the formula (4) or the formula (4 ′)
  • the use to transfer the GlcUA residue present in the present invention is the use of the present invention.
  • a BLAST search was performed using the amino acid sequence of chondroitin sulfate glucuronyltransferase (CSGlcA-T) (the amino acid sequence encoded by GenBank accession No. AB037823) as a query.
  • CSGlcA-T chondroitin sulfate glucuronyltransferase
  • EST GenBank accession No. NM_018590
  • the gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 was confirmed to be expressed at least in human brain by RT-PCR using Marathon-Ready cDNA (Clontech) as type III.
  • Marathon-Ready cDNA (Clontech)
  • the two primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 were always used to clone the soluble region.
  • PCR was performed according to the method.
  • the type III cDNA used was Marathon-Ready cDNA human brain (Clontech).
  • the amplified band of about 2 kb is digested with EcoRI and BamHI according to a conventional method, and inserted into the EcoRI and BamHI sites of pFLAG-CMV-1 (Sigma), an expression vector for mammalian cells, according to a conventional method.
  • -I got FLAG-CMV1.
  • the base sequence of the obtained solid was confirmed, it was confirmed that a DNA fragment consisting of the base sequence of base numbers 287 to 2328 in the base sequence described in SEQ ID NO: 1 was inserted.
  • K11-FLAG-CMV1 was used to introduce the gene into C0S7 cells cultured in a 100 mm culture dish so as to be 70% confluent according to the protocol. Collect the supernatant obtained after culturing for 3 days, filter through a 0.22 ⁇ filter, add 100 ⁇ l of Anti-FLAG M2-Agarose Affinity Gel (manufactured by Sigma) to 10 ml of the supernatant, and add 4 ⁇ C Well, I got mixed upside down.
  • Anti-FLAG M2-Agarose Affinity Gel manufactured by Sigma
  • CH10 The decasaccharide derived from chondroitin
  • rcsioj The decasaccharide derived from chondroitin sulfate
  • the enzyme reaction was performed at 37 ° C for 1 hour, and then the reaction solution was kept at 100 ° C for 1 minute to inactivate the enzyme and stop the reaction.
  • the 22-23 fractions of the reaction products obtained from CH10 and CS10 are fractions showing the molecular weight at which 11 sugars elute. Minutes.
  • the 11 sugar obtained from CH10 is referred to as “CH11”, and the 11 sugar obtained from CS10 is referred to as rcsiij.
  • chondroitin chemically desulfating chondroitin sulfate from sharks: manufactured by Seikagaku Corporation
  • chondroitin sulfate derived from shark cartilage: manufactured by Seikagaku Corporation
  • ⁇ 3 liver-derived dalcuronidase Sigma
  • the 22 to 23 fractions of the reaction product obtained from CH11 and CS11 were fractions showing the molecular weight at which the 12 sugars eluted.
  • the dodecasaccharide obtained from CH11 is referred to as “CH12”, and the dodecasaccharide obtained from CS11 is referred to as “CS12”.
  • the 21-25 fractions of CS12 were collected, pooled and desalted on a PD10 column.
  • the sample thus obtained was bisected and freeze-dried.
  • One half was dissolved in 100 ⁇ of 0.1 mol / 1 TrisHCl buffer (pH 7.4) containing 30 ol / l sodium acetate (CS12A), and the other was digested with chondroitinase ACII (100 mU Chondroitinase ACII (manufactured by Seikagaku Corporation) was dissolved in 100 / l CS11 fraction, digested with enzyme at 37 ° C for 10 hours, and heated to inactivate the enzyme: CS12B).
  • the GlcUA and GalNAc transfer activity of the enzyme of the present invention of Example 2 was examined by changing the pH of the buffer solution to determine the optimum pH.
  • Acetate buffer, MES buffer, imidazole buffer, and Tris-HCl buffer were used at a final concentration of 50 ramol / l for all buffers.
  • RT-PCR real-time PCR
  • Various types of Marathon-Ready cDNA (Clontech) were converted into type II, and two types of primers (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6) and a minor groove binder (Applied Biosystems) were attached to the 3 'end.
  • Amplification and quantification were performed using a probe (SEQ ID NO: 7).
  • the standard gene make a dilution series with glycerin Ruarudehi de Saint plasmid P CR2. 1 containing phosphate dehydrogenase (GAPDH) (Invitrogen), it was used to prepare a calibration curve.
  • GPDH phosphate dehydrogenase
  • FIG. 9 For the RT-PCR, ABI PRISM 7700 (manufactured by Applied Biosystems) was used (FIG. 9).
