WO2004078969A1 - コンドロイチン重合化因子の同定と、その利用 - Google Patents

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WO2004078969A1
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chondroitin
protein
amino acid
acid sequence
chpf
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PCT/JP2004/002893
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Kazuyuki Sugahara
Hiroshi Kitagawa
Original Assignee
The New Industry Research Organization
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)

Definitions

  • the present invention relates to the identification of a polymerization factor (polymerization promoting factor) that promotes the polymerization reaction of chondroitin chains by chondroitin synthase, a method for synthesizing chondroitin sugar chains using the same, and the like.
  • a polymerization factor polymerization promoting factor
  • Chondroitin sulfate is a type of sulfated glycosaminodalican that is widely distributed on the cell surface and extracellular matritus.Cell-cell interaction, cell recognition mechanism in immunity, lymphocyte specific homing phenomenon, cancer cell adhesion It is considered to be involved in a wide variety of biological phenomena such as metastasis and metastasis, and is widely used in pharmaceuticals, cosmetics, foods, etc. due to its various physiological functions. Recent studies have revealed that chondroitin sulfate, like heparan sulfate, plays an important role in the formation of brain neural networks in vertebrates and the like.
  • Chondroitin sulfate biosynthesis begins with the transfer of xylose (Xyl) to specific serine (Ser) residues in the core protein, followed by two galactoses (Gal) and glucuronic acid (GlcA). Transfer is performed at the saccharide unit, and the tetrasaccharide-binding domain (GlcAfil-3Gami-3GalBl-4XyUJl-0 "Ser) is synthesized. Alternating and repetitive transfer causes a polymerization reaction of chondroitin chains to form a disaccharide repeating region of chondroitin sulfate, and the sulfotransferase sulphates the constituent sugars to chondroitin sulfate.
  • chondroitin sulfate include natural products such as whale cartilage.
  • the method of preparation was known.
  • the amount of chondroitin sulfate that can be prepared from whale cartilage and the like is limited.
  • whale whaling has been restricted from the viewpoint of animal welfare, making it difficult to procure whales.
  • ChSy expressed as a recombinant protein in vitro showed activity to transfer GalNAc and GlcA, respectively, but failed to polymerize chondroitin chains on ⁇ - ⁇ .
  • the polymerization reaction of the chondroitin chain detected in the culture supernatant of the G361 cells described above could not be reproduced. Disclosure of the invention
  • the present inventors have found that in collaboration with ChSy, the chondroitin chain can be polymerized. We anticipated that there might be an unidentified protein factor that is essential for this, and we searched for the same molecule.
  • An object of the present invention is to identify a novel molecule involved in the polymerization of a chondroitin chain, and to provide a method for synthesizing a chondroitin sugar chain using the molecule, a method for producing chondroitin sulfate, and the like.
  • glycosyltransferases involved in chondroitin sulfate biosynthesis. Since all of them show high homology with ChSy, we thought that factors involved in the polymerization of chondroitin chains might also show homology with ChSy, and searched the database based on the amino acid sequence of ChSy. As a result of an analysis based on the obtained data, the existence of a novel human gene consisting of 775 amino acids and having 23% homology with human ChSy at the amino acid level was identified.
  • the present invention includes the following inventions A) to P) as industrially useful methods.
  • a recombinant expression vector comprising the polynucleotide according to A) or B).
  • Use plasmid, phage, cosmid, etc. to construct a recombinant expression vector But is not particularly limited.
  • a transformant into which the polynucleotide according to A) or B) has been introduced means that the polynucleotide (gene) is introduced into the target cell (host cell) so that it can be expressed by a known genetic engineering technique (gene manipulation technique).
  • a known genetic engineering technique gene manipulation technique.
  • transformant means not only cells and tissues, but also animals (transgenic animals such as nematodes, Drosophila melanogaster, mice, rats, puppies, stags, and monkeys). It is a meaning that includes.
  • a protein comprising any one of the following amino acid sequences (a) to (d):
  • the antibody can be obtained as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody by a known method using the full length of the protein or its partial peptide as an antigen.
  • Ii A method for determining the presence or absence of a genetic disease by detecting a mutation in a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • this protein is a human-derived chondroitin polymerization factor (ChPF) that plays an important role in the polymerization of chondroitin chains in cooperation with ChSy, and its mutation causes abnormalities in the biosynthesis of chondroitin sulfate. May be the cause of the disease.
  • ChPF human-derived chondroitin polymerization factor
  • Such diseases it is possible to determine the presence of those gene disease by detecting the mutation on CiLPi 7 gene.
  • FIG. 1 shows the structure and sequence of the human chondroitin polymerization factor (ChPF) according to the present invention. It is a figure shown in comparison with. In the figure, the box indicates the transmembrane domain, and the estimated JV-glycosylation site of ChPF Is indicated by ⁇ .
  • ChPF human chondroitin polymerization factor
  • FIG. 2 is a diagram showing the genomic structure of the above-mentioned human chondroitin polymerization factor (ChPF) in comparison with chondroitin / dalc oxalate transferase (Chondroitin GlcAT).
  • ChoPF human chondroitin polymerization factor
  • Chodroitin GlcAT chondroitin / dalc oxalate transferase
  • boxes indicate exons
  • pars indicate introns
  • white boxes indicate untranslated regions
  • black boxes indicate translated regions.
  • ATG indicates a start codon and TGA 'TAG indicates a stop codon.
  • FIG. 3 A and B in Fig. 3 show the results of an experiment in which the size of the chondroitin chain obtained was compared by conducting a polymerization reaction using the oligosaccharides in the binding region, the artificial substrate, and ⁇ -topoamphomodulin (CK- ⁇ ) as receptor substrates.
  • FIG. 1 A and B in Fig. 3 show the results of an experiment in which the size of the chondroitin chain obtained was compared by conducting a polymerization reaction using the oligosaccharides in the binding region, the artificial substrate, and ⁇ -topoamphomodulin (CK- ⁇ ) as receptor substrates.
  • 4A to 4C are graphs showing the results of experiments in which a polymerization reaction was performed using (GlcABl-3GalNAc) 3 ⁇ chondroitin polymer as an acceptor substrate, and the size of the obtained chondroitin chain was compared and examined.
  • ⁇ B in FIG. 5 is a graph showing the results of analysis of hexasaccharide in the sugar-protein binding region derived from the chondroitin sugar chain synthesized on ⁇ - ⁇ .
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of an interaction analysis between ChPF and ChSy using the pull-down method.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of Northern plot analysis of 3 ⁇ 4FF and (3 ⁇ 4Sy. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the present invention in conjunction with chondroitin synthase (ChSy), identifies a polymerization factor that promotes the polymerization of chondroitin chains and a gene encoding the same, and analyzes its functions in detail.
  • the present invention proposes a method for synthesizing a chondroitin chain using the method. Therefore, in the following, the sequence and structure of the chondroitin polymerization factor and its gene (polynucleotide) will be described, and then its function, usage, and the like will be described.
  • this novel protein did not have the DXD motif, which is a binding motif of the sugar donor UDP-sugar. This suggested that this gene product was involved in the biosynthesis of chondroitin sulfate but did not retain glycosyltransferase activity. From the results of functional analysis, it was found that this gene product was not a glycosyltransferase but a factor that polymerizes chondroitin in cooperation with ChSy. ehondroitin polvmerising factor (ChPF)).
  • ChPF ehondroitin polvmerising factor
  • SEQ ID NO: 1 in the sequence listing shows the cDNA sequence of the human CPFF gene
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of human ChPF encoded by the gene
  • SEQ ID NO: 4 shows the amino acid sequence of a soluble ChPF recombinant protein obtained by recombining 62 amino acids from the N-terminal side including the putative transmembrane domain of C3 ⁇ 4PF with other sequences
  • No. 3 shows the cDNA sequence.
  • functional analysis of ChPF was performed by expressing this soluble ChPF.
  • CjhPF was spread over about 5 kb on chromosome 2 and the gene in the translation region was composed of four exons. This genomic structure was similar to the Cl miiroitiii GJcAT gene.
  • the protein according to the present invention comprises (a) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, (b) a soluble protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and (c) the sequence No. 2 or 4 (D) a protein comprising an amino acid sequence containing an amino acid sequence (for example, a fusion protein); (d) one or several amino acids in the amino acid sequence of any of (a) to (c) above,
  • the protein may be any one of a protein comprising an import and a Z or an added amino acid sequence (functioning as a chondroitin polymerization factor).
  • it may be a chondroitin polymerization factor derived not only from human but also from other organisms.
  • substitution, deletion, insertion, and / or addition of one or several amino acids refers to substitution, deletion, insertion, and Z or It means that as many amino acids as can be added are substituted, deleted, inserted, and / or added.
  • the protein (d) is, in other words, the mutant protein of (a) to (c), and the “mutation” referred to herein is mainly introduced artificially by a known method for producing a mutant protein. It means a mutation that has been made, but it may be a naturally occurring similar mutant protein isolated and purified.
  • the protein according to the present invention may include a known additional sequence such as HA or F1ag at the end thereof, or may be a fusion protein in order to easily purify or detect the protein.
  • a known additional sequence such as HA or F1ag at the end thereof
  • various known modifications may be applied, or those which form multimers of dimers or more may be used.
  • polynucleotide (gene) of the present invention is not particularly limited as long as it has a sequence encoding any of the above-described proteins (a) to (d), and further includes a sequence of an untranslated region (UTR) and the like. It may be.
  • the "polynucleotide (gene)" of the present invention includes RNA and DNA.
  • RNA includes mRNA and siRNA
  • DNA includes cDNA and genomic DNA.
  • the DNA may be double-stranded or single-stranded, and the single-stranded DNA may be a coding DNA serving as a sense strand or an anti-coding strand serving as an antisense strand.
  • the antisense strand can be used as a probe or as an antisense drug.
  • gene expression of siRNA as RNAi It can be used for suppression.
  • ChPF chondroitin polymerization factor
  • ChPF For the polymerization reaction of chondroitin chains using ChPF, it is preferable to use a core protein such as ⁇ - ⁇ as an acceptor substrate. 4) ChSy and ChPF co-expressed as secreted proteins are thought to form a complex and interact with each other. 5) ChPF was expressed in most tissues examined, and its expression pattern was similar to ChSy. This suggests that both are involved in the biosynthesis of chondroitin sulfate in vivo.
  • chondroitin polymerization factor ((PF) and its gene can be used for artificial synthesis of the sugar chain skeleton of physiologically active sulfated glycosaminodalican (chondroitin sulfate, dermatan sulfate).
  • Chondroitin was previously prepared by chemically desulfating chondroitin sulfate prepared from whale cartilage, etc., but by co-expressing ChSy and ChPF and using this as an enzyme source, in vitro This makes it possible to stably and easily mass-produce chondroitin sugar chains.
  • chondroitin polymerization factor ChoPF
  • a chondroitin sugar chain on a core protein such as ⁇ - thrombomodulin ( ⁇ - ⁇ ).
  • the gene for the chondroitin polymerization factor of the present invention can be used as a research reagent or a test reagent, as well as diseases caused by abnormal chondroitin polymerization factor, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, etc. It can be used for the pathological analysis of diseases related to sulfated glycosaminoglycans, and for the development of therapeutics, treatments, diagnostics, and diagnostics for the diseases.
  • the method for obtaining the C3 ⁇ 4LP gene according to the present invention is not particularly limited, and a DNA fragment containing the gene sequence can be isolated and cloned by various methods based on the above-described sequence information and the like. it can.