  • the expression levels in FIG. 9 are as follows: 1: trachea, 2: brain, 3: liver, 4: skeletal muscle, 5: uterus, 6: kidney, 7: heart, 8: fetal brain, 9: salivary gland, 1 °: Cerebellum, 11: spinal cord, 12: fetal liver, 13: placenta, 14: testis, 15: prostate, 16: mammary gland, 17: knee, 18: adrenal gland, 19: thyroid, 2 0: expression level in the stomach, 21: small intestine, 22: large intestine.
  • the gene of the present invention is strongly expressed in the placenta, testis, ligament, thyroid, stomach and small intestine, especially in the knee.
  • an enzyme for synthesizing the basic skeleton of chondroitin which has a glucuronyltransferase activity and also has a novel N-acetylgalactosamine transferase activity, is a novel chondroitin synthesis derived from human.
  • An enzyme is provided. Sequence listing free text

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Description

明 細 書 コンドロイチン合成酵素および該酵素をコードする DNA 技術分野
本発明はコンドロイチン/コンドロイチン硫酸の糖鎖骨格 （基本骨格： コン ドロイチン骨格とも記載する） を合成する酵素及びそれをコードする DNAに関 するものである。 より詳細にはコンドロイチン骨格の非還元末端に N-ァセチ ル- D -ガラク トサミン残基が存在する際には当該 N-ァセチル- D -ダルコサミン残 基に D-ダルク口ン酸残基を転移し、 非還元末端に D-ダルク口ン酸残基が存在す る場合には当該 D-グルクロン酸残基に N-ァセチル -D-ガラク トサミン残基を転 移する酵素活性を有する酵素及びそれをコードする DNAに関する。 背景技術
以下本明細書中の糖及び糖残基の表記においては特に明記しない限り光学異 性体はすべて D体を示すものとする。
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチンは D -ダルク口ン酸残基 （以下単に 「グルクロン酸」 又は 「GlcUA」 とも記載する） と N-ァセチル -D-ガラク トサミ ン残基 （以下単に 「N-ァセチルガラク トサミン」 又は 「GalNAc」 とも記載す る） の二糖の繰り返し構造 （すなわち、 _[GlcUA i3 (1, 3) - GalNAc ]3 (l, 4) -]n： n は 2以上の整数を示す） を基本骨格とするダリコサミノダリカンの一種である。 従来ダリコサミノダリカン、 特にコンドロイチンやコンドロイチン硫酸は動 物の軟骨、 臓器等から抽出 '精製されていた。 しかし、 近年は原料の不足から コンドロイチンやコンドロイチン硫酸に共通するコンドロイチン骨格を人工的 に合成する手法が模索されている。 特に、 ヒ ト由来の酵素を用いる方法であれ ば、 人工的に合成したコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸に当該酵素が混 入していても、 抗原抗体反応などの生体防御機構が強く作用することもないた め好ましい。 現時点においてこのようなコンドロイチン骨格を合成するための 酵素、 その中でも特にヒ ト由来であって GlcUA転移活性を有しており、 且つ GalNAc転移活性も有している酵素は 1種類しか得られていない （J. Biol. Chem. , 276, 38721-38726 (2001) ) 。 コンドロイチン骨格の合成を行うためには酵素を数種類含むカクテル形式で 行うことが好ましいと考えられている。 各々の酵素の至適反応条件が異なるこ とから反応系全体での反応条件を緩和することが可能となるからである。 しか し、 現時点において、 GlcUA転移活性及び GalNAc転移活性の両者を有するヒ ト 由来の酵素としては上述の酵素が知られているのみであり、 条件の厳密なコン トロールが困難であることからコンドロイチン骨格の合成の検討が不十分な状 況だった。
そこで、 コンドロイチン骨格を合成するための酵素であって、 GlcUA転移活 性を有しており、 且つ GalNAc転移活性も有しているヒ ト由来の新たな酵素が期 待されていた。 発明の開示
本発明は、 以下の （1 ) 〜 （1 4 ) に関する。
( 1 ) 配列番号 2記載のァミノ酸配列又は配列番号 2記載のァミノ酸番号 97 〜755からなるアミノ酸配列からなるポリべプチド、 又はそれに糖鎖が結合し た糖鎖結合ポリぺプチドからなることを特徴とするコンドロイチン合成酵素。
( 2 ) N -ァセチル -D-ガラク トサミン残基を N-ァセチル -D-ガラクトサミン受 容体に対して転移する酵素活性又は D -ダルク口ン酸残基を D -ダルク口ン酸受容 体に対して転移する酵素活性を有すると共に、 配列番号 2記載のアミノ酸番号 97〜755からなるアミノ酸配列のうち 1〜131個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付加及び/又は転移を有するァミノ酸配列からなるポリぺプチドを含む ことを特徴とするコンドロイチン合成酵素。
( 3 ) 非還元末端に D-グルクロン酸残基を有するコンドロイチンの当該 D-グ ルク口ン酸残基に対して N-ァセチル- D-ガラクトサミン供与体から N-ァセチル- D-ガラク トサミン残基を転移する酵素活性を有すると共に、 非還元末端に N-ァ セチル -D-ガラク トサミン残基を有するコンドロイチンの当該 N-ァセチル -D-ガ ラクトサミン残基に対して D -ダルク口ン酸供与体から D -ダルク口ン酸残基を転 移する酵素活性を有することを特徴とする （2 ) 記載のコンドロイチン合成酵
( 4 ) ( 1 ) 〜 （3 ) いずれか記載のコンドロイチン合成酵素をコードする 核酸。 (5) (4) 記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。
( 6 ) 発現べクターが真核細胞中において発現可能であることを特徴とする
(5) 記載の発現ベクター。
(7) (5) 又は （6) 記載の発現ベクターを含むことを特徴とする形質転 換体。
(8) (7) 記載の形質転換体を生育させ、 生育物にコンドロイチン合成酵 素を産生又は蓄積させて該生育物から前記コンドロイチン合成酵素を単離する ことを特徴とするコンドロィチン合成酵素の製造方法。
(9) (1) 〜 （3) いずれか記載のコンドロイチン合成酵素を下記式（1) で示される構造を有する N-ァセチル -D-ガラク トサミン受容体及び N-ァセチル- D-ガラク トサミン供与体に対して作用させて、 N-ァセチル- D-ガラク トサミン 受容体に N-ァセチル -D -ガラク トサミン残基を転移することを特徴とする、 下 記式 (2)で示される構造を有する糖鎖の合成方法。
(GlcUA-GalNAc)n- (GlcUA)m (1)
GalNAc- (GlcUA-GalNAc)n- (GlcUA)m (2) 式（1)及び（2)中、 「GalNAc」 は N-ァセチル -D-ガラク トサミン残基を示し、 「GlcUA」 は D_ダルクロン酸残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を 示し 「一」 はグリコシド結合を示す。
(10) (1) 〜 （3) いずれか記載のコンドロイチン合成酵素を下記式 (3)で示される構造を有する D-ダルク口ン酸受容体及び D-ダルク口ン酸供与体 に対して作用させて、 D-ダルク口ン酸受容体に D-ダルク口ン酸残基を転移する ことを特徴とする、 下記式 (4)で示される構造を有する糖鎖の合成方法。
(GalNAc-GlcUA)n- (GalNAc) ra (3)
GlcUA- (GalNAc -GlcUA)n- (GalNAc) m (4) 式（3)及び（4)中、 「GalNAc」 は N-ァセチル- D-ガラク トサミン残基を示し、 「GlcUA」 は D-グルクロン酸残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を 示し 「一」 はグリコシド結合を示す。 (1 1) 下記式（1)で示される構造を有する N-ァセチル -D-ガラクトサミン受 容体の非還元末端に存在する D-グルクロン酸残基に対して、 N -ァセチル -D-ガ ラタ トサミン残基を転移して下記式 (2)で示される構造を有する糖鎖を合成す るための、 （1) 〜 （3) いずれか記載のコンドロイチン合成酵素の使用。
(GlcUA-GalNAc)n- (GlcUA)m (1)
GalNAc- (GlcUA-GalNAc)n- (GlcUA)m (2) 式（1)及び（2)中、 「GalNAcJ は N-ァセチル- D-ガラク トサミン残基を示し、 「GlcUA」 は D -グルクロン酸残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を 示し 「一」 はグリコシド結合を示す。
(1 2) 下記式（3)で示される構造を有する D-グルクロン酸受容体の非還元 末端に存在する N-ァセチル- D-ガラク トサミン残基に对して、 D-グルクロン酸 残基を転移して下記式 (4)で示される構造を有する糖鎖を合成するための、
(1) 〜 （3) いずれか記載のコンドロイチン合成酵素の使用。
(GalNAc-GlcUA)n- (GalNAc) m (3)
GlcUA- (GalNAc -GlcUA)n- (GalNAc) m (4) 式（3)及び（4)中、 「GalNAc」 は N-ァセチル- D-ガラク トサミン残基を示し、 「GlcUA」 は D-グルクロン酸残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を 示し 「一」 はグリコシド結合を示す。
(13) (1) 〜 （3) いずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素の活性 調節剤。
(14) (13) の活性調節剤を有効成分として含む （1) 〜 （3) のいず れか一項記載のコンドロイチン合成酵素の活性の変化に起因する疾患の処置剤。 図面の簡単な説明
第 1図は、 本発明酵素の GalNAc転移活性による奇数糖の合成を示すク口マト グラフィ一のチヤ一トを示す図である。 白丸はコンドロイチン硫酸に対する GalNAc転移活性を示すチヤ一トであり、 黒丸はコンドロイチンに对する GalNAc 転移活性を示すチャートである。 白三角はコンドロイチン硫酸 10糖に対する GalNAc転移活性を示すチヤ一トであり、 黒三角はコンドロイチン 10糖に対する GalNAc転移活性を示すチヤ一トである。
第 2図は、 本発明酵素の GalNAc転移活性により調製された 11糖とそのコンド 口イチナーゼ ACII消化物のクロマトグラフィ一のチヤ一トを示す図である。 白 丸はコンドロイチナーゼ ACII未消化の 11糖のチャートを示し、 黒丸はコンドロ イチナーゼ ACII消化後の消化産物のチャートを示す。
第 3図は、 本発明酵素の GlcUA転移活性による偶数糖の合成を示すクロマト グラフィ一のチヤ一トを示す図である。 白丸はコンドロイチン硫酸に対する GlcUA転移活性を示すチヤ一トであり、 黒丸はコンドロイチンに対する GlcUA転 移活性を示すチヤ一トである。 白三角はコンドロイチン硫酸 11糖に対する GlcUA転移活性を示すチヤ一トであり、 黒三角はコンドロイチン 11糖に対する GlcUA転移活性を示すチャートである。
第 4図は、 本発明酵素の GlcUA転移活性により調製された 12糖とそのコンド 口イチナーゼ ACII消化物のクロマトグラフィ一のチヤ一トを示す図である。 白 丸はコンドロイチナーゼ ACII未消化の 12糖のチャートを示し、 黒丸はコンドロ ィチナーゼ ACII消化後の消化産物のチヤ一トを示す。
第 5図は、 本発明酵素の GlcUA転移活性の至適 pHを示す図である。 白丸は酢 酸緩衝液を示し、 黒丸は MES緩衝液を示し、 白三角はイミダゾール緩衝液を示 し、 黒三角は Tris緩衝液を示す。
第 6図は、 本発明酵素の GalNAc転移活性の至適 pHを示す図である。 白丸は酢 酸緩衝液を示し、 黒丸は MES緩衝液を示し、 白三角はイミダゾール緩衝液を示 し、 黒三角は Tris緩衝液を示す。
第 7図は、 本発明酵素の活性に対する二価陽イオンの影響を示す図である。 白いバーは GlcUA転移活性を示し、 黒いバーは GalNAc転移活性を示す。
第 8図は、 本発明酵素の活性に対するマンガンイオンの濃度による影響を示 す図である。 白丸は本発明酵素の GlcUA転移活性への影響を示し、 黒丸は本発 明酵素の GalNAc転移活性への影響を示す。
第 9図は、 健常人各組織における本発明酵素の発現量の定量値を示す図であ る。 発明を実施するための最良の形態
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、 公知のコンドロ ィチン合成酵素と類似の酵素活性を有する別の酵素が存在することを発見した。 そして当該酵素の DNAを取得して酵素を調製することにより本発明を完成させ た。
以下、 発明の実施の形態により本発明を詳説する。 ( 1 ) 本発明酵素
本発明酵素は配列番号 2記載のァミノ酸配列又は配列番号 2記載のァミノ酸 番号 97〜755からなるアミノ酸配列からなるポリべプチド、 又はそれに糖鎖が 結合した糖鎖結合ポリべプチドからなることを特徴とするコンドロイチン合成 酵素である。
本発明酵素はコンドロイチン骨格の非還元末端に存在する糖残基に対して、 GalNAc残基を転移する活性及び GlcUA残基を転移する活性 （GalNAc残基を転移 する活性を 「GalNAc転移活性」 、 GlcUA残基を転移する活性を 「GlcUA転移活 性」 と記載する） を有する。 すなわち、 本発明酵素は、 コンドロイチン骨格の 非還元末端に GlcUA残基が存在する場合には当該 GlcUA残基に対して GalNAc転移 活性を示し、 非還元末端に GalNAc残基が存在する場合には当該 GalNAc残基に対 して GlcUA転移活性を示す。 この様な酵素が最もコンドロイチン骨格の合成に おいて利用価値が高いからである。
したがって、 本発明酵素はコンドロイチン骨格の非還元末端に GlcUA残基が 存在する GalNAc受容体と、 非還元末端に GalNAc残基が存在する GlcUA受容体と の両者を糖残基受容体とすることが好ましい。
本発明酵素の GalNAc受容体は例えば下記式（1)で示す構造を含む。
(GlcUA-GalNAc) n- (GlcUA) m (1) 式（1)中、 「GlcUA」 は D_ダルクロン酸残基を示し、 「GalNAcJ は N-ァセチ ル -D-ガラク トサミン残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を示し、 「―」 はグリコシド結合を示す。 GalNAc受容体において、 上記 nは 2以上である ことが好ましく、 更に 4以上であることが好ましい。 このような範囲であると、 より効率的にコンドロイチン骨格の伸長をさせることができるからである。
このような式（1)の構造を有する GalNAc受容体としては、 例えばコンドロイ チン若しくはコンドロイチン硫酸又はこれらを切断して得られる低分子化コン ドロイチン又はコンドロイチン硫酸が例示されるが、 これに限定はされない。 式（1)で示される構造を有する GalNAc受容体に対して本発明酵素は GalNAc供 与体基質から GalNAc残基を転移する。 本発明酵素はコンドロイチン骨格の合成 に有用であるため、 GalNAc残基は ]3 1, 4ダリコシド結合で非還元末端の GlcUA残 基に転移されることが好ましい。
GalNAc供与体とは、 GalNAc残基を有する糖ヌクレオチドであることが好まし い。 そのような物質としては例えばアデノシン二リン酸一 N-ァセチルガラクト サミン （ADP- GalNAc) 、 ゥリジン二リン酸一 N-ァセチルガラタ トサミン （UDP - GalNAc) 、 グアノシン二リン酸一N-ァセチルガラク トサミン （GDP- GalNAc) 、 シチジン二リン酸一 N-ァセチルガラク トサミン （CDP-GalNAc) 等が例示され、 UDP-GalNAcが最も好ましい。 生体内でのコンドロイチン骨格の合成は UDP- GalNAcが GalNAc供与体基質として主に働いているからである。 しかし、 本発明 酵素による GalNAc転移活性に関して GalNAc残基を供給しうる GalNAc供与体であ れば特に限定はされない。
上記式（1)で示される構造を有する GalNAc受容体に対して GalNAc残基を本発 明酵素により転移すると、 下記式 (2)記載の構造を有する糖鎖が得られる。
GalNAc- (GlcUA-GalNAc) n- (GlcUA) m (2) 式（2)中、 「GlcUA」 、 「GalNAc」 、 n、 m、 「一」 は式（1)と同義である。
なお、 GalNAc受容体は上記（1)で表される構造を有しており、 更にその還元 末端に更に糖鎖、 タンパク質、 脂質、 合成高分子化合物などが結合した構造を 有する物質も GalNAc受容体とすることができ、 そのような GalNAc受容体に对し て GalNAc残基を転移した場合には、 上記（2)で表される構造を有しており、 力 つ更にその還元末端に糖鎖、 タンパク質、 脂質、 合成高分子化合物などを有す る化合物が得られる。 このような本発明酵素の GalNAc転移活性は例えば本明細書実施例 2 ( 1 ) 記 載の方法の様に放射性同位元素で GalNAcを標識しておく手法を用いることで容 易に検出 '測定することができる。
本発明酵素の GlcUA受容体は例えば下記式 (3)で示す構造を含む。
(GalNAc -GlcUA) n- (GalNAc) B (3) 式（3)中、 「GlcUA」 は D-グルクロン酸残基を示し、 「GalNAc」 は N-ァセチ ル- D-ガラク トサミン残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を示し、
「―」 はグリコシド結合を示す。 GlcUA受容体において、 上記 nは 2以上である ことが好ましく、 更に 4以上であることが好ましい。 このような範囲であると、 より効率的にコンドロイチン骨格の伸長をさせることができるからである。
式 (3)で示される構造を有する GlcUA受容体に対して本発明酵素は GlcUA供与 体から GlcUAを転移する。 本発明酵素はコンドロイチン骨格の合成に有用であ るため、 GlcUA残基は β 1, 3グリコシド結合で GalNAc残基に転移するものである ことが好ましい。
GlcUA供与体とは、 GlcUA残基を有する糖ヌクレオチドであることが好ましい。 そのような物質としては例えばアデノシンニリン酸一 D-ダルク口ン酸 （ADP- GlcUA) 、 ゥリジン二リン酸一D -グルクロン酸 （UDP-GlcUA) 、 グアノシンニリ ン酸一D-ダルク口ン酸 （GDP- GlcUA) 、 シチジンニリン酸 _ D_ダルク口ン酸 (CDP-GlcUA) 等が例示され、 UDP_GlcUAが最も好ましい。 生体内でのコンドロ ィチン骨格の合成は UDP-GlcUAが GlcUA供与体として主に働いているからである。 しかし、 本発明酵素による GlcUA転移活性に関して GlcUA残基を供給しうる GlcUA供与体であれば特に限定はされない。