  • a probe that specifically hybridizes with a partial sequence of the cDNA of the above gene may be prepared, and a human genome DNA library and a cDNA library may be screened.
  • any probe may be used as long as it is a probe that specifically hybridizes to at least a part of the cDNA sequence of the CILPF gene or its complementary sequence.
  • screening may be performed.
  • the clones obtained by the above screening can be analyzed in more detail by creating a restriction map and determining its nucleotide sequence (sequencing). By these analyses, it can be easily confirmed whether a DNA fragment containing the gene sequence according to the present invention has been obtained.
  • the method for obtaining a gene (polynucleotide) according to the present invention comprises: In addition to the amplification method, there is a method using amplification means such as PCR.
  • primers are respectively prepared from the sequences of the untranslated regions on the 5, 5 and 3 sides (or their complementary sequences), and human primers are prepared using these primers.
  • a large amount of a DNA fragment containing the polynucleotide of the present invention can be obtained by amplifying the DNA region sandwiched between both primers by performing PCR or the like using DNA (or cDNA) or the like as type III.
  • the method for obtaining the above ChPF protein and the like according to the present invention is not particularly limited.
  • the gene obtained as described above cDNA encoding the above ChPF protein or a homologous molecule thereof, etc.
  • the recombinant DNA is introduced into a microorganism or animal cell such as Escherichia coli or yeast by a well-known method and expressed as a transformant to express and purify the protein encoded by the cDNA.
  • a microorganism or animal cell such as Escherichia coli or yeast by a well-known method
  • expressed as a transformant to express and purify the protein encoded by the cDNA.
  • the method for producing the mutant protein of the above ChPF protein is not particularly limited.
  • one or more bases can be prepared by modifying such that one or more bases are substituted, deleted, inserted, transmitted and / or added.
  • a commercially available kit may be used for preparing the mutant protein.
  • the ChPF knockout animal of the present invention that is, a non-human animal obtained by modifying all or a part of the ChPF gene sequence in the genome, It can be produced using the gene targeting method.
  • the gene targeting method may be performed according to an ordinary method.
  • a targeting vector for homologous recombination is constructed.
  • Targeting vector it can be made Ri by the known method, generally, CiiPi 1 genomic DNA clone, a commercially available plasmid, marker for positive selection (PGK- neo cassette, etc.), for Oyopine moth Restorative selection It can be prepared by appropriately ligating each fragment such as a marker (DTA gene, ⁇ [3-115: gene, etc.). At this time, it is advisable to design a targeting vector so that the target restriction enzyme cleavage site is located at an appropriate position.
  • the homologous region is preferably as long as possible. Furthermore, since the targeting vector is preferably linear rather than circular, an appropriate restriction enzyme cleavage site may be provided at a site other than the homologous region for linearization.
  • the gene targeting vector prepared by the above method is introduced into totipotent cells derived from a target animal, such as ES cells, by electroporation or the like, and then cells in which the desired homologous recombination has occurred are selected.
  • the screening can be efficiently screened using a drug by a positive-negative selection method.
  • the cells in which the desired homologous recombination has occurred are confirmed by Southern Plot II PCR method or the like.
  • the totipotent cells for which homologous recombination has been confirmed are introduced into blastocysts (plastocysts) collected from the pregnant uterus.
  • the cells can be introduced into the blastocyst by a microinjection method or the like, but is not limited thereto.
  • the blastocyst is transplanted to a foster mother according to a conventional method.
  • a germ-line chimeric animal preferably male
  • a wild-type (preferably female) wild-type (preferably female) homozygous for the 3 ⁇ 4PF gene By mating a germ-line chimeric animal (preferably male) born from a foster mother with a wild-type (preferably female) wild-type (preferably female) homozygous for the 3 ⁇ 4PF gene, a homozygous first-generation (F 1)
  • F 1 One ⁇ 3 ⁇ 4PF gene on the chromosome can be obtained by homologous recombination to obtain a disrupted heterozygote. Wear.
  • homozygotes in which both C3 ⁇ 4PF genes on homologous chromosomes are disrupted can be obtained as the second generation (F 2).
  • a part of the body (for example, the tail) may be cut, DNA may be extracted, and the genotype may be determined by Southern blot II PCR.
  • F 2 a wild-type animal (having a wild-type gene homozygously) with a GW ⁇ knockout animal can be obtained, and this wild-type animal is suitably used for control experiments. be able to.
  • the target animals of the ChPF knockact animal are not particularly limited, but examples include mammals such as porcupines, pigs, higgins, goats, puppies, dogs, cats, monulemots, hamsters, mice, and rats. Is done. Of these, for use as laboratory animals, preference is given to egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice and rats, of which rodents are more preferred, and many inbred strains have been produced. Mice equipped with techniques such as egg culture and in vitro fertilization are particularly preferred.
  • the totipotent cells include fertilized eggs and early embryos, as well as cultured cells such as ES cells and somatic stem cells having multipotency.
  • ChPF knockout animal of the present invention is useful for functional analysis of ChPF and the like.
  • the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • the detailed experimental method in each example will be described together in the last section.
  • a BLAST search using the amino acid sequence of human ChSy revealed that a novel gene homologous to ChSy was present.
  • This gene was composed of a 236 bp 5, untranslated region, a 2325 bp translated region encoding 775 amino acids ( Figure 1 and SEQ ID NOS: 1 and 2), and an approximately 500 bp 3 'untranslated region. .
  • the translation start area and The expected sequence followed the Kozak consensus sequence.
  • the protein translated from this gene is located on the N-terminal side by Kyte-Doolittle hydropathy analysis.
  • Golgi-localized glycosyltransferase with a single transmembrane domain consisting of 23 amino acids has been identified as a type II membrane protein. site. This gene showed 23% homology with ChSy at the amino acid sequence level and 57% homology with human Chondroitiii GlcA (Fig.
  • Gaenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster were also found to have orthologs of the above ChPF, with 27 and 25% homology, respectively.
  • ChPF 62 amino acids from the N-terminus including the transmembrane domain of ChPF are recombined with the sequences of the extracellular secretion signals insulin leader and the IgG-binding domain of protein A.
  • the secreted protein fused with protein A was expressed in COS-1 cells.
  • Chn is used as a sugar receptor substrate for UDP-GalNAc or UDP-GlcA.
  • the sugar transfer activity was measured using as a sugar donor, but almost no sugar transfer activity could be detected (Table 1 below).
  • ChPF is not a glycosyltransferase but a polymerization factor, and co-expressed ChSy, which has glycosyltransferase activity to synthesize the disaccharide repeating region of the Chn chain, in the same cell as ChPF.
  • ChPF was co-expressed with ChSy as the enzyme source, the GalNAcT-II and GlcAT-II activities were increased 20 times or more as compared with the case of using ChSy alone (Table 1).
  • no increase in glycosyltransferase activity was observed in a mixture of recombinant proteins expressing ChSy and ChPF independently. This suggested that ChSy and ChPF form a complex in cells.
  • the complex was not formed when expressed alone, and that the complex was formed by co-expressing ChSy and ChPF in the same cell.
  • Chn polymer was used as a sugar acceptor substrate.
  • ChSy expressed as a recombinant protein was GalNAc and GlcA Despite retaining both GalNAcT_II and GlcAT-II activities that transfer each of them with a monosaccharide, they did not retain the activity of polymerizing Clm chains on ⁇ -TM. Thus, the increased glycosyltransfer activity was observed in the co-expressed ChPF and ChSy, indicating that the co-expressed ChPF and ChSy may retain the activity to polymerize the Chn chain.
  • GalNAcT_II and GlcAT-II activities that transfer each of them with a monosaccharide
  • the reaction product isolated in B was digested with GSaseACII, separated by gel filtration chromatography using a Superdex Peptide column, and measured with a liquid scintillation counter. Chromatogram after CSase digestion of the reaction product when the enzyme was used as the enzyme source ( ⁇ ) and after CSase digestion of the reaction product when the ChSy-expressed product was used as the enzyme source ( ⁇ ) Arrows indicate the elution positions of disaccharide sugar GalNAc derived from Chn.
  • the radiolabeled fraction containing the binding region (Fr. 1 in Graph A) was collected and analyzed by HPLG using an anion exchange column. The chromatograms of Fr. 1 before ( ⁇ ) and after (Fr) digestion with chondro-glycuronidase are shown. The radioactivity of the eluate was measured. The arrows indicate the elution positions of the pentasaccharide and hexasaccharide bound to the binding region labeled with 2-AB. Wavy line indicates a concentration gradient of NaH 2 P0 4.
  • the radiolabeled sugar chain was digested with CSaseABC to obtain Fr. 1 containing the binding region and Fr. 2 containing the disaccharide. Since the ratio of the radioactivity of Fr. 1 and Fr. 2 was 1:47, the synthesized Clm chains were expected to consist of an average of about one hundred sugars.
  • Fig. 6 First, ChPF and ChSy were expressed alone and in the same cell as secretory fusion proteins with 6XHis or protein A, and a pull-down assay using Ni-NTA agarose was performed. Then, separated by SDS-PAGE, the fusion protein with protein A was detected by western Blotting with I g G antibodies.
  • Lane 1 a pan of about 110 kDa, which is expected to be the size of protein A-ChPF, was detected. Lane detected a pan of about 120 kDa, which is expected to be the size of protein A-ChSy.
  • the samples in each lane are as follows. Lane 1: protein A-ChPF / His-ChSy, lane 2: His-ChSy ⁇ lane 3: protein AC Sy + His-ChPF (single A mixture of independently expressed proteins), lane 4: protein A-ChSy / His-ChPF, lane 5: His-ChPF.
  • Lane 1 brain; lane 2, heart; lane 3, skeletal muscle; lane% colon; lane 5, thymus; lane 6, spleen; lane 7, kidney; lane 8, liver; lane 9, small intestine; lane 10, placenta lane 11, lung; lane 12, peripheral Mood leulioeytes.
  • the size of the mRNA was about 3.4 kb, and expression was observed in all the tissues examined except for peripheral leukocytes. This was consistent with the finding that chondroitin sulfate was expressed in almost all tissues. The level of expression varies depending on the tissue, with the strongest expression in the placenta and heart, followed by strong expression in the brain, skeletal muscle, and kidney and liver. Furthermore, 3 ⁇ 4PF was very similar to 3 ⁇ 4Sy mRNA expression pattern. This indicates that both are involved in the biosynthesis of chondroitin sulfate.
  • the soluble recombinant An expression plasmid for expressing ChPF as a protein was prepared.
  • the sequence excluding the first 62 amino acids predicted to be a transmembrane domain from the N-terminal side of CM ⁇ was amplified by PCR.
  • 5'-Primer has 5, terminal containing BamHI site (underlined) 5, -CGGGATCCAACTCGGTGCAGC-3, 3, -primer has 5, terminal BamHI site (underlined) 5, -CGOe ⁇ GCTCTGGTTTTGGGGGAGAAG-3 , Was used.
  • PCR used KOD DNA polymerase and 50 ng of cDNA library derived from human malignant melanoma cell line G361 (ATCC CRL-1424) as type II.
  • the reaction is in 5% DMSO exist under 94 0 C, 30 sec; 55 . C, 30 sec; 68. C, 32 cycles of 180 sec were performed.
  • the amplified fragment was digested with BamHI and inserted into pEF-BOS / IP vector to obtain an expression plasmid (pEF-B0S / IP-ChPP) o
  • the above expression plasmid pEF-BOS / IP-ChPF 6.0 was transfected into African green monkey kidney-derived COS-1 cells using FuGENE TM 6 transfection reagen.