上記式 (3)で示される構造を有する GlcUA受容体に対して GlcUA残基を本発明 酵素により転移すると、 下記式 (4)記載の構造を有する糖鎖が得られる。
GlcUA- (GalNAc— GlcUA)„— (GalNAc) m (4) 式（4)中、 「GlcUA」 、 「GalNAc」 、 n、 m、 「一」 は式（3)と同義である。 なお、 GlcUA受容体は上記（3)で表される構造を有しており、 更にその還元末 端に更に糖鎖、 タンパク質、 脂質、 合成高分子化合物などが結合した構造を有 する物質も GlcUA受容体とすることができ、 そのような GlcUA受容体に対して GlcUA残基を転移した場合には、 上記 (4)で表される構造を有しており、 かつ更 にその還元末端に糖鎖、 タンパク質、 脂質、 合成高分子化合物などを有する化 合物が得られる。
このような本発明酵素の GlcUA転移活性は例えば本明細書実施例 2 ( 2 ) 記 載の方法の様に放射性同位元素で GlcUAを標識しておく手法を用いることで容 易に測定することができる。
本発明酵素は配列番号 2記載のアミノ酸番号 97〜755からなるアミノ酸配列 からなるポリペプチドを含むことが好ましい。 この様な範囲のアミノ酸配列を 含むポリぺプチドは上述した GalNAc転移活性及ぴ GlcUA転移活性の双方を有す るからである （本明細書実施例 2参照） 。
一般に酵素は、 それを構成するタンパク質に若干数のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加及び Z又は転移 （これらを総括して以下 「アミノ酸変異」 と記載す る） を有していてもその活性が維持され、 このようなアミノ酸変異を有する酵 素はバリアントと呼ばれている。 一般的に全アミノ酸数の 20%程度のアミノ酸 変異であれば、 活性中心に係る変異でない限りにおいて酵素活性は十分に維持 される。 従って、 上述の GalNAc転移活性及び GlcUA転移活性を有する限りにお いて、 本発明酵素も上記配列番号 2記載のアミノ酸番号 97〜755からなるアミ ノ酸配列に、 若干数のアミノ酸変異を有していてもよい （酵素活性の有無は上 述の様に本明細書実施例 2に従って検定することが可能である） 。 なお、 上記 した 「若干数」 とは酵素を構成する全アミノ酸数の 20%以下 （配列番号 2のァ ミノ酸番号 97〜755からなるポリペプチドにおいては 131個以下：すなわち相同 性 80%以上） 、 好ましくは 15%以下 （配列番号 2のァミノ酸番号 97〜755からな るポリペプチドにおいては 98個以下：すなわち相同性 85%以上） 、 最も好まし くは 10%以下 （配列番号 2のアミノ酸番号 97〜755からなるポリべプチドにおい ては 65個以下：すなわち相同性 90%以上） である。 このようなァミノ酸配列の 相同性は、 FASTAのような周知のコンピュータソフトウエアを用いて容易に算 出することができる。 FASTAのようなソフトウエアはインターネットによって も利用に供されている。 なお、 配列番号 2記載のアミノ酸配列の全配列からなるポリべプチドによつ て構成された酵素も、 ァミノ酸番号 97〜755からなるポリぺプチドに若干数の 変異が起こって得られるポリべプチドによって構成されていると言うことがで き、 本発明酵素として好ましいポリぺプチドの範囲内であると言える。
また、 更にほ乳類由来のタンパク質には糖鎖が結合しているものも多く、 本 発明酵素は、 ポリペプチドのみからなる酵素も、 ポリペプチドに糖鎖が結合し た酵素もいずれも包含する。
また本発明酵素は、 下記の性質を有することが好ましい。
活性の増強： 10瞧 ol/lの二価金属陽イオン （好ましくはマンガンイオン、 コ バ^^トイオン） を反応系に存在させることにより活性が増強される。 具体的に は上記金属陽イオンのハロゲン化物 （塩化物など） を反応液中に存在させれば よい。
活性の阻害： 10隱 ol 濃度のエチレンジァミン四酢酸を反応系に存在させる ことにより実質的に酵素活性を失う。
至適反応 pH ： GlcUA転移酵素活性は 2-モルホリノエタンスルホン酸 （MES) 緩 衝液中で pH5. 7〜6. 7 (好ましくは PH6. 0〜6. 5) 、 GalNAc転移酵素活性は MES緩 衝液中で pH5. 7〜6. 7 (好ましくは pH6. 0〜6. 4)
また、 本発明酵素の活性測定系を利用することで、 かかる酵素の活性を促進 したり阻害したりする働きを有する物質をスクリ一二ングして得ることができ る。 かかる物質は、 本発明酵素の活性調節剤の有効成分として利用することが 可能である。 更にこの様な活性調節剤は、 本発明酵素の活性の変化に起因する 疾患の処置剤として利用することができる。
( 2 ) 本発明核酸
本発明核酸は本発明酵素をコードすることを特徴とする。
すなわち、 本発明核酸はそれ又はそれに相補的な塩基配列を有する核酸を含 む発現ベクターで形質転換した形質転換体で本発明酵素を産生させることがで きる核酸であれば特に限定はされない。 また、 本発明核酸は DNAであっても RNA であってもかまわないが、 安定性の面で極めて優れるため DNAであることが好 ましい。 本発明核酸の好ましい態様の一つとしては配列番号 1記載の塩基配列のうち、 塩基番号 289〜2328からなる DNA、 及び配列番号 1記載の全塩基配列からなる DNAが例示される。
ところでタンパク質の生合成においては、 遺伝暗号 （トリプレット） とアミ ノ酸は必ずしも 1対 1とはなっておらず、 同一のアミノ酸が異なるトリプレツ トに対応することがある （遺伝暗号の縮重） 。 従って上述のような遺伝暗号の 縮重によって同一アミノ酸配列に対応する、 例示した特定の塩基配列以外の他 のトリプレツトを含む核酸も、 結果的に同一の本発明酵素を得るために利用可 能であることは当業者であれば容易に理解されるところであり、 本発明核酸に 含まれることは言うまでもない。
また、 配列番号 1記載の塩基配列のうち、 塩基番号 289〜2328からなる DNA又 はそれに相補的な塩基配列からなる DNAにストリンジヱントな条件下でハイブ リダイズする核酸は、 例えば本発明核酸の生体内での発現状況などを検査する ためのプローブとして使用することができ、 試薬として極めて有用である。 こ のようなプローブとしての核酸はあまりに分子量が大きいと取扱が困難となる ため、 500bp〜10kbpが例示され、 より好ましくは 600bp〜9kbp、 最も好ましく は 700bp〜8kbpが例示される。
なお、 ここでス トリンジェントな条件下とは、 一般にハイブリダイズを使用 する手法 （例えばノザンブロットハイブリダイゼーシヨン、 サザンブロットハ イブリダィゼーシヨン） 等で用いられる条件が挙げられ、 好ましくは 37. 5%ホ ルムアミ ド、 5 X SSPE (塩化ナトリウム/リン酸ナトリウム EDTA (エチレン ジァミン四酢酸） 緩衝液） 、 5 Xデンハルト溶液（Denhardt' s solution) , 0. 5% SDS (ドデシル硫酸ナトリウム） 存在下での 42°Cで条件が例示される。
( 3 ) 本発明発現ベクター
本発明発現ベクターは本発明核酸を含む発現ベクターである。
本発明発現ベクターは上記本発明核酸が目的の宿主細胞中で発現しうるよう に遺伝子発現に関与する領域 （プロモータ領域、 ェンハンサー領域、 オペレー ター領域等） が適切に配列されており、 さらに本発明核酸が適切に発現するよ うに構築されている。 従って本発明発現ベクターを適当な宿主細胞に導入する ことで形質転換体が得られる。 本発明発現ベクターの基本ベクター （本発明遺 伝子を導入する前のベクター） は、 発現ベクターを導入する宿主細胞との関係 において適宜選択される。 例えば宿主細胞として真核細胞 （ほ乳類細胞、 酵母、 昆虫細胞など） を使用する場合には、 真核細胞用のベクターを基本べクタ一と して選択し、 原核細胞 （大腸菌、 枯草菌など） を宿主細胞として選択する場合 には、 原核細胞用のベクターを基本ベクターとして選択する。 ところで本発明 酵素はヒ ト由来の酵素であるため、 本発明においては真核細胞を宿主細胞とし て用いるとより天然物に近い性質を有した本発明酵素が得られる （例えば糖鎖 が付加された態様など） と考えられる。 従って、 宿主細胞としては真核細胞、 特にほ乳類細胞を選択することが好ましく、 本発明発現ベクターの基本べクタ 一は真核細胞、 特にほ乳類細胞用のベクターを選択することが好ましい。
なお、 近年は遺伝子工学的手法として、 形質転換体を培養、 生育させてその 培養物、 生育物から目的物質を単離 ·精製する手法が確立されている。 本発明 発現ベクターはそのような本発明酵素の単離 ·精製 ·検出が容易となるように 構築されていることが好ましい。 特に本発明酵素を標識べプチドとの融合タン パク質として発現するように構築した本発明ベクターを用いて遺伝子工学的に 本発明酵素を調製すると単離 ·精製が比較的容易となるため好ましい。
上記識別べプチドの例としては、 目的タンパク質を遺伝子組み換えによって 調製する際に、 該ぺプチドと目的タンパク質とが結合した融合タンパク質とし て発現させることにより、 形質転換体の生育物から目的タンパク質の分泌 ·分 離 ·精製又は検出を容易にすることを可能とするぺプチドである。 このような 識別べプチドとしては、 例えばシグナルぺプチド （多くのタンパク質の N末端 に存在し、 細胞内の膜透過機構においてタンパク質の選別のために細胞内では 機能している 15〜30アミノ酸残基からなるペプチド：例えば 0mpA、 OmpT, Dsb 等） 、 プロテインキナーゼ 、 プロテイン A (黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分 で分子量約 42， 000のタンパク質） 、 ダルタチオン S転移酵素、 Hisタグ （ヒスチ ジン残基を 6〜10個並べて配した配列） 、 mycタグ （cMycタンパク質由来の 13ァ ミノ酸配列） 、 FLAGペプチド （8アミノ酸残基からなる分析用マーカー） 、 T7 タグ （genelOタンパク質の最初の 11アミノ酸残基からなる） 、 Sタグ （膝臓 RNaseA由来の 15アミノ酸残基からなる） 、 HSVタグ、 pelB (大腸菌外膜タンパ ク質 pelBの 22アミノ酸配列） 、 HAタグ （へマダルチュン由来の 10アミノ酸残基 からなる） 、 Trxタグ （チォレドキシン配列） 、 CBPタグ （カルモジュリン結合 ペプチド） 、 CBDタグ （セルロース結合ドメイン） 、 CBRタグ （コラーゲン結合 ドメイン） 、 j3 - lac/blu ( ]3ラクタマーゼ） 、 ]3 - gal ( j3ガラク トシダ一ゼ） 、 luc (ルシフェラーゼ） 、 HP- Thio (His- patchチォレドキシン） 、 HSP (熱ショ ックペプチド） 、 ίη γ (ラミニン γペプチド） 、 Fn (フイブロネクチン部分べ プチド） 、 GFP (緑色蛍光べプチド） 、 YFP (黄色蛍光ぺプチド） 、 CFP (シァ ン蛍光ペプチド） 、 BFP (青色蛍光ペプチド） 、 DsRed、 DsRed2 (赤色蛍光ぺプ チド） 、 MBP (マルトース結合ペプチド） 、 LacZ (ラク トースオペレーター） 、 IgG (免疫グロブリン G) 、 アビジン、 プロテイン G等のペプチドが挙げられ、 何れの識別べプチドであっても使用することが可能である。 その中でも特にシ グナルペプチド、 プロテインキナーゼ 、 プロテイン A、 ダルタチオン S転移酵 素、 Hisタグ、 mycタグ、 FLAGペプチド、 T7タグ、 Sタグ、 HSVタグ、 pelB又は HA タグが、 遺伝子工学的手法による本発明物質の発現、 精製がより容易となるこ とから好ましく、 特に FLAGぺプチドとの融合タンパク質として本発明酵素を得 るのが、 取扱面が極めて優れるため好ましい。
ほ乳類細胞で発現可能であって、 かつ上述の FLAGぺプチドとの融合タンパク 質として本発明酵素を得ることができる基本ベクターとしては例えば pFLAG- CMV-1 (シグマ社） 等が例示されるが、 当業者であれば本発明酵素の発現に使 用する宿主細胞、 制限酵素、 識別ペプチドなどから判断して適当な基本べクタ 一を選択することが可能である。
( 4 ) 本発明核酸、 本発明発現ベクター、 及び形質転換体の調製方法
本発明によって本発明核酸の塩基配列が開示されたため、 当業者であれば目 的とする本発明核酸や調製したい核酸の領域の両端の塩基配列を基に適宜ブラ ィマーを作成し、 それを用いて PCR法などによって目的の領域を増幅して調製 することが可能である。 本発明核酸の好ましい態様である配列番号 1の塩基番 号 289〜2328からなる DNAの調製は以下のように行うことができる。
CSGlcA - Tのアミノ酸配列 （GenBank accession No. AB037823がコードするァ ミノ酸配列） をクエリーとして BLAST検索を行ない本発明核酸の部分配列を得 ることができる。 そして例えばそれによつて得られる EST (GenBank accession No. MN_018590等） を基にゲノムデータベースからゲノム配列の検索を行うこ とができる。 ゲノム配列の検索は例えば GenScan (米国スタンフォード大学） などを用いて行うことができる。 この方法によつて配列番号 1記載の全塩基配 列を得ることができる。 このようにして得られた塩基配列からプライマーを調 製して塩基番号 289〜2328からなる DNAを調製することができる。 DNAの調製は 例えばポリメラーゼチェインリアクション法 （以下 「PCR法」 と記載する） が 好ましくは挙げられる。 PCR法においては、 ベクターにあわせた適切な制限酵 素領域を予めプライマーに含めておくことが、 本発明核酸のベクターへの導入 が容易とするため好ましい。 この様なプライマーとしては例えば 5'プライマー としては配列番号 3記載の塩基配列 （EcoRI領域を含んでいる） 、 3'プライマ 一としては配列番号 4記載の塩基配列 （BamHI領域を含んでいる） が例示され る。
例えば上記 GenScanで GenBank accession No. MN_018590の ESTを基にして検 索して得られるゲノムは、 データベース上の情報からヒ トの脳で発現している ことが分かる。 そこで PCR法の铸型としては市販のヒ ト脳 cDNAライブラリー (例えば Marathon- Ready cDNA human brain (クロンテック社製等） ） などを 用いることができる。
上記で例示したプライマーを用いて PCR法を行うと約 2kbの増幅産物として本 発明核酸 （DNA) が生じる。 この増幅産物の単離はァガロースゲル電気泳動法 などの分子量による DNAの分離方法とゲルの切り出し、 本発明核酸の抽出など を常法に従って行うことができる。
上記で例示したプライマーは EcoRI領域と BamHI領域とを含んでいるため、 こ れらの制限酵素によって処理することで、 EcoRI及び BamHI領域を有するべクタ 一^■常法により挿入することができる。 例えば上記で例示した基本ベクターで ある pFLAG-CMV- 1には EcoRI及び BamHI領域が含まれているため、 この基本べク タ一を EcoRI及び BamHIで消化し、 本発明核酸を結合させることで本発明べクタ 一を得ることができる。
本発明ベクターの宿主細胞への導入は常法に従って行うことができる。 基本 ベクターとして pFLAG-CMV-1を使用した場合には pFLAG_CMV_lの宿主細胞として 機能する C0S1細胞や C0S7細胞等のほ乳類由来の細胞にエレク トロポレーシヨン 法などの常法を用いて導入して形質転換体を得ることができる。 ( 5 ) 本発明酵素調製法
本発明酵素調製法は、 本発明組換体を生育させ、 生育物に本発明酵素を蓄積 させて該生育物から前記本発明酵素を単離することを特徴とする。
本発明酵素の調製は、 形質転換体をそれが生育するのに適した条件下で生育 させて、 本発明核酸を発現させてその生育物から調製して行なうことができる。 ここで宿主細胞の生育とは、 宿主細胞を培養することの他、 宿主細胞を生体 などに投与してその生体内で宿主細胞を生育させることも含む概念である。 ま た、 生育物とは、 培養された宿主細胞、 培養上清の他、 宿主細胞を生体内で生 育させた場合には、 その生体の排泄物、 分泌物なども含む概念である。
例えば COS- 7細胞を宿主細胞として選択した場合には、 in vitroで形質転換 体を培養し、 その培養物 （培養後の形質転換体及び培養上清） から本発明物質 を精製することが可能である。 本発明酵素の単離 ·精製の方法は、 識別べプチ ドによって適宜、 適当な方法を常套的に選択することが可能である。 特に上記 pFLAG-CMV-1ベタターを用いた場合には本発明酵素は FLAGぺプチドとの融合タ ンパク質として得られるので、 本発明物質は例えば抗 FLAG抗体 （例えば Mlな ど） を用いて、 ァフイエティー精製などの方法で本発明酵素を単離 ·精製する ことが可能である。 抗 FLAG抗体が結合した樹脂などを使用すると、 宿主細胞の 培養物 （培養上清や宿主細胞の抽出物など） からタンパク質を容易に単離 ·精 製することが可能であり、 またその樹脂をそのまま緩衝液などに懸濁して酵素 懸濁液として使用することも可能である。
( 6 ) 本発明合成法
(a)本発明合成法 1
本発明合成法 1は、 本発明酵素を作用させて下記式（1)で示される構造を有 する GalNAc受容体及ぴ GalNAc供与体に対して作用させて、 GalNAc受容体に GalNAc残基を GalNAc供与体から転移することを特徴とする、 下記式 (2)で示さ れる構造を有する糖鎖の合成方法である。
(GlcUA— GalNAc) n—(GlcUA)m (1)
GalNAc- (GlcUA— GalNAc) n— (GlcUA) m (2) 式（1)及び (2)中、 「GalNAcJ は N-ァセチル- D-ガラク トサミン残基を示し、 「GlcUA」 は D-グルクロン酸残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を 示し 「一」 はグリコシド結合を示す。
本発明合成法 1において、 GalNAc受容体とは、 GalNAc残基が転移される対象 となる上記式（1)の糖鎖を含むものであれば特に限定はされず、 更にその非還 元末端に糖鎖、 タンパク質、 脂質、 合成高分子化合物などが結合した化合物で めって1 良レ、。
上記式（1)の GalNAc受容体に対して本発明酵素を作用させて GalNAc供与体か ら GalNAc残基を転移すると、 上記式 (2)で示す構造を有する化合物が得られる。 コンドロイチン骨格は、 GlcUA残基と GalNAc残基とが ]3 1, 3グリコシド結合で 結合した二糖が 3 1, 4グリコシド結合で結合した構造からなり、 本発明合成方 法 1においてもそのような糖鎖に GalNAc残基を結合できることが好ましい。 す なわち上記式（1)の構造を有する GalNAc受容体は下記式（ )の構造を有するこ とがより好ましい。
(4GlcUA ]3 l -3GalNAc j3 l) n-4 (GlcUA) m ( ) 式（ )中の 「GlcUA」 、 「GalNAc」 及び 「一」 は上記式（1)と同様である。 ]3 は β結合を示し、 数字は隣り合う糖残基との結合位置 （グリコシド結合存在位 置） を示す。
式（ )に本発明酵素で GalNAc残基を転移させ、 下記式 (2' )の構造を含む産物 が得られることが好ましい。 GalNAc残基を β 1, 4グリコシド結合で GlcUA残基に 結合する活性がコンドロイチン骨格の合成には必要とされるからである。
GalNAc β 1— (4GlcUA ]3 1— 3GalNAc β l) n_4 (GlcUA) m (2， ) 式 (2' )中の 「GlcUA」 、 「GalNAc」 及び 「―」 は上記式（2)と同様である。 β は ]3結合を示し、 数字は隣り合う糖残基との結合位置 （グリコシド結合存在位 置） を示す。