  • both plasmids were introduced into COS-1 cells using FuGENE TM 6 transfection reagent in the same manner as for pEF-BOS / IP-ChPF and 3.0 for pEF-BOS / IP-ChSy.
  • After Transfeetioii 3 * 7 for 2 days in DMEM / 10% FBS medium. After incubation under conditions of C / 5% G0 2, the culture supernatant and IgG-Sepharose 4.
  • the mixture was mixed with C for 1 hour to bind the fusion protein with protein A. Thereafter, the mixture was centrifuged at 1,000 rpm for 2 minutes to remove the supernatant, and the precipitated resin was washed with 0.15 M NaCl / 0.02% Tween-20 / 50 mM Tris-HCl (pH 7.5). This was repeated three times, and the purified fusion protein / IgG-Sepharose was used as an enzyme source.
  • the purified product after the polymerization reaction of ⁇ - ⁇ was isolated by removing the free isotope using a syringe column.
  • the sugar chain labeled with [ 3 H] GaINAc on ⁇ - ⁇ was excised from the core protein by alkali treatment using 0.5 M LiOH, and a quarter was subjected to gel filtration chromatography using a Superdex 75 column to fractionate. The radioactivity of the fractions was measured with a liquid scintillation counter. Alkali treated The remaining three quarters were fluorescently labeled with 2-aminobeiizainide (AB). The obtained fluorescently labeled sugar chain was completely digested with 50 mlU of CSaseABC for 1 hour.
  • the digested product of the CSaseABC was subjected to gel filtration chromatography using a Superdex Peptide column to collect fractions that were considered to be the binding region hexasaccharide labeled with 2-AB. 03) was analyzed by HPLC. In addition, digestion with chondro-glycuronidase was performed and analyzed by HPLC. The reaction product was identified by co-chromatography with a 2-AB labeled binding area hexasaccharide standard and a binding area pentasaccharide standard.
  • the product after the polymerization reaction was isolated by removing the free isotope using a syringe column. Thereafter, the purified product was directly analyzed by gel filtration chromatography using a Superdex 200 column. In addition, the isolated purified product was digested with CSaseACII, separated by gel filtration using a Superdex Peptide column after digestion, and the radioactivity of the fractionated fraction was measured using a liquid scintillation force counter. It was measured.
  • ChPF 5'-Primer is 5, contains EcoKi site (underlined) at the end 5, -CGGAATTCAA PCR was performed using CTCGGTGCAGCCCGGAGC-3 ', 3, -primer was 5, and 5, -CGQO ⁇ m ⁇ GCTCTGGTTTTGGGGGAGAAG-3, which contained a _BamHI site (underlined) at the end, under the same conditions as in the above method (1).
  • the amplified fragment was digested with EcoM and BairiHI, integrated into the pcDNA3 (Ins. Leader + 6 XHis) vector and used as an expression plasmid ⁇ pcDNA3 (Ins. Leader + 6 XHis) -ChPF ⁇ 0
  • ChSy 5 -Primer has 5, terminal containing Xbal site (underlined) 5, -GCTCTAGAGGC TGCCGGTCCGGGCAG-3 ', 3, -primer has 5, terminal has Xbal site (underlined) 5, -GCie ⁇
  • S4CAATCTTAAAGGAGTCCTATGTA-3 ' PCR was performed under the same conditions as in the above method (1).
  • the amplified fragment was digested with XbaL, integrated into pcDNA3 (Ins. Leader + 6 XHis) and used as an expression plasmid ⁇ pcDNA3 (Ins. Leader + 6 X His) -ChSy ⁇ .
  • HRP horseradish peroxidase
  • the membrane was used for human 12-Lane MTN TM blot, and the probe was amplified by the PCR method using CliPF-incorporated plasmid as type I, and the amplified fragment was digested with BgRl to obtain a C840-specific 840 bp. The purified fragment was used.
  • 5'-primer is 5'-CGGGATC CACTCCTCTGGCTGCTCTGG-3 '
  • 3'-primer is 5'-CGGGATCCGCTCTGGTT
  • Contaminants were removed by centrifuging the sample after the enzyme reaction, and applied to a column which had been equilibrated with 0.2 M NH4HCO3 in advance. Gel filtration chromatography was performed at a flow rate of 0.4 ml / min, and the radioactivity of each 0.4 ml fraction was measured with a liquid scintillation counter.
  • ChPF chondroitin sulfates
  • the molecular weight of the enzymatic activity partially purified from the culture supernatant of G361 cells was 160 kDa, and the molecular weight of the secreted proteins of ChPF and ChSy, which were clawed this time, was about 80 kDa, both of which were 1: 1. It is suggested that a complex is formed.
  • ChSy showed low glycosyltransferase activity on Chn polymers and Chn-derived oligosaccharides (Table 1). However, soluble ChSy and ChPF W 200
  • ChPF was expressed in almost all tissues examined except for peripheral leukocytes. ChPF was very similar to the expression pattern of ChSy mRNA, strongly suggesting that both are involved in CS biosynthesis in cooperation (Fig. 7).
  • the chondroitin-polymerizing factor (ChPF) of the present invention forms a complex with chondroitin synthase (CiiSy) and has an action of promoting the polymerization of chondroitin sugar chains. It can be used for artificial synthesis of sugar chain skeleton of sulfated glycosaminodalican having useful physiological activities such as sulfuric acid and dermatan sulfate, and has various usefulness.

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Abstract

コンドロイチン鎖の重合化に関与する新規遺伝子を見出した。この遺伝子産物は、生体内でコンドロイチン合成酵素と複合体を形成し、コンドロイチンの重合化を促進する作用を有するので、コンドロイチン重合化因子（ChPF）と命名した。このコンドロイチン重合化因子は、コンドロイチン硫酸やデルマタン硫酸といった有用生理活性を有する硫酸化グリコサミノグリカンの糖鎖骨格の人工合成などに利用することができ、産業上有用なものである。

Description

明 細 書 コンドロイチン重合化因子の同定と、 その利用
技術分野
本発明は、 コンドロイチン合成酵素によるコンドロイチン鎖の重合反応を促進 する重合化因子 （重合促進因子） の同定と、 同因子を利用したコンドロイチン糖 鎖の合成方法などに関するものである。 背景技術
コンドロイチン硫酸は、細胞表面や細胞外マトリツタスに広く分布する硫酸化 グリコサミノダリカンの一種であり、 細胞間相互作用、 免疫における細胞認識機 構、 リンパ球の特異的ホーミング現象、 がん細胞の接着と転移等、 多方面にわた る生物学的現象に関与すると考えられ、 その多彩な生理的機能から、 医薬品、 化 粧品、 食品等に広く利用されている。 また、 コンドロイチン硫酸は、 へパラン硫 酸と同様に、脊椎動物等における脳の神経ネットワーク形成に重要な役割を果た すことが最近の研究から明らかになってきている。
コンドロイチン硫酸の生合成は、 コアタンパク質の特定のセリン （Ser) 残基 にキシロース (Xyl) が転移されることにより始まり、 続いて 2つのガラクトー ス (Gal) およぴグルクロン酸 (GlcA) が単糖単位で転移され、 四糖結合領域 (GlcAfil-3Gami-3GalBl-4XyUJl-0"Ser)が合成される。 その後、 結合領域に 一 ァセチルガラタトサミン （GalNAc) とグルクロン酸 (GlcA) とが交互に繰り返 し転移されることによりコンドロイチン鎖の重合反応が起こり、 コンドロイチン 硫酸の二糖繰り返し領域が形成される。 そして、 硫酸基転移酵素によって構成糖 が硫酸化されてコンドロイチン硫酸となる。
コンドロイチン硫酸を取得する従来方法としては、 クジラ軟骨等の天然物から 調製する方法が知られていた。 しかしながら、 クジラ軟骨等から調製できるコン ドロイチン硫酸の量は限られている。 また、 近年、 クジラは動物愛護の観点から 捕鯨は制限されており、 クジラの調達自体が困難となっている。
そこで、 コンドロイチン糖鎖の合成技術の開発、 さらに得られたコンドロイチ ン糖鎖を硫酸化してコンドロイチン硫酸を製造する方法の開発が望まれている。 コンドロイチン糖鎖の合成については、 次のような報告がある。 即ち、 ヒトの悪 性黒色腫 G361 細胞の培養上清を酵素源 と し、 四糖結合領域
(GlcAfil-3Gami-3Gami-4Xyl)で糖鎖の伸長が停止しているパートタイムプロテ ォグリカンである α -トロンポモジュリン ( a -TM) を糖受容体基質として用いる と、 GalNAcと GlcAの二糖が交互に繰り返し重合し、 重合化した糖鎖は天然の コンドロイチンと同程度の長さにまで伸長することが報告されている (Nadanaka, S.， ivitagawa, H.， Goto, R， Tamura, J., Neumann, . W" Ogawa,
T" and Sugahara, K. (1999) Biochem. J. 340， 353-357) 0
他方、コンドロイチンの重合化に関与する酵素の cDNAクローユングは遅れて いたが、 最近、 コンドロイチン鎖の二糖繰り返し領域の合成に関与する V—ァセ チルガラクトサミン転移酵素- II (GalNAcT-II) およびグルク口ン酸転移酵素- II (GlcAT-II)の両活性をもつコンドロイチン合成酵素 (ChSy)の eDNAがクロー二 ングされた (Kitagawa, H" Uyama, T" and Sugahara, K. (2001) J. Biol. Chem.