本発明合成方法 1において GalNAc供与体から GalNAc受容体に対して GalNAc残 基が転移される。 本発明合成方法 1に使用する本発明酵素は、 前記 GalNAc受容 体に対し前記 GalNAc供与体から GalNAc残基を β 1, 4グリコシド結合で転移する ものであることが好ましい。 コンドロイチン骨格への GalNAc残基の結合は ]3 1， 4グリコシド結合でなされているからである。
本発明合成方法における GalNAc供与体から GalNAc受容体への GalNAc残基の転 移反応は、 本発明酵素の至適反応 pH、 至適反応温度の範囲内で行われることが 好ましい。 例えば pHは 5. 0〜9. 0が好ましく、 5. 5〜8. 0がより好ましく、 6. 0〜 7. 5であることが最も好ましい。 このような条件を保っために、 上記転移反応 は緩衝液中で行われることが好ましい。 緩衝液としては酢酸緩衝液、 MES緩衝 液、 ヒ ドロキシメチルァミノエタン-塩酸緩衝液 （以下単に 「Tris - HC1緩衝 液」 とも記載する） 、 及びリン酸ナトリウム緩衝液等が挙げられ、 いずれも使 用することは可能である。 しかし本発明合成方法において最も好ましい PH範囲
(PH6. 0〜7. 5) 全体において安定した pHを保つ作用が強いことから MESが最も 好ましい。 緩衝液の緩衝剤の濃度は特に限定はされないが 10〜200mmol/l、 好 ましい範囲としては 20〜100mmol/lが例示される。
また、 この緩衝液には酵素活性の促進のために二価の金属陽イオン、 更に好 ましくはマンガンイオン、 コバルトイオン等、 特にマンガンイオンが含まれて いることが好ましい。 このような金属陽イオンは塩の形で緩衝液に添加しても 良い。 塩としては例えば塩化マンガンなどの上記金属陽イオンのハロゲン化物 が例示される。
作用時の温度条件は 20〜45°Cが例示され、 好ましくは 24〜40°C、 最も好まし くは 36〜37°Cが例示される。
本発明酵素は、 上述の式 (2)及び式 (2' )記載の糖鎖の合成に使用することが でき、 式 (2)又は式（2' )の構造を有する糖鎖の非還元末端に存在する GalNAc残 基を転移するための使用は本発明使用となる。
(b)本発明合成法 2
本発明合成法 2は、 本発明酵素を下記式 (3)で示される構造を有する Gl cUA受 容体及ぴ GlcUA供与体に対して作用させて、 GlcUA受容体に GlcUA残基を GlcUA供 与体から転移することを特徴とする、 下記式 (4)で示される構造を有する糖鎖 の合成方法である。 (GalNAc-GlcUA) n- (GalNAc) m (3)
GlcUA- (GalNAc-GlcUA) n- (GalNAc) ra (4) 式（3)及ぴ（4)中、 「GalNAc」 は N-ァセチル- D-ガラク トサミン残基を示し、 「GlcUA」 は D-グルクロン酸残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 raは 1又は 0を 示し 「―」 はグリコシド結合を示す。
本発明合成法 2において、 GlcUA受容体とは、 GlcUA残基が転移される対象と なる上記式（3)の糖鎖を含むものであれば特に限定はされず、 さらにその非還 元末端に糖鎖、 タンパク質、 脂質、 合成高分子化合物などが結合した構造を有 する化合物であっても良い。
上記式 (3)の GlcUA受容体に対して本発明酵素を作用させて GlcUA供与体から GlcUA残基を転移すると、 上記式 (4)で示す構造を有する化合物が得られる。 コンドロイチン骨格は、 GlcUA残基と GalNAc残基とが 1， 3グリコシド結合で 結合した二糖が ]3 1, 4グリコシド結合で結合した構造からなり、 本発明合成方 法 1と同様に本発明合成方法 2においてもそのような糖鎖に GlcUA残基を結合 できることが好ましい。 すなわち上記式 (3)の構造を有する GlcUA受容体は下記 式 (3' )の構造を有することがより好ましい。
(3GalNA )3 l -4GlcUA ]3 l) n-3 (GalNAc) ra (3' ) 式（3' )中の 「GlcUA」 、 「GalNAc」 及び 「一」 は上記式（3)と同様である。 β は ]3結合を示し、 数字は隣り合う糖残基との結合位置 （グリコシド結合存在位 置） を示す。
式 (3' )に本発明酵素で GlcUA残基を転移させ、 下記式 (4' )の構造を含む産物 が得られることが好ましい。 GlcUA残基を β 1， 3グリコシド結合で GalNAc残基に 結合する活性がコンドロイチン骨格の合成には必要とされるからである。
GlcUA ]3 1 - (3GalNAc j3 l -4GlcUA /3 l) n-3 (GalNAc)m (4' ) 式（3' )、 （4' )中の 「GlcUA」 、 「GalNAc」 及び 「一」 は上記式（1)、 （2)と同 様である。 /3は] 3結合を示し、 数字は隣り合う糖残基との結合位置 （グリコシ ド結合存在位置） 'を示す。
本発明合成方法 2において GlcUA供与体から GlcUA受容体に対して GlcUA残基 が転移される。 本発明合成方法 2に使用する本発明酵素は、 前記 GlcUA受容体 に対し前記 GlcUA供与体から GlcUA残基を ]3 1， 3ダリコシド結合で転移すもので あることが好ましい。 コンドロイチン骨格への GlcUA残基の結合は β 1， 3結合で なされているからである。
本発明合成方法における GlcUA供与体から GlcUA受容体への GlcUA残基の転移 反応は、 本発明酵素の至適反応 pH、 至適反応温度で行われることが好ましい。 例えば pHは 4. 0〜8. 0が好ましく、 4. 5〜7. 0がより好ましく、 5. 7〜6. 7であるこ とがより好ましく、 特に 6. 0〜6. 5であることが好ましい。 このような条件を保 つために、 上記転移反応は緩衝液中で行われることが好ましレ、。 緩衝液として は酢酸緩衝液、 MES、 Tris- HC1緩衝液及びリン酸ナトリゥム緩衝液等が挙げら れ、 いずれも使用することは可能である。 しかし本発明合成方法において最も 好ましい pH範囲 （PH6. 0〜6. 5) 全体において安定した pHを保つ作用が強いこと から MESが好ましレ、。 ρΗ6· 0〜6. 5が緩衝領域の中心域なので、 pHをより安定に 保つことができるからである。 緩衝液の緩衝剤の濃度は特に限定はされないが 10〜200腿 ol/l、 好ましい範囲としては 20〜100mmol/lが例示される。
また、 この緩衝液には酵素活性の促進のために二価の金属陽イオン、 更に好 ましくはマンガンイオン、 コバルトイオン等、 特にマンガンイオンが含まれて いることが好ましい。 このような金属陽イオンは塩の形で緩衝液に添加しても 良レ、。 塩としては例えば塩化マンガンなどの上記金属陽イオンのハロゲン化物 が例示される。
作用時の温度条件は 20〜45°Cが例示され、 好ましくは 24〜40° ( 、 最も好まし くは 36〜37°Cが例示される。
本発明酵素は、 上述の式 (4)及び式（4' )記載の糖鎖の合成に使用することが でき、 式 (4)又は式 (4' )の構造を有する糖鎖の非還元末端に存在する GlcUA残基 を転移するための使用は本発明使用となる。 実施例 1
本発明酵素の調製
( 1 ) cDNAのクローニングと発現ベクターの構築
コンドロイチン硫酸グルクロン酸転移酵素 （CSGlcA- T) のアミノ酸配列 (GenBank accession No. AB037823がコードするアミノ酸配列） をクエリーと して、 BLAST検索を行った。 その結果、 EST (GenBank accession No. NM_018590) が見つかった。 しかし、 この配列は不完全であったため、 ゲノム データベースから、 GenScan (米国スタンフォード大学） により 0RFを調べた。 その結果、 配列番号 1記載の塩基配列 （コードされるァミノ酸配列は配列番号 2 ) を発見した。 配列番号 1記載の塩基配列からなる遺伝子は、 少なくともヒ ト脳で発現していることを Marathon- Ready cDNA (クロンテック社製） を铸型 とした RT- PCR法によって確認した。 この遺伝子の膜貫通領域を含む領域 （配列 番号 2のアミノ酸番号 1 〜 9 6からなる領域） を除く可溶性領域をクローニン グするため、 配列番号 3及び配列番号 4の 2種のプライマーを用いて常法に従 つて PCRを行った。 使用した铸型 cDNAは Marathon-Ready cDNA human brain (ク ロンテック社製） を使用した。 増幅された約 2 kbのバンドを常法に従って EcoRIと BamHIで消化し、 ほ乳類細胞用の発現べクタ一 pFLAG-CMV - 1 (シグマ社 製） の EcoRIと BamHI部位に常法に従って挿入して K11- FLAG- CMV1を得た。 得ら れたベタターの塩基配列を確認したところ、 配列番号 1記載の塩基配列の塩基 番号 287〜2328の塩基配列からなる DNA断片が挿入されていることを確認した。
( 2 ) 本発明酵素の調製
K11-FLAG-CMV1 15 gを TransFast (プロメガ社製）を用い、 プロ トコールに従 つて 100mm培養皿に 70%コンフルェントになるように培養した C0S7細胞に遺伝 子を導入した。 3日間培養した上清を回収し、 0. 22 μ ηιのフィルターで濾過後、 その上清 10mlに Ant i- FLAG M2- Agarose Affinity Gel (シグマ社製） 100 μ 1を加 え、 4 °Cでー晚、 転倒混和した。 反応後、 ゲルを 50匪 ol Tris-HCl, pH7. 4/20%グリセロールで 3回洗浄後、 27Gの注射針をつけたシリンジを用い余 分な洗浄液を除いた。 このゲルを 50raraol/l Tris-HCl, pH7. 4/20%グリセロール /10瞧 ol/l フエ二ルメチルスノレホニルフノレオライ ド / 1 μ g/ml leupeptin/ 1 μ g/ml pepstatinに 50% (v/v)となるように懸濁し、 これを遠心分離した後に上清 を取り除いて酵素吸着ゲル懸濁液とした。 実施例 2