276， 38721-38726) o しかしながら、 ifl vitroにおいて組換え型タンパク質として 発現させた ChSyは、 GalNAcや GlcAをそれぞれ転移させる活性は示したが、 α -ΤΜ 上にコンドロイチン鎖を重合させることができず、 上記の G361細胞の 培養上清中に検出されたコンドロイチン鎖の重合反応を再現することができな かった。 発明の開示
本発明者は、 上記の知見から、 ChSy と共同してコンドロイチン鎖を重合化さ せるために必須の、未だ同定されていないタンパク性因子が存在するのではない かと予想し、 同分子の探索を行った。
本発明の目的は、 コンドロイチン鎖の重合化に関与する新規分子を同定すると 共に、 同分子を利用したコンドロイチン糖鎖の合成方法、 さらにはコンドロイチ ン硫酸の製造方法などを提供することにある。
ごく最近、 コンドロイチン硫酸の生合成に関与する糖転移酵素として ChSyを 含む 5つの糖転移酵素が同定された。 これらはすべて ChSyと高い相同性を示す ので、 コンドロイチン鎖の重合化に関与する因子も ChSyと相同性を示すのでは ないかと考え、 ChSyのアミノ酸配列をもとにデータベースを検索した。 得られ たデータをもとに解析を進めた結果、 775アミノ酸からなり、 アミノ酸レベルで ヒト ChSyと 23%の相同性を示すヒト新規遗伝子の存在を同定した。 さらに機能 解析の結果、 この遺伝子産物が ChSyと共同して in Yitroでコンドロイチン鎖の 重合化を促進する作用を有すること等を見出し、 本発明を完成させるに至った。 即ち、 本発明は、 産業上有用な方法 ·物として、 下記 A) 〜： P ) の発明を含む ものである。
A) 下記 （a ) 〜 （d ) の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質をコー ドするポリヌクレオチド。
(a) 配列番号 2に示されるアミノ酸配列、
(b) 配列番号 4に示されるアミノ酸配列、
(c) 配列番号 2又は 4に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、
(d) 上記 ( a ) 〜 ( c ) の何れかのアミノ酸配列において、 1又は数個のァ ミノ酸が置換、 欠失、 揷入、 及び 又は付加されたアミノ酸配列。
B ) 配列番号 1又は 3に示される塩基配列を有する上記 A) 記載のポリヌク レオチド。
C ) 上記 A) 又は B ) 記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。 組換え発現ベクターの作製には、 プラスミ ド、 ファージ、 又はコスミ ドなどを用 いることができるが、 特に限定されるものではない。
D) 上記 A) 又は B ) 記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。 こ こで、 「ポリヌクレオチドが導入された」 とは、 公知の遺伝子工学的手法 （遺伝 子操作技術） により、 対象細胞 （宿主細胞） 内にポリヌクレオチド （遺伝子） が 発現可能に導入されることを意味する。 また、 上記 「形質転換体」 とは、 細胞 · 組織 '器官のみならず、 動物個体 （線虫、 キイ口ショウジヨウバエ、 マウス、 ラ ット、 ゥサギ、 プタ、 サルなどの形質転換動物） を含む意味である。
E ) 下記 （a ) 〜 （d ) の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
(a) 配列番号 2に示されるァミノ酸配列、
(b) 配列番号 4に示されるアミノ酸配列、
(c) 配列番号 2又は 4に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、
(d) 上記 （a ) 〜 ( c ) の何れかのァミノ酸配列において、 1又は数個のァ ミノ酸が置換、 欠失、 揷入、 及ぴ Z又は付加されたアミノ酸配列。
F ) 上記 E) 記載のタンパク質を含むコンドロイチン重合促進剤。
G) 上記 E) 記載のタンパク質とコンドロイチン合成酵素とを共発現させる ことにより得られた複合体。
H) 上記 E) 記載のタンパク質に対する抗体。 抗体は、 タンパク質の全長又 はその部分べプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体または モノクローナル抗体として得ることができる。
I ) 上記 E) 記載のタンパク質を用いてコンドロイチン鎖の重合化を促進す る方法。
J ) 上記 E ) 記載のタンパク質とコンドロイチン合成酵素とを共発現させる ことにより得られた複合体を使用することを特徴とする上記 I ) 記載のコンドロ イチン鎖重合化方法。
) 四糖が結合した α -トロンボモジュリン等のコアタンパク質上にコンドロ イチン鎖を合成することを特徴とする上記 I ) 又は】） 記載のコンドロイチン鎖 重合化方法。
L ) 上記 I ) 〜！ の何れかに記載の方法を用いて製造されたコンドロイチ ン鎖。
M) 上記 I ) 〜！ O の何れかに記載の方法を用いて製造されたコンドロイチ ン硫酸。
N) 上記 I ) 〜K) の何れかに記載の方法を用いて製造されたデルマタン硫 酸。
Ο) 配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺 伝子上の変異を検出することにより遺伝子病の有無を判定する方法。 同タンパク 質は、 後述のように、 ChSy と共同してコンドロイチン鎖の重合化に重要な役割 を果たすヒト由来コンドロイチン重合化因子 （ChPF) であり、 その変異により コンドロイチン硫酸の生合成に異常を生じ、疾患の原因となっている可能性があ る。 このような疾患については、 CiLPi7遺伝子上の変異を検出することにより当 該遺伝子病の有無を判定することができる。
P ) ゲノム中のコンドロイチン重合化因子 （(¾PF) 遺伝子配列の全部また は一部を改変することにより得られ、相同染色体上の一方又は双方の £¾PF遺伝 子が破壊されたことを特徴とするノックァゥト非ヒト動物。
本発明のさらに他の目的、 特徴、 および優れた点は、 以下に示す記載によって 十分わかるであろう。 また、 本発明の利益は、 添付図面を参照した次の説明で明 白になるであろう。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明に係るヒ ト由来コンドロイチン重合化因子 （ChPF) の配列 ' 構造を、 ヒ ト由来コンドロイチン合成酵素 （ChSy) およぴヒ ト由来コンドロイ チン 'グルクロン酸転移酵素 （Chondroitin GlcAT) と比較して示す図である。 図中、 ボックスは膜貫通ドメィンを示し、 ChPFの推定上の JV-glycosylation site は★で示される。
図 2は、 上記ヒト由来コンドロイチン重合化因子 （ChPF) のゲノム構造を、 コンドロイチン ·ダルク口ン酸転移酵素 （Chondroitin GlcAT) と比較して示す 図である。 図中、 ボックスはェキソン、 パーはイントロンを示し、 白いボックス は非翻訳領域、黒いボックスは翻訳領域を表す。 ATGは開始コドン、 TGA ' TAG は終止コドンを示す。
図 3の A · Bは、結合領域ォリゴ糖、人工基質および α -ト口ンポモジュリン（ CK -ΤΜ)をそれぞれ受容体基質として重合反応を行い、得られたコンドロイチン鎖の サイズを比較検討した実験結果を示すグラフである。
図 4の A〜Cは、（GlcABl-3GalNAc)3ゃコンドロイチンポリマーを受容体基質 として重合反応を行い、 得られたコンドロイチン鎖のサイズを比較検討した実験 結果を示すグラフである。
図 5の Α · Bは、 α -ΤΜ上に合成されたコンドロイチン糖鎖に由来する糖-タ ンパク質結合領域の六糖の分析結果を示すグラフである。
図 6は、 pull-down法を用いた ChPFと ChSyとの相互作用解析の結果を示す 図である。
図 7は、 ¾FFおよび (¾Syのノーザンプロット分析の結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 コンドロイチン合成酵素 （ChSy) と共同して、 コンドロイチン鎖 の重合化を促進する重合化因子およびこれをコードする遺伝子を同定すると共 に、 その機能を詳細に解析し、 この重合化因子を利用したコンドロイチン鎖の合 成方法などを提案するものである。 そこで以下では、 このコンドロイチン重合化 因子とその遺伝子 （ポリヌクレオチド） の配列、 構造について説明し、 次いでそ の機能、 利用方法等について説明することにする。
( 1 ) 本努明に係るコンドロイチン重合化因子とその遺伝子の配列、 構造 ヒト ChSyのァミノ酸配列をもとに BLASTサーチを行った。その結果、 ChSy と相同性の高い遺伝子情報 （ァクセッション番号： B C 0 2 1 2 2 3 ) を見出し た。 しかし、 この情報に開示される推定アミノ酸配列は 5 2 2残基からなる短い ものであった。 本発明者は、 得られたデータをもとに解析を進めた結果、 775ァ ミノ酸からなり、 ヒ ト ChSy と 23%の相同性を示し、 ヒ ト Chondroitin GlcAT とは 57%の相同性を示す新規タンパク質（C PF)の存在を同定した（図 1参照）。 後述のように、 この新規タンパク質には、 糖供与体である UDP-糖の結合モチ ーフである DXD モチーフが存在しなかった。 このことより、 この遺伝子産物は コンドロイチン硫酸の生合成に関与しているが、糖転移活性を保持していないこ とが予想された。機能解析の結果からも、この遺伝子産物は糖転移酵素ではなく、 ChSy と共同してコンドロイチンを重合化させる因子であることが判明したので、 本発明者は、 この新規タンパク質をコンドロイチン重合化因子 （ehondroitin polvmerising factor (ChPF)) と名付けた。
配列表の配列番号 1には、 ヒト C¾PF遺伝子の c D NA配列が示され、配列番 号 2には、同遺伝子によってコードされるヒト ChPFのアミノ酸配列が示される。 また、 配列番号 4には、 上記 C¾PFの推定膜貫通ドメィンを含む N末端側から 62個のアミノ酸を他の配列と組換えた可溶性の ChPF組換え型タンパク質のァ ミノ酸配列が示され、 配列番号 3には、 その c D NA配列が示される。 後述のよ うに、 ChPFの機能解析は、 この可溶性 ChPFを発現させることにより行った。 ゲノム情報を検索し解析した結果、 図 2に示すように、 CjhPFは第 2番染色体 上で約 5 kbに広がって存在し、 翻訳領域の遺伝子は 4つのェキソンから構成さ れていた。 このゲノム構造は、 Cl miiroitiii GJcAT遺伝子と類似するものであつ た。
本発明に係るタンパク質、 即ちコンドロイチン重合化因子は、 （a ) 配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、 （b ) 配列番号 4に示されるァ ミノ酸配列からなる可溶性タンパク質、 （c ) 配列番号 2又は 4に示されるアミ ノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質 （例えば、 融合タンパク質）、 (d) 上記 （a) 〜 （c) の何れかのアミノ酸配列において、 1又は数個のアミ ノ酸が置換、 欠失、 揷入、 及ぴ Z又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク 質（コンドロイチン重合化因子として機能するもの）、のいずれであってもよい。 また、 ヒト由来に限らず、 他の生物由来のコンドロイチン重合化因子であっても よい。
上記 「1又は数個のアミノ酸が置換、 欠失、 揷入、 及び/又は付加」 とは、 点 変異導入法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、 欠失、 挿入、 及ぴ Z又 は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 及び 又は付加されるこ とを意味する。 このように、 上記 （d) のタンパク質は、 換言すれば、 上記 （a) 〜 （c) の変異タンパク質であり、 ここにいう 「変異」 は、 主として公知の変異 タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する 同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
本発明に係るタンパク質は、 タンパク質の精製や検出等を容易に行うために、 公知の HAや F 1 a g等の付加配列を末端に含ませてもよいし、融合タンパク質 としてもよい。 また、 公知の各種修飾を施してもよいし、 二量体以上の多量体を 形成するものであってもよい。