本発明酵素を用いたコンドロイチン骨格の伸長
(1)コンドロイチン/コンドロイチン硫酸奇数糖の調製
コンドロイチン （サメ由来コンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化：生化学 工業株式会社製） 及びコンドロイチン硫酸 （サメ軟骨由来：生化学工業株式会 社製） をゥシ睾丸ヒアルロニダーゼ （シグマ社製） で限定消化後、 反応液を 10 分間 100°Cで保ち、 酵素を加熱失活させた。 この反応液を Superdex 30カラム
(60 X 1. 6cm: アマシャムバイオサイエンス株式会社製、 クロマトグラフィー 条件；移動相： 0. 2mol/l NH4HC03、 流速： 2ml/分） にかけ溶出液を 225nmの吸光 度でモニターしながら、 2ml毎に分画し、 10糖相当画分をプールした。 各画分 を PD10カラム （アマシャムバイオサイエンス株式会社製） により脱塩後、 常法 に従って力ルバゾール硫酸法によりゥロン酸定量を行い、 凍結乾燥した。 凍結 乾燥物を 1讓 ol/lとなるように蒸留水に溶解し、 偶数オリゴ糖サンプルとした
(コンドロイチン由来の 10糖を 「CH10」 、 コンドロイチン硫酸由来の 10糖を rcsioj と記載する） 。
10nmol/lの MnCl2、 171 μ mol の ATPナトリゥム塩を含む 50mmol/l MES緩衝液 (pH6. 5) に酵素吸着ゲル懸濁液 10 μ 1、 被検物質 （コンドロイチン （CHEL) 、 コンドロイチン硫酸 （CSEL) 、 CH10又は CS10) を lnmol、 [3H]UDP- GalNAcを 0. 036nmol添加して全量を 30 μ 1とした。 酵素反応は 37°Cで 1時間行い、 その後 反応液を 100°Cで 1分間保って酵素を失活させて反応を停止させた。
各々の反応液を孔径 0. 22 μ πιのマイクロフィルター （ミリポア社製） で濾過 した後、 Superdex peptideカラム（30 X 1. 0cm：アマシャムバイオサイエンス株 式会社製、 クロマトグラフィ一条件；移動相： 0. 2mol/l NaCl、 流速 0. 5ml/分） で分離し、 溶出液を 0. 5mlの画分毎に分取して、 シンチレーシヨンカウンター で放射能を測定した （第 1図） 。 その結果、 強い GalNAc転移活性が CHEL (18画 分） 、 CH10 (23画分） 及び CS10 (23画分） を GalNAc受容体基質とした場合に観 察され、 CSELに対しては弱い GalNAc転移活性が観察された （16画分） 。 CH10及 び CS10から得られた反応生成物の 22〜23画分は 11糖が溶出する分子量を示す画 分だった。 CH10から得られた 11糖を 「CH11」 、 CS10から得られた 11糖を rcsiij と記載する。
CS11の 21〜25画分を回収してプールし、 PD10カラムにより脱塩した。 このよ うにして得られたサンプルを二等分して凍結乾燥した。 二分した一方を 30騰 ol/lの酢酸ナトリゥムを含む 0. lmol/1の TrisHCl緩衝液 （pH7. 4) 100 1に 溶解し （CS11A) 、 他方をコンドロイチナーゼ ACIIで消化した （lOOmUのコンド 口イチナーゼ ACII (生化学工業株式会社製） を 100 μ 1の CS11画分に溶解し、 37°Cで 10時間酵素消化し、 加熱して酵素を失活させた： CS11B) 。
CS11Aと CS11Bとを孔径 0. 22 mのマイクロフィルター （ミリポア社製） で濾 過した後、 Superdex p印 tideカラム（30 X 10讓 ： アマシャムバイオサイエンス 株式会社製、 クロマトグラフィー条件；移動相 ： 0. 2mol/l NaCl、 流速 0. 5ml/ 分）で分離し、 溶出液を 0. 5mlの画分毎に分取して、 シンチレーシヨンカウンタ 一で放射能を測定したところ、 CS11Bにおいて三糖画分に放射能ピークがシフ トした （第 2図） 。 この結果から、 本発明酵素はコンドロイチン硫酸由来の 10 糖の非還元末端の GlcUAに対して GalNAcを ]3 1， 4結合で転移し、 11糖を調製する ことができることが推測された。
(2)コンドロイチン/コンドロイチン硫酸偶数糖の調製
コンドロイチン （サメ由来コンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化：生化学 工業株式会社製） 及びコンドロイチン硫酸 （サメ軟骨由来：生化学工業株式会 社製） をゥシ睾丸ヒアルロニダーゼ （シグマ社製） で限定消化後、 反応液を 10 分間 100°Cで保ち、 酵素を加熱失活させた。 この反応液を 10， 000 X gで 10分間遠 心処理し、 上清を回収して更にゥシ肝臓由来 ]3ダルクロエダーゼ （シグマ社 製） で消化した。 酵素反応は反応液を 10分間 100°Cで保って停止させた。 この 反応液を Superdex 30カラム （60 X I. 6cm: アマシャムバイオサイエンス株式会 社製、 クロマトグラフィ一条件；移動相： 0. 2mol/l NH4HC03、 流速： 2ml/分） にかけ溶出液を 225nmの吸光度でモニターしながら、 2ml毎に分画し、 11糖相当 画分をプールした。 各画分を PD10カラム （アマシャムバイオサイエンス株式会 社製） により脱塩後、 常法に従って力ルバゾール硫酸法によりゥロン酸定量を 行い、 凍結乾燥した。 凍結乾燥物を lmmol/1となるように蒸留水に溶解し、 奇 数オリゴ糖サンプルとした （コンドロイチン由来の 11糖： 「CH11」 、 コンドロ ィチン硫酸由来の 11糖： 「CS11」 ) 。
またコンドロイチン （サメ由来コンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化：生 化学工業株式会社製） 及びコンドロイチン硫酸 （サメ軟骨由来：生化学工業株 式社製） をゥシ肝臓由来 /3ダルクロニダーゼ （シグマ社製） で消化してサンプ ルとした （各々 「CH0L」 及び 「CS0L」 と記載する） 。
10nmol/lの MnCl2、 50隱 ol/l 酢酸緩衝液 （PH5. 6) に酵素吸着ゲル懸濁液 10 μ 1、 被検物質 （CH0L 、 CS0L、 CH11又は CS11 ) を lnmol 、 [14C] UDP- GlcUAを 0. 432nmol添加して全量を 30 1とした。 酵素反応は 37°Cで 1時間行い、 その後 反応液を 100°Cで 1分間保って酵素を失活させて反 を停止させた。
各々の反応液を孔径 0. 22 μ πιのマイクロフィルター （ミリポア社製） で濾過 した後、 Superdex peptideカラム（30 X 1. 0cm： アマシャムバイオサイエンス株 式会社製、 クロマトグラフィ一条件；移動相： 0. 2mol/l NaCl、 流速 0. 5ml/分） で分離し、 溶出液を 0. 5mlの画分毎に分取して、 シンチレーシヨンカウンター で放射能を測定した （第 3図） 。 その結果、 強い GlcUA転移活性が CH0L (18画 分） 、 CH11 (23画分） 及び CS10 (22画分） を GlcUA受容体基質とした場合に観 察され、 CS0Lに対しては GlcUA転移活性が観察されなかった。 CH11及び CS11か ら得られた反応生成物の 22〜23画分は 12糖が溶出する分子量を示す画分だった。 CH11から得られた 12糖を 「CH12」 、 CS11から得られた 12糖を 「CS12」 と記載す る。
CS12の 21〜25画分を回収してプールし、 PD10カラムにより脱塩した。 このよ うにして得られたサンプルを二等分して凍結乾燥した。 二分した一方を 30匪 ol/lの酢酸ナトリゥムを含む 0. lmol/1の TrisHCl緩衝液 （pH7. 4) 100 μ ΐに 溶解し （CS12A) 、 他方をコンドロイチナーゼ ACIIで消化した （lOOmUのコンド 口イチナーゼ ACII (生化学工業株式会社製） を 100 / lの CS11画分に溶解し、 37°Cで 10時間酵素消化し、 加熱して酵素を失活させた： CS12B) 。
CS12Aと CS12Bとを孔径 0. 22 μ ηιのマイクロフィルター （ミリポア社製） で濾 過した後、 Superdex peptideカラム（30 X 1. 0cm：アマシャムバイオサイエンス 株式会社製、 クロマトグラフィ一条件；移動相 ： 0. 2mol/l NaCl、 流速 0. 5ml/ 分）で分離し、 溶出液を 0. 5mlの画分毎に分取して、 シンチレーシヨンカウンタ 一で放射能を測定したところ、 CS12Bにおいて二糖画分に放射能ピークがシフ 卜した （第 4図） 。 この結果から、 本発明酵素はコンドロイチン硫酸由来の 11 糖に対して GlcUAを β 1, 3結合で転移し、 12糖を調製することができることが明 かとなつた。 実施例 3
実施例 2の本発明酵素の GlcUA及び GalNAc転移作用を、 緩衝液の pHを変化さ せて至適 pHを調べた。 酢酸緩衝液、 MES緩衝液、 イミダゾール緩衝液、 Tris- HC1緩衝液を、 何れの緩衝液も最終濃度 50ramol/lで使用した。
その結果、 GlcUA転移活性の至適 pHは 6. 0〜6. 5 (第 5図） 、 GalNAc転移活性 の至適 pHは 6· 2 (第 6図） であることが判明した。 実施例 4
実施例 2の本発明酵素の GlcUA転移活性及び GalNAc転移活性の測定条件にお いて、 反応系に 10mmol/lのエチレンジァミン四酢酸 （EDTA) を添加して GlcUA 転移活性及び GalNAc転移活性を調べたところ、 酵素活性が完全に失われた （第 7図） 。 従って、 本発明酵素はその活性に二価陽イオンを必要とすることが明 かとなつた。
また、 反応系に MnCl2に代えて CoCl2を 10議 ol/lで添加すると、 高い酵素活性 が得られることが明かとなった （第 7図） 。