本発明の 「ポリヌクレオチド （遺伝子）」 は、 上記 (a ) 〜 (d) のいずれか のタンパク質をコードする配列を有するものであればよく、 さらに非翻訳領域 (UTR) の配列などを含むものであってもよい。
尚、 本発明の 「ポリヌクレオチド （遺伝子）」 には、 RNAおよび DNAが含 まれるものとする。 RNAには mRNAや s i RNAなどが含まれ、 DNAには、 c DNAやゲノム DNAなどが含まれる。 また、 DNAは二本鎖でも一本鎖でも よく、 一本鎖 DNAは、 センス鎖となるコード DNAでもよく、 アンチセンス鎖 となるアンチコード鎖でもよい。 アンチセンス鎖は、 プロープとして又はアンチ センス薬物として利用できる。 また、 s i RNAは、 RNA iとして遺伝子発現 抑制などに利用できる。
( 2 ) コンドロイチン重合化因子の機能とその利用方法
機能解析の結果、 上記コンドロイチン重合化因子 （ChPF) には以下の機能が 見出されている （詳細は、 後述の実施例参照）。 1 ) GalNAcT-IIおよび GlcAT-II 活性を保持する ChSyと ChPFを同一細胞内で共発現させると、 ChSy単独発現 時と比べて、 GalNAcT-IIおよび GlcAT-IIの活性が 20倍以上に上昇した。 2 ) α -ΤΜを受容体基質、 ChSyと ChPFを共発現させた分泌型タンパク質を酵素源 として用い、 UDP-GalNAcと UDP-GlcA共存下で酵素反応を行った結果、 天然 のコンドロイチン鎖と同程度の長さにまで重合化を起こすことに成功した。 3 ) ChPFを用いたコンドロイチン鎖の重合反応には、受容体基質として α -ΤΜ等の コアタンパク質を用いることが好ましい。 4 ) 分泌型タンパク質として共発現さ せた ChSyと ChPFとは複合体を形成し、 相互作用していると考えられる。 5 ) ChPFは調べた殆どの組織で発現しており、 その発現パターンは ChSyと類似し ていた。 このことより生体内で両者が共同して、 コンドロイチン硫酸の生合成に 関与していると考えられる。
したがって、 上記コンドロイチン重合化因子 （(¾PF) およびその遺伝子は、 生理活性を有する硫酸化グリコサミノダリカン (コンドロイチン硫酸、 デルマタ ン硫酸） の糖鎖骨格の人工合成に利用することができる。 例えば、 コンドロイチ ンはこれまでクジラの軟骨などから調製されたコンドロイチン硫酸を化学的に 脱硫酸化することによって調製されていたが、 ChSyと ChPFとを共発現させ、 これを酵素源として用いることにより、 in vitroでコンドロイチン糖鎖を安定か つ容易に大量生産することが可能となる。
上記コンドロイチン重合化因子 （ChPF) を用いた糖鎖合成において、 α -トロ ンボモジュリン （α -ΤΜ) 等のコアタンパク質上にコンドロイチン糖鎖を合成す ることは好ましい。
さらに、 特異性の異なる種々の硫酸化転移酵素を用いることによって、 生理活 性を有する種々のコンドロイチン硫酸やその異性体であるデルマタン硫酸の合 成に利用できる。
その他にも、 本発明のコンドロイチン重合化因子おょぴその遺伝子は、 研究用 試薬や検査用試薬として利用可能であるほか、 コンドロイチン重合化因子の異常 に起因する疾患や、 コンドロイチン硫酸、 デルマタン硫酸等の硫酸化グリコサミ ノグリカンが関係する疾患の病態解析、 並びにその病気への治療薬、 治療法、 診 断薬、 および診断法等の開発に利用可能である。
( 3 ) 本発明に係るタンパク質、 遺伝子の取得方法
本発明に係る C¾LP 遺伝子の取得方法は、 特に限定されるものではなく、 前述 の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記遺伝子配列を含む D N A断片を単離し、 クローユングすることができる。
例えば、上記 遺伝子の c D N Aの一部配列と特異的にハイプリダイズす るプローブを調製し、 ヒ トゲノム D NAライプラリーや c D NAライプラリーを スクリーニングすればよい。 このようなプローブとしては、上記 CILPF遺伝子の c D N A配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイプリダイズす るプロープであれば、 いずれの配列》長さのものを用いてもよい。 また、 インシ リコ 'スクリ一二ングを行ってもよい。
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成及ぴそ の塩基配列決定 (シークェンシング) によって、 さらに詳しく解析することがで きる。 これらの解析によって、 本発明に係る遺伝子配列を含む D NA断片を取得 したか容易に確認することができる。
また、上記プローブの配列を、上記 C¾FF遺伝子の特異性の高い領域の中から 選択し、 ヒ ト 'マウスやその他の生物のゲノム D NA (又は c D NA) ライプラ リーをスクリーニングすれば、上記 ChPFタンパク質と同様の機能を有する相同 分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。 本発明に係る遺伝子 （ポリヌクレオチド） を取得する方法は、 上記スクリー- ング法以外にも、 P C R等の増幅手段を用いる方法がある。 例えば、 上記 C¾P_F の c D NA配列のうち、 5， 側及び 3， 側の非翻訳領域の配列 （又はその相補配 列） の中からそれぞれプライマーを調製し、 これらプライマーを用いてヒトのゲ ノム D NA (又は c D NA) 等を铸型にして P C R等を行い、 両プライマー間に 挟まれる D NA領域を増幅することで、本発明のポリヌクレオチドを含む D NA 断片を大量に取得できる。
本発明に係る上記 ChPFタンパク質等を取得する方法についても、特に限定さ れるものではなく、 例えば、 上述のようにして取得された遺伝子 （上記 ChPFタ ンパク質又はその相同分子等をコードする c D N A等) を導入した組換え発現べ クタ一を作製し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに 組み入れて形質転換体として、 その c D NAがコードするタンパク質を発現させ 精製することで、 本発明に係るタンパク質を容易に取得することができる。
上記 ChPF タンパク質の変異タンパク質を作製する方法についても特に限定 されるものではなく、 例えば、 点変異導入法などの公知の変異タンパク質作製法 を用いて、 上述のようにして取得された遺伝子の塩基配列において、 1又はそれ 以上の塩基が置換、 欠失、 揷入、 及ぴ 又は付加されるように改変を加えること によつて作製することができる。 また、 変異タンパク質の作製には、 市販のキッ 卜を利用してもよい。
( 4 ) 本発明の ChPFノックァゥト動物
本発明の ChPFノックァゥト動物、即ち、ゲノム中の ChPF遗伝子配列の全部 または一部を改変することにより得られ、 相同染色体上の一方または双方の (¾PF遺伝子が破壊された非ヒト動物は、 遺伝子ターゲッティング法を用いて作 製することができる。
ここで 「(¾Ρ 遺伝子が破壊された」 とは、 換言すれば、 ChPF本来の機能を 持った蛋白質が発現されないことを意味する。 したがって、 ChPF本来の活性を 持たない ChPF蛋白の一部断片 （ポリペプチド） が発現されるものであってもよ い。
遺伝子ターゲッティング法は、 通常の方法にしたがって行えばよい。 一例を挙 げれば、 まず、 相同組換えのためのターゲッティングベクター （ターゲッティン グコンストラク ト） を構築する。 ターゲッティングベクターは、 公知の方法によ り作製することができ、大略、 CiiPi1ゲノム D N Aクローン、市販のプラスミ ド、 ポジティブセレクション用のマーカー （P G K— n e oカセット等）、 およぴネ ガティブセレクション用のマーカー （D T A遺伝子、 《[ 3 — 1 15：遺伝子等） な どの各フラグメントを適切に連結することにより作製することができる。 このと き、 目的とする制限酵素切断部位が適切な位置に配されるようターゲッティング ベクターを設計するとよい。 また、 ターゲッティングの効率は相同領域の長さに 依存するので、 相同領域はできるだけ長いほうが好ましい。 さらに、 ターゲッテ ィングベクターは環状より直鎖状のほうが好ましいので、直鎖状化のため相同領 域以外の部分に一力所適当な制限酵素切断部位を設けておくとよい。
上記方法により作製した 遺伝子ターゲッティングベクターを、 E S細胞 等の対象動物由来の全能性細胞にエレクトロポレーシヨン法等により導入し、 そ の後、 目的とする相同組換えが起こった細胞を選別する。 選別は、 ポジティブ一 ネガティブ選択法により薬剤を用いて効率よくスクリーユングできる。 選別後、 目的とする相同組換えが起こった細胞を、 サザンプロットゃ P C R法などによつ て確認する。 最終的に相同組換えが確認された全能性細胞を、 妊娠中の子宮から 採取された胚盤胞 (プラストシスト) に導入する。 胚盤胞への細胞の導入は、 マ ィクロインジェクション法等により行うことができるが、 これに限定されるもの ではない。
上記胚盤胞を常法に従い仮親に移植する。 仮親から生まれた生殖系列キメラ動 物 （好ましくは雄） と、 野生型（¾PF遺伝子をホモで持つ野生型動物 （好ましく は雌） とを交配させることにより、 第 1世代 （F 1 ) として、 相同染色体上の一 方の <¾PF遺伝子が相同組換えによ.り破壊されたへテロ接合体を得ることがで きる。 さらに、 これらへテロ接合体同士を交配させることにより、 第 2世代 （F 2 ) として、相同染色体上の双方の C¾PF遺伝子が破壊されたホモ接合体を得る ことができる。 ホモ接合体の同定は、 体の一部 （例えば尻尾） を切断し、 D NA を抽出してサザンプロットゃ P C R法などによって遺伝子型を調べればよい。 ま た、 第 2世代 （F 2 ) として、 GW^ノックアウト動物と同腹の野生型動物 （野 生型遺伝子をホモで持つ） を得ることができるが、 この野生型動物は対照実験に 好適に用いることができる。
以上説明した遺伝子ターゲッティング法は、 あくまでその一例を示すものであ つて、 公知の種々の変更が可能であることはいうまでもない。
ChPFノックァクト動物の対象となる動物は、特に限定されるものではないが、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モヌレモット、 ハムスター、 マ ウス、 ラットなどの哺乳動物が例示される。 これらのうち、 実験動物として用い るには、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 マウス、 ラットが好ま しく、 なかでも齧歯目がさらに好ましく、 近交系が多数作出されており、 受精卵 の培養、 体外受精等の技術が整っているマウスが、 特に好ましい。 また、 全能性 細胞としては、 受精卵や初期胚のほか、 多分化能を有する E S細胞、 体性幹細胞 のような培養細胞を対象とすることができる。
本発明の ChPFノックアウト動物は、 ChPFの機能解析などに有用である。 以下、 実施例により本発明をより具体的に説明するが、 本発明はこれら実施例 により何ら限定されるものではない。 尚、 各実施例における詳しい実験方法につ いては、 最後の項においてまとめて説明する。
〔実施例 1 ： ChPFのクローエング〕
ヒ トの ChSyのアミノ酸配列を用いた BLASTサーチの結果、 ChSyと相同性 のある新規遺伝子が存在することが判明した。 この遺伝子は 236 bpの 5，非翻訳 領域、 775個のアミノ酸をコードする 2325 bpの翻訳領域（図 1および配列番号 1 · 2 )と、 約 500 bpの 3'非翻訳領域から構成されていた。 その翻訳開始領域と 予想される配列は Kozak consensus配列に従っていた。また、 この遺伝子から翻 訳されるタンパク質は、 Kyte-Doolittle hydropathy analysisより、 N末端側に
23個のアミノ酸からなる膜貫通ドメインを 1つ持つ、 ゴルジ体に局在する糖転 移酵素に特徴的な II 型膜蛋白質であることが同定され、 さらに 3 力所の
Figure imgf000015_0001
siteを保持していた。この遺伝子は ChSyとァミノ酸配列レベル で 23%の相同性を示し、 ヒト Chondroitiii GlcA とは 57%の相同性を示した (図
Do しかしながら、糖供与体である UDP-糖の結合モチーフである DXD モチー フが存在しなかった。 このことより、 この遺伝子産物は、 コンドロイチン硫酸の 生合成に関与しているが、 糖転移活性を保持していないことが予想された。 機能 解析の結果からも、 この遺伝子産物は糖転移酵素ではなく、 ChSy と共同してコ ンドロイチン (以下、 略して rchnj という。） を重合化させる因子であること が判明したので、 本発明者は、 この新規タンパク質をコンドロイチン重合化因子 <.chondroitin polymensmg factor (ChPF)) と名付けた。