更に、 マンガンイオンの濃度による本発明酵素の活性への影響を調べるため に、 実施例 2の反応条件でマンガンィオンの最終濃度を 0〜50mmol/lの範囲内 で変化させて同様に GlcUA転移活性及び GalNAc転移活性を測定したところ、 何 れの活性も、 10瞧 ol/lの至適マンガンィオン濃度の要求性を有することが明か となった （第 8図） 。 実施例 5
本発明遺伝子のヒ ト組織発現パターンの解析
ヒ ト各種組織における本発明遺伝子の発現量を解析するために、 リアルタイ ム PCR法 （RT- PCR) を用いた。 各種 Marathon-Ready cDNA (クロンテック社製） を铸型にし、 2種のプライマー （配列番号 5及び配列番号 6 ) と 3'末端にマイ ナーグルーヴバインダー （アプライドバイオシステムズ社製） が結合したプロ ーブ （配列番号 7 ) を用いて増幅、 定量を行った。 標準遺伝子としてはグリセ ルアルデヒ ド三リン酸デヒ ドロゲナーゼ （GAPDH) を含むプラスミ ド PCR2. 1 (インビトロゲン社製） で希釈系列を作り、 検量線を作成して使用した。 また、 RT - PCRは ABI PRISM 7700 (アプライ ドバイオシステムス社製） を使用した （第 9図） 。 第 9図における発現量は、 、 1 ：気管、 2 ：脳、 3 ：肝臓、 4 ：骨格 筋、 5 ：子宮、 6 ：腎臓、 7 ：心臓、 8 ：胎児脳、 9 ：唾液腺、 1◦ ：小脳、 1 1 ：脊髄、 1 2 ：胎児肝臓、 1 3 ：胎盤、 1 4 ：精巣、 1 5 ：前立腺、 1 6 ：乳腺、 1 7 ：膝臓、 1 8 ：副腎、 1 9 ： 甲状腺、 2 0 ： 胃、 2 1 :小腸、 2 2 ：大腸における発現量を表す。
その結果、 本発明遺伝子は胎盤、 精巣、 滕臓、 甲状腺、 胃、 小腸、 特に膝臓 で強く発現していることが明かとなった。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、 本発明の精神と 範囲を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者 にとつて明らかである。
本出願は、 2002年 5月 31日おょぴ 2003年 5月 6日出願の日本特許出願 （特願特 願 2002 - 160854および特願 2003-128343) に基づくものであり、 その内容はここ に参照として取り込まれる。 ここに引用されるすべての参照は全体として取り 込まれる。 産業上の利用可能性
本発明により、 コンドロイチンの基本骨格を合成するための酵素であって、 グルクロン酸転移酵素活性を有しており、 且つ N-ァセチルガラクトサミン転移 酵素活性も有しているヒ ト由来の新規コンドロイチン合成酵素が提供される。 配列表フリーテキスト
配列番号 3—人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 4—人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 5—人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 6—人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 7—人工配列の説明：合成 DNA

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 配列番号 2記載のァミノ酸配列又は配列番号 2記載のァミノ酸番号 97〜755からなるアミノ酸配列からなるポリぺプチド、 又はそれに糖鎖が結合 した糖鎖結合ポリペプチドからなることを特徴とするコンドロイチン合成酵素。
2 . N-ァセチル- D-ガラク トサミン残基を N-ァセチル- D-ガラク トサミン 受容体に対して転移する酵素活性又は D-ダルク口ン酸残基を!) -ダルク口ン酸受 容体に対して転移する酵素活性を有すると共に、 配列番号 2記載のアミノ酸番 号 97〜755からなるアミノ酸配列のうち 1〜131個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付加及び 又は転移を有するァミノ酸配列からなるポリぺプチドを含む ことを特徴とするコンドロイチン合成酵素。
3 . 非還元末端に D-グルクロン酸残基を有するコンドロイチンの当該 D- グルクロン酸残基に対して N-ァセチル -D-ガラク トサミン供与体から N -ァセチ ル- D-ガラク トサミン残基を転移する酵素活性を有すると共に、 非還元末端に N-ァセチル -D-ガラク トサミン残基を有するコンドロイチンの当該 N-ァセチル- D-ガラク トサミン残基に対して D-ダルク口ン酸供与体から D-ダルク口ン酸残基 を転移する酵素活性を有することを特徴とする請求の範囲 2記載のコンドロイ チン合成酵素。
4 . 請求の範囲 1〜3いずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素をコ 一ドする核酸。
5 . 請求の範囲 4記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。
6 . 発現ベクターが真核細胞中において発現可能であることを特徴とす る請求の範囲 5記載の発現ベクター。
7 . 請求の範囲 5又は 6記載の発現ベクターを含むことを特徴とする形 質転換体。
8 . 請求の範囲 7記載の形質転換体を生育させ、 生育物にコンドロイチ ン合成酵素を産生又は蓄積させて該生育物から前記コンドロイチン合成酵素を 単離することを特徴とするコンドロイチン合成酵素の製造方法。
9 . 請求の範囲 1〜3いずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素を下 記式（1)で示される構造を有する N-ァセチル- D-ガラク トサミン受容体及び N -ァ セチル -D-ガラク トサミン供与体に対して作用させて、 N -ァセチル -D-ガラク ト サミン受容体に N-ァセチル- D-ガラク トサミン残基を転移することを特徴とす る、 下記式 (2)で示される構造を有する糖鎖の合成方法。
(GlcUA-GalNAc) n- (GlcUA) m (1)
GalNAc- (GlcUA-GalNAc) n- (GlcUA)ffi (2) 式（1)及び（2)中、 「GalNAcJ は N-ァセチル- D-ガラク トサミン残基を示し、 「GlcUA」 は D-グルクロン酸残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を 示し 「一」 はグリコシド結合を示す。
1 0 . 請求の範囲 1〜3いずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素を 下記式（3)で示される構造を有する D-グルクロン酸受容体及び D-グルクロン酸 供与体に対して作用させて、 D-ダルク口ン酸受容体に D-ダルク口ン酸残基を転 移することを特徴とする、 下記式 (4)で示される構造を有する糖鎖の合成方法。
(GalNAc— GlcUA) n— (GalNAc) m (3)
GlcUA— (GalNAc -GlcUA) n- (GalNAc) m (4) 式 (3)及び (4)中、 「GalNAc」 は N-ァセチル _D -ガラク トサミン残基を示し、 「GlcUA」 は D-グルクロン酸残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を 示し 「一」 はグリコシド結合を示す。
1 1 . 下記式（1)で示される構造を有する N-ァセチル- D-ガラク トサミン 受容体の非還元末端に存在する D-グルクロン酸残基に対して、 N-ァセチル -D- ガラク トサミン残基を転移して下記式 (2)で示される構造を有する糖鎖を合成 するための、 請求の範囲 1〜 3いずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素の 使用。
(GlcUA-GalNAc) n- (GlcUA) m (1)
GalNAc- (GlcUA-GalNAc) n- (GlcUA) ra (2) 式（1)及ぴ（2)中、 「GalNAc」 は N_ァセチル- D-ガラク トサミン残基を示し、 「GlcUA」 は D-グルクロン酸残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を 示し 「一」 はグリコシド結合を示す。
1 2 . 下記式（3)で示される構造を有する D-グルクロン酸受容体の非還元 末端に存在する N-ァセチル- D-ガラク トサミン残基に対して、 D-グルクロン酸 残基を転移して下記式 (4)で示される構造を有する糖鎖を合成するための、 請 求の範囲 1〜 3いずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素の使用。
(GalNAc-GlcUA) n- (GalNAc)m (3)
GlcUA- (GalNAc-GlcUA) n- (GalNAc) m (4) 式（3)及び（4)中、 「GalNAc」 は N-ァセチル _D -ガラク トサミン残基を示し、 「GlcUA」 は D-グルクロン酸残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を 示し 「一」 はグリコシド結合を示す。
1 3 . 請求の範囲 1〜 3 、ずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素の活 性調節剤。
1 4 . 請求の範囲 1 3記載の活性調節剤を有効成分として含む請求の範囲 1〜 3のいずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素の活性の変化に起因する 疾患の処置剤。
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