解析の結果、 Gaenorhabditis elegansや Drosophila melanogasterにお ヽても 上記 ChPFの orthologが存在することがわかり、 それぞれ 27 およぴ 25%の相 同性があった。
〔実施例 2 ： ChPFの遺伝子構造と染色体マッピング〕
図 2に示すように、 ChPFは第 2番染色体上で約 5 kbに広がって存在し、 翻 訳領域の遺伝子は 4つのェキソンから構成されていた。 それぞれのィントロン/ ェキソンの境界は GT/AG ruleに適合していた。
〔実施例 3 ： ChPFの発現と機能解析〕
ChPFの機能を解析するために、 ChPFの膜貫通ドメインを含む N末端側から 62個のァミノ酸を、 細胞外分泌シグナルである insulin leaderおよび protein A の IgG-結合ドメインのシークェンスと組換えることにより、 COS-1 細胞で protein Aが融合した分泌型タンパク質を発現させた。 この ChPF組換え型タン パク質を酵素源に用い、 Chnを糖受容体基質に UDP-GalNAcあるいは UDP-GlcA を糖供与体として糖酝移活性を測定したが、糖転移活性はほとんど検出できなか つた (下記表 1)。
そこで、 ChPFは糖転移酵素ではなく重合化因子であると考え、 Chn鎖の二糖 繰り返し領域を合成する糖転移活性をもつ ChSyを ChPFと同一細胞内で共発現 させた。 その結果、 ChPFを ChSyと共発現させたものを酵素源に用いた場合で は、 ChSy単独時よりも GalNAcT-IIおよび GlcAT-II活性は 20倍以上に上昇し た (表 1)。また、 ChSyと ChPFをそれぞれ単独に発現させた組換え型タンパク質 を混合したものでは、糖転移活性の上昇は見られなかった。 このことより、 ChSy と ChPFが細胞内で複合体を形成することが示唆された。 さらに、複合体は単独 で発現させたときには形成されず、同一細胞内で ChSyと ChPFを共発現させる ことにより、 複合体が形成されると考えられた。
〔表 1〕
Protein GalNAcT-II Activity* GlcAT-II Activity
pmol/ml medium/h pmol/ml medium^
ChSy 1.3 2.3
ChPF 0.2 NDfe
ChSy/ChPF 31.0 188.4
ChSy + ChPF' 0.5 1.1
a Chnポリマーを糖受容体基質として用いた。
b ND, not detected (く 0.01 pmol/ml medium/h)
e COS-1 cellで別々に発現させた分泌型 ChSyと ChPFのタンパク質を混合したものを 酵素源として用いた。
〔実施例 4 ：様々な糖受容体基質を用いた重合化反応〕
前述のように、組換え型タンパク質として発現させた ChSyは GalNAcと GlcA のそれぞれを単糖で転移させる GalNAcT_IIおよび GlcAT-II両活性を保持してい るにもかかわらず、 α -TM上に Clm鎖を重合させる活性は保持していなかつた。 そこで、 ChPFと ChSyを共発現させたものに糖転移活性の上昇が見られたこ とより、 ChPFと ChSyを共発現させたものが Chn鎖を重合させる活性を保持し ているのではないかと考えた。 この点について解析するため、 ChSyと ChPFを 共発現させた組換え型タ ンパク 質を酵素源 と して、 α -ΤΜ、 GlcABl-3GalBl-3Galfil-4XylBl-0-Ser, 四糖結合領域に α -ΤΜ 由来のペプチド が結合した GlcABl-3GalBl-3Galfil-4Xymi-CKGly)Ser-Gly-Glu、 四糖結合領域 に β-glycan とよばれるプロテオダリカン (PG) 由来のぺプチドが結合した GlcABl-3GalBl-3GalBl-4XylBl-0-Ser-Gly-Trp-Pro-Asp-Gly および人工基質で ある GlcAfil-3Gami-i C2H4NH-beiisyloxycarl onylを糖受容体基質として用い、 重合活性を測定した。 その結果が図 3のグラフ A、 Bに示される。
図 3の説明： A. Chn鎖の重合反応の基質として GIcABl-3GaIBl-3Gami-4Xy lBl-0-Ser (⑩)、 GlcABl-3Galfil-3GalBl-4XylBl- 0-(Gly)Ser-Gly-Glu( X )、 Glc ABl-3GalBl-3GalBl-4XylBl-0-Ser-Gly-Trp-Pro-Asp-Gly (△)、 GlcABl-3Galfil- C2H NH- engylo22ycarbonyl( ) a. -TM (O)を用いた。 [3H]標識重合反応生 成物を Superdex peptideカラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行うこ とにより分析した。 《-ΤΜ を受容体基質に用いた場合には、 [3H〗標識重合反応 生成物をアルカリ還元処理した後、 分析に用いた。 矢印は Chn 由来八糖一十糖 の溶出位置を示す。 Vtはフラクション （Fr.) 60付近である。 B. 重合反応によ り a -TM上で合成された糖鎖 (〇)を Superdex 75 カラム (1.6 X 60 cm)を用いて 分析した。 ゲルろ過クロマトグラフィー後の溶出液の放射活性を測定した。 分子 量スタンダードとして Chnポリマーについても分析し、 溶出液の 210 nmにお ける紫外吸収を測定した （鲁)。
図 3に示すように、 用いた様々な基質上に Clm鎖の重合が起ったが、 α -ΤΜ 上には最も効率よく、 より長く Clm鎖が伸長した。 また、 既に糖鎖が伸長した Chn鎖にも ChSyと ChPFを共発現させた融合タ ンパク質により、 Clm 鎖が伸長されるかを確かめるため、 Chn 由来の六糖 (GlcABl-3GalNAc)3 および Clmポリマーを受容体基質として、 Clm鎖の重合反 応を行った。 その結果が図 4のグラフ A〜Cに示される。
図 4の説明： A. Chn鎖の重合反応の受容体基質として Chn由来のオリゴ糖 (GlcAfil-3GalNAc)3を用いた。 [3H]標識重合反応生成物を Superdex peptide力 ラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーにより分離し、溶出液の放射活性を測 定した （拳)。 矢印は Chn由来八糖一" h糖の溶出位置を示す。 Vtは Fr. 60付近で ある。 B. Chnポリマーを受容体基質として ChPFと ChSyを共発現させたもの (〇)および ChSy単独のもの (誊)を酵素源に用い重合反応を行い、 [ ]重合反応生 成産物をゲルろ過ク口マトグラフィ一により単離した。 単離した [3H]標識重合反 応生成物を Superdex 200 カラム （1.6 X60 cm)を用いたゲノレろ過クロマトグラ フィーを行い、 溶出液の放射活性を測定した。 矢印は分子量マーカーとして用い たデキストランにより求めたそれぞれの分子量における溶出位置を示している。 C.上記 Bで単離した反応生成物を GSaseACII消化し、消化後 Superdex Peptide カラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行うことによって分離し、液体シ ンチレーションカウンターで測定した。 ChPFと ChSyを共発現させたものを酵 素源に用いたときの反応生成物の CSase消化後 （〇)および ChSy単独で発現さ せたものを酵素源に用いたときの反応生成物の CSase消化後 (·) のクロマトグ ラムを示す。 矢印は Chn由来の二糖おょぴ GalNAcの溶出位置を示す。
図 4に示すように、 Chn由来の六糖（GlcABl-3GalNAc)3を受容体基質として 使用した場合は八一十糖の位置にピークが検出されたことより、二糖一四糖程度 の糖鎖の伸長が起つたと予想された （同図 A)。 Chnポリマーを受容体基質とした 場合、 伸長した糖鎖の長さは、 control として ChSyのみを酵素源として得られ た生成物と比べて、 ゲルろ過クロマトグラフィーによる分析で大きな差異は見ら れなかった （同図 B)。 し力 >し、 CSaseACII消化の結果、 ChSyを用いて調製した 反応生成物からは単糖の位置のみに放射活性のあるピークが検出されたのに対 して、 ChPFと ChSyを共発現させたものを酵素源に用いた場合の反応生成物か らは、二糖の位置にも顕著なピークが検出された （同図 C)。 このことより、 ChSy 単独時よりも、 Clmポリマー基質上に少なくとも数糖程度の糖鎖の伸長反応が起 つたことが明らかになった。
〔実施例 5 ： α -ΤΜの四糖結合領域に重合した Clm鎖の分析〕
次に、 α -ΤΜの四糖結合領域をプライマーとして Chn鎖の伸長反応が起った かを確認した。 その結果が図 5のグラフ A、 Bに示される。
図 5の説明： A. a -TMを受容体基質として重合反応を行い、 [3H]標識重合反 応生成物をゲルろ過により単離した。 単離した [3H]標識重合反応生成物をアル力 リ処理した後、 2-aminobenzamide (AB)により蛍光標識した。 蛍光標識した糖鎖 を CSaseABC で完全に消化し、 不飽和二糖標準品として ADi-OS を添加し、 Superdex peptideカラムを用いたゲルろ過ク口マトグラフィ一により分画し、溶 出液の放射活性（搴)を測定した。 矢印は不飽和二糖（ lex a l-SGalNAc)の溶出 位置を示す。 B. 結合領域を含む放射標識された画分（グラフ Aの Fr. 1)を回収 し、 陰イ オン交換カ ラ ムを用いた HPLG で分析した。 Fr. 1 の chondro-glycuronidase による消化前 （〇）および消化後 （籲）のクロマトグラム を示す。 溶出液の放射活性を測定した。 矢印は 2-ABで標識された結合領域五糖 と六糖の溶出位置を示す。 波線は NaH2P04の濃度勾配を示す。
図 5 Aに示すように、 放射標識された糖鎖が CSaseABC により消化され、 結 合領域を含む Fr. 1およぴニ糖を含む Fr. 2を得た。 Fr. 1と Fr. 2の放射活性の 比は 1 ： 47であるため、 合成された Clm鎖は平均約百糖から成っていると予想 された。
その後、 Fr. 1を陰イオン交換 HPLCで分析したところ、 放射活性をもった 1 本のピーク （図 5 Bの矢印 2)が検出され、 その溶出位置は、 結合領域六糖標準品 AHexA a l-3Gal AcBl-4GlcABl-3GalBl-3Galfil-4Xyl-2-AB のものと一致した。 また、 このピークは chondro-glycuronidase による消化によって非還元末端の ΔΗΘΧΑが消化され、 GalNAcfil-4GlcABl-3Galfil-3Galfil-4Xyl-2-ABの溶出位置
(図 5 Bの矢印 1)へ移動した。 これらの結果より、 糖鎖の伸長は α -TMの結合領 域四糖上で起つたことが示された。
興味深いことに、 ChSyと ChPFの複合体が GalNAcT-II、 GlcAT-II活性だけ でなく、 結合領域に最初に GalNAcを酝移する GalNAcT-I活性をも保持してい ることが明らかとなった。 この結果は、以前報告された、ヒトの悪性黒色腫 G361 細胞の培養上清中に見出した重合活性と同様の結果であった。
〔実施例 6 ： ChPFと ChSyの相互作用解析〕
以上の結果より、 ChSyと ChPFを同じ細胞内で共発現させると、 糖転移活性 の上昇おょぴ Chn鎖の重合が起こることが明らかとなった。 さらに、 それぞれ を単独に発現させた融合タンパク質を混合したものでは、糖転移活性の上昇は見 られなかった。 このことより、 単独で発現させたときには複合体は形成されず、 同じ細胞内で ChSyと ChPFを共発現させることにより、複合体が形成されるこ とが示唆された。 そこで、 ChSyと ChPFが実際に複合体を形成しているかを確 認するため、 ChPFおよび ChSyを 6XHis あるいは protein Aとの分泌型融合 タンパク質として同一細胞内で共発現させ、 pull-down法により ChPF および ChSy間の相互作用を調べた。 その結果が図 6に示される。
図 6の説明：まず、 ChPFおよび ChSyを 6 XHis あるいは protein Aとの分 泌型融合タンパク質として単独および同一細胞内で発現させ、 Ni-NTA agarose を用いた pull-down assayを行った。その後、 SDS-PAGEにより分離し、 protein Aとの融合タンパク質を IgG抗体を用いた western blottingにより検出した。
Lane 1では protein A-ChPFの大きさと予想される約 110 kDaのパンドが検出 された。 Lane では protein A-ChSyの大きさと予想される約 120 kDaのパンド が検出された。 各レーンのサンプルは以下のとおりである。 Lane 1： protein A-ChPF/His-ChSy, lane 2： His-ChSyゝ lane 3： protein A-C Sy + His-ChPF (単 独に発現させたタンパク質を混合したもの）、 lane 4： protein A-ChSy/His-ChPF, lane 5： His-ChPF。
このように、 protein A-ChPF/His-ChSyおよぴ！) rotein A-ChSy/His-ChPFの 組合せで ChPFと ChSyを共発現させたものでは、それぞれ protein A-ChPF (約 110 kDa)および protein A-ChSy (約 120 kDa)と予想されるパンドが検出された。 しかし、 単独で発現させたものや、 単独で発現させそれぞれのタンパク質を混合 したものでは、 パンドは検出されなかった。 このことより、 ChPFおよび ChSy は同一細胞内で相互作用していることが示された。
〔実施例 7 ： Northern blotによる ChPFの発現パタ一ン解析〕
ChPFの発現パターンを調べるため、 northern blot分析を行つた。 その結果が 図 7に示される。
図 7の説明： ヒトの様々な組織から抽出した mRNA を用いて、 £¾Ρ (上段） および C¾S ^(下段)の発現を調べた。各レーンのサンプルは以下のとおりである。
Lane 1， brain; lane 2， heart; lane 3, skeletal muscle; lane % colon; lane 5， thymus; lane 6， spleen; lane 7, kidney; lane 8， liver; lane 9， small intestine; lane 10， placenta; lane 11, lung; lane 12, peripheral Mood leulioeytes。
図 7に示すように、 mRNAのサイズは約 3.4 kbであり、 末梢白血球を除き調 ベた組織全てに発現が認められた。 このことは、 コンドロイチン硫酸がほとんど すべての組織に発現しているという結果と一致した。 し力 >し、 組織により発現レ ベルは異なり、 胎盤おょぴ心臓では発現がもっとも強く、 続いて脳、 骨格筋、 腎 臓おょぴ肝臓で強い発現が見られた。 さらに、 ¾PFは ¾Syの mRNAの発現 パターンと非常に類似していた。 このことより、 両者が共同してコンドロイチン 硫酸の生合成に関与していることが示された。
〔実験方法〕
(1) ChPFの機能解析のための soluble formの発現プラスミドの作製
内在性の糖転移酵素の混入をさけるために、培養上清中に可溶性の組換え型タ ンパク質として ChPFを発現させるための発現プラスミドを作製した。 CM^の N 末端側から膜貫通ドメインと予想される最初の 62 アミノ酸を除いた配列を PCR法によつて增幅させた。 5'-Primerは 5，末端に BamHI site (下線） を含む 5，-CGGGATCCAACTCGGTGCAGC-3，を、 3，-primerは 5，末端に BamHI site (下 線） を含む 5，-CGOe ^GCTCTGGTTTTGGGGGAGAAG-3，を用いた。 PCR は KOD DNA polymerase を使い、 錡型としてヒ ト悪性黒色腫細胞株 G361 (ATCC CRL-1424)由来 cDNA library 50 ngを使用した。 反応は、 5% DMSO存 在下で 940C， 30 sec; 55。C， 30 sec; 68。C， 180 secを 32 cycle行った。 増幅した fragmentを BamHIで消化し、 pEF-BOS/IPベクターに組込み発現プラスミドと した (pEF-B0S/IP-ChPP)o
(2)培養細胞への遺伝子の導入と組換えタンパク質の精製
上記発現プラスミ ド pEF-BOS/IP-ChPF 6.0 を FuGENE™ 6 transfection reagen を用いてアフリカミ ドリザル腎臓由来 COS-1細胞に遺伝子導入した。共 発現の場合には、 pEF-BOS/IP-ChPFと pEF-BOS/IP-ChSyを 3.0 ずつ同様 に FuGENETM 6 transfection reagentを用いて、 COS-1細胞に両方のプラスミ ドを導入した。 Transfeetioii 後、 DMEM/10% FBS培地で 2日間、3*7。C /5 % G02 の条件で incubationした後、培養上清を IgG-Sepharoseと 4。Cで 1時間混合し、 protein Aとの融合タンパク質を結合させた。 その後、 1,000 rpmで 2 min遠心 し上清を除き、 沈殿した樹脂を 0.15 M NaCl/0.02% Tween-20/50 mM Tris-HCl (pH 7.5)で洗浄した。 これを 3 回繰り返し、 精製された融合タンパク質 /IgG-Sepharoseを酵素源とした。
(3)糖転移酵素活性の測定条件
(3-1) GalNAcT-II活性の測定
最終濃度として、 50 mM MES-NaOH (pH 6.5)、 10 mM MnCl2、 8.57 μΜ UDP-[3H]GalNAc (3.60 x 105 dpm)を加えた条件で 171 の Clmを糖受容体基 質として加えた。酵素源は上記方法 (2)で精製したものを使用した。 この反応溶液 を 37°Cで 2時間 incubationした。シリンジカラムを用いて反応産物から遊離の アイソトープを除去し、溶出液の放射活性を液体シンチレーションカウンターで 測定した。
(3-2) GlcAT-II活性の測定
最終濃度として、 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.6)、 10 mM MnCl2、 14.3 μΜ UDP-[i4C]GlcA (1.46 x 105 dpm)を加えた条件で 171 pg の Chnを糖受容体 基質として加えた。酵素源は上記方法 (2)で精製したものを使用した。 この反応溶 液を 37°Cで 2時間 incubationした。シリンジカラムを用いて反応産物から遊離 のアイソトープを除去し、溶出液の放射活性を液体シンチレーションカウンター で測定した。
(3-3) Polymerization活' 14の測定
最終濃度として 100 mM MES-NaOH (pH 6.5)、 10 mM MnC½、 250 μΜ UDP-i iGaWAc (50.0 x 10s dpm)、 250 μΜ UDP-GIcAを加えた条件で 1 n molの oi -TM、 GlcABl-3GalBl-3Gami-4XylBl-0-Ser, GlcABl-3GalBl-3Gami- 4XylBl- 0-(Gly)Ser-Gly-Gl , GlcABl-3Galfil-3GalBl-4XylBl- O-Ser-Gly- rp- Pro-Asp-Gly 100 nmol GlcA l-SGal&l-O-GzH^ -hensjloxyeaTbonyl 10 n mol (GlcAfil-3GalNAe)3または Γ71 Chnをそれぞれ糖受容体基質として加 えた。 酵素源は上記方法 (2)で精製したものを使用した。 この反応溶液を 37°Cで 12時間 incubationした。
(4) Polymerization reaction productの同定
(4-1) -ΎΜを糖受容体基質に用いた際の productの同定
α -ΤΜの重合反応後の精製物を、 シリンジカラムを用いて、遊離のァイソトー プを除去することにより単離した。 α -ΤΜ上の [3H]GaINAcで標識された糖鎖を 0.5 M LiOHを用いたアルカリ処理によりコアタンパク質より切り出し、 4分の 1 を Superdex 75カラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーにかけ、分画した画 分の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。 アルカリ処理した 残りの 4分の 3を 2-aminobeiizainide (AB)により蛍光標識した。 得られた蛍光 標識された糖鎖を 50 mlUの CSaseABCを用いて 1時間、 完全に消化した。 こ の CSaseABCによる消化物を Superdex Peptideカラムを用いたゲルろ過ク口マ トグラフィーにかけ、 2-AB で標識された結合領域六糖と考えられる画分を分取 し、 ポリアミン結合シリカカラム （PA-03)を用いた HPLC で分析した。 また、 chondro-glycuronidaseによる消化を行い、 HPLCで分析した。 反応生成物の同 定は 2-AB で標識された結合領域六糖標準品おょぴ結合領域五糖標準品との co- クロマトグラフィーにより行つた。
(4-2) 糖鎖または糖ぺプチドを受容体基質に用いた際の productの同定 重合反応後の生成物を Superdex Peptideカラムを用いたゲルろ過クロマトグ ラフィ一によつて分離し、分画した溶出液の放射活性を液体シンチレーシ 3ンカ ゥンターで測定した。
(4-3) Cimポリマーを受容体基質に用いた際の productの同定
重合反応後の生成物を、 シリンジカラムを用いて遊離のァイソトープを除去す ることにより単離した。 その後、 精製物をそのまま Superdex 200カラムを用い たゲルろ過クロマトグラフィーで分析した。また、単離した精製物を CSaseACII 消化し、 消化後 Superdex Peptideカラムを用いたゲルろ過ク口マトグラフィー を行うことによつて分離し、分画した画分の放射活性を液体シンチレーシヨン力 ゥンターで測定した。
(5) ChPFと ChSvの相互作用解析
(5-1)相互作用解析用の His-tag融合タンパク質発現プラスミドの作製
ChPFと ChSyとの相互作用を確認する際、内在性の糖転移酵素の影響を除去 するため、培養上清中に His-tagされた ChPFおよび ChSyを分泌型組換えタン パク質として発現させるための発現プラスミドを作製した。 （¾PFおよび ChSy の膜貫通ドメイン以降の配列を PCR法によって以下のように増幅した。
a) ChPF: 5'-Primerは 5，末端に EcoKi site (下線） を含む 5，-CGGAATTCAA CTCGGTGCAGCCCGGAGC-3'を、 3，-primerは 5，末端に _BamHI site (下線） を含む 5，-CGQO^m^GCTCTGGTTTTGGGGGAGAAG-3，を用い、 上記方法 (1) と同条件で PCRを行った。 増幅した fragmentを EcoMと BairiHIで消化し、 p cDNA3(Ins. leader+6 XHis)ベクターに組込み発現プラスミドとした {pcDNA3 (Ins. leader+6 XHis)-ChPF}0
b) ChSy: 5，-Primerは 5，末端に Xbal site (下線） を含む 5，-GCTCTAGAGGC TGCCGGTCCGGGCAG-3'を、 3，-primerは 5，末端に Xbal site (下線） を含む 5， -GCie^ S4CAATCTTAAAGGAGTCCTATGTA-3'を用い、上記方法 (1)と同条件 で PCRを行った。 増幅した fragmentを XbaLで消化し、 pcDNA3(Ins. leader+ 6 XHis)に組込み発現プラスミドとした {pcDNA3(Ins. leader+6 X His)-ChSy}。
(5-2)培養細胞への遺伝子の導入と組換えタンパク質の精製
上記 a)および b)で調製した発現プラスミ ド 6.0 μδ を FUGENETM 6 transfection reagentを用いて COS-1細胞に遺伝子導入した。共発現の場合には、 pcDNA3(Ins. leader+6 X His)-ChSyと pEF-BOS/IP-ChPFあるいは pcDNA3(Ins. leader+6 XHis)-ChPFと pEF-BOS/IP-ChSyを 3.0 ずつ同様に FuGENETM 6 transfection reagent を用いて、 GOS-1 細胞に両方のプラスミ ドを導入した。 Transfection 後、 DMEM/10% FBS培地で 2 日間、 37。G /5% C02の条件で incubationした後、培養上清を Ni-NTA agaroseと 4。Cで 1時間混合し、 His-tag 融合タンパク質を結合させた。 その後、 1,000 rpmで 2 min遠心し上清を除き、 沈殿した樹脂を 0.15 M NaCl/0.02% Tween-20/50 mM Tris-HCl (pH 7.5)で洗浄 した。
(5-3) SDS-PAGEおよび western blot分析によるタンパク質相互作用の確認 上記方法で得た His-tag 融合タンパク質/ Ni-NTA agarose を 1.3 mM dithiothreitol (DTT)の存在下で 94。C、5分間 incubationした。その後、 5,000 rpm で 5 min遠心し、 上清をサンプルとした。 そのサンプルを SDS-PAGEによって 分離し、 分離されたタンパク質を電気的に PVDF膜に移行させた。 1次抗体には protein Aと高親和性を持つマウスモノク口ーナル抗体 IgG3 (MSW113)、 2次抗 体には horseradish peroxidase (HRP)が結合した anti-mouse IgGを用い、 ECL Advance Detection Reagents kitのプロトコールに従い、 目的タンパク質を検出 した。
(6) ChPFの northern blot解析
メンプランは Human 12-Lane MTN™ blot用い、 probeは、 CliPFが組込ま れたプラスミ ドを铸型として、 PCR法により増幅し、 増幅したフラグメントを BgRl消化することにより、 C¾PFに特異的な 840 bpのフラグメントを精製した ものを用いた。 上記方法 (1)と同条件で PCRを行い、 5'-primerは 5'-CGGGATC CACTCCTCTGGCTGCTCTGG-3'を、 3'-primerは 5'-CGGGATCCGCTCTGGTT
を用いた。 Probeの標識は [ t» -32P]dCTPを使用し、 ランダ ムプライム法に基づく oligolabelling kitを用いて行った。 次に、 メンプランを プレハイプリダイゼーシヨンし、 32p標識 pro eを加え、 68°Gで 24時間ハイプ Vダイゼーシヨンを行った。 メンブランを洗浄した後、 BIOMAX™ MA(Kodak 社)に 1週間露光し、 検出した。
(7)酵素活性の測定方法
(7-1) Superdex Peptide, Supredex 75、 Superdes: 200の各種カラムを用いた グ 'ノレろ過クロマトグラフィー
酵素反応後のサンプルを遠心する事によつて夾雑物を取り除き、 予め 0.2 M NH4HCO3で平衡化しておいたカラムにアプライした。 0.4 ml/minの流速でゲル ろ過クロマトグラフィーを行い、 0.4 mlずつ分画した画分の放射活性を、液体シ ンチレーションカウンターで測定した。
(7-2) シリンジカラムアツセィ
1 mlのシリンジ（0.45 X 6.8 cm) に 0.2 M NH HCO3で平衡化した Sephadex G-25 (superfine)を充填し、 150 g x 5 mm, 続いて 900 g x 5 min遠心して、 ゲ ル内の溶媒を除去した。 0.2 M NH4HCO3を 30 μΙ加え、全量 50 μ1としたサンプ ルをこの樹脂に添加して 900 g X 5 minで遠心し、 さらに 0.2 M NH4HC03を 50 μΐ加えてもう 1度、 900 g X 5 minで遠心し、 未反応の UDP-糖を取り除き、 そ の溶出液の放射活性を液体シンチレーシヨンカウンタ一で測定した。
〔実験結果の考察〕
ChPFと ChSyを共発現させることにより、 in vitroで Clm鎖の重合化が可能 になることを明らかにした。 ChPF自身は GalNAcT-IIおよび GlcAT-Π活性をほ とんど保持していないにも関わらず、 ChPFは今までに同定されている他の 5つ のコンドロイチン硫酸（CS) の生合成に関与している糖転移酵素と高い相同性を 示す。 それゆえ、 ChPF は CS の生合成に関与する 6番目の遗伝子ファミリー (ChSy family)の memberであると考えられる。
以前、 in vitroでヒ トの悪性黒色腫 G361細胞培養上清を酵素源に用い、 α -ΤΜ 上に Chn鎖の重合化がおこることが報告されている。 さらに基質阻害実験によ り、 この推定される ciumdrortin polymeraseは 3つの糖転移活性を保持してい ることが予想された。 1 つは CS 合成の開始に関与する四糖結合領域に最初の GalNAcを転移する GalNAcT-I活性、 2つ目おょぴ 3つ目は CS鎖を伸長させる GalNAeT-IIおよび GleAT-II活性である。 今回、 GhPFと GhSyを共発現した組 換えタンパク質を酵素源とした際に、 《-ΤΜの四糖結合領域上に Clm鎖の重合 化が起こったことより、 Cimの重合化は単独のタンパク質により担われるのでは なく、 ChPFと ChSyの複合体により担われていることが示唆された。 Pull-down 法による相互作用解析からも、 ChPFと ChSyが同一細胞内で複合体を形成して いることが強く示唆された （図 6 )。 さらに、 G361細胞の培養上清から部分精製 した酵素活性の分子量は 160 kDaであり、 今回クローユングした ChPFおよび ChSyの分泌型のタンパク質の分子量は、 それぞれ約 80 kDaであり、 両者が 1： 1で複合体を形成していることが示唆されこ。
以前の報告と同様に、 ChSyは Chnポリマーや Chn由来のオリゴ糖に対して 低い糖転移活性しか示さなかった （表 1)。 しかし、 ChSyと ChPFを可溶性の融 W 200
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合タンパク質として共発現させると、 ChSy 単独時よりも GalNAcT-II および GlcAT-II两活性は 20倍以上に上昇した （表 1)。 このことから、 ChSyが十分な 活性を発揮するためには ChPFが必要であると考えられる。
さらに、 Chn鎖の重合化にはコアタンパク質が重要な役割を果たしていること が示唆された。 GlcABl-3GaUJl-3Galfil-4XylBl-0~Ser、 GlcABl-3GalBl-3Galfil -4XylBl- ( (Gly)Ser-Gly-Glu, GlcABl-3GalBl-3Galfil-4XylBl- O-Ser-Gly-Trp- Pro-Asp-Gly. GlcABl-3GalBl- 0-C2H4NH-benzyloxycarbonyl, (GlcABl-3GalN Ac)3 、 および CImポリマーを受容体基質に用いたときと比較し、 α -ΤΜを受容 体基質に用いたときの方がより長く効率よく Chn鎖の重合ィ匕が起った （図 3)。 これに関連して、 以前、 PGである decorinのコアタンパク質の様々な欠失変異 体では短い GAG鎖しか合成されず、 その理由としてコアタンパク質と糖転移酵 素間の親和性が低下したためであるとの報告がある。 それ故、今回の結果は Clm 鎖の長さが、 受容体となるコアタンパク質によって影響を受け、 （¾Sy と CiiPF の複合体がコアタンパク質と相互作用し、 GAG 鎖の長さを調節していることが 示睃された。
動物細胞において β-D-xyloside をプライマーとして GAGが合成されることが 知られており、このことより疎水的な性質を保持している xylosideのァグリコン 部分はコアタンパク質を模倣することが示唆されている。 実際、 ChPF と ChSy の組換え型タンパク質を同一細胞内で共発現させたものを酵素源とし、 GlcABl-3GalBl-0-C2H4NH-beMyloxycarbonylを受容体とした際、 Chn鎖の重 合反応が起った （図 3 )。 しかし、 α -ΤΜ を受容体に用いたときよりも短い Chn 鎖しか重合しなかった （図 3 )。 このことは疎水的なァグリコンが GAG鎖の付カロ するコアタンパク質の最小限の性質を保持しており、 ChSyと ChPFの複合体と 相互作用することが可能であることを示唆している。
これまでの研究では、通常、重合化反応と硫酸化修飾は同じ Golgi区画で起り、 硫酸化修飾と糖鎖の伸長および停止との間には密接な相関があると考えられて いる。 伸長している CS鎖の硫酸化は糖鎖の重合化に影響を与えるといわれてい るが、今回の結果より in vitroでは Clm鎖の重合化には硫酸化修飾は必須ではな いことが示された。
Northern blot解析により、 ChPFは末梢白血球を除いて調べた組織ほとんど 全てに発現が認められた。 また、 ChPFは ChSyの mRNAの発現パターンと非 常に類似していたことより、 両者が共同して CSの生合成に関与していることが 強く示唆された （図 7 )。
今回、組換え型タンパク質として共発現させた ChSyと ChPFの複合体を用い て in vifcroで Clm鎖の重合化を起こすことができた。 この知見は、 CSの生合成 機構の解明およびその機能解析にも役立つと考えられる。
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様ま たは実施例は、 あくまでも、 本発明の技術内容を明らかにするものであって、 そ のような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、 次に記載す る特許請求の範囲内で、 様々に変更して実施することができる。 産業上の利用の可能性
以上のように、 本発明のコンドロイチン重合化因子 （ChPF) は、 コンドロイ チン合成酵素 （CiiSy) と複合体を形成し、 コンドロイチン糖鎖の重合化を促進 する作用を有するので、 前述したとおり、 コンドロイチン硫酸やデルマタン硫酸 といった有用生理活性を有する硫酸化グリコサミノダリカンの糖鎖骨格の人工 合成などに利用することができるほか、 種々の有用性を有するものである。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 下記 （a) 〜 （d) の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質をコード するポリヌクレオチド。
(a) 配列番号 2に示されるアミノ酸配列、
(b) 配列番号 4に示されるアミノ酸配列、
( c ) 配列番号 2又は 4に示されるァミノ酸配列を含むァミノ酸配列、
(d) 上記 （a) 〜 （c) の何れかのアミノ酸配列において、 1又は数個のアミ ノ酸が置換、 欠失、 挿入、 及ぴノ又は付加されたアミノ酸配列。
2. 配列番号 1又は 3に示される塩基配列を有する請求項 1記載のポリヌクレ ォチド。
3. 請求項 1又は 2記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現べクター。
4. 請求項 1又は 2記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
5. 下記 （a) 〜 （d) の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
(a) 配列番号 2に示されるアミノ酸配列、
(b) 配列番号 4に示されるアミノ酸配列、
( c ) 配列番号 2又は 4に示されるァミノ酸配列を含むァミノ酸配列、
(d) 上記 (a) 〜 (c) の何れかのァミノ酸配列において、 1又は数個のアミ ノ酸が置換、 欠失、 挿入、 及び/又は付加されたアミノ酸配列。
6. 請求項 5記載のタンパク質を含むコンドロイチン重合促進剤。
7. 請求項 5記載のタンパク質とコンドロイチン合成酵素とを共発現させるこ とにより得られた複合体。
8. 請求項 5記載のタンパク質に対する抗体。
9. 請求項 5記載のタンパク質を用いてコンドロイチン鎖の重合化を促進する 方法。
1 0. 請求項 5記載のタンパク質とコンドロイチン合成酵素とを共発現させるこ とにより得られた複合体を使用することを特徴とする請求項 9記載のコン ドロイチン鎖重合化方法。
1 1 . 四糖が結合した α—トロンポモジュリン等のコアタンパク質上にコンドロ イチン鎖を合成することを特徴とする請求項 9又は 1 0記載のコンドロイ チン鎖重合化方法。
1 2 . 請求項 9〜1 1の何れか 1項に記載の方法を用いて製造されたコンドロイ チン鎖。
1 3 . 請求項 9〜1 1の何れか 1項に記載の方法を用いて製造されたコンドロイ チン硫酸。
1 4 . 請求項 9〜1 1の何れか 1項に記載の方法を用いて製造されたデルマタン 硫酸。
1 5 . 配列番号 2に示されるァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝 子上の変異を検出することにより遺伝子病の有無を判定する方法。
1 6 . ゲノム中のコンドロイチン重合化因子 （C¾P ) 遺伝子配列の全部または 一部を改変することにより得られ、相同染色体上の一方又は双方の ChPFM 伝子が破壊されたことを特徴とするノックァゥト非ヒト動物。
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